一、大鼠血浆TNF-α的测定以及小剂量rTNF-α对感染的大鼠保护作用（论文文献综述）
李祥[1]（2021）在《乌司他丁通过抑制NLRP3活化减轻脓毒症肠道炎症反应的研究》文中提出目的:探讨NLRP3炎症小体活化在脓毒症大鼠肠道黏膜屏障破坏中的作用及乌司他丁（UTI）对脓毒症大鼠肠道核转录因子-κB（NF-κB）/NLRP3炎症小体信号通路表达的影响。方法:64只雄性Wistar大鼠按随机数字表法分成假手术（Sham）组、盲肠结扎穿孔术（CLP）组、UTI及UTI预处理组,16只/组。UTI组于CLP术后1、6、12、18 h以100 k U/kg UTI腹腔注射;UTI预处理组于CLP术前1 h 100 k U/kg UTI腹腔注射,其余处理同UTI组。苏木素-伊红（HE）染色进行回肠病理评分;采用酶联免疫吸附试验（ELISA）测定肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、肠型脂肪酸结合蛋白（I-FABP）水平;应用蛋白质免疫印迹试验（Wertern Blot,WB）检测小肠组织NF-κB p65、NLRP3、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶1（Caspase-1）、凋亡相关斑点蛋白（ASC）、肠道紧密连接蛋白-1（Claudin-1）水平;免疫组化（IHC）法检测Claudin-1、闭合蛋白（Occludin）以及NLRP3、ASC、Caspase-1的表达。结果:相比Sham,CLP组术后24h存活率下降;肠道病理学评分升高;I-FABP及IL-1β、TNF-α水平均明显升高;WB提示NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白明显增加而Claudin-1的明显降低;IHC提示组织Claudin-1、Occludin表达减少,NLRP3、Caspase-1、ASC增加。与CLP组相比,UTI干预或UTI预处理后,24h存活率无明显差别（均P>0.05）,但肠道损伤明显缓解,Chiu评分及血浆中TNF-α、IL-1β、I-FABP水平明显降低（均P<0.05）,小肠NF-κB p65、NLRP3、Caspase-1、ASC的表达明显下降（均P<0.05）;IHC提示,小肠组织Claudin-1、Occludin阳性表达面积百分比（Area%）升高（均P<0.05）。NLRP3、Caspase-1、ASC阳性Area%降低（均P<0.05）。但UTI组与UTI预处理组的改善作用差异均无统计学意义。结论:脓毒症时肠道屏障功能障碍可能与肠黏膜中NLRP3炎症小体活化有关;UTI肠道黏膜保护作用可能与抑制肠黏膜中NLRP3炎症小体活化有关,但UTI预处理与UTI干预比较无明显优势。
陈立[2]（2020）在《通腑理肺汤对脓毒症肠功能损伤的保护作用及机制研究》文中进行了进一步梳理目的从临床研究及基础研究两方面探讨通腑理肺汤（TFL）对脓毒症肠功能损伤的保护作用及作用机制。方法一、临床研究本研究回顾性收集2016年03月-2019年09月在贵州中医药大学第一附属医院重症医学科住院的符合脓毒症肠功能损伤患者的临床资料,依据是否应用通腑理肺汤直肠滴入分为通腑理肺汤直肠滴入组（TFL组）及非通腑理肺汤直肠滴入组（NTFL组）进行统计学分析,收集患者基线水平及入住ICU后7天的资料,包括一般资料、基本生命体征、是否使用机械通气、感染指标、器官功能障碍指标、肠功能损伤指标、机械通气时间、危重程度及预后等,使用SPSS20.0统计软件进行分析,有序多分类Logistic回归模型用于探测肠屏障损伤的独立危险因素,所有分析都采用双测检验法,以P<0.05为差异有统计学意义。二、基础研究健康雄性SD大鼠随机分为假手术组（sham）、模型组（model）、3.6g/kg通腑理肺汤治疗组（3.6g/kg TFL）及7.2g/kg通腑理肺汤治疗组（7.2g/kg TFL）,共4组,采用盲肠结扎穿孔（CLP）方法诱导建立脓毒症肠屏障损伤大鼠模型,TFL治疗组通过灌胃接受TFL煎剂,剂量为3.6或7.2g/kg体重,每天1次。假手术组和模型组每天通过灌服给予蒸馏水（10ml/kg）,每天1次。实验为7天。取血及回肠组织用于检测。应用酶联免疫吸附法（ELISA）检测肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,白细胞介素-1β（IL-1β）,白细胞介素-6（IL-6）和白细胞介素-10（IL-10）的含量,苏木精-伊红（HE）染色观察大鼠肠组织病理学改变,实时荧光定量多聚合酶链式反应（RT-PCR）检测大鼠肠组织RNA中胞质附着蛋白-1（ZO-1）、Claudin-1和Occludin m RNA表达,免疫组化（IHC）及免疫印迹法（WB）检测大鼠肠组织中ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白水平,所有统计学分析使用SPSS 20.0进行,使用Prism 8.0（Graph Pad软件）进行统计作图。所有分析都采用双侧检验法,以P<0.05为差异有统计学意义。结果一、临床研究1.两组患者基线资料比较显示,TFL组呼吸频率明显高于NTFL组,脉搏血氧饱和度明显低于NTFL组,差异具有显着统计学意义（P<0.05）;两组急性生理与慢性健康评分（APACHEII）评分、序贯器官衰竭（SOFA）评分及腹腔压力（IAP）无显着统计学差异（P>0.05）。治疗后7天资料比较显示:TFL组脉搏血氧饱和度明显高于NTFL组,而APACHEII评分及IAP明显低于NTFL组,差异具有显着统计学意义（P<0.05）,两组呼吸频率及SOFA评分无显着统计学差异（P>0.05）。2.两组患者基线急性胃肠功能损伤（AGI）分级比较无显着统计学差异（P>0.05）;两组治疗后7天急性胃肠功能损伤分级比较具有显着统计学差异,且TFL组Ⅰ级、Ⅱ级所占比例更高（P<0.05）。3.以治疗后7天急性胃肠功能损伤分级为因变量建立有序多分类Logistic回归分析模型。在矫正平均动脉压、体温、白细胞计数、APACHEII评分、SOFA评分及PCT后,结果显示通腑理肺汤直肠滴入使患者急性胃肠功能损伤分级增加Ⅰ级的可能性是未使用通腑理肺汤直肠滴入的0.30倍（OR=0.30,P=0.015）。4.TFL组与NTFL组比较,两组机械通气时间、ICU住院日具有显着的统计学差异,且TFL组机械通气时间、ICU住院日中位数均明显高于NTFL组（P<0.05）,两组患者28天病死率无显着统计学差异（P>0.05）。二、基础研究1.TFL组CLP诱导的脓毒症大鼠的生存率明显高于模型组,差异具有显着统计学意义（P<0.05）。2.与假手术组大鼠血清TNF-α和IL-1β水平相比,模型组大鼠血清TNF-α和IL-1β水平显着升高（P<0.05）。与模型组比较,各给药组TNF-α和IL-1β水平显着下降（P<0.05）。假手术组大鼠肠组织TNF-α,IL-1β和IL-6水平显着低于模型组,3.6 g/kg TFL治疗组和7.2 g/kg TFL治疗组（P<0.05）。与模型组相比,3.6 g/kg TFL治疗组和7.2 g/kg TFL治疗组肠组织中TNF-α、IL-1β和IL-6水平显着降低（P<0.05,P<0.01）。对于回肠组织IL-10水平来说,模型组、3.6g/kg和7.2g/kg TFL组均显着高于假手术组（P<0.05）。与其他因子不同,模型组IL-10水平显着低于TFL组、3.6g/kg和7.2g/kg TFL组（P<0.05,P<0.01）。3.组织病理学结果显示,在光学显微镜下,假手术组回肠组织结构完整,肠粘膜绒毛排列整齐,周围血管结构正常,无明显出血,肌纤维排列整齐,浆膜正常。模型组肠粘膜破坏,肠黏膜上皮组织水肿、变性,绒毛严重受损,肠绒毛紊乱,在血管周围观察到粘膜肿胀和出血,上皮细胞从固有层分离,基底层破裂,出血、水肿、坏死,有大量增殖的淋巴细胞,观察到中性粒细胞。在给药治疗后,3.6g/kg TFL治疗组和7.2g/kg TFL治疗组,在血管周围观察到中度粘膜肿胀和出血,粘膜组织水肿、出血给药后均明显减轻,粘膜上皮细胞轻度水肿,肠粘膜绒毛中度受损,绒毛顶部被破坏,基本绒毛结构完整,并观察到破裂的基底层,固有层轻度水肿,出血坏死不明显,有少量增殖的淋巴细胞,观察到中性粒细胞。4.与假手术组相比,模型组大鼠肠组织ZO-1、Claudin-1和Occludin m RNA相对表达水平均显着下降,差异具有统计学意义（P<0.01）。与模型组相比,给药组大鼠肠组织ZO-1、Claudin和Occludin m RNA相对表达水平显着升高,差异具有统计学意义（P<0.01）。5.免疫组化结果显示,与假手术组相比,模型组ZO-1蛋白表达（IOD:2549±786）低于假手术组（IOD:15809±1566）;模型组Occludin蛋白表达（IOD:1951±845）低于假手术组（IOD:14088±1808）;模型组Claudin-1蛋白表达（IOD:616.3±161.8）低于假手术组（IOD:6572±704）。与模型组相比,TFL处理的大鼠回肠组织中的ZO-1蛋白表达（IOD:3.6 g/kg TFL,5089±846;7.2 g/kg TFL,7094±1465）显着增加。与模型组相比,7.2 g/kg TFL治疗上调了Occludin蛋白表达（IOD:1951±845至6632±704）和Claudin-1蛋白表达（IOD:616±162至4385±671）。6.免疫印迹检测大鼠肠组织中ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白水平,结果显示,与假手术组比较,模型组大鼠肠组织中ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白表达显着下降（P<0.05,P<0.01）。与模型组比较,给药治疗后,3.6 g/kg TFL治疗组和7.2 g/kg TFL治疗组大肠组织中ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白表达水平显着上升（P<0.05,P<0.01）。结论通腑理肺汤能够降低脓毒症肠功能损伤患者腹腔压力及肠功能损伤分级,减少患者APACHEII评分,改善患者预后,其直肠滴入是肠功能损伤的独立保护因素,对脓毒症肠功能损伤有一定的保护作用。通腑理肺汤能够提高CLP诱导的脓毒症大鼠的存活率,减轻脓毒症引起的肠黏膜损伤,减少CLP诱导的脓毒症大鼠的TNF-α、IL-1β和IL-6促炎性细胞因子的表达,增加IL-10抗炎细胞因子表达,减轻炎症反应,能够恢复CLP诱导的脓毒症大鼠肠组织紧密连接蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1 m RNA及蛋白的表达水平,并且可以通过减轻炎症反应及上调Occludin、Claudin-1及ZO-1的表达改善肠道屏障功能,这有可能成为脓毒症肠功能损伤治疗的新方法。
王媛[3]（2020）在《骨髓间充质干细胞外泌体对脓毒症大鼠肠屏障功能影响及相关机制探讨》文中研究说明目的脓毒症时机体对感染产生了失控的炎症反应,大量炎症因子被释放,多条炎症相关信号通路被激活,最终出现多器官功能障碍,死亡率高,而且在治疗上措施少,效果差,花费高。目前急需找到新的治疗切入点。肠道是人体最大的细菌池,脓毒症时过度的炎症反应累及肠道,肠粘膜屏障受损,大量细菌及内毒素入血,加重炎症反应,推动了后续器官损伤的进程。因此肠道既是脓毒症的损伤器官,也是脓毒症向多器官功能障碍发展的重要中间环节,所以对脓毒症时肠屏障功能的保护至关重要。本实验研究骨髓间充质干细胞外泌体对脓毒症大鼠肠屏障功能影响并探讨其相关机制,目的是为脓毒症时肠屏障功能的保护提供方法及理论基础。方法第一部分骨髓间充质干细胞及外泌体的提取:实验提取大鼠股骨及胫骨的骨髓间充质干细胞,采用骨髓贴壁法分离及培养原代细胞,消化培养传代细胞,于光镜下观察细胞形态,采用流式细胞术检测细胞表面抗原进行鉴定;采用离心法提取骨髓间充质干细胞外泌体,在电镜下观察外泌体形态,采用流式细胞术检测表面标志物进行鉴定,保存外泌体为后续实验做好准备。第二部分脓毒症大鼠模型建立及生存率观察:取18只大鼠随机分为3组,（1）正常对照组（n=6）（2）假手术组（n=6）,麻醉后开腹,翻动盲肠后逐层关腹,术后为防止休克皮下注射生理盐水20m L/kg。（3）盲肠结扎穿孔术致脓毒症（CLP）组（n=6）,采用CLP制备脓毒症大鼠模型,术后为防止休克皮下注射生理盐水20m L/kg。观察大鼠术后一般情况、腹腔情况及生存率。第三部分骨髓间充质干细胞外泌体对脓毒症大鼠肠屏障功能影响及相关机制探讨:取48只大鼠随机分为4组,具体分组为（1）假手术+生理盐水组（n=12）:开腹后翻动盲肠关腹并缝合腹壁,于术后2小时经尾静脉注射100μL生理盐水;（2）盲肠结扎穿孔术致脓毒症+生理盐水（CLP+生理盐水）组（n=12）大鼠行CLP,并于术后2小时经尾静脉注射100μL生理盐水;（3）盲肠结扎穿孔术致脓毒症+外泌体（CLP+外泌体）组（n=12）:大鼠行CLP,并于术后2小时经尾静脉注射含30μL间充质干细胞外泌体的稀释液100μL;（4）盲肠结扎穿孔术致脓毒症+去外泌体上清液（CLP+去外泌体上清液）组（n=12）:大鼠行CLP,并于术后2小时经尾静脉注射不含外泌体的上清液100μL。在6小时和24小时两个时间点,每时间点取6只大鼠,取血浆及小肠组织,在光镜下观察肠组织病理变化,应用ELISA检测血浆中D-乳酸、二胺氧化酶（DAO）、内毒素水平,检测肠组织中肿瘤坏死因子-a（TNF-a）、白介素-6（IL-6）及髓过氧化物酶（MPO）水平,反应脓毒症时肠粘膜通透性变化、炎症变化以及骨髓间充质干细胞外泌体对其影响;采用westernblot检测不同组别脓毒症大鼠MAPK信号通路及NF-kB信号通路磷酸化水平,以探索骨髓间充质干细胞外泌体对脓毒症时肠屏障功能影响的机制。结果第一部分骨髓间充质干细胞及外泌体的提取:骨髓间充质干细胞接种后24小时可见部分细胞贴壁,3-4天后细胞由多形转变为梭形为主,1周后出现旋涡式集落,9-10天细胞逐渐融合成片。消化传代24小时,细胞完全贴壁,生长旺盛,形态均一呈现梭形。流式细胞术显示培养的骨髓间充质干细胞均一表达CD44 CD105（>95%）,而CD34 CD45（<2%）。离心法分离骨髓间充质干细胞外泌体,并于电镜下观察可见囊泡状结构,大小约为30-60nm,流式细胞术显示其表面标志物CD9、CD63、CD81有表达。第二部分脓毒症大鼠模型建立及生存率观察:采用CLP制造脓毒症大鼠模型,术后约6小时左右大鼠病态逐渐明显,出现精神萎靡、呼吸急促、进食及饮水减少、竖毛蜷缩等表现,观察腹腔情况发现CLP组大鼠在CLP术后6小时腹腔内肠管排列紊乱,盲肠有肿胀扩张,腹腔可见少量积液,随时间延长肠管肿胀扩张明显出现粘连坏死,腹腔积液逐渐增多可见血性积液,术后72小时内,假手术组大鼠未发现死亡,CLP组生存率为50%,且大鼠死亡时间主要集中在术后24-48小时。第三部分骨髓间充质干细胞外泌体对脓毒症大鼠肠屏障功能影响及相关机制探讨:在6小时与24小时两个时间点,光镜下假手术+生理盐水组小肠绒毛排列整齐,小肠粘膜结构基本完整,CLP+生理盐水组及CLP+去外泌体上清液组小肠绒毛稀疏排列紊乱倒伏,部分绒毛顶端及固有膜脱落,毛细血管扩张,炎性细胞浸润,CLP+外泌体组小肠粘膜充血水肿,无绒毛及固有层脱落,进行Chius评分后发现,与假手术+生理盐水组相比,CLP+生理盐水组和CLP+去外泌体上清液组大鼠肠组织Chius评分显着升高（P<0.05）,而CLP+外泌体组与CLP+生理盐水组和CLP+去外泌体上清液组相比Chius评分显着降低（P<0.05）;在6小时与24小时两个时间点,与假手术+生理盐水组相比,CLP+生理盐水组和CLP+去外泌体上清液组大鼠血浆中D-乳酸、DAO及内毒素水平显着升高（P<0.05）,而CLP+外泌体组与CLP+生理盐水组和CLP+去外泌体上清液组相比血浆中D-乳酸、DAO及内毒素水平显着降低（P<0.05）;与假手术+生理盐水组相比,CLP+生理盐水组和CLP+去外泌体上清液组大鼠肠组织中TNF-α、IL-6及MPO水平显着升高（P<0.05）,而CLP+外泌体组与CLP+生理盐水组和CLP+去外泌体上清液组相比肠组织中TNF-α、IL-6及MPO水平显着降低（P<0.05）;与假手术+生理盐水组相比,CLP+生理盐水组和CLP+去外泌体上清液组大鼠肠组织中ERK、P38、JNK及NF-kB磷酸化水平显着升高（P<0.05）,而CLP+外泌体组与CLP+生理盐水组和CLP+去外泌体上清液组相比肠组织中ERK、P38、JNK及NF-kB磷酸化水平显着降低（P<0.05）。结论1.采用骨髓贴壁法可以成功分离及培养骨髓间充质干细胞,离心法可成功提取外泌体。2.盲肠结扎穿孔术可以成功制备脓毒症大鼠模型。3.骨髓间充质干细胞外泌体可以抑制脓毒症大鼠肠组织炎症反应,降低肠粘膜通透性保护肠屏障功能。4.骨髓间充质干细胞外泌体可以通过抑制脓毒症大鼠肠组织中MAPK信号通路及NF-kB信号通路的激活起到保护肠屏障功能的作用。
滑晓莉[4]（2020）在《基于AMPK/PGC-1α通路探讨亚甲蓝对脓毒症脑能量代谢调控作用》文中研究说明目的:本研究的目的是在观察脓毒症相关性脑病（Sepsis-associated Encephalopathy,SAE）线粒体损伤的基础上,探讨亚甲蓝（Methylene Blue,MB）通过AMPK/PGC-1α通路对SAE脑能量代谢的调控作用。主要研究包括:1)制备脓毒症相关性脑病的细胞实验模型,观察线粒体损伤,三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）水平、细胞凋亡等;2)探讨MB在SAE细胞模型中对AMPK/PGC-1α通路的激活以及能量调控;3)建立Wistar大鼠脓毒症模型,探讨亚甲蓝在SAE动物模型中对SAE Wistar大鼠的AMPK/PGC-1α通路的激活以及能量调控。方法:1)应用细胞原代培养技术分离纯化Wistar大鼠乳鼠（出生3天以内）的大脑皮质星形胶质细胞,进行纯度鉴定后,以不同浓度的脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）和20 ng/mL的干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）联合孵育,依照孵育时间（6h,12h,24h,48h）以及脂多糖的浓度（50 ng/mL,100 ng/mL,200 ng/mL）制备脓毒症相关性脑病的细胞实验模型,通过对比细胞活力,肿瘤坏死因子-α（TNF-α）,白介素-6（IL-6）,一氧化氮（NO）,活性氧（ROS）,星形胶质细胞形态的改变,确认模型成功制备。通过观察细胞凋亡比、线粒体网格形态、线粒体膜电位观察SAE细胞模型下的星形胶质细胞的线粒体损伤。通过Western blot实验观察线粒体生物发生以及线粒体动力学相关指标的变化,包括过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子-1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α,PGC-1α）、线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A,TFAM）、核呼吸因子-1（nuclear respiratory factor-1,NRF1）、视神经萎缩l基因蛋白（optic atrophy l gene protein,OPA1）、动力相关蛋白1（dynamin-related protein,DRP1）,测定能量指标ATP,观察细胞凋亡;2)在第一部分研究基础之上,以100ng/mL的LPS联合20 ng/mL的IFN-γ分别孵育原代培养的星形胶质细胞6h和48h,模拟SAE细胞模型的早期和晚期SAE疾病环境。对上述SAE细胞模型均分别给予MB（0.01 nmol/mL）和MB（0.01nmol/mL）+Compound C（10nmol/mL）6h干预。分别探讨MB在SAE细胞模型的早期和晚期对AMPK/PGC-1α通路激活的分子机制,以及在细胞研究水平上观察MB对线粒体生物发生相关指标,包括PGC-1α,TFAM,NRF1,能量指标ATP、细胞凋亡、ROS的影响;3)选用成年雌性,体重180-200g左右的Wistar大鼠,行盲肠结扎穿孔（Cecal ligation and puncture,CLP）术制备脓毒症动物实验模型。CLP术后24h后根据脑电图出现广泛而较为持久的θ波以及神经行为学评分确认为SAE模型。对SAE组动物随机给予亚甲蓝（0.15mg/100g）腹腔注射,6h后处理各组动物,采集血清,提取大鼠大脑皮质蛋白。通过Western blot实验观察SAE大鼠大脑皮质组织的线粒体生物发生相关蛋白水平,凋亡指标,ATP的变化;探讨亚甲蓝腹腔注射对SAE大鼠的大脑皮质组织AMPK/PGC-1α通路的调控、对大脑皮质组织ATP含量及凋亡的影响。结果:1)用LPS和IFN-γ联合孵育原代培养的星形胶质细胞,制备SAE的体外实验模型,和control对比,SAE细胞活力下降,IL-6、TNF-α、ROS和NO增高,SAE模型的星形胶质细胞胞体变大,突起变粗,确认成功制备模型;2)观察SAE细胞实验模型,发现星形胶质细胞的线粒体生物发生相关蛋白水平（PGC-1α,TFAM,NRF1）,线粒体融合及分裂相关蛋白水平（OPA1和DRP1）在LPS和IFN-γ联合孵育6h,随着LPS浓度的增加,表达逐渐上升,联合孵育12h,上述指标随着LPS浓度的增加表现为先上升后下降,在联合孵育24h及48h,上述指标随着LPS的浓度的增加,表现下降趋势,细胞内ATP含量呈现较为接近的变化趋势;3)在SAE细胞实验模型里,和对照组对比,MB在6h及48h组都增加了p-AMPK表达,增强了细胞线粒体生物发生,增加了细胞内ATP含量,在6h组,凋亡比下降,在48h组,未见凋亡比下降;4)在SAE动物实验模型,发现CLP术后24h,和sham组及CLP组对比,SAE组和SAE+MB组的神经行为学评分下降,血清S100β、GFAP、NSE升高,MB增加了SAE大鼠大脑皮质组织p-AMPK表达,增强了线粒体生物发生蛋白表达,增加细胞内ATP含量,改善凋亡。结论:原代培养的星形胶质细胞的线粒体生物发生以及细胞ATP水平在SAE体外实验模型早期增强,晚期减弱;在细胞水平和组织水平的研究,均发现MB可以通过激活AMPK/PGC-1α通路增强线粒体生物发生,改善SAE细胞能量水平及细胞凋亡。
孙海鹏[5]（2019）在《瑞舒伐他汀对脓毒症大鼠心血管损伤的保护作用及其机制研究》文中研究说明背景:脓毒症是一种病原体侵入人体血液造成的全身炎性反应综合征,严重创伤、感染、急性胰腺炎、重症肺炎是常见的诱发因素,病情严重者进一步发展成脓毒症休克、多器官功能障碍综合征,病死率高,目前已成为患者第三大致死原因。严重脓毒症和脓毒症休克会引发心肌损伤及最终的心功能不全,主要表现为心脏扩大、心肌收缩功能障碍以及左室射血分数下降。临床研究发现内毒素和炎症因子在脓毒症所致心血管损伤的致病过程中发挥了重要作用,此外,缺氧、酸中毒、低血压和低血容量、代谢紊乱、凝血功能异常以及氧化应激损伤后过氧化物产生增加,都被认为参与脓毒症期间的心脏和大血管损伤,但其确切病理生理机制目前尚不清楚。他汀类药物是一种降脂药物,主要抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶,导致胆固醇合成减少。近年来的研究结果表明,他汀类药物不仅具有降脂作用,还具有广泛的抗炎、调节细胞免疫功能等作用。鉴于脓毒症是一种炎症反应性疾病,而他汀类药物具有广泛的抗炎效果,我们推测他汀类药物可能对脓毒症所致心血管损伤具有保护作用。多个临床研究证实,磷脂酰醇-3激酶（phosphoinositide-3 kinase,PI-3K）/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase,Akt）-内皮一氧化氮合成酶（endothelial nitric oxide synthase,eNOS）信号通路是保护心肌的重要信号传导通路之一,PI3K-Akt途径激活后,活化的Akt主要通过eNOS的磷酸化促进内源性一氧化氮（nitric oxide,NO）生成,而产生的NO作为信号分子发挥保护心肌和血管等重要作用。因此,他汀类药物能否通过调控PI3K-Akt-eNOS信号通路,促进NO生成,减轻炎症反应和心肌损伤,从而可能对脓毒症患者具有很好的治疗效果,目前尚缺乏这方面的临床和基础研究。目的:本研究旨在评价瑞舒伐他汀对脂多糖（lipopoly saccharide,LPS）诱导的脓毒症大鼠心血管损伤的影响,同时评价瑞舒伐他汀对LPS诱导的大鼠主动脉内皮细胞氧化应激反应的影响,探索其心血管保护作用的机制,为临床脓毒症的治疗提供新的思路和策略。方法:第一部分评价瑞舒伐他汀对脂多糖诱导的脓毒症大鼠心血管损伤的保护作用。SD大鼠分为对照组、LPS脓毒症组、LPS脓毒症+瑞舒伐他汀低剂量组（10mg/kg/d）和LPS脓毒症+瑞舒伐他汀高剂量组（20mg/kg/d）。脓毒症组SD大鼠给予一次性腹腔注射LPS 20mg/kg以建立脓毒症模型。对照组SD大鼠给予一次性腹腔注射等体积生理盐水后,立即给予灌胃同等体积的高压消毒双蒸水。瑞舒伐他汀治疗组:腹腔注射LPS后立即一次性口服灌胃瑞舒伐他汀（10mg/kg或20mg/kg）。（1）造模后6小时至12小时观察脓毒症大鼠生长状态并记录生存率。（2）腹腔注射LPS后3小时、6小时和9小时的SD大鼠,经心尖抽取血液标本,分离大鼠心脏,检测血浆肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素-6（Interleukin-6,IL-6）、肌钙蛋白I（Troponin I,cTNI）、N端前脑钠肽（N-terminal pronatriuretic peptide,NT-proBNP）和高迁移率族蛋白B1（high-mobility group box 1protein,HMGB1）的水平。（3）分离四组大鼠的心肌组织提取RNA和蛋白,检测心肌损伤标志物ANP、BNP和炎症因子TNF-α、IL-6、IL-2的表达水平。（4）超声心动图评价四组大鼠的心脏结构和功能改变。（5）Masson染色方法观察瑞舒伐他汀对心肌组织的形态学影响。（6）分离大鼠胸主动脉,进行主动脉环诱导血管内皮细胞萌芽实验以评价血管新生水平。第二部分评价瑞舒伐他汀对脂多糖诱导的大鼠主动脉内皮细胞氧化应激损伤的保护作用及并探讨作用机制。（1）LPS对大鼠主动脉内皮细胞（Rat Aortic Endothelial Cells,RAOEC）活性的影响:给予不同浓度（10、100、500、1000、10000ng/ml）LPS,作用于RAOEC 24小时,采用MTT比色法测定细胞活性及抑制率,研究LPS对RAOEC的损伤作用,选择下一步实验中LPS合适浓度。（2）瑞舒伐他汀（Rosuvastatin,RSV）对LPS诱导的RAOEC活性的影响:应用不同浓度的瑞舒伐他汀预处理RAOEC 2小时,再给予1000ng/ml（1μg/ml）的LPS作用24小时,分为5组,阴性对照组、LPS组、LPS+2μM RSV组、LPS+4μM RSV组、LPS+8μM RSV组。采用MTT比色法测定细胞活性及抑制率,评价RSV对LPS诱导细胞损伤的保护作用,选择下一步实验中RSV合适浓度。（3）RSV对LPS诱导的RAOEC氧化应激指标活性氧（Reactive oxygen species,ROS）及丙二醛（Malonic dialdehyde,MDA）的影响:分为4组,阴性对照组、LPS（1μg/ml）组、RSV（4μM）组、LPS（1μg/ml）+RSV（4μM）组。LPS+RSV组:给予4μM的瑞舒伐他汀预处理RAOEC 2小时,和/或给予（1μg/ml）的LPS作用24小时;使用H2DCHF-DA探针测细胞内ROS产生,硫代巴比妥酸法测脂质氧化水平MDA含量;（4）LPS、RSV及Perifosine（Akt抑制剂）对大鼠主动脉内皮细胞NO生成的影响:分组及处理:1)阴性对照组:仅给予等体积培养基;2)LPS干预组:1μg/ml LPS处理24小时;3)LPS+RSV干预组:4μM RSV处理2小时,然后再用1μg/ml LPS处理24小时;4)LPS+RSV+Perifosine干预组:5μM Perifosine（Akt抑制剂）预处理细胞1小时,然后4μM RSV处理2小时,再用1μg/ml LPS处理24小时。（5）保护作用机制研究:分组及处理同第（4）NO生成分组;机制研究方面,我们通过免疫印迹法研究瑞舒伐他汀对LPS诱导的RAOEC内PI3K-Akt-eNOS信号通路磷酸化的影响。结果:第一部分瑞舒伐他汀对脂多糖诱导的脓毒症大鼠心血管损伤的保护作用。1.SD大鼠腹腔注射LPS 6小时后开始出现死亡,连续观察至12小时,LPS诱导的脓毒症SD大鼠给予低剂量和高剂量的瑞舒伐他汀均能显着降低脓毒症大鼠的死亡率（12小时生存率:LPS组20%,LPS+低剂量瑞舒伐他汀组50%,LPS+高剂量瑞舒伐他汀组70%,Mantel-Cox检验P=0.0165）。2.SD大鼠给予腹腔注射LPS后3小时、6小时和9小时,检测血浆中cTNI、NT-proBNP的水平,发现LPS诱导后血浆cTNI和NT-proBNP水平逐渐升高,6小时到达高峰（P<0.05）;3.比较三组LPS诱导6小时后的脓毒症大鼠的血浆cTNI和NT-proBNP水平,低剂量和高剂量瑞舒伐他汀均能显着降低cTNI和NT-proBNP水平（P<0.05）。4.比较三组LPS诱导6小时后的脓毒症大鼠血浆中TNF-α、IL-6和HMGB1的水平,低剂量和高剂量瑞舒伐他汀均能显着降低血浆TNF-α、IL-6和HMGB1的水平（P<0.05）。5.在脓毒症诱导的心肌组织中,给予低剂量和高剂量瑞舒伐他汀均能显着降低心肌损伤标志物ANP和BNP的mRNA和蛋白表达水平,同时炎症因子TNF-α、IL-6和IL-2的mRNA和蛋白表达水平也较LPS组有明显下调（P<0.05）。6.大鼠心肌标本进行Masson染色,发现LPS诱导后大鼠心肌纤维化明显加重,心肌细胞肥大,间隙松弛,心肌组织内空泡化明显,而给予低剂量和高剂量瑞舒伐他汀后,心肌纤维化、心肌肥大和空泡化现象明显减轻,瑞舒伐他汀能有效减轻脓毒症引起的心肌病所致心肌病理性重构。7.通过超声心动图发现,与对照组比较,LPS诱导的脓毒症心肌病存在左心室收缩末期内径（left ventricular end systolic dimension,LVEDs）和左心室舒张末期内径（left ventricular end diastolic dimension,LVEDd）显着增加（P<0.05）,而左心室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）显着下降（P<0.05）;与LPS组比较,低剂量和高剂量瑞舒伐他汀均能显着缓解脓毒症引起LVEDs和LVEDd增大,以及LVEF下降（P<0.05）。8.给予LPS干预后,我们发现SD大鼠的主动脉环新生血管萌芽数较对照组显着减少,而低剂量和高剂量瑞舒伐他汀则能逆转LPS诱导的血管新生萌芽数减少（每高倍镜视野萌芽数:对照组18.82±3.64个,LPS组8.64±1.88个,LPS+低剂量瑞舒伐他汀组12.52±3.76个,LPS+高剂量瑞舒伐他汀组14.93±3.21个,P<0.05）。第二部分瑞舒伐他汀对脂多糖诱导的大鼠主动脉内皮细胞氧化应激损伤的保护作用及并探讨作用机制。1.与对照组相比,LPS以剂量依赖的方式抑制细胞活性,差异均有统计学意义（P<0.05）;LPS（1μg/ml）时RAOEC活性显着下降,细胞抑制程度中等（P<0.01）,可导致中度细胞损伤,适合下一步研究中实验浓度。2.与LPS处理组相比,RSV以剂量依赖的方式减弱LPS诱导的RAOEC损伤,RAOEC活性明显升高,差异具有统计学意义（P<0.05）,瑞舒伐他汀4μM浓度对RAOEC活性影响最小,同时对细胞抑制程度最轻,因此后续实验瑞舒伐他汀选择4μM浓度。3.与对照组相比,单独瑞舒伐他汀（4μM）处理组RAOEC的ROS产生无显着变化,无统计学意义（P>0.05）,1μg/ml LPS显着增加了RAOEC的ROS产生（P<0.01）;与LPS处理组相比,4μM RSV却显着抑制了LPS诱导的ROS产生（P<0.01）。4.与对照组相比,单独瑞舒伐他汀（4μM）处理组RAOEC的MDA含量无显着变化,无统计学意义（P>0.05）,1μg/ml LPS显着增加了RAOEC的MDA含量（P<0.01）;与LPS处理组相比,4μM瑞舒伐他汀显着降低LPS诱导的RAOEC MDA含量（P<0.01）。5.与对照组相比,LPS 1μg/ml显着抑制了RAOEC NO的生成（P<0.01）;与LPS处理组相比,4μM瑞舒伐他汀显着增加了LPS诱导的RAOEC NO的产生（P<0.01）;与LPS+RSV组相比,Akt抑制剂Perifosine处理组NO产生量显着降低（P<0.01）。6.分子机制方面,与对照组相比,1μg/ml LPS处理RAOEC后,对Akt和eNOS的总蛋白水平无明显影响,无统计学意义（P>0.05）,却显着降低了Akt和eNOS的磷酸化水平（P<0.05）;与LPS处理组相比,4μM瑞舒伐他汀显着增加了LPS抑制的Akt和eNOS的磷酸化水平（P<0.05）。与LPS+RSV组相比,Akt抑制剂Perifosine处理组Akt和eNOS的磷酸化水平显着降低（P<0.05）。结论:1.瑞舒伐他汀能抑制LPS诱导的脓毒症大鼠心肌损伤和心功能不全,减轻炎症反应,促进大鼠的主动脉环血管新生,改善心肌重构和血管重构,降低脓毒症大鼠的死亡率。2.瑞舒伐他汀对LPS诱导的RAOEC的损伤有明显的保护作用,可显着抑制LPS诱导的氧化应激反应,降低内皮细胞ROS和MDA产生,促进NO的生成。其可能机制为:通过激活PI3K-Akt-eNOS信号通路促进NO生成发挥保护内皮细胞作用。
李毅[6]（2019）在《NADPH氧化酶2及右美沙芬在内毒素诱导的病态行为中的作用研究》文中研究指明目的:我们已知右美沙芬是一种临床使用十分广泛而安全的止咳剂,结构上属于吗啡类药物,鉴于其右旋结构,故右美沙芬与阿片类受体亲和力弱,很难形成成瘾性。而既往的研究已经证实通过抑制NOX2活性,减少ROS及其他促炎因子的合成,减少LPS引起的小胶质细胞的活化,右美沙芬具有对抗神经系统炎症反应,预防神经退行性变的作用。同时还可以减轻脓毒症模型下,急性肝衰竭的死亡率但上述研究目标是观察长期神经元的保护效应。而关于右美沙芬在LPS引起的感染急性期病态行为的作用,以及NOX2-/-模型中,观察短期病态行为的研究目前罕有报道。所以我们提出假设右美沙芬是否在LPS诱导的病态行为中通过抑制炎症反应（中枢）,达到缓解病态行为的目的。材料与方法:1.（1）分组:野生型（C57BL/6J）小鼠随机分为2组（A组,B组）;NOX2基因敲除（Cybb）小鼠随机分为2组（C组,D组）。（2）处理方式:A组.野生型对照组（WT-saline）。B组.野生型内毒素组（WT-LPS）。C组.NOX2基因敲除对照组（Cybb-saline）。D组.NOX2基因敲除内毒素组（Cybb-LPS）。PBS（100ul/20g）及内毒素（2.5mg/kg）均为腹腔内注射。2.病态行为的观察及旷场实验:实验小鼠分别在注射内毒素后每3小时观察一次病态行为学评分,并测量体重变化。主要观测指标:触碰反应,触碰后移动距离,竖毛,眼睑下坠,眼睛分泌物。实验小鼠注射PBS或LPS后9小时,给予病态行为评分后立即进行旷场实验,测量时间20分钟。3.实验小鼠在注射内毒素溶液/PBS溶液后第6,9,12,24小时予以灌流取脑组织,并行免疫组织化学染色（DAB法）。4.ELISA方法测量脑组织的炎症因子蛋白表达水平（IL-1β,IL-6）;Real-time PCR测量脑组织的炎症因子基因表达水平（IL-1β,IL-6,TNF-α,MCP-1,iNOS,NOX2,CD-11b）。5.（1）分组:野生型（C57BL/6J）小鼠随机分为4组（A组,B组,C组,D组）。（2）处理方式:A组.野生型对照组（WT-Saline）。B组.野生型内毒素组（WT-LPS）。C组.野生型内毒素联合右美沙芬组（WT-LPS/DM）。D组.野生型右美沙芬组（WT-DM）。PBS（100ul/20g）及内毒素（2.5mg/kg）均为腹腔内注射。DM皮下注射（12.5mg/kg、100uL/20g）。6.病态行为的观察及旷场实验:实验小鼠分别在注射内毒素后每3小时观察一次病态行为学评分,并测量体重变化。主要观测指标:触碰反应,触碰后移动距离,竖毛,眼睑下坠,眼睛分泌物。实验小鼠注射PBS或LPS后9小时,给予病态行为评分后立即进行旷场实验,测量时间20分钟。7.实验小鼠在注射内毒素溶液/PBS溶液后第6,9,12,24小时予以灌流取脑组织,并行免疫组织化学染色（DAB法）。ELISA方法测量脑组织的炎症因子蛋白表达水平（IL-1β,IL-6,TNF-α）;Real-time PCR测量脑组织的炎症因子基因表达水平（IL-1β,IL-6,TNF-α,MCP-1,iNOS,NOX2,CD-11b）。结果:1.野生型小鼠及NOX2-/-小鼠均接受LPS的腹腔注射后,分别从3小时开始到24小时结束每3小时观察一次,两组小鼠都可观察到病态行为,而且均是从3小时开始逐渐加重,直至15小时,病态行为达到最严重的程度。随后病态行为逐渐减轻,但直至24小时,两组小鼠仍存留不同程度的病态行为。其中NOX2-/-小鼠表现出的病态行为较野生型小鼠的病态行为轻微,而在注射LPS后的第9,12,15小时,NOX2-/-小鼠的病态行为评分低于WT小鼠的病态行为,两组差异有统计学意义（p<0.05）。而旷场实验中,NOX2-/-小鼠在第9小时的各项指标高于WT小鼠在第9小时的各项指标（总活动次数506.6±206.7 vs 293.5±183.6;走动次数437.8±184.2 vs 313±210.8;总活动时间138.3±56.6s vs 71.9±43.5s;移动距离681.2±237.2cm vs 252.4±170.3cm）,两组差异有统计学意义（p<0.05）。2.野生型小鼠及NOX2-/-小鼠均接受LPS的腹腔注射后,前者黑质纹状体部位的小胶质细胞出现可活化的迹象,通过CD11b的染色可以观察到,小胶质细胞形状体积的增大,触角的增多,染色深染;对比野生型小鼠,NOX2-/-小鼠黑质纹状体部位的小胶质细胞活化不甚明显,细胞体积较WT-LPS组明显缩小,细胞分叉减少,染色较WT-LPS浅淡,同时与NOX2-/-注射生理盐水组对比,NOX2-/-注射LPS的小鼠的小胶质细胞并且显示出激活的迹象。同时我们还分析了两组小鼠分别给LPS后脑内炎症介质（IL-1β及IL-6）的时间变化规律,发现NOX2-/-小鼠注射LPS后中枢神经系统产生的IL-1β及IL-6均较野生型小鼠注射LPS后中枢神经系统产生的IL-1β及IL-6水平降低（IL-1β:29.58±4.9 pg/ml vs 40.17±3.22pg/ml;IL-6:19.2±2.1 pg/ml vs 25.93±2.61 pg/ml）（p<0.05）。3.腹腔注射LPS后,分次皮下注射右美沙芬后（LPS注射后3小时,6小时,9小时）,每3小时观察一次病态行为。单纯注射LPS组的小鼠,其病态行为评分从第3小时开始,随时间的推移逐渐增加,直至注射LPS后的第15小时,病态行为评分达到最高,此后逐渐下降,至24小时,仍存在一定程度的病态行为。与之相比,注射LPS及右美沙芬组的小鼠,其病态行为随时间推移,其升高的程度较单纯注射LPS组小鼠,表现轻微;尤其是在第6小时,第9小时及第15小时三个时间点,两组之间的病态行为评分差异具有统计学意义（p<0.05）。而旷场实验中,LPS联合DM组小鼠在第9小时的各项指标高于单纯LPS处理组小鼠在第9小时的各项指标（总活动次数785±194 vs 340±91;走动次数711±168vs 294±78;总活动时间194±39.8s vs 60±10.7s;移动距离833±179cm vs332±96.4cm）,两组差异有统计学意义（p<0.05）。4.我们通过ELISA方法连续测定（注射LPS后的第3小时,第6小时及第9小时）小鼠脑组织内的IL-1β,IL-6及TNF-α的含量。发现在腹腔注射LPS后的第9小时（即第三次皮下注射右美沙芬时间点）,测定两组小鼠脑组织内的IL-1β及IL-6的含量（单纯LPS组及LPS联合右美沙芬组）有差异。联合注射LPS及右美沙芬组的小鼠脑组织内第9小时的IL-1β及IL-6水平比单纯注射LPS小鼠脑组织内第9小时的IL-1β,IL-6水平降低（IL-1β:39.41±4.3pg/ml vs 50.73±1.82pg/ml;IL-6:17.9±2.67pg/ml vs 24.7±2.20pg/ml）（p<0.05）;同时我们通过免疫组化染色还发现,腹腔注射LPS后的第24小时,单纯腹腔注射LPS的小鼠,脑组织内黑质纹状体处的小胶质细胞活化程度明显,呈现出体积增大,伪足增多,胞内染色深染（CD11b）的表现;而联合注射LPS及右美沙芬组的小鼠,在第24小时,脑组织内黑质纹状体处的小胶质细胞染色发现,小胶质细胞体积增大较前者减弱,伪足数量较单纯注射LPS组小鼠减少,同时CD11b的染色较单纯注射LPS组小鼠轻微。结论:NOX2-/-模型中,腹腔注射LPS后引起的短期病态行为比野生型小鼠的病态行为轻微,提示NOX2-/-可以减轻腹腔注射LPS引起的小鼠的病态行为;同时使用NOX2的抑制剂右美沙芬,可以通过减轻中枢炎症反应（降低IL-1β,IL-6水平）,达到缓解病态行为的作用。
陈珍[7]（2017）在《BMSCs干预对糖尿病脓毒症大鼠肠屏障功能影响的实验研究》文中提出本研究拟建立大鼠糖尿病脓毒症模型,通过检测不同处理实验组大鼠回肠组织学观察、外周血内毒素移位、肠淋巴细胞凋亡及其淋巴细胞膜上PD-1分子表达等,观察BMSCs对糖尿病脓毒症大鼠肠粘膜屏障损伤的影响,探讨BMSCs对脓毒症及其器官损伤的治疗作用与机理,为脓毒症的治疗提供新的理论依据和基础。第一章:糖尿病脓毒症模型建立及生存曲线分析研究目的及方法:制备糖尿病脓毒症大鼠模型,对大鼠生存率进行观察并绘制生存曲线,初步确定骨髓间充质干细胞对糖尿病脓毒症大鼠预后影响。研究主要结果:1、与正常大鼠相比,糖尿病组大鼠在注射链脲佐菌素（STZ）后3d、7d、14d及21d血糖水平均高于正常大鼠组同期血糖水平（P<0.01）。2、BMSCs治疗组血浆TNF-α水平显着高于Control组和Sham组,但低于CLP+Saline组,且均有统计学差异（P<0.05）;而血浆IL-10水平则明显升高。3、BMSCs治疗组中位生存时间长于CLP+Saline组中位生存时间。结论:糖尿病脓毒症大鼠炎症因子检测和生存曲线分析,结果提示BMSCs可降低机体促炎因子水平并提高脓毒症大鼠生存率。第二章:BMSCs对糖尿病脓毒症大鼠肠道粘膜屏障作用初步观察研究目的及方法:通过检测肠道病理组织切片、血浆内毒素（LPS）及血浆二胺氧化酶（DAO）水平,初步明确BMSCs对糖尿病脓毒症大鼠肠道粘膜屏障功能障碍的治疗作用。研究主要结果:1、BMSCs治疗组较CLP+Saline组肠绒毛损伤相对较轻,坏死、脱落少。2、BMSCs治疗组可降低大鼠CLP术后血浆DAO及LPS的水平,24h节点均有统计学差异（P<0.05）。3、相关性分析提示,大鼠小肠绒毛高度/面积与血浆DAO和LPS水平呈负相关（P<0.05）。结论:BMSCs可减轻糖尿病脓毒症大鼠肠道粘膜损伤,对大鼠肠道粘膜屏障具有一定的保护作用。第三章:BMSCs对糖尿病脓毒症大鼠肠道粘膜免疫保护作用及可能机制研究目的及方法:通过检测肠组织炎症因子水平、空肠液sIgA及肠系膜淋巴结、派氏淋巴结（PP）功能变化,初步探讨BMSCs对糖尿病脓毒症大鼠肠道免疫屏障保护作用及可能机制。研究主要结果:1、BMSCs治疗组肠组织炎症因子IFN-γ、TNF-α及LPS水平含量较CLP+Saline组显着降低,而IL-10水平增高,且均有统计学差异（P<0.05）。2、BMSCs治疗组空肠液中总sIgA水平高于CLP+Saline组;而游离型sIgA水平低于CLP+Saline组,有统计学差异（P>0.05）。3、BMSCs治疗组肠淋巴细胞凋亡率明显低于CLP+Saline组（P<0.05）;且淋巴细胞膜表面PD-1表达强度明显增加,与对照组相比,其荧光强度无差异。结论:BMSCs可抑制肠淋巴细胞凋亡;维持肠道淋巴细胞膜上PD-1表达,在促进肠道黏膜免疫系统恢复稳态中起着关键作用。
侯君艺[8]（2008）在《姜黄素防治细菌脓毒症的实验研究》文中研究指明背景与目的脓毒症是由严重细菌感染引起的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）的晚期失代偿表现,可导致感染性体克（septic shock）、多器官功能障碍综合症（multiple organ dysfuction syndrome, MODS）。近年来,虽然大量广谱、高效抗生素的应用为临床治疗脓毒症提供了有力的措施,但并没有从根本上改变脓毒症患者高病死率的现状。姜黄素（Curcumin,Cur）具有拮抗脂多糖诱发的炎症反应的作用,本课题将从动物水平观察姜黄素对大肠埃希菌感染导致的细菌脓毒症的防治作用,并进一步从细胞分子水平探讨其作用机制。方法（1）体外培养小鼠单核巨噬细胞RAW264.7,观察姜黄素对LPS诱导RAW264.7细胞释放TNF-α（tumor necrosis factor-α）和NO（nitric oxide）的影响;（2）建立小鼠脓毒症模型,观察姜黄素对大肠埃希菌感染小鼠的保护作用;（3）以蛋白免疫印迹法分析姜黄素对LPS诱导RAW264.7细胞NF-кB核转移的影响;（4）以蛋白免疫印迹分析姜黄素对RAW264.7细胞Hsp70表达的影响。结果（1）姜黄素显着抑制LPS诱导RAW264.7细胞的TNF-α和NO释放,并具有明显的量效关系;（2）100、200 mg/kg姜黄素显着降低大肠埃希菌感染小鼠的死亡率,降低血清中TNF-α和NO的含量,并减轻细菌脓毒症小鼠的肝脏损害;（3）姜黄素具有明显的抑制LPS诱导RAW264.7细胞NF-кB核转移的作用;（4）姜黄素能够诱导RAW264.7细胞表达Hsp70蛋白,并呈明显的时效和量效关系。结论姜黄素对细菌脓毒症小鼠具有显着保护作用,其机制可能与姜黄素上调单核巨噬细胞Hsp70蛋白的表达,进而抑制NF-кB的活化,并与抑制单核巨噬细胞释放TNF-α和NO等炎症因子有关。
崔晓辉[9]（2007）在《硫化氢在大鼠内毒素休克发生发展中的作用及其对一氧化氮和一氧化碳的影响》文中研究指明内毒素休克（endotoxic shock,ES）多由革兰氏阴性杆菌内毒素引起,血管调节功能失调、血管扩张引起的低血压及全身炎症反应导致的器官组织损伤为其主要的临床病理过程。内毒素主要活性成分脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）可激活或诱发各种内源性炎症介质如补体、激肽及多种细胞因子,包括肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor,TNF-α）、白介素-1β（interleukin-1β,IL-1β）和干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）等。以往实验证明许多炎症介质本身即是血管活性物质,是参与休克发生发展的主要因素。然而内毒素休克时,循环衰竭器官组织炎症性损伤的确切发病机制尚未阐明,且在临床治疗上仍是一个非常棘手的问题。近年来,随着分子生物学研究进展,发现小分子气体如一氧化氮（nitric oxide,NO）和一氧化碳（carbon monoxide,CO）在休克时含量增高,对血压调节和血管舒张起重要作用。但内毒素休克时低血压状态发生的确切机制仍未完全阐明,大量的研究表明,内毒素休克时严重低血压的形成并非完全由于此时大量诱导生成的NO和CO所致,而且NO、CO在内毒素休克组织炎症反应的发生发展过程中具有“双面刃”作用。选择性抑制NO的产生（应用诱生型NO合酶抑制剂）能减轻内毒素引起的组织炎症性损伤,而完全抑制NO、CO的产生虽能使内毒素休克动物血压升高,但并未能降低内毒素休克动物的死亡率和延长其存活时间,甚至是相反的结果。九十年代中叶,人们发现在体内半胱氨酸代谢过程中生成小分子气体硫化氢（hydrogen sulfide,H2S）,对神经系统特别是海马功能具有调节作用,且可以调节消化道和血管平滑肌张力,其生物学作用类似NO和CO。H2S作为内毒素休克时一系列病理生理反应中的一种新的内源性介质,已开始受到人们的重视。目前,内源性H2S的生理与病理意义远未阐明,其在内毒素休克中的病理生理作用研究较少且尚存在争议。有研究报道H2S生成增多导致了内毒素休克低血压和组织炎症性损伤的发生,抑制H2S产生后可改善低血压和组织损伤。但也有研究认为H2S具有组织保护作用,如Yuka等认为内源性H2S可通过增加谷胱甘肽的生成来保护神经元免受氧化损伤;Bian的研究显示H2S在缺血性心肌损伤中发挥细胞保护作用;Fiorucci等人证实H2S通过改善胃的微循环可减轻抗炎性非甾体类药物引起的胃损伤。因此,本研究在建立内毒素休克大鼠模型的基础上,观察血浆中H2S含量的变化与低血压、组织炎症性损伤的关系,从而证实H2S在内毒素休克时的确切作用;观察H2S在内毒素休克发生发展中的作用与NO、CO的关系,旨在探讨H2S在内毒素休克发生发展中的作用及其机制,以期进一步揭示内毒素休克的发病机制。1内毒素休克大鼠模型的建立内毒素休克（endotoxic shock,ES）是一个以急性微循环障碍为主的常见临床危重病症,死亡率极高。因此,如何防治内毒素休克的发生是重症医学所关注并亟待解决的重大课题。在本研究中,我们试图阐明其发病机制,为此需制备较稳定的ES动物模型。革兰氏阴性细菌内毒素的主要活性成分脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）是内毒素休克的首要原因,本部分实验通过静脉注入LPS复制内毒素休克模型。Wistar大鼠64只,随机分成三组:①对照组（n=18）:经静脉注入生理盐水（1 ml/kg）;②小剂量LPS组（n=22）:经静脉注入LPS 5 mg/kg（LPS 5 mg/ml,1 ml/kg）;③大剂量LPS组（n=24）:经静脉注入LPS 10 mg/kg（LPS 10 mg/ml,1 ml/kg）。连续监测生理盐水、LPS注入后6 h内的平均动脉压（MAP）、心率变化;并于生理盐水、LPS注入后不同时间点（30, 60, 90 min, 2, 3, 4, 6 h）留取血浆,测定血浆中的TNF-α含量;实验结束后计算各组大鼠的存活率（LPS注入6 h后未死亡者计为存活）。结果发现:①大鼠的基础血压（给药前）在三组之间无显着差异（P > 0.05）。在6 h实验过程中,对照组大鼠MAP无明显变化,维持在110±5 mmHg 106±9 mmHg范围内。大剂量LPS（10 mg/kg）组大鼠MAP迅速下降,但15 min内回升至正常（考虑为应激性反应）,并维持60 min左右,然后逐渐缓慢下降,并呈进行性持续性降低,4 h接近最低水平（69±4 mmHg）,一直维持到6 h,均明显低于同时间点对照组的血压（P均< 0.01）。小剂量LPS（5 mg/kg）组大鼠注入LPS后3 h内MAP没有明显的变化,3 h后开始缓慢下降,4 h时明显下降,6 h接近最低水平。②大剂量LPS（10 mg/kg）组大鼠注入LPS后心率短暂减慢,随后逐渐回升至正常（考虑为应激性反应）,并维持30 min左右,于90120 min后逐渐缓慢减慢,直至死亡。另外存活时间长的大鼠心率回升幅度大,存活时间短者心率多无明显回升。对照组和小剂量LPS（5 mg/kg）组心率短暂加快后有所减慢。③对照组全部存活,大剂量LPS（10 mg/kg）组存活率为66.67%（16/24,P < 0.05 vs对照组）,小剂量LPS（5 mg/kg）组存活率为90.91%（20/22）。大鼠最短存活时间3.5 h。④两个剂量的LPS组大鼠血浆中TNF-α含量均于注入LPS后逐渐上升（P均< 0.05 vs对照组）,60 min明显上升（P均< 0.05 vs对照组）,90 min达高峰（P均<0.01 vs对照组）,然后逐渐下降,均于3 h接近正常水平（P均> 0.05 vs对照组）。小剂量组TNF-α上升幅度高于大剂量组。对照组各时间点TNF-α均未测出。结果提示:本部分实验通过静脉注入大剂量LPS的方法成功复制了内毒素休克动物模型。应用LPS建立的感染性休克动物模型MAP、心率变化与临床感染性休克相似,是一个理想的模型。2内毒素休克大鼠血浆和主要器官中硫化氢含量的变化和意义2.1内毒素休克大鼠血浆中硫化氢含量的变化和意义内毒素休克多由革兰氏阴性杆菌内毒素的主要活性成分脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）引起,以血管调节功能失调,血管扩张致低血压为主要临床表现。近年来,随着分子生物学研究进展,发现小分子气体如一氧化氮（nitric oxide,NO）和一氧化碳（carbon monoxide,CO）在休克时含量增高,对血压调节和血管舒张起重要作用。但ES时低血压状态发生的确切机制仍未完全阐明,大量的研究表明,ES时严重低血压的形成并非完全由于此时大量诱导生成的NO和CO所致,其中体内半胱氨酸代谢过程中生成的小分子气体硫化氢（hydrogen sulfide,H2S）作为感染性休克时一系列病理生理反应中的一种新的内源性介质,已开始受到人们的重视。目前,内源性H2S的生理与病理意义远未阐明,其在ES中的病理生理作用研究较少且报道不一。本研究在建立内毒素休克大鼠模型的基础上观察了血浆中H2S含量的变化,以探讨H2S在内毒素休克低血压发生中的作用。Wistar大鼠96只,每组24只。实验分为:①正常对照组:经静脉注入生理盐水（1 ml/kg）;②LPS组:经静脉注入LPS（10 mg/ml,1 ml/kg）;③LPS+硫氢化钠（NaHS,H2S供体）组:注入LPS前10 min经腹腔注入NaHS（28μmol/kg,溶于0.5 ml生理盐水）;④LPS+炔丙基甘氨酸（PPG,H2S代谢酶抑制剂）组:注入LPS前30 min经腹腔注入PPG（45 mg/kg,溶于0.5 ml生理盐水）。连续监测生理盐水、LPS注入后6 h内的MAP和心率的变化;并于生理盐水、LPS注入后不同时间点经股动脉（30, 60, 90 min, 2, 3, 4, 6 h）留取血浆测定H2S含量。结果如下:①大鼠的基础血压（给药前）在4组之间无显着差异（P > 0.05）。在6 h实验过程中,对照组大鼠MAP无明显变化,维持在110±5 mmHg 106±9 mmHg范围内。LPS组大鼠MAP迅速下降,但15 min内回升至正常（考虑为应激性反应）,并维持60 min左右,然后逐渐缓慢下降,90 min时血压明显降低（81±3 mmHg）并呈进行性持续性降低,4 h接近最低水平（69±4 mmHg）,一直维持到6 h,均明显低于同时间点对照组的血压（P均< 0.01）。LPS+PPG组MAP在90 min（97±5 mmHg）,4 h（92±6 mmHg）,6 h（88±7 mmHg）均显着高于同时间点的LPS组（P < 0.05或P < 0.01）;与同时间点的LPS组相比,LPS+NaHS组MAP值在90 min（74±6 mmHg）,4h（51±5 mmHg）,6h（43±4 mmHg）均更为降低（P < 0.05或P < 0.01）。②LPS组大鼠注入LPS后心率短暂减慢,随后逐渐回升至正常（考虑为应激性反应）,并维持30 min左右,于90120 min后逐渐缓慢减慢,直至死亡,LPS+NaHS组与同时间点的LPS组相比,心率减慢明显（3、4、6 h,P < 0.05）。对照组和LPS+PPG组心率短暂回升后有所减慢。③LPS组大鼠血浆H2S含量呈增高趋势,注入LPS后4 h较对照组增高,6 h明显增高（P均< 0.05）,且LPS大鼠血浆中H2S含量（注入LPS后4、6 h）与血压呈显着负相关关系,其相关系数分别为-0.973和-0.986（P均< 0.05）;LPS+PPG组大鼠血浆H2S含量较相应时间点（注入LPS后4、6 h）的LPS组明显降低（P < 0.05）;LPS+NaHS组大鼠血浆中H2S含量明显高于相应时间点（注入LPS后4、6 h）的LPS组（P均< 0.05）。以上结果提示,内毒素休克大鼠严重低血压发生的部分原因是由于H2S生成增多所致。2.2内毒素休克大鼠主要器官中硫化氢含量的变化和意义我们已在前面的实验中证实内毒素休克大鼠严重低血压发生的部分原因是由于H2S生成增多所致。本实验通过观察大鼠主要器官组织中H2S含量的变化及其与内毒素休克组织损伤的关系,进一步探讨H2S在内毒素休克的病理生理调节机制中的作用。将154只雄性Wistar大鼠随机分为四组:①正常对照组（n=28）:经静脉注入生理盐水（1 ml/kg）;②LPS组（n=50）:经静脉注入LPS（10 mg/kg, 10 mg/ml）;③LPS+硫氢化钠（NaHS,H2S供体）组（n=38）:注入LPS前10 min经腹腔注入NaHS（28μmol/kg,溶于0.5 ml生理盐水）;④LPS+炔丙基甘氨酸（PPG,H2S代谢酶抑制剂）组（n=38）:注入LPS前30 min经腹腔注入PPG（45 mg/kg,溶于0.5 ml生理盐水）。于生理盐水、LPS注入后不同时点分别留取血清、血浆、脾脏（0 h、2 h、4 h、6 h）及心、肝、肺、肾（6 h）等主要器官组织。检测各组织中MDA含量、MPO活性、硫化氢合酶活性和H2S含量;检测血清乳酸脱氢酶、转氨酶及血浆尿素氮、肌酐水平;检测脾脏组织中IL-1β、IL-6含量;测定动脉血氧分压（PaO2）并观察各组织的形态学变化。结果如下:①与对照组相比,LPS注入6 h组心、肝、脾、肺、肾各组织中MDA含量、MPO活性均明显增高（P均< 0.01）;与LPS组相比,LPS+PPG组各组织中MDA含量、MPO活性均明显降低（P均< 0.01）,而LPS+NaHS组各组织中MDA含量、MPO活性较LPS组均明显增高（P均< 0.01）。②LPS组较对照组大鼠血清中LDH和ALT活性显着增高（P均< 0.05）;与LPS组相比,LPS+PPG组大鼠血清中LDH和ALT活性较明显降低（P均< 0.05）;LPS+NaHS组大鼠血清中LDH和ALT活性明显高于相应时间的LPS组的变化（P均< 0.05）。③对照组大鼠脾脏组织中IL-1β的浓度低于检测的下限,IL-6浓度为54.03±6.57 ng/L。大鼠脾脏组织中细胞因子（IL-1β、IL-6）的浓度随着LPS刺激时间的延长而升高,与对照组相比,LPS组各时间点的大鼠脾脏组织中IL-1β、IL-6的浓度均有显着差异（P均< 0.05）。IL-1β及IL-6的浓度分别于注入LPS后2 h、4 h达到高峰,IL-1β、IL-6的浓度分别为342.14±14.89 ng/L及4022.76±39.72 ng/L。PPG预注入（LPS+PPG组）可使大鼠脾脏组织中IL-1β（2 h）、IL-6（4 h）的浓度较同时间点LPS组的相应浓度分别降低86.9%、62.8%（P均< 0.05）,但均仍高于对照组（P均< 0.05 vs对照组）;NaHS预注入（LPS+NaHS组）可使大鼠脾脏组织中IL-1β（2 h）、IL-6（4 h）的浓度较同时间点LPS组的相应浓度分别增高86.9%、62.8%（P均< 0.05）。④与对照组相比,LPS组大鼠PaO2显着降低（P均< 0.05）;LPS+PPG组较LPS组大鼠PaO2明显增高（P均< 0.05）;LPS+NaHS组大鼠PaO2明显低于相应时间点的LPS组的变化（P均< 0.05）。⑤给药前各组间血浆BUN和Cr无显着性差异;给药后,LPS组2 h、4 h、6 h血浆BUN和Cr含量均显着升高（P均< 0.05）;与LPS组相比,LPS+PPG组4 h、6 h血浆BUN和Cr含量均明显减少（P均< 0.05）,LPS+NaHS组4 h、6 h血浆BUN和2h、4h血浆Cr含量明显升高,且均有显着性差异（P均< 0.05）。⑥LPS组较对照组大鼠心、肝、脾、肺、肾各组织中H2S含量及硫化氢合酶活性显着增高（P均< 0.05）;LPS+PPG组较LPS组大鼠组织中H2S含量及硫化氢合酶活性明显降低（P均< 0.05）;LPS+NaHS组大鼠组织中H2S含量及硫化氢合酶活性明显高于相应时间点LPS组的变化（P均< 0.05）。⑦对照组心、肝、脾、肺、肾各组织结构无异常改变。LPS注入后,各组织均可见明显的损伤性变化,主要表现为细胞肿胀和细胞间质水肿,细胞间大量炎性细胞浸润;PPG可明显减轻LPS所致的各组织中细胞及间质水肿和炎性细胞浸润;而NaHS可加重各组织损伤。结果提示内毒素休克大鼠组织炎症损伤的发生与H2S生成增多密切相关。3硫化氢在内毒素休克中的作用与一氧化氮的关系我们前面的研究发现,内毒素休克时低血压及此时由于炎症导致的组织损伤的部分原因是由于内源性H2S生成增多引起的。我们课题组以往的研究发现,在LPS所致的急性肺损伤模型中,内源性H2S生成不足、NO大量产生可能是肺损伤发生的机制之一;外源性H2S的抗组织损伤作用可能与其抑制iNOS活性,减少NO的大量产生有关。但是H2S在内毒素休克中的作用与NO有何关系报道较少且尚有争议。在本部分实验中我们将组织代谢生成H2S的关键酶[(胱硫醚-γ-裂解酶（Cystathionineγ-lyase, CSE）]的抑制剂炔丙基甘氨酸（propargylglycine,PPG）及外源性H2S供体NaHS应用于内毒素大鼠,观察H2S对内毒素休克大鼠NOS/NO体系的影响,以探讨H2S在内毒素休克中的作用与NO的关系。32只雄性Wistar大鼠随机分为四组:①正常对照组:经静脉注入生理盐水（1 ml/kg）;②LPS组:经静脉注入LPS（10 mg/kg）;③LPS+硫氢化钠（NaHS,H2S供体）组:注入LPS前10 min经腹腔注入NaHS（28μmol/kg,溶于0.5 ml生理盐水）;④LPS+炔丙基甘氨酸（PPG,H2S代谢酶抑制剂）组:注入LPS前30 min经腹腔注入PPG（45 mg/kg,溶于0.5 ml生理盐水）。于生理盐水、LPS注入后6 h分别留取心、肝、脾、肺、肾等主要器官组织。应用试剂盒测定各组织中NOS活性和NO含量;采用免疫组织化学和Western blot方法检测各组织中iNOS的表达。结果如下:①与对照组相比,LPS组心、肝、脾、肺、肾各组织中iNOS活性和NO含量均明显增高（P < 0.05或P < 0.01）;LPS+PPG组较LPS组各组织中iNOS活性和NO含量均明显降低（P < 0.05或P < 0.01）;而LPS+NaHS组较LPS组各组织中iNOS活性和NO含量均明显增高（P < 0.05或P < 0.01）。②LPS组较对照组各组织中eNOS活性明显降低（P均< 0.05）; LPS+PPG组较LPS组各组织中eNOS活性增高（P均< 0.05）;NaHS+LPS组各组织中eNOS活性明显低于LPS组相应变化（P均< 0.05）。③应用iNOS特异性抗体对各组织进行免疫组织化学细胞定位检测。结果显示,正常对照组各组织中未见HO-1蛋白表达的阳性棕黄色颗粒,LPS组各组织中出现iNOS蛋白表达的阳性信号,主要分布在炎症细胞及各组织的实质细胞以及血管平滑肌细胞等的胞浆内;PPG可使LPS诱导的iNOS蛋白表达减少;NaHS可使LPS诱导的iNOS蛋白表达增多。④各组织iNOS的Western blot检测结果进行信号密度扫描后显示,与对照组相比,LPS可使各组织中iNOS蛋白表达增多（P均< 0.05）;PPG可使LPS诱导的iNOS蛋白表达减少（P < 0.05或P < 0.01）;NaHS可使LPS诱导的iNOS蛋白表达增多（P均< 0.05）。以上结果提示:H2S可使eNOS活性下降,iNOS活性升高及随后产生的大量NO,此可能与H2S导致内毒素休克及休克时的组织损伤有关。4硫化氢在内毒素休克中的作用与一氧化碳的关系近年来大量的研究表明,内毒素休克严重低血压的形成及组织的炎症损伤并非完全由于iNOS诱导生成的NO所致,其中血红素氧合酶-1/一氧化碳（heme oxygenase-1/carbon monoxide,HO-1/CO）系统作为感染性休克一系列病理生理反应中的内源性介质也已逐渐为人们所重视。我们前面的研究发现,内毒素休克时的低血压及此时由于炎症导致的组织损伤的部分原因是由于内源性H2S生成增多引起的。可见,迄今发现的三种内源性气体信号分子,即NO、CO和H2S均参与了内毒素休克的发生。第三部分的实验已证实,H2S在内毒素休克过程中的作用与NO有关。那么在此过程中,H2S的作用与HO-1/CO有无联系、H2S对HO-1/CO有无作用呢?本部分实验将观察内毒素休克时H2S对HO-1/CO的影响。将64只雄性Wistar大鼠随机分为四组:①正常对照组:经静脉注入生理盐水（1 ml/kg）;②LPS组:经静脉注入LPS（10mg/kg, 10 mg/ml）;③LPS+硫氢化钠（NaHS,H2S供体）组:注入LPS前10 min经腹腔注入NaHS（28μmol/kg,溶于0.5 ml生理盐水）;④LPS+炔丙基甘氨酸（PPG,H2S代谢酶抑制剂）组:注入LPS前30 min经腹腔注入PPG（45 mg/kg,溶于0.5 ml生理盐水）。于生理盐水、LPS注入后不同时间点自股动脉分别留取肝素抗凝的血液（0, 30, 60, 90 min, 2, 3, 4, 6 h）和心、肝、脾、肺、肾等主要器官组织（6 h）。测定血液和各组织中CO含量;采用免疫组织化学和Western blot方法检测各组织中HO-1蛋白的表达。结果如下:①与对照组相比,LPS组血液和各组织中CO含量均明显增高（P均< 0.05）;LPS+PPG组较LPS组血液和各组织中CO含量均明显降低（P均< 0.05）;而LPS+NaHS组较LPS组血液和各组织中CO含量均明显增高（P均< 0.05）。②应用HO-1特异性抗体对各组织进行免疫组织化学细胞定位检测。结果显示,正常对照组各组织中未见HO-1蛋白表达的阳性棕黄色颗粒,LPS组各组织中出现HO-1蛋白表达的阳性信号,主要分布在炎症细胞及各组织的实质细胞以及血管平滑肌细胞等的胞浆内;PPG可使LPS诱导的HO-1蛋白表达减少;NaHS可使LPS诱导的HO-1蛋白表达增多。③各组织HO-1的Western blot检测结果进行信号密度扫描后显示,与对照组相比,LPS可使各组织中HO-1蛋白表达增多;PPG可使LPS诱导的HO-1蛋白表达减少;NaHS可使LPS诱导的HO-1蛋白表达增多（P均< 0.05）。结果提示H2S可上调内毒素休克大鼠HO-1/CO通路。但HO-1/CO上调的确切机制和在休克中的作用还有待阐明。结论本研究在建立内毒素休克大鼠模型的基础上从整体和分子水平较为系统地观察了H2S在内毒素休克发生发展中的作用及其对NO和CO的影响。探讨了H2S在内毒素休克发生发展中的作用及其机制,为进一步揭示内毒素休克的发病机制提供了实验依据。1通过静脉注入大剂量LPS的方法成功复制了内毒素休克动物模型。应用LPS建立的感染性休克动物模型MAP、心率变化与临床感染性休克相似,是一个理想的模型。2内毒素休克大鼠严重低血压和组织炎症损伤的发生与H2S生成增多有关。3首次发现H2S可使内毒素休克大鼠组织中eNOS活性下降,iNOS活性升高及随后产生的大量NO,该作用可能与H2S导致内毒素休克及休克时组织的炎症损伤有关。4首次发现H2S可上调内毒素休克大鼠组织中的HO-1/CO通路。但HO-1/CO上调的确切机制和在休克中的作用还有待阐明。
王蕾[10]（2006）在《参附黄注射液对脓毒症大鼠的器官保护作用及其分子机制研究》文中认为脓毒症是具有感染依据的全身炎症反应综合症,是烧创伤、休克、感染等临床危急重症患者的严重并发症之一,也是诱发脓毒性休克、多器官功能障碍综合症的重要原因。脓毒症的发病不仅与炎症失控相关,还涉及到免疫系统、凝血系统、内分泌调节等以及它们之间的相互作用。目前脓毒症发病率居高不下,缺乏行之有效的治疗方法,而且成本高昂,成为严重影响生命健康的重要疾患,中西医结合治疗可能是提高脓毒症防治效果的有效途径之一。1理论依据总结临床危急重症救治经验,提出对脓毒症中医病因病机的新认识:外来之毒与内生毒邪互结是主要病因基础;内陷营血是主要病变层次;深入络脉是传变的重要途径;正虚毒损、络脉闭阻是关键病机变化;扶正解毒通络、分层扭转是主要治则。由中药大黄、附子和红参提取有效成分,制备参附黄注射液,作为本治法的代表方剂。2参附黄注射液对脓毒症动物死亡率和器官功能和形态的影响采用盲肠结扎穿孔手术（CLP）复制脓毒症大鼠模型,静脉注射参附黄注射液。雄性Wistar大鼠96只,随机分为4组:①正常对照组,n=8;②假手术组,n=8;③盲肠结扎穿孔组,n=40,按时间点分为CLP后2、8、24、48小时组;④参附黄注射液治疗组,n=40,分组同模型组。经腹主动脉采血,无菌留取肝、肺、肾组织,冷冻保存备用。观察脓毒症大鼠死亡率、生存时间和肝、肺脏病理学改变,检测肝功、肾功、心肌酶谱和二胺氧化酶水平变化。结果显示:治疗组术后72小时死亡率明显降低（88.88% vs. 67.57%）,术后48小时死亡率也有降低趋势（83.33% vs. 62.16%）,治疗组生存时间明显延长,但两组死亡率在术后120小时和1周的终末观察点无差别。可见,参附黄注射液有改善脓毒症动物预后的作用,虽然没有改变死亡的终末结果,但是延长了生存时间,为早期救治赢得宝贵的时机。治疗组动物血清ALT、AST、BUN、Cr水平在CLP术后24小时和48小时均有不同程度的下降,具有统计学差异。治疗组2小时、24小时DAO水平有下降趋势。本药对心肌酶无明显影响。肝、肺组织病理学观察显示:治疗组组织病理改变程度显着减轻。参附黄注射液能够改善脓毒症动物模型的肝、肾器官功能,减轻肝、肺和肠道组织损伤,对脓毒症动物具有一定的器官保护作用。3参附黄注射液对脓毒症动物炎症介质基因表达和蛋白合成的影响采用ELISA试剂盒检测脓毒症动物血浆和肝、肺组织匀浆中TNF-α、IL-10的蛋白水平,荧光实时定量PCR技术测定肝、肺组织TNF-αmRNA、IL-10 mRNA表达。TNF-α是目前已知释放最早的细胞因子之一,也是炎症反应的最初触发者。结果显示:正常组织中有少量的TNF-α蛋白合成,其中肝脏含量多,约为肺脏的70倍。术后2小时,肝、肺组织
二、大鼠血浆TNF-α的测定以及小剂量rTNF-α对感染的大鼠保护作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠血浆TNF-α的测定以及小剂量rTNF-α对感染的大鼠保护作用（论文提纲范文）
（1）乌司他丁通过抑制NLRP3活化减轻脓毒症肠道炎症反应的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研方内容与方法 |
| 1 研究对象 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 物品准备及实验分组 |
| 2.2 脓毒症模型的构建 |
| 2.3 标本的获取及保存 |
| 2.4 ELISA法测各组大鼠血清中IL-1β、TNF-α、I-FABP的表达水平 |
| 2.5 苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠肠道病理改变 |
| 2.6 Western Blot 法测定大鼠小肠组织 NF-κB p65 及 NLRP3 炎症小体蛋白的表达 |
| 2.7 免疫组化(IHC)法检测肠道组织 Claudin-1、Occludin、NLRP3、Caspase-1、ASC 的表达水平 |
| 3 质量控制 |
| 4 统计方法 |
| 5 技术路线图 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 脓毒症肠道功能障碍的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间的成果 |
| 导师评阅表 |
（2）通腑理肺汤对脓毒症肠功能损伤的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 脓毒症与炎症反应 |
| 第二节 脓毒症与肠功能损伤 |
| 一、脓毒症肠损伤动物模型研究 |
| 二、脓毒症肠黏膜屏障功能研究 |
| 三、肠黏膜屏障与紧密连接研究 |
| 四、肠道通透性与肠屏障损伤病理研究 |
| 五、脓毒症肠功能损伤防治现状 |
| 第三节 脓毒症及脓毒症肠功能损伤中医药研究现状 |
| 一、中医对脓毒症病因病机的辨证认识 |
| 二、脓毒症及脓毒症肠功能损伤的中医治法 |
| 第二章 通腑理肺汤对肠功能损伤的保护作用及机制研究 |
| 第一节 通腑理肺汤对脓毒症肠功能损伤患者的保护作用研究 |
| 一、临床资料 |
| 二、研究方法 |
| 三、研究结果 |
| 第二节 通腑理肺汤对脓毒症肠功能损伤的基础研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 第三节 结论 |
| 第三章 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（3）骨髓间充质干细胞外泌体对脓毒症大鼠肠屏障功能影响及相关机制探讨（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Absract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、骨髓间充质干细胞及外泌体分离和鉴定 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 研究对象 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 研究方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 大鼠骨髓间充质干细胞形态学观察 |
| 1.2.2 骨髓间充质干细胞表面抗原鉴定 |
| 1.2.3 骨髓间充质干细胞外泌体形态学观察 |
| 1.2.4 骨髓间充质干细胞外泌体表面标志物鉴定 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、脓毒症大鼠模型制备及生存率观察 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 研究方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 大鼠术后一般情况 |
| 2.2.2 大鼠术后腹部情况 |
| 2.2.3 大鼠术后72小时生存率 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、骨髓间充质干细胞外泌体对脓毒症大鼠肠屏障功能影响及相关机制探讨 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 研究对象 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 研究方法 |
| 3.1.5 统计方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 骨髓间充质干细胞外泌体对脓毒症大鼠肠病理变化及评分的影响 |
| 3.2.2 骨髓间充质外泌体对脓毒症大鼠肠通透性的影响 |
| 3.2.3 骨髓间充质干细胞外泌体对脓毒症大鼠肠炎症变化的影响 |
| 3.2.4 骨髓间充质干细胞外泌体对脓毒症大鼠肠相关信号通路的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 骨髓间充质干细胞外泌体对脓毒症大鼠肠屏障功能影响 |
| 3.3.2 骨髓间充质干细胞外泌体对脓毒症大鼠肠屏障功能影响的机制探讨 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 外泌体研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）基于AMPK/PGC-1α通路探讨亚甲蓝对脓毒症脑能量代谢调控作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 脓毒症相关性脑病细胞模型的制备以及对线粒体损伤的观察 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要仪器设备和试剂 |
| 1.3 内容与方法 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计学分析 |
| 1.6 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 亚甲蓝对脓毒症相关性脑病细胞模型的AMPK/PGC-1α通路的调控研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要仪器设备和试剂 |
| 1.3 内容与方法 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计学分析 |
| 1.6 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 亚甲蓝通过调控AMPK/PGC-1α通路影响脓毒症相关性脑病大鼠的脑能量代谢的研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要仪器设备和试剂 |
| 1.3 内容与方法 |
| 1.4 质量控制 |
| 1.5 统计学分析 |
| 1.6 技术路线图 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（5）瑞舒伐他汀对脓毒症大鼠心血管损伤的保护作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 瑞舒伐他汀对LPS诱导的脓毒症大鼠心血管损伤的保护作用 |
| 1.1 背景 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 统计方法 |
| 1.4 结果 |
| 1.5 讨论 |
| 第二部分 瑞舒伐他汀对LPS诱导的大鼠主动脉内皮细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制研究 |
| 2.1 背景 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 统计方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
（6）NADPH氧化酶2及右美沙芬在内毒素诱导的病态行为中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、NOX在内毒素诱导的小鼠病态行为中的作用 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 实验设备及材料 |
| 1.1.3 实验方法 |
| 1.1.4 统计分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 病态行为 |
| 1.2.2 旷场实验 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 疾病状态下的行为学的变化 |
| 1.3.2 疾病状态下的情绪变化 |
| 1.3.3 病态行为是一种机体对感染及炎症反应的适应性反应 |
| 1.3.4 病态行为反映的是动机状态 |
| 1.4 小结 |
| 二、NOX2 在内毒素诱导的中枢系统炎症中的作用 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验设备及材料 |
| 2.1.3 实验方法 |
| 2.1.4 统计分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 免疫组化染色 |
| 2.2.2 炎症因子蛋白测定 |
| 2.2.3 炎症因子mRNA |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 NOX酶的亚细胞结构分布 |
| 2.3.2 ROS在中枢神经系统细胞中信号传导的作用 |
| 2.3.3 NOX2 在小胶质细胞活化的作用 |
| 2.4 小结 |
| 三、右美沙芬在内毒素诱导的小鼠病态行为中的作用 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验设备及材料 |
| 3.1.3 实验方法 |
| 3.1.4 统计分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 病态行为 |
| 3.2.2旷场实验 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 右美沙芬的神经系统保护性作用 |
| 3.3.2 DM的神经系统保护性机制——抑制谷氨酰胺/NMDA及电压门控钙离子通道 |
| 3.3.3 DM的神经系统保护性机制——Sigma-1 受体拮抗剂 |
| 3.4 小结 |
| 四、右美沙芬在内毒素诱导的中枢神经系统炎症中的作用 |
| 4.1 对象和方法 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验设备及材料 |
| 4.1.3 实验方法 |
| 4.1.4 统计分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 免疫组化染色 |
| 4.2.2 炎症因子蛋白测定 |
| 4.2.3 炎症因子mRNA测定 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 NOX2 抑制剂与中枢神经系统炎症 |
| 4.3.2 右美沙芬与中枢神经系统炎症反应 |
| 4.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 病态行为的研究进展——从细胞因子,前列腺素以及补体系统向神经元功能展望 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）BMSCs干预对糖尿病脓毒症大鼠肠屏障功能影响的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 糖尿病脓毒症模型建立及生存曲线分析 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验材料 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 结果 |
| 1.5 讨论 |
| 第二章 BMSCs对糖尿病脓毒症大鼠肠道粘膜屏障作用初步观察 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 BMSCs对糖尿病脓毒症大鼠肠道粘膜免疫保护作用的可能机制 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（8）姜黄素防治细菌脓毒症的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 姜黄素对LPS诱导RAW264.7释放炎症因子的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 姜黄素对RAW264.7细胞释放 TNF-α的影响 |
| 3.2 姜黄素对 LPS 诱导 RAW264.7 细胞释放TNF-α的影响 |
| 3.3 姜黄素对LPS诱导RAW264.7细胞释放NO的响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 姜黄素对脓毒症小鼠的保护作用 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 血浆内毒素的检测 |
| 3.2 姜黄素对细菌脓毒症小鼠血清TNF-α和NO 的影响 |
| 3.3 姜黄素对脓毒症小鼠血清ALT 和AST 的影响 |
| 3.4 肝脏病理改变 |
| 3.5 姜黄素对脓毒症小鼠生存率的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 姜黄素抗炎作用机制的探讨 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 LPS 刺激对 RAW264.7 细胞 NF-kB ( p65 )核移位的影响 |
| 3.2 姜黄素对 LPS 刺激 RAW264.7 细胞 NF-кB ( p65 )核移位的影响 |
| 3.3 姜黄素对 RAW264.7 细胞 HSP70 蛋白的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
（9）硫化氢在大鼠内毒素休克发生发展中的作用及其对一氧化氮和一氧化碳的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 研究论文 硫化氢在内毒素休克发生发展中的作用及其对一氧化氮和一氧化碳的影响 |
| 引言 |
| 第一部分 内毒素休克大鼠模型的建立 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 内毒素休克大鼠血浆和主要器官中硫化氢含量的变化和意义 |
| 一、内毒素休克大鼠血浆中硫化氢含量的变化和意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 二、内毒素休克大鼠主要器官中硫化氢含量的变化和意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 硫化氢在内毒素休克中的作用与一氧化氮的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 硫化氢在内毒素休克中的作用与一氧化碳的关系 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 气体信号分子在内毒素休克低血压形成中的作用 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（10）参附黄注射液对脓毒症大鼠的器官保护作用及其分子机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 上篇：文献综述 |
| 一 脓毒症发病机制研究新进展 |
| 二 脓毒症中西医治疗的新疗法和新方向 |
| 中篇 理论探讨 |
| 下篇 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一参附黄注射液对脓毒症大鼠生存率及脏器形态和功能的保护作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附图一 |
| 实验二脓毒症动物炎性介质的变化规律及参附黄注射液的干预用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附图二 |
| 实验三脓毒症动物信号转导因子NF-kB活性和表达变化规律及参附黄注射液的干预作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 附图三 |
| 主要结果和展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、大鼠血浆TNF-α的测定以及小剂量rTNF-α对感染的大鼠保护作用（论文参考文献）
- [1]乌司他丁通过抑制NLRP3活化减轻脓毒症肠道炎症反应的研究[D]. 李祥. 新疆医科大学, 2021(08)
- [2]通腑理肺汤对脓毒症肠功能损伤的保护作用及机制研究[D]. 陈立. 广州中医药大学, 2020(09)
- [3]骨髓间充质干细胞外泌体对脓毒症大鼠肠屏障功能影响及相关机制探讨[D]. 王媛. 天津医科大学, 2020(06)
- [4]基于AMPK/PGC-1α通路探讨亚甲蓝对脓毒症脑能量代谢调控作用[D]. 滑晓莉. 新疆医科大学, 2020(07)
- [5]瑞舒伐他汀对脓毒症大鼠心血管损伤的保护作用及其机制研究[D]. 孙海鹏. 青岛大学, 2019(07)
- [6]NADPH氧化酶2及右美沙芬在内毒素诱导的病态行为中的作用研究[D]. 李毅. 天津医科大学, 2019(02)
- [7]BMSCs干预对糖尿病脓毒症大鼠肠屏障功能影响的实验研究[D]. 陈珍. 南方医科大学, 2017(05)
- [8]姜黄素防治细菌脓毒症的实验研究[D]. 侯君艺. 福建医科大学, 2008(01)
- [9]硫化氢在大鼠内毒素休克发生发展中的作用及其对一氧化氮和一氧化碳的影响[D]. 崔晓辉. 河北医科大学, 2007(06)
- [10]参附黄注射液对脓毒症大鼠的器官保护作用及其分子机制研究[D]. 王蕾. 北京中医药大学, 2006(01)