一、生物素标记的6种cDNA探针检测S180及其克隆细胞株mRNA的表达（论文文献综述）
苗雪文,高德煜,于浩,李敏,王苗苗,姜爱莉,王召旭[1]（2021）在《大鼠体内生物素示踪重组人胶原蛋白的方法研究》文中认为目的:建立一种在大鼠体内示踪外部重组人胶原蛋白的方法。方法:采用超级生物素标记重组人胶原蛋白,将标记后的重组人胶原蛋白植入大鼠体内,实验周期结束后取植入部位组织,制备石蜡切片,用辣根过氧化物酶标记链霉亲和素识别病理切片上生物素标记的蛋白,二氨基联苯胺法染色（DAB法染色）,显微镜观察组织情况。结果:在病理切片中观察到生物素标记重组人胶原蛋白的棕褐色沉淀,实现了植入组织的重组人胶原蛋白的定位。结论:生物素标记重组人胶原蛋白的方法灵敏度高,操作简单,可快速实现对重组人胶原蛋白的追踪。本文通过设立生物素对照组,排除生物素本身体内代谢对实验结果的影响。
丁森[2]（2016）在《HPV16 RNA非扩增型核酸杂交捕获检测技术的体系研究》文中研究表明HPV（Human papilloma virus,人乳头瘤病毒）可导致人类多种恶性肿瘤,包括头颈癌、口咽癌、肺癌、呼吸道癌及肛门生殖器癌等。根据HPV的致癌潜力不同可以将目前已发现的100多种HPV划分为高危型、中等危害型及低危型。高危型中的HPV16和HPV18的持续感染是人类多种生殖器癌尤其是子宫颈癌的直接诱因。其中,HPV16又是最常见、更容易传播、危害程度最大的高危HPV型。由于高危HPV所致宫颈癌治疗难度很大并且临床预后不佳,导致女性罹患子宫颈癌后的存活率极低。因此,临床上有效的HPV16早期检测不仅能够及时筛查出潜在的患病个体,还能够为有效的控制HPV的传播提供可靠的依据,更能够使患者得到及时有效的治疗并以此提高其生存几率。由于针对HPV病毒蛋白的检测方法的特异性和灵敏度不够,FDA目前批准的HPV检测方法主要针对的靶标是HPV的核酸（DNA及RNA）。这些检测方法有杂交捕获信号放大法如HC2（Qiagen/Digene）,实时定量PCR法如Cobas HPV（Roche）,酶切信号放大法如 Cervista（Hologic）,NASBA 法如 Aptima（Gen-Probe）等。但是,这些检测手段都存在诸多缺陷。一方面,由于HPV存在一过性、反复性感染的特性,针对HPVDNA的检测方法出现假阳性、假阴性的几率较大,容易造成误诊和漏诊;另一方面,由于目前针对HPVDNA或RNA的检测方法都需要对靶序列进行扩增以增强检测信号,因而需要高规格的操作环境及高性能的核酸扩增仪器,这不仅大大提高了其成本投入、延长了检测时间,而且还不能反映真实的病毒载量,故不能用于临床HPV感染所致疾病的准确分期。因此,研发能够突破现行检测方法瓶颈的HPV检测手段显得尤为重要。本论文叙述了两种以酶联免疫吸附分析技术为基础的新检测体系的建立过程,开展了以HPV RNA为靶标的新型核酸免疫检测方法的研究,探讨其优势及待改进之处,为开发的针对HPV核酸的免疫检测平台奠定了基础。该技术的设计策略是:以HPV16 RNA为检测对象（该靶标可作为判断是否存在活病毒的依据从而反映感染状态）,设计、筛选特异性探针组合,该探针组合可与HPV16 RNA退火杂交形成能够被抗体特异性识别的DNA-RNA杂合体（DNA-RNA Hybrid）,最终通过酶促反应介导的显色或化学发光显示信号以达到对HPV准确、灵敏检测的目的并可真实反映样本中的活HPV的病毒载量。针对上述设计思想,本研究对检测体系中的每个环节进行了具体的设计、筛选及优化。在体系构建环节上,本研究以人工合成的互补DNA-RNA杂合体片段为模型,确定了两种高效的固定核酸抗原的方法——抗体捕获法及多聚L赖氨酸（PLL）固定法并优化了检测条件,包括抗体浓度、退火缓冲液离子强度、探针长度及数量等;在探针应用环节上,本研究根据HPV基因组结构特征,大量设计并筛选出了数条具有自主知识产权的特异性识别HPV16 RNA特征序列的DNA探针,并成功应用于该检测体系中;在终端信号输出及读取环节上,通过抗DNA-RNA杂合体的单克隆抗体捕获待检抗原,进一步采用化学发光、显色技术体系显示检测信号,实现了对微量HPV病毒检测的目的。结果显示,该核酸免疫检测技术对人工合成的DNA-RNA杂合体片段的检测灵敏度可达到10-11 M;对HPV16 E6、E7体外转录片段的检测灵敏度分别为9.23 pg/mL、4.24 pg/mL;对细胞株或临床样本中提取的HPV16 RNA的检测灵敏度能达到10万级病毒拷贝数。在与国际公认的高危HPV检测方法——Q-PCR法的比较中,该方法与Q-PCR法的检测结果一致,从而证实了该核酸免疫检测方法的准确性与可靠性。本论文相关研究工作的创新点及技术优势主要体现在以下几方面:1.成功构建了针对HPV16 RNA的酶联免疫分析技术,该技术属独创性质,具有自主知识产权;2.以该酶联免疫分析技术为基础,该研究探索出了两种高效结合核酸抗原的固相载体表面处理方法——抗体捕获法及PLL固定法;3.运用该酶联免疫分析技术,该研究以HPV16RNA为检测对象,不仅可以准确地得到HPV活病毒的载量信息,而且可以为HPV感染后所致疾病的临床分期提供依据;4.该酶联免疫分析技术通过运用特异性的探针组合,提高了检测特异性与灵敏度,与针对HPV基因组的全长的RNA探针相比,极大降低了检测成本;5.该酶联免疫检测法免除了其它HPV核酸检测过程中的扩增步骤,简化了检测流程,节约了分析时间。综上所述,通过本研究工作,不仅成功研发了可用于临床的准确、快速、实时、高效的HPV定性、定量检测新技术,而且构建的技术平台可为下一步工作中研制针对HPV检测的系列产品及研发其它核酸分析技术提供关键技术支撑。
孙龙昊[3]（2014）在《AFP158-166特异性TCR转基因T细胞治疗肝癌的实验研究》文中认为第一部分：AFP158-166特异性TCR转基因T细胞的构建目的：构建AFP158-166特异性TCR转基因T细胞并鉴定其功能。方法：采集基因型HLA-A0201的健康志愿者单核细胞,制备负载AFP158-166表位肽的成熟树突状细胞（DC）,体外激活T细胞通过流式分选建立AFP158-166特异性T细胞克隆,获取并扩增AFP158-166特异性TCR基因,构建AFP158-166特异性TCR慢病毒载体,感染多克隆T细胞建立AFP158-166特异性TCR转基因T细胞。通过MHC五聚体检测转基因T细胞比例,以ELISPOT和细胞毒性实验进行功能鉴定。结果：（1）成功构建AFP158-166特异性TCR慢病毒载体VAT,可转染多克隆T细胞使其表达AFP158-166特异性TCR,构建AFP158-166特异性TCR转基因T细胞；（2）FCM检测Pro5AFP158-166-MHC五聚体和CD8双阳性细胞比例为1.8%；（3）ELSPOT检测显示AFP158-166特异性TCR转基因T细胞中分泌IFN-γ的细胞数是DC诱导的AFP158-166特异性T细胞中的1.8倍。（4）细胞毒性实验显示AFP158-166特异性TCR转基因T细胞较DC诱导的AFP158-166特异性T细胞对AFP+人肝癌细胞HepG2杀伤作用在效靶比10：1,20：1,30：1时分别从6.3±1.3%,17.9±5.2%,39.2±3.7%上升至11.3±2.9%,27.9±7.8%,62.7±10.4%,而对AFP-细胞无明显杀伤作用。结论：AFP158-166特异性TCR慢病毒载体VAT可转染多克隆T细胞构建AFP158-166特异性TCR转基因T细胞,对AFP+人肝癌细胞有特异性杀伤作用。第二部分：AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞的构建目的：构建AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞并鉴定其功能。方法：以AFP158-166抗原表位肽和IL-15协同表达质粒,构建慢病毒载体VA15转染人B细胞淋巴瘤细胞BJAB,以放射辐照抑制增殖,建立安全且稳定表达IL-15并递呈AFP158-166表位肽的人工抗原递呈细胞,通过ELISA、FCM和液相色谱-质谱联用分别鉴定IL-15、MHC分子、CD80、CD86、AFP158-166抗原肽的稳定表达,于体外诱导AFP158-166抗原特异性T细胞增殖,并以细胞毒性实验进行功能鉴定。结果：（1）成功构建AFP158-166抗原表位肽和IL-15协同表达慢病毒载体VA15,可转染BJAB细胞,获得协同表达AFP158-166抗原表位肽和IL-15的BJAB细胞单克隆BA15；（2）BA15可稳定表达AFP158-166抗原肽和IL-15；（3）20Gy剂量的137Csγ射线辐照可诱导凋亡有效阻滞BA15细胞增殖但不会使其迅速死亡；（4）20Gy剂量的137Csγ射线辐照不会影响BA15细胞表面MHC分子及协同刺激分子CD80、CD86的表达。（5）BA15可有效激活扩增AFP158-166抗原特异性T细胞,其功能较负载AFP158-166的DC无明显差异；（6）细胞毒性实验显示BA15诱导的AFP158-166特异性T细胞较DC诱导的AFP158-166特异性T细胞对AFP+人肝癌细胞HepG2杀伤作用在各效靶比无明显差异。结论：构建AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞可有效激活AFP158-166特异性T细胞,对AFP+人肝癌细胞有特异性杀伤作用。第三部分AFP158-166特异性转基因T细胞过继性免疫治疗的实验研究目的：以AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞BA15体外刺激AFP158-166特异性TCR转基因T细胞鉴定其功能变化。方法：体外非特异性激活HLA-0201健康志愿者淋巴细胞,以AFP158-166特异性TCR慢病毒VAT感染,制备AFP158-166特异性TCR转基因T细胞,并以本实验建立的AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞BAl5刺激扩增,通过MHC五聚体检测转基因T细胞比例变化,以细胞毒性实验进行体外实验功能鉴定。利用HepG2肝癌细胞NOD/SCID小鼠模型,进行AFP158-166特异性T细胞过继免疫治疗实验,观察治疗效果。结果：（1）经BA15刺激,AFP158-166特异性TCR转基因T细胞中Pro5AFP158-166-MHC五聚体和CD8双阳性细胞比例从1.8%上升至4.2%,CD8+T细胞/CD4+T细胞比例由0.42上升至1.10,但对AFP+人肝癌细胞HepG2的杀伤作用无明显变化。（2）AFP158-166特异性TCR转基因T细胞较负载AFP158-166表位肽DC诱导的AFP158-166特异性T细胞对于HepG2肝癌细胞NOD/SCID小鼠模型具有更好的治疗效果。结论：AFP158-166抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞BA15体外刺激AFP158-166特异性TCR转基因T细胞可提高转基因T细胞比例。AFP158-166特异性转基因T细胞过继性免疫治疗有效。
黄华欣[4]（2013）在《小反刍兽疫病毒Nigeria75/1株M蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备和初步应用》文中研究表明小反刍兽疫（PPR）是一种主要感染小反刍动物的急性、烈性传染病，具有高发病率和高死亡率特点。本研究通过RT-PCR方法获得PPRV M基因，分别与原核表达载体pET-32a（+）和pGEX-6P-1连接，构建重组质粒pET-32a-PPRV M和pGEX-6P-1-PPRV M，分别转入E.coli Rosetta感受态细胞诱导表达，SDS-PAGE及可溶性分析结果表明pET-32a-PPRV M和pGEX-6P-1-PPRV M重组蛋白均为包涵体。纯化重组蛋白的Western blot结果表明，2种重组蛋白均具有良好的反应原性。以浓缩的PPRV Nigeria75/1株全病毒蛋白为免疫原，对6-8周龄的雌性BALB/c小鼠进行3次免疫，再以纯化pGEX-6p-1-PPRV M重组蛋白加强免疫。取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，以纯化pET-32a-PPRV M重组蛋白为包被抗原筛选阳性杂交瘤，经三次亚克隆后得到2F6、2B5、3A4和1B5四株单抗细胞株，亚类鉴定结果表明，2F6株和2B5株为IgG3型，3A4株和1B5株为IgM型。Western blot及间接免疫荧光实验表明，4株单抗均能识别重组PPRV M蛋白，且能与Nigeria75/1病毒株特异性结合。单抗染色体分析及单抗细胞传代分析结果表明，筛选出的单抗细胞能稳定分泌特异性的单克隆抗体。用纯化pET-32a-PPRV M蛋白包被酶标板，以2F6株单抗为竞争抗体，建立监测PPRV血清抗体的竞争ELISA方法。通过优化抗原最佳包被量和单抗上清最佳稀释倍数，确定最佳封闭试剂和羊抗鼠酶标二抗的最佳稀释度、孵育时间及显色时间。用建立的竞争ELISA方法对129份临床羊血清样本检测，其检测结果与标准竞争ELISA试剂盒的符合率为95.56%。应用BepiPred分析PPRV M蛋白潜在的B细胞线性表位，以本实验室构建的pCR2.1T-PPRVM质粒为模板，获得三段截短的M基因，分别与表达载体pET-32a（+）及pGEX-6p-1连接，将阳性重组质粒转入E.coli BL21菌株诱导表达，截短重组蛋白经SDS-PAGE及Western blot鉴定，所构建的重组蛋白均获得高效表达，且均具有良好的反应原性。用纯化的pET-32a-PPRV M重组蛋白包被酶标板，建立监测PPRV血清抗体的间接ELISA方法。通过优化抗原最佳包被量和血清稀释倍数，确定最佳封闭试剂和兔抗羊酶标二抗的最佳稀释浓度、孵育时间和显色时间。用建立的间接ELISA方法对129份临床羊血清样本检测，其结果与法国CIRAD-EMVT提供的标准竞争ELISA试剂盒的符合率为92.14%。
贾建伟[5]（2013）在《参桃软肝胶囊抗肝癌作用及其机理初探》文中进行了进一步梳理目的本试验目的在于从体内试验、体外实验实验入手,研究参桃软肝胶囊治疗肝癌的机理。方法1.体外实验：制备低、中、高剂量含药血清,取处于对数增长期的肿瘤细胞,实验分为6组,即正常对照组,正常血清组,低剂量含药血清组,中剂量含药血清组,高剂量含药血清组和阳性对照组。采用MTT法检测含药血清对于HepG2人肝癌细胞增殖情况的影响；采用流式细胞术检测含药血清对HepG2人肝癌细胞的早期凋亡情况的影响；采用RT-PCR检测含药血清对HepG2人肝癌细胞内bax和bcl-2mRNA水平的影响；采用wb检测含药血清对细胞内bax、bcl-2和活化的caspase-3蛋白水平的影响。2.体内试验：建立H22荷瘤小鼠模型,将荷瘤小鼠随机分为五组,分别为阴性对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和阳性对照组,每组8只。阴性对照组（生理盐水）,低剂量组（参桃软肝胶囊混悬液0.35g/kg）,中剂量组（参桃软肝胶囊混悬液0.7g/kg）,高剂量组（参桃软肝胶囊混悬液1.4g/kg）,阳性对照组（顺铂注射液2.0mg/kg）,每天2次,共3周,停药后24小时取材。观察药物对荷瘤小鼠的抑瘤作用以及促进肿瘤组织内肿瘤细胞凋亡作用；检测荷瘤小鼠血浆及肿瘤组织内TNF-α、IL-1β、IL-6的含量、检测荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞对H22细胞的杀伤活性、检测荷瘤小鼠外周血及脾脏淋巴细胞CD4+和CD8+细胞比例,以药物对荷瘤小鼠的免疫功能影响；针对肿瘤组织,采用免疫组化法检测CD34和VEGF水平、采用RT-PCR法检测bcl-2和bax mRNA水平、采用免疫组化检测活化的caspase-3水平、采用western blot方法检测bcl-2,bax和活化的caspase-3的蛋白水平,以探讨参桃软肝胶囊的抗肝癌机制。结果1.体外实验1.1参桃软肝胶囊含药血清作用于HepG,人肝癌细胞后,与用药前相比,形态发生改变,细胞数量减少。1.2含药血清对HepG2人肝癌细胞增殖的影响,正常大鼠的血清对人肝癌细胞HepG2的增殖没有明显的影响（P>0.05）,低、中和高剂量含药血清和顺铂都能够明显抑制肝癌细胞的增殖（P<0.05）。其中,低、中和高剂量含药血清处理组随着血清中中药有效成分浓度的增加,抑制细胞增殖的能力逐渐加强,呈现一定的剂量依赖关系。1.3流式细胞术结果显示,普通培养的人肝癌细胞HepG2自然凋亡率比较低,约为5%-10%左右,正常的大鼠血清对HepG2细胞的凋亡没有明显的影响,低、中和高剂量含药血清和顺铂都能够明显诱导HepG2细胞的凋亡。1.4RT-PCR结果显示,正常大鼠的血清对人肝癌细胞HepG2胞内Bax和Bcl-2mRNA水平没有明显的影响（P>0.05）,低中高剂量的含药血清和阳性化疗药物都能够明显诱导Bax基因的转录（P<0.01）,抑制Bcl-2基因的转录（P<0.01）,明显上调Bax/Bcl-2基因的比值。其中低中高剂量含药血清组Bax mRNA水平的上调,Bcl-2mRNA水平的下调,同药物浓度呈现一定的剂量依赖关系。1.5western blot结果显示,正常大鼠的血清对人肝癌细胞HepG2胞内Bax、Bcl-2和活化的caspase-3蛋白水平没有明显的影响（P>0.05）,低、中、高剂量的含药血清和阳性化疗药物都能够明显诱导Bax蛋白的表达,抑制Bcl-2蛋白的表达,明显上调Bax/Bcl-2蛋白的比值,活化caspase-3。其中,低、中、高剂量组中,随着药物浓度的增加,这种作用不断增强。2.体内实验2.1模型组肿瘤最大,重量最重；阳性对照组肿瘤最小,肿瘤最轻；低剂量给药组、中剂量给药组和高剂量给药组介于它们之间,随着药物浓度的增加,抑瘤效果不断增强,同模型组相比,各组瘤重明显的降低,具有显着差异（P<0.01）。2.2模型组小鼠肿瘤组织本身就存在一定的自然凋亡率,在2%-5%左右,低、中、高剂量给药处理和腹腔注射阳性化疗药物,都能够明显的在体内诱导肿瘤细胞的凋亡,细胞的凋亡率明显增加,其中以阳性对照组最为明显（50%-70%）,其次为中药高剂量组（40%-60%）,接着是中药中剂量组（30%-50%）,最次是中药低剂量组（20%-30%）。2.3荷瘤小鼠血浆中细胞因子的含量明显的低于正常对照组（P<0.01）,给予中药处理,随着药物浓度的增加,能够明显的增加血浆内细胞因子的含量,同模型组比,具有明显的差异（P<0.01）；阳性化疗药物处理的小鼠,血浆内这些细胞因子的含量并没有得到改善（P>0.05）。小鼠肿瘤组织内这些细胞因子的含量也有类似于血浆的趋势,中药组均能明显提高局部肿瘤组织内细胞因子的含量,从而改善机体的免疫状态,而阳性化疗药物则没有此作用。2.4同正常小鼠比,荷瘤小鼠外周血和脾脏T淋巴细胞中CD4+细胞比例明显降低,CD8+细胞比例明显升高,CD4+/CD8+的比值明显降低。中药低、中、高剂量组均能明显改善小鼠的细胞免疫功能（P<0.01）,而阳性化疗药物则没有改善作用（P>0.05）。2.5同正常小鼠相比,荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞对H22细胞的杀伤活性明显减弱,中药低、中、高剂量组能够明显增强荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞的杀伤活性（P<0.01）,而且杀伤活性均高于正常非荷瘤小鼠。阳性化疗药物对荷瘤小鼠脾脏淋巴细胞的杀伤活性没有改善作用（P>0.05）。2.6同模型组,阳性对照组、中药低、中、高剂量组MVD计数明显减少,具有明显的统计学意义（P<0.01）；各组之间VEGF表达水平无明显差异。2.7中药低、中、高剂量组的中药和阳性化疗药物都能够明显诱导Bax基因的转录（P<0.01）,抑制Bcl-2基因的转录（P<0.01）,明显上调Bax/Bcl-2基因的比值。其中低中高剂量组Bax mRNA水平的上调,Bcl-2mRNA水平的下调,同药物浓度呈现一定的剂量依赖关系。2.8模型组中,活化的caspase-3日性细胞比例最低,阳性对照组最高,低中高剂量中药处理组介于2者之间,呈现一定的剂量依赖关系。2.9低中高剂量的中药和阳性化疗药物都能够明显诱导Bax蛋白的表达,抑制Bcl-2蛋白的表达,明显上调Bax/Bcl-2蛋白的比值,其中低中高剂量组中,随着药物浓度的增加,这种作用不断增强。小鼠肿瘤组织内活化的caspase-3蛋白水平表达趋势也与上面免疫组化的结果类似,与模型组相比,低中高剂量组和阳性组小鼠肿瘤组织内活化的caspase-3蛋白水平明显增加,其中低中高剂量组中,活化的casapse-3蛋白水平的增加同剂量呈现一定的依赖关系。结论1.参桃软肝胶囊含药血清可能抑制HepG2人肝癌细胞生长,并诱导其凋亡。2.参桃软肝胶囊可能抑制H22肝癌小鼠肿瘤细胞生长,并诱导凋亡的作用。3.参桃软肝胶囊可能具有改善机体的免疫功能状态的作用。4.参桃软肝胶囊可能具有抑制肿瘤血管生成的作用。5.参桃软肝胶囊可能通过调节Bax/Bcl-2比值,活化casapse-3蛋白来实现抗肿瘤的作用。
叶芬[6]（2011）在《PRRSV、CSFV和PCV-2多重PCR诊断方法及基因芯片诊断方法的建立》文中研究表明近年来,猪的疫病日益呈现复杂化和严重化趋势,混合感染的比例大幅度上升,这一现状也增加了临床和实验室诊断的难度。而猪瘟（Classical swine fever,CSF）、猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）和猪圆环病毒病（Porcine circovirus type 2, PCV 2）是目前威胁我国猪的主要传染性疾病。所以建立集成的CSF、PRRS、PCV2的多重PCR及基因芯片诊断方法显得十分必要。本研究利用NCBI基因组比对方法挖掘PRRSV、PCV-2、CSFV基因组中的特异性序列,并结合引物及探针设计原则,设计和筛选相关PCR特异性引物及基因芯片的寡核苷酸探针。同时整合已报道的检测探针和引物,利用筛选和整合的引物和探针建立并优化多重PCR体系和基因芯片方法,检测上述三种猪病毒性疾病。主要研究结果如下：1.病毒的增殖与鉴定利用MARC-145、PK-15、ST三种细胞分别增殖出了PRRSV欧洲型毒株、PRRSV美洲型毒株、PCV-2、CSFV,其中PRRSV欧洲型、PRRSV美洲型毒株的增殖结果利用观察其引起MARC-145细胞发生细胞病变进行初步判定, PCV-2、CSFV的增殖结果利用间接免疫荧光进行初步判定,（?）表明这几种病毒均在相应的易感细胞中得到了有效的增殖。2.多重PCR检测体系根据GenBank中已发表的PRRSV欧洲型毒株、PRRSV美洲型毒株、CSFV和PCV-2 4个病毒株基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,设计合成4对特异性引物,然后进行单基因PCR反应特异性验证,在此基础上建立和优化了4种病原的多重PCR检测体系,其最低检测限可达10-4-10-5数量级,整个检测时间在4h以内。并分别用多重PCR和单项PCR/ RT-PCR检测60份临床病料,符合率为100%,表明该检测方法可以用于临床病料的检测,具有较大的应用价值,可广泛应用于临床检验。3.基因芯片检测方法根据GenBank中已发表的PRRSV、CSFV和PCV-2的病毒基因序列,设计合成特异性引物和特异性较强的60mer左右的寡核苷酸探针,并将探针按所设计阵列固定于表面经氨基化修饰的玻片上,制备出寡核苷酸芯片。然后进行引物标记及特异性验证,在此基础上建立了带标记引物的多重PCR检测体系,从而产生大量可与寡核苷酸探针特异性互补的带标记的DNA片段。将标有荧光染料的扩增产物与芯片上寡核营酸探针杂交,扫描、分析芯片上荧光信号。试验结果表明,芯片上各样本对应探针位点呈现阳性荧光信号,而阴性对照和空白对照则基本不能检测到荧光信号。并分别用基因芯片检测方法和PCR/RT-PCR检测60份临床病料,两者符合率高达92%,结果表明该检测技术能够用于临床病料的检测及快速诊断PRRSV、CSFV和PCV-2。
李璐[7]（2010）在《生物单分子定量检测新方法及电化学发光共振能量转移》文中研究说明本文分为生物单分子定量检测新方法及电化学发光共振能量转移两部分,其中第一章至第六章为第一部分,第七章至第九章为第二部分。第一章主要对生物单分子激光诱导荧光检测涉及的各种检测方法及荧光探针进行了简要综述。在生物单分子激光诱导荧光检测中涉及的方法主要有共聚焦荧光显微术、全内反射荧光显微术、落射荧光显微术、双光子或多光子荧光显微术等。本章着重介绍了这些方法的原理及其在生物单分子定量研究中的应用,同时也对常用的荧光探针（包括有机荧光染料、纳米粒子、荧光蛋白及稀土离子等）的性质和应用做了简单介绍。第二章中我们建立了一种电化学吸附富集结合全内反射荧光显微术超灵敏的单分子成像定量新方法。我们选择罗丹明6G、Alexa-488标记的羊抗鼠IgG、以及罗丹明6G标记的DNA作为研究对象,利用电化学富集将这些分子吸附到镀有铟锡氧化物的光透导电玻片上,然后利用高灵敏的电子增强型电感耦合器（EMCCD）对玻片上的荧光分子进行全内反射成像。通过一个三维移动控制器移动玻片实现对玻片的顺次成像,对每一个样品获取100帧图片,并对其上对应单分子的荧光点计数。电化学富集的方法提高了已报道的单分子检测方法的灵敏度,结果显示浓度范围在5×10-15到5×10-12 mol/L的罗丹明6G,3×10-15到2×10-12 mol/L的Alexa-488标记的羊抗鼠IgG和3×10-15到2×10-12 mol/L罗丹明6G标记的DNA荧光点数和物质的浓度都具有良好的线性关系。第三章中我们建立了一种超灵敏的检测1.8 nL样品中蛋白质的单分子计数微阵列分析方法。有关微阵列芯片的单分子检测仅有少量文献报道,且这些工作都未能实现整个阵列点的成像。由于单分子检测是以检测到的单分子数作为定量基础,所以提高单分子计数微阵列分析法灵敏度的关键是将整个阵列点上的单分子完全成像。我们首先设计并研究出了微阵列单分子成像系统以实现整个阵列点的单分子成像,其次以量子点取代传统的有机荧光探针对生物分子进行标记,并针对量子点荧光闪烁问题提出了一种捕获微阵列上全部量子点图像的方法。再通过乙醇胺与牛血清白蛋白共同封闭基底降低背景使单分子计数微阵列分析法测定蛋白质的灵敏度比文献报道的方法提高100倍,达到1.8×10-21 mol（1080个分子）。该方法检测样品所需体积极小（1.8 nL）,因此可以用来实现珍贵或者少量样品的多次取样测定。我们利用此方法测定了不同时间下人蜕膜基质细胞培养液中骨桥蛋白的含量,研究了活细胞中骨桥蛋白的表达动力学。第四章中我们利用单分子计数微阵列分析法实现了单细胞内无PCR扩增的多种基因表达的定量测定。首先用将不同的DNA1 s点样至玻片上形成形成10个亚阵列,每个亚阵列包括9个点,每个阵列点的直径约为300μm。3μL由单细胞中的mRNA反转录的cDNAs溶液滴至玻片上的亚阵列,不同的cDNAs通过杂交反应结合至亚阵列的各个点上。然后,通过与QDs标记的检测DNA2（QDs-DNA2）杂交反应,cDNAs被QDs标记。最后,使用我们在第三章中应用的单分子阵列成像设备对微阵列成像,对应单个cDNA的亮点被计数定量。这一方法可以检测至3μL样品体积中2×10-16 mol/L的DNA（360个分子）,利用微阵列,10个细胞中9种基因表达可以被平行定量。实验的结果依赖于亮点的个数而不是荧光强度,减少了测定误差,保证了结果的可靠性。此方法实现了无PCR扩增的单细胞中多个基因表达的同时定量测定。第五章中我们利用亚微米粒径的磁珠作为标记物发展了一种新的简单易推广的可视单分子检测方法。以往单分子光学检测通常采用激光诱导荧光方法,常常需要高灵敏度的昂贵检测仪器,且荧光检测会受到荧光背景干扰和荧光标记物淬灭等影响。我们用粒径为300 nm的磁珠对DNA单分子标记,这些磁珠在普通光学显微镜下可以观察到。此可视单分子检测方法可以检测3μL样品中浓度低至4.0×10-16mol/L的DNA（720个分子）,并实现了单细胞内多种基因的同时测定。这种直接可视的单分子检测方法有很多优点,首先普通光学显微镜即可对单分子信号成像,无需特殊的高灵敏仪器设备；其次由于单分子信号为磁珠的普通光学图像,背景不会干扰检测结果,且信号不会淬灭,因此保证了定量检测结果的可靠性。第六章中我们利用链酶亲和素修饰的磁珠结合AMCA,FAM及Cy5三种荧光染料标记的DNA,制备各种颜色的编码微珠。单个微珠上可以结合上千个染料分子,根据结合三种染料的比例不同,可以实现多种颜色微珠的制备。我们利用制备的各种微珠实现不同生物分子的单分子编码检测。第七章中我们对荧光共振能量转移（FRET）的原理及其在生物分析方面应用作了介绍。共振能量转移作为一种有力的生物分析工具在生物分子构型测定、免疫分析、核酸检测等方面广泛应用。半导体量子点（quantum dots, QD s）由于其优良的光学性能而被广泛应用于FRET体系中,将量子点作为能量供体或者受体引入生物发光共振能量转移（BRET）体系和化学发光共振能量转移（CRET）体系同样引起了人们的兴趣,本章也对QD在共振能量转移体系中的应用进行了综述。第八章中我们建立了一种新的共振能量转移模式—电化学发光共振能量转移（ECRET）.以往报道的共振能量转移根据供体激发方式的不同分为荧光共振能量转移、生物发光共振能量转移、化学发光共振能量转移。以电化学发光作为光源激发供体只有能量被受体淬灭的研究,而受体得到能量发射荧光的现象未见报道。我们以鲁米诺作为能量供体,量子点作为能量受体实现了ECRET。本章对基于该体系的ECRET进行了理论计算,而且将ECRET应用至测定蛋白质之间相互作用和蛋白质构型的变化。第九章中我们研究了量子点作为能量供体,Cy5作为能量受体的电化学发光共振能量转移体系。对基于该体系的ECRET进行了理论计算,并将ECRET应用至测定蛋白质构型的变化。基于QDs-Cy5体系的ECRET不仅可以进行DNA的定性定量研究,也是蛋白质相互作用、蛋白质构型测定研究中一个有用的工具,它将为生命科学提供一种新的研究方法。
赵英,牛建新[8]（2008）在《生物素标记cDNA探针检测苹果锈果类病毒》文中研究说明以含苹果锈果类病毒（ASSVd）全长序列的重组质粒PUC为模板DNA,加入ASSVd类病毒特异性引物,应用聚合酶链式反应技术（PCR）合成了生物素标记的cDNA探针,在斑点杂交反应中,探针最适使用浓度为1/10,探针检测感病的ASSVd类病毒的最大稀释倍数是1/100。利用制备的探针进行田间检测,结果与RT-PCR检测结果一致,阴性对照均无杂交信号出现。
王学林[9]（2008）在《旋毛虫抗肿瘤作用机制研究》文中研究表明针对性强、疗效好、毒副作用较小的生物疗法已成为人们关注的焦点,被肿瘤界认同为肿瘤的第四种治疗方法,并被认为是最有希望彻底治愈肿瘤的方法。因此,对抗肿瘤蛋白的研究将对肿瘤和癌症的治疗将产生深远意义并将重燃肿瘤和癌症患者的生命之光。旋毛虫属于嘴刺目（Order Encplida）,毛形科（Family Trichinellidae）,毛形属（Genus Trichinella）。旋毛虫病是由旋毛虫感染人或动物后引起的一种严重的人兽共患性疾病,但罕见感染旋毛虫后致死的报道。国内外学者在对旋毛虫的研究过程中,发现旋毛虫能够提高宿主对肿瘤的抵抗力,试验小鼠在感染旋毛虫后对肿瘤细胞在体内的增殖有抑制作用,或对移植进体内的肿瘤块的生长有抑制作用,但对不同的肿瘤的作用效果不同。有的肿瘤移植进体内或肿瘤细胞进入体内后根本不生长,而有的则是生长变慢。目前的资料表明对旋毛虫抗肿瘤活性成份的研究虽未有报道,但是随着展示文库技术日趋成熟,使旋毛虫抗肿瘤活性成份分离、鉴定乃至走向临床的研究必将成为抗肿瘤药物研究的新宠。我们的实验结果表明事先口服感染400条旋毛虫的ICR鼠,7天后接种MFC、H22、S180实体瘤,11天后,抑瘤率分别是72.35±18.82%、54.22±23.52%、5 5.62±28.05%;IC R小鼠尾静脉注射旋毛虫总蛋白70mg/kg后对MFC、H22、S180实体瘤的抑制率为68.99±7.46%, 74.49±13.38% , 86.88±11.09%; P<0.05;旋毛虫的虫体蛋白0.140mg/ml对MFC、H22、S180、K562、H7402的体外抑制率为45.65±6.23%, 40.39±7.28%, 38.21±9.06%, 50.63±4.03%, 48.03±8.72%;且统计学处理后P〈0.05。划痕和侵袭实验表明旋毛虫的虫体蛋白可抑制肿瘤细胞增殖并具有对抗肿瘤细胞侵袭的作用。我们对旋毛虫虫体蛋白作用后的K562、H7402进行TUNEL检测,高、中、低三个剂量组都不同程度的发生了凋亡,DNA凝胶电泳观察到肿瘤细胞DNA片段化。通过免疫组化、流氏细胞仪检测旋毛虫虫体蛋白对H7402的p53、Bcl-2表达发现旋毛虫虫体蛋白可上调p53的表达,下调Bcl-2的表达。RT-PCR检测表明旋毛虫虫体蛋白也可影响IL-2、IL-10、DR4的表达。以上结果表明在旋毛虫虫体蛋白中存在抗肿瘤活性成份,且该活性成份参与调控K562、H7402的凋亡。噬菌体展示技术是由美国Missouri大学Smith G P等于1985年首先建立起来的一种新的生物技术,噬菌体展示肽库技术是一种用于筛选功能性多肽的生物技术。编码多肽的DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因重组后,以融合蛋白的形式在噬菌体表面表达出多肽序列,实现了表型和基因型的统一。将化学合成的随机寡核苷酸序列插入噬菌体基因组,在噬菌体表面表达出各种氨基酸组合的短肽,通过与特定的靶标反应,使展示特定蛋白的噬菌体从表达有各种外源性蛋白的噬菌体肽库中筛选出来,通过感染大肠杆菌使选择出的噬菌体扩增,然后进行序列测定,获得相应的结构和功能信息,实现了高通量筛选,成为一种有效的分子筛选方法。在研究蛋白质间相互作用,寻找酶和受体的激动剂和拮抗剂,研制新型诊断试剂和疫苗以及在抗肿瘤药物研究中都有重要价值。Novagen公司开发的T7噬菌体展示系统构建旋毛虫噬菌体cDNA展示文库,由于T7噬菌体展示系统能构建和筛选更大的文库,能使研究者更有可能发现“沧海一粟”的目标分子。T7噬菌体为裂解性噬菌体,其展示的蛋白无需分泌,这一优点使更多的序列可能被展示。插入序列被克隆到T7载体基因的C-端,可以使带有终止密码子的插入子得以表达和展示。因此我们以获得旋毛虫抗肿瘤蛋白为研究目标,通过构建旋毛虫T7噬菌体cDNA展示文库,利用该文库采用有机相多细胞亲和淘选,筛选出和人白血病细胞系K562、人肝癌细胞系H7402特异结合的含一致序列的氨基酸短肽,通过探针杂交法,进而从λZAP噬菌体cDNA文库中钓取到cDNA全长序列。利用相关软件分析表明该蛋白分子量为16736.3,分子式为C765H1163N205O205S7,疏水性指数是84.04,位于细胞质的可能性较大,α螺旋占17.12%无规则卷曲占58.22%,肽链延伸占17.12%.检索显示其为tRNA-内含子核酸内切酶,与ProtParam tool推测结构域一致。预测该蛋白的cAMP和cGMP依赖性磷酸化位点[RK]（2）-x-[ST]位于138到141 RKVS,蛋白激酶C磷酸化位点[ST]-x-[RK]位于75到77 TWR和133到135 SDK。酪蛋白激酶II磷酸化位点[ST]-x（2）-[DE]位于2到5 TSNE、13到16 SAAD、75到78 TWRD、109到112 TLAD、143到146 TLSD。该蛋白为一稳定蛋白。这为我们进一步研究其抗肿瘤特性,以及对肿瘤的靶向治疗奠定了基础。
王险峰[10]（2006）在《四个H22克隆细胞株的RAPD特征及H22-H8D8传代细胞的生物学特性研究》文中提出目的:可移植性肿瘤动物模型,可以客观的模拟人类肿瘤的发生、发展过程。因此,在人类肿瘤的发病机理和抗肿瘤药物的筛选研究中被广泛采用。由于肿瘤细胞株在长期的保存传代过程中,受到各种不稳定因素影响。例如细胞遗传污染和基因变异等。故经过一段时间之后,肿瘤细胞的遗传物质可能发生变异,并导致其生物学特性的改变,从而降低肿瘤动物模型的均一性和可比对性。因此要想保证肿瘤动物模型的稳定性,必须对肿瘤细胞株进行质量监控。小鼠肝癌22（H22）是最常用的小鼠可移植性肿瘤细胞系之一,广泛应用于小鼠肿瘤动物模型的复制。由于该细胞株建立已有五十多年历史,许多学者报告它已发生较大遗传变异,并且在不同研究机构中所保存的细胞株亦有很大差异。刘军须等对H22细胞株进行了克隆化处理,得到经筛选的4个克隆细胞株,分别为H22-H8D8、H22-H2C4、H22-H2G4、H22-H2E10,其中H22-H8D8克隆株基本符合H22原细胞系生物学特性,并具有性质稳定和表现均一的特点,已经被中国典型培养物保藏中心收藏。目前他们选用已知的单抗和核酸探针与H22-H8D8进行反应,初步建立肿瘤细胞株遗传变异的检查方法。随着分子生物学技术的发展,许多分子生物学的方法已逐渐运用到肿瘤细胞的遗传检测中。随机扩增多态性DNA
二、生物素标记的6种cDNA探针检测S180及其克隆细胞株mRNA的表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、生物素标记的6种cDNA探针检测S180及其克隆细胞株mRNA的表达（论文提纲范文）
（1）大鼠体内生物素示踪重组人胶原蛋白的方法研究（论文提纲范文）
| 1 仪器、设备与材料 |
| 2 方法与结果 |
| 2.1 超级生物素标记重组人胶原蛋白 |
| 2.1.1 重组人胶原蛋白的标记 |
| 2.1.2 重组人胶原蛋白标记效率检测 |
| 2.1.3 结果 |
| 2.2 超级生物素标记重组人胶原蛋白DAB显色验证 |
| 2.2.1验证方法 |
| 2.2.2 验证结果 |
| 2.3 动物实验 |
| 2.3.1 供试样品制备 |
| 2.3.2 实验步骤 |
| 2.3.3 实验动物观察结果 |
| 2.4 制备石蜡切片及染色 |
| 2.4.1 切片 |
| 2.4.2 染色 |
| 2.4.3 组织切片结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（2）HPV16 RNA非扩增型核酸杂交捕获检测技术的体系研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 概述 |
| 1.1. 乳头瘤病毒 |
| 1.1.1. 分类 |
| 1.1.2. 形态及基因组结构 |
| 1.1.3. 编码蛋白 |
| 1.1.4. 病毒复制 |
| 1.1.5. 感染自然史 |
| 1.2. 乳头瘤病毒与癌症 |
| 1.2.1. 乳头瘤病毒致瘤潜能 |
| 1.2.2. HPV感染与子宫颈癌 |
| 1.3. HPV感染的检测方法 |
| 1.3.1. 培养法 |
| 1.3.2. 细胞与组织学法 |
| 1.3.3. 血清学法 |
| 1.3.4. 基于DNA的检测方法 |
| 1.3.5. 基于RNA的检测方法 |
| 第二章 抗体捕获免疫检测法的建立 |
| 2.1. 引言 |
| 2.2. 材料与方法 |
| 2.2.1. 设计、合成互补的DNA、RNA寡核苷酸探针 |
| 2.2.2. 人工合成DNA、RNA片段的退火杂交 |
| 2.2.3. 抗体包被浓度的优化 |
| 2.2.4. 退火缓冲液离子强度的优化 |
| 2.2.5. 对人工合成片段的检测及其灵敏度的分析 |
| 2.2.6. HPV16、18型E6、E7基因片段的克隆 |
| 2.2.7. 克隆HPV16 E6、E7基因片段的条件优化 |
| 2.2.8. 克隆HPV18 E6、E7基因片段的条件优化 |
| 2.2.9. 设计针对HPV16 E6、E7基因片段的寡核苷酸探针 |
| 2.2.10. 体外转录HPV16 E6、E7基因片段制备RNA |
| 2.2.11. 对体外转录RNA片段的检测及灵敏度的分析 |
| 2.2.12. 对体外转录RNA片段的检测及其特异性分析 |
| 2.2.13. 检测体外转录RNA片段的条件优化 |
| 2.2.14. HPV16各mRNA片段的DNA探针的合成 |
| 2.2.15. 检测CaSki细胞株中total RNA (Trizol法提取) |
| 2.2.16. 检测CaSki及SiHa mRNA的条件优化 |
| 2.2.17. 检测细胞株中tota RNA(试剂盒提取) |
| 2.2.18. 检测试剂盒提取细胞株total RNA(化学发光法) |
| 2.2.19. Q-PCR定量细胞株HPV拷贝数 |
| 2.2.20. 检测试剂盒提取临床样本total RNA(化学发光法) |
| 2.2.21. Q-PCR定量临床样本中HPV病毒拷贝 |
| 2.3. 实验结果 |
| 2.3.1. 人工合成DNA、RNA寡核苷酸片段的退火杂交 |
| 2.3.2. 检测方案的建立和检测条件的优化 |
| 2.3.3. 检测人工合成DNA-RNA寡核苷酸片段 |
| 2.3.4. HPV16、HPV18型E6、E7基因片段的克隆 |
| 2.3.5. 克隆HPV16 E6、E7基因片段条件优化 |
| 2.3.6. 克隆HPV18 E6、E7基因片段条件优化 |
| 2.3.7. 体外转录HPV16 E6、E7基因片段制备RNA |
| 2.3.8. 对体外转录RNA片段的检测及灵敏度分析 |
| 2.3.9. 对体外转录RNA片段的检测及特异性分析 |
| 2.3.10. 检测体外转录RNA片段的条件优化 |
| 2.3.11. 检测细胞株提取total RNA (Trizol法提取) |
| 2.3.12. 检测CaSki及SiHa mRNA(磁珠法纯化) |
| 2.3.13. 检测试剂盒提取细胞株total RNA (TMB显色法) |
| 2.3.14. 检测试剂盒提取细胞株total RNA(化学发光法) |
| 2.3.15. 抗体捕获免疫检测法与Q-PCR法检测细胞株中HPV结果比较 |
| 2.3.16. 抗体捕获免疫检测法与Q-PCR法检测临床样本中HPV结果比较 |
| 2.4. 讨论 |
| 第三章 PLL固定免疫检测法的建立 |
| 3.1. 引言 |
| 3.2. 材料与方法 |
| 3.2.1. 设计、合成互补的DNA、RNA寡核苷酸片段 |
| 3.2.2. 人工合成DNA、RNA探针的退火杂交 |
| 3.2.3. 检测方案具体实施步骤 |
| 3.2.4. 检测方案的条件优化 |
| 3.2.5. 检测人工合成DNA-RNA寡核苷酸片段 |
| 3.2.6. 检测体外转录RNA片段的灵敏度分析 |
| 3.2.7. 检测体外转录RNA片段的特异性分析 |
| 3.2.8. 检测细胞株total RNA (Trizol法提取) |
| 3.2.9. 检测细胞株及临床样本total RNA (Trizol法提取) |
| 3.2.10. 检测细胞株及临床样本total RNA的条件优化 |
| 3.2.11. 检测细胞株mRNA(磁珠法纯化) |
| 3.2.12. 检测临床样本mRNA(磁珠法纯化) |
| 3.2.13. 检测细胞株及临床样本mRNA的条件优化 |
| 3.2.14. 临床样本mRNA的检测及灵敏度分析 |
| 3.2.15. 细胞株及临床样本mRNA的检测及特异性分析 |
| 3.2.16. 探究检测结果无特异性的原因 |
| 3.2.17. 单条探针信号情况探索 |
| 3.2.18. 新探针组合的筛选及其特异性分析 |
| 3.3. 实验结果 |
| 3.3.1. 人工合成DNA、RNA片段退火杂交 |
| 3.3.2. 探索检测方案的实施步骤 |
| 3.3.3. 检测方案的条件优化 |
| 3.3.4. 人工合成片段的检测及灵敏度分析 |
| 3.3.5. 体外转录片段的检测及灵敏度分析 |
| 3.3.6. 体外转录片段的检测及特异性分析 |
| 3.3.7. 检测细胞株total RNA (Trizol法提取) |
| 3.3.8. 检测临床样本及细胞株total RNA (Trizol法提取) |
| 3.3.9. 检测细胞株mRNA(磁珠法纯化) |
| 3.3.10. 检测细胞株及临床样本mRNA(磁珠法纯化) |
| 3.3.11. 检测细胞株及临床样本mRNA的条件优化 |
| 3.3.12. 临床样本mRNA的检测及灵敏度分析 |
| 3.3.13. 细胞株及临床样本mRNA的检测及特异性分析 |
| 3.3.14. 检测结果无特异性的原因探索 |
| 3.3.15. 单条探针信号情况探索 |
| 3.3.16. 新探针组合的筛选及特异性分析 |
| 3.4. 讨论 |
| 第四章 总结与展望 |
| 4.1. 论文总结 |
| 4.2. 论文的创新点 |
| 4.3. 展望 |
| 参考文献 |
| 已发表与待发表的论文 |
| 致谢 |
| 附录1: 主要试剂的配制方法 |
| 附录2: 主要实验操作方法 |
（3）AFP158-166特异性TCR转基因T细胞治疗肝癌的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、AFP_(158-166)特异性TCR转基因T细胞的构建 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 筛选基因分型HLA-A0201健康志愿者 |
| 1.2.2 建立AFP_(158-166)特异性T细胞克隆 |
| 1.2.3 克隆AFP_(158-166)特异性TCRα和TCRβ基因,构建表达特异性TCR的慢病毒载体 |
| 1.2.4 体外制备并扩增AFP_(158-166)特异性TCR转基因T细胞 |
| 1.2.5 AFP_(158-166)特异性TCR转基因T细胞功能检测 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 肝细胞肝癌的生物治疗 |
| 1.3.2 AFP在肝细胞肝癌诊治中的意义 |
| 1.3.3 人树突细胞的培养与生物学功能 |
| 1.3.4 抗原特异性T细胞的激活增殖与检测分离 |
| 1.3.5 TCR多样性及AFP_(158-166)抗原特异性TCR基因克隆 |
| 1.3.6 AFP_(158-166)特异性TCR转基因T细胞的体外制备和功能检测 |
| 1.4 小结 |
| 二、AFP_(158-166)抗原肽与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞的构建 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 流式细胞术鉴定BJAB细胞表型 |
| 2.2.3 辐照对BJAB细胞表型,增殖及存活影响 |
| 2.2.4 质粒CS-CDF-EF-1-afpIL15-PRE(JA15)浓度 |
| 2.2.5 质粒CS-CDF-EF-1-afpIL15-PRE(JA15)的鉴定 |
| 2.2.6 质粒CCS-IL15-Lv201的鉴定 |
| 2.2.7 荧光倒置显微镜评估细胞转染情况 |
| 2.2.8 FCM评估细胞转染情况 |
| 2.2.9 ELISA检测BA15对IL-15表达 |
| 2.2.10 BA15对eGFP,IL-15与AFP158-166抗原肽的稳定表达 |
| 2.2.11 BA15体外刺激AFP特异性T细胞克隆性增殖 |
| 2.2.12 AFP特异性T细胞对AFP~+肝癌细胞特异性杀伤作用 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 人工抗原提呈细胞与肿瘤特异性T细胞过继性免疫治疗 |
| 2.3.2 IL-15与肿瘤特异性T细胞过继性免疫治疗 |
| 2.3.3 AFP抗原与IL-15协同表达人工抗原递呈细胞的构建和鉴定 |
| 2.4 小结 |
| 三、AFP_(158-166)特异性转基因T细胞过继性免疫治疗的实验研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 体外实验 |
| 3.2.2 体内实验 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 肿瘤特异性TCR转基因T细胞免疫治疗进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
（4）小反刍兽疫病毒Nigeria75/1株M蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备和初步应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 病原特征 |
| 1.1.2 生物学特性 |
| 1.1.3 分子生物学研究 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 小反刍兽疫诊断方法研究 |
| 1.3.1 病毒分离 |
| 1.3.2 病毒 RNA 检测 |
| 1.3.3 血清学检测 |
| 1.4 展望 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 小反刍兽疫病毒 NIGERIA75/1 株 M 蛋白的原核表达及鉴定 |
| 摘要 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株、载体、病毒及细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 实验所用主要试剂及配制方法 |
| 2.1.4 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 PPRV M 基因稀有密码子分析 |
| 2.2.2 病毒扩增 |
| 2.2.3 引物设计 |
| 2.2.4 提取病毒总 RNA |
| 2.2.5 RT-PCR 扩增 PPRV M 基因及纯化 |
| 2.2.6 PPRV M 基因与 pCR 2.1T 载体连接、转化及阳性克隆鉴定 |
| 2.2.7 重组表达质粒构建和鉴定 |
| 2.2.8 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.2.9 重组蛋白可溶性分析 |
| 2.2.10 重组蛋白纯化及定量 |
| 2.2.11 重组蛋白 Western blot 鉴定 |
| 2.3 实验结果与分析 |
| 2.3.1 PPRV M 基因稀有密码子分析结果 |
| 2.3.2 PPRV Nigeria75/1 疫苗弱毒株扩增结果 |
| 2.3.3 PCR 鉴定 PPRV M 基因 |
| 2.3.4 重组克隆质粒双酶切鉴定 |
| 2.3.5 双酶切鉴定重组表达质粒 |
| 2.3.6 重组蛋白的诱导表达 |
| 2.3.7 pET-32a-PPRV M 重组蛋白可溶性分析 |
| 2.3.8 重组蛋白纯化及定量 |
| 2.3.9 重组蛋白 Western blot 鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 小反刍兽疫病毒 NIGERIA75/1 株 M 蛋白单克隆抗体制备及鉴定 |
| 摘要 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 蛋白、实验动物与细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器及耗材 |
| 3.1.4 主.要.溶.液.配.制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 PPRV 浓缩抗原制备 |
| 3.2.2 BLAB/C 小鼠免疫程序 |
| 3.2.3 三免后小鼠血清效价测定 |
| 3.2.4 建立杂交瘤细胞株 |
| 3.2.5 冻存和复苏杂交瘤细胞 |
| 3.2.6 单克隆抗体鉴定 |
| 3.2.7 大量制备单克隆抗体 |
| 3.3 实验结果分析 |
| 3.3.1 三免后小鼠血清抗体效价测定 |
| 3.3.2 单克隆细胞株的建立 |
| 3.3.3 单克隆抗体亚类鉴定结果 |
| 3.3.4 单克隆抗体抗原表位分析 |
| 3.3.5 单克隆抗体 WESTERN BLOT 鉴定 |
| 3.3.6 单克隆抗体间接免疫荧光实验 |
| 3.3.7 单克隆抗体染色体分析 |
| 3.3.8 小鼠腹水中单抗效价测定 |
| 3.3.9 纯化的单克隆抗体 SDS-PAGE 分析 |
| 3.3.10 单克隆抗体细胞稳定性评价 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 小反刍兽疫病毒 M 蛋白单抗竞争 ELISA 的建立 |
| 摘要 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 蛋白、单抗上清及血清 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备及耗材 |
| 4.1.4 主要溶液配制 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 pET-32a-PPRV M 蛋白最佳包被浓度及单抗上清最佳稀释度确定 |
| 4.2.2 最佳封闭剂选择 |
| 4.2.3 山羊抗小鼠 IgG-HRP 最佳工作浓度确定 |
| 4.2.4 山羊抗小鼠 IgG-HRP 最佳孵育时间确定 |
| 4.2.5 最佳显色时间确定 |
| 4.2.6 单抗竞争 ELISA 阴阳临界值判定 |
| 4.2.7 单抗竞争 ELISA 操作程序 |
| 4.2.8 待检血清样本稀释度确定 |
| 4.2.9 单抗竞争 ELISA 交叉反应性评价 |
| 4.2.10 单抗竞争 ELISA 稳定性评价 |
| 4.2.11 临床血清样本检测 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 pET-32a-PPRV M 重组蛋白包被浓度和单抗上清最佳稀释度确定 |
| 4.3.2 最佳封闭剂确定 |
| 4.3.3 山羊抗小鼠 IgG-HRP 最佳工作浓度确定 |
| 4.3.4 山羊抗小鼠 IgG-HRP 最佳孵育时间确定 |
| 4.3.5 最佳显色时间确定 |
| 4.3.6 待检血清样本稀释度确定 |
| 4.3.7 单抗竞争 ELISA 交叉反应性评价 |
| 4.3.8 单抗竞争 ELISA 稳定性评价 |
| 4.3.9 临床血清样本检测 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 小反刍兽疫病毒 NIGERIA75/1 株 M 基因截短表达及鉴定 |
| 摘要 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 菌种和质粒 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要溶液配制 |
| 5.1.4 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 PRV M 基因抗原位点分析及表达蛋白可溶性预测 |
| 5.2.2 引物设计与合成 |
| 5.2.3 截短的 PPRV M 三段基因扩增及纯化 |
| 5.2.4 TA 克隆载体重组质粒的构建及鉴定 |
| 5.2.5 截短的 PPRV M 三段基因重组表达质粒的构建及鉴定 |
| 5.2.6 重组蛋白的诱导表达及 SDS-PAGE 分析 |
| 5.2.7 重组蛋白可溶性分析 |
| 5.2.8 pET-32a-PPRV M1 重组蛋白纯化及定量 |
| 5.2.9 重组蛋白的 Western blot 鉴定 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 PPRV M 基因抗原位点分析及表达蛋白可溶性预测 |
| 5.3.2 截短的 PPRV M 三段基因 PCR 鉴定 |
| 5.3.3 截短的 PPRV M 三段基因重组克隆质粒双酶切鉴定 |
| 5.3.4 重组表达质粒的双酶切鉴定 |
| 5.3.5 重组蛋白诱导表达及 SDS-PAGE 分析 |
| 5.3.6 截短后的 PPRV M 重组蛋白可溶性分析 |
| 5.3.7 pET-32a-PPRV M1 重组蛋白纯化及定量 |
| 5.3.8 重组蛋白的 Western blot 鉴定 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 基于 PPRV M1 重组蛋白间接 ELISA 方法的建立 |
| 摘要 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 抗原及血清 |
| 6.1.2 主要试剂及所用耗材 |
| 6.1.3 主要仪器及主要溶液配制 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 pET-32a-PPRV M1 纯化蛋白间接 ELISA 方法的优化 |
| 6.2.2 cut off 值及阴阳性判断标准确定方法 |
| 6.2.3 重复性实验 |
| 6.2.4 间接 ELISA 方法特异性评价 |
| 6.2.5 临床血清样本检测（符合率） |
| 6.3 实验结果 |
| 6.3.1 pET-32a-PPRV M1 蛋白间接 ELISA 方法优化结果 |
| 6.3.2 cut off 值及阴阳性判断标准确定 |
| 6.3.3 间接 ELISA 操作程序 |
| 6.3.4 批内重复性评价 |
| 6.3.5 批间重复性评价 |
| 6.3.6 间接 ELISA 方法特异性评价 |
| 6.3.7 临床血清样本检测 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（5）参桃软肝胶囊抗肝癌作用及其机理初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 第一节 原发性肝癌的现代医学研究概况 |
| 一、原发性肝癌的流行病学研究 |
| 二、原发性肝癌的病因和发病机制的现代医学研究 |
| 三、原发性肝癌的现代医学治疗现状 |
| 第二节 传统中医药对原发性肝癌的研究分析 |
| 一、中医药基础理论研究 |
| 二、中医药治疗肝癌的研究现状 |
| 三、抗肿瘤中药的作用机制研究 |
| 第三节 参桃软肝胶囊的前期研究状况 |
| 一、参桃软肝胶囊的由来及方解 |
| 二、参桃软肝胶囊的前期临床及实验研究 |
| 三、参桃软肝胶囊各成分抗癌机制文献研究 |
| 第二章 实验研究 |
| 第一节 体外细胞实验研究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 第二节 动物实验研究 |
| 一、参桃软肝胶囊对H22荷瘤小鼠的抑瘤作用 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| (三) 实验结果 |
| (四) 讨论 |
| (五) 小结 |
| 二、参桃软肝胶囊对H22荷瘤小鼠的免疫功能影响 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| (三) 实验结果 |
| (四) 讨论 |
| (五) 小结 |
| 三、参桃软肝胶囊抗肝癌机制探讨 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| (三) 实验结果 |
| (四) 讨论 |
| (五) 小结 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略语对照表 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学证明 |
（6）PRRSV、CSFV和PCV-2多重PCR诊断方法及基因芯片诊断方法的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 基因芯片技术及其在猪重大病毒性疾病研究中的应用 |
| 1.1.1 基因芯片及其原理 |
| 1.1.2 基因芯片的类型 |
| 1.1.3 基因芯片的应用 |
| 1.1.4 基因芯片猪重大病毒性疾病研究中的的应用 |
| 1.1.5 存在的问题及应用前景 |
| 1.2 PRRSV分子生物学及其诊断方法研究进展 |
| 1.2.1 PRRSV的分子生物学特性 |
| 1.2.2 PRRS的诊断 |
| 1.2.3 结语 |
| 1.3 CSFV分子生物学及其诊断方法研究进展 |
| 1.3.1 CSFV的分子生物学特性 |
| 1.3.2 CSFV的诊断 |
| 1.3.3 结语 |
| 1.4 猪圆环病毒分子生物学及其诊断方法研究进展 |
| 1.4.1 PCV的分子生物学特性 |
| 1.4.2 PCV-2的诊断 |
| 1.4.3 结语 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究的目的和意义 |
| 2.2 研究的范围和内容 |
| 第三章 PRRSV、CSFV、PCV-2的增殖与鉴定 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 PRRSV欧洲型毒株、美洲型毒株的增殖 |
| 3.2.2 CSFV毒株的增殖 |
| 3.2.3 PCV-2毒株的增殖 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 PRRSV毒株的增殖结果 |
| 3.3.2 CSFV毒株的增殖结果 |
| 3.3.3 PCV-2毒株的增殖结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 细胞培养 |
| 3.4.2 病毒增殖 |
| 3.4.3 间接免疫荧光 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 PRRSV、CSFV、PCV-2多重PCR检测方法的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 试剂的配制 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 RNA的提取及检测 |
| 4.2.2 反转录 |
| 4.2.3 细胞毒基因组DNA的提取及检测 |
| 4.2.4 PCR反应 |
| 4.2.5 琼脂糖凝胶电泳 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 RNA检测结 |
| 4.3.2 DNA检测结果 |
| 4.3.3 PCR产物的鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 关于RNA的提取 |
| 4.4.2 关于PCR |
| 4.4.3 关于RT-PCR |
| 4.4.4 关于多重PCR |
| 4.5 小结 |
| 第五章 PRRSV、CSFV、PCV-2基因芯片检测方法的建立 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 试剂的配制 |
| 5.1.5 芯片引物与探针 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 PRRSV、CSFV、PCV-2DNA、RNA的提取及检测 |
| 5.2.2 多重PCR体系 |
| 5.2.3 PRRSV、CSFV、PCV-2基因芯片的点制 |
| 5.2.4 基因芯片的杂交与洗片 |
| 5.2.5 基因芯片的扫描与数据分析 |
| 5.2.6 基因芯片的杂交温度的确定 |
| 5.2.7 基因芯片的特异性试验 |
| 5.2.8 基因芯片的灵敏度试验 |
| 5.2.9 猪重大病毒性疾病基因芯片的重复性试验 |
| 5.2.10 基因芯片的临床样品检测 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 基因芯片的杂交温度的确定 |
| 5.3.2 基因芯片的特异性试验结果 |
| 5.3.3 基因芯片的灵敏度试验结果 |
| 5.3.4 基因芯片的重复性试验结果 |
| 5.3.5 基因芯片的临床样品结果 |
| 5.4 |
| 5.4.1 基因芯片载体的选择 |
| 5.4.2 芯片设计 |
| 5.4.3 关于探针和靶标的定义 |
| 5.4.4 关于探针的选择 |
| 5.4.5 关于标记方法 |
| 5.4.6 芯片检测的临床应用 |
| 5.5 小结 |
| 参考文献 |
| 附录 英文缩略词一览表 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间论文发表情况 |
（7）生物单分子定量检测新方法及电化学发光共振能量转移（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 生物单分子定量检测新方法 |
| 第一章 生物单分子光学检测 |
| 1.1 单分子检测 |
| 1.2 LIFM单分子检测 |
| 1.2.1 共聚焦荧光显微术 |
| 1.2.2 全内反射荧光显微术 |
| 1.2.3 落射荧光显微术 |
| 1.2.4 其它光学方法 |
| 1.3 荧光标记物 |
| 1.3.1 有机荧光染料探针 |
| 1.3.2 纳米粒子探针 |
| 1.3.3 其它荧光探针 |
| 1.4 前景与展望 |
| 1.5 文献 |
| 第二章 电化学吸附富集结合全内反射荧光显微术定量检测溶液中单分子 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料与试剂 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.2.3 荧光分子电化学吸附富集至ITO导电玻片 |
| 2.2.4 全内反射单分子成像 |
| 2.3 结果和讨论 |
| 2.3.1 R6G在ITO玻片上的电化学吸附富集 |
| 2.3.2 利用全内反射荧光显微术对ITO玻片上富集的分子进行单分子成像 |
| 2.3.3 Alexa-488标记的IgG(H+L)和R6G标记的DNA电化学吸附富集 |
| 2.3.4 单分子计数定量检测 |
| 2.4 结论 |
| 2.5 参考文献 |
| 第三章 纳升样品单分子计数蛋白微阵列分析及其在检测活细胞蛋白质动力学表达中的应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 材料与试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 玻璃片的硅烷化 |
| 3.2.4 玻璃片包被抗体 |
| 3.2.5 封闭 |
| 3.2.6 芯片阵列的点样与标记 |
| 3.2.7 全内反射系统进行单分子芯片微阵列成像 |
| 3.2.8 DSC细胞的提取 |
| 3.2.9 细胞上清液的提取 |
| 3.2.10 基于ELISA的人OPN蛋白酶联免疫检测 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 图像的获取 |
| 3.3.2 非特异性吸附 |
| 3.3.3 测定CEA抗原的线性范围、检测限 |
| 3.3.4 蜕膜基质细胞中OPN蛋白表达动力学研究 |
| 3.4 小结 |
| 3.5 文献 |
| 第四章 单分子计数微阵列分析测定单细胞内多基因表达 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料与试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 玻璃片包被DNA1 |
| 4.2.4 制备量子点修饰的检测DNA2 |
| 4.2.5 封闭 |
| 4.2.6 tDNA的结合 |
| 4.2.7 芯片阵列的标记 |
| 4.2.8 细胞的培养和提取 |
| 4.2.9 实时定量PCR检测细胞中基因表达 |
| 4.2.10 利用SMCMA定量单个细胞中多种基因表达 |
| 4.3 结果和讨论 |
| 4.3.1 芯片制作 |
| 4.3.2 测定合成的DNA |
| 4.3.3 直接定量单细胞中单个基因表达 |
| 4.4 结论 |
| 4.5 文献 |
| 4.6 附录 |
| 第五章 普通显微镜可见单分子检测方法及其在定量单细胞多基因表达中的应用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 材料与试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 玻璃片硅烷化、封闭、cDNA的点样、细胞的培养、单分子荧光成像及获取单细胞cDNA |
| 5.2.4 制备MBs修饰的DNA1 |
| 5.2.5 MBs单分子标记 |
| 5.2.6 普通光学显微扫描成像 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 MBs的明场成像 |
| 5.3.2 MBs的定量 |
| 5.3.3 MBs单分子标记 |
| 5.3.4 背景噪音的消除 |
| 5.3.5 利用MBs标记cDNA单分子定量单细胞内多基因表达 |
| 5.4 结论 |
| 5.5 文献 |
| 第六章 多色微珠制备及编码单分子检测研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 材料与试剂 |
| 6.2.2 实验仪器 |
| 6.2.3 制备MBs修饰的DNA2 |
| 6.2.4 制备各色微球 |
| 6.2.5 玻璃片的硅烷化 |
| 6.2.6 DNA1的结合及基底封闭 |
| 6.2.7 tDNA的结合 |
| 6.2.8 MBs-DNA2单分子标记 |
| 6.2.9 荧光编码 |
| 6.2.10 荧光成像 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 染料及滤色片的选择 |
| 6.3.2 颜色混合及多色微球制备 |
| 6.3.3 生物单分子检测 |
| 6.4 结论 |
| 6.5 文献 |
| 第二部分 电化学发光共振能量转移 |
| 第七章 共振能量转移 |
| 7.1 荧光共振能量转移 |
| 7.2 QD在共振能量转移中应用 |
| 7.3 前景与展望 |
| 7.4 文献 |
| 第八章 鲁米诺作供体量子点作受体的电化学发光共振能量转移理论及生物应用 |
| 8.1 引言 |
| 8.2 实验部分 |
| 8.2.1 材料和试剂 |
| 8.2.2 仪器设备 |
| 8.2.3 电极的制作和表征 |
| 8.2.4 蛋白质溶液去磷酸盐 |
| 8.2.5 人IgG-ABEI及CEA-ABEI结合物的制备 |
| 8.2.6 免疫反应 |
| 8.2.7 Fn-QD结合物的制备 |
| 8.2.8 ABEI-Fn-QD结合物的制备 |
| 8.2.9 蛋白质的变性 |
| 8.2.10 电化学发光共振能量转移光谱的检测 |
| 8.3 结果与讨论 |
| 8.3.1 鲁米诺荧光量子产率Φ_(Lum) |
| 8.3.2 Forster半径R_0,共振能量转移效率η_E及供受体之间的距离r_n |
| 8.3.3 ECRET测定DNA理论计算 |
| 8.3.4 测定蛋白质之间的相互作用 |
| 8.3.5 研究蛋白质构型的变化 |
| 8.4 结论 |
| 8.5 文献 |
| 第九章 量子点作供体Cy5作受体的电化学发光共振能量转移研究蛋白质构型的变化 |
| 9.1 引言 |
| 9.2 实验部分 |
| 9.2.1 实验仪器、电极的制作和表征及蛋白质溶液去磷酸盐 |
| 9.2.2 材料与试剂 |
| 9.2.3 油溶性量子点羧基化 |
| 9.2.4 QD-Fn-DNA1-DNA2-Cy5复合物的制备及蛋白质的变性 |
| 9.2.5 ECL检测 |
| 9.2.6 ECRET光谱检测 |
| 9.3 结果与讨论 |
| 9.3.1 CdSe/ZnS QDs ECL机理 |
| 9.3.2 QDs-Fn-Cy5 ECRET体系的建立 |
| 9.3.3 QDs与Fn比例选择 |
| 9.3.4 电位对QDs-Fn-Cy5体系ECRET影响 |
| 9.3.5 研究蛋白质构型的变化 |
| 9.3.6 Forster半径R_0,共振能量转移效率η_E及供受体之间的距离r_n |
| 9.4 结论 |
| 9.5 文献 |
| 致谢 |
| 博士期间发表论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 英文论文 |
| References |
（8）生物素标记cDNA探针检测苹果锈果类病毒（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 试剂 |
| 1.3 引物 |
| 1.4 方法 |
| 1.4.1 总RNA提取 |
| 1.4.2 有效RT-PCR体系 |
| 1.4.3 克隆及测序 |
| 1.4.4 非放射性标记探针的制备 |
| 1.4.5 探针显色灵敏度的检测 |
| 1.4.6 ASSVd核酸斑点杂交检测法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RT-PCR分子检测 |
| 2.2 苹果锈果类病毒RT-PCR产物克隆和序列分析 |
| 2.3 Biotin探针的获得 |
| 2.4 斑点杂交结果 |
| 2.4.1 斑点杂交特异性检测结果 |
| 2.4.2 灵敏度检测结果 |
| 2.4.3 Biotin标记的cDNA探针对田间样品的检测 |
| 3 讨 论 |
（9）旋毛虫抗肿瘤作用机制研究（论文提纲范文）
| 提要 |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 综述一 肿瘤发生发展的分子机理 |
| 一、肿瘤细胞与肿瘤的发生 |
| 二、肿瘤的转移 |
| 三、原癌基因与肿瘤抑制基因 |
| 四、影响细胞无序增殖的肿瘤基因突变 |
| 五、导致细胞周期调控丧失的基因突变 |
| 六、影响基因组稳定性的突变 |
| 七、癌症治疗的分子策略 |
| 八、其他 |
| 综述二 抗肿瘤药物研究进展 |
| 一、以细胞信号转导分子为靶点的抗肿瘤药物 |
| 二、新生血管生成抑制剂 |
| 三、端粒酶抑制剂 |
| 四、反义药物 |
| 五、肿瘤耐药逆转剂(resistance reversal agents RRA) |
| 六、分化诱导剂 |
| 七、高分子抗肿瘤药物 |
| 八、基因治疗 |
| 九、抗肿瘤中草药 |
| 综述三 旋毛虫抗肿瘤研究进展 |
| 一、旋毛虫抗肿瘤国外研究现状 |
| 二、旋毛虫抗肿瘤国内研究现状 |
| 三、国内外研究存在的不足和本研究的研究突破口 |
| 四、抗肿瘤蛋白研究对肿瘤的预防与治疗的意义。 |
| 五、利用噬菌体展示肽库技术筛选抗肿瘤活性蛋白的研究前景 |
| 六、获得旋毛虫抗肿瘤活性蛋白的社会及经济意义 |
| 第二篇 实验研究 |
| 实验一 旋毛虫及其虫体蛋白体内抗肿瘤作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结 果 |
| 3 小结 |
| 实验二 旋毛虫虫体蛋白体外抗肿瘤作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 实验三 虫体蛋白诱导 H7402 和 K562 细胞凋亡的检测 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 实验四 旋毛虫虫体蛋白对 H7402 细胞凋亡的调控 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 实验五 旋毛虫成虫和新生幼虫T7 噬菌体cDNA 展示文库构建 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 实验六 旋毛虫抗肿瘤相关蛋白基因的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 小结 |
| 讨论 |
| 1.关于旋毛虫及虫体蛋白对实体瘤的作用 |
| 2.关于虫体蛋白在体外对肿瘤细胞增殖的影响 |
| 3.虫体蛋白对肿瘤细胞凋亡诱导作用 |
| 4.虫体蛋白对H7402细胞凋亡相关蛋白的调控作用 |
| 5.虫体蛋白对诱导肿瘤细胞凋亡的机制 |
| 6.关于噬菌体cDNA 展示文库 |
| 7.关于利用文库T7 噬菌体cDNA 展示文库筛选旋毛虫抗肿瘤活性蛋白 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 致谢 |
（10）四个H22克隆细胞株的RAPD特征及H22-H8D8传代细胞的生物学特性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究论文 四个H22 克隆细胞株的RAPD 特征及H22-H8D8 传代细胞的生物学特性研究 |
| 引言 |
| 第一部分 四个H22 克隆细胞株的RAPD 特征分析研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 H22-H8D8 传代细胞的RAPD 特征分析以及肿瘤动物模型生物学特征研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 小鼠肝癌(H22) 细胞的基本特性及在肿瘤研究中的应用 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、生物素标记的6种cDNA探针检测S180及其克隆细胞株mRNA的表达（论文参考文献）
- [1]大鼠体内生物素示踪重组人胶原蛋白的方法研究[J]. 苗雪文,高德煜,于浩,李敏,王苗苗,姜爱莉,王召旭. 药物分析杂志, 2021(04)
- [2]HPV16 RNA非扩增型核酸杂交捕获检测技术的体系研究[D]. 丁森. 南京大学, 2016(06)
- [3]AFP158-166特异性TCR转基因T细胞治疗肝癌的实验研究[D]. 孙龙昊. 天津医科大学, 2014(01)
- [4]小反刍兽疫病毒Nigeria75/1株M蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备和初步应用[D]. 黄华欣. 中国农业科学院, 2013(02)
- [5]参桃软肝胶囊抗肝癌作用及其机理初探[D]. 贾建伟. 广州中医药大学, 2013(10)
- [6]PRRSV、CSFV和PCV-2多重PCR诊断方法及基因芯片诊断方法的建立[D]. 叶芬. 西南大学, 2011(10)
- [7]生物单分子定量检测新方法及电化学发光共振能量转移[D]. 李璐. 山东大学, 2010(07)
- [8]生物素标记cDNA探针检测苹果锈果类病毒[J]. 赵英,牛建新. 西北农业学报, 2008(03)
- [9]旋毛虫抗肿瘤作用机制研究[D]. 王学林. 吉林大学, 2008(11)
- [10]四个H22克隆细胞株的RAPD特征及H22-H8D8传代细胞的生物学特性研究[D]. 王险峰. 河北医科大学, 2006(11)