一、心肌细胞周期调控的研究进展（论文文献综述）
王正桂[1]（2021）在《CDK4/6抑制剂帕博西尼对糖尿病心肌病的保护作用及机制研究》文中研究说明背景:随着社会经济的发展,心血管疾病的发病率逐年攀升,已经成为全球需要共同面对的一个巨大的健康问题。糖尿病心肌病被定义为在糖尿病患者中观察到的心室功能障碍的疾病,与冠状动脉疾病,瓣膜疾病或高血压无关。如今,诊断糖尿病心肌病的标准包括左心室舒张功能障碍和/或左心室射血分数（LVEF）降低,病理性左心室肥大和间质纤维化。这种左心室重塑可能表现为偏心性扩张伴左心室收缩和舒张功能障碍。目前,糖尿病心肌病的发病机制较为复杂,尚不完全清楚,且缺乏特异的诊治方法。以高血糖导致的心肌能量代谢底物的改变、心肌细胞凋亡、微血管功能障碍、肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）激活、氧化应激激活、线粒体功能障碍和Ca2+离子信号调控异常等被认为是主流的发病机制。心肌细胞凋亡是糖尿病心肌病期间的重要病理事件,其可能导致心肌收缩功能障碍、心脏重塑并最终导致心力衰竭。此事件可由多种因素触发,例如氧化应激,炎症反应,内质网应激和晚期糖基化终产物（AGEs）。持续的高血糖会刺激氧化应激激活促使ROS生成,这可能导致乳酸脱氢酶（LDH）释放和丙二醛（MDA）含量升高,同时抑制抗氧化超氧化物歧化酶（SOD）,过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）表达,这些因素都与心肌细胞凋亡相关。此外,很少有方法可以缓解氧化应激触发的心肌细胞凋亡。因此,寻找有效的抗糖尿病心肌细胞凋亡药物具有重要意义。目的:明确CDK4和CDK6这两个重要的细胞周期调控因子在STZ糖尿病小鼠中的表达,并评估CDK4/6抑制剂Palbociclib对STZ糖尿病小鼠进行心脏功能、氧化损伤以及心肌细胞凋亡方面的影响,阐明CDK4/6抑制剂Palbociclib是否可以通过抑制病理条件下上调的细胞周期激酶起到治疗DCM的作用。方法:构建STZ糖尿病小鼠,利用超声心动图等方式分析CDK4/6激酶选择性抑制剂Palbociclib对小鼠心脏损伤的作用;利用酶学试剂盒检测氧化损伤;利用免疫组化和免疫印迹等手段检测细胞凋亡和炎症发生。并构建HG诱导的大鼠心肌成纤维细胞H9c2细胞模型,利用酶学试剂盒、流式细胞术、免疫印迹等手段探讨CDK4/6抑制剂Palbociclib在细胞凋亡和线粒体氧化应激的作用,并探讨Palbociclib抑制心肌细胞凋亡的相关机制。结果:本研究首次发现了细胞周期激酶CDK4和CDK6在STZ糖尿病小鼠心脏中的表达上调,提示其可能是针对糖尿病心肌病治疗的一个新靶点。通过运用CDK4/6激酶选择性抑制剂Palbociclib处理STZ糖尿病小鼠,我们发现这种新的靶向治疗方法能改善STZ糖尿病小鼠的心脏损伤,并降低小鼠心脏的氧化应激损伤,炎症反应。与二甲双胍等传统治疗方式不同,Palbociclib对血糖调节没有任何调节作用;治疗后,小鼠的体重也未见异常变化。然而Palbociclib对左室射血分数（LVEF）、缩短分数（FS）、二尖瓣流入流速早晚比（E/A）、左室舒张期内径（LVIDd）、左室收缩期内径（LVIDs）、室间隔厚度（IVS）、左室后壁厚度（LVPWd）及dp/dt max和dp/dt min这些心脏关键指标均有改善。通过动物以及细胞实验,我们发现CDK4/6抑制剂Palbociclib有效抑制心肌细胞的细胞凋亡,并探索了Palbociclib在糖尿病下心肌细胞中的抗凋亡作用机理。裂解的caspase-3和caspase-9表达在暴露于高糖（HG）的心肌细胞中显着增加,表明线粒体途径参与其中。有趣的是,Palbociclib显着抑制了裂解的caspase-3和caspase-9表达。由于Bcl-2蛋白是细胞凋亡的重要介质,对线粒体膜电位的稳定具有重要作用。我们发现在心肌细胞中,ROS的过量产生增加了Bax/Bcl-2比例,降低了线粒体膜电位,并进一步介导了caspase-3的表达。而Palbociclib通过分别上调抗凋亡蛋白Bcl-2和下调促凋亡蛋白Bax,恢复Bax/Bcl-2比例,并且稳定心肌细胞线粒体膜电位,最终抑制了高糖条件下的心肌细胞细胞凋亡。结论:由此,本文提出了细胞周期激酶CDK4和CDK6可能是糖尿病心肌病的潜在治疗靶点,并证明了Palbociclib通过使Rb信号级联失活来减弱高糖介导的心肌细胞凋亡。结合我们的动物实验结果,表明Palbociclib可能比通过常规的血糖调节更具有治疗糖尿病心肌病的潜力。为糖尿病心肌病的临床防治新策略提供理论及实验基础。
兰聪[2]（2021）在《孕激素通过调控YAP表达促进心肌细胞增殖及DYRK1A在调控成年心肌细胞增殖中的作用研究》文中研究说明第一部分孕激素通过调控YAP表达促进心肌细胞增殖及心脏损伤修复研究背景:急性心肌梗死作为临床上常见的危重症之一,是冠心病最重要的死亡原因。心肌细胞的大量丢失是导致心肌梗死后发生心力衰竭甚至患者死亡的根本原因。实现对心肌梗死的彻底治疗,最根本的策略是应用有收缩能力的细胞来代替坏死的心肌,即通过心肌再生彻底治疗心肌梗死,恢复心功能。大量研究证据显示,心肌细胞增殖是心肌再生的主要来源,但哺乳动物在出生后短期,心肌细胞退出细胞周期,基本丧失增殖能力,其调控机制尚不清楚。要实现有效的心肌再生,需进一步阐明心肌细胞增殖调控机制并寻找促进心肌细胞增殖的有效方法。哺乳动物的心肌细胞在胚胎期具有较强的再生能力,但出生后心肌细胞快速退出细胞周期,基本丧失增殖能力,其原因尚不清楚。在众多研究的努力下,心肌细胞增殖的分子调控机制的神秘面纱已经初步被揭开。包括细胞周期基因,转录因子,细胞外因子等在心肌细胞增殖中的调控作用均已得到证实,但调控心肌细胞增殖的上游因素仍然不清楚。由于哺乳动物出生时脱离母体内环境,人们自然将研究重点放在孕期内环境和出生后环境差异上。出生前后心脏的氧环境和负荷差异均是导致出生后心肌细胞增殖停滞的重要原因。另外,出生前后心脏所处的激素环境发生大幅改变,已经有研究证实出生后甲状腺激素水平的升高是造成出生后心肌增殖能力下降的重要因素之一。众多的激素中孕激素在出生后下降幅度最大,并且孕激素的促增殖能力已在神经元等细胞中得到证实,因此我们推测其可能与出生前后心肌增殖调控存在一定关系。目的:（1）明确孕激素对心肌细胞增殖的调控作用。（2）阐明孕激素调控心肌细胞增殖的分子机制。（3）探索孕激素对成年心肌细胞增殖及心肌梗死后心脏修复的改善作用。方法:第一部分（1）我们首先通过酶联免疫吸附法（ELISA）检测胚胎16天（E16）、出生后1天（P1）、P7、P14时小鼠血清孕激素浓度,同时通过免疫荧光染色检测E16、P1、P7、P14时小鼠心肌细胞Ki67及磷酸化组蛋白H3（PH3）阳性率以评估心肌细胞增殖能力,然后分析出生前后血清孕激素与心肌细胞增殖能力变化的相关性。（2）接下来我们给予新生小鼠每天腹腔注射孕激素（8mg/kg.d）,于P7及P14时检测心脏体重比（HW/BW）,通过免疫荧光染色染色检测心肌细胞Ki67及PH3阳性率,通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测心脏细胞周期基因表达,通过Langendorff灌流系统用酶消化法分离出心肌细胞以检测心肌细胞大小。（3）为了进一步证明孕激素对心肌细胞增殖的促进作用,我们提取并培养7天新生Sprague-Dawley（SD）大鼠心肌细胞,给予孕激素及孕激素受体拮抗剂RU486处理。通过免疫荧光染色染色检测心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率,通过qRT-PCR检测心脏细胞周期基因表达。第二部分（1）为了明确孕激素对心肌细胞周期的调控及筛选介导孕激素促心肌细胞增殖效应的关键基因,我们应用孕激素处理培养的原代P7 SD大鼠心肌细胞后进行转录组测序。（2）根据基因表达变化初步筛选孕激素调控心肌细胞增殖的可能中间靶分子,并通过qRT-PCR和Western blot实验对其表达进行验证后,进一步筛选出可能的关键靶分子。（3）分离培养P7 SD大鼠心肌细胞,针对靶分子设计小干扰RNA（siRNA）并转染心肌细胞以沉默靶分子的表达,通过免疫荧光染色检测心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率以明确靶分子在孕激素促心肌细胞增殖中的作用。（4）我们构建了靶基因启动子-荧光素酶报告基因质粒并转染培养的心肌细胞,然后检测荧光素酶的活性以明确孕激素对靶基因启动子活性的影响;通过凝胶迁移阻滞（EMSA）实验检测孕激素受体与靶基因启动子的相互作用,同时通过染色质免疫共沉淀及荧光定量PCR（Ch IP-qPCR）实验检测孕激素受体在靶基因启动子区的富集度。第三部分（1）为了在体明确孕激素对成年心肌细胞增殖的影响,我们结扎小鼠冠状动脉前降支构建急性心肌梗死（AMI）模型,术后从P2开始经腹腔给予孕激素注射,于P7时通过制作心脏石蜡切片并通过免疫荧光染色检测梗死边缘区心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率,同时通过Langendorff灌流系统用酶消化法分离出心肌细胞后qRT-PCR检测细胞周期基因的表达。（2）心肌梗死后于P28利用小动物超声系统检测小鼠心功能,明确孕激素对心肌梗死后心功能的改善;同时P35时通过马松三色染色（Masson trichrome staining）检测心脏纤维化,明确孕激素对心肌梗死后心脏重构的保护作用。（3）为明确孕激素是否在成年心肌细胞依然促进靶基因的表达,心肌梗死后P7时通过Langendorff灌流系统用酶消化法分离出心肌细胞后进行qRT-PCR及Western blot检测孕激素对心肌梗死后靶基因表达的影响。结果:第一部分（1）心肌细胞Ki67及PH3阳性率从E16、P1、P7、P14依次降低,同时小鼠血清孕激素水平从E16、P1、P7、P14依次降低,二者的变化存在相关性。（2）于P7及P14时免疫荧光染色发现孕激素提高新生小鼠心肌细胞Ki67及PH3阳性率并促进细胞周期基因表达;孕激素对HW/BW无影响,但其处理后心肌细胞体积小于对照组。（3）孕激素提高原代P7 SD大鼠心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率,同时这种作用被RU486阻断;孕激素促进原代P7 SD大鼠心肌细胞细胞周期基因表达,同时这种作用被RU486阻断。第二部分（1）转录组测序结果显示孕激素处理后,分别有2240个基因及2736个基因表达上下调超过1.4倍。基因本体分析（Gene Ontology,GO）及京都基因与基因组百科全书通路分析（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路分析显示与细胞增殖相关分子功能和信号通路出现大量上调基因富集。（2）我们根据基因表达变化初步筛选出4个介导孕激素调控心肌细胞增殖的可能中间靶分子,并通过qRT-PCR和Western blot实验对其表达进行验证后进一步筛选出上调幅度最大的yes相关蛋白（yes-associated protein,YAP）作为靶分子;同时通过YAP siRNA沉默YAP表达后,孕激素对原代P7 SD大鼠心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率的上调作用受到阻断。（3）荧光素酶报告基因实验表明孕激素处理后,心肌细胞荧光素酶活性升高,提示孕激素可以促进YAP基因启动子的转录活性;同时EMSA实验发现孕激素受体与YAP基因启动子存在相互作用,而Ch IP-PCR实验进一步显示孕激素受体在YAP基因启动子区存在富集,且孕激素存在时孕激素受体在YAP基因启动子区的富集增多。第三部分（1）通过结扎冠状动脉前降支,我们建立了小鼠急性心肌梗死模型。构建这一模型后于P7检测心肌心肌细胞增殖,我们发现孕激素可以显着提高梗死边缘区心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率,同时促进心肌细胞细胞周期基因表达。（2）心肌梗死后P28小动物超声结果显示孕激素处理后小鼠左心室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）及左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening,LVFS）均明显高于对照组小鼠;同时P35时马松三色染色结果提示孕激素处理组小鼠心脏左心室纤维化面积比低于对照组。（3）心肌梗死后P7时通过Langendorff灌流系统用酶消化法分离出心肌细胞后qRT-PCR及Western blot检测结果显示孕激素促进心肌梗死后心肌细胞YAP基因表达。结论:通过以上研究,我们得出以下结论。（1）胚胎期和出生后不同时期血清孕激素和心肌细胞增殖能力的变化存在相关性。（2）出生后补充孕激素可促进新生小鼠心肌细胞增殖,同时孕激素可以促进离体培养的原代P7 SD大鼠心肌细胞增殖。（3）孕激素对心肌细胞增殖的促进作用主要是孕激素受体在孕激素存在时,结合于YAP基因启动子区进而促进YAP基因转录实现的。（4）孕激素可以刺激成年心肌梗死后心肌细胞增殖并改善心功能和心脏纤维化。这一研究揭示了孕激素在心肌细胞增殖中的作用及机制,为心肌再生治疗心肌梗死提供了新的理论依据和靶点。第二部分DYRK1A在调控成年心肌细胞增殖中作用研究研究背景:心肌细胞丢失是心肌梗死后心衰发生的重要病理学基础,成年心肌细胞微弱的增殖能力为心脏损伤修复提供了希望。探索成年心肌细胞增殖的关键调控因子,对促进成年心肌增殖,改善心肌梗死的治疗具有重要意义。双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A（DYRK1A）是一种在进化上高度保守的激酶,在调控细胞增殖、分化和存活等功能中发挥重要作用。既往研究证据表明,抑制DYRK1A可以抑制多种类型的肿瘤细胞增殖,发挥抗肿瘤作用。同时DYRK1A对胰岛β细胞增殖也有强烈的调控作用,抑制DYRK1A可显着促进胰岛β细胞增殖,改善糖尿病的治疗。鉴于肿瘤细胞和胰岛β细胞均是难以调控增殖的细胞,提示DYRK1A可能是细胞增殖的强力调控因子。因此,我们推测DYRK1A可能对成年心肌细胞增殖具有调控作用。目的:（1）明确DYRK1A对成年心肌细胞增殖的调控作用。（2）探索DYRK1A调控心肌细胞增殖对心肌梗死后心脏修复的改善作用。方法:（1）通过Crispr-cas9系统,我们成功构建了能够条件性敲除DYRK1A的floxP小鼠(DYRK1Aflox/flox),通过将该小鼠与心肌细胞特性表达Cre重组酶的转基因小鼠(α-MHCMerCreMe)杂交,获得了α-MHCMerCreMer/DYRK1Aflox/flox小鼠,通过腹腔注射他莫昔芬诱导成年小鼠心肌DYRK1A敲除（DYRK1A CKO）,通过Western blot实验检验DYRK1A的敲除效率。（2）为了研究DYRK1A敲除对成年心肌细胞增殖的影响,我们结扎小鼠冠状动脉前降支构建急性心肌梗死（AMI）模型,于心肌梗死后7天（P7）时通过制作心脏石蜡切片并通过免疫荧光染色检测梗死边缘区心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率。（3）心肌梗死前一天及梗死后每周利用小动物超声系统检测小鼠心功能,明确DYRK1A敲除对心肌梗死后心功能的改善作用;同时P35时通过马松三色染色（Masson trichrome staining）检测心脏纤维化,明确DYRK1A敲除对心肌梗死后心脏重构的保护作用。结果:（1）接受他莫昔芬腹腔注射的α-MHCMer Cre Mer/DYRK1Aflox/flox小鼠心脏DYRK1A蛋白表达显着低于对照组。（2）免疫荧光染色发现DYRK1A敲除显着提高了梗死边缘区心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率。（3）小动物超声结果显示DYRK1A敲除组小鼠左心室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）及左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening,LVFS）均明显高于对照组小鼠;同时P35时马松三色染色结果提示DYRK1A敲除组小鼠心脏左心室纤维化面积低于对照组。结论:通过以上研究,我们得出以下结论。（1）DYRK1A是成年心肌细胞增殖的重要调控因子,通过敲除DYRK1A可显着促进成年心肌梗死后心肌细胞增殖。（2）DYRK1A敲除可通过促进成年心肌细胞增殖改善心肌梗死后心功能和心脏纤维化。这一研究揭示了DYRK1A在成年心肌细胞增殖中的作用,为心肌再生治疗心肌梗死提供了新的理论依据和靶点。
付文斌,王伟,曾春雨[3]（2022）在《心肌细胞增殖影响因素和评价方法》文中提出大量心肌细胞丢失是心肌梗死后进展为心力衰竭和临床死亡的主要原因.近年来的研究证明,成年哺乳动物心肌具有一定的再生能力,但该能力十分有限而不足以修复受损的心脏组织,因此促进内源性心肌再生是未来治疗心肌梗死的重要方向.原有心肌细胞的增殖是内源性心肌再生的主要来源,因而探索心肌细胞增殖的调控机制,寻找促进心肌细胞增殖的干预措施成为心肌再生研究领域的热点,并取得显着进展.同时,成年心肌细胞具有可多倍体化、多核化但难以胞质分裂等特点,导致评估心肌增殖的方法成为难题,精确量化心肌增殖的各种模型和体系不断被开发.本文回顾总结了心肌再生的基本方式、心肌细胞增殖影响因素和评估方法,探讨了当前内源性心肌再生研究领域的进展和挑战.
高嘉宇[4]（2020）在《miR-4755-5p靶向调控Cyclin D1在氟致成骨细胞增殖活化中的作用研究》文中研究表明目的:地方性氟中毒在许多国家仍然是一个主要的公共卫生问题。氟可引起异常成骨细胞增殖和活化,导致氟骨症。然而其详细的分子机制尚不清楚。本研究在既往发现细胞周期调控关键分子Cyclin D1高表达参与氟骨症成骨细胞增殖活跃基础上,开展了燃煤污染型氟暴露人群和体外实验研究,探讨miR-4755-5p通过靶向调控Cyclin D1在氟骨症成骨细胞增殖活化中的作用。本研究旨在探讨micro RNA（miRNA）在氟骨症发病机制中的作用,为最终应用miRNA治疗氟骨症提供科学依据。方法:1.依据地方性氟中毒病区划分标准（GB 17018-2011）,选择贵州省燃煤污染型氟中毒病区织金县荷花村为调查点,非氟中毒地区安顺市双堡镇张官村作为对照点。依据纳入排除标准,追踪既往调查对象共248人。在知情同意原则下收集调查对象血样及尿样。采用国家标准氟离子选择电极法测定尿氟（UF）含量,并根据所测得的UF浓度,将调查对象分为3组:（1）UF<1.96 mg/g Cr组,117例;（2）1.96 mg/g Cr≤UF<3.92 mg/g Cr组,65例;（3）UF>3.92mg/g Cr组,66例。分别采用微量酶标法和酶联免疫吸附法（ELISA）检测碱性磷酸酶（ALP）活性和骨钙素（BGP）含量。使用miRWalk 3.0数据库（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de）的四种不同算法（包括miRwalk、miRDB、miRTar Base和Target Scan）预测靶向Cyclin D1的miRNA。在课题组前期miRNA-seq分析基础上,基于以下三个标准选择候选miRNA:miRNA测序结果中下调且差异表达的miRNA（P≤0.05 and|log2FC|≥1）;预测的结果至少为两种算法的交集;结合位点为3’UTR。采用实时荧光定量PCR（q RT-PCR）在248例调查对象中验证miR-4755-5p的表达;q RT-PCR检测Cyclin D1 m RNA表达;ELISA法检测Cyclin D1蛋白表达。2.收集骨科外伤手术健康人髂骨或股骨松质骨,采用酶消法分离人原代成骨细胞,通过细胞形态学观察、碱性磷酸酶及茜素红染色鉴定人原代成骨细胞。以0、200、400、600、800、1000、1200、1400及1600μmol/L氟化钠（Na F）处理人成骨细胞24、48、72及96h,CCK-8法检测染氟人成骨细胞代谢活力;并根据CCK-8实验结果选择以0、600、1200μmol/L Na F处理人成骨细胞72h进行后续试验,流式细胞术检测细胞周期分布;微量酶标法和ELISA法检测ALP活性和BGP含量;q RT-PCR检测miR-4755-5p表达;q RT-PCR检测Cyclin D1 m RNA表达;蛋白印迹法（Western-blotting）检测Cyclin D1蛋白表达。3.采用双荧光素酶报告基因检测验证miR-4755-5p与Cyclin D1的靶向结合。采用miR-4755-5p mimic和mimic NC转染人成骨细胞24h,q RT-PCR检测转染后miR-4755-5p表达,确定转染成功后,进一步用1200μmol/L Na F处理人成骨细胞72 h,q RT-PCR检测miR-4755-5p表达;q RT-PCR检测Cyclin D1m RNA表达;Western-blotting检测Cyclin D1蛋白表达;CCK-8法检测细胞代谢活力;流式细胞术检测细胞周期分布;微量酶标法和ELISA法检测ALP活性和BGP含量。结果:1.在燃煤型氟暴露人群中,与低UF组比较,高UF组ALP活力和BGP含量增加,差异有统计学意义（P均<0.05）,表明,在氟暴露人群中观察到了氟暴露诱导的成骨细胞活化。基于课题组前期miRNA-seq结果和筛选标准,利用生物信息学软件在下调的miRNAs中筛选获得靶向Cyclin D1的miR-4755-5p。结果显示,与低UF组比较,高UF组miR-4755-5p表达逐渐降低（P<0.05）,Cyclin D1基因m RNA转录及蛋白表达逐渐增加（P均<0.05）。同时,miR-4755-5p与Cyclin D1表达呈负相关(r蛋白=-0.72,P<0.05;rm RNA=-0.373,P<0.05),提示miR-4755-5p可能参与Cyclin D1的上调。2.随着染氟剂量的增加,人成骨细胞增殖指数（PI）、ALP活力及BGP含量逐渐升高（P均<0.05）,表明Na F处理可致成骨细胞的异常增殖和活化。同时,随Na F剂量的增加,miR-4755-5p表达逐渐降低（P<0.05）,Cyclin D1基因m RNA转录及蛋白表达逐渐增加（P均<0.05）,表明Na F可抑制人成骨细胞miR-4755-5p的表达,上调Cyclin D1的表达,此结果与前期的人群研究结果相一致。3.双荧光素酶报告基因实验表明miR-4755-5p通过靶向Cyclin D1的3’-UTR调控Cyclin D1的表达。成骨细胞转染miR-4755-5p mimic后miR-4755-5p的表达较对照组增加（P<0.05）,表明转染是成功的。与单纯Na F处理的成骨细胞相比,转染miR-4755-5p mimic后的Na F处理成骨细胞中,miR-4755-5p的表达增加（P<0.05）,Cyclin D1蛋白表达降低（P<0.05）,但Cyclin D1 m RNA表达无明显变化（P>0.05）,表明在Na F作用下,过表达miR-4755-5p后下调了成骨细胞Cyclin D1蛋白表达,明确了miR-4755-5p对Cyclin D1表达的调控。同时miR-4755-5p过表达后,人成骨细胞增殖指数（PI）、ALP活力及BGP含量降低（P均<0.05）。以上结果表明,在Na F作用下,过表达miR-4755-5p降低人成骨细胞中Cyclin D1蛋白表达后,可进一步抑制其细胞增殖和活化。但本研究未观察到miR-4755-5p过表达对Cyclin D1 m RNA的影响,表明miR-4755-5p可能通过抑制Cyclin D1蛋白的翻译而不是m RNA的降解来调控Cyclin D1的表达。结论:1.氟暴露可诱导miR-4755-5p低表达。2.低表达的miR-4755-5p通过上调Cyclin D1促进氟诱导的成骨细胞增殖活化。3.miR-4755-5p直接结合于Cyclin D1的3’-UTR影响其蛋白表达。
王嘉馨[5]（2020）在《基于网络药理学探讨芪苈强心胶囊治疗糖尿病性心肌病的分子机制》文中提出目的:随着糖尿病（diabetes mellitus,DM）患病人数逐年增长,糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy,DCM）患者也在逐年增加,分子机制尚未阐明。因此,本课题利用H9c2心肌细胞建立DCM体外模型,结合转录组测序（RNA-seq）技术及生物信息学分析,以期揭示DCM的发病机制。此外,对于中医药治疗DCM潜在作用机制,相关研究涉及较少,已有研究也多为复方制剂,单药有效成分的研究相对偏少,无法明确作用靶点。临床试验研究结果显示,芪苈强心胶囊对DCM心功能不全及预后具有明显改善作用。因此,我们基于网络药理学及文献调研对芪苈强心胶囊功效化合物进行筛选,并获取各成分对应靶点,进一步与RNA-seq结果进行整合分析,寻找药物作用靶点与疾病靶点一致的化合物,并通过生物实验对药物功效进行验证。本课题探究了 DCM发病机制,以及芪苈强心胶囊活性成分对DCM的改善作用及相关机制,为芪苈强心胶囊治疗DCM提供理论和数据支持,推动中草药用于治疗DCM的进程。方法:（1）利用高糖（（highglucose,HG）含33 mmol·L-1葡萄糖的DMEM培养基）培养H9c2细胞构建体外DCM模型,运用RNA-seq技术获得差异表达基因（differential genes,DGEs）,并对这些基因进行 GO（Gene Ontology）富集及 KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析,预测DGEs的功能及与DCM发生相关的关键通路。（2）通过检索中药系统药理数据分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP）和查阅文献,筛选芪苈强心胶囊主要化合物成分,并整合各成分对应靶点,使用DAVID数据库对靶点进行KEGG富集分析,进一步与RNA-seq结果进行整合分析。通过分析得到芪苈强心胶囊中主要功效成分。（3）利用HG培养H9c2细胞构建DCM体外模型。CCK-8法测定HG、丹参酮ⅡA（Tanshinone ⅡA,TanⅡA）对细胞活力的影响;流式细胞术检测HG及药物干预后H9c2细胞周期变化情况。进一步通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）法检测周期相关mRNA的表达。结果:RNA-seq分析结果显示,HG组与对照组差异基因数1416个,其中上调基因数为546个,下调基因数为870个。KEGG生物通路富集结果显示,DGEs在核糖体（Ribosome）、细胞周期（Cell cycle）等通路中被富集。KEGG富集分类结果显示,DGEs在细胞生长与死亡（Cell growth and death）、运输和分解代谢（Transportand catabolism）等中被富集。GO富集分析结果显示,差异基因可能是通过参与细胞进程（Cellularprocess）等生物过程发挥作用。这些结果表明,DCM细胞的生长与死亡进程发生改变。网络药理学分析筛选出芪苈强心胶囊化合物230个,文献调研共获得入血成分56个,对二者进行整合,获得5个具有显着活性的药物（海帕乌头碱、槲皮素、丹参酮ⅡA、隐丹参酮、芒柄花黄素）,其中槲皮素对应靶点154个,丹参酮ⅡA对应靶点41个,隐丹参酮对应靶点30个,芒柄花黄素对应靶点23个。对各单体成分靶点与RNA-seq差异基因进行比对分析,获得Tan ⅡA是芪苈强心胶囊中能够调控细胞周期通路的主要有效成分之一。通过生物实验验证Tan ⅡA对HG培养导致的大鼠H9c2细胞损伤的保护作用。研究结果提示,Tan ⅡA对HG培养导致的H9c2细胞损伤具有显着的保护作用。此外,Tan ⅡA可能是通过调控细胞周期通路来发挥这一作用。结论:本研究提供了 DCM体外模型的转录组数据,DGEs功能分析提示HG会影响细胞生长与死亡,进而影响细胞周期。网络药理学分析表明,芪苈强心胶囊中功效成分丹参酮ⅡA可能通过调控细胞周期相关mRNA的表达,从而改善HG诱导的细胞损伤。生物学实验结果显示,Tan ⅡA对能够通过上/下调细胞周期相关基因的表达,改善HG引起的细胞周期阻滞。
刘岩松[6]（2020）在《基于SIRT1信号通路探讨舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠的保护作用和机制》文中研究说明目的:院内制剂舒心生脉丹,是三十多年临床经验总结得出的经验方,在治疗冠心病为代表的心血管疾病方面疗效确切。为进一步探讨其作用机制,本课题通过病理学、分子生物学等分析方法,探索其对心肌细胞的保护机制,探讨其与细胞凋亡相关性,运用实验数据评价舒心生脉丹的疗效,为舒心生脉丹新药研发提供数据支持,为中医治疗心血管疾病的临床药物应用以及疾病治疗提供有价值的理论依据。方法:1.将70只健康SPF级SD雌性大鼠随机分成7组:空白组、假手术组、阳性对照组（复方丹参滴丸）、模型组、舒心生脉丹低剂量组、舒心生脉丹中剂量组、舒心生脉丹高剂量组。2.中药预处理:适应性饲养5天后,分组给药。给药剂量:根据动物与人之间药物等效剂量换算系数表计算,舒心生脉丹中剂量组为健康成年人1日用量,舒心生脉丹高剂量组与舒心生脉丹低剂量组分别为2倍剂量与0.5倍剂量,对照组复方丹参滴丸按照健康成年人1日用量给药。预给药7天,每日给药1次,空白组、假手术组、模型组给予蒸馏水。7天后禁食进行造模,空白组不做处理,假手术组只进行穿线,不予结扎。其余各组行左冠状动脉前降支结扎30min,再灌注120min,制备心肌缺血再灌注损伤大鼠模型。造模成功取心脏组织。3.监测并记录缺血/再灌注过程中心电图、血流动力学的改变,分析舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠心功能的影响。4.通过HE染色和透射电镜观察MI/RI大鼠心肌组织及超微结构,分析舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠心肌组织及超微结构的干预效果。5.分别采用qRT-PCR法、Western blot法、IHC法检测中药舒心生脉丹对SIRT1信号通路相关因子SIRT1、p53、ac-p53、Bax、Bcl-2、Capase-3、Capase-9的mRNA及蛋白的表达量影响。分析舒心生脉丹对MI/RI大鼠心肌组织SIRT1/p53信号通路上相关因子的调控。结果:1.心电图:各组大鼠在造模成功后心电图均有明显ST段改变,肢体导联出现ST段抬高,并有出现T波倒置改变;再灌注30min后各组大鼠心电图提示ST段不同程度回落改变,提示MI/RI大鼠造模成功。2.血流动力学:与模型组相比,舒心生脉丹各剂量治疗组及阳性对照组大鼠血流动力学指标均有不同程度的改善,舒心生脉丹组改善更为明显。3.HE染色:MI/RI模型组大鼠心肌组织结构欠完整,形态排列紊乱,细胞间质水肿明显,细胞核出现固缩。与模型组相比,中药舒心生脉丹各治疗组结构相对完整,形态排列较规则,层次较清晰,细胞间质水肿程度较模型组减轻,细胞核固缩减少。其中舒心生脉丹高剂量组改善最明显。4.电镜观察:模型组肌纤维排列不整齐,线粒体肿胀,排列呈不规则形态,部分线粒体嵴不完整,出现空泡。中药舒心生脉丹各剂量治疗组及阳性药组线粒体可见轻度肿胀变形,多数结构完整,肌纤维排列大致整齐,程度较模型组减轻。5.qRT-PCR法检测MI/RI大鼠心肌组织中SIRT1、Bcl-2、Bax、Caspase-9的基因表达量:与模型组相比,舒心生脉丹能上调SIRT1、Bcl-2的基因表达量,差异具有统计学意义（P<0.05）,降低Bax、Caspase-9基因表达量,差异具有统计学意义（P<0.05）。Western blot法检测MI/RI大鼠心肌组织中SIRT1、Caspase-9、p53、ac-p53的蛋白表达量:与模型组相比,舒心生脉丹能够上调MI/RI模型大鼠心肌细胞中SIRT1的蛋白表达量,差异具有统计学意义（P<0.05）,下调Caspase-9、p53、ac-p53的蛋白表达量,差异具有统计学意义（P<0.05）。IHC检测提示舒心生脉丹能够上调SIRT1的蛋白表达,降低p53、Caspase-3、Caspase-9的蛋白表达。结论:1.舒心生脉丹对能改善大鼠MI/RI后的心功能和心肌超微结构,对心肌细胞具有保护作用。2.舒心生脉丹能调控MI/RI模型大鼠心肌细胞中SIRT1、p53、ac-p53、Bax、Bcl-2、Capase-3、Capase-9的mRNA及蛋白的表达量,减少细胞凋亡的发生,其保护作用与细胞凋亡机制相关。
谢金凤[7]（2020）在《运动通过IGF-1/PI3K/Akt/mTOR信号通路激活延缓衰老大鼠心肌细胞凋亡的机制》文中进行了进一步梳理目的:以自然饲养的老年SPF级Wistar大鼠为模型,用耐力运动和抗阻运动干预12周,探索不同运动类型干预对衰老大鼠心肌细胞自噬、凋亡和细胞周期调控信号通路的作用与机制,为运动干预老年心血管疾病的预防和康复提供参考或依据。方法:取30只6月龄的雄性大鼠,饲养至21月龄以建立自然衰老大鼠模型,随机分为老年对照组（Old control group,OC组）、老年耐力运动组（Old endurance exercise group,OE组）和老年抗阻运动组（Old resistance exercise group,OR组）,每组10只;两种运动干预周期均为12周,其中OE组:给予大鼠10°坡度跑台耐力运动训练,5天/周,45 min/天（跑速为15 m/min）;OR组:给予大鼠尾部负重爬梯抗阻训练,5天/周,2组/次,每组重复3次,组内休息1 min,组间休息2 min。末次运动干预24小时后,取心肌组织样本,HE染色观察大鼠心肌形态学变化,TUNEL染色考察心肌细胞凋亡情况。Western Blot用于检测大鼠心肌细胞中相关蛋白的表达情况。另取同品系6月龄大鼠8只,作为青年对照组（Youth control group,YC组）。结果:1.HE染色:与YC组相比,OC组大鼠心肌细胞排列紊乱,细胞边界不清晰,心肌间质细胞明显增多。OE组与OR组大鼠的心肌细胞相对于OC组大鼠排列更加有序、细胞的边界相对明显、心肌间质细胞也有所减少。2.TUNEL染色:与YC组相比,OC组大鼠心肌中阳性细胞数极显着性增多（p<0.001）;与OC组相比,OE组与OR组大鼠心肌中阳性细胞凋亡率极大地降低（p<0.001）,运动组之间的比较,OR组大鼠心肌中阳性细胞数较OE组大鼠明显减少（p<0.05）。3.IGF-1R/PI3K/Akt/mTOR蛋白表达水平:与YC组相比,OC组大鼠心肌的IGF-1R、PI3K和p-Akt/Akt,显示老年大鼠心肌激活IGF-1/PI3K/Akt/mTOR信号通路水平低于青年组。然而与OC组相比,OE组大鼠心肌的IGF-1R和PI3K的表达量极显着性上调（p<0.001）、p-Akt/Akt表达量极显着性下调（p<0.001）,p-mTOR/mTOR的表达量显着性下调（p<0.05）;同时,与OC组相比,OR组大鼠心肌的IGF-1R和PI3K的表达量极显着性上调（p<0.001）,p-Akt/Akt表达量极显着性上调（p<0.001）。最后相比OE组,OR组大鼠心肌的IGF-1R表达量非常显着性下调（p<0.01）,PI3K的表达量显着性上调（p<0.05）,p-Akt/Akt表达量极显着性上调（p<0.001）,结果说明耐力运动与抗阻运动都可改善老年大鼠心肌IGF-1/PI3K/Akt/mTOR信号通路水平的低下,而且对比两种运动,耐运动较抗阻运动激活IGF-1R/PI3K/Akt/mTOR信号通路水平比较大。4.自噬相关蛋白表达水平:与YC组相比,OC组大鼠心肌LC3-II/LC-I的比值极显着性下降（p<0.001）,p62表达量极显着性上升（p<0.001）,显示老年大鼠心肌的自噬水平低于青年组。然而与OC组相比,OE组大鼠心肌LC3-II/LC-I的比值极显着性增加（p<0.001）,p62表达量显着性减少（p<0.05）;同时,与OC组相比,OR组大鼠心肌LC3-II/LC3-I比值非常显着性增加（p<0.01）。最后与OE组相比,OR组大鼠心肌LC3-II/LC3-I比值非常显着性下降（p<0.01）,p62表达量非常显着性上升（p<0.01）,结果说明耐力运动与抗阻运动都能改善老年大鼠心肌自噬水平低下的状态,但对比两种运动,耐力运动激活自噬水平的能力强于抗阻运动。5.凋亡相关蛋白表达水平:与YC组相比,OC组大鼠心肌的Bcl-2表达量极显着性下降（p<0.001）,Bax、Caspase-9和Cleaved-Caspase-3的表达量都极显着性上升（p<0.001）,FasL的表达量显着性上升（p<0.05）,Caspase-8的表达量极显着性上升（p<0.001）,显示老年大鼠心肌的抗凋亡能力低于青年组,而老年大鼠心肌的内源性与外源凋亡水平明显高于青年组。然而与OC组相比,OE组大鼠心肌的Bcl-2表达量极显着性增加（p<0.001）,Bax的表达量显着性下降（p<0.05）,FasL和Caspase-8表达量极显着性下降（p<0.001）,Cleaved-Caspase-3的表达量非常显着性下降（p<0.01）;OR组大鼠心肌的Bcl-2表达量显着性增加（p<0.05）,Caspase-9的表达量极显着性下降（p<0.001）,FasL、Caspase-8和Cleaved-Caspase-3表达量极显着性下降（p<0.001）。对比OE组与OR组,OE组大鼠心肌的Bcl-2表达量显着性增多（p<0.05）,Caspase-9和Caspase-8的表达量极显着性增多（p<0.001）,结果说明耐力运动与抗阻运动都能降低老年大鼠心肌凋亡水平,提高抗凋亡能力,结合TUNEL染色凋亡率对比两种运动,抗阻运动的抗凋亡能力强于耐力运动。6.细胞周期相关蛋白表达水平:与YC组相比,OC组大鼠心肌的CyclinD1、CDK4和p-Rb/Rb的表达量极显着性下降（p<0.001）,p21的表达量极显着性上升（p<0.001）,显示老年大鼠心肌周期调控能力低于青年组。然而与OC组相比,OE组大鼠心肌的CyclinD1的表达量极显着性上调（p<0.001）,CDK4的表达量非常显着性上调（p<0.01）,p21的表达量极显着性下调（p<0.001）,p-Rb/Rb的表达量极显着性上调（p<0.001）。同时,与OC组相比,OR组大鼠心肌的CDK4的表达量极显着性上调（p<0.001）,p21的表达量极显着性上调（p<0.001）,p-Rb/Rb的表达量极显着性上调（p<0.001）。最后相比OE组,OR组大鼠心肌的CyclinD1的表达量极显着性下调（p<0.001）,p21的表达量极显着性上调（p<0.001）,p-Rb/Rb的表达量极显着性上调（p<0.001）,结果说明耐力运动与抗阻运动都可提高老年大鼠心肌周期调控能力,对比两种运动,抗阻运动调控老年大鼠心肌周期调控能力也强于耐力运动。结论:运动通过促进IGF-1/PI3K/Akt/mTOR信号通路激活自噬和细胞进程、以抑制凋亡机制,改善老年大鼠心肌细胞紊乱形态及不规整细胞排列,降低老年大鼠心肌细胞的凋亡。
张辰[8]（2020）在《有机氯农药五氯硝基苯诱导心脏毒性的分子机制研究》文中认为在心脏发育过程中,心肌细胞增殖对心室壁形态发生和心肌致密化过程起到了关键作用,心肌细胞增殖异常与心肌致密化不全的发生密切相关。有机氯农药五氯硝基苯（Pentachloronitrobenzene,PCNB）是一种农业生产中广泛使用的土地杀菌剂,在生态系统中具有较强的生物富集性,给农作物生产和食品安全带来了严重的隐患。本研究基于前期工作基础进一步探究了 PCNB影响心肌细胞增殖以及诱导心脏发育毒性的机制。我们对E8.5天的孕鼠（C57BL/6N）分别进行玉米油和PCNB连续灌胃给药,对E14.5和E17.5胎鼠心脏组织进行病理学检测。HE染色结果显示PCNB处理没有引起明显的心脏发育结构缺损,而对心室小梁区和心肌致密层区域厚度进行测定发现,PCNB孕期暴露引起胎鼠心脏组织左右心室过度小梁化,致密层区变薄,心室非致密化比例显着升高,表现出心室致密化不全样病理表型。为了探究PCNB引起心肌致密化不全的可能机制,我们对心脏组织及心肌细胞的增殖和凋亡情况进行检测。免疫荧光染色检测结果显示PCNB处理引起胎鼠心室壁致密层区心肌细胞周期标志物Ki67和有丝分裂标志物磷酸化组蛋白H3（pH3）水平降低,TUNEL染色结果显示PCNB处理没有诱导明显的胎鼠心肌细胞凋亡,表明PCNB主要诱导胎鼠心肌细胞有丝分裂异常,抑制增殖。进一步我们利用体外心肌细胞探究了 PCNB的毒性效应,分别用不同浓度PCNB处理大鼠心肌细胞H9c2,EdU染色发现PCNB剂量依赖性抑制心肌细胞增殖,pH3免疫荧光染色显示PCNB抑制体外心肌细胞有丝分裂,而流式检测表明PCNB没有诱导细胞发生明显的凋亡现象。这些结果表明PCNB可能通过诱导胎鼠心肌细胞有丝分裂异常,抑制细胞增殖活性而引起心室致密化不全。为了探索PCNB诱导心室致密化不全表型的分子机制,对照组和PCNB处理组E17.5胎鼠心脏组织进行RNA-seq分析,结果显示PCNB处理导致心脏组织内97个基因上调,92个基因下调。GO分析结果表明差异表达基因主要与细胞有丝分裂、染色体分离以及动粒和微管结合相关。差异表达基因互作网络分析表明动粒核心组分（包括NDC80复合物成员Hec1、Nuf2、Spc25）以及动粒微管互作调控因子位于差异表达基因互作网络的中心位置,候选基因RT-PCR分析也验证转录组测序结果。作为有丝分裂过程的核心事件,染色体的正确排列与分离由动粒和纺锤体微管的动态相互作用协调实现,其中Hec1构成动粒上核心的微管结合位点,在染色体分离中发挥核心作用。我们初步候选Hec1作为PCNB作用的关键靶分子进行进一步探究。免疫组化检测结果显示Hec1在胎鼠心脏组织内整体均有分布,在心肌细胞增殖活性较高的心室壁致密层区高表达。PCNB处理下调心脏组织内Hec1的mRNA和蛋白水平。对心脏组织切片HE染色进行观测发现PCNB处理引起细胞核型异常比例显着增加,对纺锤体标志物β-tubulin免疫荧光染色发现PCNB引起心脏组织内细胞有丝分裂过程纺锤体形态和染色体分离异常。体外心肌细胞实验结果表明,PCNB处理下调Hec1的表达,诱导心肌细胞纺锤体的形态和染色体排列、分离异常,干扰细胞有丝分裂,抑制细胞增殖活性。细胞免疫荧光染色结果显示,心肌细胞内源性Hec1主要表达分布于有丝分裂期细胞动粒内。利用siRNA敲低Hec1抑制心肌细胞增殖和有丝分裂,导致单极和多极纺锤体比例显着增加,而正常的双极纺锤体比例明显降低,加剧了 PCNB对心肌细胞增殖和有丝分裂的抑制作用,心肌细胞内过表达Hec1能够显着抑制 PCNB引起的心肌细胞纺锤体形态异常以及细胞增殖和有丝分裂活性的降低。这些研究结果提示PCNB抑制心肌细胞增殖和有丝分裂可能因为下调Hec1的表达,影响动粒与纺锤体微管的相互结合。本研究结果表明PCNB暴露抑制心肌细胞增殖,引起胎鼠心肌致密化不全样表型,其作用机制可能与PCNB下调NDC80复合物组分Hec1等动粒相关蛋白的表达,诱导心肌细胞有丝分裂过程纺锤体形态和染色体分离异常,导致有丝分裂阻滞有关。
孔繁达[9]（2020）在《补肾活血方调控Wnt/β-catenin通路抑制心梗后心室重构治疗慢性心衰机制研究》文中提出目的:本研究通过建立心梗后心衰模型,在“心肾相关”理论指导下应用补肾活血方治疗心衰大鼠,观察补肾活血方对大鼠实验疗效,明确其改善大鼠心室重构作用,并以Wnt/β-catenin信号通路为契合点,从在体及离体两个层面进一步探讨补肾活血方改善心室重构的具体分子机制。材料与方法:1.心梗后心衰大鼠模型建立及评价。购买130只SPF级雄性SD大鼠（体重250±20g）,随机选出30只用于心梗后心衰大鼠模型建立及评价,剩余100只用于后续其他实验。将选出的30只大鼠随机分为假手术组与模型组,每组15只。通过结扎大鼠冠脉左前降支（left anterior descending artery,LAD）造成大鼠大面积心肌梗死,随机选取术后存活大鼠3只,于术后第三天行2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2、3、5-Triphenytetrazoliumchlor ide,TTC）染色测量大鼠心肌梗死面积,其余术后存活大鼠进行力竭式游泳,1次/日,并减半喂食（按体重计算标准饲料量/2）,持续4周,造成慢性心衰大鼠模型,假手术组大鼠冠脉LAD只挂线,不结扎,术后正常饮食。造模过程中,观察大鼠存活状况,造模结束后计算大鼠存活率,观察两组大鼠体征（包括心率、呼吸频率、尿量等）,采用超声法测量大鼠射血分数（ejection fraction,EF）,称取大鼠体重及心脏重量计算心重指数（heart weight index,HWI）,酶联免疫吸附（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）法检测大鼠血清脑钠肽（brain natriuretic peptide,BNP）、血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ,Ang Ⅱ）含量。通过上述方法综合评价心梗后心衰模型制备的可靠性。2.补肾活血方对慢性心衰大鼠心功能及“心肾相关”指标的影响。购买的130只SPF级雄性SD大鼠,上述实验使用30只,剩余100只。在剩余的100只SPF级雄性SD大鼠中随机挑选20只作为假手术组,其余80只大鼠通过结扎大鼠冠脉LAD造成心肌梗死,术后进行力竭式游泳及饥饿,造成慢性心衰大鼠模型（造模操作手法同上述实验）。将造模后存活大鼠随机分为模型组、补肾活血组、赖诺普利组。赖诺普利组大鼠给予赖诺普利片配置成的混悬液2.0mg/kg·d（按人鼠剂量换算）灌胃,每天1次,每次3ml;补肾活血组大鼠给予补肾活血方熬制汤剂灌胃,剂量为18.0g/kg·d（按人鼠剂量换算）,每天1次,每次3ml;假手术组和模型组大鼠每日给予常规等容积蒸馏水灌胃,每天1次,每次3ml。各组均给药4周。药物治疗4周后超声检测各组大鼠舒张末期左心室内径（LVEDD）,收缩末左心室内径（LVESD）并计算EF值及左心室短轴缩短分数（FS）,处死大鼠取材,制作心肌病理切片并采用HE染色法（纵切）观察各组大鼠心肌形态改变,Elisa法测定各组大鼠血清BNP表达水平,免疫蛋白印记（Western blotting,WB）法检测大鼠肾组织中Klotho蛋白表达水平,反转录聚合酶链式反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）法检测大鼠肾组织骨桥蛋白（osteopontin,OPN）信使核糖核酸（messenger ribonucleic cid,m RNA）表达情况。3.观察补肾活血方对心梗后心衰大鼠模型Wnt/β-catenin信号通路的干预,探讨补肾活血方抗心肌肥大改善心室重构机制。动物造模及药物治疗同上。药物治疗4周后,采用HE染色法（横切）观察心肌横截面面积,Elisa法测定各组大鼠血清Wnt3a表达水平,WB法检测各组大鼠心肌β-连环蛋白（β-catenin）、散乱蛋白1（dishevelled 1,Dvl1）、磷酸化糖原合酶激酶3β（phosphorylated glycogen synthase kinase-3β,p-GSK3β）水平,RT-PCR法检测大鼠心肌组织Myc m RNA表达情况。4.观察补肾活血方对H9C2心肌细胞肥大模型Wnt/β-catenin信号通路的干预,探讨补肾活血方抗心肌肥大机制,明确补肾活血方调控Wnt/β-catenin信号通路的主要靶点。含药血清制备:购买20只大鼠,随机选出10只给予补肾活血方熬制汤剂18.0g/kg·d灌胃,每天1次,每次3ml,灌胃1周后取材收集大鼠血清,离心制备补肾活血方含药血清;另外10只大鼠给予等量蒸馏水灌胃,1周后取材收集大鼠血清,离心制备正常大鼠血清。购买H9C2细胞株,根据实验设计分为四组。应用96孔板培养细胞。正常组心肌细胞共转染Top-flash质粒、p RL-TK质粒及对照质粒,转染时添加正常大鼠血清培养液;模型组心肌细胞用Ang Ⅱ(10-8mol/L)刺激24h,然后共转染Top-flash质粒、p RL-TK质粒及对照质粒,转染时添加正常大鼠血清培养液;中药组心肌细胞用Ang Ⅱ(10-8mol/L)刺激24h,然后共转染Top-flash质粒、p RL-TK质粒及对照质粒,转染时添加补肾活血方含药血清培养液;中药实验组心肌细胞用Ang Ⅱ(10-8mol/L)刺激24h,然后共转染Top-flash质粒、p RL-TK质粒及持续活化型β-catenin质粒,转染时添加补肾活血方含药血清培养液。为消除误差,实验另设对照,将上述分组中Top-flash换为Fop-flash。将96孔板置于37℃、5%CO2培养箱中48h,应用Dual-Glo?Luciferase Assay System双荧光报告系统检测细胞荧光值。另取24孔板,孔中铺圆形玻片,按上述分组方法培养细胞并转染,转染后取出玻片用显微镜观察心肌细胞面积,鬼笔环肽法观察心肌细胞F-actin荧光强度及细胞形态。结果:1.造模完成时,模型组大鼠死亡4只,LAD结扎后大鼠心电图显示ST段明显抬高,幅度超过0.1m V;TTC染色显示术后大鼠心肌梗死面积为39.46%。造模结束时模型组大鼠心率、呼吸频率高于假手术组,尿量少于假手术组（P﹤0.01）;模型组大鼠EF均值低于45%,低于假手术组（P﹤0.01）;模型组大鼠心重指数高于假手术组（P﹤0.01）;模型组大鼠血清BNP、Ang Ⅱ水平明显高于假手术组（P﹤0.01）。2.用药4周后,与假手术组比较,模型组大鼠LVEDD、LVESD升高,EF、FS值降低,血清BNP水平明显升高,心肌结构紊乱,部分胞核溶解,肾组织Klotho蛋白表达降低,OPN m RNA表达升高（P﹤0.01）;与模型组大鼠比较,补肾活血组大鼠LVEDD、LVESD降低,EF、FS值升高,血清BNP水平明显降低,心肌结构改善,肾脏Klotho蛋白表达升高,OPN m RNA表达降低（P﹤0.01）;与赖诺普利组比较,补肾活血组大鼠超声指标、肾组织Klotho蛋白及OPN m RNA表达无差异（P﹥0.05）。3.用药4周后,与假手术组比较,模型组大鼠心肌横截面面积增大,Wnt经典通路配体Wnt3a血清水平降低,心肌组织β-catenin、Dvl1、p-GSK3β蛋白表达明显升高,心肌组织Myc m RNA表达升高（P﹤0.01）;与模型组比较,补肾活血组及赖诺普利组大鼠心肌横截面面积变小,血清Wnt3a水平升高,心肌组织Dvl1、p-GSK3β蛋白表达明显降低,心肌组织Myc m RNA表达降低（P﹤0.01）,补肾活血组心肌组织β-catenin表达较高（P﹤0.01）,赖诺普利组心肌组织β-catenin蛋白表达变化不明显（P﹥0.05）;与赖诺普利组相比,补肾活血组大鼠心肌横截面面积无差异（P﹥0.05）,血清Wnt3a水平较高,心肌组织β-catenin、Dvl1、p-GSK3β蛋白表达较低,Myc m RNA表达降低（P﹤0.01）。4.显微镜下观察正常组H9C2细胞,可见细胞多呈长梭形。模型组H9C2细胞面积增大,F-actin荧光强度明显高于正常组（P﹤0.01）,细胞内微丝增多增粗,细胞横向增宽,形态不规则,提示H9C2细胞肥大模型成功,双荧素酶报告系统显示模型组H9C2细胞荧光值明显高于正常组（P﹤0.01）;相比于模型组,中药组H9C2细胞面积缩小,细胞多呈梭形,F-actin荧光强度降低,细胞内微丝较细,双荧素酶报告系统的荧光值降低（P﹤0.01）;相比于中药组,中药实验组H9C2细胞面积增大,细胞形态不规则、粗大,细胞内F-actin荧光强度增强（P﹤0.01）,微丝增多增粗,双荧光系统荧光值明显升高（P﹤0.01）。结论:1.结扎LAD可见大鼠心电图ST段明显升高并有大面积心肌梗死,说明手术流程可靠;术后大鼠经力竭式游泳、饥饿造成慢性心衰模型,其体征符合临床表现,心脏重量增加,心功能（BNP、EF值）降低,心衰时RAAS系统主要指标Ang Ⅱ升高,贴近临床,是可靠的慢性心衰造模方法。2.补肾活血方可提高慢性心衰大鼠心功能（BNP、EF值）,改善心肌排列,改善心室结构（LVEDD、LVESD）,调节“心肾相关”因子Klotho、OPN的表达,明确“心肾相关”理论对于慢性心衰治疗的指导地位。3.补肾活血方可下调大鼠心肌组织中β-catenin、Dvl1、p-GSK3β蛋白表达,下调Myc m RNA表达,表明补肾活血方可调控Wnt/β-catenin信号通路中的多个信号分子靶点,并通过Wnt/β-catenin信号通路发挥抑制心肌肥大作用。补肾活血方对Wnt/β-catenin信号通路主要干预靶点在Dvl1。4.实验显示,Ang Ⅱ可刺激H9C2细胞肥大,且其机制与激活Wnt/β-catenin信号通路有关,补肾活血方可通过抑制Wnt/β-catenin信号通路达到抑制心肌肥大的作用,其作用靶点位于通路传导中β-catenin的上游,结合体内实验可推断补肾活血方对Wnt/β-catenin信号通路主要干预靶点在Dvl1。
叶宁[10]（2020）在《E3泛素化连接酶cul4a通过特异性结合并调控PARP-1对抗氧化应激诱导的大鼠心肌细胞损伤的机制研究》文中研究表明目的:急性心肌梗死是心血管疾病死亡的重要原因之一,再灌注治疗是对其最好的治疗方法。即使许多再灌注的患者血液供应得到了恢复,但是心肌组织依然出现了损伤的进行性加重,这种损伤被称为缺血再灌注损伤。在缺血再灌注损伤诸多因素中,活性氧累积的氧化应激损伤是其核心。因此,通过对氧化应激损伤调控机制的探索,可以为治疗缺血再灌注损伤及其他氧化应激引起的心血管疾病提供新的策略。近年来,许多研究证实了泛素-蛋白酶体系统,尤其是E3泛素化连接酶在氧化应激损伤的调控中起到关键的作用,cul4a是近期发现的一种E3泛素化连接酶,与癌症有着密切的联系,广泛参与了细胞生理和病理过程。但是,目前尚没有研究表明cul4a是否参与到心血管系统疾病中,发挥怎样的生理功能和病理作用。因此,本研究拟应用体外心肌细胞实验,探讨cul4a在心肌细胞氧化应激损伤中的作用及分子机制。研究方法:选择H2O2作为H9c2心肌细胞氧化应激损伤的诱导因素,首先用50μM、100μM、200μM、400μM的H2O2处理2小时后,利用CCK-8-kit测定其细胞活力,使用Annexin V-FITC/PI双染色法-流式细胞术检测细胞凋亡,利用细胞免疫荧光检测氧化应激损伤后cul4a的表达水平和位置,使用western blot检测cul4a以及凋亡相关蛋白cleaved PARP-1,cleaved caspase3的表达情况,使用ROS荧光检测心肌细胞内ROS产生水平。接下来,在心肌细胞过表达cul4a,用50μM、100μM、200μM、400μM的H2O2处理2小时后,同样利用CCK-8-kit测定其细胞活力,使用Annexin V-FITC/PI双染色法-流式细胞术检测细胞凋亡,使用western blot检测Flag-cul4a以及凋亡相关蛋白cleaved PARP-1,cleaved caspase3的表达情况,使用ROS荧光检测心肌细胞内ROS产生水平。紧接着,利用3个cul4a-siRNA片段对心肌细胞进行RNA的干扰从而敲减蛋白,检测cul4a的敲减效率,选用敲减效率最高的片段,用50μM、100μM、200μM、400μM的H2O2处理2小时后,同样利用CCK-8-kit测定其细胞活力,使用Annexin V-FITC/PI双染色法-流式细胞术检测细胞凋亡,使用western blot检测Flag-cul4a以及凋亡相关蛋白cleaved PARP-1,cleaved caspase3的表达情况,使用ROS荧光检测心肌细胞内ROS产生水平。最后,利用免疫共沉淀实验检测泛素连接酶cul4a与凋亡相关蛋白PARP-1在生理状态下以及H2O2诱导的氧化应激损伤中内源和半外源的相互作用情况,并在梯度过表达和敲减cul4a后,检测凋亡相关蛋白PARP-1的表达水平。结果:1、H2O2刺激H9c2细胞后,随着浓度的逐渐增加,细胞活力显着降低,细胞凋亡比率明显增加,细胞内ROS产生增加,cul4a的表达明显上调,凋亡相关蛋白cleaved PARP-1和cleaved caspase 3表达水平显着提高。2、过表达cul4a后,200μM H2O2干预的过表达组细胞活力较空载对照组明显提高,细胞凋亡比率大幅下降,凋亡相关蛋白cleaved PARP-1和cleaved caspase3的表达水平显着下降,细胞内ROS产生也显着下降。3、敲减cul4a后,200μM H2O2干预的cul4a siRNA组细胞活力较阴性对照组明显下降,细胞凋亡比率增加大幅增加,凋亡相关蛋白cleaved PARP-1和cleaved caspase3的表达水平显着增加,细胞内ROS产生也显着增加。4、免疫共沉淀实验证实H9c2心肌细胞中cul4a可以与PARP-1相互作用,并且这种作用会在氧化应激损伤中加强。并且cul4a作为E3泛素化连接酶减少PARP-1的表达。结论:心肌细胞氧化应激损伤中,cul4a表达水平上升并且与凋亡相关蛋白PARP-1的结合增加,减少了PARP-1的表达和ROS的生成,从而抑制了细胞损伤。提示cul4a可为氧化应激导致的再灌注损伤和其他心血管疾病的提供一种新的潜在治疗策略。
二、心肌细胞周期调控的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、心肌细胞周期调控的研究进展（论文提纲范文）
（1）CDK4/6抑制剂帕博西尼对糖尿病心肌病的保护作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 糖尿病心肌病研究进展 |
| 2.1.1 糖尿病心肌病概述 |
| 2.1.2 心脏对糖尿病的反应 |
| 2.1.3 糖尿病心肌病的诊断 |
| 2.1.4 糖尿病心肌病的发病机制 |
| 2.1.5 糖尿病心肌病的治疗 |
| 2.2 糖尿病心肌病治疗西药的研究 |
| 2.2.1 糖尿病治疗药物 |
| 2.2.2 血管治疗药物 |
| 2.2.3 降脂药物 |
| 2.2.4 代谢调节剂 |
| 2.2.5 糖尿病心肌病治疗中药的研究 |
| 2.3 细胞周期依赖性激酶CDK4/6 抑制剂 |
| 第3章 CDK4/6抑制剂Palbociclib改善糖尿病心肌病的心功能不全 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 药品与试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 CDK4和CDK6在STZ糖尿病小鼠心脏中的表达上调 |
| 3.2.2 Palbociclib抑制STZ糖尿病小鼠的心脏损伤,改善心脏功能 |
| 3.2.3 Palbociclib减轻STZ糖尿病小鼠心脏的氧化损伤 |
| 3.2.4 Palbociclib减轻STZ糖尿病小鼠心脏的炎症发生 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 CDK4/6抑制剂Palbociclib通过抑制心肌细胞中的RB磷酸化来防止心肌细胞凋亡 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 药品与试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 实验方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 Palbociclib抑制了STZ糖尿病小鼠心肌细胞的细胞凋亡 |
| 4.2.2 Palbociclib对 HG诱导的心肌细胞生存率的影响 |
| 4.2.3 Palbociclib通过调控Bcl-2 家族蛋白抑制糖尿病心肌病的心肌细胞凋亡 |
| 4.2.4 Palbociclib抑制心肌细胞中HG导致的氧化指标和线粒体ROS上调,促进抗氧化因子上调 |
| 4.2.5 Palbociclib抑制心肌细胞中HG诱导的RB的磷酸化和p53表达 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 课题创新性总结 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）孕激素通过调控YAP表达促进心肌细胞增殖及DYRK1A在调控成年心肌细胞增殖中的作用研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| abstract |
| 摘要 |
| 第一部分 孕激素通过调控YAP表达促进心肌细胞增殖及心脏损伤修复 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 孕激素可促进新生哺乳动物心肌细胞增殖 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 孕激素调控YAP表达实现促心肌细胞增殖作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 统计学分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 孕激素促进成年心肌梗死后心肌细胞增殖及心脏损伤修复 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 统计学分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 DYRK1A在调控成年心肌细胞增殖中作用研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.3 统计学分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 心肌细胞增殖的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（3）心肌细胞增殖影响因素和评价方法（论文提纲范文）
| 1 心肌再生的基本方式 |
| 1.1 心肌再生的来源 |
| 1.2 心肌细胞增殖模式 |
| 1.3 心肌再生的模型 |
| 2 心肌细胞增殖的影响因素 |
| 2.1 能量代谢与氧化应激 |
| 2.2 细胞周期调控因子 |
| 2.3 转录因子 |
| 2.4 Hippo-YAP信号通路 |
| 2.5 免疫反应信号 |
| 2.6 细胞外基质和肌小节结构 |
| 2.7 非编码RNA |
| 3 心肌细胞增殖的评价方法 |
| 3.1 基于增殖分子标志的免疫荧光染色评估心肌细胞的增殖 |
| 3.2 基于同位素或核苷酸类似物的掺入评估心肌细胞的增殖 |
| 3.3 利用有丝分裂染色体重组现象来荧光标记子代心肌细胞 |
| 3.4 利用转基因技术荧光标记增殖分子标志评估心肌细胞的增殖 |
| 3.5 利用谱系示踪和随机荧光标记报告系统观察心肌细胞的增殖 |
| 4 促心肌再生的临床前景和忧虑 |
| 5 总结与展望 |
（4）miR-4755-5p靶向调控Cyclin D1在氟致成骨细胞增殖活化中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 0 引言 |
| 第一部分 :miR-4755-5p与Cyclin D1在燃煤污染型氟暴露人群的表达及相关性分析 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 第二部分 :氟诱导人成骨细胞增殖活化及miR-4755-5p、Cyclin D1在染氟人成骨细胞中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 第三部分 :miR-4755-5p靶向调控Cyclin D1参与氟诱导人成骨细胞增殖活化 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 miRNAs在细胞周期相关疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
| 学位论文数据集 |
（5）基于网络药理学探讨芪苈强心胶囊治疗糖尿病性心肌病的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 文献综述 |
| 第一章 糖尿病性心肌病的发病机制和诊疗进展 |
| 1 糖尿病性心肌病发病机制研究进展 |
| 1.1 糖代谢紊乱 |
| 1.2 脂代谢紊乱 |
| 1.3 肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)被激活 |
| 1.4 氧化应激与线粒体损伤 |
| 1.5 炎症反应 |
| 1.6 钙稳态失衡 |
| 1.7 内质网应激 |
| 1.8 细胞凋亡 |
| 1.9 自噬 |
| 1.10 细胞周期 |
| 2 糖尿病性心肌病中西医诊疗研究进展 |
| 第二章 芪苈强心胶囊研究进展 |
| 1 药理作用及临床应用研究进展 |
| 2 主要化学成分研究进展 |
| 综述小结 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 技术路线图 |
| 实验研究 |
| 第一部分 糖尿病性心肌病模型建立和转录组学研究 |
| 1 试药与材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂与药品 |
| 1.3 溶液配制 |
| 2 实验方法与步骤 |
| 2.1 建立高糖损伤H9c2细胞模型 |
| 2.2 基于RNA-seq分析高糖对H9c2细胞基因表达的影响 |
| 2.3 RNA-seq生物信息学分析 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果分析 |
| 3.1 高糖对H9c2心肌细胞细胞活力的影响 |
| 3.2 RNA-seq基础分析 |
| 3.3 差异基因的功能分析 |
| 3.4 细胞周期相关基因的蛋白互作分析 |
| 3.5 相关信号通路 |
| 4 小结与讨论 |
| 第二部分 芪苈强心胶囊治疗糖尿病性心肌病的作用机制的网络药理学研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 主要软件和数据库 |
| 1.2 芪苈强心胶囊化学成分检索 |
| 1.3 芪苈强心胶囊活性成分的筛选 |
| 1.4 活性成分靶点预测 |
| 1.5 核心靶点生物功能注释及通路图绘制 |
| 2 结果 |
| 2.1 黄芪活性成分筛选 |
| 2.2 人参活性成分筛选 |
| 2.3 附子活性成分筛选 |
| 2.4 丹参活性成分筛选 |
| 2.5 葶苈子活性成分筛选 |
| 2.6 泽泻活性成分筛选 |
| 2.7 玉竹活性成分筛选 |
| 2.8 桂枝活性成分筛选 |
| 2.9 红花活性成分筛选 |
| 2.10 香加皮活性成分筛选 |
| 2.11 陈皮活性成分筛选 |
| 2.12 芪苈强心胶囊入血成分的收集 |
| 2.13 筛选出的活性化合物信息 |
| 2.14 有效成分潜在作用靶点分析及注释 |
| 2.15 各有效成分生物过程与通路富集分析 |
| 3 小结与讨论 |
| 第三部分 丹参酮ⅡA对高糖诱导H9c2心肌细胞损伤的保护作用研究 |
| 1 试药与材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 试剂与药品 |
| 1.3 溶液配制 |
| 2 实验方法与步骤 |
| 2.1 建立高糖损伤H9c2细胞模型 |
| 2.2 细胞周期测定 |
| 2.3 细胞总RNA的提取 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 丹参酮ⅡA对H9c2心肌细胞活力的影响 |
| 3.2 丹参酮ⅡA对高糖(33 mmol·L~(-1))诱导的H9c2心肌细胞活力的影响 |
| 3.3 丹参酮ⅡA对高糖(33 mmol·L~(-1))诱导H9c2细胞周期的影响 |
| 3.4 丹参酮ⅡA对高糖(33 mmol·L~(-1))诱导H9c2细胞周期相关mRNA表达的影响 |
| 4 小结与讨论 |
| 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 在学期间主要研究成果 |
（6）基于SIRT1信号通路探讨舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠的保护作用和机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 引言 |
| 文献综述 |
| 综述一中西医对心肌缺血再灌注损伤的认识及研究进展 |
| 1 西医对心肌缺血再灌注损伤的研究进展 |
| 1.1 心肌缺血再灌注损伤的概念及常见损伤 |
| 1.2 心肌缺血再灌注损伤的发病机制 |
| 1.3 西医对心肌缺血再灌注损伤的治疗 |
| 2 中医对心肌缺血再灌注损伤的研究进展 |
| 2.1 病名源流 |
| 2.2 病因病机 |
| 2.3 辨证分型 |
| 2.4 中医药治疗研究进展 |
| 综述二SIRT1 信号通路在心血管疾病中的研究进展 |
| 实验研究 |
| 第一章 MI/RI大鼠模型的建立及心功能指标测定 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验用药 |
| 1.3 实验主要试剂、器械、仪器与耗材 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 分组与给药 |
| 2.2 MI/RI大鼠模型建立 |
| 2.3 指标检测 |
| 2.4 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 MI/RI大鼠心电图改变 |
| 3.2 MI/RI大鼠血流动力学改变 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二章 舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠心肌组织形态学的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 主要实验试剂 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 石蜡病理切片的制备 |
| 2.2 HE染色法 |
| 2.3 透射电镜检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 HE染色实验结果 |
| 3.2 透射电镜实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠心肌组织SIRT1 信号通路的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验用药 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 q RT-PCR检测法 |
| 2.2 Western blot检测法 |
| 2.3 IHC检测法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 q RT-PCR实验结果 |
| 3.2 Western blot实验结果 |
| 3.3 IHC 化结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 讨论 |
| 1 舒心生脉丹的创立和意义 |
| 2 MI/RI模型建立的关键问题 |
| 3 实验指标分析 |
| 3.1 舒心生脉丹对心电图影响 |
| 3.2 舒心生脉丹对血流动力学的影响 |
| 3.3 舒心生脉丹对心肌组织形态学影响 |
| 3.4 对SIRT1 信号通路的影响 |
| 4.实验总结 |
| 结论 |
| 本文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
| 个人简介 |
（7）运动通过IGF-1/PI3K/Akt/mTOR信号通路激活延缓衰老大鼠心肌细胞凋亡的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 第二章 文献综述 |
| 2.1 心脏老化与心肌细胞衰老 |
| 2.2 心肌细胞衰老的相关机制 |
| 2.2.1 胰岛素生长因子受体通路激活自噬与心肌衰老 |
| 2.2.2 胰岛素生长因子受体通路抑制凋亡与心肌衰老 |
| 2.2.3 胰岛素生长因子受体通路调控细胞周期进程与心肌衰老 |
| 2.3 运动干预对衰老心肌细胞的保护作用与机制 |
| 2.3.1 运动激活IGF-1/PI3K/Akt/mTOR信号通路保护衰老心肌细胞 |
| 2.3.2 运动激活自噬有利于衰老心肌细胞存活 |
| 2.3.3 运动抑制凋亡促进老年心肌保护 |
| 2.3.4 运动调控细胞周期调控系统促进衰老心肌细胞存活 |
| 第三章 实验对象及方法 |
| 3.1 技术路线 |
| 3.2 实验对象 |
| 3.3 主要仪器 |
| 3.4 实验试剂 |
| 3.5 实验分组 |
| 3.6 实验动物的运动干预 |
| 3.7 实验小鼠取材 |
| 3.7.1 组织样品的取材 |
| 3.7.2 心肌组织样品的制备 |
| 3.8 实验方法 |
| 3.8.1 石蜡包埋HE染色 |
| 3.8.2 TUNEL染色 |
| 3.8.3 蛋白质免疫印迹实验 |
| 3.9 数据处理 |
| 第四章 实验结果 |
| 4.1 运动干预可改善老年大鼠心肌结构 |
| 4.2 运动干预抑制老年大鼠心肌凋亡 |
| 4.3 运动介导IGF-1/PI3K/Akt/mTOR通路调控自噬、凋亡及细胞周期进程 |
| 4.3.1 运动上调IGF-1/PI3K/Akt/mTOR通路 |
| 4.3.2 运动激活老年大鼠心肌自噬 |
| 4.3.3 运动抑制老年大鼠心肌凋亡 |
| 4.3.4 运动促进细胞周期进程 |
| 第五章 分析与讨论 |
| 5.1 运动干预可激活衰老心肌细胞的自噬流通量 |
| 5.2 运动干预抑制衰老大鼠心肌细胞凋亡 |
| 5.3 运动调控衰老心肌细胞进程 |
| 5.4 适度耐力运动和抗阻运动均可保护大鼠衰老心肌细胞 |
| 结论 |
| 1、主要结论 |
| 2、创新点 |
| 3、缺陷和不足 |
| 4、展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）有机氯农药五氯硝基苯诱导心脏毒性的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 实验材料和方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 心肌细胞增殖调控机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 附录 小G蛋白RablO通过降低线粒体氧化应撖抑制阿霉素诱导的心脏毒性 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（9）补肾活血方调控Wnt/β-catenin通路抑制心梗后心室重构治疗慢性心衰机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 心梗后心衰大鼠模型的建立与评价(前言) |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 基于“心肾相关”理论探讨补肾活血方对Klotho、OPN及心室重构的影响(前言) |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 基于Wnt/β-catenin通路补肾活血方抑制心梗后心衰大鼠心肌肥大机制研究(前言) |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文四 补肾活血方调控Wnt/β-catenin通路抑制HC92 心肌细胞肥大机制研究(前言) |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述一 Wnt/β-catenin 信号通路与心室重构的关系 |
| 参考文献 |
| 综述二 “心肾相关”理论源流及研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（10）E3泛素化连接酶cul4a通过特异性结合并调控PARP-1对抗氧化应激诱导的大鼠心肌细胞损伤的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 抗体 |
| 2.1.3 培养基、检测试剂盒和相关主要试剂 |
| 2.1.4 实验溶液 |
| 2.1.5 siRNA序列 |
| 2.1.6 耗材 |
| 2.1.7 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒的构建 |
| 2.2.2 siRNA的构建 |
| 2.2.3 H9c2细胞的复苏、传代培养、冻存 |
| 2.2.4 H9c2细胞氧化应激损伤的诱导 |
| 2.2.5 H9c2 细胞系敲减cul4a |
| 2.2.6 H9c2 细胞中过表达cul4a |
| 2.2.7 细胞活力测定 |
| 2.2.8 细胞免疫荧光 |
| 2.2.9 AnnexinⅤ-FITC/PI流式细胞术测定细胞凋亡 |
| 2.2.10 Western Blot检测蛋白的表达量 |
| 2.2.11 免疫共沉淀 |
| 2.2.12 ROS荧光 |
| 2.2.13 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 心肌细胞氧化应激损伤上调cul4a表达 |
| 3.2 cul4a对 H_2O_2 诱导的H9c2 心肌细胞氧化应激损伤的影响 |
| 3.2.1 H9c2 心肌细胞过表达cul4a减轻H_2O_2 诱导的氧化应激损伤 |
| 3.2.2 H9c2 心肌细胞敲减cul4a加重H_2O_2 诱导的氧化应激损伤 |
| 3.3 cul4a的表达影响H_2O_2 诱导的氧化应激损伤中ROS的变化 |
| 3.3.1 H9c2 细胞内ROS水平随H_2O_2 诱导的氧化应激损伤程度加重而上升 |
| 3.3.2 H9c2 心肌细胞过表达cul4a降低H_2O_2 诱导的氧化应激损伤中ROS的水平 |
| 3.3.3 H9c2 心肌细胞敲减cul4a增加H_2O_2 诱导的氧化应激损伤中ROS的水平 |
| 3.4 H9c2 心肌细胞中cul4a与凋亡相关蛋白PARP-1 的相互作用 |
| 3.4.1 免疫共沉淀实验确定PARP-1 作为E3 泛素化连接酶cul4a全新的结合蛋白与其相互作用 |
| 3.4.2 在H_2O_2 诱导的氧化应激损伤中,cul4a与 PARP-1 相互作用增强 |
| 3.5 cul4a作为E3 泛素化连接酶可以降解PARP-1,减少其表达 |
| 3.5.1 梯度过表达cul4a可以使PARP-1 表达水平逐渐降低 |
| 3.5.2 敲减cul4a程度与PARP-1 表达水平增加正相关 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、心肌细胞周期调控的研究进展（论文参考文献）
- [1]CDK4/6抑制剂帕博西尼对糖尿病心肌病的保护作用及机制研究[D]. 王正桂. 吉林大学, 2021(01)
- [2]孕激素通过调控YAP表达促进心肌细胞增殖及DYRK1A在调控成年心肌细胞增殖中的作用研究[D]. 兰聪. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [3]心肌细胞增殖影响因素和评价方法[J]. 付文斌,王伟,曾春雨. 中国科学:生命科学, 2022(02)
- [4]miR-4755-5p靶向调控Cyclin D1在氟致成骨细胞增殖活化中的作用研究[D]. 高嘉宇. 贵州医科大学, 2020
- [5]基于网络药理学探讨芪苈强心胶囊治疗糖尿病性心肌病的分子机制[D]. 王嘉馨. 北京中医药大学, 2020(04)
- [6]基于SIRT1信号通路探讨舒心生脉丹对MI/RI模型大鼠的保护作用和机制[D]. 刘岩松. 长春中医药大学, 2020(08)
- [7]运动通过IGF-1/PI3K/Akt/mTOR信号通路激活延缓衰老大鼠心肌细胞凋亡的机制[D]. 谢金凤. 武汉体育学院, 2020(10)
- [8]有机氯农药五氯硝基苯诱导心脏毒性的分子机制研究[D]. 张辰. 北京协和医学院, 2020(05)
- [9]补肾活血方调控Wnt/β-catenin通路抑制心梗后心室重构治疗慢性心衰机制研究[D]. 孔繁达. 辽宁中医药大学, 2020(01)
- [10]E3泛素化连接酶cul4a通过特异性结合并调控PARP-1对抗氧化应激诱导的大鼠心肌细胞损伤的机制研究[D]. 叶宁. 中国医科大学, 2020(01)