一、基因疫苗及其在猪传染病中的应用（论文文献综述）
祁兵[1]（2021）在《上海市几种猪传染病的流行病学调查研究》文中认为猪口蹄疫、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病、猪圆环病毒病、流行性腹泻等疫病是危害全球养猪业的几种重要传染病,其中口蹄疫、猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征是上海市强制免疫的病种。为了解上海市猪群中这些传染病的流行状况,本研究于2019年在该市规模养殖场、种猪场、屠宰企业采集血样4581份,组织样品2019份（包括扁桃体1044份、颌下淋巴结345份、肺脏315份和小肠组织315份）、鼻拭子798份、口腔唾液样品76份,以及种公猪精液255份,通过对相关病原和抗体的检测,开展流行病学分析评估,为上海市猪场主要疫病的防控提供参考。应用ELISA方法对O型口蹄疫病毒（FMDV）免疫抗体、感染抗体（针对非结构蛋白3ABC的抗体）进行检测,并以实时荧光定量RT-PCR检测FMDV核酸。结果显示,规模养殖场O型FMDV免疫抗体的平均合格率为90.5%,种猪场为97.9%,屠宰场为88.7%;规模养殖场、种猪场和屠宰场感染抗体的阳性率均为0,实时荧光定量RT-PCR未检出FMDV的核酸。应用ELISA方法对猪瘟病毒（CSFV）免疫抗体进行检测,并以实时荧光定量RT-PCR对CSFV核酸进行检测。结果显示,规模养殖场免疫抗体平均合格率为92.3%,种猪场为98%,屠宰场为85.1%;实时荧光定量RT-PCR未检出CSFV核酸。上述结果表明,上海市猪口蹄疫、猪瘟强制免疫的效果较好,疫情总体上稳定可控。应用ELISA方法对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）免疫抗体检测,并以实时荧光定量RT-PCR对PRRSV核酸进行检测。结果显示,规模养殖场免疫抗体平均合格率为94%,种猪场为78%,屠宰场为98.1%;在规模养殖场未检出PRRSV核酸,种猪场检出的病毒核酸阳性率0.3%,屠宰场检出的病毒核酸阳性率为0.6%,送检病料样品中PRRSV核酸阳性率为18.2%。由于上海市猪群中仍有一定的PRRSV阳性率,而且种猪场免疫抗体的合格率较低,所以应加强对PRRSV流行毒株的跟踪检测和遗传分析,及时疫情预测预警。应用ELISA方法对猪伪狂犬病病毒（PRV）的gB抗体（免疫抗体）和gE抗体（感染抗体）进行检测,应用实时荧光定量PCR对PRV核酸进行检测。结果显示,规模养殖场PRV gB抗体合格率平均为97.3%,PRV gE抗体阳性率29.1%;种猪场PRV gB抗体合格率为99.2%,PRV gE抗体阳性率12%;屠宰场PRV gB抗体合格率为98.1%,PRV gE抗体阳性率31.7%;规模养殖场PRV核酸阳性率为2.2%,种猪场样品中PRV核酸未检出,屠宰场样品中PRV核酸阳性率为8.1%,送检病料样品中PRV核酸阳性率为8.3%。全市PRV免疫抗体水平良好,PRV gE抗体阳性率总体呈现明显下降趋势,种猪场猪伪狂犬病净化成效较为显着。应用实时荧光定量PCR对猪圆环病毒2型（PCV 2）病毒核酸进行检测。结果显示,种猪场样品中PCV 2阳性率为1.9%,屠宰场样品阳性率为6.2%,送检病料阳性率为21.4%。由于PCV 2感染会造成免疫抑制,为了保证口蹄疫等疫病的疫苗效果,必须重视PCV 2感染的防控。应用ELISA方法对猪流行性腹泻病毒（PEDV）免疫抗体检测,并应用实时荧光定量RT-PCR检测PEDV核酸。结果显示,规模养殖场PEDV抗体合格率为54.9%,种猪场为74.8%;屠宰场样品PEDV核酸阳性率2.9%。本研究发现,PEDV免疫抗体水平整体不高,而且病原的阳性率较高,因此必须指导养殖场制定合理的免疫程序,加强疫病监测。
徐丹[2]（2019）在《FAdV-4 pcDNA3.1-Penton重组质粒的构建及免疫原性的初步探究》文中研究指明禽心包积液-肝炎综合征（Hydropericardium-Hepatitis Syndrome,简称为HHS）,主要由Ⅰ群血清4型禽腺病毒（Fowl Adenovirus serotype 4,FADV-4）感染所引起,以心包积液、肝组织损伤等为主要特征。该病1987年首次在巴基斯坦安卡拉地区爆发,因此又称之为禽“安卡拉病”。目前该病在世界多个国家均有流行,造成严重影响。2015年,该病在中国许多地区流行,造成雏鸡免疫功能降低,死淘率升高,给中国养禽业带来严重的经济损失。目前为止,对于安卡拉病我国还未有商品化疫苗在临床上使用,因此急需研发有效疫苗来预防此病。五邻体（Penton）蛋白是FADV的主要结构蛋白,具有良好的抗原性和免疫原性,而且高度保守。本试验以Penton基因为研究对象,构建pcDNA3.1-Penton重组质粒,将重组质粒以不同剂量免疫雏鸡,探究其免疫原性,为研制有效安卡拉病疫苗提供相应的理论依据。试验内容及结果如下:1.根据GenBank上FAdV-4 Penton基因序列设计引物,以本实验室保存的FAdV-4阳性病料肝组织DNA为模板,进行Penton基因扩增、纯化,然后将纯化的Penton基因与pMD19-T克隆载体连接,构建pMD19-T-Penton重组质粒,进行HindⅢ和EcoRⅠ双酶切鉴定,然后将Penton基因与pcDNA3.1载体连接,最终成功构建pcDNA3.1-Penton重组质粒。2.本试验共选取90只3日龄健康雏鸡,30只为SPF雏鸡,60只为商品化海兰褐雏鸡,共分6组,每组15只。分组为:SPF雏鸡免疫组和对照组;商品化雏鸡低、高剂量及低剂量佐剂免疫组和对照组,免疫方式为肌肉注射,初次免疫7d后加强免疫一次。初次免疫后每周进行采血,通过ELISA方法检测免疫后血清中FAdV-4抗体水平、白细胞介素6（IL-6）和干扰素γ（IFN-γ）含量,进而评价免疫效果。试验结果显示,pcDNA3.1-Penton重组质粒免疫雏鸡后,免疫组均产生FAdV-4抗体,其中SPF雏鸡免疫组与商品化雏鸡低剂量组比较,血清中FAdV-4抗体差异不显着（P>0.05）,与空白对照组比较差异极显着（P<0.01）;商品化雏鸡低剂量与高剂量组比较,高剂量与低剂量佐剂组比较,差异不显着（P>0.05）;高剂量、低剂量佐剂组与低剂量免疫组比较,差异显着（P<0.05）,免疫组与空白对照组比较,差异极显着（P<0.01）。血清中IFN-γ和IL-6的含量:在7、14和21 d,SPF雏鸡免疫组与商品化雏鸡低剂量组之间差异不显着（P>0.05）,与空白对照组差异极显着（P<0.01）;商品化雏鸡低、高剂量及低剂量佐剂组与对照组比较,差异极显着（P<0.01）;低剂量佐剂组与低、高剂量组之间差异显着（P<0.05）,低剂量、高剂量组之间比较差异不显着（P>0.05）,21 d后,所有免疫组与空白对照组之间差异不显着（P>0.05）。本试验结果表明,构建的pcDNA3.1-Penton重组质粒免疫雏鸡后,机体均能产生FAdV-4特异性抗体,说明构建的pcDNA3.1-Penton重组质粒具有很好的免疫原性,并且弗氏佐剂免疫组与高剂量免疫组产生的FAdV-4特异性抗体均高于低剂量组;与空白对照组比较,各免疫组血清中IFN-γ和IL-6含量均升高,说明pcDNA3.1-Penton重组质粒免疫后,能诱导细胞免疫和体液免疫等相关细胞因子的产生。
程渝[3]（2012）在《PEDV S蛋白抗原表位基因重组减毒沙门氏菌的构建及免疫原性研究》文中认为2006年以来,猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea, PED）疫情在我国各地持续发生,严重危害了养猪业的生产,造成重大的经济损失。灭活疫苗自身免疫保护力较弱、野毒变异株的出现致使疫苗免疫效果不稳定等因素,导致目前使用的PED疫苗无法有效地预防和控制我国PED疫情的区域性流行。因此,开发和研制安全、高效的新型PED基因工程疫苗具有重要的实际意义。本实验以猪流行性腹泻病毒四川分离DY株为材料,克隆S蛋白两个重要抗原表位基因SA （499-638aa）和SB （744-771aa）,构建重组减毒沙门氏菌S.C500/pVAX1-SAB,并进行小鼠免疫试验评价其免疫效果。主要研究内容如下：1、PEDV SA, SB基因片段的克隆及重组表达质粒、重组沙门氏菌的构建本试验根据GenBank中猪流行性腹泻病毒CV777株S基因序列设计引物,以猪流行性腹泻病毒总RNA为模板,RT-PCR分别扩增出456bp、105bp的目的片段SA和SB,分别克隆至pMD-19-T获得pMD-SA和pMD-SB,通过酶切连接将SB片段插入到pMD-SA上,获得pMD-SAB,再将SAB片段亚克隆到pET-32a（+）上,获得pET-SAB;根据真核表达载体pVAX1上可用的酶切位点,重新设计引物,以pMD-SA和pMD-SAB为材料,PCR扩增出446bp、534bp的目的片段SA’和SAB’以构建pMD-SA’和pMD-SAB’,将SA’和SAB’分别亚克隆至pVAX1上,获得pVAX1-SA和pVAX1-SAB。pVAX1-SA和pVAX1-SAB转化S.C500感受态细胞,获得S.C500/pVAX1-SA和S.C500/pVAX1-SAB。2、SAB融合基因的原核和真核表达研究将pET-SAB转入大肠杆菌Rosetta（DE3）,经IPTG诱导,表达出主要以包涵体的形式存在,大小约为36.5kDa的SAB融合蛋白,Western-blot实验证实SAB融合蛋白具有免疫学反应性；分别将pVAX1-SA和pVAX1-SAB转染Vero细胞,间接免疫荧光试验检测目的基因的表达,两个重组质粒转染的Vero细胞均出现特异性绿色荧光,表明目的蛋白成功表达,且具有免疫反应性。3、重组沙门氏菌安全性、稳定性和口服免疫小鼠的研究S.C500/pVAX1-SAB以不同剂量口服免疫小鼠,小鼠均未为表现出沙门氏菌感染症状,表明对小鼠无致病性,1×107、1×108CFU/mL剂量对小鼠是相对安全的；S.C500/pVAX1、S.C500/pVAX1-SA和S.C500/pVAXl-SAB体外无抗性下连续传代培养,1-80代内,质粒稳定性均在90%以上,第80代质粒稳定性开始较大幅度下降；S.C500/pVAX1、S.C500/pVAX1-SAB在小鼠体内消长动态显示,免疫后第1、3和7天从粪便、肝脏和脾脏中分离出重组菌,粪便中分离的细菌数量远多于肝脏和脾脏,2周左右在脾脏、肝脏、粪便均未分出细菌,表明重组菌已被小鼠机体系统清除出体外：小鼠免疫试验结果：S.C500/pVAx1-SA.S.C500/pVAX1-SAB和pVAX1-SA.pVAX1-SAB均能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答,三免后一周S.C500/pVAX1一SAB诱导产生的PEDV抗体显着高于其他三个免疫组（P<0.05）, S.C500/pVAX1-SA和S.C500/pVAX1-SAB还能诱导特异性肠粘膜免疫应答。总的来说,S.C500/pVAX1-SAB比S.C500/pVAX1-SA诱导了更高水平体液免疫应答,同时达到一个相对平衡的Thl/Th2细胞免疫反应。结论：重组减毒沙门氏菌S.C500/pVAXl-SAB具有良好的免疫原性,为PED新型口服基因工程活载体疫苗的研制奠定了基础。
张德庆[4]（2011）在《C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究》文中研究指明近年来,随着分子生物学、免疫学理论和技术的发展,运用基因重组表达技术研制预防、治疗用生物制品己经成为免疫学领域研究的热点,其中核酸（DNA）疫苗倍受青睐。该疫苗是继灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗及基因工程疫苗后的新一代疫苗。核酸疫苗具有同时激发机体体液和细胞免疫应答、使用安全、易于生产等优点,并可将多种基因联合在一起制成基因联合疫苗。然而由于DNA疫苗蛋白表达量低,激发的免疫应答较弱,从而限制了其开发应用速度。因此,提高DNA疫苗的免疫效果已成为基因免疫研究中急需解决的问题;目前常采用新型分子佐剂,如白细胞介素、干扰素、胸腺肽和补体分子佐剂等是提高DNA疫苗免疫效果的重要措施,其中补体C3d分子佐剂倍受人们的关注。补体C3d分子是补体C3被抗原激活以后的最终裂解片段,能够促进抗原提呈细胞对抗原的摄取、提呈作用,增强机体的免疫应答能力。因此,C3d已经成为核酸疫苗有效的新型分子佐剂。但是C3d作为分子佐剂具有种属差异性,不同种动物间C3d免疫增强作用的差异性需要作进一步的研究。PRRSV GP5基因编码的GP5蛋白为糖基化囊膜蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性,能诱导机体产生特异性体液免疫和细胞免疫。invH基因是沙门氏菌A-E群的高度保守基因,编码吸附和侵袭上皮细胞表面的蛋白,该蛋白决定沙门菌对肠粘膜细胞的侵袭力。本研究首先对哺乳动物猪、鼠的C3d基因进行克隆及序列测定分析,并探讨了不同种动物（猪、鼠、鸡、鸭）间补体C3d在基因水平上的相关性和差异性,然后以PRRSV GP5为模型基因,利用鼠、猪（哺乳动物）C3d的受体结合功能区p28和鸡、鸭（禽类动物）C3d的受体结合功能区p29作为分子佐剂,构建了C3d-p28（29）.n（n=2、4、6）多聚体分子佐剂PRRSV GP5核酸疫苗和沙门氏菌pcDNA3.1-invH-mC3d -p28.6核酸疫苗;用构建的核酸疫苗免疫小鼠并对其免疫效果进行了体液和细胞免疫主要指标的检测,探讨不同动物C3d-p28（29）对核酸疫苗的免疫增强作用。本研究主要包括四部分内容:1、哺乳动物猪、鼠补体C3d基因的克隆及序列分析:为了获得哺乳动物（猪、鼠）的补体C3d基因克隆并比较同禽类动物（鸡、鸭）C3d基因序列的差异性,首先从哺乳动物鼠、猪的肝组织中提取总RNA,通过RT-PCR扩增C3d基因的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定并进行序列测定,然后进行C3d序列和CR2结合区同源性比较分析。电泳结果显示,分别在936bp和888bp处呈现明亮的条带,成功获得了鼠和猪的C3d基因克隆。序列分析结果表明,哺乳动物（猪、鼠）和禽类（鸡、鸭）的补体C3d基因同源性仅为64%;进化树显示,哺乳动物与禽类的亲缘关系越近,C3d基因进化关系也越近。哺乳动物（猪、鼠）与禽类（鸡、鸭）C3d基因的CR2结合区比较分析发现,禽类为29个氨基酸,而哺乳动物为28个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为62%,而鼠、猪两种哺乳动物之间、鸡、鸭两种禽类动物之间的同源性分别达82.8%和84%,证明补体C3d及CR2结合区具有种属的差异性。2、不同动物C3d分子佐剂PRRSV GP5核酸疫苗的构建:为探明不同动物C3d分子佐剂在核酸疫苗中的免疫增强作用,在上述试验克隆了动物C3d cDNA的基础上,设计引物克隆C3d-p28（29）至pUC19载体,利用同裂酶BamHⅠ和BglⅡ构建多聚体C3d-p28（29）.n,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）上;然后以RT-PCR扩增的PRRSV GP5基因作为模式基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1-C3d-p28（29）.n中p28（29）.n上游,构建pcDNA3.1-GP5-C3d-p28 （29）.n重组质粒。酶切结果显示,电泳后在807、987、1167bp处分别出现了明亮的条带,表明成功构建了含有补体C3d-p28（29）多聚体分子佐剂的PRRSV GP5核酸疫苗（pcDNA3.1-GP5-C3d-p28（29）.n）。3、不同动物C3d分子佐剂对PRRSV GP5核酸疫苗免疫增强效果研究:为了探索不同动物C3d分子佐剂对PRRSV GP5核酸疫苗的免疫增强作用及差异性,在构建了鼠、猪、鸡、鸭四种动物补体C3d-p28（29）.n PRRSV GP5核酸疫苗（pcDNA3.1-GP5-C3d-p28（29）.2.4.6）及pcDNA3.1-GP5核酸疫苗的基础上,分别提取质粒,通过脂质体转染至Marc145细胞进行瞬时表达,并免疫BALB/c小鼠,然后利用不同ELISA试剂盒分别检测各免疫组小鼠的GP5抗体水平和IL-4、IFN-γ含量。结果表明,以补体C3d-p28（29）.n为分子佐剂的PRRSV GP5基因重组疫苗均可在Marc145细胞内进行表达;连接不同动物C3d-p28（29）2,4,6聚体的核酸疫苗免疫鼠血清中GP5抗体水平、IL-4和IFN-γ含量均比空载体（pcDNA3.1）和pcDNA3.1-GP5对照组的升高,差异均显着（P<0.05）,其中以pcDNA3.1-GP5-p28（29）.6组的效果最佳,但均不如PRRSV油乳剂灭活苗组的效果好。另外,含有C3d-p28（29）.n（n=2,4,6）相同聚体的疫苗免疫组小鼠血清中的GP5抗体水平、IL-4和IFN-γ含量两两比较无差异性。4、鼠C3d分子佐剂沙门氏菌invH基因核酸疫苗的构建及免疫效果研究:为了进一步探讨分子佐剂C3d在细菌核酸疫苗中的免疫增强作用,以沙门氏菌invH为核酸疫苗的模式基因,构建了pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6重组质粒,免疫BALB/c小鼠并检测了小鼠血清中invH抗体和IL-4、IFN-γ的含量,然后进行小鼠攻毒保护试验。结果表明,小鼠血清中invH抗体水平、IL-4和IFN-γ的含量与pcDNA3.1、pcDNA3.1-invH对照组比较,差异均显着（P<0.05）。通过攻毒试验结果表明,pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.6核酸疫苗对小鼠的免疫保护率高于pcDNA3.1-invH组,差异显着（P<0.05）,与空白组和pcDNA3.1组比较,差异均极显着（P<0.01）,但核酸疫苗的保护效果不及灭活疫苗。本研究结果探明了动物C3d分子佐剂对病毒及细菌核酸疫苗的免疫增强作用,为开发利用不同动物C3d分子佐剂研制其他病原的核酸疫苗提供了理论依据和技术支持。
陈杨[5]（2011）在《PPV和PCV2核酸疫苗及PRV-PPV-PCV2基因工程疫苗的研究》文中提出猪细小病毒（Porcine Parvovims, PPV）是引起猪繁殖障碍的主要病原之一,猪圆环病毒2型（porcine circovirus type2, PCV2）引起以断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）为代表的系列疾病。该两种疾病在世界范围内广泛流行,造成了巨大的经济损失,目前,对这两种疾病的防制主要靠预防接种。然而,目前广泛使用的猪细小病毒灭活疫苗存在灭活不完全的风险,而且由于PPV体外培养较困难,病毒增殖滴度较低,这给灭活疫苗的生产带来一定困难；同时PCV2在细胞上增殖滴度很低,发展传统疫苗都存在一定障碍,因此有必要发展新型疫苗来防制这两种疾病。这两种疾病常发生混合感染,并具有协同性,如果能研发一种可同时预防这两种疾病的疫苗,将具有重要意义。据此,本研究展开了对四川省PPV和PCV2的抗原流行病学调查,以掌握其流行现状；对PPV VP2基因和PCV2 ORF2基因及其串联基因设计核酸疫苗；并以猪伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus, PRV）为活病毒载体,构建了PRV-PPV-PCV2三价基因工程疫苗,为进一步预防和控制PRV、PPV和PCV2及其混合感染打下坚实的基础。具体如下：1.四川省猪细小病毒、猪圆环病毒2型流行病学调查从四川省21个规模化猪场共采集273份样品,通过PCR诊断技术进行了PPV、PCV2病原流行病学调查,结果检出PPV抗原阳性样品47份（17.22%）、PPV阳性猪场8个（38.1%）,具有种猪的感染率较高,而在仔猪感染率相对较低的特点：检出PCV2抗原阳性样品143份（52.38%）、PCV2阳性猪场18个（85.7%）,具有PCV2感染随猪年龄的增长而升高的趋势；检出PPV和PCV2混合感染样品29份（10.62%）、同时混合感染PPV和PCV2的猪场6个（28.7%）,混合感染主要集中在母猪和保育仔猪阶段。2.猪细小病毒和猪圆环病毒2型核酸疫苗的构建通过PCR方法扩增PPV VP2基因和PCV2 ORF2基因,并分别插入真核表达载体pCI-neo中,成功构建了真核表达质粒pCI-VP2和pCI-ORF2,同时,将PPV VP2基因和PCV2 ORF2基因进行串联,两基因间以高亲水性氨基酸（Gly-Gly-Gly-Ser）编码核苷酸连接,插入到PCI-neo中构建真核表达质粒pCI-VP2-ORF2。将pCI-VP2. pCI-ORF2和pCI-VP2-ORF2转染Vero细胞后,通过RT-PCR法检测目的基因转录、SDS-PAGE电泳、Western blotting分析和间接免疫荧光分析蛋白表达,结果表明,3种真核表达质粒转染哺乳动物细胞后,既可扩增到目的基因,也可检测到特异性蛋白的表达,成功地表达了外源基因。3.猪细小病毒和猪圆环病毒2型核酸疫苗对小鼠免疫效果研究将84核酸疫苗pCI-VP2、pCI-ORF2和pCI-VP2-ORF2以100μg/只剂量免疫健康昆明小白鼠,2周后相同剂量加强免疫一次,于首免后O d、7 d、14 d、21 d、28 d、42 d、56 d断尾采血并分离血清进行抗体检测,发现首免后14d,可检测到PPV和PCV2特异性抗体的出现,加强免疫后7d,其抗体转化为阳性,但其诱导抗体水平均低于疫苗组所诱导的抗体水平：于首免后0 d、21 d、56 d分离血清进行细胞因子检测,发现其均可诱导较高水平的IL-2、IL-4、IFN-y;于首免后56d,采集抗凝血一份,进行T淋巴细胞亚群检测,发现CD4+/CD8+比例明显下降；首免后56d在每组随机挑选一只小鼠颈椎脱臼处死,取脾脏制备单个脾细胞悬液,用ConA进行刺激并测定刺激指数,发现能够诱导较强的脾细胞增殖；首免后56d采集小鼠的实质器官,进行安全性检测,均未检测到3种核酸疫苗的外源基因与小鼠基因组DNA整合的情况,表明3种核酸疫苗是安全的。这些结果说明,3种核酸疫苗均能够诱导小鼠产生较强的细胞免疫应答和体液免疫应答,并具有良好的安全性。4. PPV-PCV2-PRV三价基因工程疫苗PRV SA215（D1）的构建将VP2-ORF2融合基因从真核表达载体pCI-VP2-ORF2切下,连接到PRV通用转移载体pPI-2.EGFP中,成功构建了转移载体pPI-2.EGFP-VP2-ORF2。将PRV SA215基因组DNA与转移质粒pPI-2.EGFP-VP2-ORF2共转染Vero细胞,通过同源重组,构建重组病毒。挑斑筛选后,通过绿色荧光检测和PCR检测表明成功构建了PRV-PPV-PCV2三价基因工程疫苗株PRV SA215 （Dl）;通过SDS-PAGE电泳、Western blotting分析和间接免疫荧光分析,结果表明,VP2基因和ORF2基因在重组PRV SA215 （D1）获得了成功表达,融合蛋白具有良好的免疫反应原性。5. PRV SA215（D1）部分生物学特性研究将PRV SA215（D1）接种Vero细胞,观察其致病变效应、重组病毒的形态,测定一步法生长曲线,结果表明,外源PPV VP2和PCV2 ORF2基因的插入不影响重组病毒的增殖和病毒粒子的包装。将PRVSA215（D1）在Vero细胞上连续传6代,未发现PPV VP2和PCV2 ORF2基因丢失,表明PRV SA215（D1）具有遗传稳定性。将PRVSA215（D1）以104PFU剂量免疫健康昆明小鼠,发现其对小鼠有良好的安全性,以104PFU免疫小白鼠可对106 PFU PRV Fa株强毒攻击产生完全保护。将PRVSA215（D1）以105PFU剂量免疫仔猪,可引起仔猪外周血CD4+T淋巴细胞阳性细胞数明显提高,CD8+T淋巴细胞阳性细胞数相对减少；可诱导产生较高水平的细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ,表明能够显着的增强Thl和Th2型免疫应答；可诱导仔猪产生较高水平的PRV、PPV和PCV2的抗体,其中PRV水平抗体与其亲本株PRV SA215相当,PPV和PCV2抗体水平略低于灭活疫苗组;这些结果表明,PRV SA215（D1）可望作为预防控制PRV、PPV和PCV2的三价基因工程疫苗候选株。
蔺文成,胡峰,任梅,崔玉东,钱爱东,崔尚金[6]（2010）在《猪细小病毒病国内流行状况以及防治策略》文中研究指明猪细小病毒病是由猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）引起的一种繁殖障碍疾病,同时与猪渗出性皮炎、断奶仔猪多系统衰弱综合征等疾病有关,对妊娠母猪与仔猪具有极大的威胁,给养殖业造成了巨大的经济损失。
蔺文成,胡峰,任梅,崔玉东,钱爱东,崔尚金[7]（2010）在《猪细小病毒病国内流行状况以及防治策略》文中提出猪细小病毒病是由猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）引起的一种繁殖障碍疾病,与猪渗出性皮炎、断奶仔猪多系统衰弱综合征等疾病有关,对妊娠母猪与仔猪具有极大的威胁,常给养殖业造成巨大经济损失。
刘栋[8]（2010）在《畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究》文中认为在生产实践中,传统的疫苗（弱毒苗、灭活苗）对防治动物疫病发挥了重要作用,但近年来该类疫苗暴露出来的免疫效果不佳等缺陷,使研制更安全、高效、廉价的新型疫苗显得非常迫切和必要。基因疫苗主要由真核表达载体和保护性抗原基因构成,此种疫苗与传统疫苗相比,具有设计灵活、安全性高、性质稳定、成本低、同时诱导体液免疫和细胞免疫等优点。然而核酸疫苗存在的问题是产生抗体慢且水平低,需要加入有效的佐剂才能克服这些缺陷;核酸疫苗的佐剂需用分子佐剂,分子佐剂主要有干扰素分子佐剂、白细胞介素分子佐剂、胸腺肽分子佐剂及C3d分子佐剂等,其中C3d分子作为一种新型分子佐剂日益引起人们的关注。补体C3是机体补体激活的经典途径、替代途径以及甘露聚糖结合凝集素（MBL）途径的交汇点的中心成分,是宿主防御机能的一个分子。C3d片段是补体C3的裂解片段之一,是C3分子α链不能被蛋白酶再裂解并仍保持与抗原共价连接的最小片段,具有广泛的免疫学功能。其可以直接与抗原递呈细胞（APC）上的CR2受体结合,从而降低淋巴细胞的活化阈,提高抗原分子的免疫原性。因此,C3d被认为是一种具有研究、开发应用价值的核酸疫苗分子佐剂。鉴于上述研究背景,本研究在对不同动物补体C3d基因克隆及序列测定比较分析的基础上,探讨了补体C3d在不同畜禽间基因水平上的相关性和差异性;验证了鸡补体C3d原核表达重组蛋白（rChC3d）对大肠杆菌疫苗和新城疫灭活油乳苗的免疫增强作用;然后采用新城疫病毒F基因为试验材料、以鸡补体C3d的受体结合功能区P29作为分子佐剂,构建了C3d-P29.n（n=2、4、6）多聚体分子佐剂新城疫F基因疫苗,并经过检测证明了其具有较好的免疫保护效果。本研究成果为以后研制禽类的其他有效细菌及病毒性疫苗提供了理论基础和技术支撑。本研究主要内容如下:1、不同畜禽补体C3d基因的克隆及序列分析:从不同畜禽的肝细胞提取总RNA,通过RT-PCR扩增出C3d基因的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定后进行序列测定,然后进行C3d序列比较、CR2结合区同源性分析比较。结果表明,畜禽补体C3d基因同源性相差较大,进化树反映出C3d基因具有种的多样性,亲缘关系越近,进化关系也越近。对CR2结合区分析发现,禽类的该区为29个氨基酸,而哺乳动物的为28个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为40%,而哺乳动物之间的同源性高达80%,证明补体C3d及CR2结合区具有种属的特异性。另外,用生物学软件对补体C3d基因编码的氨基酸序列以及蛋白结构进行了分析、用ESyPred 3D同源建模等软件对补体C3d的三级结构进行了三维结构预测和分子特征分析,分析结果显示,C3d 3D模型是一种由核心和外层构成的桶状分子结构。本研究为进一步研究动物C3d分子佐剂基因疫苗奠定了基础。2、鸡补体C3d原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化:补体C3d是补体系统（Complement system,CS）中补体C3的最终裂解产物。为研究其免疫增强的生物学功能,利用RT-PCR技术从罗曼蛋鸡肝脏总RNA中扩增出C3d cDNA,经克隆测序证实所得基因为C3d。然后,将其连接至表达载体pET-32a（+）,转化E. coli BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,目的基因在大肠杆菌中以包涵体的形式进行了高效表达,Western-blotting证实目的蛋白为C3d。包涵体蛋白通过尿素溶解液洗涤并溶解后,经硫酸铵盐析、透析、浓缩和Sephadex G-200凝胶过滤层析,重组C3d蛋白得到纯化。最后,SDS-PAGE及Western-blotting检测验证该C3d表达蛋白得到很好的纯化,并且纯化后的表达蛋白仍具有良好的反应原性。本研究为进一步研究、利用鸡补体C3d蛋白提供了保证。3、鸡补体C3d重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究:从SDS-PAGE凝胶中分离纯化原核表达的重组C3d蛋白,用戊二醛将其与大肠杆菌抗原连接,免疫注射SPF鸡;对照组鸡免疫注射完全弗氏佐剂大肠杆菌疫苗。分别在免疫后的第2、3、4、5、6、7、8、9周采血,用ELISA方法测定血清中的抗体含量,同时测定血清中总补体活性。结果表明,免疫后3周,弗氏佐剂大肠杆菌疫苗诱导鸡体产生的抗体效价高于C3d佐剂疫苗组,但至第4周,弗氏佐剂疫苗组的抗体水平达到高峰（OD值=0.273±0.044）,然后迅速下降,到第9周降至0.200±0.055,而C3d疫苗组鸡免疫后的抗体水平持续上升,从免疫后第2周的0.099±0.030上升到第9周的0.275±0.020。证明原核表达的C3d能够促进免疫记忆细胞的产生,并能够使细菌抗原给予免疫细胞持续稳定的刺激,从而使鸡体维持高水平抗体的时间延长。研究结果为研制有效的家禽细菌性疫苗提供了理论依据。4、鸡补体C3d重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究:为进一步探讨重组鸡补体C3d蛋白的佐剂作用,本试验观察了原核表达纯化后的重组鸡补体C3d蛋白和新城疫灭活油乳苗共同免疫鸡群之后,重组鸡补体C3d蛋白对新城疫灭活油乳苗的免疫协同作用。将7日龄雏鸡分为三组进行免疫注射,作用结果显示联合免疫灭活油乳苗和重组鸡补体C3d蛋白的鸡群,在免疫后1～7周（即14～57日龄）整个观察期内,不但其胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA的反应均明显强于单纯油乳苗免疫组（其中除在接种后第1周时两组鸡的B淋巴细胞增殖OD值差异不显着外,其余各检测时间两组间均表现为差异显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）,特别是T淋巴细胞增殖情况在接种第2周后均表现为差异极显着（P<0.01））;而且联合免疫组的HI抗体效价水平也持续性高于单纯油乳苗免疫鸡群,并在免疫接种后5～7周时差异显着（P<0.05）。在免疫接种后第7周时进行的攻毒保护试验中,联合免疫组的保护率为100%,而单纯油乳苗免疫组鸡在观察期内则有3只发病,保护率为83.3%,且有1只死亡。总之,本试验所用重组鸡补体C3d蛋白和灭活油乳苗联合免疫可显着提高机体的体液免疫和细胞免疫水平,产生了较好的免疫协同作用,使机体对新城疫病毒的综合免疫保护能力得到进一步的增强,从而初步验证了重组C3d蛋白的免疫佐剂作用。5、新城疫病毒C3d-P29分子佐剂F基因疫苗的构建及其表达:C3d是补体C3的裂解产物之一,与抗原相连时可以明显提高抗原分子的免疫原性。CR2/CD21在其功能发挥过程中起到重要作用,P29为编码C3d与CR2结合区域的基因。在克隆出C3d cDNA基础上,设计引物克隆P29至pUC19载体,利用同裂酶BamH I和Bgl II构建pUC-P29.n。酶切获得P29.n,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）。最后RT-PCR扩增新城疫F基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA-P29.n中P29.n的上游,构建完成新城疫F基因疫苗,用IFA法检测pcDNA-F-C3d-P29.n可在CEF中大量表达。本研究为进一步研究补体C3d的分子佐剂效应以及开发和利用鸡C3d奠定了基础。6、鸡C3d-P29重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3含量的初步研究:为验证鸡补体C3d-P29分子佐剂作用,本试验比较研究了免疫注射含有鸡C3d-P29基因重组表达质粒之后的鸡血清中补体水平及其补体C3含量与含有异种动物（如小鼠）CR2结合区基因序列重组质粒或空白对照之间的差异,以探讨鸡补体C3d基因重组质粒能否特异性的增强鸡补体总活性与补体C3含量。根据构建的真核表达重组质粒不同分为五组对鸡进行免疫注射,具体为空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组;含有新城疫F基因的pcDNA3.1-F组;含有新城疫F基因以及鸡CR2结合区（P29）基因序列C3d-P29六聚体的pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组;含有新城疫F基因以及小鼠CR2结合区（P28）基因序列C3d-P28六聚体的pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组。分别采取各组经二免后成年鸡的新鲜血清,测定其补体总活性;利用生化合成的C3α链N端21肽,经免疫家兔后制备的抗鸡C3抗体,具有能够与鸡血清中的补体C3发生特异性反应的特性,用来测定注射过不同真核表达质粒后鸡血清中C3含量差异。结果表明,空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组; pcDNA3.1-F组; pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组和pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组五个试验组鸡血清中的补体C3含量分别为0.34±0.005mg/mL、1.47±0.008mg/mL、1.70±0.005mg/mL、1.78±0.007mg/mL和4.18±0.008mg/mL。免疫鸡补体C3d（pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组）的鸡血清中补体总活性和C3含量都远远高于其他组,差异极显着（P<0.01）;并且鸡C3d重组质粒能特异性增强鸡补体总活性与C3含量,差异极显着（P<0.01）。7、新城疫补体C3d分子佐剂疫苗免疫效果的研究:在克隆了鸡C3d cDNA和新城疫F48E9株F基因cDNA的基础上,构建编码CR2结合区P29基因的多聚体,以此多聚体为分子佐剂构建了新城疫F基因疫苗pcDNA3.1-F-C3d-P29.2、pcDNA3.1-F-C3d-P29.4、pcDNA3.1-F-C3d-P29.6及pcDNA3.1-F,通过了实验室安全检验和效力检验。将含有不同个数P29基因的多聚体作为分子佐剂的新城疫F基因疫苗、新城疫油乳剂灭活苗以及质粒载体作为对照分别免疫SPF鸡,利用MTT法、血凝抑制法（HI）和ELISA等分别检测不同疫苗免疫后的细胞免疫和体液免疫水平,并在免疫后第五周进行了攻毒试验。最后,还进行了重组鸡补体C3d质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d蛋白（rChC3d）对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验。结果表明,以补体C3d-P29为分子佐剂的新城疫F基因重组疫苗安全性好;虽然免疫后抗体水平和保护率不如新城疫油乳剂灭活苗,但是能够抵抗致死量病毒的攻击,具有较好的保护作用,其中以pcDNA3.1-F-C3d-P29.6效果更好;MTT法测定T淋巴细胞转化结果表明,补体C3d-P29.6佐剂能显着促进淋巴细胞转化,多数时间点与油佐剂的效果相当,部分时间点显着强于油佐剂。MTT法检测pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果显示pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6免疫组峰值较rChC3d协同免疫组出现时间稍晚,但随后质粒免疫组可维持在更高的水平值。这表明pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6在体内持续的时间更长。本研究中C3d分子佐剂疫苗免疫效果的验证,为进一步开发和利用鸡C3d奠定了基础。
邹庆[9]（2010）在《基于DEV gC基因FQ-PCR方法建立及gC基因疫苗在免疫小鼠体内分布规律的研究》文中认为本论文围绕鸭病毒性肠炎病毒（DEV） gC基因检测方法、DEV gC基因疫苗免疫小鼠后在机体的动态分布开展了下列研究：①检测DEV gC基因的实时荧光定量PCR （FQ-PCR）方法的建立。②将DEV gC基因疫苗（pcDNA-DEV-gC）分别以基因枪轰击法（6μg／只、3μg／只、1μg／只）,肌肉注射法（200μg／只、100μg／只、50gg／只）,肌肉注射阳性脂质体/pcDNA-DEV-gC纳米粒和壳聚糖/pcDNA-DEV-gC纳米粒,口服阳性脂质体/pcDNA-DEV-gC纳米粒和壳聚糖/pcDNA-DEV-gC纳米粒的方法免疫4周龄BALB/c小鼠,免疫后不同时间分别取各组小鼠的免疫部位（皮肤或肌肉）、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、胸腺、十二指肠、直肠和盲肠等组织器官,用建立的FQ-PCR的方法检测pcDNA-DEV-gC在BALB/C小鼠体内的动态分布。获得如下结果：1.建立的FQ-PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,标准曲线扩增效率为100%,核酸模板数与FQ-PCR测定的Ct值相关系数达到1.000,具有很好的线性关系,使用方程Y=-3.321X+45.822能够对未知样品进行精确定量（Y=样品Ct值,X=样品拷贝数的对数值）,不仅能够用于研究pcDNA-DEV-gC在小鼠体内的动态分布,而且可以用于DEV的临床快速检测。2. pcDNA-DEV-gC在小鼠体内的分布规律：各免疫组免疫小鼠1h即可在各组织器官中检测到pcDNA-DEV-gC,基因枪轰击组和肌肉注射组检测到免疫部位含量最高,其次是肝脏、脾脏和胸腺,肌肉注射脂质体和口服脂质体检测到肝脏和脾脏含量最高,肌肉注射壳聚糖和口服壳聚糖检测到十二指肠和直肠含量最高。到18wk时,各免疫组各个组织器官内仍然能够检测到pcDNA-DEV-gC的存在,但多数组织器官中的含量比免疫1h时降低了约102-104。3.不同免疫剂量与分布的关系：不同剂量pcDNA-DEV-gC免疫小鼠各组织中的含量呈现的总体规律为6μg组>3μg组>1μg组,200μg组>100μg组>50μg组。在基因枪轰击三个免疫剂量组中,基因疫苗的剂量与基因疫苗在小鼠组织中的含量呈现较弱的正相关性,各剂量之间差异不显着（P>0.05）。在肌肉注射三个免疫剂量组中,基因疫苗的剂量与基因疫苗在小鼠组织中的含量呈现正相关性,1h-3d差异显着（P<0.05）,3d-18wk差异不显着（P>0.05）。4.基因枪轰击基因疫苗剂量很小,但在小鼠组织中检测出的含量与肌肉注射相似。脂质体和壳聚糖各有优势,脂质体组检测含量最大的组织是肝脏和脾脏,壳聚糖组检测含量最大的组织是十二指肠和直肠。
符芳,李曦,李雪松,李海忠,陈欣,王伟,魏萍[10]（2010）在《猪圆环病毒2型衣壳蛋白（Cap）在293T细胞中的亚细胞定位》文中进行了进一步梳理猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因编码病毒的核衣壳蛋白（Cap）,该蛋白属于病毒保护性抗原,具有重要免疫功能。本研究以PCV2871毒株基因组为模板,用特异性上下游引物扩增获得ORF2基因,利用真核表达载体构建了表达PCV2Cap蛋白的重组质粒pCAGGS-ORF2。采用脂质体将pCAGGS-ORF2转染至293T细胞,用抗PCV2-Cap单克隆抗体对重组质粒转染细胞进行了免疫活性分析和免疫荧光检测,表明Cap蛋白在细胞中获得表达;利用共聚焦显微镜对Cap蛋白在293T细胞中的亚细胞定位观察结果表明,转染24h后可见Cap蛋白的表达随培养时间延长显着增多,72h达到高峰,表达的Cap蛋白主要分布在细胞核中。构建的pCAGGS-ORF2真核表达重组质粒在293T细胞中的表达,为进一步PCV2基因疫苗的研制奠定了基础。
二、基因疫苗及其在猪传染病中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、基因疫苗及其在猪传染病中的应用（论文提纲范文）
（1）上海市几种猪传染病的流行病学调查研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一篇 综述 几种重要猪病研究进展概述 |
| 1 口蹄疫(FMD)的研究进展 |
| 1.1 口蹄疫的概述 |
| 1.2 病原学 |
| 1.3 流行病学 |
| 1.4 临床症状和病理变化 |
| 1.5 诊断和防控 |
| 2 猪瘟(CSF)的研究进展 |
| 2.1 猪瘟的概述 |
| 2.2 病原学 |
| 2.3 流行病学 |
| 2.4 临床症状和病理变化 |
| 2.5 诊断和防控 |
| 3 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的研究进展 |
| 3.1 猪繁殖与呼吸综合征的概述 |
| 3.2 病原学 |
| 3.3 流行病学 |
| 3.4 临床症状和病理变化 |
| 3.5 诊断和防控 |
| 4 猪伪狂犬病(PR)的研究进展 |
| 4.1 猪伪狂犬病的概述 |
| 4.2 病原学 |
| 4.3 流行病学 |
| 4.4 临床症状和病理变化 |
| 4.5 诊断和防控 |
| 5 猪圆环病毒病(PCVD)的研究进展 |
| 5.1 猪圆环病毒病的概述 |
| 5.2 病原学 |
| 5.3 流行病学 |
| 5.4 临床症状和病理变化 |
| 5.5 诊断和防控 |
| 6 猪流行性腹泻(PED)的研究进展 |
| 6.1 猪流行性腹泻的概述 |
| 6.2 病原学 |
| 6.3 流行病学 |
| 6.4 临床症状和病理变化 |
| 6.5 诊断和防控 |
| 第二篇 上海市几种猪传染病的流行病学调查研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 血清学检测材料 |
| 1.1.1 疫苗 |
| 1.1.2 血清样品来源 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.2 分子生物学检测材料 |
| 1.2.1 样品 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 1.2.3 主要仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 血清学检测方法 |
| 2.1.1 样品抽样方法 |
| 2.1.2 血清样品采集 |
| 2.1.3 血清样品处理 |
| 2.1.4 抗体检测方法 |
| 2.1.4.1 O型口蹄疫病毒抗体检测方法 |
| 2.1.4.2 口蹄疫病毒非结构蛋白(3ABC)抗体检测方法 |
| 2.1.4.3 猪瘟病毒抗体检测方法 |
| 2.1.4.4 猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测方法 |
| 2.1.4.5 伪狂犬病毒gB抗体检测方法 |
| 2.1.4.6 伪狂犬病毒gE抗体检测方法 |
| 2.1.4.7 猪流行性腹泻病毒抗体检测方法 |
| 2.2 分子生物学检测方法 |
| 2.2.1 样品抽样方法 |
| 2.2.2 样品采集 |
| 2.2.3 样品处理 |
| 2.2.4 核酸提取 |
| 2.2.5 病原学检测方法 |
| 2.2.5.1 荧光RT-PCR检测猪瘟病毒 |
| 2.2.5.2 荧光RT-PCR检测口蹄疫病毒 |
| 2.2.5.3 荧光RT-PCR检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 |
| 2.2.5.4 荧光PCR检测伪狂犬病毒 |
| 2.2.5.5 荧光PCR检测猪圆环病毒2型 |
| 2.2.5.6 荧光RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒 |
| 3 结果 |
| 3.1 猪群疫病定点流行病学调查 |
| 3.2 定点监测猪场主要疫病监测 |
| 3.3 市级定点流调规模猪场主要疫病监测 |
| 3.4 市级种猪场主要疫病监测 |
| 3.5 生猪屠宰场上市肉猪主要疫病流行病学调查 |
| 3.6 发病猪场和委托检测样品检测结果 |
| 4 讨论与分析 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（2）FAdV-4 pcDNA3.1-Penton重组质粒的构建及免疫原性的初步探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 I群禽腺病毒的概述 |
| 1.1.1 腺病毒的分类 |
| 1.1.2 禽腺病毒的形态结构和理化特性 |
| 1.1.3 禽腺病毒的主要蛋白及其功能 |
| 1.2 安卡拉病流行病学 |
| 1.3 禽腺病毒疫苗研究 |
| 1.3.1 全病毒灭活疫苗 |
| 1.3.2 弱毒疫苗 |
| 1.3.3 亚单位疫苗 |
| 1.3.4 基因疫苗 |
| 1.4 本试验研究目的与意义 |
| 2 试验一 FAdV-4中Penton基因重组质粒的构建 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 病料来源 |
| 2.1.2 主要试剂及厂家 |
| 2.1.3 试验仪器及厂家 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 主要溶液的配制 |
| 2.2.2 FAdV-4 Penton基因PCR扩增 |
| 2.2.3 Penton基因克隆及鉴定 |
| 2.2.4 菌液中质粒提取及 PCR 扩增 |
| 2.2.5 Penton基因重组质粒的构建及鉴定 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 Penton基因PCR扩增结果 |
| 2.3.2 Penton基因克隆鉴定 |
| 2 3.3 Penton 重组质粒鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 试验二 Penton基因重组质粒免疫雏鸡后免疫原性的初探 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 主要仪器及厂家 |
| 3.1.2 主要试剂及厂家 |
| 3.1.3 试验动物 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 主要溶液配制 |
| 3.2.2 质粒大量制备 |
| 3.2.3 雏鸡免疫试验 |
| 3.3 试验结果与分析 |
| 3.3.1 血清中FAdV-4 抗体水平结果与分析 |
| 3.3.2 血清中IFN-γ含量结果与分析 |
| 3.3.3 血清中IL-6 含量结果与分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（3）PEDV S蛋白抗原表位基因重组减毒沙门氏菌的构建及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪流行性腹泻病毒病原学、流行病学、分子生物学特征及其疫苗的研究进展 |
| 1.1 病原学 |
| 1.2 流行病学 |
| 1.3 分子生物学 |
| 1.3.1 基因组结构及其编码蛋白 |
| 1.3.2 S基因及其编码蛋白研究进展 |
| 1.4 PED疫苗研究进展 |
| 1.4.1 灭活疫苗 |
| 1.4.2 弱毒疫苗 |
| 1.4.3 重组活病毒载体疫苗 |
| 1.4.4 转基因植物疫苗 |
| 1.4.5 重组乳酸菌疫苗 |
| 2 减毒沙门氏菌作为基因疫苗载体的研究现状 |
| 2.1 减毒猪霍乱沙门氏菌作为基因疫苗载体的研究 |
| 2.1.1 国外研究现状 |
| 2.1.2 国内研究现状 |
| 2.2 减毒猪霍乱沙门氏菌载体的优点和潜在威胁 |
| 本研究目的和意义 |
| 第二章 猪流行性腹泻病毒S蛋白抗原表位串联基因的构建及其原核表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 生物材料及试剂 |
| 1.1.2 主要仪器设备 |
| 1.1.3 主要溶液配制 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 引物设计和合成 |
| 1.2.2 猪流行性腹泻病毒总RNA的提取 |
| 1.2.3 两步法RT-PCR扩增PEDV S蛋白两个中和表位区片段 |
| 1.2.4 目的片段的回收 |
| 1.2.5 目的基因的T-A克隆 |
| 1.2.6 重组质粒pMD-SAB的构建 |
| 1.2.7 重组质粒pET-SAB的构建 |
| 1.2.8 重组表达菌株的制备、培养及诱导表达 |
| 1.2.9 表达蛋白的可溶性检测 |
| 1.2.10 重组表达融合蛋白的SDS-PAGE电泳研究 |
| 2 结果 |
| 2.1 SA、SB片段的RT-PCR扩增及T-A克隆 |
| 2.2 重组质粒pMD-SAB和pET-SAB构建 |
| 2.3 串联基因SAB的序列分析 |
| 2.4 重组菌诱导表达、纯化、SDS-PAGE和Western-blot分析 |
| 3 讨论 |
| 第三章 运送PEDV S蛋白抗原表位重组真核质粒的减毒沙门氏菌的构建及其小鼠免疫实验 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 工具酶和试剂盒 |
| 1.1.3 实验动物 |
| 2 方法 |
| 2.2 重组沙门氏菌的构建 |
| 2.2.1 引物设计和合成 |
| 2.2.2 真核表达载体pVAX1-SA的构建 |
| 2.2.3 真核表达载体pVAX1-SAB的构建 |
| 2.2.4 重组质粒转染Vero细胞 |
| 2.2.5 目的基因的表达检测 |
| 2.2.6 pVAX1-SA和pVAX1-SAB转化入减毒沙门氏菌S.C 500 |
| 2.2.6.1 TSS法制备S.C 500感受态细胞 |
| 2.2.6.2 重组菌S.C 500/pVAX1-SA和S.C 500/pVAX1-SAB的构建 |
| 2.2.6.3 重组菌S.C 500/pVAX1-SA和S.C 500/pVAX1-SAB的鉴定 |
| 2.3 重组沙门氏菌对小鼠的安全性试验 |
| 2.4 重组沙门氏菌的体外稳定性试验 |
| 2.5 重组沙门氏菌对小鼠不同组织的侵袭力及消长变化 |
| 2.6 重组沙门氏菌的小鼠免疫实验 |
| 2.6.1 肌注免疫真核质粒pVAX1、pVAX1-SA和pVAX1-SAB的制备 |
| 2.6.2 口服免疫重组沙门氏菌的制备 |
| 2.6.3 实验小鼠分组与免疫程序 |
| 2.6.4 小鼠血清中PEDV抗体测定 |
| 2.6.5 小鼠粘膜和粪便中PEDV特异性IgA抗体测定 |
| 2.6.6 小鼠血清中PEDV特异性IgG抗体亚类测定 |
| 3 结果 |
| 3.1 重组质粒pVAX1-SA的构建 |
| 3.2 重组质粒pVAX1-SAB的构建 |
| 3.3 目的基因的细胞内表达检测 |
| 3.4 重组沙门氏菌的构建 |
| 3.5 重组沙门氏菌安全性试验 |
| 3.6 重组沙门氏菌体外稳定性试验 |
| 3.7 重组沙门氏菌对小鼠不同组织的侵袭性及消长变化 |
| 3.8 小鼠PEDV特异性抗体测定 |
| 3.9 小鼠血清PEDV特异性IgG抗体亚类测定 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（4）C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 核酸疫苗的研究进展 |
| 1.1.1 核酸疫苗的构成 |
| 1.1.1.1 抗原编码基因 |
| 1.1.1.2 真核表达质粒载体 |
| 1.1.2 核酸疫苗的分类 |
| 1.1.3 核酸疫苗可能的作用机制 |
| 1.1.4 核酸疫苗的免疫 |
| 1.1.4.1 靶细胞的选择 |
| 1.1.4.2 接种前动物组织的预处理 |
| 1.1.4.3 核酸疫苗的接种方法和途径 |
| 1.1.4.4 核酸疫苗的接种剂量 |
| 1.1.4.5 核酸疫苗的免疫佐剂选择 |
| 1.1.4.5.1 细胞因子佐剂 |
| 1.1.4.5.2 协同刺激分子佐剂 |
| 1.1.4.5.3 补体佐剂 |
| 1.1.4.5.4 免疫刺激序列( |
| 1.1.4.5.5 霍乱毒素(choleratoxin,CT)和大肠杆菌不耐热肠毒素( |
| 1.1.4.5.6 蛋白转换域( |
| 1.1.4.5.7 模拟或增强 MHC 作用 |
| 1.1.5 核酸疫苗的应用 |
| 1.1.5.1 寄生虫核酸疫苗 |
| 1.1.5.2 细菌核酸疫苗 |
| 1.1.5.3 病毒核酸疫苗 |
| 1.1.6 核酸疫苗研究的意义及展望 |
| 1.2 分子佐剂补体C3d 的研究进展 |
| 1.2.1 补体系统的组成 |
| 1.2.1.1 补体固有成分 |
| 1.2.1.2 补体调节蛋白 |
| 1.2.1.3 补体受体 |
| 1.2.2 补体的激活 |
| 1.2.2.1 经典激活途径 |
| 1.2.2.2 旁路途径 |
| 1.2.2.3 凝集素途径 |
| 1.2.3 C3d 的结构特征及生物学功能 |
| 1.2.3.1 C3d 的产生 |
| 1.2.3.2 C3d 的分子结构 |
| 1.2.3.3 C3d 的天然受体CR2 |
| 1.2.3.4 CR2 与C3d 的结合位点 |
| 1.2.4 C3d 佐剂作用的研究方法 |
| 1.2.4.1 C3d 分子间的直接串联 |
| 1.2.4.2 C3d 与CR2 结合功能区的串联 |
| 1.2.5 C3d 分子的佐剂作用 |
| 1.2.5.1 C3d 对体液免疫应答的影响 |
| 1.2.5.2 C3d 对细胞免疫应答的影响 |
| 1.2.5.3 C3d 对细胞因子表达类型的影响 |
| 1.2.5.4 对抗原特异性体液和细胞免疫的负向调节作用 |
| 1.2.5.5 小鼠品系对C3d 免疫作用的影响 |
| 1.2.6 C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 1.2.6.1 C3d 偶联抗原可增强CR2细胞（B 细胞，FDC 等）对抗原的摄取 |
| 1.2.6.2 促进B 细胞活化，降低B 细胞的活化阈 |
| 1.2.6.3 促进抗体亲合力成熟 |
| 1.2.6.4 上调Raji 细胞协同刺激分子87-1 和87-2 的表达 |
| 1.2.6.5 依赖B 细胞CR2 受体，且相应的抗原必须与C3d 偶联在一起才能发挥作用 |
| 1.2.7 不同动物C3d 的研究 |
| 1.3 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5 蛋白研究进展 |
| 1.3.1 PRRSV 的结构及其生物学特性 |
| 1.3.1.1 PRRSV 的形态结构 |
| 1.3.1.2 PRRSV 的理化性质 |
| 1.3.1.3 PRRSV 的生物学结构 |
| 1.3.1.4 PRRSV GP5 蛋白 |
| 1.3.2 PRRSV 的免疫特性 |
| 1.3.3 PRRSV 的持续性感染与免疫抑制 |
| 1.3.4 PRRS 的诊断方法研究进展 |
| 1.3.4.1 病毒的分离与鉴定 |
| 1.3.4.2 抗原检测方法 |
| 1.3.4.3 PRRSV 的分子生物学诊断 |
| 1.3.4.4 血清学诊断 |
| 1.3.5 基于GP5 蛋白的疫苗研究进展 |
| 1.3.5.1 核酸疫苗 |
| 1.3.5.2 重组多肽疫苗 |
| 1.3.5.3 活载体疫苗 |
| 1.4 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 毒株和菌株 |
| 2.1.2 载体 |
| 2.1.3 试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 试验动物 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 溶液及配制 |
| 2.1.7 RT-PCR 相关物品的处理 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 哺乳动物鼠、猪的补体C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 2.2.1.1 鼠、猪C3d 基因的克隆 |
| 2.2.1.2 C3d 和pMD18-T 载体的构建 |
| 2.2.1.3 鼠、猪C3d 基因的测序 |
| 2.2.1.4 哺乳动物与禽类补体C3d 基因序列的比较分析 |
| 2.2.2 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗的构建 |
| 2.2.2.1 鼠、猪C3d-p28 串联体的构建 |
| 2.2.2.2 pcDNA3.1-C3d-p28.n(n=2，4，6)的构建 |
| 2.2.2.3 PRRSV GP5 基因的扩增 |
| 2.2.2.4 pcDNA3.1-GP5-C3d-p28(29).n 重组质粒的构建 |
| 2.2.3 不同动物C3d 分子佐剂对PRRSV GP5 核酸疫苗免疫增强效果研究 |
| 2.2.3.1 重组质粒在Marc145 细胞的表达 |
| 2.2.3.2 GP5 核酸疫苗免疫小鼠效果检测 |
| 2.2.3.3 数据处理和分析 |
| 2.2.4 鼠C3d 分子佐剂沙门氏菌invH 核酸疫苗的构建及免疫效果研究 |
| 2.2.4.1 重组质粒pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.2 4 6 的构建 |
| 2.2.4.2 重组质粒在Marc145 细胞的表达 |
| 2.2.4.3 invH 重组质粒免疫小鼠效果检测 |
| 2.2.4.4 数据处理和分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 哺乳动物鼠、猪的补体C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 3.1.1 鼠、猪C3d 基因克隆的电泳结果 |
| 3.1.2 pMD18-T-C3d 的PCR 及酶切鉴定 |
| 3.1.3 补体C3d cDNA 的测序及序列分析 |
| 3.1.3.1 鼠、猪的C3d 序列 |
| 3.1.3.2 C3d 基因序列比较分析 |
| 3.1.3.3 CR2 结合区氨基酸同源性比较 |
| 3.2 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗的构建 |
| 3.2.1 C3d-p28 串联体的构建 |
| 3.2.1.1 单拷贝C3d-p28 基因克隆 |
| 3.2.1.2 C3d-p28 串联体的构建 |
| 3.2.2 RT-PCR 扩增PRRSV GP5 基因 |
| 3.2.3 pcDNA3.1-GP5-C3d-p28(29).n 重组质粒的构建 |
| 3.3 不同动物C3d 分子佐剂对PRRSV GP5 核酸疫苗免疫增强效果研究 |
| 3.3.1 GP5 表达结果 |
| 3.3.2 安全性检验结果 |
| 3.3.3 GP5 核酸疫苗的免疫效果 |
| 3.3.3.1 抗体水平检测结果 |
| 3.3.3.2 中和抗体测定结果 |
| 3.3.3.3 IFN-γ含量的测定结果 |
| 3.3.3.4 IL-4 含量的测定 |
| 3.4 鼠C3d 分子佐剂沙门氏菌invH 核酸疫苗的构建及免疫效果研究 |
| 3.4.1 pcDNA3.1-invH-mC3d-p28.n 重组质粒的构建 |
| 3.4.2 invH 表达结果 |
| 3.4.3 安全性检验结果 |
| 3.4.4 invH 核酸疫苗的免疫效果 |
| 3.4.4.1 invH 抗体水平结果 |
| 3.4.4.2 小鼠血清中IL-4 和IFN-γ的含量 |
| 3.4.4.3 小鼠攻毒保护试验 |
| 4 讨论 |
| 4.1 哺乳动物鼠、猪的补体C3d 基因的克隆 |
| 4.2 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗构建 |
| 4.3 不同动物C3d 分子佐剂PRRSV GP5 核酸疫苗免疫增强效果研究的意义 |
| 4.4 鼠C3d 沙门氏菌invH 核酸疫苗构建及免疫效果研究的意义 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 博士学位论文内容简介及自评 |
（5）PPV和PCV2核酸疫苗及PRV-PPV-PCV2基因工程疫苗的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 猪细小病毒研究概述 |
| 1.1 猪细小病毒病的发生与流行特点 |
| 1.2 猪细小病毒病原学 |
| 1.2.1 病毒特性 |
| 1.2.2 猪细小病毒基因组结构 |
| 1.2.3 基因组产物 |
| 1.3 猪细小病毒病疫苗研究进展 |
| 1.3.1 灭活疫苗 |
| 1.3.2 弱毒疫苗 |
| 1.3.3 新型疫苗 |
| 2 猪圆环病毒概述 |
| 2.1 猪圆环病毒病的发生与流行特点 |
| 2.2 猪圆环病毒病原学 |
| 2.2.1 猪圆环病毒病原特性 |
| 2.2.2 猪圆环病毒基因组结构 |
| 2.2.3 猪圆环病毒基因组产物 |
| 2.3 PCV2与免疫的关系 |
| 2.4 猪圆环病毒疫苗研究进展 |
| 2.4.1 PCV灭活疫苗 |
| 2.4.2 PCV弱毒疫苗 |
| 2.4.3 核酸疫苗 |
| 2.4.4 重组活载体疫苗 |
| 2.4.5 其他 |
| 3. 核酸疫苗研究进展 |
| 4. 伪狂犬病毒载体研究进展 |
| 5. 本文研究的目的和意义 |
| 第二章 四川省PPV与PCV2病原流行病学调查 |
| 1 试验材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 样品的收集 |
| 1.4 样品的处理 |
| 1.5 检测方法 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 总体阳性率 |
| 2.2 各生产阶段阳性率 |
| 2.3 猪场阳性率 |
| 3. 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 PPV和PCV2核酸疫苗的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株及细胞 |
| 1.2 主要试剂及药品 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 真核表达载体PCI-VP2的构建 |
| 1.4.1 质粒pMD-VP2的小量制备 |
| 1.4.2 PPV VP2基因亚克隆 |
| 1.4.3 真核表达载体pCI-VP2的构建 |
| 1.5 真核表达载体PCI-ORF2的构建 |
| 1.5.1 质粒pMD-ORF2的小量制备 |
| 1.5.2 PCV2 ORF2基因亚克隆 |
| 1.5.3 真核表达载体pCI-ORF2的构建 |
| 1.6 真核表达载体pCI-VP2-ORF2的构建 |
| 1.6.1 质粒pCI-VP2和pCI-ORF2的小量制备 |
| 1.6.2 pCI-VP2和ORF2基因的酶切与回收 |
| 1.6.3 连接与转化 |
| 1.6.4 重组质粒的酶切鉴定 |
| 1.6.5 重组质粒的PCR鉴定 |
| 1.6.6 重组质粒的序列测定 |
| 1.7 重组质粒转染VERO细胞 |
| 1.7.1 pCI-VP2、pCI-ORF2和pCI-VP2-ORF2质粒DNA的抽提 |
| 1.7.2 pCI-VP2、pCI-ORF2和pCI-VP2-ORF2质粒DNA的转染 |
| 1.8 重组质粒表达分析 |
| 1.8.1 真核表达转录RT-PCR检测 |
| 1.8.2 SDS-PAGE及Western blotting分析 |
| 1.8.3 间接免疫荧光检测 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 真核表达载体pCI-VP2的构建 |
| 2.1.1 PPV VP2基因的PCR扩增 |
| 2.1.2 pMD-VP2(A)的酶切鉴定 |
| 2.1.3 pCI-VP2的酶切鉴定 |
| 2.2 真核表达载体PCI-ORF2的构建 |
| 2.2.1 PCV2 ORF2基因的PCR扩增 |
| 2.2.2 pMD-ORF2(A)的酶切鉴定 |
| 2.2.3 pCI-ORF2的酶切鉴定 |
| 2.3 真核表达载体PCI-VP2-ORF2的构建 |
| 2.3.1 pCI-VP2-ORF2的酶切鉴定 |
| 2.3.2 重组质粒的PCR鉴定 |
| 2.3.3 重组质粒的序列测定 |
| 2.4 重组质粒表达分析 |
| 2.4.1 真核表达转录RT-PCR检测 |
| 2.4.2 SDS-PAGE与Western blotting分析 |
| 2.4.3 间接免疫荧光检测 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 核酸疫苗的设计 |
| 3.1.1 目的基因的选择 |
| 3.1.2 表达载体的选择 |
| 3.2 重组质粒的构建策略 |
| 3.2.1 融合基因的设计 |
| 3.2.2 重组构建技术 |
| 3.3 关于表达 |
| 4. 小结 |
| 第四章 PPV和PCV2核酸疫苗对小鼠免疫效果研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒和实验动物 |
| 1.2 主要试剂及药品 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 质粒DNA的大量抽提与纯化 |
| 1.5 质粒DNA的免疫 |
| 1.6 T淋巴细胞数量的动态变化检测 |
| 1.7 脾淋巴细胞增殖反应(MTT比色法) |
| 1.8 抗体检测 |
| 1.8.1 PPV抗体检测 |
| 1.8.2 PCV2抗体检测 |
| 1.9 细胞因子检测 |
| 1.9.1 IL-2检测 |
| 1.9.2 IL-4检测 |
| 1.9.3 IFN-γ检测 |
| 1.10 重组质粒安全性研究 |
| 1.11 统计学分析 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 T淋巴细胞数量的动态变化检测 |
| 2.2 脾淋巴细胞增殖反应的检测(MTT比色法) |
| 2.3 抗体水平检测 |
| 2.3.1 PPV抗体检测 |
| 2.3.2 PCV2抗体检测 |
| 2.4 细胞因子检测 |
| 2.4.1 IL-2检测 |
| 2.4.2 IL-4检测 |
| 2.4.3 IFN-γ检测 |
| 2.5 重组质粒安全性研究 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 核酸疫苗对小鼠免疫效力的研究 |
| 3.2 核酸疫苗的免疫途径与剂量 |
| 3.3 细胞免疫应答 |
| 3.4 体液免疫应答 |
| 3.5 核酸疫苗的安全性 |
| 4. 小结 |
| 第五章 PPV-PCV2-PRV三价基因工程疫苗PRV SA215(D1)的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒、菌株及细胞 |
| 1.2 主要试剂及药品 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 质粒PCI-VP2-ORF2的小量制备 |
| 1.5 PPI-2.EGFP.VP2.ORF2的构建 |
| 1.5.1 质粒pPI-2.EGFP与pCI-VP2-ORF2的酶切回收 |
| 1.5.2 连接与转化 |
| 1.6 重组质粒的鉴定 |
| 1.6.1 重组质粒的酶切鉴定 |
| 1.6.2 重组质粒的PCR鉴定 |
| 1.6.3 重组质粒的序列测定 |
| 1.7 PPV-PCV2-PRV三价基因工程疫苗PRV SA215(D1)的构建 |
| 1.7.1 pPI-2.EGFP.VP2.ORF2质粒DNA的抽提 |
| 1.7.2 PRV SA215病毒DNA的抽提 |
| 1.7.3 pPI-2.EGFP.VP2.ORF2质粒与PRV SA215 DNA共转染Vero细胞 |
| 1.8 重组病毒的筛选 |
| 1.9 重组病毒表达分析 |
| 1.9.1 SDS-PAGE及Western blotting分析 |
| 1.9.2 间接免疫荧光分析 |
| 2. 实验结果 |
| 2.1 PPI-2.EGFP.VP2.ORF2的鉴定 |
| 2.1.1 pPI-2.EGFP.VP2.ORF2的酶切鉴定 |
| 2.1.2 pPI-2.EGFP.VP2.ORF2的PCR鉴定 |
| 2.1.3 pPI-2.EGFP.VP2.ORF2的序列测定 |
| 2.2 重组PRV SA215(D1)的构建与筛选 |
| 2.3 重组PRV SA215(D1)的PCR鉴定 |
| 2.4 PRV SA215(D1)的表达分析 |
| 2.4.1 SDS-PAGE及Western blotting分析 |
| 2.4.2 间接免疫荧光分析 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 伪狂犬病病毒载体的优越性 |
| 3.2 重组病毒PRV SA215(D1)的构建 |
| 3.3 外源基因在伪狂犬病病毒载体中的表达 |
| 4. 小结 |
| 第六章 PRV SA215(D1)部分生物学特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞、疫苗和实验动物 |
| 1.2 主要试剂及药品 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 PRV SA215(D1)在VERO细胞上的致病效应观察 |
| 1.5 蚀斑试验 |
| 1.6 一步生长曲线测定 |
| 1.7 PRV SA215(D1)与亲本毒株SA215形态学比较 |
| 1.8 PRV SA215(D1)的遗传稳定性检测 |
| 1.9 PRV SA215(D1)对小鼠的安全性与免疫保护试验 |
| 1.9.1 PRV SA215(D1)对小鼠的安全性试验 |
| 1.9.2 PRV SA215(D1)对小鼠的免疫保护试验 |
| 1.10 PRV SA215(D1)对仔猪的免疫性实验 |
| 1.10.1 试验分组 |
| 1.10.2 外周T淋巴细胞亚群数量的检测 |
| 1.10.3 PRV、PPV、PCV2抗体检测 |
| 1.10.4 细胞因子检测 |
| 2 试验结果 |
| 2.1 PRV SA215(D1)在VERO细胞上的致病效应观察 |
| 2.2 噬斑形态观察 |
| 2.3 一步生长曲线测定 |
| 2.4 PRV SA215(D1)与亲本毒株PRV SA215形态学比较 |
| 2.5 PRV SA215(D1)的遗传稳定性检测 |
| 2.6 PRV SA215(D1)对小鼠的安全性与免疫保护 |
| 2.6.1 PRV SA215(D1)对小鼠的安全性试验 |
| 2.6.2 PRV SA215(D1)对小鼠的免疫保护试验 |
| 2.7 PRV SA215(D1)对仔猪的免疫性实验 |
| 2.7.1 外周T淋巴细胞亚群数量的检测 |
| 2.7.2 PRV抗体检测 |
| 2.7.3 PPV抗体检测 |
| 2.7.4 PCV2抗体检测 |
| 2.8 细胞因子检测 |
| 2.8.1 IL-2检测 |
| 2.8.2 IL-4检测 |
| 2.8.3 IFN-γ检测 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 重组病毒PRV SA215(D1)的培养增殖特性 |
| 3.2 安全性试验 |
| 3.3 PRV SA215(D1)对仔猪的免疫效果 |
| 4. 小结 |
| 本研究的创新之处 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
（6）猪细小病毒病国内流行状况以及防治策略（论文提纲范文）
| 1??病原学 |
| 2??流行病学 |
| 3??发病机理 |
| 4??混合感染 |
| 5??基因与表达 |
| 6??PPV的诊断方法 |
| 6.1?病原学检测 |
| 6.2??血清学诊断 |
| 6.2.1 血凝试验和血凝抑制试验 |
| 6.2.2 血清中和试验 |
| 6.2.3 酶联免疫吸附试验 |
| 6.2.4 免疫荧光技术 |
| 6.2.5 乳胶凝集试验 |
| 6.3?分子生物学诊断技术 |
| 6.3.1 PCR检测技术 |
| 6.3.2 核酸探针技术 |
| 6.3.3 单克隆抗体技术 |
| 6.3.4 基因芯片技术 |
| 7??疫苗防治 |
| 7.1??灭活疫苗 |
| 7.2??弱毒苗 |
| 7.3??基因工程亚单位疫苗及活病毒载体疫苗 |
| 7.4??核酸疫苗 |
| 8??问题与展望 |
（8）畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 DNA 疫苗及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 综述一 DNA 疫苗的研究进展及其免疫应答增强策略 |
| （一） DNA 疫苗的研究进展 |
| 1、核酸疫苗的研究历史 |
| 2、核酸疫苗的组成和分类 |
| 2.1 核酸疫苗的组成 |
| 2.2 核酸疫苗的分类 |
| 3、DNA 疫苗的免疫机制 |
| 4、核酸疫苗的优点及其不足 |
| 4.1 核酸疫苗的优点 |
| 4.2 核酸疫苗的不足 |
| 5、影响DNA 免疫效果的主要因素 |
| 5.1 目的基因的选择 |
| 5.2 载体及启动子的选择 |
| 5.3 增强剂和佐剂的应用 |
| 5.4 接种途径和剂量 |
| 5.5 接种前动物组织的预处理 |
| （二） DNA 疫苗免疫应答增强策略 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 1.1 细胞因子基因佐剂 |
| 1.2 共刺激分子 |
| 1.3 补体佐剂 |
| 1.4 免疫刺激序列（immunostimulation sequence，ISS） |
| 1.5 霍乱毒素（choleratoxin，CT）和大肠杆菌不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT） |
| 1.6 蛋白转换域（protein transduction domains，PTD） |
| 1.7 模拟或增强MHC 作用 |
| 1.8 提高APC 存活时间和捕捉处理抗原的能力 |
| 1.9 提高抗原处理能力 |
| 1.10 双作用子的应用 |
| 2、通过基因修饰改变抗原特性以提高其免疫原性 |
| 3、载体的优化及选择 |
| 3.1 质粒载体 |
| 3.2 细菌载体 |
| 3.3 病毒载体 |
| 4、免疫方案的优化 |
| 4.1 免疫途径 |
| 4.2 免疫工具的选择 |
| 4.3 免疫程序及组合免疫 |
| 5、展望 |
| 综述二 补体系统概述及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| （三） 补体系统概述 |
| 1、补体成分的分类 |
| 1.1 补体系统的固有成分 |
| 1.2 补体系统的调节因子 |
| 1.3 补体受体 |
| 1.4 补体活性片段 |
| 2、补体系统的激活 |
| 2.1 经典激活途径 |
| 2.2 替代途径 |
| 2.3 凝集素途径 |
| （四） CR2-C3d 的结构特征及生物学功能 |
| 1、分子特征 |
| 1.1 C3d 分子 |
| 1.2 CR2(CD21 分子) |
| 1.3 CR2-C3d 结合的结构特征 |
| 2、C3d-CR2 结合介导的生物学效应及作用机理 |
| 2.1 C3d-CR2 结合介导、增强B 细胞Ag 的内化、提呈 |
| 2.2 C3d-CR2 结合促进B 细胞活化及分化 |
| 2.3 C3d-CR2 结合促进记忆性B 细胞的产生 |
| （五） C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 2、C3d 的分子结构 |
| 3、C3d 分子的佐剂作用 |
| 3.1 C3d 可提高抗流感病毒、抗麻疹病毒HA 抗体的水平 |
| 3.2 C3d 可以增强基因免疫效果 |
| 3.3 C3d 可促进抗HIV-1 衣壳蛋白抗体的生成 |
| 3.4 C3d-P28 可在提高体液免疫应答的同时增强基因免疫诱导的HBV 特异性细胞免疫应答 |
| 3.5 C3d 可增强PPS514 的免疫原性、促进Ig 类别转换 |
| 3.6 C3d 负调控HER-2/neu 基因免疫诱导的免疫应答 |
| 3.7 C3d 增强hCGβ的免疫原性、转变免疫应答 |
| 3.8 C3d 与靶抗原共表达的免疫抑制效应 |
| 4、C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 4.1 C3d 偶联抗原可增强CR~(2+)细胞（B 细胞，FDC 等）对抗原的摄取 |
| 4.2 C3d/C3dg 包裹的抗原被 BCR 特异性识别产生抗原刺激信号,同时又与 B 细胞表面的CR2 结合形成交联桥，提供共刺激活化信号，促进B 细胞活化，降低B细胞的活化阈 |
| 4.3 C3d 通过结合CR2、上调IL-4 和转录因子的表达、促进抗体亲合力成熟来增强基因免疫诱导的HBV 特异性免疫应答 |
| 4.4 分子佐剂C3d 上调Raji 细胞协同刺激分子B7-1 和B7-2 的表达 |
| 4.5 C3d 的佐剂作用依赖B 细胞CR2 受体，且相应的抗原必须与C3d 偶联在一起才能发挥作用 |
| （六） 本研究的目的及意义 |
| 第二部分 试验研究部分 |
| 一 不同畜禽补体C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 载体 |
| 1.1.3 试剂及试剂盒 |
| 1.1.4 试验动物 |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.1.6 试验所用溶液及其配制 |
| 1.1.7 RT-PCR 相关物品的处理 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 引物设计 |
| 1.2.3 RT- PCR 扩增C3d cDNA |
| 1.2.4 制作感受态细胞 |
| 1.2.5 PCR 产物与pMD18-T 的连接 |
| 1.2.6 连接物的转化 |
| 1.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 1.2.8 测序 |
| 1.2.9 补体C3d 基因序列分析 |
| 1.2.10 补体C3d 基因蛋白质结构分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR 扩增C3d cDNA |
| 2.2 pMD18-T-C3d 的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 补体C3d cDNA 的测序及序列分析 |
| 2.3.1 测序结果递交GenBank |
| 2.3.2 利用DNASTAR 软件进行C3d 基因序列比较分析 |
| 2.3.3 DNAMAN 及Vector NTI 软件进行CR2 结合区氨基酸同源性比较 |
| 2.4 蛋白序列结构及功能特征预测 |
| 2.4.1 ProtParam tool 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行理化性质分析 |
| 2.4.2 ProtFun 2.2 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行蛋白功能推测分析 |
| 2.4.3 补体C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测分析 |
| 2.4.4 补体C3d 基因编码的蛋白质三级结构预测分析 |
| 3 讨论 |
| 二 鸡补体C3d 原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体与受体菌 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂 |
| 1.1.5 包涵体纯化的有关试剂 |
| 1.1.6 免疫转印有关试剂和材料 |
| 1.1.7 仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鸡肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 RT-PCR 及C3d cDNA 的克隆、测序 |
| 1.2.3 C3d 原核表达载体的构建 |
| 1.2.4 重组质粒的提取与初步筛选 |
| 1.2.5 pET-C3d 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 1.2.6 重组菌表达条件的优化 |
| 1.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 1.2.8 表达产物的Western-blotting 检测 |
| 1.2.9 重组表达蛋白的纯化 |
| 2 结果 |
| 2.1 C3d cDNA 的克隆及其PCR、酶切鉴定 |
| 2.2 pET-32a-C3d 表达载体的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 重组蛋白的表达 |
| 2.4 IPTG 诱导表达最佳浓度的确定 |
| 2.5 IPTG 诱导表达最佳作用时间的确定 |
| 2.6 目的蛋白的表达量分析 |
| 2.7 Western-Blotting 结果 |
| 2.8 融合蛋白的纯化 |
| 2.8.1 硫酸铵盐析 |
| 2.8.2 Sephadex G-200 凝胶过滤层析 |
| 2.8.3 蛋白质纯度的鉴定 |
| 2.8.4 蛋白浓度的测定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 重组C3d 原核表达系统的选择 |
| 3.2 重组C3d 目的蛋白的表达 |
| 3.3 重组C3d 目的蛋白的复性 |
| 3.4 重组C3d 目的蛋白的检测鉴定 |
| 3.5 重组C3d 目的蛋白的分离提纯 |
| 三 鸡补体C3d 重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗C3d 21 肽抗体 |
| 1.1.2 SPF 鸡血清及SPF 鸡 |
| 1.1.3 菌株 |
| 1.1.4 新西兰白兔 |
| 1.1.5 1%致敏绵羊红细胞 |
| 1.1.6 主要试剂 |
| 1.2 C3d 佐剂大肠杆菌疫苗的制备 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的分离纯化 |
| 1.2.2 大肠杆菌抗原的制备 |
| 1.2.3 C3d 与大肠杆菌抗原的连接 |
| 1.3 C3d 佐剂疫苗的作用效果试验 |
| 1.3.1 动物试验免疫方案 |
| 1.3.2 抗体效价的检测（间接ELISA 方法） |
| 1.3.3 总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 2 结果 |
| 2.1 不同佐剂疫苗的效果比较 |
| 2.2 疫苗注射对补体总活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 四 鸡补体C3d 重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 新城疫油乳剂灭活苗 |
| 1.1.2 重组C3d 佐剂新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.3 血清和抗原 |
| 1.1.4 攻毒用新城疫病毒 |
| 1.1.5 实验用鸡 |
| 1.1.6 主要试剂及其配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的纯化制备 |
| 1.2.2 试验动物分组免疫及样品采集 |
| 1.2.3 血清HI 抗体的检测 |
| 1.2.4 淋巴细胞增殖试验（MTT 法） |
| 1.2.5 攻毒保护试验 |
| 1.2.6 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 三组试验鸡在免疫接种后不同时期HI 抗体的检测结果 |
| 2.2 三组试验鸡在免疫接种后不同时期法氏囊B 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.3 三组试验鸡在免疫接种后不同时期胸腺T 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.4 攻毒保护试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 C3d 分子佐剂与淋巴细胞增值试验（MTT 法） |
| 3.2 重组C3d 蛋白和灭活油乳苗的免疫协同作用 |
| 3.3 重组C3d 分子佐剂研究意义及现状 |
| 五 鸡补体C3d-p29 多聚体与新城疫 F 基因真核表达重组质粒的构建及其表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料及仪器设备 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 P29 串联体的构建 |
| 1.2.2 pcDNA-P29.n(n=2，4，6)的构建 |
| 1.2.3 RT-PCR 扩增新城疫(F48E9 株)F 基因 |
| 1.2.4 插入抗原基因 |
| 1.2.5 重组真核表达质粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF) |
| 2 结果 |
| 2.1 新城疫C3d-P29 分子佐剂F 基因疫苗的构建 |
| 2.2 构建P29 串联体 |
| 2.2.1 单拷贝P29 基因克隆 |
| 2.2.2 P29 串联体的构建 |
| 2.3 RT-PCR 扩增新城疫F48E9 株F 基因 |
| 2.4 抗原基因的插入 |
| 2.5 转染细胞中pcDNA-F-C3d-P29.n F 表达蛋白的检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DNA 疫苗佐剂研究的意义 |
| 3.2 抗原基因的选择及C3d-P29 多聚体的构建 |
| 3.3 脂质体及影响其转染CEF 细胞的因素 |
| 六 鸡C3d-P29 重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3 含量的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 试验动物分组及免疫注射 |
| 1.2.2 不同试验组鸡血清补体总活性的测定 |
| 1.2.3 各试验组鸡血清中总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 1.2.4 抗鸡C3 21 肽抗体的制备 |
| 1.2.5 抗鸡C3 21 肽抗体工作浓度的确定 |
| 1.2.6 C3 含量标准曲线的绘制 |
| 1.2.7 各试验组鸡血清补体C3 含量的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 各试验组鸡血清中补体总活性 |
| 2.1.1 溶血素效价的测定 |
| 2.1.2 各试验组鸡血清中补体总活性的测定 |
| 2.2 兔抗鸡C3 21 肽IgG 抗体工作浓度的确定 |
| 2.3 溶液中C3 含量与OD 值关系的标准曲线 |
| 2.4 各试验组鸡血清中补体C3 的含量、 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 微量板溶血法测定动物血清补体的效价 |
| 3.2 影响补体效价测定的因素 |
| 3.3 补体总活性与动物的抗病力 |
| 3.4 C3 21 肽的合成及抗C3 21 肽抗体的制备 |
| 3.5 补体C3 与动物的抗病力 |
| 七 新城疫补体C3d 分子佐剂疫苗免疫效果的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 常用试剂配制 |
| 1.1.2 制备新城疫油乳剂灭活苗用佐剂 |
| 1.1.3 新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.4 ELISA 常用试剂 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组质粒的大量提取 |
| 1.2.2 质粒的安全性检验 |
| 1.2.3 质粒疫苗的体液免疫效果检测 |
| 1.2.4 攻毒保护试验 |
| 1.2.5 病毒排放的检测 |
| 1.2.6 解剖检查 |
| 1.2.7 重组质粒疫苗的细胞免疫效果检测 |
| 1.2.8 重组鸡补体C3d 质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d 蛋白（rChC3d）对外周血T 淋巴细胞增殖效果对比试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 安全性检验结果 |
| 2.2 血凝抑制抗体变化 |
| 2.3 间接ELISA 法检测NDV 抗体最佳工作浓度的确定结果 |
| 2.4 NDV 核酸疫苗在SPF 雏鸡体内诱导抗体的检测结果 |
| 2.5 攻毒保护试验结果 |
| 2.6 免疫鸡攻毒后的病毒分离结果 |
| 2.7 重组质粒疫苗细胞免疫效果的检测结果 |
| 2.8 pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6 与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 新城疫核酸疫苗研究的意义 |
| 3.2 疫苗注射部位、注射方式和免疫剂量的选择 |
| 3.3 采用淋巴细胞转化试验（MTT 法）进行外周血T 淋巴细胞增殖实验效果的讨论 |
| 3.4 本源动物补体C3d 及抗原基因的选择 |
| 3.5 C3d 的CR2 结合域P29 的特殊性 |
| 3.6 C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测 |
| 附录二 使用garnier 软件对C3d 二级结构预测结果 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
（9）基于DEV gC基因FQ-PCR方法建立及gC基因疫苗在免疫小鼠体内分布规律的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 1. 前言 |
| 1.1 疱疹病毒gC基因的研究进展 |
| 1.1.1 gC基因的分子生物学特征 |
| 1.1.2 gC基因编码产物的特性 |
| 1.1.3 gC基因影响病毒粒子的稳定性 |
| 1.1.4 gC基因影响病毒粒子的毒力 |
| 1.1.5 gC基因介导病毒吸附 |
| 1.1.6 gC与C3b结合 |
| 1.2 基因疫苗的概述 |
| 1.3 基因疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 基因疫苗的作用原理 |
| 1.3.2 基因疫苗的优化策略 |
| 1.3.3 gC基因与基因疫苗的研究 |
| 1.4 TaqMan实时荧光定量PCR概述 |
| 1.4.1 TaqMan FQ-PCR的荧光化学原理 |
| 1.4.2 TaqMan FQ-PCR的工作原理 |
| 1.4.3 FQ-PCR技术诊断鸭病毒性肠炎病毒 |
| 2. 材料和方法 |
| 2.1 菌株、毒株、质粒、载体及佐剂 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 实验仪器及软件 |
| 2.4 主要试剂 |
| 2.5 主要试剂的配制 |
| 2.5.1 大肠杆菌培养用试剂 |
| 2.5.2 质粒提取用试剂 |
| 2.5.3 琼脂糖凝胶电泳相关溶液 |
| 2.5.4 DNA抽提相关溶液 |
| 2.6 pcDNA-DEV-gC质粒的大批量制备 |
| 2.6.1 大肠杆菌DH5a的复壮 |
| 2.6.2 pcDNA-DEV-gC质粒小量提取 |
| 2.6.3 pcDNA-DEV-gC质粒酶切鉴定 |
| 2.6.4 大肠杆菌DH5a的保存 |
| 2.6.5 发酵罐高密度培养大肠杆菌 |
| 2.6.6 pcDNA-DEV-gC质粒大量提取 |
| 2.6.7 质粒含量及纯度测定 |
| 2.7 基因枪"子弹"的制备及评价 |
| 2.7.1 基因枪"子弹"的制备 |
| 2.7.2 基因枪"子弹"的初步评价 |
| 2.8 TaqMan FQ-PCR检测pcDNA-DEV-gC方法的建立 |
| 2.8.1 FQ-PCR引物、探针的设计与合成 |
| 2.8.2 FQ-PCR引物合理性的验证 |
| 2.8.3 FQ-PCR反应条件的优化 |
| 2.8.4 FQ-PCR标准曲线的建立 |
| 2.8.5 FQ-PCR检测方法的敏感性 |
| 2.8.6 FQ-PCR检测方法的特异性 |
| 2.8.7 FQ-PCR检测方法的重复性 |
| 2.9 动物的免疫接种 |
| 2.10 组织样品的采集和初步处理 |
| 2.11 FQ-PCR检测质粒pcDNA-DEV-gC在小鼠体内的分布 |
| 2.11.1 样品中模板DNA的提取 |
| 2.11.2 FQ-PCR检测样品 |
| 3 结果 |
| 3.1 pcDNA-DEV-gC质粒酶切鉴定 |
| 3.2 发酵培养和常规培养的菌体湿重 |
| 3.3 基因枪"子弹"的初步评价 |
| 3.4 FQ-PCR检测pcDNA-DEV-gC方法的建立 |
| 3.4.1 引物合理性的验证 |
| 3.4.2 引物浓度的优化 |
| 3.4.3 探针浓度的优化 |
| 3.4.4 FQ-PCR标准曲线的建立 |
| 3.4.5 FQ-PCR检测方法的敏感性 |
| 3.4.6 FQ-PCR检测方法的特异性 |
| 3.4.7 FQ-PCR检测方法的重复性 |
| 3.5 小鼠免疫后的临床表现 |
| 3.6 pcDNA-DEV-gC在免疫小鼠体内各组织中的分布 |
| 3.6.1 pcDNA-DEV-gC在免疫小鼠体内各组织中不同时间的分布规律 |
| 3.6.2 pcDNA-DEV-gC不同免疫剂量对免疫小鼠体内分布规律的影响 |
| 3.6.3 pcDNA-DEV-gC不同免疫途径对免疫小鼠体内分布规律的影响 |
| 3.6.4 生理盐水组检测结果 |
| 3.6.5 阳性对照组检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 FQ-PCR检测方法的优势 |
| 4.2 gC基因疫苗在动物体内动态分布规律 |
| 4.3 不同免疫途径对gC基因疫苗在动物体内动态分布规律的影响 |
| 4.4 不同免疫剂量对gC基因疫苗在动物体内动态分布规律的影响 |
| 4.5 基因疫苗不同免疫方式的比较与展望 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 攻读学位期间第一作者发表的学术论文 |
（10）猪圆环病毒2型衣壳蛋白（Cap）在293T细胞中的亚细胞定位（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 病毒株、主要试剂 |
| 1.2 真核表达重组质粒的构建及鉴定 |
| 1.3 p CAGGS-ORF2转染细胞试验 |
| 1.4 IFA试验 |
| 1.5 We s te rn blot检测 |
| 1.6 共聚焦成像分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 P CV2 OR F2基因的扩增 |
| 2.2 真核表达载体的构建 |
| 2.3 IFA试验 |
| 2.4 表达产物的we s te rn blot检测 |
| 2.5 Ca p蛋白的亚细胞定位特征 |
| 2.6 Ca p蛋白在细胞中的动态表达特征 |
| 3 讨论 |
四、基因疫苗及其在猪传染病中的应用（论文参考文献）
- [1]上海市几种猪传染病的流行病学调查研究[D]. 祁兵. 扬州大学, 2021(02)
- [2]FAdV-4 pcDNA3.1-Penton重组质粒的构建及免疫原性的初步探究[D]. 徐丹. 沈阳农业大学, 2019(02)
- [3]PEDV S蛋白抗原表位基因重组减毒沙门氏菌的构建及免疫原性研究[D]. 程渝. 四川农业大学, 2012(07)
- [4]C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究[D]. 张德庆. 山东农业大学, 2011(08)
- [5]PPV和PCV2核酸疫苗及PRV-PPV-PCV2基因工程疫苗的研究[D]. 陈杨. 四川农业大学, 2011(02)
- [6]猪细小病毒病国内流行状况以及防治策略[J]. 蔺文成,胡峰,任梅,崔玉东,钱爱东,崔尚金. 猪业科学, 2010(09)
- [7]猪细小病毒病国内流行状况以及防治策略[A]. 蔺文成,胡峰,任梅,崔玉东,钱爱东,崔尚金. 中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第八次学术研讨会论文集, 2010
- [8]畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究[D]. 刘栋. 山东农业大学, 2010(05)
- [9]基于DEV gC基因FQ-PCR方法建立及gC基因疫苗在免疫小鼠体内分布规律的研究[D]. 邹庆. 四川农业大学, 2010(04)
- [10]猪圆环病毒2型衣壳蛋白（Cap）在293T细胞中的亚细胞定位[J]. 符芳,李曦,李雪松,李海忠,陈欣,王伟,魏萍. 中国预防兽医学报, 2010(05)