一、甲型流感病毒诱导产生的IFN-α/β和IL-18可协同加强IFN-γ基因在人T细胞的表达（论文文献综述）
武星辰[1]（2021）在《PCV2感染在PPV致病过程中的免疫调控作用及机制研究》文中提出猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）是引起猪圆环病毒相关疾病（porcine circovirus associated disease,PCVAD）主要病原,PCV2感染会侵害机体免疫系统,使免疫细胞出现不同程度的损伤,从而影响干扰素等细胞因子的表达,抑制机体免疫反应,导致机体对其他病原易感。猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）是引起初孕母猪繁殖障碍性疾病的重要病原,PPV感染的临床表现为流产、产死胎、畸形胎、木乃伊胎及弱仔等。近年来,PPV的感染率和致病率呈现逐年上升趋势,而且感染PPV猪群往往同时可以检测到PCV2混合感染,表现出比PPV单独感染更为严重的症状,给养猪业造成了巨大的经济损失。但是,关于PCV2感染在PPV致病过程中的免疫调控作用及机制迄今未见报道。本研究首先用PCV2和PPV先后感染仔猪,研究PCV2感染对PPV复制的影响,检测白介素-10（interleukin-10,IL-10）、干扰素-β（interferon-β,IFN-β）和白介素-12p40（interleukin-12p40,IL-12p40）等表达的变化。然后,用PCV2感染猪肺泡巨噬细胞（Porcine alveolar macrophages,PAMs）,研究PCV2Rep诱导IL-10表达的调控机制。用PCV2和PPV分别先后感染PK-15细胞和ST细胞,研究PCV2感染对PPV诱导IFN-β表达的调控机制。最后,用PCV2和PPV先后感染PAMs,研究PCV2感染对PPV诱导IL-12p40表达的调控机制。旨在探究PCV2感染在PPV致病过程中的免疫调控作用及机制。研究取得如下结果:1.PCV2感染显着上调仔猪外周血中IL-10的表达,抑制外周血中PPV诱导的IFN-α、IFN-β和IL-12p40表达,上调血清和靶器官中PPV拷贝数28 d龄仔猪感染PCV2 28 d后再感染PPV。在PCV2感染后24 h、48 h采集外周血,ELISA检测发现,PCV2感染可显着上调IL-10表达（P<0.01）。PPV感染后24 h采集外周血,ELISA检测发现,PCV2感染可显着抑制PPV诱导的IFN-α、IFN-β和IL-12p40表达（P<0.01）;q PCR检测发现,PCV2感染可显着抑制PPV诱导的仔猪外周血单个核细胞（PBMC）ISG15、ISG56、IFIT2和CXCL10的m RNA水平（P<0.01）。分别在PPV感染14 dpi、28 dpi采集外周血,q PCR检测发现,PCV2感染可显着上调猪血清中PPV拷贝数（P<0.01）。在PPV感染28 dpi扑杀动物,采集子宫和卵巢,western blotting检测发现,PCV2感染可以显着上调子宫和卵巢内PPV VP2的表达水平（P<0.01）。2.PCV2Rep在PCV2感染后期激活p38-MAPK通路促进IL-10表达PCV2感染PAMs,ELISA和q PCR检测发现,PCV2感染可诱导IL-10持续高表达。PCV1、PCV2、PCV2-Cap1和PCV1-Cap2分别感染PAMs,ELISA和q PCR检测发现,PCV2Cap可持续显着上调IL-10表达（P<0.01）。PCV1、PCV2、PCV2-Rep1和PCV1-Rep2分别感染PAMs,ELISA检测显示,当病毒感染0～24 h,PCV2和PCV2-Rep1感染可显着上调IL-10的表达（P<0.01）;当病毒感染24 h～48 h,PCV1-Rep2感染可显着上调IL-10的表达（P<0.01）;当病毒感染48 h～72 h,PCV1-Rep2感染可持续显着上调IL-10的表达（P<0.01）。IL-10 m RNA表达动态变化与蛋白表达基本一致。r Ad-Rep2感染PAMs,q PCR检测发现,r Ad-Rep2感染显着上调IL-10 m RNA水平（P<0.05,P<0.01）。western blotting检测显示,r Ad-Rep2感染可以激活p38-MAPK通路。si RNAs转染干扰通路后,ELISA检测发现,si-p38可显着抑制r Ad-Rep2感染诱导的IL-10表达（P<0.01）。Ch IP检测显示,r Ad-Rep2感染可显着激活转录因子NF-κB p50和Sp1与il10启动子的结合（P<0.01）。PCV1、PCV2、PCV2-Rep1和PCV1-Rep2分别感染PAMs 12 h、24 h、48 h,western blotting检测显示,PCV1-Rep2在感染48 h激活p38-MAPK磷酸化;Ch IP检测显示,PCV1-Rep2在感染48 h显着增强NF-κB p50和Sp1与il10启动子的结合（P<0.05）。ELISA检测发现,si-TDG可以显着抑制Rep介导的IL-10表达（P<0.01）。q PCR检测发现,si-TDG可以显着抑制PCV2诱导的IL-10m RNA水平（P<0.01）。Ch IP检测发现,si-TDG可以显着抑制PCV2介导的NF-κB p50和Sp1与il10启动子的结合活性（P<0.05）。3.PCV2感染介导p38-MAPK-USP21-STING通路抑制PPV诱导的IFN-β表达PCV2分别感染PK-15细胞和ST细胞72 h后感染PPV,PPV感染8 h后,q PCR检测发现,PCV2感染显着抑制PPV诱导的IFN-β以及干扰素刺激基因m RNA水平（P<0.01）;PPV感染24 h后,双荧光素酶试验结果表明,PCV2感染显着抑制了PPV诱导的ifn-β启动子活性（P<0.01）;PPV感染36 h后,q PCR检测发现,PCV2感染可显着增加PPV拷贝数（P<0.01）。PCV2感染PK-15细胞72 h后感染PPV,western blotting检测显示,PCV2感染可抑制PPV诱导的TBK1和IRF3的磷酸化以及p-IRF3的入核;免疫共沉淀（Co-IP）检测发现,PCV2感染可抑制PPV诱导的STING-K63泛素化水平。PCV2感染PK-15细胞后,用c GAMP刺激的细胞,q PCR检测和双荧光素酶试验结果发现,PCV2感染可显着抑制c GAMP诱导的IFN-βm RNA水平以及ifn-β启动子活性（P<0.01）;western blotting检测发现,PCV2感染可抑制c GAMP诱导的TBK1和IRF3磷酸化以及p-IRF3的入核;Co-IP检测发现,PCV2感染可抑制c GAMP诱导的STING-K63泛素化。si RNAs转染干扰通路后,q PCR检测发现,si-p38MAPK可显着缓解PCV2感染对PPV和c GAMP诱导的IFN-βm RNA水平的抑制（P<0.01）;Co-IP检测发现,si-p38MAPK可以缓解PCV2感染对c GAMP介导的STING-K63泛素化的抑制。转染泛素特异肽酶21（USP21）的si RNA,q PCR检测发现,si-USP21可显着缓解PCV2对PPV和c GAMP诱导的IFN-βm RNA水平的抑制（P<0.01）;Co-IP检测发现,si-USP21可缓解PCV2感染对c GAMP介导的STING-K63泛素化的抑制。转染si-p38后PCV2感染后24 h～72 h,western blotting检测发现,si-p38可以降低PCV2诱导的USP21磷酸化水平。4.PCV2 Cap和Rep在感染的不同时期抑制PPV诱导的IL-12p40表达PCV2感染PAMs后再用PPV刺激,ELISA和q PCR检测发现,PCV2感染可显着抑制PPV诱导的IL-12p40表达（P<0.01）。r Ad-Blank、r Ad-Cap2、r Ad-Rep2分别感染PAMs后再用PPV刺激,ELISA和q PCR检测发现,PCV2Cap和PCV2Rep均能显着抑制PPV诱导的IL-12p40表达（P<0.01）。PCV1、PCV2、PCV2-Cap1、PCV1-Cap2、PCV2-Rep1和PCV1-Rep2分别感染PAMs后再用PPV刺激,q PCR检测发现,PCV2Cap可在感染早期显着抑制PPV诱导的IL-12p40 m RNA水平（P<0.01）,而PCV2Cap和PCV2Rep可在感染后期显着抑制PPV诱导的IL-12p40 m RNA水平（P<0.01,P<0.05）。western blotting检测表明,PCV2感染可以抑制PPV诱导的IκB的磷酸化以及p65的入核。Ch IP检测表明,PCV2感染可以显着抑制PPV诱导的NF-κB p65与il12B启动子的结合活性（P<0.01）。双荧光素酶试验结果表明,PCV2感染可以显着抑制PPV诱导的p65启动子活性（P<0.01）。si RNAs转染干扰通路后,q PCR检测发现,si-Akt和si-p38可以显着缓解PCV2感染对PPV诱导的IL-12p40 m RNA水平的抑制（P<0.01）;si-Akt和si-p38可以显着缓解r Ad-Cap2感染对PPV介导的IL-12p40 m RNA水平的抑制（P<0.01）;而只有si-p38可以显着缓解r Ad-Rep2感染对PPV诱导的IL-12p40 m RNA水平的抑制（P<0.01）。双荧光素酶试验结果表明,si-Akt和si-p38可以显着缓解r Ad-Cap2感染对PPV介导的p65启动子活性的抑制（P<0.01）;而只有si-p38可以显着缓解r Ad-Rep2感染对PPV介导的p65启动子活性的抑制（P<0.01）。本研究发现,PCV2感染仔猪可以抑制PPV诱导的免疫应答并促进PPV在体内复制。进一步细胞试验研究发现,PCV2Rep在感染后期激活p38-MAPK通路,促进转录因子NF-k B p50和Sp1与il10启动子结合,诱导IL-10的表达,宿主蛋白TDG在此过程发挥了重要作用。PCV2感染介导p38-MAPK通路促进USP21磷酸化,抑制STING-K63泛素化并抑制STING-TBK1-IRF3形成,从而抑制了PPV诱导的IFN-β表达。PCV2Cap在PCV2感染后激活PI3K-Akt和p38-MAPK通路抑制PPV诱导的IL-12p40表达,而PCV2Rep在PCV2感染后期激活p38-MAPK通路抑制PPV诱导的IL-12p40表达。上述结果阐明了PCV2感染在PPV致病过程中的免疫调控作用及机制,为进一步研究PCV2感染在一些病原致病过程中发挥的免疫调控作用和机制提供依据。
勾雪梅[2]（2021）在《IL-6在流感病毒-肺炎链球菌共感染肺炎及肺炎链球菌肺炎继发脓毒症中的作用及机制研究》文中提出【目的】在整个人类历史上,肺炎一直是引起人类患病和死亡的重要原因。其中,甲型流感病毒（Influenza A virus,IAV）和肺炎链球菌（S.pneumoniae,S.pn）是引起人类肺炎的两种主要病原体。虽然在某些情况下,宿主可通过免疫系统抵抗甲型流感病毒和肺炎链球菌性肺炎而不会有大的后遗症,但如果宿主不能控制入侵的病原体并消除持续的炎症,就会导致重症肺炎并引起死亡。已知,与流感相关的重症病例和死亡病例中超过95%均并发了细菌感染,如肺炎链球菌（约50%）、金黄色葡萄球菌等,即发生了流感病毒-肺炎链球菌共感染;此外,持续的肺炎链球菌肺炎会导致脓毒症,也即肺炎链球菌肺炎继发脓毒症。高死亡率和高发病率是流感病毒-肺炎链球菌共感染肺炎和肺炎链球菌肺炎继发脓毒症疾病的共同特点,但这两种疾病的发病机制迄今尚未完全阐明。对这两种肺炎链球菌相关疾病的特点分析发现,宿主抵抗肺炎链球菌感染的能力受损可能是两种疾病发生发展的一个重要原因。因此,对宿主抵抗肺炎链球菌感染方面进行研究有助于进一步阐明这两种疾病的发病机制。为此,我们查阅了大量相关文献,发现这两种疾病中感染宿主均表现出显着升高的IL-6（Interleukin-6）。IL-6是一种在综合免疫应答中发挥作用的多效应细胞因子。虽然研究发现,IL-6可促使机体抵抗多种病原体感染,但升高的IL-6在共感染肺炎中的作用以及IL-6抵抗肺炎链球菌感染的相关机制尚不清楚。因此,本研究拟探究IL-6在流感病毒-肺炎链球菌共感染肺炎以及肺炎链球菌肺炎继发脓毒症发生发展中的作用及机制。【方法】首先,选择双性别的、健康成年WT C57BL/6J小鼠,通过双侧鼻腔滴入小鼠适应的IAV（A/Puerto Rico/8/1934株,PR8）和肺炎链球菌（D39株）构建临床相关的流感病毒-肺炎链球菌共感染肺炎小鼠模型或滴入肺炎链球菌（D39株）构建肺炎链球菌肺炎继发脓毒症小鼠模型,所得小鼠模型的病理学特征与人相似。其次,探究IL-6在两种疾病中的作用。（1）IL-6在流感病毒-肺炎链球菌共感染肺炎中的作用研究:收集不同时间点形成共感染肺炎的小鼠样本和共感染肺炎患者的血浆样本并检测其中IL-6的表达水平,以观察动物实验所得结果是否与临床一致。利用WT和IL-6-/-鼠构建共感染肺炎模型,分别观察小鼠体重、生存率和临床表现,通过空斑实验和q RT-PCR法检测病毒滴度、细菌铺板计数法测细菌载量,并使用HE染色法观察肺组织病理、ELISA法检测炎症因子水平,从而明确IL-6在共感染肺炎中的作用。（2）IL-6在肺炎链球菌肺炎继发脓毒症中的作用研究:利用WT和IL-6-/-鼠构建肺炎继发脓毒症模型,通过检测感染宿主在不同感染时间点、不同器官的菌载量,了解肺炎链球菌肺炎继发脓毒症的疾病特点以及IL-6在肺炎链球菌肺炎继发脓毒症发生发展中的作用。接着给予外源性IL-6蛋白,通过检测不同器官菌载量进一步明确IL-6在肺炎链球菌肺炎继发脓毒症中的作用。通过观察感染小鼠的临床症状、生存率以及体重变化,分析IL-6在影响肺炎链球菌肺炎继发脓毒症结局中的作用。最后,探究IL-6在两种疾病中起作用的相关机制。（1）IL-6在共感染肺炎中起作用的相关机制研究:采用体内、外吞噬实验,探究IL-6对主要吞噬细胞功能的影响。通过流式细胞术检测炎症细胞募集情况、细胞存活情况以及细胞表面具有胶原结构的巨噬细胞A类清道夫受体（Class A scavenger receptor macrophage receptor with collagenous structure,MARCO）表达情况,探究IL-6起作用的机制并验证外源性IL-6蛋白的治疗作用。（2）IL-6在肺炎链球菌肺炎继发脓毒症中起作用的相关机制研究:通过观察感染小鼠中IL-6对肺部巨噬细胞的效应,然后通过构建细胞感染模型和动物感染模型,利用流式细胞术、蛋白免疫印迹、免疫组化等方法检测细胞死亡情况及相关通路,探究IL-6在该疾病中起作用的具体机制。【结果】（1）IL-6在流感病毒-肺炎链球菌共感染肺炎中的作用及机制研究结果:1.流感后4天,初始流感病毒感染增加了小鼠继发细菌感染的易感性;而流感后6天,肺部继发的感染细菌发生了肺外器官的远处散播。此外,病毒与细菌协同作用使得疾病进一步恶化导致绝对致死性疾病的发生。2.在流感病毒-肺炎链球菌共感染的小鼠和患者体内均检测到了高水平的IL-6。3.在流感病毒-肺炎链球菌共感染中,缺乏IL-6导致小鼠体内细菌载量和肺部炎症细胞死亡数目增多。4.机体缺乏IL-6使得巨噬细胞表面的MARCO表达下调,进而损害了巨噬细胞的吞菌功能。中和共感染小鼠体内IFN-γ后,不影响巨噬细胞表面的MARCO表达,表明IL-6对MARCO的调控是一种直接调节作用。5.外源性IL-6蛋白可有效促进肺部细胞存活并增强流感后小鼠对继发感染细菌的清除,最终出现降低的易感性。（2）IL-6在肺炎链球菌肺炎继发脓毒症中的作用及机制研究结果:1.随着肺部感染肺炎链球菌的时间延长,肺部细菌向远处器官散播发展为脓毒症。缺乏IL-6不利于小鼠抵抗感染,而外源性IL-6蛋白可明显增强IL-6-/-小鼠对入侵肺炎链球菌的清除。更重要的,缺乏IL-6导致肺炎链球菌肺炎继发脓毒症小鼠100%死亡,而感染的WT小鼠死亡率约为30%。2.肺炎链球菌肺炎继发败血症期间,缺乏巨噬细胞抵消了先前IL-6-/-小鼠和WT小鼠对肺炎链球菌清除以及抑制肺部炎症应答反应的差异。IL-6发挥抗菌和抗炎效应主要是通过其对巨噬细胞的调控效应。3.肺炎链球菌肺炎继发脓毒症期间,缺乏IL-6不利于感染小鼠肺巨噬细胞存活和肺炎症损伤控制。4.IL-6调节肺炎链球菌感染的小鼠原代腹腔巨噬细胞和小鼠传代巨噬细胞RAW 264.7发生caspase-3-GSDME介导的凋亡向焦亡的转变,以及caspase-1-GSDMD介导的经典焦亡。5.肺炎链球菌肺炎继发脓毒症期间,IL-6可有效抑制小鼠肺组织产生GSDME和GSDMD介导的肺炎症损伤,从而增强了小鼠抵抗入侵细菌的能力。【结论】IL-6在宿主抵抗流感病毒-肺炎链球菌共感染肺炎以及肺炎链球菌肺炎继发脓毒症的发病过程中发挥了重要的保护作用。IL-6通过巨噬细胞介导的抗菌反应增强为机体对抗复杂流感肺炎和细菌继发感染的研究提供了一个独特的方向。这种保护性免疫机制使我们进一步了解了感染期间免疫分子的潜在影响,并为肺炎链球菌相关感染提供了潜在的治疗选择和途径。
宁唤唤[3]（2021）在《结核分枝杆菌ESAT-6的免疫学特性及其在黏膜疫苗中的应用》文中提出研究背景结核病（tuberculosis,TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）感染引起的呼吸道传染病。卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin,BCG）是目前唯一批准使用的结核病疫苗,但对成人结核病的保护效果不完善,可能与BCG在减毒传代过程中丢失了一些编码保护性抗原的基因序列有关,例如:差异编码区1（region difference,RD1）。因此,新型疫苗的研发有助于更好地防控结核病。6k Da早期分泌靶抗原（6 k Da early secretory antigenic target,ESAT-6）是Mtb与BCG的差异抗原。研究发现,ESAT-6能够诱导机体产生抗Mtb感染的保护性免疫应答,被广泛用于结核病疫苗研究。目前,包含ESAT-6及其他抗原的四种疫苗已进入临床试验。此外,ESAT-6作为毒力因子与Mtb的致病性有关,且参与调控Mtb感染宿主的免疫应答。因此,ESAT-6是结核病疫苗研究中有潜能的候选抗原之一。然而,课题组前期研究发现,ESAT-6抗原诱导的机体免疫应答水平不高。研究发现,细菌信号分子环二腺苷酸（c-di-AMP）不仅调控细菌生理功能,还能诱导宿主固有免疫应答,且作为黏膜佐剂能够增强抗原诱导的特异性免疫应答。因此,本研究旨在探究ESAT-6的免疫学特性,评价ESAT-6亚单位疫苗及以c-di-AMP为佐剂黏膜接种对Mtb感染的保护作用,为ESAT-6用于结核病黏膜疫苗的研制提供理论与实验依据。研究目的探究Mtb ESAT-6同系物Ms ESAT-6在快速生长型分枝杆菌耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis,Ms）调控免疫应答中的作用;探究Mtb的重组ESAT-6蛋白对巨噬细胞固有免疫的调控作用;明确基于Mtb ESAT-6的亚单位疫苗以c-di-AMP为佐剂经黏膜免疫小鼠诱导的免疫应答特点,评价ESAT-6为基础的亚单位疫苗抗Mtb感染的保护效率。方法与结果（1）耻垢分枝杆菌ESAT-6敲除株的免疫学特性1)Ms ESAT-6是Mtb ESAT-6在Ms中的同系物,二者氨基酸序列相似性为72%。采用CRISPR/Cas9技术成功构建了Ms ESAT-6敲除株MsΔE6（ΔE6）,并构建了互补菌株ΔE6 C。生长及染色特性结果显示,敲除ESAT-6对细菌生长有一定影响,但不影响细菌抗酸染色特性。2)建立Ms体外感染巨噬细胞模型,发现ESAT-6在Ms感染诱导巨噬细胞产生炎症因子、诱导炎症小体活化以及自噬中发挥作用,但影响水平有限。3)细菌胞内存活结果显示,敲除ESAT-6的菌株在巨噬细胞内复制减少,说明ESAT-6与Ms在巨噬细胞内存活有关。（2）ESAT-6在调节巨噬细胞固有免疫中的作用1)建立巨噬细胞体外刺激模型,发现c-di-AMP促进了Mtb ESAT-6重组蛋白诱导的I型IFN应答;ESAT-6和c-di-AMP在处理早期可诱导巨噬细胞自噬起始,二者长时间处理主要表现为抑制自噬降解,该过程受m TOR调控但不依赖于IL-17。2)ESAT-6可诱导巨噬细胞炎症因子应答,且c-di-AMP促进了ESAT-6诱导的炎症因子应答。3)Mtb胞内存活结果显示,在感染早期ESAT-6和c-di-AMP以协同的方式限制了Mtb的复制;随着感染时间延长,抑制Mtb生长的作用逐渐不明显。（3）ESAT-6亚单位疫苗的免疫学特性1)以ESAT-6、ESAT-6+c-di-AMP经鼻黏膜接种小鼠,体液免疫应答检测结果显示,ESAT-6可诱导机体系统性和黏膜局部特异性抗体产生,c-di-AMP为黏膜佐剂增强了ESAT-6诱导的体液免疫应答。2)细胞免疫应答检测结果显示,c-di-AMP为佐剂促进了ESAT-6诱导的系统性Th1/Th2/Th17型以及炎症因子应答;同时促进了黏膜局部的Th17型和炎症因子应答。3)肺组织免疫细胞亚群分析结果显示,ESAT-6、ESAT-6+c-di-AMP接种导致CD8+T细胞和巨噬细胞比例减少;同时,c-di-AMP为黏膜佐剂促进了ESAT-6诱导的固有淋巴样细胞ILC1和NK细胞的分化。（4）ESAT-6亚单位疫苗对Mtb感染的免疫保护效率1)ESAT-6免疫小鼠Mtb感染后黏膜免疫应答增强,且c-di-AMP促进了ESAT-6诱导的黏膜免疫应答。2)ESAT-6、ESAT-6+c-di-AMP免疫小鼠Mtb感染后,Th1型（IFN-γ）、Th2（IL-10）、Th17（IL-17）以及炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的产生均减少。3)ESAT-6、ESAT-6+c-di-AMP经黏膜接种小鼠提供了抗Mtb感染的保护作用,且c-di-AMP为佐剂在一定程度上提高了ESAT-6的免疫保护作用。研究结论Ms ESAT-6在Ms感染诱导的宿主固有免疫中发挥一定的作用,影响细菌胞内存活,整体上作用有限。Mtb ESAT-6与免疫调节子c-di-AMP协同激活I型IFN,调控细胞自噬,诱导炎症应答,促进了巨噬细胞清除Mtb感染。ESAT-6经黏膜接种,可诱导体液免疫应答,c-di-AMP为佐剂促进了ESAT-6诱导的黏膜免疫应答以及Th1/Th2/Th17型细胞免疫应答。ESAT-6经黏膜免疫可提供对Mtb感染的保护力,且c-di-AMP在一定程度上可提高ESAT-6的免疫保护效率。
涂丽裙[4]（2020）在《转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用》文中研究指明转化生长因子-β2（TGF-β2）对免疫应答有全方位的负调节作用,可调节几乎每一种适应性免疫应答和固有免疫应答的细胞,包括树突状细胞、T细胞、B细胞、粒细胞和固有免疫淋巴样细胞。使用免疫检查点抑制剂治疗肿瘤的成功案例提示我们:抑制免疫抑制性细胞因子TGF-β2可能是一种新的策略去研制新型疫苗佐剂。为了研制出以核酸为基础的TGF-β2的抑制剂,我们设计了三个靶向人鼠的TGF-β2 m RNA3’UTR保守区域的反义寡核苷酸,并将其命名为TIO1,TIO2,TIO3。在小鼠巨噬细胞,人单核细胞及人浆细胞样树突状细胞,TIO1,TIO2及TIO3均明显下调TGF-β2的表达。在小鼠中,TIO3和TIO1,均可显着增强微生物疫苗所诱导的抗体反应。其中TIO3为佐剂的流感疫苗可抵抗流感病毒的攻击并减轻流感病毒引起的急性肺损伤。在小鼠中,TIO3可明显下调淋巴结及脾脏细胞CD4+T细胞及CD19+B细胞上s TGF-β2的表达,上调CD19+B细胞及CD11c+DC表面CD40,CD80,CD86,CD69及MHC II分子的表达,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,促进CD4+T细胞产生IL-4,抑制调节性T细胞（Tregs）的产生,促进CD4+T细胞和CD19+B细胞的增殖与活化,促进流感病毒感染的小鼠的肺脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞表面CD69的表达。总的来说,通过干扰TGF-β2的表达,TIO3或TIO1,可作为新型微生物疫苗佐剂增强疫苗诱导的抗体反应;此外,TIO3为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗可显着延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。TIO3可通过抑制人和小鼠的胶质瘤细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞表达TGF-β2,诱生胶质瘤特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞,激活NK细胞,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,上调胶质瘤细胞表面MHCI分子的表达进而增强胶质瘤疫苗的抗肿瘤功效。单独应用TIO3可通过抑制胶质瘤细胞表达TGF-β2、促进胶质瘤细胞表达MHC I,IL-17A及IFN-α、抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞表达s TGF-β2、抑制Tregs的产生、促进CD4+T细胞及CD8+T细胞的增殖而明显延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。单独应用TIO3可通过抑制胃癌细胞表达TGF-β2,促进MHC I,IL-13,IL-15,IL-17及IFN-γ的表达而显着减少肿瘤体积、延长胃癌背部移植瘤小鼠的生存期。TGF-β2的反义寡核苷酸有潜能作为微生物疫苗和肿瘤疫苗的新型佐剂,或单独治疗胶质瘤和胃癌的候选药物。
五且昆·吐尔逊[5]（2020）在《干扰素调节因子家族成员在流感病毒诱导的局部和全身炎症反应中的表达模式》文中研究表明流感病毒感染可诱发急性肺损伤（ALI）与其介导的大量I型干扰素（IFN-I）产生关系密切。干扰素调节因子（IRF）是负责IFN-I产生的转录因子家族,包括IRF1-9。尽管IRF3和IRF7被普遍认为是调控IFN-I产生的主要转录因子,IRF家族所有成员都能识别/结合其靶基因启动子上富含GAAA序列元件的特征提示可能都对流感病毒感染应答。本文以流感病人鼻咽上皮细胞和流感模型小鼠肺组织作为局部应答组织、流感模型小鼠外周血白细胞及其他组织如心、肠、肝、肾、脾、胃作为全身应答组织,观察了IRF家族成员对流感病毒应答的表达谱变化,并用专职产生IFN-I的人p DC样CAL-1细胞研究了流感病毒诱导IRF家族表达谱的变化规律及可能调控机制。本研究为流感病毒诱发急性免疫损伤如ALI的诊断和防治提供了分子靶标。
欧阳譞[6]（2020）在《TRIM32在抗细菌先天免疫调控中的功能和机制研究》文中认为TRIM32（Tripartite motif protein 32,TRIM32）是RBCC-NHL型TRIM家族分子,即N端含有RING,B-box和Coiled-coil结构域,C端含有6个NHL重复结构域。TRIM32在哺乳动物细胞中普遍表达,参与多种细胞生理过程,包括天然免疫,发育和分化,信号传导和癌症的演变进程等。在天然免疫方面,TRIM32可通过泛素化XIAP、PIASy和STING等参与多个天然免疫信号通路的调节。此外,TRIM32还通过泛素化流感病毒RNA聚合酶复合物催化核心PB1、结合鼠伤寒沙门氏菌分泌的效应物Ssek3等在病原-宿主相互作用中发挥重要作用。但是,TRIM32在革兰氏阳性菌感染过程中的功能和机制尚未有研究报道。本研究以猪链球菌和单核细胞增生李斯特菌为模式细菌,分别研究TRIM32在胞外菌和胞内菌感染过程中对天然免疫的调节及作用机制。猪链球菌是人畜共患病原菌,感染会导致宿主中毒性休克综合征和脑膜炎;单核细胞增生李斯特菌是食源性病原菌,在免疫低下人群和胎儿中尤其易感,发病严重会导致菌血症和脏器衰竭,治疗不当会引起胎儿致死。既往研究发现,猪链球菌感染早期造成炎症因子风暴,造成急性死亡,后期通过细胞旁方式穿过血脑屏障,造成脑膜炎。单核细胞增生李斯特菌主要通过自身双链DNA和分泌的c-di-AMP激活宿主先天免疫识别系统,通过NF-κB、MAPK、STAT等信号通路,激活宿主干扰素和炎症因子产生,加重宿主炎症感染。在本研究第一部分,我们通过TALEN和CRISPR/Cas9技术,分别构建了TRIM32基因缺失小鼠和RAW264.7细胞系,为研究TRIM32在革兰氏阳性菌感染过程中的功能和机制提供了研究材料。在本研究第二部分,我们研究了TRIM32在猪链球菌中毒性休克综合征和脑膜炎中的作用。我们用大剂量猪链球菌05ZYH33通过腹腔和静脉注射方式感染野生型和TRIM32基因敲除小鼠,研究TRIM32缺失对细菌感染后小鼠存活、菌血症水平以及血中细胞因子和趋化因子含量的影响。研究发现:相比于野生型小鼠,TRIM32基因缺失小鼠在猪链球菌感染后存活率提高,血中细菌载荷显着降低,促炎症细胞因子（IL-6,TNFα,IL-18,IL-1β,IFN-γ）和趋化因子（MCP-1,MCP-3,GROα,MIP-1β,MIP-2,IP-10,RANTES）显着降低。上述结果提示:TRIM32在猪链球菌感染过程中正调控天然免疫信号通路。我们用低剂量猪链球菌05ZYH33腹腔感染野生型和TRIM32基因敲除小鼠构建猪链球菌脑膜炎模型,研究感染不同时间后脑中细菌载荷,病理损伤情况,血脑屏障通透性改变情况以及血液和脑中天然免疫细胞的组成和数目变化情况。研究发现:相比于野生型小鼠,TRIM32基因敲除小鼠脑中细菌载荷显着降低,脑膜炎症状显着下降,提示TRIM32缺失减轻猪链球菌脑膜炎的发生。后继的研究发现相比于野生型小鼠,TRIM32基因敲除小鼠在猪链球菌感染早期,增大血脑屏障通透性,增加炎性单核细胞和中性粒细胞的脑实质浸润,有助于清除脑中细菌,降低脑中细菌载荷,从而阻止或减轻猪链球菌脑膜炎的发生。在本研究第三部分,我们利用单核细胞增生李斯特菌感染模型,研究了TRIM32在胞内菌中感染中的功能。我们首先发现TRIM32在单增李斯特菌感染过程中上调表达,提示TRIM32可能参与细菌的感染过程。在小鼠感染模型中,我们发现相比于野生型小鼠,TRIM32基因缺失小鼠存活率显着提高,脾脏和肝脏中细菌载荷和病理损伤显着下降,血清中炎症因子（IL-12、IL-18、IL-6和TNFα）和干扰素IFN-γ、IFN-β显着下调,p44/42、p-JNK、STAT1和TBK1磷酸化水平减弱。上述结果提示,TRIM32正调控单增李斯特菌感染激活的天然免疫通路。随后,我们进一步研究了TRIM32缺失降低单增李斯特菌感染造成损伤的机制。首先,我们通过流式细胞术研究单增李斯特菌感染后天然免疫细胞亚群的动态变化,发现相比于野生型小鼠,TRIM32基因敲除小鼠在在感染第一天增加脾脏中巨噬细胞的比例,在感染第三天显着提高肝脏中性粒细胞的比例,提示TRIM32缺失有助于增加吞噬细胞清除细菌。通过进一步研究脏器中天然免疫细胞亚群的活性和杀菌能力,我们发现TRIM32缺失提高脾脏中存活中性粒细胞的比例,且增加中性粒细胞分泌穿孔素和颗粒酶B的能力。此外,TRIM32缺失显着提高脾脏中自然杀伤细胞产生IFN-γ和TNFα的能力以及巨噬细胞分泌IL-12和i NOS的含量。最后,我们发现TRIM32缺失显着降低单增李斯特菌在巨噬细胞中的存活。上述结果提示:在单增李斯特菌感染过程中,TRIM32通过多种机制降低天然免疫细胞清除细菌的能力。综上所述,我们研究发现TRIM32在革兰氏细菌感染过程中正调控天然免疫信号通路,并通过多种机制降低天然免疫细胞对细菌的清除。我们认为作为宿主抗菌天然免疫信号通路中的关键分子,TRIM32有望成为潜在的抗菌治疗药物靶标。
宋世斌[7]（2020）在《藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定》文中认为干扰素（Interferon,IFN）是机体细胞受到病毒等生物诱导剂刺激而产生的一类分泌型糖蛋白类细胞因子,而白细胞介素18（Interleukin-18,IL-18）是一种具有促炎作用的细胞因子,由机体活化的单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等产生,能诱导IFN-γ等细胞因子的分泌,具有促进T细胞增殖、增强Th1型细胞、NK细胞及CTL细胞的细胞毒效应,与临床自身免疫性疾病及心血管系统疾病等多种疾病的发生发展呈现相关性,IFN和IL-18都具有抗病毒、抗寄生虫和细菌感染、抗肿瘤、免疫调节等多种生物学功能。因此,本实验开展藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18的相关研究,采用分子克隆和基因工程等技术获得了3个基因,体外制备了藏獒犬3个基因的重组蛋白,验证了其生物学活性,并开展了临床相关实验,丰富了犬细胞因子的知识,对犬疾病的检测和防控以及保障人类健康有着重要的意义,在犬疾病的防控上有着广阔的应用前景。第一,从藏獒犬血液中分离淋巴细胞,利用脂多糖（LPS）与植物血凝素（PHA）联合刺激淋巴细胞后提取RNA,经RT-PCR扩增IFN-γ、IFN-α和IL-18基因全长片段,将扩增到的基因分别克隆到pGEM-T-easy载体,经酶切、测序鉴定,结果表明:所克隆的IFN-γ基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达99.6%,开放阅读框为501 bp,编码166个氨基酸（AA）,N端23个AA为信号肽,成熟蛋白编码143个AA,分子量为17.2 kD;克隆的IFN-α基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达96.0%,其开放阅读框为564 bp,N端23个AA为信号肽,成熟蛋白编码164个AA,推测的分子量为19.0 kD;克隆的IL-18基因与GenBank上登载的犬核苷酸序列同源性达100%,其开放阅读框为582 bp,编码193个AA,N端36个AA为信号肽,成熟蛋白编码157个AA,推测的分子量为18.1 kD。第二,根据克隆的藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18基因阅读框序列,设计3个基因去掉信号肽的表达引物,克隆去信号肽后的目的片段,构建原核表达质粒pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18,转化大肠杆菌后诱导表达。经优化诱导条件后,3个重组菌都能够在温度为37℃,浓度为0.5 mM IPTG的诱导条件下成功的表达,3个重组菌在诱导后主要以包涵体形式表达,其中pET-30a-IFN-γ重组蛋白在上清中也有一定量的表达;经SDS-PAGE分析,pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18表达的蛋白分别约为23 kD、25kD和24 kD,表达的蛋白大约占菌体蛋白30%35%。第三,用镍琼脂糖凝胶纯化层析柱纯化pET-30a-IFN-γ、pET-30a-IFN-α和pET-30a-IL-18重组蛋白,纯度达到90%以上,通过梯度透析复性法复性蛋白。利用抑制病毒噬斑法测定重组藏獒犬IFN-γ和IFN-α的生物学活性,二者都具有抗病毒的活性,而且IFN-α抑制VSV的作用强于IFN-γ,二者的抗病毒活性在一定的浓度范围内有作用,在高于或低于这个浓度范围时发挥的效果一般;利用MTS法检测重组藏獒犬IL-18重组蛋白的生物学活性,纯化的重组IL-18具有诱导淋巴细胞增殖的能力,说明表达的蛋白具有生物学活性。第四,通过对总数为128只犬病毒性传染病病例（包括犬细小病毒病、犬冠状病毒病及犬瘟热3类宠物常见病）的IFN治疗组和对照治疗组的比较分析结果显示:IFN治疗组中3类疾病总计67只,治愈45只,平均治愈率67.2%,对照治疗组中3类疾病总计61只,治愈34只,平均治愈率55.7%,使用本实验获得的IFN-α重组蛋白治疗宠物犬病毒性传染病,能显着提高治愈率,有较好的临床治疗病毒性疾病的效果。本研究克隆了藏獒犬IFN-γ、IFN-α和IL-18基因,并应用分子生物学软件对序列进行生物信息学分析;首次成功的表达了3个基因,纯化、复性了重组蛋白,发现IFN-γ、IFN-α和IL-18基因具有较高的生物学活性,可以开发利用;通过藏獒犬IFN-α重组蛋白的临床病毒性犬病的治疗,验证了藏獒犬IFN的抗病毒活性。藏獒犬是中国特有的大型犬种,本研究为犬基因工程生物制品的进一步开发和相关疾病的检测及防治奠定了理论基础。
王启辉[8]（2020）在《动物流感病毒跨种属感染树鼩致病特性及抗感染免疫研究》文中进行了进一步梳理研究背景和目的:甲型流感病毒（influenza A virus,IAV）具有宿主范围广、型别多、易变异、传播迅速等特点,常导致流感反复季节性局部流行甚至世界大流行,且部分型别可跨种属传播至人,给人类健康造成极大威胁。动物模型对于研究疾病的感染传播过程、发病机制、宿主抗病免疫机制以及评价新型药物和疫苗的效果及安全性等极为重要。目前已尝试建立了多种流感病毒动物模型,但各有利弊,迄今尚未有十分理想的流感病毒动物模型。树鼩（Tupaia belangeri,tree shrew）在亲缘关系和种系发育上与人类非常接近,是灵长类动物的旁亲,基因组测序结果也证实树鼩与灵长类具有很高的亲缘性。因其体型小,生长繁殖快,驯养条件及成本较黑猩猩、猴类低,且其生理特征、解剖特点、神经发育、免疫、生化代谢和心理压力等方面与人类高度相似,利用树鼩作为多种疾病的动物模型研究日渐受到极大关注。迄今国内外已有用树鼩成功建立人H1N1亚型流感病毒以及H9N2、H5N1、H7N9亚型禽流感病毒感染模型的案例,但尚未利用树鼩模型对具有感染人潜能的低致病性猪和陆禽流感病毒的致病、感染和免疫特征等进行详细研究。为了阐明具备感染人潜能的低致病性猪和陆禽流感病毒的致病机制、免疫特点,以及跨种属感染的潜力,为流感大流行的防控和治疗提供更充分的策略依据,本研究选用前期证实可体外感染猪和人肺组织、体内可未经适应感染小鼠引起病变的具有感染人潜力的两株不同种属来源的IAV:基因组整合了2009新甲型H1N1大流行流感病毒（pdm/09）基因片段的新现H3N2亚型猪流感病毒（简称SW2783）和我国家禽中呈主要流行的陆禽鸡H6N6亚型禽流感病毒（简称ZZ346）,以树鼩作为实验动物模型,观察两株流感病毒的致病性、免疫特征及跨种属感染的潜力;利用高通量深度测序和生物信息学分析方法,获得SW2783感染树鼩呼吸道组织的m RNA表达谱,从分子水平较全面分析动物IAV感染与宿主免疫相关m RNA表达情况,为进一步探讨具有感染人潜能的低致病性动物流感病毒与宿主相互作用机制打下坚实基础,同时也为进一步开发树鼩在抗病毒药物、疫苗效果及安全性评价等方面提供理论依据;另外,为深入研究流感病毒等病原体感染树鼩后的免疫应答及免疫病理机制奠定分子检测基础,本研究还探讨了人、小鼠和大鼠三种不同物种抗体芯片检测树鼩抗感染免疫相关分子的可行性,为解决目前缺乏树鼩相关分子检测试剂难题提供参考。方法:1.建立SW2783和ZZ346树鼩呼吸道组织体外感染模型,同时以pdm/09疫苗株CA09（简称CA09）和水禽鸭流感病毒H9N2亚型（简称ST3208）为参考病毒株,采用病毒血凝试验（HA）、半数组织细胞感染试验(TCID50)、免疫组化等方法观察4种病毒株对树鼩体外呼吸道组织的感染和复制能力及致病性特征。2.建立SW2783和ZZ346树鼩体内感染模型,通过HA、TCID50、HE染色、免疫组化、实时定量PCR等实验方法观察两种不同种属来源低致病流感病毒体内感染树鼩的能力、致病特征及抗病毒免疫分子的变化情况。3.利用转录组高通量测序技术（RNA-seq）检测SW2783体内感染树鼩后第3 d、5 d、7 d鼻甲组织中差异表达m RNA,并结合生物信息学方法对其进行GO和KEGG富集及蛋白质互作网络（PPI）分析,观察m RNA差异表达谱特征以及其变化趋势。4.采用人、小鼠和大鼠三个物种抗体芯片检测树鼩脾细胞中抗感染相关免疫分子,探讨采用非树鼩种属特异性抗体检测树鼩相应分子的可行性。结果:1.4株流感病毒未经适应性培养均能体外感染树鼩呼吸道组织,但感染能力存在差异。新现H3N2亚型猪流感病毒SW2783株和陆禽H6N6亚型鸡流感病毒ZZ346株对树鼩体外上呼吸道鼻甲、气管组织具有较好的感染能力(TCID50),SW2783复制能力（HA）较ZZ346强;人pdm/09疫苗株CA09也可在树鼩呼吸道组织中复制,但其复制能力相对较弱;而鸭流感病毒株ST3208虽然也能感染树鼩呼吸道组织,但显现出有限的感染能力。2.SW2783和ZZ346未经适应性培养均可体内感染树鼩,显现出一定的致病性,但感染能力(TCID50)、病理变化及临床症状相对较轻,类似于人类普通流感感染,其中SW2783感染能力强于ZZ346,提示其可能进化成具有较好结合人型SAα2,6-Gal受体的能力而具有跨种属感染人的潜能。3.SW2783和ZZ346感染树鼩后第3 d、5 d、7 d抗病毒及炎症效应分子Mx1、MDA5、TNF-α、IL-6、MCP-1、IP-10、IFN-γ、IL-10等表达上调,提示感染早期启动有效抗病毒固有免疫应答;感染后第7 d,部分动物产生流感病毒特异抗体,第14 d所有动物均产生流感病毒特异抗体,提示流感病毒感染树鼩后,能激发有效的适应性体液免疫应答。4.通过对新现猪流感病毒SW2783株感染树鼩后第3 d、5 d、7 d的鼻甲组织RNA进行RNA-seq高通量测序,得到感染后不同时间点的m RNA表达谱,与未感染组相比,SW2783感染后第3 d、第5 d、第7 d差异表达的m RNA分别为878个、1460个、833个;通过韦恩分析,发现三个时间点共同差异表达的m RNA共有146个;对差异表达m RNA进行GO和KEGG富集及PPI蛋白互作网络分析,得到SW2783感染树鼩后不同时间点鼻甲组织m RNA的功能分布情况及变化趋势。病毒感染后第3 d促炎细胞因子和趋化因子基因早期表达;第5 d促炎细胞因子和趋化因子基因表达进一步增强,同时启动了黏膜免疫和适应性免疫相关基因以及多种免疫负调控基因的高表达;感染后第7 d,固有抗病毒免疫基因和促炎细胞因子及趋化因子基因迅速抑制,而适应性免疫基因得以维持。5.利用人、小鼠和大鼠抗体芯片检测树鼩脾细胞抗感染相关40个分子,共有38个可与三个物种抗体芯片中相应抗体之一发生反应,人、小鼠和大鼠抗体芯片反应率分别为20.0%（8/40）、89.7%（35/39）、45.8%（11/24）;树鼩脾细胞培养上清液共有35个分子能与三个物种相应抗体之一发生反应,总反应率为87.5%（35/40）;细胞裂解液中共有20个分子能与三个物种之一抗体发生反应,总反应率为50%（20/40）;TLR8刺激剂（R848）作用于树鼩脾细胞后,TLR8信号通路下游效应分子IL-12、IFNs等表达上调。结论:本研究以低致病性动物流感病毒为研究对象,以树鼩为动物模型,围绕其跨种属感染、致病性和免疫学特征以及免疫分子检测手段问题开展研究,得到如下结论:1.成功建立低致病性动物流感病毒跨种属感染树鼩模型。体内外实验证明具有感染人潜能的新现H3N2亚型猪流感病毒SW2783株和陆禽H6N6亚型鸡流感病毒ZZ346株均可未经适应跨种属感染树鼩;体内能激发有效的抗病毒固有免疫和适应性免疫应答。2.通过对SW2783感染树鼩鼻甲组织RNA进行高通量测序,得到感染后第3 d、5 d、7 d的m RNA表达谱,获得三个时间点差异表达m RNA分别为878个、1460个、833个;对差异表达m RNA进行生物信息学分析,得到SW2783感染树鼩后不同时间点鼻甲组织m RNA的功能分布情况和变化趋势以及抗感染免疫应答基因表达的初步规律。病毒感染后第3 d固有免疫基因早期表达;第5 d固有免疫基因表达过渡至适应性免疫相关基因以及多种免疫负调控基因的高表达;感染后第7 d,固有免疫基因迅速抑制,而适应性免疫基因得以维持,提示树鼩具有较完善的免疫功能。3.部分人、小鼠和大鼠抗体芯片可与树鼩抗感染免疫分子发生交叉反应,人、小鼠和大鼠抗体芯片反应率分别为20.0%（8/40）、89.7%（35/39）、45.8%（11/24）;不同物种抗体检测树鼩脾细胞不同样本（上清液和细胞裂解液）的结果存在差异;树鼩TLR8可被R848刺激活化,与人TLR8功能更加接近。综上所述,低致病性动物流感病毒可未经适应跨种属感染树鼩,其中SW2783致病力相对较强,可在树鼩体内激发较全面的抗病毒免疫应答;对SW2783感染后的m RNA进行生物信息学分析,获得了转录组学变化趋势规律;而人、小鼠和大鼠部分抗体可用于树鼩相关免疫分子的检测。本研究结果为低致病性流感病毒跨种属感染的致病及免疫机制、抗病毒药物靶点及疫苗研究奠定了基础。
胡传霞[9]（2020）在《朊蛋白在H7N7-IAV感染中的作用及机制研究》文中研究说明甲型流感病毒（Influenza A virus,IAV）是有包膜的、负义、单链RNA病毒,常引起季节性流感,新型IAV具有引起流感大流行的潜在风险。IAV首先通过病毒表面蛋白HA与细胞表面的唾液酸受体结合而侵入呼吸道或肺上皮细胞,病毒感染的结果取决于病毒复制和宿主免疫反应之间的平衡。IAV感染引起炎症反应的过度激活会导致促炎细胞因子的过度表达,形成的“细胞因子风暴”被认为是IAV感染机体诱导肺部炎症和引起致病性的重要原因。正常细胞朊蛋白（Normal Cellular Prion Protein,PrPc）是一种细胞表面膜糖蛋白,在脑中表达最丰富,肺次之。PrPc参与神经保护、免疫反应,并在各种病毒感染中发挥调节作用。最新研究表明PrPc通过抗氧化应激能够发挥抗IAV病毒感染的作用,其机制是通过PrPc N末端OR区与Cu2+结合,进一步调节活性氧产生酶（Superoxide Dismutase,SOD1）的活性,降低细胞内过量的活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）的产生,抑制细胞凋亡,保护小鼠免受IAV的致死性感染。然而,PrPc的非OR区（除了OR区以外的功能域）是不是也具有抗病毒感染的作用,目前尚未有文献深入探讨。此外,PrPc能够在T淋巴细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞等免疫细胞,以及Ⅰ型、Ⅱ型肺泡上皮细胞和细支气管Clara细胞中表达,因此PrPc可能在肺部的免疫系统中扮演重要角色。IAV感染肺上皮细胞,直接或间接诱导炎性细胞因子产生,但是PrPc在IAV诱导的炎症反应中到底发挥哪些重要作用尚不清楚。基于此,本论文通过PrPc两种基因敲除小鼠及PrPc过表达质粒分别在体内和体外两个层次探讨其在IAV感染及炎性反应中的作用,并借助RNA-Seq测序、差异基因表达谱的分析和验证,进一步探讨其中的分子机制。主要研究内容和实验结果如下:1.从体内水平研究PrPc对小鼠致病性的影响。首先利用CRISPR/Cas9技术构建两类PrP-/-小鼠,分别是朊蛋白全基因敲除小鼠（119KO）和朊蛋白OR区敲除小鼠（120KO）,比较野生型小鼠（WT）与PrP-/-基因敲除小鼠（119KO和120KO）在H7N7-IAV感染后3、5、8、11天时的临床症状和肺组织病理学变化。结果表明,与WT小鼠相比,120KO小鼠更容易感染H7N7病毒,即小鼠存活率降低,体重下降明显以及肺部病理损伤更严重;而PrPc全基因敲小鼠（119KO）不易感染H7N7病毒,即临床症状及肺组织病理学变化均轻于野生型小鼠。因此,我们推测朊蛋白在病毒感染的过程中具有双重调节作用,即朊蛋白OR区可能具有抗流感病毒感染,保护机体,减轻机体损伤的作用,而PrPc非OR区可能对于病毒感染具有促进作用。2.对病毒感染后3、5、8、11天的120KO、119KO、WT小鼠和生理盐水对照组小鼠的肺组织进行RNA-seq分析与q-PCR验证,进一步探讨PrPc在IAV诱导炎症反应中的作用。结果表明,H7N7感染小鼠肺后能够诱导大量细胞炎症因子表达,如TLRs通路基因（如TLR4/7/3、MyD88、TAK1、IRF3）、干扰素（IFNα/β和IFNγ）、IL6、TNFα、Nrf2和两类趋化因子及其受体（CCL2/3/11和受体CCR2/3,CXCL2/3/10/11和受体CXCR3/4/6）。与野生型WT小鼠相比,大部分细胞因子和趋化因子在120KO小鼠中的表达量显着升高,而在119KO小鼠中显着降低。因此我们认为OR区能够抑制细胞因子和趋化因子在H7N7感染后的上调表达,在IAV感染诱导的炎症风暴中发挥保护作用;而PrPc的非OR区可能促进了炎症因子上调表达,即增强H7N7-IAV感染诱导的炎症反应。综上所述,朊蛋白的不同功能域在H7N7-IAV感染小鼠的肺损伤及炎症反应中可能具有不同的调节作用。3.通过PrPc过表达质粒转染小鼠肺上皮细胞（MLE-12）,进一步验证PrPc在流感病毒H7N7感染中的作用。结果表明,在H7N7侵染细胞后的不同时期,病毒与PrPc互相作用的结果不同:感染早期（12h）,病毒诱导PrPc上调表达;感染24h后,PrPc的表达显着下降,并能持续下调病毒M基因的表达;感染48h后,PrPc的表达又开始升高。转染24h后,过表达的PrPc诱导了MLE-12细胞中的IFN-β和TLR3显着上调,但当病毒感染后,过表达的PrPc显着降低了IFN-β表达,升高了TLR3的表达,该结果与120KO小鼠中表达趋势一致。因此,在IAV感染过程中,PrPc对不同的细胞因子可能有不同的调节作用。综上所述,本研究首次揭示了朊蛋白在IAV病毒感染诱导炎症反应中的作用,为朊蛋白作为抗流感的分子靶标研究提供了重要依据。另外,我们也首次对朊蛋白不同功能域所发挥的作用进行了探讨,进一步拓展了对PrPc生理功能的认识。
欧阳微[10]（2020）在《N-Myc和STAT交互子在甲型流感病毒性肺炎的作用及调控机制》文中研究说明甲型流感病毒（influenza A virus,IAV）是引起人类急性呼吸系统传染病的典型病原体,已经多次全球爆发流行,造成了世界范围内大量的发病和死亡。临床上,严重流感病毒感染的患者表现为双侧肺浸润和低氧血症,并常死于急性肺损伤（acute lung injury,ALI）或急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）。甲型流感病毒易感人群广泛,变异率高。除了流感疫苗疗效受限之外,抗病毒药物的耐药等原因导致甲型流感病毒性肺炎的防治日渐困难。天然免疫系统作为机体抵抗病毒入侵的第一道防线,在IAV入侵机体后,宿主的模式识别受体（pattern recognition receptors,PRRs）可以迅速识别病毒的病原体相关分子模式（pathogen associated molecular patterns,PAMPs）,诱导下游核转录因子（nuclear factor-kappa B,NF-κB）、干扰素调节因子（interferon regulatory factor,IRF）3和IRF7的活化,启动I型干扰素（IFN-I）、炎症因子和趋化因子表达,从而杀伤和清除病毒。IFN-I是抗病毒免疫的关键因子,能诱导大量干扰素刺激基因（interferon stimulated genes,ISGs）的转录,这些基因的表达能够促使机体迅速发挥抗病毒活性。在抗病毒天然免疫过程中,蛋白翻译后修饰（post-translational modification,PTM）包括磷酸化、泛素化、乙酰化、甲基化等是动态调节蛋白质功能的重要方式。一些调控蛋白可以通过不同的翻译后修饰形式,靶向PRR信号通路中的感受器、受体、适配蛋白、酶、转录因子等,严密地调节机体抗病毒免疫反应。因此,寻找抗病毒天然免疫反应信号通路上的重要调控蛋白,并揭示其作用机制对筛选抗病毒药物靶点和防治甲型流感病毒性肺炎都具有重要的意义。N-Myc和STAT交互子（N-Myc and STAT interactor,NMI）是一种在干扰素刺激后高表达的蛋白,由N端的卷曲螺旋结构域（CC）,和C端的两个串联NMI/IFP35结构域（NID1,NID2）组成。以前的研究表明,NMI与干扰素诱导蛋白（interferon-induced protein 35,IFP35）同源,通过相互结合,增强IFP35的稳定性。NMI能抑制癌细胞增殖、参与JAK-STAT通路、作为损伤相关分子模式,促进炎症反应、还与抗SARS-Co V和仙台病毒有密切关系。在IAV感染中,NMI是否发挥调控作用?其具体的机制如何?目前仍不清楚。在本课题中,我们围绕NMI在IAV感染中发挥的作用及调控机制进行了深入研究。我们利用GEO数据库发现在IAV感染的病人外周血白细胞中,与正常病人相比,NMI的转录水平明显增高。野生型C57BL/6小鼠感染甲型流感病毒株PR8第三天后,肺组织NMI的表达水平达到顶峰。NMI基因全敲(Nmi-/-)小鼠对流感病毒的抵抗力明显增强,与野生型C57BL/6小鼠相比,Nmi-/-小鼠生存率明显增高,肺部病毒滴度减少,IFN-I（IFN-α/IFN-β）和ISGs表达增高。上述结果表明NMI作为负向调节因子,参与调控机体的抗病毒天然免疫反应。在体外实验,我们发现人肺上皮和小鼠巨噬细胞NMI缺陷能够促进甲流病毒PR8感染诱导的IFN-I和炎症因子的表达。利用小干扰RNA敲除NMI或者质粒转染过表达NMI后,通过双荧光素酶报告基因检测PR8刺激后细胞内的干扰素刺激应答元件（ISRE）和NF-κB转录活性水平,发现NMI抑制ISRE和NF-κB的活性。免疫印迹检测PR8感染后信号分子的磷酸化水平,发现NMI抑制IRF3、IRF7和NF-κB信号通路活化。我们进一步对NMI的作用机制进行了研究。利用双荧光素报告基因实验,在HEK293T细胞中筛选了抗病毒信号通路上重要的节点蛋白RIG-1、MDA5、MAVS、TRIF、TBK1、IRF3和IRF7,结果表明NMI的作用位点位于IRF3、IRF7或者其下游。免疫共沉淀实验确认了NMI能与IRF3和IRF7相互结合。免疫荧光实验也证实NMI与IRF3和IRF7共定位。免疫共沉淀实验进一步发现在PR8刺激细胞后,内源性NMI与IRF3和IRF7相互结合增加。利用NMI截短体质粒和免疫共沉淀实验发现NMI通过其NID1、NID2结构域与IRF3和IRF7相互结合。采用蛋白合成抑制剂、蛋白酶体抑制剂及溶酶体抑制剂,免疫印迹后发现NMI通过蛋白酶体途径降解IRF3和IRF7。同时,我们用免疫共沉淀实验证明了NMI促进了IRF3和IRF7的K48位泛素化修饰及蛋白酶体途径的降解。蛋白质谱分析显示E3泛素连接酶TRIM21（tripartite motif-containing 21）能与IRF3和IRF7相互作用,并且TRIM21能减少IRF3和IRF7的蛋白表达。免疫共沉淀发现NMI与TRIM21相互结合。在TRIM21和NMI过表达后,IRF3和IRF7的内源性泛素化增强。而si RNA沉默TRIM21后,即使NMI过表达,IRF3和IRF7的内源性泛素化几乎不能被检测,表明NMI依赖于TRIM21促进IRF3和IRF7的泛素化降解。综上,我们的研究首次发现了NMI在IAV的感染过程中发挥了重要的调控作用,并揭示NMI促进IRF3和IRF7的K48位泛素化修饰,介导其蛋白酶体途径的降解,进而抑制IFN-I和ISGs的产生,削弱抗病毒天然免疫反应。NMI依赖于TRIM21介导IRF3和IRF7的泛素化和降解。我们的研究丰富了泛素化调控网络的基础研究,揭示了机体调控抗病毒天然免疫反应的新机制,为病毒性肺炎防治提供了潜在的靶标和新思路。
二、甲型流感病毒诱导产生的IFN-α/β和IL-18可协同加强IFN-γ基因在人T细胞的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、甲型流感病毒诱导产生的IFN-α/β和IL-18可协同加强IFN-γ基因在人T细胞的表达（论文提纲范文）
（1）PCV2感染在PPV致病过程中的免疫调控作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 文献综述 |
| 第一章 动物病毒感染对免疫系统的作用及机制研究进展 |
| 1.1 动物病毒感染对先天性免疫系统的作用及机制研究进展 |
| 1.1.1 动物病毒感染对关键模式识别受体的作用及机制研究 |
| 1.1.2 动物病毒感染对固有免疫细胞的作用及机制研究 |
| 1.1.3 动物病毒感染对I型IFN介导先天性免疫的作用及机制研究 |
| 1.2 动物病毒感染对适应性免疫系统的作用及机制研究进展 |
| 1.2.1 动物病毒感染对细胞免疫的作用及机制研究 |
| 1.2.2 动物病毒感染对体液免疫的作用及机制研究 |
| 1.2.3 动物病毒感染对细胞因子分泌的作用及机制研究 |
| 1.3 PCV2感染对免疫系统的作用及机制研究进展 |
| 1.3.1 PCV2的关键组分在PCV2致病中的作用及机制 |
| 1.3.2 PCV2与其他病原混合感染现状 |
| 1.3.3 PCV2促进其他病原混合感染的免疫机制 |
| 1.4 本研究的目的意义 |
| 试验研究 |
| 第二章 PCV2感染在PPV致病过程中的作用研究 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 病毒 |
| 2.1.2 实验动物 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 试验动物及分组设计 |
| 2.2.2 酶联免疫(ELISA)检测 |
| 2.2.3 荧光定量PCR(qPCR)检测干扰素刺激基因mRNA水平 |
| 2.2.4 血液中病毒DNA的提取 |
| 2.2.5 PPV拷贝数检测 |
| 2.2.6 western blotting检测组织中病毒蛋白表达 |
| 2.2.7 数据分析 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 PCV2感染对IL-10 表达的影响 |
| 2.3.2 PCV2感染对PPV诱导的I型干扰素表达的影响 |
| 2.3.3 PCV2感染对PPV诱导IL-12p40表达的影响 |
| 2.3.4 PCV2感染对PPV诱导的干扰素刺激基因表达的影响 |
| 2.3.5 PCV2感染对血清中PPV复制的影响 |
| 2.3.6 PCV2感染对子宫和卵巢中PPV VP2表达的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 PCV2Rep对猪肺泡巨噬细胞IL-10表达的影响及调控机制研究 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 病毒和载体 |
| 3.1.2 细胞 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 ELISA检测IL-10的表达 |
| 3.2.2 qPCR检测IL-10 mRNA水平 |
| 3.2.3 western blotting检测PCV1Rep、PCV2Rep及宿主细胞相关蛋白表达 |
| 3.2.4 双荧光素报告基因检测il10 启动子活性 |
| 3.2.5 染色质免疫共沉淀(ChIP)检测il10启动子与p50、Sp1以及AP1的结合活性 |
| 3.2.6 siRNA转染抑制相关通路 |
| 3.2.7 数据分析 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 PCV2感染上调PAMs IL-10的表达 |
| 3.3.2 PCV2Cap持续上调IL-10表达 |
| 3.3.3 PCV2Rep在感染后期上调PAMs IL-10的表达 |
| 3.3.4 PCV2Rep可直接上调PAMs IL-10的表达 |
| 3.3.5 PCV2Rep激活p38-MAPK通路上调IL-10的表达 |
| 3.3.6 PCV2Rep激活p38-MAPK通路调控转录因子NF-κB p50和Sp1上调IL-10的表达 |
| 3.3.7 PCV2Rep在感染后期激活p38-MAPK通路 |
| 3.3.8 TDG参与PCV2Rep调控IL-10 表达 |
| 3.3.9 PCV2Rep互作蛋白TDG的缺失减弱PCV2诱导IL-10 的表达 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 PCV2感染对PPV诱导的IFN-β表达影响及调控机制研究 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 细胞和病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 仪器设备 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 PPV拷贝数检测 |
| 4.2.2 双荧光素报告基因检测ifn-β启动子活性 |
| 4.2.3 qPCR检测IFN-β、ISG15、ISG56、IFIT2和CXCL10 的转录水平 |
| 4.2.4 western blotting检测IRF3、TBK1和USP21及其磷酸化水平 |
| 4.2.5 免疫共沉淀(Co-IP)检测STING-K63 泛素化水平 |
| 4.2.6 siRNA转染抑制相关通路 |
| 4.2.7 数据分析 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 PCV2感染促进PPV的复制 |
| 4.3.2 PCV2感染抑制PPV诱导的IFN-βmRNA水平以及ifn-β启动子活性 |
| 4.3.3 PCV2感染抑制PPV诱导的IFN刺激基因的转录 |
| 4.3.4 PCV2感染抑制PPV诱导的TBK1和IRF3 磷酸化以及p-IRF3 入核 |
| 4.3.5 PCV2感染抑制PPV诱导的STING-K63 泛素化以及STING对 IRF3和TBK1的募集作用 |
| 4.3.6 PCV2感染抑制cGAMP诱导的IFN-β表达 |
| 4.3.7 PCV2感染抑制cGAMP诱导的p-TBK1、p-IRF3 水平以及p-IRF3 入核 |
| 4.3.8 PCV2感染抑制cGAMP诱导的STING-K63 泛素化以及STING对 IRF3 和TBK1 的募集作用 |
| 4.3.9 PCV2感染通过p38-MAPK通路调控IFN-β表达 |
| 4.3.10 PCV2感染激活p38-MAPK通路调控STING-K63 泛素化 |
| 4.3.11 PCV2感染通过USP21 调控IFN-β的转录 |
| 4.3.12 PCV2感染通过USP21 调控STING-K63 泛素化抑制STING对 IRF3 和TBK1 的募集作用 |
| 4.3.13 PCV2感染通过p38-MAPK通路调控USP21 磷酸化水平 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 PCV2Cap和 Rep对 PPV诱导的IL-12p40 表达影响及调控机制研究 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 病毒和细胞 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 ELISA检测PCV2对PPV诱导的IL-12p40表达影响 |
| 5.2.2 ELISA检测PCV2Cap和 Rep对 PPV诱导的IL-12p40表达影响 |
| 5.2.3 q PCR检测IL-12p40 mRNA水平 |
| 5.2.4 双荧光素报告基因检测p65启动子活性 |
| 5.2.5 western blotting检测p-IκB和p65核转位 |
| 5.2.6 ChIP检测NF-κB与il12B启动子的结合活性 |
| 5.2.7 数据分析 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 PCV2感染可以抑制PPV诱导的IL-12p40 表达 |
| 5.3.2 PCV2Cap和 Rep抑制PPV诱导的IL-12p40 表达 |
| 5.3.3 PCV2Cap和 Rep在 PCV2感染不同时期抑制了PPV诱导的IL-12p40 表达 |
| 5.3.4 PCV2感染抑制PPV诱导的NF-κB通路活化 |
| 5.3.5 PCV2Cap和 Rep在感染不同时期抑制PPV诱导的NF-κB通路活化 |
| 5.3.6 PCV2介导PI3K-Akt和 p38-MAPK通路抑制PPV诱导的IL-12p40 mRNA水平 |
| 5.3.7 PCV2Cap介导PI3K-Akt和p38-MAPK通路抑制PPV诱导的IL-12p40 mRNA水平 |
| 5.3.8 PCV2Rep介导p38-MAPK通路抑制PPV诱导的IL-12p40 mRNA水平 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）IL-6在流感病毒-肺炎链球菌共感染肺炎及肺炎链球菌肺炎继发脓毒症中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 IL-6 在流感病毒-肺炎链球菌共感染肺炎中的作用及机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 鸡胚、病毒、细胞和细菌 |
| 1.2 实验动物和器械 |
| 1.3 仪器设备 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 溶液配方 |
| 2实验方法 |
| 2.1 流感病毒PR8的鸡胚增殖 |
| 2.2 血凝实验 |
| 2.3 MDCK细胞培养及空斑实验 |
| 2.4 肺炎链球菌D39的培养和菌载量测定 |
| 2.5 动物感染剂量、感染表示方法、动物分组及建模 |
| 2.6 肺部、鼻咽部、血液和脾脏细菌载量测定 |
| 2.7 生存率和体重变化监测 |
| 2.8 肺组织病理分析 |
| 2.9 ELISA测定炎症因子 |
| 2.10 肺组织湿干比 |
| 2.11 共感染肺炎患者体内IL-6水平测定 |
| 2.12 IL-6~(-/-)鼠的鉴定 |
| 2.13 肺组织病毒RNA绝对定量 |
| 2.14 肺泡灌洗液中总蛋白测定 |
| 2.15 肺泡细胞流式分析 |
| 2.16 体内吞噬实验 |
| 2.17 体外吞噬实验 |
| 2.18 肺组织原位细胞死亡检测 |
| 2.19 统计学处理方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 PR8和D39的定量 |
| 3.2 初始IAV感染增加了小鼠继发S.pn感染的易感性 |
| 3.3 IAV和S.pn协同感染导致绝对致死性疾病 |
| 3.4 共感染肺炎小鼠和患者体内IL-6水平显着升高 |
| 3.5 缺乏IL-6使得流感后小鼠继发细菌感染的易感性明显增加 |
| 3.6 IAV-S.pn共感染肺炎期间,IL-6可减少肺部炎症细胞死亡 |
| 3.7 流感病毒-肺炎链球菌共感染肺炎期间,IL-6可增强肺部巨噬细胞吞噬功能 |
| 3.8 IL-6在降低流感后小鼠继发细菌感染的易感性中具有重要的保护作用 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 IL-6在肺炎链球菌肺炎继发脓毒症中的作用及机制研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物、动物模型和细胞 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 溶液配方 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 临床评分 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 肺巨噬细胞敲低 |
| 2.4 体外杀伤实验 |
| 2.5 肺泡细胞流式分析 |
| 2.6 原位细胞死亡检测 |
| 2.7 肺泡灌洗液和细胞培养上清中LDH活性检测 |
| 2.8 免疫印迹 |
| 2.9 免疫组化(石蜡切片) |
| 2.10 小鼠重组IL-6蛋白处理 |
| 2.11 体外感染 |
| 2.12 其他方法 |
| 2.13 统计分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 IL-6影响肺炎链球菌肺炎继发脓毒症的结局 |
| 3.2 IL-6影响肺炎链球菌肺炎继发脓毒症的结局主要通过其对巨噬细胞的效应 |
| 3.3 肺炎链球菌肺炎继发脓毒症期间,缺乏IL-6不利于肺巨噬细胞存活和肺炎症损伤控制 |
| 3.4 IL-6通过GSDME和GSDMD介导的焦亡调节肺炎链球菌诱导的巨噬细胞死亡 |
| 3.5 肺炎链球菌肺炎继发脓毒症期间,IL-6阻止GSDME和GSDMD介导的肺组织炎症损伤 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 文献综述 白介素6在呼吸系统感染性疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（3）结核分枝杆菌ESAT-6的免疫学特性及其在黏膜疫苗中的应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 结核病新疫苗研究进展 |
| 1.1.1 进入临床试验的结核病疫苗 |
| 1.1.2 结核病亚单位疫苗的候选抗原 |
| 1.2 ESAT-6 蛋白研究进展 |
| 1.2.1 ESAT-6 蛋白概述 |
| 1.2.2 ESAT-6在Mtb致病性中的作用 |
| 1.2.3 ESAT-6 调控宿主固有免疫应答 |
| 1.2.4 ESAT-6 作为疫苗候选抗原的研究 |
| 1.3 亚单位疫苗的佐剂研究 |
| 1.4 细菌信号分子c-di-AMP在感染与免疫中的作用 |
| 1.4.1 c-di-AMP调节细菌的生理 |
| 1.4.2 c-di-AMP调节宿主固有免疫应答 |
| 1.4.3 c-di-AMP在疫苗佐剂中的应用 |
| 1.5 黏膜免疫 |
| 1.5.1 sIgA介导的体液免疫应答 |
| 1.5.2 黏膜局部的细胞免疫应答 |
| 1.6 本研究设想 |
| 第二章 耻垢分枝杆菌ESAT-6 敲除株的免疫学特性 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 细胞系 |
| 2.1.3 培养基及缓冲液 |
| 2.1.4 试剂 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 sg RNA敲除质粒的构建 |
| 2.2.2 Ms的培养、计数与感受态制备 |
| 2.2.3 MsΔE6 敲除株的构建与鉴定 |
| 2.2.4 MsΔE6 互补株的构建与鉴定 |
| 2.2.5 r Ms生长及抗酸特性检测 |
| 2.2.6 r Ms感染巨噬细胞模型建立 |
| 2.2.7 基因转录水平检测 |
| 2.2.8 蛋白表达水平检测 |
| 2.2.9 r Ms在巨噬细胞内的存活 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 Ms ESAT-6与Mtb ESAT-6 氨基酸序列分析 |
| 2.3.2 MsΔE6 突变株的构建与鉴定 |
| 2.3.3 MsΔE6 互补株的构建与鉴定 |
| 2.3.4 rMs的生长及抗酸特性 |
| 2.3.5 rMs感染巨噬细胞诱导炎症因子的转录水平 |
| 2.3.6 rMs感染巨噬细胞诱导i NOS的转录水平 |
| 2.3.7 rMs感染巨噬细胞激活炎症小体 |
| 2.3.8 rMs感染诱导巨噬细胞自噬 |
| 2.3.9 rMs在巨噬细胞内的存活 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 ESAT-6 在调节巨噬细胞固有免疫中的作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株与细胞系 |
| 3.1.2 实验动物 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 试剂 |
| 3.1.5 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 ESAT-6 蛋白纯化 |
| 3.2.2 BMDM的分离与诱导 |
| 3.2.3 Mtb培养与计数 |
| 3.2.4 巨噬细胞体外刺激 |
| 3.2.5 基因转录水平检测 |
| 3.2.6 蛋白表达水平检测 |
| 3.2.7 免疫荧光分析 |
| 3.2.8 ELISA检测细胞因子分泌水平 |
| 3.2.9 Mtb在巨噬细胞中的存活 |
| 3.2.10 统计学分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 ESAT-6 蛋白的纯化 |
| 3.3.2 ESAT-6 诱导巨噬细胞I型 IFN应答 |
| 3.3.3 ESAT-6 调控巨噬细胞自噬 |
| 3.3.4 m TOR在 ESAT-6 调控自噬中的作用 |
| 3.3.5 IL-17在ESAT-6 通过m TOR调控自噬中的作用 |
| 3.3.6 ESAT-6 促进MH-S细胞炎症因子的释放 |
| 3.3.7 ESAT-6 抑制Mtb在 MH-S细胞内存活 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 ESAT-6 亚单位疫苗的免疫学特性 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 临床样本信息 |
| 4.1.2 伦理声明 |
| 4.1.3 实验动物 |
| 4.1.4 细胞培养基 |
| 4.1.5 试剂 |
| 4.1.6 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.0 亚单位疫苗的制备 |
| 4.2.1 动物免疫策略 |
| 4.2.2 抗体水平检测 |
| 4.2.3 肺组织免疫细胞亚群分析 |
| 4.2.4 脾淋巴细胞分离 |
| 4.2.5 脾淋巴细胞增殖检测 |
| 4.2.6 脾细胞分泌的细胞因子检测 |
| 4.2.7 组织总RNA提取 |
| 4.2.8 呼吸道菌群分析 |
| 4.2.9 统计学分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 结核病患者血清特异性抗体水平 |
| 4.3.2 亚单位疫苗诱导的体液免疫应答 |
| 4.3.3 亚单位疫苗诱导的脾脏细胞免疫应答 |
| 4.3.4 亚单位疫苗诱导的肺部细胞免疫应答 |
| 4.3.5 亚单位疫苗黏膜免疫对呼吸道菌群的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 ESAT-6 亚单位疫苗对Mtb感染的免疫保护效率 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌株与实验动物 |
| 5.1.2 培养基 |
| 5.1.3 试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Mtb感染模型的建立 |
| 5.2.2 抗体水平检测 |
| 5.2.3 脾淋巴细胞增殖检测 |
| 5.2.4 脾细胞分泌的细胞因子检测 |
| 5.2.5 脏器荷菌数 |
| 5.2.6 统计学分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 免疫小鼠Mtb感染后的体液免疫应答水平 |
| 5.3.2 免疫小鼠Mtb感染后脾淋巴细胞增殖 |
| 5.3.3 免疫小鼠Mtb感染后诱导的脾细胞因子分泌水平 |
| 5.3.4 免疫小鼠Mtb感染后脏器荷菌数 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 展望 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用（论文提纲范文）
| 提要 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 文章缩略词表 |
| 引言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 TGF-β的概述 |
| 1.1.1 TGF-β的来源 |
| 1.1.2 TGF-β的表达 |
| 1.1.3 TGF-β的结构 |
| 1.1.4 TGF-β的信号通路 |
| 1.2 TGF-β的生物学活性 |
| 1.2.1 TGF-β对胚胎发育的调节 |
| 1.2.2 TGF-β对免疫应答的负向调节 |
| 1.2.3 TGF-β2对肿瘤的生长,侵袭及迁移的促进作用 |
| 1.2.4 TGF-β对组织损伤修复、创面愈合、瘢痕增生的促进作用及炎症反应的抑制作用 |
| 1.2.5 TGF-β2对纤维化的调节作用 |
| 1.2.6 TGF-β对肿瘤的抑制作用 |
| 1.3 靶向TGF-β2的药物 |
| 1.3.1 TGF-β2的反义寡核苷酸 |
| 1.3.2 TGF-β2的micro RNA |
| 1.3.3 TGF-β2的sh RNA |
| 1.3.4 TGF-β2的抗体 |
| 1.3.5 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
| 1.3.6 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
| 1.3.7 TGF-β2的抑制剂 |
| 1.4 疫苗佐剂的概述及其研究进展 |
| 1.4.1 增强第一信号的佐剂 |
| 1.4.2 增强第二信号的佐剂 |
| 1.4.3 增强第三信号的佐剂 |
| 1.4.4 抑制T细胞抑制信号的佐剂 |
| 1.4.5 改善肿瘤免疫抑制微环境的佐剂 |
| 1.4.6 病毒载体佐剂 |
| 1.4.7 其他佐剂 |
| 1.4.8 多佐剂肿瘤疫苗 |
| 1.4.9 佐剂的接种途径 |
| 1.4.10 佐剂发挥作用的机制 |
| 1.5 RNA靶向性寡核苷酸的研究进展 |
| 1.5.1 反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide) |
| 1.5.2 siRNA |
| 1.5.3 micro RNA |
| 1.5.4 反义寡核苷酸的化学修饰方法 |
| 第2章 材料方法 |
| 2.1 ODN及引物 |
| 2.2 实验试剂,仪器与耗材 |
| 2.3 细胞与细胞系 |
| 2.4 实验动物 |
| 2.5 IAV的扩增 |
| 2.6 IAV TCID50 的测定 |
| 2.7 IAV血凝效价的测定 |
| 2.8 聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 2.9 小鼠PBMC、脾脏及淋巴结单细胞悬液的制备 |
| 2.10 TIO对 TGF-β2 m RNA表达的抑制实验 |
| 2.11 流式细胞术(Flow cytometry) |
| 2.12 蛋白免疫印迹实验(Western Blotting analysis) |
| 2.13 免疫荧光技术 |
| 2.14 TIO在小鼠器官和组织中的分布检测 |
| 2.15 小鼠的免疫 |
| 2.15.1 疫苗的制备 |
| 2.15.2 小鼠的免疫和血清的收集 |
| 2.16 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.17 流感病毒攻毒实验 |
| 2.18 小鼠肺组织的病理学观察 |
| 2.19 脑胶质瘤细胞裂解物(TCL)的制备 |
| 2.20 GL261脑胶质瘤原位模型的建立 |
| 2.21 脑胶质瘤预防模型的建立 |
| 2.22 脑胶质瘤治疗模型的建立 |
| 2.23 肿瘤周围浸润的炎性细胞的检测 |
| 2.24 肿瘤组织病理分析 |
| 2.25 胃癌背部移植瘤模型的建立 |
| 2.26 统计学分析 |
| 第3章 研究结果 |
| 3.1 靶向TGF-β2的反义寡核苷酸的设计与筛选 |
| 3.2 TIOs对 RAW264.7 细胞,U-937 细胞及CAL-1 细胞表达TGF-β2的影响 |
| 3.2.1 TIOs对 IL-4 诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 m RNA表达的影响 |
| 3.2.2 TIOs对 IL-4诱导的RAW264.7细胞Arg1及TNF-αmRNA表达的影响 |
| 3.2.3 TIOs对 LPS诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 mRNA表达的影响 |
| 3.2.4 TIOs对 LPS诱导的U-937 细胞表达TGF-β2 mRNA的影响 |
| 3.2.5 TIOs对甲型流感病毒(IAV)诱导的CAL-1 细胞TGF-β2mRNA表达的影响 |
| 3.2.6 TIOs对 IL-4/LPS诱导的RAW264.7/U-937细胞表达TGF-β2蛋白的影响 |
| 3.3 TIO3在细胞和组织中的分布 |
| 3.4 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
| 3.4.1 TIOs对微生物疫苗诱导的抗体产生水平的影响 |
| 3.4.2 TIO3对流感病毒疫苗诱导的抗流感病毒效率的增强作用 |
| 3.4.3 TIO1和TIO3 的微生物疫苗佐剂效应的可能机制 |
| 3.4.4 TIOs的微生物疫苗佐剂的安全性评价 |
| 3.5 TIO的胶质瘤疫苗的佐剂作用 |
| 3.5.1 TIOs为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗对原位接种脑胶质瘤预防模型小鼠的影响 |
| 3.5.2 TIOs为佐剂的胶质瘤疫苗对原位接种胶质瘤治疗模型小鼠生存期的影响 |
| 3.6 单独应用TIO3的抗胶质瘤及抗胃癌作用 |
| 3.6.1 单独应用TIO3对脑胶质瘤原位移植瘤模型小鼠生存期的影响 |
| 3.6.2 单独应用TIO3对胃癌背部移植瘤模型小鼠体重、肿瘤大小及生存期的影响 |
| 3.6.3 单独应用TIO3对胃癌细胞腹腔种植模型小鼠生存期的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
| 4.1.1 TIO3对CD4~+T细胞表面s TGF-β2 表达的抑制作用 |
| 4.1.2 TIO3 对 CD19~+ B 细胞表面 sTGF-β2 表达的抑制作用 |
| 4.1.3 TIO3的药效动力学分析 |
| 4.1.4 TIO1,TIO2及TIO3 的不同功效的机理分析 |
| 4.1.5 TIO3用于微生物疫苗佐剂的副作用分析 |
| 4.1.6 TIO3用于微生物疫苗佐剂的可行性分析 |
| 4.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应 |
| 4.2.1 TIO3 对胶质瘤细胞MHC I分子表达的上调作用 |
| 4.2.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应的机理分析 |
| 4.3 单独应用TIO3的抗胶质瘤和抗胃癌作用 |
| 4.4 总结和展望 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 附录1 |
| 附录2 The College of Basic Medical Sciences of Jilin University Ethics Committee Approval Form |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）干扰素调节因子家族成员在流感病毒诱导的局部和全身炎症反应中的表达模式（论文提纲范文）
| 提要 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一篇 文献综述 |
| (一)流感病毒感染与其相关免疫应答 |
| 1.1 流感病毒简介 |
| 1.2 流感病毒与固有免疫 |
| 1.3 干扰素及其信号转导途径 |
| 1.4 Ⅰ型干扰素与炎症反应 |
| (二)干扰素调节因子家族成员及其免疫调节作用 |
| 2.1 IRF家族成员的结构特征 |
| 2.2 IRF家族成员的生物学功能 |
| 2.3 IRF3、IRF5和IRF7是TLR及 RLR信号传导中Ⅰ型 IFN表达的主要调控因子 |
| (三)寡脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODN)的研究进展 |
| 3.1 免疫刺激性寡脱氧核苷酸的结构特征与功能 |
| 3.2 免疫抑制性寡脱氧核苷酸的结构特征与功能 |
| 课题设计思路 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 流感病毒感染后对局部和全身IRF家族成员表达水平的影响 |
| 前言 |
| 第一节 流感病毒感染人局部组织中IRFs的表达水平变化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.1.1 患者鼻咽拭子标本采集 |
| 1.1.2 鼻咽拭子标本的病毒检测和分类 |
| 1.1.3 IAV、IBV和非呼吸道感染者临床指标采集 |
| 1.2 实验试剂与器材 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 IAV、IBV和非呼吸道感染患者鼻咽拭子标本的收集及研究流程图 |
| 1.3.2 鼻咽拭子标本的处理和病毒检测 |
| 1.3.3 Trizol法提取IAV、IBV和非呼吸道感染者鼻咽上皮细胞内总RNA并逆转录成cDNA |
| 1.3.4 RT-qPCR法检测流感病毒感染患者鼻咽拭子标本中IRF家族成员的m RNA表达水平 |
| 1.4 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 不同流感病毒感染的鼻咽上皮细胞分类 |
| 2.2 IAV、IBV和非呼吸道感染患者临床资料分析 |
| 2.3 流感病毒感染患者鼻咽上皮细胞中IRF家族成员的m RNA水平检测 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 流感病毒感染小鼠局部和全身组织中IRFs的表达水平变化及GAAA ODN对其的调节作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和细胞 |
| 1.2 流感病毒 |
| 1.3 寡脱氧核苷酸 |
| 1.4 实验试剂与器材 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.5.1 流感病毒的扩增和血凝效价的测定 |
| 1.5.2 流感病毒在MDCK细胞上半数组织细胞感染剂量(TCID50)的检测 |
| 1.5.3 流感病毒感染小鼠LD50的检测 |
| 1.5.4 流感病毒感染小鼠模型的建立 |
| 1.5.5 流感病毒感染小鼠肺及其他重要脏器组织中IRF家族m RNA水平的检测 |
| 1.5.6 流感病毒感染小鼠经GAAA ODN M1 干预处理后,小鼠肺及其他重要脏器组织中IRF家族m RNA水平的检测 |
| 1.6 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 H1N1流感病毒的扩增和血凝效价的测定 |
| 2.2 H1N1流感病毒在MDCK细胞上半数组织细胞感染剂量的测定 |
| 2.3 流感病毒感染BALB/c小鼠的LD50测定 |
| 2.4 H1N1感染小鼠肺等脏器中IRF家族的m RNA表达谱及GAAA ODN M1对IRFs表达的调控作用 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 流感病毒感染人pDC样 CAL-1 细胞后对IRFs,TLR3/7,RIG-Ⅰ及其下游信号分子表达的影响 |
| 前言 |
| 第一节 流感病毒感染人pDC样 CAL-1 细胞IRF-IFN-Ⅰ信号通路相关因子的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 流感病毒 |
| 1.3 实验试剂与器材 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 流感病毒H1N1 感染不同时间对人pDC样 CAL-1 细胞IRF家族表达谱的影响 |
| 1.4.2 流感病毒H9N2 感染不同时间对人pDC样 CAL-1 细胞IRF家族表达谱的影响 |
| 1.4.3 流感病毒H1N1 感染不同时间对IRFs上游PRR受体信号通路(TLR3、TLR7、RIG-Ⅰ)和下游IFN-Ⅰ及炎症因子表达影响 |
| 1.4.4 分别用人重组干扰素(rIFN-α2b)和重组rIFN-γ处理CAL-1 细胞对IRFs及ISGs表达的影响 |
| 1.4.5 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 流感病毒H1N1 感染对人pDC样 CAL-1 细胞IRF家族表达谱的影响 |
| 2.2 流感病毒H9N2 感染不同时间对人pDC样 CAL-1 细胞IRF家族表达谱的影响 |
| 2.3 流感病毒H1N1 感染不同时间对IRFs上游PRR受体信号通路(TLR3、TLR7、RIG-Ⅰ)和下游IFN-Ⅰ及炎症因子表达影响 |
| 2.4 分别用人重组干扰素(rIFN-α2b)和重组rIFN-γ处理CAL-1 细胞对IRFs及 ISGs表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 流感病毒对CAL-1 细胞IRF家族及其上下游信号分子表达调控的可能机制探讨 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 流感病毒 |
| 1.3 寡脱氧核苷酸 |
| 1.4 实验试剂与器材 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.5.1 流感病毒感染人pDC样 CAL-1 细胞用人重组干扰素(rIFN-α2b)处理对IRF家族表达水平的影响 |
| 1.5.2 流感病毒感染人pDC样 CAL-1 细胞用人重组干扰素(rIFN-α2b)处理对TLR3/7及其下游信号分子表达水平的影响 |
| 1.5.3 流感病毒感染人pDC样 CAL-1 细胞同时用不同浓度的氯喹处理对IRF家族表达水平的影响 |
| 1.5.4 流感病毒感染人pDC样 CAL-1 细胞同时用不同浓度的氯喹处理对TLR3/7 及其下游信号分子表达水平的影响 |
| 1.5.5 流感病毒感染人pDC样 CAL-1 细胞同时用不同浓度的GAAA ODN A1 处理对IRF家族表达水平的影响 |
| 1.5.6 流感病毒感染人pDC样 CAL-1 细胞同时用不同浓度的GAAA ODN A1 处理对TLR3/7及其下游信号分子表达水平的影响 |
| 1.5.7 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 重组rIFN-α2b,氯喹和GAAA ODN A1对H1N1感染的CAL-1 细胞中IRF家族表达谱的影响 |
| 2.2 重组IFN-α2b,氯喹和GAAA ODN A1对H1N1感染的CAL-1 细胞中TLR3/7 及其下游信号分子表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三节 流感病毒感染CAL-1 细胞后对IRF3、IRF5和IRF7 磷酸化水平的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 流感病毒 |
| 1.3 寡脱氧核苷酸 |
| 1.4 实验试剂与器材 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.5.1 流感病毒感染人pDC样 CAL-1 及用GAAA ODN A1 处理对IRF3,IRF5,IRF7 的表达和磷酸化水平的影响 |
| 1.5.2 GAAA ODN A1对H1N1感染CAL-1细胞中IRF5核转位的影响 |
| 1.5.3 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 流感病毒感染人pDC样 CAL-1 细胞及用GAAA ODN A1 处理对IRF3,IRF5,IRF7 的表达和磷酸化水平的影响 |
| 2.2 GAAA ODN A1对H1N1感染CAL-1细胞中IRF5核转位的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 不同单链RNA病毒对人pDC样 CAL-1 细胞中IRFs、TLR3/7和RIG-Ⅰ及其下游信号分子表达的影响 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞 |
| 1.2 不同ssRNA病毒 |
| 1.3 实验试剂与器材 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.4.1 不同流感病毒感染CAL-1 细胞中TLR3、7和RIG-Ⅰ及其下游信号分子m RNA水平动态变化 |
| 1.4.2 不同ssRNA病毒对IRF家族表达谱的影响 |
| 1.4.3 统计分析 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 不同流感病毒感染CAL-1 细胞中TLR3、7和RIG-Ⅰ及其下游信号分子mRNA水平动态变化 |
| 2.2 TNF-和 IFN-m RNA表达水平有可能是决定流感病毒致病性强弱和炎症强弱的重要指标 |
| 2.3 不同ssRNA病毒对IRF家族表达谱的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
（6）TRIM32在抗细菌先天免疫调控中的功能和机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 细菌诱导先天免疫概述 |
| 1.1 胞外菌猪链球菌诱导先天免疫概述 |
| 1.2 胞内菌李斯特菌诱导先天免疫概述 |
| 2 TRIM家族与先天免疫信号通路调节研究进展 |
| 2.1 TRIM蛋白N端结构域 |
| 2.2 TRIM蛋白C端结构域 |
| 2.3 TRIM蛋白表达模体 |
| 2.4 TRIM蛋白抑制HIV感染和释放 |
| 2.5 TRIM蛋白与PRR信号通路 |
| 2.6 TRIM21调节细胞因子基因转录 |
| 3 TRIM32的功能和作用机制研究进展 |
| 3.1 TRIM32参与细胞分化过程 |
| 3.2 TRIM32通过多种机制参与调控免疫信号通路 |
| 3.3 TRIM32在病毒-宿主互作中发挥重要作用 |
| 3.4 TRIM32在革兰氏阴性菌感染过程中具有重要功能。 |
| 4 本课题研究目的和思路 |
| 4.1 研究TRIM32在细菌感染过程中的功能 |
| 4.2 研究TRIM32在抗菌免疫反应调控中的先天免疫信号通路 |
| 4.3 研究在抗菌免疫反应中TRIM32影响细胞因子表达和转录调控的分子机制 |
| 第一章 :TRIM32基因敲除小鼠和细胞系的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 构建得到TRIM32 基因缺失C57BL/6 小鼠 |
| 2.2 筛选得到TRIM32 基因缺失RAW264.7 细胞系 |
| 3 讨论 |
| 第二章 :TRIM32在猪链球菌致脑膜炎和中毒性休克综合征中的功能和机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 TRIM32 基因缺失降低猪链球菌引起的STSLS |
| 2.2 TRIM32 缺失在猪链球菌感染早期下调血清中IFN-γ含量 |
| 2.3 TRIM32基因缺失降低猪链球菌诱发的脑膜炎 |
| 2.4 TRIM32基因缺失增加猪链球菌感染早期宿主血脑屏障通透性 |
| 2.5 TRIM32 基因缺失在猪链球菌感染早期增加PMN和炎性单核细胞募集 |
| 2.6 TRIM32基因缺失不影响巨噬细胞的吞噬和杀菌能力 |
| 3 讨论 |
| 第三章 :TRIM32在单核细胞增生李斯特菌感染中的功能和作用机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| (一)体内实验方法 |
| (二)体外实验方法 |
| (三)生化实验方法 |
| 2 实验结果 |
| 2.1 TRIM32在单增李斯特菌的感染过程中增加表达 |
| 2.2 TRIM32基因缺失提高小鼠抵抗李斯特菌感染能力 |
| 2.3 TRIM32 缺失RNAseq下调Erb B信号通路和细胞因子应答 |
| 2.4 TRIM32正调控干扰素信号通路的激活 |
| 2.5 TRIM32正调控单增李斯特菌感染过程中的先天免疫信号通路 |
| 2.6 TRIM32 调控MAPK、STAT和 TBK1 信号通路 |
| 2.7 TRIM32对单增李斯特菌感染后先天免疫细胞亚群组成的影响 |
| 2.8 TRIM32缺失提高活性嗜中性粒细胞比例及杀菌能力 |
| 2.9 TRIM32缺失增强巨噬细胞和自然杀伤细胞抗菌因子分泌 |
| 2.10 TRIM32缺失抑制李斯特菌胞内生长 |
| 3 讨论 |
| 第四章 :结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 A:主要仪器列表 |
| 附录 B:常用试剂配制方法 |
| 附录 C:抗体相关信息 |
| 附录 D:引物序列信息 |
| 作者在学期间取得的学术成果 |
| 主要简历 |
| 致谢 |
（7）藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 缩略语表 |
| 第一章 犬干扰素研究进展 |
| 1 IFN概述 |
| 1.1 IFN分类 |
| 1.2 犬IFN理化特性及基因组成 |
| 1.3 IFN的空间结构及受体研究 |
| 1.4 IFN生物学活性及作用机制 |
| 2 犬IFN基因工程研究 |
| 2.1 犬Ⅰ型IFN基因工程研究 |
| 2.2 犬Ⅱ型IFN基因工程研究 |
| 2.3 犬Ⅲ型IFN基因工程研究 |
| 2.4 犬长效IFN研究 |
| 3 犬IFN临床应用 |
| 3.1 治疗犬病毒性传染病 |
| 3.2 治疗犬皮肤性疾病 |
| 3.3 治疗眼科及其他疾病 |
| 4 犬IFN应用展望 |
| 第二章 白细胞介素18研究进展 |
| 1 IL-18概述 |
| 1.1 IL-18的发现、结构、特性 |
| 1.2 IL-18受体及信号传导途径 |
| 1.3 IL-18结合蛋白 |
| 2 IL-18生物学作用 |
| 2.1 IL-18抗肿瘤作用 |
| 2.2 IL-18抗感染作用 |
| 2.3 IL-18免疫调节作用 |
| 3 IL-18与临床疾病的关系 |
| 3.1 IL-18与自身免疫性疾病 |
| 3.2 IL-18与心血管系统疾病的关系 |
| 3.3 IL-18与神经系统疾病的关系 |
| 3.4 IL-18与肿瘤疾病的关系 |
| 3.5 IL-18与糖尿病等其他疾病的关系 |
| 4 IL-18应用展望 |
| 5 本研究的目的及意义 |
| 第三章 藏獒犬IFN-γ和 IFN-α基因克隆与序列分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 淋巴细胞的体外刺激活化 |
| 2.2 RT-PCR扩增藏獒犬IFN-γcDNA |
| 2.3 重组质粒的酶切及PCR鉴定 |
| 2.4 藏獒犬IFN-γ序列测定及分析 |
| 2.5 藏獒犬IFN-α序列测定及分析 |
| 3 讨论 |
| 第四章 藏獒犬IFN-γ和 IFN-α基因的表达、纯化及活性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组表达质粒的鉴定 |
| 2.2 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组蛋白Western bloting分析 |
| 2.3 藏獒犬pET-30a-IFN-γ和 pET-30a-IFN-α重组蛋白纯化分析 |
| 2.4 藏獒犬IFN-γ抗病毒活性检测 |
| 2.5 藏獒犬IFN-α抗病毒活性检测 |
| 2.6 藏獒犬IFN-α抗病毒临床应用 |
| 3 讨论 |
| 第五章 藏獒犬IL-18基因克隆、表达及生物学活性鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 藏獒犬IL-18基因的克隆 |
| 2.2 藏獒犬IL-18基因序列测定及分析 |
| 2.3 藏獒犬IL-18基因比较分析及进化分析 |
| 2.4 pET-30a-IL-18 重组质粒的鉴定 |
| 2.5 pET-30a-IL-18 重组蛋白表达及Western bloting分析 |
| 2.6 pET-30a-IL-18 重组蛋白纯化结果 |
| 2.7 藏獒犬IL-18基因生物学活性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 导师简介1 |
| 导师简介2 |
（8）动物流感病毒跨种属感染树鼩致病特性及抗感染免疫研究（论文提纲范文）
| 主要英文缩写词表 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 新现H3N2亚型SIV和H6N6亚型AIV跨种属感染树鼩致病特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 新现H3N2亚型SIV感染树鼩呼吸道组织基因特征研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 人、小鼠和大鼠抗体芯片检测树鼩抗感染免疫分子分析研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 本研究的创新点 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 流感病毒及感染动物模型研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（9）朊蛋白在H7N7-IAV感染中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 甲型流感病毒概述 |
| 1.2 甲型流感病毒的致病机制研究进展 |
| 1.2.1 甲型流感病毒诱导的免疫应答与炎症反应 |
| 1.2.1.1 甲型流感病毒诱导的免疫应答 |
| 1.2.1.2 甲型流感病毒诱导的炎症反应 |
| 1.2.2 甲型流感病毒感染后参与调节的固有免疫信号通路 |
| 1.3 朊蛋白PrP~c在病毒感染中的研究综述 |
| 1.3.1 朊蛋白的构象与朊蛋白病 |
| 1.3.2 朊蛋白的结构与生理功能 |
| 1.3.3 朊蛋白在病毒感染中的作用 |
| 1.3.4 朊蛋白在甲型流感病毒感染中的作用 |
| 1.4 本研究的科学问题,研究内容与意义 |
| 1.4.1 科学问题 |
| 1.4.2 研究内容与技术路线 |
| 1.4.3 创新点与研究意义 |
| 第二章 PrP~c在H7N7 亚型IAV诱导的小鼠炎症反应中的作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验毒株与小鼠 |
| 2.2.2 实验试剂、耗材与仪器 |
| 2.2.3 CRISPR/Cas9-PrP~(c-/-)小鼠的构建与鉴定 |
| 2.2.4 H7N7 感染小鼠诱导肺损伤模型的建立 |
| 2.2.5 H7N7 感染PrP~(-/-)小鼠后临床症状评价 |
| 2.2.6 H7N7 感染PrP-/-小鼠后肺组织病理评价 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PrPc缺失小鼠朊蛋白表达验证 |
| 2.3.2 H7N7 感染PrP~(-/-)小鼠后临床症状评价结果 |
| 2.3.3 H7N7 感染PrP~(-/-)小鼠后肺组织病理评价结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 H7N7 感染小鼠肺的RNA-seq及差异基因表达谱分析及验证 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 技术路线与分析方法 |
| 3.2.3 差异表达基因的q-PCR验证 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 肺转录组常规分析结果 |
| 3.3.2 肺转录组差异表达基因分析结果 |
| 3.3.3 肺转录组差异表达基因的q-PCR验证结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 PrP~c在H7N7 感染MLE-12 细胞诱导的炎症反应中的作用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.2.2.1 过表达质粒moPrP~c-pcDNA3.1(+)的构建 |
| 4.2.2.2 H7N7 感染MLE-12 细胞 |
| 4.2.2.3 过表达质粒转染MLE-12 细胞 |
| 4.2.2.4 H7N7 感染已转染moPrP-pcDNA3.1的MLE-12 细胞后检测基因表达 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 H7N7 感染细胞后M基因表达评价 |
| 4.3.2 moPrP-pcDNA3.1 转染细胞后基因表达评价 |
| 4.3.3 moPrP-pcDNA3.1 转染MLE-12 细胞后基因表达评价 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 主要结论 |
| 5.2 后续研究建议 |
| 附录 |
| 附录1 |
| 附录2 |
| 附录3 |
| 附录4 |
| 附录5 |
| 附录6 |
| 附录7 |
| 附录8 |
| 参考文献 |
| 科研成果 |
| 致谢 |
（10）N-Myc和STAT交互子在甲型流感病毒性肺炎的作用及调控机制（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 1.实验材料及设备 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 流感病毒 |
| 1.3 细胞系 |
| 1.4 实验主要抗体 |
| 1.5 实验主要试剂与试剂盒 |
| 1.6 实验相关的载体和分子克隆 |
| 1.7 实验耗材、仪器和设备 |
| 2.基础试剂配制 |
| 2.1 细胞培养基 |
| 2.2 小鼠腹腔巨噬细胞诱导液 |
| 2.3 DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶 |
| 2.4 细菌培养基 |
| 2.5 免疫印迹相关试剂 |
| 2.6 细胞样品制备相关试剂 |
| 3.实验方法 |
| 3.1 Nmi基因敲除小鼠的鉴定 |
| 3.2 细胞的常规培养 |
| 3.3 小鼠腹腔巨噬细胞的提取和培养 |
| 3.4 流感病毒的扩增 |
| 3.5 流感病毒的滴定 |
| 3.6 小鼠病毒感染 |
| 3.7 小鼠肺组织分离、匀浆和肺泡灌洗液的收集 |
| 3.8 小鼠肺组织病毒滴定测定 |
| 3.9 细胞的刺激和感染 |
| 3.10 真核细胞的小干扰RNA和质粒转染 |
| 3.11 细胞总蛋白提取和浓度测定 |
| 3.12 Western Blot |
| 3.13 免疫共沉淀 |
| 3.14 质粒的抽提 |
| 3.15 RNA的抽提和纯化 |
| 3.16 逆转录PCR和荧光定量PCR |
| 3.17 酶联免疫吸附试验 |
| 3.18 荧光素酶报告基因检测 |
| 3.19 免疫荧光 |
| 3.20 差异表达基因分析 |
| 4.实验结果的统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 1.甲型流感病毒感染诱导NMI表达升高 |
| 2.体外敲除NMI促进甲型流感病毒感染后细胞因子的表达 |
| 3.NMI缺失增强抗病毒免疫反应 |
| 3.1 NMI缺失增强小鼠对流感病毒的抵抗力 |
| 3.2 NMI缺失降低流感病毒感染后小鼠的肺部炎症反应 |
| 3.3 NMI缺失促进小鼠肺部I型干扰素和抗病毒ISG基因的表达 |
| 3.4 NMI缺失抑制流感病毒在小鼠肺部的复制 |
| 4.NMI抑制抗病毒天然免疫信号通路的活化 |
| 4.1 NMI抑制流感病毒诱导的ISRE和 NF-κB的活化 |
| 4.2 NMI负向调节天然免疫信号通路中IRF3、IRF7、NF-κB、P38和STAT的磷酸化水平 |
| 5.NMI通过NID1和NID2 结构域与IRF3及IRF7 相互作用 |
| 5.1 NMI与 IRF3和IRF7 相互作用 |
| 5.2 NMI通过NID1和NID2 结构域与IRF3及IRF7 结合 |
| 6.NMI促进IRF3和IRF7 的蛋白酶体途径的降解 |
| 7.NMI促进IRF3和IRF7的K48 位泛素化修饰 |
| 8.NMI通过招募E3 泛素连接酶TRIM21 催化IRF3和IRF7 的泛素化和降解 |
| 8.1 TRIM21 是与IRF3和IRF7 相互作用的E3 连接酶 |
| 8.2 NMI与 TRIM21 相互作用 |
| 8.3 TRIM21 降低IRF3和IRF7 蛋白水平 |
| 8.4 NMI依赖于TRIM21 促进IRF3和IRF7 泛素化和降解 |
| 四、讨论 |
| 五、总结 |
| 参考文献 |
| 综述 泛素化在抗病毒天然免疫反应中的作用 |
| (综述)参考文献 |
| 个人简历 |
四、甲型流感病毒诱导产生的IFN-α/β和IL-18可协同加强IFN-γ基因在人T细胞的表达（论文参考文献）
- [1]PCV2感染在PPV致病过程中的免疫调控作用及机制研究[D]. 武星辰. 西北农林科技大学, 2021
- [2]IL-6在流感病毒-肺炎链球菌共感染肺炎及肺炎链球菌肺炎继发脓毒症中的作用及机制研究[D]. 勾雪梅. 重庆医科大学, 2021(01)
- [3]结核分枝杆菌ESAT-6的免疫学特性及其在黏膜疫苗中的应用[D]. 宁唤唤. 西北大学, 2021(12)
- [4]转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用[D]. 涂丽裙. 吉林大学, 2020(03)
- [5]干扰素调节因子家族成员在流感病毒诱导的局部和全身炎症反应中的表达模式[D]. 五且昆·吐尔逊. 吉林大学, 2020(01)
- [6]TRIM32在抗细菌先天免疫调控中的功能和机制研究[D]. 欧阳譞. 军事科学院, 2020(02)
- [7]藏獒犬IFN-γ,IFN-α和IL-18基因克隆、表达及产物活性鉴定[D]. 宋世斌. 甘肃农业大学, 2020(01)
- [8]动物流感病毒跨种属感染树鼩致病特性及抗感染免疫研究[D]. 王启辉. 广西医科大学, 2020
- [9]朊蛋白在H7N7-IAV感染中的作用及机制研究[D]. 胡传霞. 华东师范大学, 2020(12)
- [10]N-Myc和STAT交互子在甲型流感病毒性肺炎的作用及调控机制[D]. 欧阳微. 浙江大学, 2020(01)