一、转染血小板第四因子氨基末端改构体cDNA抑制裸鼠实体肿瘤生长的研究（论文文献综述）
徐阳[1]（2020）在《阳离子PCL-b-P（GMA-EA）载体递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的研究》文中研究表明背景:近年来,采用微生物载体递送靶向炎症通路的基因在肿瘤治疗中取得了良好的效果。微生物载体主要包括病毒与细菌。病毒类载体可以分成两类:整合型和非整合型病毒载体,细菌主要包括厌氧菌和兼性厌氧菌。尽管已有大量的研究表明,应用减毒沙门菌体内递送基因能取得良好的治疗效果,但是,由于生物载体的安全性问题,限制了其临床转化过程。近期,人工合成载体递送基因抗肿瘤成为研究热点。人工合成载体包括脂质体和阳离子聚合物。聚醚酰亚胺（Polyetherimide,PEI）是经典的阳离子聚合物,并作为阳离子基因载体研究的金标准被广泛应用。但是PEI毒性较高,体内转染效率不高,这使得开发新型阳离子基因载体成为现阶段的研究热点。现阶段国内已开发出一系列合成基因载体用于治疗肿瘤,但是相关的体内研究仅局限于肿瘤本身,机体对合成载体递送基因抗肿瘤的综合反应仍未知。神经母细胞瘤（Neuroblastoma,NB）是儿童最常见的颅外实体肿瘤,最常见的发生部位是肾上腺。约有50%以上的患儿生存率低于40%,探寻有效的治疗靶点是神经母细胞瘤研究的热点。在临床上,神经母细胞瘤组织血运丰富,常出现早期转移,且伴有大量出血、坏死和钙化。抑制炎症致癌信号通路在该肿瘤的治疗中发挥明显作用。维甲酸/干扰素联合应用诱导的细胞凋亡调控基因19（Genes associated with retinoid-interferon-induced mortality 19,GRIM-19）可以通过抑制转录因子信号转导和转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription-3,STAT3）通路抑制恶性肿瘤的生长。虽然近期的研究表明,STAT3信号通路在神经母细胞瘤转移和化疗耐药的患儿中至关重要,但是尚缺乏临床病理分期与GRIM-19的相关性报道。异种移植瘤的体内实验提示抑制STAT3信号通路可以抑制神经母细胞瘤的生长,但是不足以评估抑制该通路后肿瘤局部微环境的改变。我们推测在神经母细胞瘤同种移植瘤中,过表达GRIM-19可能通过抑制STAT3信号通路的机制,抑制肿瘤细胞的生长,促进凋亡,而且抑制MMP-9表达,减轻瘤内出血,提高治疗效果。众所周知,多数肿瘤化疗的一线药物顺铂具有明显的内皮细胞毒性,治疗后可明显增加血浆血管性血友病因子（Von Willebrand factor,v WF）水平。针对致病机制的基因治疗具有高效低毒的特点,理论上对机体毒副作用较小。虽然已经开发出许多脂质体、阳离子载体用于神经母细胞瘤的治疗研究,可是如何在体内达到最大的治疗效果仍需仔细评估。方法:1、基因载体的合成与表征:通过酶促聚合反应合成双亲性嵌段共聚物PCL-b-P（GMA-EA）（PCG）,核磁检测PCG的化学结构,凝胶电泳检测PCG与GRIM-19质粒的结合能力,动态光散射评估PCG与GRIM-19质粒复合物的粒径和ζ电位。在人宫颈癌Hela细胞、人肝癌Hep G2细胞和鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞中,用细胞增殖活性检测（CCK-8）检测PCG与EGFP-N1质粒复合物的细胞毒性,用流式细胞仪或荧光显微镜检测PCG的转染效率。2、临床样本的分析:收集吉林大学白求恩第一医院住院确诊为神经母细胞瘤的28例患儿手术标本的石蜡切片,通过免疫组化分析GRIM-19的表达与神经母细胞瘤患儿年龄、性别、肿瘤大小、INSS分期、INPC分期、淋巴结和/或脉管转移的相关性。3、PCG递送GRIM-19基因抑制神经母细胞瘤的体内外研究:用PEI作为阳性对照,采用Western blot检测PCG介导的GRIM-19在鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞中的转染效率。体外实验分为6组,分别为对照组、PCG组、裸p GRIM-19组、PCG/p CDNA组、PCG/p GRIM-19组和PEI/p GRIM-19组,应用细胞增殖实验（CCK-8）、克隆形成实验、Brd U检测、流式凋亡检测、免疫荧光、划痕及Transwell实验,探讨PCG介导的GRIM-19过表达对肿瘤增殖、凋亡及转移的影响。体内实验中,分为对照组、PEI/p GRIM-19组和PCG/p GRIM-19共3组,应用免疫组化及Western blot检测GRIM-19的转染效率,通过免疫组化检测PCNA的表达,细胞凋亡检测（TUNEL）及Western blot检测分析裸鼠移植瘤治疗后增殖及凋亡的改变。进一步的体内实验分为对照组、顺铂组和PCG/p GRIM-19组共3组,检测各组裸鼠生存期的差异,自动血液分析仪检测裸鼠血红蛋白,酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血浆中v WF,HE染色检测荷瘤鼠肺部改变,免疫组化检测肿瘤组织p-STAT3、MMP-9的表达,评价肿瘤组织学、瘤内出血、贫血及肺栓塞等肿瘤相关并发症改变。结果:1、N/P=1（阳离子聚合物中的N和DNA中的P的摩尔比）时,PCG完全阻止GRIM-19质粒DNA在凝胶电泳中的泳动。在w/w（质量比）为5-50的范围内,PCG能将p GRIM-19质粒压缩成200-400 nm大小,表面电势为25-30 m V的纳米粒子。在人宫颈癌Hela细胞、人肝癌Hep G2细胞和鼠神经母细胞瘤Neuro2a细胞中,PCG（w/w=20）在细胞中有效递送EGFP-N1质粒,同时对细胞的毒性较小。2、神经母细胞瘤组织中GRIM-19蛋白表达水平较癌旁正常组织下调或缺失。肿瘤组织中GRIM-19表达水平与年龄（P=0.0012）、INSS分期（P=0.0012）、INPC分期（P=0.0299）、淋巴结和/或脉管转移（P=0.0062）呈负相关,与性别及肿瘤原发部位无关。3、体外实验中,PCG载体可以将GRIM-19基因转染进Neuro2a细胞并提高GRIM-19基因的蛋白表达水平,其转染效率高于PEI。在对照组、PCG组、裸p GRIM-19组、PCG/p CDNA组、PCG/p GRIM-19组和PEI/p GRIM-19组中,PCG/p GRIM-19组和PEI/p GRIM-19组细胞凋亡增加,细胞增殖和细胞迁移抑制。PCG介导细胞内过表达GRIM-19蛋白抑制了STAT3信号通路,抑制了Cyclin D1、Bcl-2、MMP2和MMP9的表达。体内实验中,在对照组、PEI/p GRIM-19组和PCG/p GRIM-19组中,PCG/p GRIM-19组移植瘤生长抑制最明显,该组GRIM-19蛋白表达增加,PCNA表达下调,TUNEL染色及Cleaved caspase-3上调。在对照组、顺铂组和PCG/p GRIM-19组中,PCG/p GRIM-19组小鼠生存期延长最明显,该组大体观见瘤内出血减少,裸鼠血红蛋白升高,v WF下调,HE提示肺栓塞减少,肿瘤组织内p-STAT3下调,下游靶基因MMP-9表达下调。结论:1.人工合成的双亲性阳离子聚合物PCG能在体内外进行有效的基因转染。2.神经母细胞瘤肿瘤组织中GRIM-19的表达下调或缺失,其表达水平与年龄、INSS分期、INPC分期、淋巴结和/或脉管转移呈负相关。3.在裸鼠同种移植瘤模型中,PCG递送p GRIM-19可以有效抑制STAT3信号通路,不仅直接抑制肿瘤细胞的生长,而且抑制MMP-9表达,减轻瘤内出血。顺铂化疗引起荷瘤裸鼠内皮损伤及肺血栓增加,基因递送组v WF下调,肺血栓减少,小鼠生存期延长。阳离子PCG载体递送p GRIM-19抑制神经母细胞瘤的治疗策略可能为肿瘤治疗提供有价值的参考。
李永红[2]（2020）在《空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究》文中提出研究目的以手术及放化疗为主的胃癌治疗已经进入平台期。过去三十年中,以凋亡蛋白为靶标的新型抗肿瘤药物研发取得了一定的进展,但受凋亡蛋白高频可变剪接、肿瘤异质性等因素的影响,凋亡相关靶向药物在临床应用特别是在胃癌等实体肿瘤中疗效欠佳。因此,基于凋亡因子可变剪接调控的抗肿瘤研究引起广泛关注,但在胃癌中的相关研究尚未见相关报道。Mcl-1分子是Bcl-2凋亡基因家族的核心成员,Mcl-1 pre-mRNA可通过可变剪接表达抗凋亡蛋白Mcl-1L和促凋亡蛋白Mcl-1S两种剪接异构体。基于Mcl-1可变剪接的干预有望通过改变肿瘤细胞抗凋亡状态、促进肿瘤细胞凋亡而成为胃癌治疗的新策略和新靶点。本研究通过临床研究,明确凋亡因子Mcl-1可变剪接与胃癌病理分级、临床分期、生存预后的相关性;通过细胞学实验,探讨空间阻滞寡核苷酸（SBOs）调控Mcl-1可变剪接进而促进胃癌细胞凋亡,抑制胃癌细胞增殖的生物学效应;通过裸鼠移植瘤实验,在体内验证SBOs治疗对肿瘤组织Mcl-1可变剪接的调控作用及其促进肿瘤组织细胞凋亡、抑制肿瘤生长增殖的作用。研究方法临床研究:应用基因表达谱交互分析软件GEPIA分析来源于TCGA数据库的408例胃癌组织以及36例正常胃粘膜组织中Mcl-1 mRNA表达情况及其与胃癌病理分级、临床分期、生存预后之间的相关性;收集59例胃腺癌患者新鲜胃癌组织和31例胃炎患者胃黏膜组织,应用荧光定量PCR技术定量检测Mcl-1可变剪接产物Mcl-1L及Mcl-1S的mRNA表达;利用Western blotting技术对Mcl-1L及Mcl-1S蛋白表达水平进行半定量检测;Mcl-1L及Mcl-1S表达水平与胃癌病理分级、临床TNM分期、生存预后的相关性分析。体外实验:合成Mcl-1特异性SBOs,应用Endo-Porter系统转染至不同分化程度的胃癌细胞系（MKN-28（高分化）、SGC-7901（中分化）、MKN-45（低分化））;RT-q PCR及Western blotting技术检测转染不同浓度SBOs细胞的Mcl-1L及Mcl-1S mRNA和蛋白的表达;应用流式细胞术检测转染不同浓度SBOs胃癌细胞的凋亡率;Western blotting检测细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）,评价转染不同浓度SBOs胃癌细胞的凋亡活化状态;CCK8增殖实验评价转染不同浓度SBOs胃癌细胞的增殖能力。体内实验:应用胃癌细胞系种植裸鼠背前壁皮下部位建立MKN-45和HGC-27两种胃癌移植瘤模型;通过瘤体局部多点注射不同剂量Mcl-1特异性SBOs,注射3天后处死裸鼠;记录裸鼠移植瘤体积治疗前后变化并组间比对分析;RT-q PCR及Western blotting技术检测不同浓度SBOs治疗后癌组织Mcl-1L及Mcl-1S mRNA和蛋白的表达;HE染色后计算SBOs治疗后肿瘤组织细胞死亡面积;免疫荧光技术原位观察肿瘤组织细胞凋亡;组织研磨后制备组织细胞悬液,应用流式细胞术检测肿瘤组织细胞凋亡率,同时应用Western blotting检测细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）,评价不同剂量SBOs治疗的胃癌组织的肿瘤凋亡活化状态;应用免疫组化技术检测细胞增殖指标Ki-67表达。研究结果临床研究:与正常胃粘膜组织相比,肿瘤组织中Mcl-1L mRNA表达显着升高（p<0.05）,与之相反,Mcl-1S mRNA表达则显着降低（p<0.01）,Mcl-1S/Mcl-1L mRNA亦明显降低（p<0.001）;与mRNA表达水平差异相一致,在胃癌组织中,Mcl-1L蛋白表达明显升高,Mcl-1S蛋白表达水平显着降低;同时,Mcl-1S与Mcl-1L mRNA表达水平的比值与胃癌T分期呈负相关,与N分期无明显关联性;Kaplan Meier生存分析显示,低Mcl-1S/Mcl-1L mRNA水平胃癌患者的总生存期低于Mcl-1S/Mcl-1L mRNA高水平胃癌患者。体外实验:相对GES-1正常细胞,不同分化程度的胃癌细胞系MKN-28、SGC-7901、MKN-45中Mcl-1L表达明显升高,Mcl-1S表达显着降低,但胃癌细胞株组间无显着差异;转染不同浓度SBOs 48 h后,Mcl-1L mRNA表达水平呈SBOs剂量依赖性降低,而Mcl-1S mRNA表达水平呈SBOs剂量依赖性增加;与mRNA水平的定量变化相似,SBOs处理的胃癌细胞系中,Mcl-1L蛋白表达水平下降,Mcl-1S蛋白表达水平升高;流式细胞术检测SBOs处理的胃癌细胞系显示三株细胞凋亡率均呈SBOs剂量依赖性升高;SBOs处理的胃癌细胞系中,细胞凋亡关键标志物（Bak、cleaved caspase 9和cleaved caspase 3）表达显着升高;转染不同浓度SBOs胃癌细胞的CCK8 OD值呈SBOs剂量依赖性升高。体内实验:SBOs治疗后,MKN-45和HGC-27两种小鼠移植瘤组织中Mcl-1S mRNA及蛋白表达上调,而Mcl-1L表达显着下调;肿瘤组织HE染色显示,相对于对照组,SBOs治疗组移植瘤组织细胞死亡面积呈SBOs剂量依赖性增加;免疫荧光原位检测显示,治疗后癌组织原位肿瘤细胞凋亡数量亦呈SBOs剂量依赖性增加;流式细胞术定量检测细胞凋亡显示,MKN-45异种移植模型中Con-SBO、6.25和12.5 mg/kg SBOs治疗组肿瘤细胞凋亡率分别为2.76%、14.44%和28.75%,在HGC-27异种移植模型中肿瘤细胞凋亡率分别为2.49%、31.26%和50.57%;SBOs治疗后,肿瘤组织中细胞凋亡关键标志物Bak、cleaved caspase9和cleaved caspase 3表达水平明显升高;SBOs治疗组肿瘤体积基本保持稳定,而对照组肿瘤体积增长超过30%;免疫组化检测显示,SBOs治疗组肿瘤生存能力和增殖的指标Ki-67表达率呈SBOs剂量依赖性下降。研究结论1.凋亡因子Mcl-1可变剪接异构体Mcl-1L和Mcl-1S在胃癌中表达不平衡,与胃癌临床进展及预后不良密切相关。2.Mcl-1特异性SBOs可以调控Mcl-1 pre-mRNA可变剪接从Mcl-1L转换为Mcl-1S mRNA剪接模式,抑制抗凋亡可变剪接异构体Mcl-1L的表达,诱导促凋亡异构体Mcl-1S的表达;这种干预能有效促进不同分化程度胃癌细胞的凋亡并抑制胃癌细胞增殖。3.在活体肿瘤组织内Mcl-1特异性SBOs亦可靶向调控Mcl-1 pre-mRNA可变剪接,使剪接模式从Mcl-1L向Mcl-1S mRNA转换,进而诱导胃癌移植瘤组织细胞凋亡并抑制移植瘤增殖和生长。4、以Mcl-1可变剪接为靶标的细胞凋亡调控,具有较高的特异性和有效性可作为抗胃癌治疗的新方向。
顾剑峰[3]（2019）在《TBL1XR1调控人胰腺癌肿瘤细胞增殖作用机制及其临床意义的研究》文中研究指明第一部分TBL1XR1在胰腺导管腺癌中异常表达及其临床意义目的研究转导蛋白β样1X相关蛋白1（TBL1XR1）在胰腺导管腺癌中的表达情况及其与胰腺导管腺癌患者临床病理特征间的关系。方法收集苏州大学附属常熟市第一人民医院收治的46例胰腺导管腺癌肿瘤组织及其配对的癌旁组织样本,采用免疫组织化学（IHC）染色方法、蛋白质免疫印迹（Western Blot）和实时荧光定量PCR检测TBL1XR1表达水平,并结合患者临床病理资料分析相关关系。本研究获得本院伦理委员会批准,且所有患者均被提前告知并签署知情同意书。结果46例胰腺导管腺癌患者手术获取肿瘤组织和癌旁组织检测分析TBL1XR1在mRNA转录水平和蛋白质翻译水平上相对高表达,差异有统计学意义（p<0.05）。46例患者中年龄超过60岁者为27例,其中TBL1XRl阳性68.4%,年龄低于60岁者19例,其中TBL1XR1阳性66.7%,p>0.05,无统计学意义。男性患者23例,其中TBL1XR1阳性65.2%,而女性患者为23例,其中TBL1XR1阳性69.6%,p>0.05,无统计学意义。胰腺导管腺癌病灶特征上,肿瘤直径≥3 cm的患者人数为12例,其中TBLlXR1阳性50.0%,肿瘤直径<3 cm的患者人数为34例,其中TBL1XR1阳性73.5%,p>0.05,无统计学意义。肿瘤TNM分期中,Ⅰ-Ⅱ期的患者为8例,其中TBL1XR1 阳性 25.0%,Ⅲ期患者为 38 例,其中 TBL1XR1 阳性 76.3%,p<0.01,有统计学意义。局部淋巴结转移的情况,46例患者中有淋巴结转移的患者为19例,其中TBL1XR1 阳性73.7%,无淋巴结转移27例,其中TBL1XR1阳性63.0%,p>0.05,无统计学意义。总之,PDAC中TBLlXR1的表达水平与患者的年龄、性别、肿瘤组织的分化程度,肿瘤大小（最大直径）和部位,淋巴结转移情况都无明显相关关系（p>0.05）。而却与肿瘤恶性程度、TNM分期密切相关（p<0.01）,具有统计学意义。PDAC患者肿瘤恶性程度高,其TBL1XR1表达量显着高于低恶性程度PDAC患者（75.6%vs 33.3%）。结论1、TBL1XR1在胰腺导管腺癌组织中高水平表达。2、TBL1XR1与PDAC肿瘤恶性程度（TNM分期）密切相关。3、高表达TBL1XR1提示患者预后不佳,生存率低,提示TBL1XR1基因在胰腺癌进展过程中可能起到重要作用。第二部分TBL1XR1调控胰腺癌肿瘤细胞体外增殖凋亡和体内成瘤能力的研究目的研究TBL1XR1对胰腺癌肿瘤细胞体外增殖凋亡和体内成瘤能力的调控作用。方法利用RNA干扰技术调控降低了基础水平表达较高的胰腺癌细胞系中TBLXR1蛋白的表达量,转染48-72小时后采用qRT-PCR和Western Blot试验验证干扰沉默效率;以体外细胞增殖实验、克隆形成试验、细胞周期试验、细胞凋亡试验以及裸鼠体内成瘤实验观察通过抑制TBL1XR1表达对人胰腺癌细胞体内外增殖成瘤能力及细胞周期凋亡的影响。利用细胞质粒DNA转染表达低细胞株,研究对细胞功能的影响。结果TBL1XR1在胰腺癌细胞系中的表达水平各有差异,其中在Aspc-1和Pancl细胞系中相对高水平表达。对这两株细胞系利用RNAi技术获得高水平沉默TBL1XR1的效率。TBL1XR1促进胰腺癌细胞体外增殖及克隆形成。TBL1XR1影响胰腺癌细胞周期进程,促进细胞向G2/M期转化。TBL1XR1抑制胰腺癌细胞凋亡。TBL1XR1促进胰腺癌细胞裸鼠皮下体内成瘤及增殖。被转染DNA细胞株表达外源性TBL1XR1明显增高。结论TBL1XR1可以在体外促进胰腺癌细胞增殖能力及克隆形成能力;TBL1XR1可能通过减少胰腺癌细胞株G0/1期阻滞和抑制细胞凋亡促进细胞生存;TBL1XR1在胰腺癌细胞体内成瘤增殖中发挥重要作用。第三部分TBL1XR1通过激活PI3K信号通路促进胰腺导管腺癌发生发展目的研究TBL1XR1对胰腺癌细胞增殖、周期凋亡等相关信号通路的影响。方法运用Western Blot实验验证胰腺癌细胞经RNAi干扰TBL1XR1表达后细胞周期相关蛋白表达量改变情况,细胞凋亡相关蛋白表达情况,以及PI3K、AKT和ERK1/2信号通路的蛋白磷酸化水平改变情况。使用PI3K通路抑制剂LY294002观察能否回复胰腺癌细胞的增殖作用。结果TBLIXR1表达量降低后,Cyclin A和CDK2细胞周期蛋白表达量随之下降,Cyclin D周期蛋白表达量升高,同时csc25a周期蛋白的表达量也明显下降。TBL1XR1蛋白水平不足导致了胰腺癌细胞在G0/1期发生滞留,细胞无法顺利从G0/1期过度到S期及后续G2/M期的分裂进程。TBL1XR1表达量下降后,Bax表达量增多,Bcl-2下降,Bax/Bcl-2比值升高,代表细胞凋亡的促进。另外,降低TBL1XR1蛋白表达水平后,磷酸化形式的P13K表达下降,磷酸化形式的Akt表达也同时下降,代表该PI3K/Akt通路信号转导的活性下降,即其促进胰腺癌细胞增殖的能力减弱。PI3K通路抑制剂LY294002能够有效回复TBL1XR1促胰腺癌细胞增殖功能的作用。结论TBL1XR1表达降低后细胞内周期相关蛋白和凋亡相关蛋白的表达变化与胰腺癌细胞表型结果相符。TBL1XR1通过激活胰腺癌细胞内PI3K/Akt信号转导通路发挥促进胰腺癌细胞增殖的作用。PI3K/Akt通路是TBL1XR1发挥其生物学功能的主要下游通路,PI3K抑制剂LY294002可以有效回复TBL1XR1促进胰腺癌细胞增殖进展的效果。
陈东[4]（2019）在《低表达PDCL3在卵巢癌SKOV3细胞中对VEGF影响的初步探究》文中提出[目 的]卵巢癌对妇女生命造成严重威胁。近年来,以抑制VEGF/VEGFR2信号通路为主的抗血管生成靶向治疗受到越来越多的关注,但该信号通路的调控机制尚不明确。既往有研究发现VEGFR2的新型分子伴侣PDCL3能够正性调控其数量,刺激血管生成。本研究拟在卵巢癌SKOV3细胞系中初步探究低表达PDCL3对VEGF的影响:同时采用贝伐珠单克隆抗体封闭SKOV3细胞内VEGF后,观察PDCL3的变化情况。[方法]1.对卵巢癌SKOV3细胞系进行PDCL3-SiRNA慢病毒转染72h,下调PDCL3。荧光显微镜下观察PDCL3-SiRNA慢病毒转染效率。2.琼脂糖凝胶电泳检验各组总RNA的完整性。3.用qPCR及Western blot验证PDCL3下调情况以及检测各组VEGF、VEGFR2 mRNA和蛋白的表达情况,Western blot检测p-AKT及p-ERK蛋白表达情况。4.采用贝伐珠单克隆抗体处理SKOV3细胞,设置浓度梯度:0（对照组）、50、100、150mg/L,药物处理24h后,用qPCR和Western blot检测各药物浓度组中PDCL3的表达情况。[结果]1.荧光显微镜证实PDCL3 SiRNA慢病毒转染效率己达50%以上。2.琼脂糖凝胶电泳成像图可见28S、18S以及5S完整条带。3.qPCR及Western blot结果显示,PDCL3-SiRNA转染后,PDCL3的mRNA和蛋白表达量明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;PDCL3下调后,VEGFR2 mRNA表达量无明显变化,但其蛋白表达量显着降低,差异具有统计学意义（P<0.05）;VEGF的mRNA和蛋白表达量无明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）,p-AKT、p-ERK蛋白表达量无明显变化,差异无统计学意义（P>0.05）。4.qPCR及Western blot结果显示,贝伐珠单克隆抗体（50、100、150mg/L）作用SKOV3细胞24h后,PDCL3的mRNA和蛋白表达量较对照组显着升高,差异具有统计学意义（P<0.05）。[结论]1.下调PDCL3后,SKOV3细胞中VEGFR2的蛋白表达量显着降低,PDCL3可能在SKOV3细胞中对VEGFR2具有一定的调控作用。2.下调PDCL3后,SKOV3细胞中VEGF、p-AKT以及p-ERK无明显变化。3.一定浓度的贝伐珠单克隆抗体能够增加SKOV3细胞中PDCL3的mRNA和蛋白表达。
陈圆圆[5]（2019）在《HBx诱导BNIP3L依赖性线粒体自噬介导糖酵解代谢重编程调控肝癌细胞干性表型的机制研究》文中进行了进一步梳理原发性肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是常见恶性肿瘤之一,其病死率高居全球第二位。肝癌干细胞（livercancerstemcells,LCSCs）是一小群具有多向分化潜能、自我更新能力和耐药的异质细胞群体,在肝癌耐药和复发过程中发挥重要作用;肝癌发生发展与乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染密切相关。HBV基因组X基因编码的x蛋白（hepatitis B virus x protein,HBx）在HBV的复制和扩散中必不可少,其参与调节宿主细胞基因组稳定性、信号转导和细胞周期等,但在肝致癌过程中由HBx介导的细胞应激反应与肝癌干细胞之间的关系仍有待阐明。线粒体是细胞能量代谢的重要场所,其功能与数量的完整性与细胞结局息息相关;线粒体自噬是降解损伤线粒体,调节线粒体稳态的重要方式之一,但线粒体自噬在能量代谢中的作用尚有待阐明。代谢重编程指细胞在恶性转化过程中代谢模式发生改变,主要涉及到糖酵解、电子传递链、氧化磷酸化和磷酸戊糖途径等诸多方面,已作为肿瘤发生发展的标志之一。然而,线粒体自噬通路与糖酵解代谢重编程的关系、以及参与HBx蛋白介导肝癌细胞癌干性表型转归的作用及其调控机制,尚有待研究。目的:通过建立HBx表达诱导肝癌细胞癌干性表型模型,阐明HBx诱导BNIP3L依赖性线粒体自噬参与糖酵解代谢重编程,介导肝癌细胞癌干性转归;探讨BNIP3L干预对线粒体自噬、糖酵解代谢重编程和癌干性表型的影响。结果为进一步阐明HBx表达诱导肝癌细胞癌干性的调控机制、探讨预防和控制肝癌发生发展的潜在靶点提供依据。方法:（1）GEO分析:采用GEO数据库（GSE83148）,分析HBV慢性感染人群肝组织和正常人群肝组织中干性相关基因、糖酵解相关基因和线粒体自噬相关基因差异水平情况,并分析线粒体自噬相关基因与糖酵解相关基因的相关性。（2）体内实验:pcDNA3.1-HA和pcDNA3.1-HA-HBX质粒转染人肝癌Huh7和MHCC-97H细胞,构建HBx表达的肝癌细胞模型。分别接种于BALB/c裸小鼠右下肢皮下,建立裸鼠移植瘤动物模型。①检测HBx对肿瘤生长的影响:每3天观察原位移植瘤的生长情况。24天后处死裸鼠,剥离移植瘤测量体积及质量后用于以下指标检测:②检测HBx对干性表型的影响:采用qRT-PCR检测干性相关基因（ABCG2,BM1,NANOG,KLF4,OCT4）转录水平;WB检测干性相关蛋白（ABCG2,Oct4,Bmi-1,CD44）表达;IHC检测组织中干性相关蛋白表达情况。③检测HBx对BNIP3L依赖性线粒体自噬的影响:WB检测总蛋白和线粒体蛋白中BNIP3L依赖性线粒体自噬相关蛋白（HIF-1 a,Beclin 1,BNIP3L,LC3B）表达;IHC检测组织中BNIP3L依赖性线粒体自噬相关蛋白表达情况。④检测HBx对糖酵解代谢重编程的影响:采用qRT-PCR检测糖酵解相关基因（SLC2A1,HHK2,PFKL,LDHA）转录水平;化学发光法检测细胞内ATP含量和乳酸分泌量。（3）体外实验:①本研究采用低侧群（side population,SP）细胞比例的人肝癌Huh7细胞株和高SP比例的人肝癌MHCC-97H细胞株,转染pcDNA3.1-HBX（1 μg/mL）构建HBx表达模型,以pcDNA3.1组为对照组,pcDNA3.1-HBX组为HBx表达组。上述两种肝癌细胞处理至终点时,采用qRT-PCR检测干性相关基因、糖酵解相关基因、电子传递链相关基因（ND4L,NDUFA4,ND2,CytB,ATP6,ATP8）以及ACTB等mRNA水平;采用 WB检测干性相关蛋白、线粒体自噬相关蛋白及HBx、Actin等蛋白表达;克隆形成实验和锚着非依赖生长实验检测细胞自我更新能力;Confocal检测BNIP3L和LC3B细胞内表达及与线粒体三者共定位情况和细胞内自噬流;透射电镜观察细胞线粒体自噬现象;流式细胞仪检测SP细胞比例和细胞葡萄糖摄取能力;化学发光法检测细胞内ATP含量和细胞外乳酸分泌量。②两种肝癌细胞瞬时转染pGEM-HBV和pGEM-HBVX null（1 μg/mL）,以pGEM组为对照组,pGEM-HBV组为HBV表达组,pGEM-HBV X null组为HBV表达HBx缺失组,检测癌干性相关指标。③通过球囊培养法富集Huh7细胞中的肝癌干细胞,检测指标同HBx表达组。④采用CCCP（15 μmol/L）预处理Huh7细胞构建线粒体自噬阳性模型;采用BNIP3L小干扰RNA（siBNIP3L）（50 nmol/L）处理MHCC-97H细胞构建线粒体自噬抑制模型,检测癌干性和BNIP3L依赖性线粒体自噬相关指标。⑤两种肝癌细胞采用STF-31和2-DG处理构建糖酵解抑制模型,检测癌干性相关指标。⑥采用HBx表达Huh7细胞瞬时转染pTT5或者pTT5-9Dl 1（200 ng/mL）构建HBx敲低模型,检测癌干性、BNIP3L依赖性线粒体自噬和糖酵解代谢相关指标。结果:（1）GEO分析:筛选获得HBV感染肝组织（n=122）与正常人肝组织（n=6）的GEO数据库GSE83148,分析发现HBV感染肝组织中干性相关基因（BM1,CD44,NANOG,POU5F1）,糖酵解相关基因（HK2,PFKL,ALDOA,PKM2）,自噬相关基因MAP1LC33 mRNA水平显着高于正常人肝组织,且MAP1LC3B与糖酵解相关基因呈显着正相关。（2）体内实验:改造后的Huh7细胞3周成瘤体积约为2-3 cm3,肿瘤表面可见大量血管形成;改造后的MHCC-97H细胞3周成瘤体积约为0.1-0.2cm3,肿瘤表面光滑。与对照组相比,HBx表达组肿瘤体积增长较快,肿瘤质量和体积显着增加。剥离肿瘤组织检测发现,与对照组相比,HBx表达组移植瘤组织中干性相关蛋白和BNIP3L依赖性线粒体自噬相关蛋白表达显着增高,干性相关基因转录水平明显增加。与对照组相比,HBx表达组移植瘤组织中ATP含量下降,乳酸含量和糖酵解相关基因表达水平增高。（3）体外试验:首先,在人肝癌Huh7和MHCC-97H细胞中,①流式细胞仪分析显示分别存在1.25%和16.8%的SP细胞。与MP细胞相比,SP细胞中癌干性相关指标上升。②与对照组相比,HBx表达组两株肝癌细胞中癌干性指标上升,其中SP细胞比例由Huh7中的1.25%和MHCC-97H中的16.8%分别上升到1.73%和24.9%,细胞内BNIP3L依赖性线粒体自噬和糖酵解代谢增强。③与HBV表达组相比,HBV表达HBx缺失组中癌干性相关蛋白表达降低;④与亲本细胞相比,肝癌干细胞中癌干性相关指标上调,BNIP3L依赖性线粒体自噬和糖酵解代谢过程增强。其次,⑤在siBN1P3L构建的线粒体自噬抑制模型中,与HBx表达组相比,HBx+siBNMP3L组中BNIP3L依赖性线粒体自噬被抑制,癌干性表型相关指标降低并且糖酵解代谢被抑制;而在CCCP构建的线粒体自噬阳性模型中观察到了相反的现象。⑥在STF-31干预模型中,与HBx表达组相比,HBx+STF-31组中癌干性表型相关指标降低;在2-DG干预模型中也观察到同样的结果。同时与肝癌干细胞组相比,STF-31或2-DG干预组中肝癌干细胞癌干性表型相关蛋白表达降低。⑦在HBx表达Huh7细胞中,瞬时转染pTT5-9D11构建HBx敲低模型,与HBx表达组相比,HBx敲低表达组中癌干性和BNIP3L依赖性线粒体自噬相关蛋白表达降低,并且由HBx诱导的糖酵解代谢被抑制。结论:建立HBV、HBx表达和HBx敲低肝癌细胞体外试验模型和HBx表达肝癌细胞裸鼠荷瘤体内试验模型,诱导肝癌细胞发生糖酵解代谢重编程,介导肝癌细胞干性表型上调。HBx表达还可诱导肝癌细胞BNIP3L表达和线粒体转位与LC3B交互作用介导线粒体自噬并与糖酵解代谢重编程有关,靶向干预BNIP3L表达可调控HBx表达诱导的肝癌细胞糖酵解代谢重编程和癌干性表型。结果为进一步阐明HBx表达诱导肝癌细胞癌干性的调控机制、探讨预防和控制肝癌发生发展的潜在靶点提供依据。
徐力[6]（2019）在《基于前药策略的纳米药物输送体系的构建及联合达沙替尼治疗肝癌的研究》文中进行了进一步梳理研究背景:肝细胞肝癌（HCC）是死亡率最高的恶性肿瘤之一,因缺乏早期症状或体征,患者就诊时多处于中晚期,错失手术切除根治或肝移植的机会。不可切除肝癌的介入治疗或系统性药物治疗的效果相对不佳,患者预后较差。因此,探索肝癌治疗的新策略对于肝癌患者而言具有十分重大的意义。抗肿瘤纳米药物输送体系的研发是近年来肿瘤治疗研究的热点之一。通过无机材料或高分子有机材料等纳米材料装载抗肿瘤药物,并进行特定靶向基团的修饰,可显着增加抗肿瘤药物在肿瘤部位的富集,减少毒副作用。对抗肿瘤药物进行前药化修饰,能够改善药物与聚合物载体间的相容性,提升纳米药物在血液循环中的稳定性,进一步增加疗效。此外,传统化疗药物与分子靶向药物的联合用药也是肿瘤治疗的重要策略之一,可起到协同增效、减少肿瘤耐药、降低单药剂量并减少毒副作用的效果。研究目的:本研究通过前药策略制备聚乳酸修饰的阿霉素（DOX）前药或7-乙基-10-羟基喜树碱（SN38）前药,分别探索其与DSPE-PEG和PEG-PLA等材料在水中自组装形成纳米粒的能力。利用HCC靶向性多肽SP94对材料进行修饰,并探索载药纳米粒对HCC的靶向能力。探索化疗药物伊立替康/SN38与酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼在HCC中的抗肿瘤效果,研究药物协同增效的可能机制,并验证载SN38前药纳米粒与达沙替尼联用的效果。研究方法:第一部分:本研究将PLA通过酰胺键共价连接至DOX分子上,形成PLA修饰的DOX前药（PLA-DOX）,将HCC靶向多肽SP94通过硫醇-马来酰亚胺偶联反应连接至 DSPE-PEG2000-Mal 上,形成 SP94 修饰的 DSPE-PEG2000（DSPE-PEG2000-SP94）。利用 PLA-DOX 与 DSPE-PEG2000 或 DSPE-PEG2000-SP94在水中自组装形成非靶向性或HCC靶向性的载阿霉素前药纳米粒（nNP-PLA-DOX与tNP-PLA-DOX）,并进行粒径、Zeta电位、电镜观察、药物释放等表征。利用共聚焦激光扫描显微镜和流式细胞术检测细胞对药物的内吞作用。利用CCK-8检测nNP-PLA-DOX与tNP-PLA-DOX对不同HCC细胞株的作用,并利用EdU染色验证纳米药物对HCC增殖能力的影响。最终在裸鼠皮下移植瘤模型与活体成像实验中验证不同载药纳米粒的抗肿瘤效果与肿瘤靶向性。第二部分:本研究利用SRB法检测SN38与达沙替尼对不同HCC细胞的作用,并利用克隆形成实验研究不同药物对HCC细胞增殖能力的影响。利用Annexin V-FITC/PI染色结合流式细胞术检测SN38与达沙替尼作用下的细胞凋亡情况,利用DAPI染色观察细胞核的形态,并通过WB检测细胞凋亡相关蛋白c-PARP和c-caspase-3等。利用JC-1染料结合流式细胞术检测线粒体膜电位的变化,并通过WB检测凋亡线粒体途径相关蛋白Bcl-2和Bax等。利用qRT-PCR和WB检测SN38作用后PLK1的mRNA和蛋白水平的变化,并利用PLK1 siRNA和PLK1质粒转染探究PLK1与SN38药效间的关系。利用溶酶体抑制剂氯喹（CQ）、蛋白酶体抑制剂MG132和蛋白合成抑制剂CHX探究两药联用对PLK1抑制的作用机制。最终在裸鼠皮下移植瘤模型中验证伊立替康与达沙替尼两药联用的抗肿瘤效果。第三部分:本研究将PLA通过酯键共价连接至SN38分子上,形成聚乳酸修饰的SN38前药（PLA-SN38）。利用PLA-SN38与PEG5000-PLA8000在水中自组装形成载SN38前药纳米粒（NP-PLA-SN38）,并进行粒径、Zeta电位、电镜观察、药物释放等表征。利用CCK-8检测NP-PLA-SN38对不同HCC细胞株的作用。在BEL-7402细胞的裸鼠皮下移植瘤模型中比较NP-PLA-SN38与伊立替康对HCC的作用,并在HCC的PDX模型在中验证NP-PLA-SN38与达沙替尼两药联用的抗肿瘤效果。研究结果:第一部分:PLA-DOX 与 DSPE-PEG2000 或 DSPE-PEG2000-SP94 可在水中自组装形成非靶向性或靶向性纳米粒（nNP-PLA-DOX与tNP-PLA-DOX）,水合粒径分别为 122.6±3.8 nm 与 75.3±9.6 nm,Zeta 电位分别为-14.83±0.61 mV 与-3.10±1.51 mV,并经 TEM 和 SEM 观察摄片。nNP-PLA-DOX 与 tNP-PLA-DOX 在 37℃pH 7.4的条件下有明显缓释特性,在20天的药物释放量分别为30.09±2.53%和32.55±0.48%。共聚焦激光显微镜和流式细胞术检测显示HCC细胞对tNP-PLA-DOX的内吞作用要明显强于nNP-PLA-DOX,而在正常肝细胞或肺癌细胞中无此现象。CCK8检测的结果显示tNP-PLA-DOX在HCC-LM3和BEL-7402细胞中的IC50分别为6.571±0.855 μM和3.729±0.702 μM,显着低于nNP-PLA-DOX 的 9.283±0.422 μM 和 6.921±0.841 μM,但是体外毒性均不如游离DOX。EdU染色提示tNP-PLA-DOX对于HCC细胞的抗增殖能力要强于nNP-PLA-DOX。在HCC-LM3细胞的裸鼠皮下移植瘤模型中,活体成像与离体成像实验提示tNP-PLA-DOX对肿瘤组织的靶向能力要显着强于nNP-PLA-DOX,体内抗肿瘤药效实验显示NP-PLA-DOX的体内抗肿瘤效果要显着优于游离DOX,且毒性更低,其中,tNP-PLA-DOX 的效果要优于 nNP-PLA-DOX（tNP-PLA-DOX、nNP-PLA-DOX、游离 DOX 的抑瘤率,72.83%vs 57.29%vs 31.70%）。第二部分:SN38与达沙替尼在BEL-7402和HepG-2细胞中的合用指数（CI）均小于0.4,展现出了强协同效果。克隆形成实验证明了两药联用可显着增强SN38或达沙替尼对于细胞增殖的抑制作用。Annexin-V/PI结合流式细胞术检测结果显示达沙替尼可增强SN38的致凋亡作用,DPAI染色也可发现两药联用下典型凋亡细胞的比例增加。WB结果显示两药联用后细胞凋亡相关蛋白c-PARP和c-caspase-3的蛋白水平显着上升,凋亡线粒体途径相关抑凋亡蛋白Bcl-2蛋白水平下降而促凋亡蛋白Bax蛋白水平上升。JC-1染色结合流式细胞术检测结果显示两药联用可促进线粒体膜电位水平的下降。SN38作用后细胞PLK1的mRNA和蛋白水平有所下降,两药联用可进一步抑制PLK1,沉默PLK1可导致c-PARP蛋白水平的升高,而过表达PLK1则会减少SN38作用下的c-PARP升高。CQ和MG132预处理无法逆转两药联用所致的PLK1蛋白水平下降,而CHX处理与两药联用所致的PLK1抑制水平在蛋白质层面相仿,提示两药联用通过抑制蛋白质合成抑制PLK1。在HepG-2细胞的裸鼠皮下移植瘤模型中,伊立替康与达沙替尼两药联用的抗肿瘤效果要显着优伊立替康或达沙替尼两药单用（两药联用、伊立替康单用、达沙替尼单用的抑瘤率,49.67%vs 10.70%vs 14.56%）,且无明显毒副作用。第三部分:PLA-SN38与PEGs000-PLA8000可在水中自组装形成纳米粒（NP-PLA-SN38）,水合粒径与Zeta电位分别分别为50.9±0.243 nm与-0.015±0.862 mV,并经TEM观察摄片。NP-PLA-SN38在37℃ pH 7.4的条件下有一定的缓释特性,在10天的药物释放量51.22±6.56%。CCK8检测的结果显示NP-PLA-SN38 在 HCC-LM3 和 BEL-7402 细胞中的 IC50 分别为 15.08±2.396 和1.663±0.219 μM,接近游离SN38。在BEL-7402细胞的裸鼠皮下移植瘤模型中,抗肿瘤药效实验显示NP-PLA-SN38的体内抗肿瘤效果要显着优于游离SN38（NP-PLA-SN38、游离 SN38 的抑瘤率,83.04%vs 50.96%）,且毒性更低。在 HCC的裸鼠PDX模型中,还进一步验证了 NP-PLA-DOX与达沙替尼联用的体内抗肿瘤效果（抑瘤率86.86%）,要显着优于游离SN38与达沙替尼联用（抑瘤率54.19%）。结论:本研究构建了 一种基于前药策略的HCC靶向性纳米药物输送体系,SP94修饰可明显提升载阿霉素前药纳米粒的HCC靶向能力,增加阿霉素在肿瘤部位的富集,增强抗肿瘤效果并降低毒副作用。此外,本研究还发现伊立替康/SN38与达沙替尼联合用药可通过抑制PLK1的蛋白合成起到协同抗肿瘤效果,利用相同前药策略构建的载SN38前药纳米粒与达沙替尼联合应用可进一步加强抗肿瘤效果。
贺源[7]（2017）在《新型小分子化合物YQ456靶向Myoferlin抑制结肠癌的功能和机制研究》文中认为结直肠癌是全球第三大癌症,也是最为常见的消化道恶性肿瘤。由于人们生活饮食结构的变化以及人口老龄化现象加剧,结直肠癌的发病率和死亡率始终居高不下。据统计90%以上的结直肠癌患者死亡是由肿瘤转移所致。目前,结直肠癌的临床用药多为细胞毒性药物,和血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF）和表皮生长因子受体（Epithelial growth factor receptor,EGFR）的抗体靶向药物。但根据临床治疗反馈,它们都只部分缓解了结直肠癌的进展,治疗收益有限。究其原因主要是现有临床药物不能有效抑制晚期结直肠癌的转移。Myoferlin（MYOF）是近年新发现的一个通过调控膜泡运输促进肿瘤生长和转移的蛋白,其高表达与癌症恶性程度增加和患者生存期降低密切相关。因此,靶向MYOF是一种潜在的治疗晚期转移性结肠癌的新策略。本研究中,我们构建了靶向MYOF-C2D结构域的筛选模型,综合评价300多个小分子化合物的抗癌生物活性、MYOF亲和力和化学构象,得到靶向MYOF-C2D结构域的新型小分子化合物YQ456。在细胞水平上,YQ456选择性抑制MYOF高表达的结肠癌细胞转移。动物实验表明YQ456阻碍血管新生抑制结肠癌的肿瘤生长和肝转移。机制研究发现YQ456靶向MYOF逆转上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）降低结肠癌细胞的侵袭和迁移能力,抑制结肠癌细胞分泌基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinases,MMPs）降解细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）。此外,YQ456干扰MYOF定位到次级内体中,使之无法发挥正常的分选功能,进而调控受体酪氨酸激酶（Receptortyrosine kinase,RTK）信号通路,抑制结肠癌的生长和转移。综上所述,新型小分子化合物YQ456有望成为直接靶向MYOF治疗晚期转移性结肠癌的潜在候选药物。
蒋杞英[8]（2012）在《Hsf1在SV40T抗原引起细胞恶性转化中的作用及分子机制》文中提出背景热休克转录因子1（heat shock transcription factor1, Hsfl）是热休克因子家族中的成员之一,热休克家族成员包括Hsfl,Hsf2, Hsf3和Hsf4。这个家族成员具有保守的DNA结合结构域,能够识别并且与位于靶基因启动子区域的热休克元件（heatshockelement, HSE）结合。Hsfl是热休克反应的主要调控者,在热休克或其他应激条件下,失活的Hsfl高度磷酸化,Hsfl被激活并移位至细胞核,转变成三聚体与HSE结合,可刺激热休克蛋白（Heat shock proteins, HSPs）的转录。Hsfl介导的热休克反应不仅保护细胞免受环境或细胞内应激引起的损伤,而且涉及到对许多病理过程的调节,如炎症和肿瘤的形成。众多研究表明,在肿瘤形成和发展的调节过程中,Hsfl起了非常重要的作用,例如,Hsfl和其相关的下游靶蛋白（如HSPs）在大多数癌组织中是增高的。Hsfl敲除能够抑制DMBA诱导的皮肤癌、p53突变诱导的淋巴瘤和DEN诱导的肝细胞癌,抑制HSP90分子伴侣的活性能够诱导肿瘤细胞的凋亡。这些证据表明,Hsfl和其调节的热休克反应能够稳定快速增殖的肿瘤细胞。虽然,已经发现Hsfl与p53和Ras癌基因诱导的肿瘤形成有关,而Hsfl在病毒性癌基因诱导形成肿瘤中的作用还不清楚。SV40是双链的DNA肿瘤病毒,已经从HIV阳性的非何杰金氏淋巴瘤病人组织中分离出来。SV40能够表达两种早期的癌蛋白小t抗原（t-antigen, t-ag）和大T抗原（T-antigen, T-ag）, T-ag通常被用作转基因肿瘤鼠模型和用于转化细胞的体外研究。T-ag通过与p53和Rb相互作用和灭活肿瘤抑制因子p53和Rb的活性,能够使很多种细胞发生转化。本课题中我们研究Hsf1在SV40T-ag转化鼠胚胎成纤维细胞中的作用。结果发现SV40T-ag转化的WT/MEF细胞,MEF/Hsfl-/-细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl（重新构建的Hsf1导入MEF/Hsfl-/-细胞）在裸鼠能够形成成纤维细胞瘤,但是MEF/Hsfl-/-细胞和裸鼠肿瘤的生长明显比WT/MEF细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞慢。结果表明,Hsfl参与了刺激SV40T-ag转化细胞的增生。进一步研究表明,Hsfl缺失导致p53和Rb蛋白的蓄积,这可能与MEF/Hsfl-/-细胞生长的慢有关。我们的研究结果证实了Hsfl涉及SV40T-ag诱导肿瘤形成的调控,而SV40T-ag引起肿瘤的形成是通过调控p53和pRb蛋白的表达。目的1.观察Hsfl表达的缺失在SV40T-ag诱导肿瘤形成中的作用。2.探讨Hsfl能够刺激SV40T-ag引起肿瘤的形成,是否通过调控p53和pRb蛋白的表达引起。方法1.质粒的构建：鼠Hsfl的cDNA与N末端的Flag-tag在EcoRI亚克隆到逆转录病毒载体pWZL-blast,形成重组质粒pWZL-blast-Flag-hsfl,重建MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞系。质粒pWZL-blast-Flag-hsfl瞬时转染293Phoenix细胞,转染后48小时,收集含有病毒颗粒的上清,感染SV40T-ag转化的MEF/Hsfl-/-细胞。选用含3ug/ml的blasticitidine（?）勺培养基培养细胞3-4天,Hsfl重新进入MEF/Hsfl-/-细胞,建成MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞系。将人Hsfl的shRNA构建到逆转录病毒载体pLTHR,形成pLTHR-shRNA-Hsfl,shRNA瞬时转染进入H1299和HEK293T细胞,沉默Hsfl基因的表达。2.通过体外细胞克隆形成实验,MTT实验,流式细胞术,裸鼠皮下移植瘤实验分析SV40T-ag转化的WT/MEF细胞,MEF/Hsfl-/-细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞的增殖和肿瘤的形成。3.用免疫组织化学的方法检测VEGF.CD34和FⅧ.RAg在WT/MEF细胞,MEF/Hsfl-/-细胞和MEF/Hsfl-/-Hsfl细胞形成移植瘤组织中的表达,判断Hsfl在肿瘤血管形成中是否有作用。4.通过免疫印迹实验,用合适的抗体研究Hsfl,SV40T-ag,p53,pRb,HSP90, HSP70,HSP25等蛋白的表达；通过免疫共沉淀实验观察SV40T-ag与HSP70,pRb或p53的相互作用。结果1.重建MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞系为了避免WT/MEF细胞和MEF/Hsfl-/-细胞之间同胎仔畜的差异,我们用逆转录病毒表达鼠Hsfl全长的cDNA感染MEF/Hsfl-/-细胞,重建MEF/Hsfl-/-/sfl细胞系。通过western blot实验,结果证实Flag-Hsfl在MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞中有表达,在WT/MEF细胞中出现内源性Hsfl的表达,而在MEF/Hsfl-/-细胞中没有Hsfl的表达。2.Hsfl的缺失抑制MEF/Hsfl-/-细胞的增生通过MTT实验和细胞克隆形成实验,观察WT/MEF细胞、MEF/Hsfl-/-细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞三种细胞的增殖情况。我们的实验结果证明,MEF/Hsfl-/-细胞明显比WT/MEF细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞生长的慢（T test,P<0.05）, WT/MEF细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞之间没有明显差异（T test,P＞0.05）.细胞克隆实验结果证实,MEF/Hsnfl-/-细胞形成的克隆明显比WT/MEF细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞少（t-test,P<0.001）。此外,通过流式细胞术,我们分析这三种细胞系的细胞周期,发现在G0/G1期,WT/MEF细胞和MEF/Hsfl-/-Hsfl细胞的百分数明显低于MEF/Hsfl-/-细胞（T test,P<0.01）:但是,在S期和G2/M期,WT/MEF细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞的百分数明显高于MEF/Hsfl-/-细胞（T test. P<0.05）。我们的实验结果证实,Hsfl参与了调控SV40T-ag转化的MEF细胞的增殖。3.Hsfl的缺失能够抑制MEF细胞形成裸鼠成纤维细胞瘤的生长为了探讨Hsfl在肿瘤形成中是否有作用,将三种MEF细胞系接种到裸鼠皮下。在接种裸鼠26天后,三种MEF细胞系都能形成肿瘤。然而,WT/MEF细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞移植瘤的生长明显比MEF/Hsfl-/-细胞快；WT/MEF细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞移植瘤的重量和体积明显比MEF/Hsfl-/-细胞重和体积大（Ttest,P<0.05）.在WT/MEF细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞接种移植瘤的裸鼠中出现肺转移灶,而MEF/Hsfl-/-细胞形成肿瘤的裸鼠中没有发现肺转移。然而,VEGF. CD34和FⅧ.RAg在WT/MEF细胞和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞形成瘤组织中的表达明显多于MEF/Hsfl-/-细胞形成的肿瘤（T test,P<0.05）.所有这些结果证明,Hsfl对SV40T-ag诱导的肿瘤的生长和转移具有调控作用,但是对肿瘤的起始没有作用。4. Hsfl与p53和Rb蛋白的表达有关SV40T-ag转化细胞是通过SV40T-ag与p53和pRb的结合,灭活p53和pRb的活性。由于Hsfl的缺失能够抑制SV40T-ag转化细胞的生长,导致细胞周期阻止在G1/G0期。因此,我们推测Hsfl可能与p53和Rb信号通路有关。我们的western blotting实验结果显示,与WT/MEF和MEF/Hsfl-/-/THsfl细胞及裸鼠瘤组织相比,在MEF/Hsfl-/-细胞和裸鼠瘤组织中Rb,p53,p21,HSP25和SV40T-ag的表达是上调的（T test,P<0.05）;但是,在三种MEF细胞和肿瘤组织中Hsp70, hsp90和Hsc70的表达没有变化（T test,P>0.05）。为了探讨Hsfl对p53和Rb的调控作用,我们用shRNA技术沉默HEK293T细胞中Hsfl的表达,HEK293T细胞表达SV40T-ag,结果显示,沉默Hsfl的HEK293T细胞出现p53,pRb和SV40T-ag蛋白表达的上调（T test,P<0.05）。结果显示,Hsfl涉及调控p53, pRb和SV40T-ag蛋白的表达。为了研究p53, pRb和SV40T-ag之间的相关性,我们瞬时转染shRNA-Hsfl和SV40T-ag进入H1299细胞,H1299细胞是p53阴性的细胞,这对于研究Hsfl对Rb和SV40T-ag的作用更加方便。我们的结果显示,沉默Hsfl的H1299细胞导致Rb和SV40T-ag蛋白的表达上调（T test,P<0.05）。上述结果显示,Hsfl具有调控p53和pRb蛋白的表达。SV40T-ag是一种能够与p53和pRb结合引起细胞转化的癌蛋白。在Hsfl缺失细胞中p53, pRb和SV40T-ag皆上调,提示这三种蛋白之间的相互作用存在着某些错误。我们的免疫共沉淀实验结果显示,与转染scramble shRNA的HEK293T细胞相比,在Hsfl沉默的HEK293T细胞中SV40T-ag和p53,SV40T-ag和pRb之间的相互作用弱。总之,我们的研究结果显示,Hsfl缺失能够调控p53,Rb和SV40T-ag蛋白的表达,破坏SV40T-ag与p53或pRb的相互作用,抑制细胞的增殖。结论1.重新构建pWZL-blast-Flag-Hsfl和MEF/Hsfl-/-/Hsfl细胞系,有助于搞清楚Hsfl在SV40T-ag诱导肿瘤形成中的作用。2. Hsfl表达的缺失不能阻断SV40T-ag转化细胞形成肿瘤,但是可以抑制肿瘤的生长。3. Hsfl的缺失引起肿瘤组织中血管生成的减少,上调p53, pRb和SV40T-ag蛋白的表达,破坏SV40T-ag与p53或pRB蛋白的结合,结果抑制了SV40T-ag转化细胞和肿瘤的生长。
陈清江[9]（2011）在《Nanog在食管癌中的表达及意义》文中研究说明食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,在我国尤以河北、河南、粤东沿海等地区高发,具有发病率高、治愈率差和死亡率高等特点。目前食管癌的主要治疗方法有手术、化疗和放疗等,虽然近年来随着诊疗技术的提高和治疗方法的不断改进,食管癌病人的生存率及功能恢复率大为提高,但是疗效仍不尽人意。因此对食管癌的发生机制、诊断和防治研究仍是当前肿瘤学科的热点课题。肿瘤是一种基因病,是长期的、多步骤、多阶段、多种基因突变积累的结果。肿瘤恶性生物学行为包括细胞增殖和凋亡失衡、新生血管的形成及肿瘤细胞的侵袭和转移等。另外肿瘤细胞的无限制增殖能力和演进能力与干细胞的自我更新能力和多能性分化极其类似,这些特点提示肿瘤细胞中可能会存在某些类似胚胎干细胞调控自我更新的关键基因的异常表达,从而引起单克隆肿瘤细胞的无限制增殖。干细胞自我更新能力和多能性分化能力的维持是以Nanog、OCT-4和SOX2等转录因子和PI3K、Wnt和STAT3等信号通路为主构成的复杂网络来调控的。Nanog是调控、维持调控干细胞自我更新能力网络中的主要成员,也是与OCT-4平行的另一条重要的分子调控途径。近年来的研究发现Nanog基因不仅参与胚胎发育过程自我更新能力的调节,而且在胚胎性癌、精原细胞瘤等恶性生殖细胞肿瘤中也异常表达,随着研究的发展人们在肺癌、胃癌等一些实体瘤内也检测到了Nanog的异常表达且与肿瘤的发生发展密切相关。然而有关Nanog在食管癌中的表达及其与食管癌关系的研究,迄今国内外未鲜见文献报道。为探讨Nanog在食管鳞癌组织中的表达情况及其与食管癌临床病理因索之间的关系,评价Nanog和MDR1之间的关系并分析Nanog的表达水平对人食管癌细胞生物学行为的影响。本研究检测了食管癌组织、癌旁正常组织中Nanog的表达情况,探讨了Nanog与食管癌恶性生物学行为的关系。并构建了携带Nanog mRNA编码区全长cDNA序列和siRNA序列的真核表达载体来研究Nanog对食管癌9706细胞增殖、克隆、侵袭及药物敏感性等恶性生物学行为的影响；通过裸鼠移植瘤实验进行体内试验,从多个方面深入探讨Nanog对食管癌9706细胞的影响,试图阐明Nanog的表达在食管癌发生、发展中的意义。为使Nanog早日应用于食管癌临床诊断和治疗提供一定的理论依据。本实验研究共分以下4章。第一章：Nanog在食管癌组织中的表达及意义方法采用免疫组织化学、Real-time PCRf和Western的方法检测79例食管癌组织和23例癌旁正常组织组织之中Nanog和MDR1的表达情况。结果食管癌组织Nanog和MDR1阳性表达高于癌旁正常组织,两种食管组织表达差异有统计学意义（P<0.05）; Nanog阳性表达率与食管癌患者病理分级和淋巴结转移有关（P<0.05）; MDR1阳性表达率与食管癌患者病理分级和淋巴结转移有关（P<0.05）,且食管癌组织中Nanog和MDR1的表达相互之间呈明显的正相关（P<0.05）。第二章：Nanog对食管癌9706细胞生物学行为的影响及机制研究方法1.构建携带人Nanog mRNA编码区全长cDNA序列和特异性siRNA序列的真核表达质粒载体,转染并筛选出阳性稳定转染细胞克隆。2.采用MTT和平板克隆法测定Nanog对9706细胞增殖和克隆能力。3.采用流式细胞术（FCM）测定Nanog对9706细胞周期和凋亡的情况。4.采用侵袭小室和凝胶没谱实验检测Nanog对9706细胞侵袭能力和明胶酶活性的影响。结果1. pcDNA3.1-Nanog和pSUPER-EGFP-Nanog真核表达载体构建及转染9706细胞成功。2.MTT和平板克隆实验结果显示：与对照组相比,pcDNA3.I和pSUPER-EGFP组细胞增殖和克隆能力无明显差异（P>0.05）,pcDNA3.1-Nanog-3组细胞增殖和克隆能力明显增强（P<0.01）,而pSUPER-EGFP-Nanog-b组细胞增殖和克隆能力明显减弱（P<0.01）。3.FCM结果显示：与对照组相比,pcDNA3.1和pSUPER-EGFP空质粒组各周期细胞比例无明显差异（P>0.05）; pcDNA3.1-Nanog-3组Go/G1期细胞比例明显减少（P<0.01）,S和G2/M期细胞比例升高（P<0.05）, pSUPER-EGFP-Nanog-b组Go/G1期细胞比例明显升高（P<0.01）,S和G2/M期细胞比例减少（P<0.05）,同时与各组相比其凋亡率增加。4.侵袭小室和凝胶酶谱实验：与对照组相比,pcDNA3.1和pSUPER-EGFP组侵袭能力和明胶酶活性无明显差异（P>0.05）, pcDNA3.1-Nanog-3组细胞侵袭能力和明胶酶活性升高,而在pSUPER-EGFP-Nanog-b组降低（P<0.01）。第三章：Nanog对食管癌9706细胞药物敏感性的影响及机制研究方法1.采用MTT方法检测顺铂对人食管癌各组9706细胞增殖的影响并计算抑制率。2.采用FCM检测顺铂对人食管癌各组9706细胞周期和凋亡率的影响。3.采用Real-time PCR和Western方法检测Nanog对970细胞MDRlmRNA和蛋白表达水平的影响结果：1.MTT结果显示：Nanog可以对抗顺铂诱导的9706细胞的增殖抑制作用,减弱顺铂药物毒性（P<0.01）。2.FCM结果显示：Nanog可以对抗顺铂诱导的9706细胞细胞G0/G1期周期阻滞和凋亡作用（P<0.01）。3. Real-time PCR和Western blot结果显示：与对照组相比,pcDNA3.1和pSUPER-EGFP组细胞MDR1表达水平无明显差异（P>0.05）, pcDNA3.1-Nanog-3组升高,而在pSUPER-EGFP-Nanog-b组降低（P<0.01）。第四章：Nanog对食管癌9706细胞裸鼠移植瘤影响的研究方法1.建立人食管癌裸鼠移植瘤模型。分为对照组、pcDNA3.1-Nanog-3组和pSUPER-EGFP-Nanog-b组。每周测量瘤体大小并绘制肿瘤体积生长曲线。治疗终止时处死小鼠,剥除肿瘤称重,计算抑廇率。2.采用TUNEL法检测各组裸鼠移植瘤组织中肿瘤细胞凋亡情况,统计细胞凋亡指数（AI）。3.采用Real-time PCR和Western方法检测各组裸鼠移植瘤组织中Nanog和MDR1表达情况。结果1. pcDNA3.1-Nanog-3组裸鼠移植瘤体积和重量显着大于对照组,组间比较差异具有统计学意义（P<0.05）; pSUPER-EGFP-Nanog-b组裸鼠移植瘤体积和重量显着小于对照组,组间比较差异具有统计学意义（P<0.05）。2. TUNEL结果显示pSUPER-EGFP-Nanog-b组裸鼠移植瘤组织中细胞凋亡指数明显多于对照组,组间比较差异具有统计学意义（P<0.01）。3. pcDNA3.1-Nanog-3组裸鼠移植瘤Nanog和MDR1 mRNA和蛋白表达显着高于对照组,组间比较差异具有统计学意义（P<0.01）; pSUPER-EGFP-Nanog-b组显着低于对照组,组间比较差异具有统计学意义（P<0.01）。结论1. Nanog在食管癌组织中高表达,与食管癌的病理分级和淋巴结转移密切相关,与MDR1的表达相互之间呈明显的正相关。2. Nanog促进食管癌9706细胞的增殖、克隆和侵袭及耐药能力,当抑制其表达时会导致细胞增殖、克隆和侵袭及耐药能力的减弱,阻滞细胞于G0/G1期,诱导凋亡；其机制与调控MPP-2和MPP-9分泌及MDR1表达密切相关。3.裸鼠移植瘤模型体内试验与体外实验结果相似,Nanog可以促进移植瘤的增殖并调控MDR1的表达来参与肿瘤的发生、发展。
刘洁琼[10]（2011）在《PDGF-D在乳腺癌进展、转移及化疗药物运输中的作用和机制研究》文中进行了进一步梳理第一章PDGF-D在乳腺癌组织中的表达研究及过表达PDGF-D乳腺癌细胞株的建立目的：检测乳腺癌组织及各种乳腺癌细胞株中PDGF-D（血小板源生长因子-D）的表达情况及建立过表达PDGF-D的乳腺癌细胞株。方法：应用免疫组织化学染色方法检测乳腺良恶性肿瘤组织阵列切片中的PDGF-D表达水平；运用RT-PCR方法检测各种人类乳腺癌细胞株中PDGF-D和PDGFRβ的mRNA表达情况；体外克隆出人全长PDGF-D cDNA并转染至人乳腺癌细胞株MDA-MB-231中,应用RT-PCR和蛋白质印迹确定其稳定过表达。结果：PDGF-D在正常乳腺组织及良性乳腺肿瘤中不表达或低表达,在乳腺癌组织中高表达。单因素相关性分析表明PDGF-D与孕激素受体及HER-2表达正相关（P<0.01）。RT-PCR结果显示MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT474四种人类乳腺癌细胞株中均表达PDGF-D和PDGFRP。RT-PCR及蛋白质印迹确定了克隆的PDGF-D在MDA-MB-231细胞中的稳定过表达,并证实过表达PDGF-D能激活PDGFRP信号通路系统。结论：PDGF-D在乳腺癌组织和细胞株中高表达；在乳腺癌MDA-MB-231细胞株中过表达PDGF-D能激活其PDGFRβ使其发挥生物学功能。第二章PDGF-D对乳腺癌生长和转移的作用及其机制研究目的：确定PDGF-D在乳腺癌生长和转移中的作用及其作用机制。方法：建立过表达PDGF-D及下调表达PDGF-D乳腺癌动物模型,应用活体荧光成像仪追踪肿瘤生长及淋巴结转移情况；应用PDGF受体阻断剂格列卫处理231和231-PDGFD带瘤裸鼠而确定两种肿瘤的生长抑制情况。利用免疫荧光染色检测肿瘤细胞增生和凋亡和肿瘤组织CXCR4表达情况,运用蛋白质印迹检测肿瘤的MAPK和Akt信号通路的活化情况。利用CXCR4阻断剂研究PDGF-D作用机制。结果：过表达PDGF-D促进乳腺癌生长和淋巴结转移,而下调PDGF-D抑制乳腺癌生长及淋巴结转移；药物阻断PDGF-D能明显抑制231-PDGFD肿瘤生长,但对231肿瘤生长无影响。PDGF-D通过MAPK和Akt通路而促进肿瘤细胞增生及抑制细胞凋亡,PDGF-D通过激活SDF-1α/CXCR4趋化因子通路而促进淋巴结转移。结论：PDGF-D能促进乳腺癌生长和淋巴结转移,其机制可能是激活MAPK和Akt通路促进癌细胞增生和抑制细胞凋亡,及活化SDF-1α/CXCR4趋化因子通路。第三章PDGF-D对化疗药物运输的影响及其机制目的：确定PDGF-D在乳腺癌裸鼠模型中对化疗药物运输的影响。方法：运用免疫荧光双染检测肿瘤血管的血管旁细胞覆盖率；建立乳腺癌肿瘤窗口模型,从而应用多光子激光扫描显微镜分析肿瘤血管的形态及直径。应用荧光阿霉素及FITC标记的凝集素研究阿霉素在肿瘤中的运输情况及化疗效果。结果：231-PDGFD肿瘤的血管旁细胞覆盖率明显高于231肿瘤,多光子激光扫描显微血管图像显示231肿瘤血管形态是典型的不正常增粗及曲折的血管,而231-PDGFD肿瘤的血管直径减小,形态趋向正常血管。阿霉素渗透实验显示其在231-PDGFD肿瘤中的血管渗透性更强。且阿霉素能更有效地抑制231-PDGFD肿瘤生长及淋巴结转移。结论：PDGF-D能使裸鼠原位乳腺癌动物模型的肿瘤血管正常化,并有效促进化疗药物在肿瘤中的运输及疗效。
二、转染血小板第四因子氨基末端改构体cDNA抑制裸鼠实体肿瘤生长的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转染血小板第四因子氨基末端改构体cDNA抑制裸鼠实体肿瘤生长的研究（论文提纲范文）
（1）阳离子PCL-b-P（GMA-EA）载体递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 基因治疗载体的研究进展 |
| 1.1.1 病毒载体 |
| 1.1.2 细菌载体 |
| 1.1.3 人工合成载体 |
| 1.1.4 结语与展望 |
| 1.2 神经母细胞瘤 |
| 1.2.1 神经母细胞瘤的发生及流行病学 |
| 1.2.2 神经母细胞瘤分子生物学特征及动物研究模型 |
| 1.2.3 神经母细胞瘤的临床表现及分期分层 |
| 1.2.4 神经母细胞瘤的治疗 |
| 1.2.5 结语与展望 |
| 1.3 GRIM-19的研究进展 |
| 1.3.1 GRIM-19的发现、结构及分布 |
| 1.3.2 GRIM-19的突变及下调与恶性肿瘤的关系 |
| 1.3.3 GRIM-19的功能 |
| 1.3.4 结语与展望 |
| 第2章 实验部分 |
| 2.1 PCG阳离子聚合物的合成及转染肿瘤细胞的检测 |
| 2.1.1 前言 |
| 2.1.2 材料和方法 |
| 2.1.3 实验结果 |
| 2.1.4 讨论 |
| 2.1.5 小结 |
| 2.2 GRIM-19蛋白在神经母细胞瘤组织中的表达 |
| 2.2.1 前言 |
| 2.2.2 材料和方法 |
| 2.2.3 实验结果 |
| 2.2.4 讨论 |
| 2.2.5 小结 |
| 2.3 阳离子聚合物递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的作用及机制研究 |
| 2.3.1 前言 |
| 2.3.2 材料和方法 |
| 2.3.3 实验结果 |
| 2.3.4 讨论 |
| 2.3.5 小结 |
| 第3章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 研究背景 |
| 1.2.1 细胞凋亡与肿瘤治疗 |
| 1.2.2 可变剪接与肿瘤治疗 |
| 1.2.3 凋亡因子Mcl-1可变剪接与肿瘤 |
| 1.2.4 空间阻滞寡核苷酸应用现状 |
| 1.2.5 小结 |
| 1.3 主要研究内容与研究方案 |
| 1.4 研究意义 |
| 第二章 Mcl-1可变剪接与胃癌的相关性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 实验仪器和设备 |
| 2.2.2 主要实验试剂 |
| 2.2.3 实验对象 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.2.5 统计方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 Mcl-1表达与胃癌的相关性 |
| 2.3.2 Mcl-1 可变剪接异构体mRNA在胃癌组织中的表达 |
| 2.3.3 Mcl-1S和 Mcl-1L mRNA表达与胃癌临床进展的相关性 |
| 2.3.4 胃癌组织Mcl-1L与 Mcl-1S表达的蛋白水平验证 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 SBOs调控Mcl-1 可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 实验仪器和设备 |
| 3.2.2 主要实验试剂 |
| 3.2.3 实验对象 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 胃癌细胞株 Mcl-1L 及 Mcl-1S 基础表达 |
| 3.3.2 空间阻滞寡合苷酸(SBOs)转染效率评价 |
| 3.3.3 SBOs 对 Mcl-1L 及 Mcl-1S 表达的调控作用 |
| 3.3.4 SBOs对胃癌细胞凋亡的诱导作用 |
| 3.3.5 SBOs对胃癌细胞增殖的抑制作用 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 SBOs调控Mcl-1 可变剪接诱导凋亡的体内实验研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 实验仪器和设备 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.2.3 研究对象 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.3 研究结果 |
| 4.3.1 SBOs对裸鼠的毒性反应 |
| 4.3.2 SBOs 治疗对移植瘤体 Mcl-1L 及 Mcl-1S 表达的调控作用 |
| 4.3.3 SBOs 治疗对移植瘤体细胞凋亡的诱导作用 |
| 4.3.4 SBOs 对移植瘤增殖生长的抑制作用 |
| 4.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）TBL1XR1调控人胰腺癌肿瘤细胞增殖作用机制及其临床意义的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 第一部分 TBLIXR1在胰腺导管腺癌中异常表达及其临床意义 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计分析 |
| 结果 |
| 1.1 收集46例胰腺导管内腺癌患者临床手术样本及对应临床病例信息 |
| 1.2 TBL1XR1在46例胰腺导管内腺癌患者组织样本中的表达量 |
| 1.3 TBL1XR1表达水平与胰腺导管内腺癌患者临床及病理特征的相关关系 |
| 1.4 TBL1XR1表达水平与胰腺导管内腺癌患者预后生存状况的相关关系 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 TBL1XR1调控胰腺癌肿瘤细胞体外增殖凋亡和体内成瘤能力的研究 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 1 实验试剂与耗材 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计分析 |
| 结果 |
| 1.1 TBL1XR1在胰腺癌细胞系中的表达水平 |
| 1.2 利用siRNA或shRNA和质粒载体转染对TBL1XR1敲减及过表达验证 |
| 1.3 TBL1XR1促进胰腺癌细胞体外增殖及克隆形成 |
| 1.4 TBL1XR1影响胰腺癌细胞周期进程 |
| 1.5 TBL1XR1抑制胰腺癌细胞凋亡 |
| 1.6 TBL1XR1促进胰腺癌细胞体内成瘤及增殖 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 TBL1XR1通过激活PI3K信号通路促进胰腺导管腺癌发生发展 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.试剂和材料 |
| 2 方法 |
| 3 统计分析 |
| 结果 |
| 1.1 TBL1XR1对胰腺癌细胞的细胞周期相关蛋白的影响 |
| 1.2 TBL1XR1对胰腺癌细胞的细胞凋亡相关蛋白的影响 |
| 1.3 TBL1XR1通过激活PI3K通路调节细胞增殖相关生物学功能 |
| 1.4 PI3K通路抑制剂LY294002能够有效回复TBL1XRl促胰腺癌细胞增殖功能的作用 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 胰腺癌的分子治疗进展 |
| 参考文献 |
| 中英文符号及缩略词表 |
| 攻读学位期间发表文章及所获奖励情况 |
| 附件 苏州大学附属常熟医院伦理委员会 临床研究知情同意书 |
| 致谢 |
（4）低表达PDCL3在卵巢癌SKOV3细胞中对VEGF影响的初步探究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 VEGF/VEGFR2信号通路调控机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）HBx诱导BNIP3L依赖性线粒体自噬介导糖酵解代谢重编程调控肝癌细胞干性表型的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略语词汇表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 HBV感染相关致癌作用 |
| 1.1.1 HCC与HBV |
| 1.1.2 HBx与肝致癌作用 |
| 1.2 肝致癌作用与肝癌干细胞 |
| 1.2.1 肝癌干细胞的起源 |
| 1.2.2 肝癌干细胞的特征及其致癌作用 |
| 1.3 肝致癌过程与线粒体自噬 |
| 1.3.1 线粒体自噬概述 |
| 1.3.2 线粒体自噬与肝致癌过程 |
| 1.4 肝致癌过程与糖酵解代谢重编程 |
| 1.4.1 代谢重编程概述 |
| 1.4.2 糖酵解代谢重编程与致癌因素 |
| 1.4.3 糖酵解代谢重编程与肝致癌过程 |
| 1.4.4 HBx与代谢重编程 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 检测指标和方法 |
| 2.3 统计学方法 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 GEO数据库分析癌干性表型、线粒体自噬和糖酵解代谢相关基因水平 |
| 3.1.1 HBV感染肝组织中癌干性表型上调 |
| 3.1.2 HBV感染肝组织中自噬相关基因MAP1LC3B表达上调 |
| 3.1.3 HBV感染肝组织中糖酵解相关基因表达上调 |
| 3.1.4 自噬相关基因MAP1LC3B与糖酵解相关基因的相关性分析 |
| 3.2 体内移植瘤探究HBx对移植瘤癌干性表型、线粒体自噬和糖酵解代谢的影响 |
| 3.2.1 HBx促进体内移植瘤癌干性表型 |
| 3.2.2 HBx促进体内移植瘤BNIP3L依赖性线粒体自噬 |
| 3.2.3 HBx促进体内移植瘤糖酵解代谢重编程 |
| 3.3 体外试验检测HBx对肝癌细胞癌干性表型的影响 |
| 3.3.1 人肝癌Huh7和MHCC-97H细胞中存在肝癌干细胞 |
| 3.3.2 球囊培养法富集肝癌细胞中肝癌干细胞 |
| 3.3.3 HBx表达上调肝癌细胞癌干性表型 |
| 3.3.4 不同HBx表达模型对肝癌细胞癌干性表型影响 |
| 3.4 HBx诱导BNIP3L依赖性线粒体自噬对肝癌细胞癌干性表型的影响 |
| 3.4.1 肝癌干细胞具有较强的BNIP3L依赖性线粒体自噬 |
| 3.4.2 HBx表达上调肝癌细胞中BNIP3L依赖性线粒体自噬 |
| 3.4.3 HBx表达增强HIF-1α转录活性上调BNIP3L的表达 |
| 3.4.4 BNIP3L依赖性线粒体自噬阳性模型上调肝癌细胞癌干性表型 |
| 3.4.5 BNIP3L依赖性线粒体自噬抑制模型下调肝癌细胞癌干性表型 |
| 3.5 HBx诱导的糖酵解代谢重编程对肝癌细胞癌干性表型的影响 |
| 3.5.1 肝癌干细胞具有较强的糖酵解代谢过程 |
| 3.5.2 HBx表达促进肝癌细胞糖酵解代谢重编程 |
| 3.5.3 STF-31抑制糖酵解代谢降低癌干性表型 |
| 3.5.4 2-DG抑制糖酵解代谢降低癌干性表型 |
| 3.6 HBx诱导的BNIP3L依赖性线粒体自噬与糖酵解代谢重编程的调控机制 |
| 3.6.1 BNIP3L依赖性线粒体自噬阳性模型增强肝癌细胞糖酵解代谢重编程 |
| 3.6.2 BNIP3L依赖性线粒体自噬抑制模型降低肝癌细胞糖酵解代谢重编程 |
| 3.7 单克隆抗体靶向干预胞内HBx表达的影响 |
| 3.7.1 干预HBx表达抑制由HBx上调的癌干性表型 |
| 3.7.2 干预HBx表达抑制由HBx上调的BNIP3L依赖性线粒体自噬 |
| 3.7.3 干预HBx表达抑制由HBx上调的糖酵解代谢 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 HBx诱导肝癌细胞癌干性表型及其靶向干预 |
| 4.2 HBx诱导的BNIP3L依赖性线粒体自噬对癌干性表型的调控 |
| 4.3 HBx诱导的糖酵解代谢重编程对癌干性表型的调控 |
| 4.4 HBx诱导的致癌作用中癌干性表型干预的预防与控制作用 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）基于前药策略的纳米药物输送体系的构建及联合达沙替尼治疗肝癌的研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 1 第一部分 HCC靶向性阿霉素前药纳米粒的构建与疗效研究 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 实验材料与仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 结论 |
| 2 第二部分 SN38联合达沙替尼在HCC治疗中的作用与机制研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 3 第三部分 SN38前药纳米粒的构建及其联合达沙替尼在HCC治疗中的作用研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
（7）新型小分子化合物YQ456靶向Myoferlin抑制结肠癌的功能和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 结直肠癌 |
| 1.1.1 结肠的结构和功能 |
| 1.1.2 结直肠癌流行病学 |
| 1.1.3 结直肠癌分型和分期 |
| 1.2 结直肠癌相关信号通路 |
| 1.3 结直肠癌临床治疗 |
| 1.4 Ferlin蛋白家族的结构和功能 |
| 1.5 靶向MYOF抑制癌症发展 |
| 第二章 靶向MYOF-C2D结构域的模型构建和候选化合物的筛选 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验试剂和耗材 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验试剂配制 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.3 结果和讨论 |
| 2.3.1 靶向MYOF药物筛选的已有研究成果 |
| 2.3.2 靶向MYOF-C2D结构域筛选模型构建 |
| 2.3.3 小分子化合物库的筛选及候选化合物的获得 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 YQ456在体内外抑制结肠癌的增殖和生长 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验试剂和耗材 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 实验试剂配制 |
| 3.2.4 实验方法 |
| 3.3 结果和讨论 |
| 3.3.1 癌症中MYOF的表达以及YQ456的靶点选择性 |
| 3.3.2 YQ456抑制结肠癌细胞侵袭 |
| 3.3.3 敲除MYOF抑制结肠癌细胞侵袭并降低对YQ456的敏感性 |
| 3.3.4 YQ456和敲除MYOF抑制结肠癌细胞增殖 |
| 3.3.5 动物模型预实验确定YQ456的给药剂量 |
| 3.3.6 YQ456和敲除MYOF抑制结肠癌体内生长 |
| 3.3.7 YQ456影响肿瘤中血管新生抑制结肠癌的生长 |
| 3.3.8 YQ456和敲除MYOF对小鼠无明显毒副作用 |
| 3.3.9 YQ456和敲除MYOF抑制结肠癌体内转移 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 YQ456抑制MYOF功能的分子机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验试剂和耗材 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 实验试剂配制 |
| 4.2.4 实验方法 |
| 4.3 结果和讨论 |
| 4.3.1 YQ456抑制MMPs的分泌 |
| 4.3.2 YQ456和敲除MYOF逆转EMT |
| 4.3.3 YQ456干扰MYOF和Rab7的结合 |
| 4.3.4 YQ456抑制受体酪氨酸激酶活性 |
| 4.3.5 YQ456和敲除MYOF抑制EGF/EGFR信号通路 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 YQ456化学合成与药物化学分析 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 YQ456化学合成 |
| 5.2.1 YQ456合成路线 |
| 5.2.2 YQ456合成步骤 |
| 5.2.3 YQ456相关谱图 |
| 5.3 药物化学 |
| 第六章 总结展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 缩略词表 |
| 附录2 表格索引 |
| 附录3 图片索引 |
| 附录4 学术论文成果 |
| 附录5 授权和申请的专利 |
| 附录6 参与基金项目和获得奖励 |
| 致谢 |
（8）Hsf1在SV40T抗原引起细胞恶性转化中的作用及分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 MEF/HSF1~(-/-)/HSF1细胞系的建立 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 HSF1对SV40T抗原恶性转化胚胎成纤维细胞的调控 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 HSF1在SV40T抗原引起细胞恶性转化中的作用机制 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 个人简介及博士期间发表论文 |
| 博士期间获得的研究成果及参加学术会议 |
| 致谢 |
（9）Nanog在食管癌中的表达及意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章:Nanog在食管癌组织中的表达及意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二章:Nanog对食管癌9706细胞生物学行为的影响及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三章:Nanog对食管癌9706细胞药物敏感性的影响及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四章:Nanog对食管癌9706细胞裸鼠移植瘤影响的研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 干细胞自我更新的机制与肿瘤的关系 |
| 参考文献 |
| 在校期间发表论文和科研情况 |
| 致谢 |
（10）PDGF-D在乳腺癌进展、转移及化疗药物运输中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 PDGF-D在乳腺癌组织中的表达研究及过表达PDGF-D乳腺癌细胞株的建立 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 PDGF-D在正常乳腺组织及良性乳腺肿瘤中的表达情况 |
| 2.2 PDGF-D和PDGFRβ在四种人类乳腺癌细胞株中的表达情况 |
| 2.3 PDGF-D在转染的MDA-MB-231细胞中的表达情况及过表达PDGF-D能激活PDGFRβ |
| 3. 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 PDGF-D对乳腺癌生长和转移的作用及其机制研究 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 乳腺癌细胞中过表达PDGF-D促进肿瘤的生长的情况 |
| 2.2 乳腺癌细胞中过表达PDGF-D促进肿瘤的淋巴结转移的情况 |
| 2.3 下调乳腺癌细胞中PDGF-D基因的表达抑制肿瘤的生长和淋巴结转移情况 |
| 2.4 PDGF受体阻断剂抑制乳腺肿瘤生长情况 |
| 2.5 MDA-MB-231,231-Mock及231-PDGFD细胞在体外的增生情况 |
| 2.6 PDGF-D通过激活MAPK和Akt信号通路促进肿瘤细胞的增生和抑制细胞凋亡 |
| 2.7 PDGF-D与CXCR4/SDF-1α趋化因子反应轴在促进乳腺癌淋巴结转移中的关系 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 第三章 PDGF-D对化疗药物运输的影响及其机制 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2. 结果 |
| 2.1 PDGF-D与血管旁细胞覆盖率的关系 |
| 2.2 PDGF-D对乳腺癌血管直径和形态的影响 |
| 2.3 PDGF-D对阿霉素在乳腺癌中的运输及血管渗透作用及其疗效的影响 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间的主要研究成果 |
四、转染血小板第四因子氨基末端改构体cDNA抑制裸鼠实体肿瘤生长的研究（论文参考文献）
- [1]阳离子PCL-b-P（GMA-EA）载体递送pGRIM-19抗神经母细胞瘤的研究[D]. 徐阳. 吉林大学, 2020(03)
- [2]空间阻滞寡核苷酸调控Mcl-1可变剪接诱导胃癌细胞凋亡的研究[D]. 李永红. 兰州大学, 2020(04)
- [3]TBL1XR1调控人胰腺癌肿瘤细胞增殖作用机制及其临床意义的研究[D]. 顾剑峰. 苏州大学, 2019(08)
- [4]低表达PDCL3在卵巢癌SKOV3细胞中对VEGF影响的初步探究[D]. 陈东. 昆明医科大学, 2019(05)
- [5]HBx诱导BNIP3L依赖性线粒体自噬介导糖酵解代谢重编程调控肝癌细胞干性表型的机制研究[D]. 陈圆圆. 厦门大学, 2019(09)
- [6]基于前药策略的纳米药物输送体系的构建及联合达沙替尼治疗肝癌的研究[D]. 徐力. 浙江大学, 2019(03)
- [7]新型小分子化合物YQ456靶向Myoferlin抑制结肠癌的功能和机制研究[D]. 贺源. 华东师范大学, 2017(05)
- [8]Hsf1在SV40T抗原引起细胞恶性转化中的作用及分子机制[D]. 蒋杞英. 郑州大学, 2012(09)
- [9]Nanog在食管癌中的表达及意义[D]. 陈清江. 郑州大学, 2011(12)
- [10]PDGF-D在乳腺癌进展、转移及化疗药物运输中的作用和机制研究[D]. 刘洁琼. 中南大学, 2011(12)