一、肝/肝干细胞移植研究中的若干问题探讨（论文文献综述）
李瀚旻,刘建忠[1]（2022）在《“髓”为中心的治疗靶点》文中认为干细胞及其组织微环境是"髓"本质的生物学基础,围绕"髓"形成单个或多个"靶点"的集合就是"髓"为中心的治疗靶点。针对"髓"的单个或多个靶点的不同组合可提出若干个不同治疗方案,包括基于"补肾生髓成肝"的肝硬化、肝衰竭、肝癌防治方案及"补肾生髓"防治艾滋病免疫重建不全的方案,极大地提高了中医药防治肝藏病及其相关病证的能力和水平。"髓"是"肝肾同源"的中心环节,极大地深化和提高了"肝肾同源"的理论认识,明确了深入研究中医药调控再生修复的作用及其机制的重点研究方向。
李裕珍[2]（2021）在《基于PI3K/AkT/mTOR信号通路探讨补肾生髓法促进骨髓间充质干细胞移植治疗肝硬化的机制研究》文中研究表明目的:本课题临床部分回顾性分析补肾生髓法之加味济生肾气汤联合恩替卡韦治疗乙肝肝硬化代偿期患者的临床资料,包括临床症状、肝功能、HBV-DNA、肝脏硬度以及腹部B超等,探讨补肾生髓法联合抗病毒药物治疗肝硬化的疗效,为临床使用中药抗肝硬化提供新的思路。动物实验部分则进一步观察补肾生髓法之加味济生肾气汤联合骨髓间充质干细胞移植对肝硬化大鼠血清学、组织病理学的影响,从而探讨补肾生髓法促进BMSCs移植治疗肝硬化的疗效机制。方法:（1）临床实验:将符合纳入原则的60例脾肾阳虚证乙肝肝硬化代偿期患者分为西药组和中西药组,每组各30例。西药组予常规恩替卡韦抗病毒治疗,中西药组在西药组基础上予加味济生肾气汤,药物组成包括熟地黄40g、山茱萸20g、山药20g、泽泻15g、茯苓15g、丹皮15g、肉桂5g、制附子5g（先煎、久煎）、车前子10g、牛膝10g、三七2g（冲服）、醋鳖甲20g（先煎）,每日一剂,分早晚两次温服,200ml/次,疗程6个月。观察指标包括2组患者临床症状积分、肝功能、HBV-DNA载量、肝脏硬度及腹部B超等情况。（2）动物实验:将55只健康雄性SD大鼠进行适应性喂养1周后,进行称重编号,并将其随机分出3只用于分离BMSCs进行培养,8只用于作为空白组,剩余44只大鼠采用四氯化碳（CCL4）腹腔皮下注射的造模方法诱导大鼠肝硬化模型,连续干预8周。在8周结束后,有5只大鼠在造模过程中死亡,随机处死剩余中的4只大鼠证明造模成功。其它35只大鼠随机分为:模型组、BMSCs移植组、中药组、BMSCs移植+中药组、BMSCs移植组+中药+LY294002抑制剂组,其中需要进行BMSCs移植的组别在第9W开始从尾静脉注射BMSCs,BMSCs移植+中药组注射BMSCs同时开始进行加味济生肾气汤混悬药液灌胃、BMSCs移植组+中药+LY294002抑制剂组并行加味济生肾气汤混悬药液灌胃和抑制剂注射,空白组则予同等体积蒸馏水进行灌胃,模型组则不予任何干预。BMSCs移植每周一次,灌胃每日一次,持续时间均为4W。干预结束后进行取材,观察各组大鼠经干预后肝功能、组织病理学形态变化;ELISA法检测外周血GCSF、EPO水平;Western blot法检测肝组织中SDF-1、CXCR4、PI3K、p-Akt、m TOR蛋白表达情况。结果:（1）临床回顾性分析:本次研究共纳入有效病例60例,研究发现,经治疗后,两组患者的症状积分、临床疗效、肝功能、HBV-DNA载量、肝脏硬度、脾脏长径、脾脏厚度和门静脉内径较治疗前明显改善（P<0.01或P<0.05）,且中西药组患者上述指标均优于西药组（P<0.01或P<0.05）。（2）动物实验:BMSCs的形态:经培养后,可见形态不规则、长纺型或长梭形细胞形成;大鼠一般情况:经干预后,BMSCS移植组、中药组、BMSCS移植+中药组、BMSCS移植+中药+LY294002抑制剂组的大鼠精神状态、营养情况、活动灵敏度等较治疗前均有不同程度的改善,其中BMSCS移植+中药组改善程度最为明显;各组大鼠肝组织HE染色情况:模型组肝组织病理呈重度纤维化,可见假小叶形成,肝细胞明显变性和坏死,说明肝硬化造模成功。经干预治疗后,各治疗组大鼠肝纤维化程度、肝细胞变性及坏死呈不同程度改善,其中以BMSCS移植+中药组最为明显;各组大鼠肝功能:与空白组相比,模型组大鼠ALT、AST水平明显升高,ALB水平显着下降（P<0.01）;与模型组相比,各治疗组ALT、AST均呈不同程度下降,ALB水平不同程度升高（P<0.01）,其中以BMSCS移植+中药组最为显着;各组大鼠外周血GCSF、EPO的变化:与空白组相比,模型组GCSF、EPO水平显着下降;与模型组相比,各治疗组GCSF、EPO水平呈不同程度升高;各治疗组相比,BMSCS移植+中药组GCSF、EPO水平较BMSCs移植组、中药组和BMSCS移植+中药+LY294002抑制剂组明显升高,而BMSCs移植组、中药组和BMSCS移植+中药+LY294002抑制剂组三组对比无明显差异（P>0.05）;各组大鼠肝组织中SDF-1、CXCR4、PI3K、p-AKT、m TOR蛋白情况:经干预后,与模型组相比,各治疗组肝组织中SDF-1、CXCR4蛋白表达量均呈不同程度升高（P<0.01）,PI3K、p-AKT、m TOR蛋白表达量均呈不同程度下降;各治疗组相比,BMSCS移植+中药组肝组织中SDF-1、CXCR4蛋白表达量最高（P<0.01）,PI3K、p-AKT、m TOR蛋白表达量较BMSCs移植组、中药组低（P<0.01）。结论:临床研究发现补肾生髓法联合恩替卡韦具有缓解脾肾阳虚证乙肝肝硬化代偿期患者的临床症状、改善肝功能、降低HBVDNA载量,降低肝脏硬度及缩小脾脏的作用。动物实验研究表明补肾生髓法联合BMSCs移植可促进BMSCs的迁移,并有效改善肝硬化大鼠肝功能及肝纤维化程度的作用,其作用机制可能是通过调控PI3K/Ak T/m TOR信号通路相关基因及蛋白的表达发挥疗效。
牛文惠[3]（2019）在《MSCs促生长及免疫调节相关因子检测和促进ALPPS术后肝再生的实验研究》文中认为研究目的:通过检测人脐带间充质干细胞（Human umbilical mesenchymal stem cells,UC-MSCs）与脐血T细胞共培养后有关促生长和免疫调节的细胞因子分泌量的变化,探讨UC-MSCs的旁分泌及对T细胞的免疫调控作用。通过建立大鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCs）移植联合门静脉结扎与肝脏劈离的二步肝切除（Associating liver partition and portal vein ligation for staged hepatectomy,ALPPS）模型,探讨BM-MSCs细胞移植能否促进剩余肝再生,改善肝功能及病理指标,防止术后肝衰竭。研究方法:（1）使用脐带组织解离器与配套试剂盒标准化处理脐带组织,获得UC-MSCs;使用密度梯度离心法获得BM-MSCs。应用流式细胞仪鉴定UC-MSCs和BM-MSCs的表面标志。（2）第一部分实验分为三组,即UC-MSCs组、脐血T细胞组和共培养组。采用液相芯片技术检测三组细胞培养上清中细胞因子的分泌量。检测前八代UC-MSCs 14种细胞因子的分泌量,寻找分泌能力较强的UC-MSCs细胞代数,利用此代细胞建立不同比例UC-MSCs与脐血T细胞的共培养体系,检测五种细胞因子表达量。（3）第二部分实验分为三组,即门静脉结扎和肝叶劈离组（后简称ALPPS组）、门静脉注射生理盐水联合ALPPS组（后简称生理盐水组）和骨髓间充质干细胞细胞移植联合ALPPS组（后简称为细胞移植组）。构建ALPPS手术模型和移植模型。术后不同时间点（1d、5d、7d、10d和14d）计算大鼠体重与肝脏再生率的变化;收集静脉血,并检测血清标本中AST、ALT、Alb和Tbil的水平;HE染色检测大鼠肝脏的坏死与再生状况,免疫组织化学染色法检测PCNA指数表达情况;ELISA法检测术后大鼠肝脏TNFα、IL-6和HGF的表达水平。研究结果:（1）获得较高活力的UC-MSCs,细胞高表达CD29、CD49、CD90和CD105,低表达CD34、CD45、CD31和HLA-DR。获得较高活力的BM-MSCs,细胞高表达CD29和CD44,低表达CD45。（2）P6 UC-MSCs与其他代数的细胞相比,细胞因子分泌量较高。共培养组中GM-CSF分泌量不受UC-MSCs存在的影响。但随着UC-MSCs的加入,IL-4和IL-10的分泌量增加,TNF-α和IFN-γ的分泌量减少,且脐血T细胞与UC-MSCs比值为10∶1以上比例时分泌量变化更显着（P<0.05）。（3）第二部分实验中三组大鼠术后的体重在前五天体重为快速负增长,第5天后大鼠体重逐渐回升,第10天时逐渐恢复正常水平。术后第5天,三组右中叶均明显开始肝叶再生,且细胞移植组再生速度更快。第5、7、10、14天时细胞移植组的右中叶再生率明显大于ALPPS组和生理盐水组。（4）细胞移植组从术后第5天开始,ALT、AST的浓度明显低于ALPPS组和生理盐水组,且差异有统计学意义（P<0.05）,而ALPPS组和生理盐水组间的差异没有统计学意义（P>0.05）。直至第10天时,细胞移植组ALT、AST浓度恢复至正常值水平,ALPPS组和生理盐水组在第14天时恢复至正常值水平。细胞移植组从术后第5天开始,Alb浓度明显高于ALPPS组和生理盐水组,且差异有统计学意义（P<0.05）,而ALPPS组和生理盐水组间的差异没有统计学意义（P>0.05）。在第10天时,细胞移植组Alb浓度恢复至正常值水平,ALPPS组和生理盐水组在第14天时恢复至正常值水平。三组术后血清Tbil浓度差异均无统计学意义（P>0.05）。（5）三组术后第1天右中叶均出现大面积水肿,胞浆空泡,有少量点灶状坏死。术后第5天均出现水肿增加,但细胞形态、肝细胞索排列和淤血情况均较第1天减轻,且核分裂像增加,可见新生细胞。术后第7天,三组组织结构接近正常。（6）三组术后在第5天PCNA阳性表达水平最高,第7、10、14天的PCNA阳性表达数下降且三组间差异均无统计学意义。（7）三组术后右中叶组织中TNFα和IL-6的表达有差异但没有统计学意义（P>0.05）;而HGF的表达水平明显增高,在第5天达到峰值,且细胞移植组与其他两组相比差异有统计学意义（P<0.05）。术后第10天细胞移植组恢复至正常值范围,ALPPS组和生理盐水组在术后第14天恢复至正常值水平。研究结论:使用脐带组织解离器与配套试剂盒标准化处理脐带组织获得UC-MSCs;使用密度梯度离心法获得BM-MSCs。所获细胞细胞增殖能力较强,其形态和免疫表型均符合MSCs的生物学特征。使用液相芯片技术检测细胞培养上清中细胞因子的分泌量。UC-MSCs与T细胞共培养后抗炎细胞因子分泌量增加,促炎细胞因子分泌量减少,有降低炎症反应的功能;移植BM-MSCs并联合ALPPS可以促进剩余肝再生,改善肝功能以及病理指标,防治术后肝衰竭,为MSCs移植治疗肝病的临床应用提供理论与实验基础。
尹明[4]（2014）在《基于基因打靶技术的人胚胎干细胞向功能性肝细胞分化的研究》文中进行了进一步梳理人肝细胞作为检测药物吸收、分布、代谢、排泄及毒性的体外实验金标准模型之一，被广泛应用于临床前药物研究。CYP3A亚家族是细胞色素P450酶系家族中最为重要的成员，它在肝CYP中含量最高，在肝细胞对于药物代谢和解读功能中承担着50%的作用。新鲜分离的人原代肝脏细胞是用于药物研发以及生物人工肝的最理想细胞来源，但是由于肝脏供体的严重稀缺以及体外表型维持困难等特点，极大地限制了其应用；而其他的以细胞为基本单位成分的分析模型，如其他动物来源的原代肝脏细胞，或人肝癌细胞系，其代谢酶类和表达谱皆不能真实地反应正常人肝细胞的生理表现，例如在一些肝癌细胞系中很多代谢酶的水平与人原代成体肝细胞呈指数级的差异；干细胞体外定向分化研究的进展，使来自于干细胞的肝细胞成为最接近正常人原代肝细胞来源成为可能，然而目前遇到的共性问题是这种在体外定向分化得到的肝细胞，往往在功能上不成熟，表现为参与药物代谢的重要P450蛋白表达量低，不能表达成熟肝细胞特异表达的转录因子或蛋白质；或者这种具备条件的成熟数量极少，很难区分，因此也很难大规模应用。目前尚缺乏能在体外识别信号通路的调节和代谢功能的可靠工具。本研究首次报道了利用TALEN技术构建了打靶的人胚胎干细胞系，在体外直接分化成为具有功能性的肝细胞；这一被标记的干细胞分化体系可以识别能够促进CYP3A4表达的候选者。基于TALEN打靶技术，我们将增强型绿色荧光蛋白eGFP的基因片段插入到CYP3A4基因的外显子区域，使得eGFP能够有效的被CYP3A4的启动子调控。这一敲入CYP3A4:eGFP的细胞系在体外被定向诱导分化为人肝细胞，利用GFP作为CYP3A4的报告基因，沿用前人报道的体外定向诱导分化的方法，验证了这一基因报告细胞系具有和野生型人胚胎干细胞系同样的分化潜能；同时，这个基因标记的人胚胎干细胞系能够正确反映在细胞分化过程中CYP3A4基因的实际表达情况，可以作为筛选影响肝脏细胞成熟过程中关键因子的体系。然后，利用这一被标记的干细胞分化体系，我们在肝脏细胞发育的前体阶段加入了不同的细胞因子，以期筛选出促进功能性肝细胞分化的因子。研究表明表皮生长因子EGF可以作为一个信号蛋白有效地促进和维持人肝细胞在体外CYP3A4的表达。相对于传统的分化体系，添加了EGF的分化体系使得在体外分化的人肝细胞从5.9%增加到40.2%。随后，我们将分化得到的肝细胞移植到肝损伤小鼠URG（Tet-uPA/Rag2-/-/Il2rg-/-）体内，2周后在小鼠的血清中即检测到了人白蛋白的表达，证明分化的细胞具有移植重建肝脏的能力。本研究从实用的角度出发，建立了一种便于操作，直观观察即能评价体外分化的肝脏细胞成熟情况的有效筛选体系；以此为基础，可以对现有的分化体系进行培养条件、诱导时间等方面的优化，以提高分化效率。同时，通过该体系的应用，我们发现EGF作为一个新的调节蛋白在CYP3A4基因表达中起到了至关重要的作用。更为重要的是，用此评价体系得到的肝脏细胞具有和人成体肝脏细胞相类似的蛋白表达和mRNA转录水平，用该体系评价出来的细胞极有可能成为药物开发中检测肝脏毒性、药物相互作用评估的工具。基于TALEN技术的基因打靶，与人胚胎干细胞向肝细胞定向分化体系的结合，可以成为在体外获得稳定代谢功能的人肝细胞的可靠筛选模型，从而为以后提供供体细胞、建立人源化动物模型在体研究和应用分化的干细胞进行体外药物筛选都具有着十分重要的意义。
衣桂荣[5]（2014）在《活化肝星状细胞促进大鼠肝细胞去分化为肝前体细胞》文中研究说明【研究背景及目的】肝前体细胞（Hepatic progenitor cell, HPC）是损伤肝脏中出现的一种具有双向分化潜能的细胞，可向肝细胞和胆管上皮细胞分化参与肝再生。在慢性肝病状态下，HPC可被激活参与肝损伤修复，而且HPC的数量与疾病的严重程度及肝癌发生的风险指数相关。HPC既表达胆管上皮细胞标志物（OV-6、PCK和Sox9等）和成熟肝细胞标志物（白蛋白等），同时也表达肝母细胞标志物（AFP和Dlk1等）。目前，HPC来源尚不明确，传统观点认为HPC来自Hering管，也有研究显示肝细胞、肝星状细胞（Hepaticstellate cell, HSC）及骨髓干细胞在肝损伤环境下可转化为HPC。因此，有学者认为HPC可能是一种来源不同的异质细胞群。HSC位于Disse间隙，与肝细胞和肝窦内皮细胞直接接触。正常情况下，HSC处于静止状态，肝损伤时，HSC可激活，产生细胞外基质（Extracellular matrix, ECM），并分泌大量的细胞因子和生长因子。HSC的激活是肝纤维化发生发展的中心环节。近年来不断有证据提示HSC还具有促进肝组织再生的作用，同时也有研究表明HPC可来源于HSC。这些研究均表明HSC在肝脏再生过程中扮演着重要角色。基于以上背景，本课题旨在通过肝损伤动物模型明确活化HSC对HPC产生的影响，并利用体外共培养实验进一步明确HPC的细胞来源。【实验方法】一、探讨HSC活化与HPC产生的关系1、收集人急性肝炎、肝纤维化、肝硬化组织标本，免疫荧光检测HPC标志物PCK及活化HSC标志物α-SMA表达情况。2、构建2-乙酰氨基芴（2-acetylaminofluorene,2-AAF）/肝大部切除术（Partialhepatectomy, PH）动物模型诱导HPC活化。予2-AAF以10mg/kg体重的剂量对Sprague-Dawley（SD）大鼠进行灌胃，每天1次，持续5天，于第6天行肝大部切除术，手术当日停止灌胃2-AAF，术后第2天继续予2-AAF灌胃，并持续1周。分别取肝大部切除术后0天、4天、6天、9天的大鼠肝脏组织，免疫荧光检测PCK及α-SMA表达情况。3、构建对乙酰氨基酚（N-acetyl-paraaminophen, APAP）肝损伤模型。按照300mg/kg体重的剂量对SD大鼠腹腔注射APAP，仅注射1次，注射24小时后处死大鼠，取新鲜肝脏组织，免疫荧光检测PCK及α-SMA表达情况。二、明确活化HSC对HPC产生的影响（一）鉴定氯化钆（Gadolinium chloride, GdCl3）和胶霉毒素（Gliotoxin）对Kupffer细胞和活化HSC的作用1、以2ml/kg体重的剂量对SD大鼠腹腔注射20%四氯化碳（Carbon tetrachloride,CCl4），隔日注射1次，共注射2次，末次注射后48小时，予GdCl3以10mg/kg体重的剂量尾静脉注射1次。注射GdCl324小时后取大鼠肝脏组织。免疫荧光检测Kuppfer细胞标志物CD68和活化HSC标志物α-SMA的表达情况。2、对SD大鼠腹腔注射CCl4，隔日注射1次，共注射2次，在末次注射后48小时，予Gliotoxin以3mg/kg体重的剂量腹腔注射1次。注射Gliotoxin24小时后处死大鼠，取肝脏组织。免疫荧光检测CD68和α-SMA的表达情况。（二）观察抑制HSC活化对HPC产生的影响1、分离SD大鼠原代HSC，在体外予DMEM培液培养。收集体外培养后第3天（静息）和第12天（活化）的HSC培养上清。2、在2-AAF/PH模型肝大部切除术或APAP模型APAP注射前1天，予模型大鼠尾静脉注射GdCl3抑制Kupffer细胞活性及HSC活化。分别于肝大部切除术或APAP注射72小时后处死大鼠，取肝脏组织，免疫荧光检测PCK及α-SMA表达情况，对比观察抑制HSC活化对HPC产生的影响。3、在以上模型注射GdCl3抑制HSC活化后，于肝大部切除术或APAP注射的次日，腹腔注射不同活化状态的原代HSC培养上清4ml1次。48小时后取大鼠肝脏组织，免疫荧光检测PCK及α-SMA表达变化情况，对比观察补充HSC培养上清对HPC产生的影响。（三）观察清除活化HSC对HPC产生的影响1、在2-AAF/PH模型中，在灌胃2-AAF的第1、3天，同时以2ml/kg体重的剂量对SD大鼠腹腔注射20%CCl4以刺激HSC活化，并于肝大部切除术前1天，按3mg/kg体重的剂量对大鼠腹腔注射Gliotoxin清除活化HSC，于肝大部切除术后3天取大鼠肝脏组织，免疫荧光检测PCK及α-SMA表达情况，比较清除活化HSC前后HPC产生数量的变化。2、在2-AAF/PH+Gliotoxin处理的基础上，于肝大部切除术后24小时腹腔注射不同活化状态的原代HSC培养上清4ml1次。48小时后处死大鼠，免疫荧光检测肝脏组织中PCK及α-SMA表达情况，明确活化HSC对HPC产生的影响。三、明确活化HSC是否可促进大鼠肝细胞去分化为HPC1、分离SD大鼠原代肝细胞和原代HSC，利用可使两种细胞不直接接触的双层细胞共培养体系，将肝细胞分别与不同活化状态HSC共培养，光镜下观察肝细胞的形态变化。在共培养的第0、3、5天，细胞免疫荧光检测肝细胞标志物HNF4α及HPC标志物PCK、Sox9表达变化情况。2、为进一步明确与活化HSC共培养的肝细胞中出现的PCK阳性细胞具有双向分化潜能，将其置于胆管上皮细胞分化诱导液（含丁酸钠）中培养，8天后细胞免疫荧光检测胆管上皮细胞标志物CK19表达情况；将其置于肝细胞分化诱导液（含HGF、胰岛素、转铁蛋白、地塞米松）中培养，11天后细胞免疫荧光检测肝细胞标志物白蛋白（Albumin, Alb）表达情况。【实验结果】一、活化HSC促进HPC产生（一）HPC产生与HSC活化相关1、免疫荧光检测人急性肝炎、肝纤维化、肝硬化组织中PCK及α-SMA的表达情况，结果显示仅在与α-SMA阳性细胞毗邻区域存在PCK阳性细胞。2、在2-AAF/PH模型中，于肝大部切除术后0天、4天、6天、9天取肝脏组织，免疫荧光结果显示第0天和第4天时PCK阳性细胞及α-SMA阳性细胞数量均较少，但第6天和第9天时PCK阳性细胞及α-SMA阳性细胞数量明显增加，且两者紧密相联，交织存在。3、取APAP注射24小时后肝脏组织，免疫荧光结果显示PCK阳性细胞被大量α-SMA阳性细胞紧密围绕，提示HPC产生与HSC活化相关。（二）活化HSC促进HPC产生1、GdCl3可抑制Kuppfer细胞活性， Gliotoxin可清除活化HSC（1）CCl4造成急性肝损伤过程中，尾静脉注射GdCl3，取肝组织，免疫荧光结果显示与单纯CCl4急性肝损伤标本相比，CD68及α-SMA表达均明显减少。（2）在CCl4造成急性肝损伤后，腹腔注射Gliotoxin，免疫荧光检测肝组织中α-SMA及CD68表达情况，结果发现与单纯CCl4处理组相比，α-SMA阳性细胞明显减少，而CD68阳性细胞却没有明显变化。2、抑制HSC活化对HPC产生的影响（1）在2-AAF/PH及APAP造模过程中，利用GdCl3抑制Kuppfer细胞活性及HSC活化，免疫荧光结果显示抑制HSC活化后，PCK阳性细胞及α-SMA阳性细胞数量均明显减少。（2）抑制HSC活化后，再补充不同活化状态HSC培养上清，免疫荧光结果显示补充活化HSC培养上清后，PCK阳性细胞及α-SMA阳性细胞数量增加，且两者交织存在。而补充静息HSC培养上清后，肝组织PCK及α-SMA表达没有明显变化。3、清除活化HSC对HPC产生的影响（1）与单纯2-AAF/PH模型组织中存在大量PCK阳性细胞和α-SMA阳性细胞不同，腹腔注射Gliotoxin清除活化HSC后，免疫荧光结果显示肝组织中仅存在极少量PCK阳性细胞和α-SMA阳性细胞。（2）清除活化HSC后，再补充不同活化状态HSC培养上清，结果显示补充活化HSC培养上清后，PCK阳性细胞数量增加。而补充静息HSC培养上清后，PCK阳性细胞数量却没有明显变化。二、活化HSC促进大鼠肝细胞去分化为HPC1、将肝细胞与不同活化状态HSC共培养，细胞免疫荧光结果显示共培养5天时，与活化HSC共培养的肝细胞中可出现PCK阳性细胞，而与静息HSC共培养或单独培养的肝细胞中并没有PCK阳性细胞的出现。在肝细胞与活化HSC共培养的第0、3、5天细胞免疫荧光检测Sox9及HNF4α的表达情况，结果显示第0天时Sox9表达极弱，而HNF4α大量表达，至第5天时，Sox9表达量明显增多，而HNF4α表达减弱。2、将PCK阳性细胞置于胆管上皮细胞分化诱导液中培养8天后，细胞免疫荧光显示PCK阳性细胞分化为CK19阳性细胞。将PCK阳性细胞置于肝细胞分化诱导液中培养11天后，细胞免疫荧光结果显示PCK阳性细胞中出现Alb阳性细胞。【结论】一、肝前体细胞的产生伴随肝星状细胞的活化。二、活化肝星状细胞促进肝前体细胞的产生。三、活化肝星状细胞促进大鼠肝细胞去分化为肝前体细胞。四、肝细胞来源的肝前体细胞可向肝细胞和胆管上皮细胞分化。
袁淑芳[6]（2013）在《骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性肝衰竭的作用研究》文中指出目的：（1）对大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）进行体外培养、鉴定。（2）对D-氨基半乳糖联合脂多糖诱导的急性肝衰竭（ALF）大鼠给予尾静脉、门静脉二种途径注射同种异体移植大鼠BMSCs,探讨BMSCs移植治疗ALF的可能性、对比两种移植途径的疗效。（3）通过测定各组血清及肝组织中细胞因子的表达,探讨BMSCs移植治疗ALF的机制、了解BMSCs在肝内归巢的影响因素、探讨BMSCs移植对ALF血清和肝组织中细胞因子表达及肝细胞凋亡的影响及机制,为临床开展BMSCs移植治疗ALF、为临床提供可靠的ALF预后评估系统、实时准确地评价ALF的免疫状态、病情及预后并指导临床治疗提供依据。方法：（1）采用全骨髓贴壁法分离大鼠BMSCs,进行体外培养。采用DAPI标记BMSCs、细胞免疫荧光、流式细胞术进行BMSCs表型鉴定。（2）采用10%D-氨基半乳糖1-4g/kg/次、12小时一次和0.005%脂多糖20μg/kg,经腹腔注射制备大鼠ALF模型,观察造模后大鼠肝功能、肝组织病理损害程度。（3）通过尾静脉和门静脉注射的方式移植BMSCS。66只大鼠随机平均分为对照组、尾静脉移植、门静脉组。各途径组同种异体移植BMSCs,移植BMSCs数量为1.4×107个/kg,对照组给予等体积生理盐水腹腔注射。于移植后24h、72h、120h、168h收集血液样本和肝组织标本。检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）,比较BMSCs移植前后各组肝功能的改善情况。（4）用HE染色观察肝脏的病理学变化。用TUNEL法检测肝细胞凋亡。采用ELISA、RT-PCR方法测定各组血清及肝组织内CD163、IL-10的水平。用原位杂交、Western blot方法检测肝组织基质细胞衍化生长因子-1α （SDF-1α）蛋白的表达水平；用免疫荧光组织化学法、RT-PCR方法检测肝组织血管内皮生长因子VEGF蛋白的表达；采用免疫组化、Western blot方法检测肝组织Caspase-1、IL-18蛋白的表达水平。结果：（1）原代培养的大鼠BMSCs传代后,高表达CD29和CD90,不表达CDllb和CD45。用DAPI进行BMSCs标记,荧光显微镜下观察可见所有BMSCs均已标上蓝色荧光。（2）采用了D-氨基半乳糖模型（D-Gal）/脂多糖（LPS）诱导的大鼠ALF模型。模型建立后,组织HE染色出现典型急性肝损伤表现,肝衰竭对照组大鼠血清ALT. AST水平和肝细胞凋亡较BMSCs移植组明显升高,且有时间依赖性,这些结果支持了建模成功。（3）ALF对照组大鼠血清ALT、AST水平随病程逐渐升高,在移植后120h、168h,尾静脉、门静脉组移植组血清ALT、AST水平与对照组的差别均有统计学意义（P<0.01）,尾静脉与门静脉移植组之间血清ALT, AST水平的差别无统计学意义（P>0.05）。（4）BMSCs移植后168h,尾静脉与门静脉移植组大鼠肝组织均可见大量DAPI阳性标记的细胞,ALF模型对照组未见DAPIP日性标记的细胞。（5） BMSCs移植后120h、168h,尾静脉移植组、门静脉移植组的炎性细胞浸润明显减少,肝小叶结构逐渐恢复,汇管区可见胆管增生。尾静脉组移植组、门静脉移植组肝组织炎症改善情况与对照组相比有统计学意义（P<0.05）。尾静脉组移植组、门静脉移植组肝组织炎症改善情况的差别无统计学意义（P>0.05）。（6）在移植后120h、168h,与对照组相比BMSCs移植组肝细胞凋亡明显减轻（P<0.05）。BMSCs移植后120h尾静脉组、门静脉组细胞凋亡指数分别为22.00±16.84%、20.60±7.60%；移植后168h细胞凋亡指数分别为18.33±8.78%、12.67±8.78%,与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。尾静脉和门静脉植组之间肝细胞凋亡改善情况无统计学差异（P>0.05）。（7）原位杂交、免疫荧光、Western blot结果显示：BMSCs移植组中SDF-1α、VEGF蛋白的表达水平随肝功能的好转逐渐逐渐升高,在移植后120h、168h与对照组相比有显着性差异（P<0.05）。尾静脉和门静脉植组之间肝组织SDF-1α、VEGF蛋白的表达水平无统计学差异（P>0.05）。相关分析发现肝组织中SDF-1α、VEGF两者表达水平呈正相关（P<0.05）。肝组织中SDF-1α、 VEGF蛋白的表达与肝细胞凋亡之间存在负相关,相关系数分别0.293、-0.274（P<0.05）。（8） ELISA及RT-PCR结果显示：ALF对照组大鼠血清及肝组织中CD163、IL-10的水平随时间的延长、肝功能的恶化而升高。BMSCs移植组血清及肝组织中CD163、IL-10的水平随肝功能的好转逐渐降低,在移植后120h、168h与实验组相比有显着差异（P<0.01）。门静脉与尾静脉移植组血清及肝组织中CD163、IL-10的水平之间的差别无统计学意义（P>0.05）。相关分析发现血清及肝组织中CD163、IL-10两者表达水平呈正相关（P<0.05）。CD163IL-10与ALT、AST之间均有明显的相关性（P<0.01）。（9）大鼠肝组织中Caspase-1、IL-18蛋白及蛋白的表达趋势一致,BMSCs移植后大鼠肝组织中Caspase-1和IL-18水平明显下降,在移植后120h、68h、BMSCs移植组中Caspase-1、IL-18蛋白的表达水平与对照组相比有显着差异（P<0.05）。门静脉组与尾静脉移植组之间Caspase-1、IL-18蛋白的表达差别无统计学意义（P>0.05）。尾静脉和门静脉植组之间Caspase-1、IL-18蛋白的表达无统计学差异（P>0.05）。相关分析发现Caspase-1、IL-18两者呈正相关（P<0.05）; Caspase-1、IL-18肝细胞凋亡之间均有明显的相关性（P<0.01）。结论：（1）采用全骨髓贴壁筛选法可以成功分离培养、扩增出高纯度大鼠BMSCs,并保持其原有的生物学特性。DAPI可成功标记BMSCs。（2）采用10%D-Gall.4g/kg/次,间隔12小时,共两次。联合0.005%LPS （10mg/支）20μg/kg、腹腔注射可成功建立大鼠ALF模型。该方法可靠、可重复性强、模型形成稳定、大鼠生存期较长,能满足本研究的需要。（3） BMSCs尾静脉、门静脉移植后,BMSCs可以归巢到ALF大鼠肝脏。（4） BMSCs移植能够促进ALF大鼠肝功能的恢复,减轻肝脏组织炎症坏死程度,BMSCs对ALF大鼠具有一定治疗作用。（5）尾静脉移植、门静脉移植途径均能有效改善ALF大鼠的肝功能、减轻肝脏病理损害程度。但二种途径相比差异无统计学意义。（6） BMSCs移植可减少ALF肝脏免疫炎症反应,抑制肝细胞凋亡。（7） BMSCs可以特异归巢至损伤肝脏,促进VEGF的分泌、并促进肝细胞增殖及肝脏血管再生、促进肝脏组织修复。（8） CD163. IL-10水平随肝组织炎症程度改善而下降,反映了肝功能的急剧恶化和疾病严重程度。BMSCs移植能降低CD163、IL-10水平,调节促炎与抗炎因子达到新的平衡。CD163、IL-10可作为早期评估患者肝移植预后观察的敏感血清标志蛋白的指标。（9）Caspase-1和IL-18在肝衰竭、肝细胞凋亡的发病过程中起重要作用。BMSCs移植能降低Caspase-1、IL-18水平。Caspase-1和IL-18可望成为急性肝衰竭的预测因子和未来的治疗靶点。
国家中医药管理局国家中医临床研究基地办公室[7]（2013）在《我国16个重点病种的国家中医临床研究基地论文统计表（2008年～2013年）》文中提出
张英才[8]（2012）在《人脐带间充质干细胞对大鼠脂肪供肝肝移植的保护作用及相关机制研究》文中研究说明研究背景供体短缺是全球性难题,根据中国红十字会的数据显示,在美国供受体的比例为1：5,在英国为1：3,在中国则为1：150。器官短缺使得“扩大标准”的器官,或曾被认为不适合用于移植的器官的使用率大大增加。提高边缘性供肝（特别是中重度脂肪供肝）的利用率被认为在某种程度上可以缓解供肝短缺。但是脂肪肝对缺血再灌注损伤异常敏感,在移植过程中遭受的缺血再灌注损伤和免疫损伤可导致移植肝的原发性无功能或早期功能不良。如何预防和减少IRI是肝脏外科特别是肝移植的研究热点之一。由于间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）具有趋化迁移和组织修复再生等能力,从而广泛应用于各种抗炎性损伤和组织损伤修复等领域中。本研究即探讨人脐带间充质干细胞在大鼠脂肪供肝肝移植中的保护作用和其相关的机制,为提高边缘性供肝的利用率提供一种新的方法。第一部分大鼠脂肪肝模型的建立目的通过喂养高脂饲料建立大鼠中重度脂肪肝模型。方法雄性Sprague Dawley （SD）大鼠20只,体重40-50g。20只大鼠随机分为普通饲料组和高脂饲料组（各10只）,两组脂肪供能比为18.23%和48.32%。每天自由饮水和进食,每周称大鼠体重1次,并观察其毛色、食欲、行动、粪便及对外界的反应情况。持续喂养8周后,水合氯醛腹腔注射麻醉,腹主动脉采血,然后处死动物,称取肝脏湿重,计算肝指数（肝湿重/体重×100%）。留取血清标本行血清学指标的检测,肝脏病理检查以评估大鼠脂肪肝的程度。结果1.高脂饲料组大鼠体重和肝指数显着高于普通饲料组。2.高脂饲料组血清谷丙转氨酶（alanine aminotransferase, ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase, AST）和总胆固醇（total cholesterol, TC）水平较普通饲料组明显升高,提示高脂饮食对大鼠肝细胞有一定的破坏作用并造成脂质代谢紊乱。3.HE染色光镜下观察高脂饲料组则出现弥漫性脂肪变性,肝细胞排列紊乱,细胞空泡、气球样变明显,且小叶内有炎性细胞浸润。结论根据血清学指标和病理检测结果,高脂饲料的大鼠的肝脏已经达到中、重度脂肪肝的水平,符合下一步实验的要求,建模成功。第二部分人脐带间充质干细胞对大鼠脂肪肝缺血再灌注损伤的保护作用目的成功分离和扩增人脐带间充质干细胞,并研究其在大鼠中重度脂肪肝缺血再灌注损伤中的作用。方法采用Ⅰ型胶原酶联合透明质酸酶消化Wharton’s Jelly组织的方法分离提取人脐带间充质干细胞,用LG-DMEM和MesenPro等比例混合培养基的体系对huc-MSCs进行扩增。通过高脂饮食建立SD大鼠中重度脂肪肝模型。60只大鼠分为人脐带间充质干细胞处理组（MSC组）和对照组,各30只。MSC组缺血再灌注术前1天和术后第3天分别从尾静脉注射含2×106人脐带间充质干细胞的PBS1.5m1。对照组则在相同时间点单纯注射PBS1.5m1。术后第1、4和7天（每个时间点10只）,检测血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、肝组织中超氧化物歧化酶活性（superoxidedismutase, SOD）、丙二醛（1nalondialdehyde, MDA）、肿瘤坏死因子-a（tumor necrosis factor-α, TNF-α）的变化。肝组织病理切片HE染色观察肝组织损伤和白细胞浸润情况。结果术后第1、4天,与对照组相比,MSC组血清ALT、AST、TNF-α和肝组织MDA明显降低,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。术后第七天,两组ALT、AST和TNF-α已无明显差异（P>0.05）。而SOD在术后各时间点两组间的比较均无明显差异。肝组织病理检测则发现MSC组肝细胞坏死和白细胞浸润明显较对照组减轻。结论1.我们成功建立了高效的人脐带间充质干细胞的分离扩增方法。2.人脐带间充质干细胞输注能有效减轻大鼠脂肪肝缺血再灌注损伤,有望成为临床肝脏外科和肝移植减轻脂肪肝缺血再灌注损伤的一种新方法。第三部分人脐带间充质干细胞对大鼠脂肪供肝保护作用的机制研究目的探讨人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells, huc-MSCs）对中重度脂肪供肝肝移植的保护作用,分析其可能的保护机制,为提高边缘性供肝的利用率提供新的手段。方法1.实验动物随机分为4组：①正常肝组（n=4）,普通饲料喂养8周的Lewis大鼠；②脂肪肝组（n=4）,高脂饲料喂养8周的Lewis大鼠；③MSCs组（n=16）,脂肪肝肝移植术后从阴茎背静脉静注含2×106huc-MSCs的PBS1.5ml；④对照组（n=16）：脂肪肝肝移植术后从阴茎背静脉单纯静注含PBS1.5ml。2.对照组和MSCs组分别于术后1d、3d各取4只大鼠,留取血清和肝脏标本,两组各剩余的8只大鼠观察术后生存情况。各组留取肝组织标本行MicroRNA （MiRNA）芯片分析。结果1.术后第1、3天,与对照组相比,MSCs组血清ALT、TBIL、TNF-α和肝组织MDA明显降低,两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。而SOD在术后各时间点两组间的比较均无明显差异。2.肝组织病理检测则发现MSCs组肝细胞坏死和白细胞浸润明显较对照组减轻。3.对照组和MSCs术后1周的生存率分别为为12.5%和75%,两组大鼠术后的生存率的比较有明显的差异（P<0.05）。表明通过huc-MSCs处理后,脂肪供肝的大鼠发生PNF的几率大大降低。4.脂肪肝脏行肝移植术后1d,miRNA谱发生了很大的变化（29个上调,27个下调）。相比于对照组而言,用huc-MSCs干预后的MSCs组肝移植术后1d的miRNA谱的变化则轻微了许多（上调和下调的MiRNA各有8个）。其中MSCs组和对照组一起上调的有miR-107、miR-186、miR-25、miR-16、miR-34a、miR-339-5p,而miR-291a-5p、miR-490、miR-874、miR-3568则同时下调。而在肝移植术后1d和3d,MSCs组与对照组相比,miR-375均同时上调（2.56倍和4.22倍）结论1. Huc-MSCs可减轻脂肪供肝肝移植术后的IRI和免疫损伤,降低移植术后PNF的发生率,有望成为一种提高中重度脂肪肝等边缘性供肝利用率的新方法。2.脂肪肝行肝移植术后miRNA谱发生了很大的变化,有些miRNA可能在脂肪供肝移植术后的IRI和免疫损伤过程发挥着重要作用。3.有些miRNA在huc-MSCs保护脂肪供肝可能发挥着重要角色,如miR-21、miR-375等。这一部分尚有待下一步的功能学实验加以验证。
王鸣[9]（2012）在《腺病毒介导的炎性基因miRNAs干预小鼠暴发性肝炎和裸鼠人肝癌皮下移植瘤的研究》文中进行了进一步梳理[背景及目的]我国是乙肝病毒（HBV）感染高发地区,2006年我国乙肝流行病学调查显示,目前我国1-59岁乙肝表面抗原（HbsAg）人群携带率为7.18%,儿童（5岁以下）HBsAg携带率为0.96%,据此估算,目前我国HBV慢性感染者约9300万人,其中约2000万患者为慢性乙肝。慢性乙肝患者中约1%发展为重型肝炎。由于多种原因所致肝细胞大量坏死,导致肝脏合成、代谢、生物转化、解毒、排泄等功能发生严重障碍,并出现肝性脑病、脑水肿、感染、出血等严重并发症的临床综合征称之为重型肝炎或肝功能衰竭,是目前临床常见的急危重症。在欧美国家,药物及酒精是引起重型肝炎的主要原因,在我国,重型肝炎则主要由肝炎病毒,尤其是HBV感染所致（约70%）。重型肝炎来势凶险、病情严重、发展迅速、病死率高,严重威胁患者生命。重型肝炎的发病机制尚未明了,目前临床上仍缺乏有效治疗手段,虽然部分患者可通过肝移植手术挽救生命,但移植后1年生存率也仅为50%-60%,因此绝大部分重型肝炎患者预后不良,死亡率可达到70%-80%。开发与重型肝炎发生、发展相关的基因治疗的方法正成为该领域的研究热点和发展方向。原发性肝癌是恶性程度极高、预后极差的恶性肿瘤,居恶性肿瘤发生率的第五位、病死率的第三位。全世界每年约有65万人死于肝癌。全世界80%以上的肝癌患者集中在亚洲和非洲,其中中国占了约50%。在中国,肝癌多由乙肝所致肝硬化演变而来,而在西方国家,由于HCV感染和非酒精性脂肪肝患者的增加使得肝癌的发病率逐年增加。传统的肝癌治疗手段包括外科切除、肝移植、放疗和化疗。然而,无论是手术切除还是肝移植均存在着术后的高复发率问题,且肝移植供体贫乏,加之肝细胞癌对化疗和放疗均不敏感,使得肝癌的临床诊疗仍缺乏有效的治疗手段。因此,针对肝癌诊治新技术、新疗法如基因治疗和分子靶向治疗的研究则显得尤为重要和迫切。在重型肝炎的发病过程中,涉及到多种炎性分子的异常表达,如Fas/FasL系统、TNFa/TNFR1系统介导的肝细胞凋亡和fgl2介导的肝细胞坏死。在重型肝炎时,体内残存的肝细胞过度表达Fas,同时大量激活的CTL异常高表达FasL,且血清可溶性FasL水平显着增高,从而导致肝细胞凋亡。TNFa由活化的巨噬细胞产生,它有两种受体,即TNFR1和TNFR2,有研究表明,TNFa及TNFR1的表达水平与重型肝炎的病变程度相一致,同时凋亡的肝细胞数目与TNFa的表达呈现非常显着的正相关。Fgl2凝血酶原酶被称为“免疫凝血”,它具有免疫调节功能和凝血功能。作为新型凝血酶原酶,fgl2可直接促进凝血酶的生成而不依赖于其它凝血因子,凝血酶可通过降解纤维蛋白原形成纤维蛋白导致血栓形成和纤维素的沉积。研究揭示在IFN-y等炎性因子的刺激下,fgl2在重型肝炎中高表达,是肝细胞坏死的重要分子机制；本研究所前期利用mfgl2反义质粒和shRNA干扰质粒可显着减轻暴发性肝炎小鼠肝组织病理损伤,减少炎性细胞的浸润、纤维素的沉积,从而提高暴肝小鼠生存率至33.3%。Fgl2与肝癌的发生、发展也有密切关系。我们的前期研究发现常见实体肿瘤如肝癌、食管癌、肺癌、胃癌、结肠癌、宫颈癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的实质细胞、间质浸润细胞、血管内皮细胞及细胞外基质均有fgl2凝血酶原酶的广泛表达,并与纤维蛋白沉积有密切组织学关系。作为凝血酶的上游基因,我们推测fgl2在肿瘤生长、转移及血管新生中亦发挥了重要作用。我们应用裸鼠角膜血管新生模型和肿瘤皮下瘤移植模型显示fgl2基因沉寂后的人肝癌细胞诱导血管新生的能力显着降低；Fgl2敲除的高侵袭性人肝癌细胞HCCLM6细胞增殖能力、侵袭能力,耐受TNFa诱导的凋亡能力、表达促血管生成因子如IL-8、VEGF的能力较未干扰HCCLM6细胞及非相关对照HCCLM6细胞均显着下降,表明fgl2在肿瘤细胞中的高表达在肿瘤的生长和转移中发挥了重要作用。进一步研究表明：分泌型fgl2在肿瘤微环境中的表达上调通过激活p38-MAPK通路和抑制JNK通路实现。上述变化可增强单核巨噬细胞的致炎活性,抑制向树突状细胞分化,继而可能抑制肿瘤特异性T细胞免疫；而膜结合型fgl2在单核巨噬细胞的表达则可能通过活化p38-MAPK和ERK途径促进细胞的增殖。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指内源性或外源性双链RNA （dsRNA）分子降解相应序列的mRNA,导致靶基因表达沉默的过程,是一种序列特异性的转录后基因沉默,具有高效、特异、快速等优点。作为一种自然防御机制,RNA干扰在许多物种如线虫、果蝇、植物以及哺乳动物中都存在,可防止生物体受到病毒或其它外源核酸的入侵,同时在生物生长发育中发挥着基因表达调控的作用。目前发现有两种非编码小干扰RNA：小的干涉RNA （siRNA）和微小RNA （miRNA）. RNA干扰现象被发现以后,越来越多的研究者将其广泛应用于功能基因组学的研究。近年来,RNA干扰技术作为一种治疗工具,在预防和治疗人类疾病如感染性疾病、肿瘤、某些代谢性疾病等方面也取得了瞩目的成绩。本研究旨在利用miRNA技术干预在重型肝炎、肝癌发生发展中起重要作用的致病基因,研究基因治疗的可行性,为重型肝炎、肝癌的防治开辟出新方法。具体研究内容如下：1、针对与重型病毒性肝炎发生发展密切相关的分子mfgl2,构建腺病毒介导的miRNA即Ad-mfgl2-miRNA,探索其对目的基因的沉默效应以及联合应用（Ad-mfgl2-miRNA、Ad-mFas-mTNFR1-miRNA）对暴发性肝炎小鼠病程的干预作用；2、利用Ad-hfgl2-miRNA沉默肝癌中高表达的fgl2,观察其对裸鼠人肝癌皮下移植瘤的靶向干预作用。[研究方法]1、通过Gateway技术构建产生小鼠fg12-miRNA的表达载体P-mfgl2-miRNA和非相关对照质粒,分别连入5型缺陷型腺病毒载体中,形成Ad-mfgl2-miRNA和Ad-neg-miRNA。细胞水平共转染Ad-mfgl2-miRNA和pcDNA3.1-mfg12表达质粒,通过实时荧光定量PCR及Western blot观察fgl2在基因转录水平及蛋白水平表达量的改变。2、建立MHV-3诱导的Balb/cJ小鼠暴发性肝炎模型；通过尾静脉注射将Ad-mfg12-miRNA和／或Ad-mFas-mTNFR 1-miRNA（实验室保存）导入小鼠体内,取小鼠眼球血检测血清生化学指标的改变、肝组织HE染色检测小鼠肝组织病理变化,并观察暴发性肝炎小鼠生存率的变化；通过实时荧光定量PCR、Western blot及免疫组化检测各组小鼠肝组织中目的基因的表达情况；通过TUNNEL法检测各组小鼠肝组织中肝细胞凋亡情况。3、建立裸鼠人肝癌皮下移植瘤模型,瘤内注射Ad-hfg12-miRNA（实验室保存）,优化治疗剂量；观察裸鼠皮下瘤的动态生长变化,计算相对肿瘤增殖率；通过实时荧光定量PCR和Western blot检测瘤组织中fgl2的表达,免疫组化检测瘤组织中fgl2、纤维蛋白以及血管新生标志物CD31的表达,并计算瘤组织中微血管密度。[结果]1、成功构建了腺病毒介导的针对小鼠fgl2的miRNA和非相关对照miRNA,测序鉴定无误。在CHO细胞中,干预组fgl2在RNA水平及蛋白水平的表达均较非相关对照组和阳性对照组显着降低。2、尾静脉注射Ad-mfg12-miRNA或Ad-mFas-mTNFR 1-miRNA后,可使暴发性肝炎小鼠生存率从0分别提高到38.9%和16.7%,而上述两种腺病毒联合干预后的暴肝小鼠生存率可提高到44.4%。干预组小鼠均可见肝组织病理学变化和血清学指标的明显改善；小鼠肝组织中相应靶基因的表达和肝细胞凋亡在干预组受到明显抑制。3、经Ad-hfg12-miRNA处理后,干预组小鼠的整体状态好于非相关对照组和空白对照组小鼠,瘤块明显小于后两组小鼠的瘤块。与非相关对照及空白对照相比,其相对肿瘤增殖率分别达到29.9%和36.7%,同时,也检测到了注射腺病毒注射液后,受体组织肿瘤细胞中hfg12 mRNA水平和蛋白质水平均出现了抑制,证实了Ad-hfg12-miRNA对hfg12凝血酶原酶基因的沉默作用,此外,瘤组织中纤维蛋白沉积及新生血管也较对照组明显降低。[结论]1、本研究成功构建了Ad-mfg12-miRNA,体内外实验均观察到其高效特异的下调目的基因表达的作用。2、本研究表明fgl2、Fas及TNFR1可作为重型肝炎基因治疗的靶点,基于重型肝炎相关基因的体内联合干预较单独干预显示出了更为显着的治疗效果,利用miRNA沉默fgl2、Fas及TNFR1基因为重型肝炎的治疗提供了新的策略。3、本研究显示Ad-hfg12-miRNA可显着抑制裸鼠人肝癌皮下移植瘤生长,干预效果明显,为今后肝癌等恶性肿瘤的治疗提供了新思路。
马涛[10]（2012）在《脂肪间充质干细胞移植对大鼠小体积肝移植术后肝损伤的治疗作用及机制研究》文中研究表明实验目的：小体积肝移植术后移植物损伤可严重影响供肝功能,甚至诱发小体积综合征,危及受体生命。文献报道脂肪间充质干细胞（ADSC）移植可缓解局部组织微循环障碍,改善肝损伤,促进肝再生,但其能否保护小体积肝移植物未见报道。本研究拟探索ADSC移植对小体积肝移植物的保护作用及相应机制。材料与方法：无菌提取大鼠腹股沟脂肪带的ADSC,体外培养扩增,并进行诱导分化实验及表面标记物鉴定。通过RNA干扰技术构建包含GFP及抑制大鼠VEGF表达的短发夹RNA （shRNA）或阴性对照shRNA的质粒,经慢病毒载体包装后转染ADSC,特异性阻断ADSC表达VEGF。提取大鼠肝窦内皮细胞（LSEC）,与不同浓度的转染阴性对照shRNA的ADSC （NC-shRNA ADSC）及转染干扰VEGF shRNA的ADSC （VEGFi-shRNA ADSC）共培养,24小时后采用Annexin V/PI试剂盒流式检测LSEC的凋亡比例。建立35%的大鼠小体积肝移植模型,术中经门静脉移植2×106NC-shRNA ADSC或VEGFi-shRNA ADSC,对照组经门脉输注等体积的Hanks缓冲液。观察各组大鼠术后100天生存情况,进行血清肝功能及病理学检测（H&E、透射电子显微镜）,采用荧光显微镜进行活体肝脏灌注检测,通过实时荧光定量PCR、免疫蛋白印迹检测SFSLT术后各组肝脏内皮素-1（ET-1）、内皮素受体A （ETAR）、Bcl-2、Bax、Bad、p-bad的表达,采用免疫组织化学方法检测肝脏标本PCNA、Ⅷ因子的表达,并检测肝脏那个冰冻标本的GFP荧光,示踪移植入的ADSC。结果：（1）体外共培养实验表明：与相同数量的VEGFi-shRN ADSC相比,3×105NC-shRNA ADSC与LSEC共培养可明显降低LSEC的凋亡水平。（2） NC-shRNA ADSC移植组大鼠的肝功能（ALT. AST）及生存率显着高于对照组及VEGFi-shRNA ADSC移植组。（3）肝脏切片H&E染色显示NC-shRNA ADSC移植组大鼠的肝脏微结构基本正常；与之相比,对照组及VEGFi-shRNA ADSC移植组大鼠的肝脏结构明显破坏,表现为肝窦结构紊乱、局灶性肝细胞坏死及汇管区炎症细胞浸润等。透射电子显微镜下观察NC-shRNA ADSC移植组的肝窦超微结构基本正常,而对照组及VEGFi-shRNA ADSC移植组的肝窦内皮细胞线性结构破坏,可见细胞核皱缩等凋亡表现。（4）活体肝脏灌注检测显示NC-shRNA ADSC移植组的肝窦微循环状态明显优于对照组及VEGFi-shRNA ADSC移植组,表现为肝窦灌注指数高、肝窦直径小。（5）实时荧光定量PCR结果显示NC-shRNA ADSC移植组的ETAR表达水平明显低于其他两组,且该组的Bcl-2/Bax比值明显高于对照组,Bad表达水平明显低于对照组及VEGFi-shRNA ADSC移植组；免疫蛋白印迹结果与PCR结果一致,并表明NC-shRNA ADSC移植组的p-Bad表达明显高于其他两组。（6）NC-shRNA ADSC移植组的Ⅷ因子及PCNA免疫组化染色阳性的细胞比率均明显高于对照组及VEGFi-shRNA ADSC移植组。（7）术后第1天及第7天的大鼠肝内可见GFP阳性细胞,术后第14天及第30天的大鼠肝内未发现GFP阳性细胞。结论：小体积肝移植术后脂肪间充质干细胞移植可显着改善小体积肝移植物的肝功能、肝脏血流灌注状态,减少肝脏细胞凋亡,并促进肝细胞及肝脏微血管再生。脂肪间充质干细胞的这些作用主要是通过分泌血管内皮生长因子来实现的。
二、肝/肝干细胞移植研究中的若干问题探讨（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝/肝干细胞移植研究中的若干问题探讨（论文提纲范文）
（1）“髓”为中心的治疗靶点（论文提纲范文）
| 1 “髓”本质的生物学基础 |
| 2 “髓”是“肝肾同源”的中心环节 |
| 3 “髓”为中心治疗靶点的科学意义及其临床价值 |
| 4 “补肾生髓”对艾滋病免疫重建的作用及机制 |
（2）基于PI3K/AkT/mTOR信号通路探讨补肾生髓法促进骨髓间充质干细胞移植治疗肝硬化的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 临床观察 |
| 1 研究内容和目的 |
| 2 资料与方法 |
| 2.1 研究对象 |
| 2.2 诊断标准 |
| 2.3 纳入标准 |
| 2.4 排除标准 |
| 2.5 病例分组及治疗方法 |
| 2.6 观察指标 |
| 2.7 疗效判定标准 |
| 2.8 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 病例一般资料分析 |
| 3.2 中医证候评分情况 |
| 3.3 治疗前后患者疗效对比情况 |
| 3.4 治疗前后患者肝功能变化情况 |
| 3.5 治疗前后患者HBV-DNA阴转率对比情况 |
| 3.6 治疗前后患者肝脏硬度(LSM)变化情况 |
| 3.7 治疗前后患者腹部超声影像学结果变化情况 |
| 4 讨论 |
| 4.1 现代医学对肝硬化的研究 |
| 4.2 中医对肝硬化的研究 |
| 4.3 补肾生髓法治疗肝硬化的研究 |
| 4.4 恩替卡韦联合补肾生髓法治疗乙肝肝硬化的疗效分析 |
| 4.5 结论 |
| 4.6 本研究的不足 |
| 第二部分 动物研究 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验用药、试剂及仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 BMSCs的制备 |
| 2.2 实验动物饲养管理、分组及造模方案 |
| 2.3 实验各组干预方案 |
| 2.4 实验大鼠标本采集与处理 |
| 2.5 实验指标检测 |
| 3 统计学方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 BMSCs的形态学观察 |
| 4.2 大鼠一般状况 |
| 4.3 大鼠肝组织HE染色情况 |
| 4.4 各组大鼠肝功能情况比较 |
| 4.5 ELISA法检测外周血GCSF、EPO水平 |
| 4.6 Western blot法检测肝组织中SDF-1、CXCR4、PI3K、p-Akt、mTOR蛋白表达情况 |
| 5 讨论 |
| 5.1 BMSCs的分离培养与鉴定 |
| 5.2 肝硬化大鼠模型建立与评价 |
| 5.3 各组大鼠的一般状况、血清学指标及病理学变化的意义 |
| 5.4 PI3K/AKT/mTOR信号通路与肝纤维化的发生 |
| 5.5 PI3K/AKT/mTOR信号通路与BMSCs迁移的发生 |
| 5.6 BMSCs移植联合加味济生肾气汤对PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响 |
| 6 结论 |
| 7 问题与展望 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 综述 骨髓间充质干细胞诱导分化为肝细胞的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果 |
（3）MSCs促生长及免疫调节相关因子检测和促进ALPPS术后肝再生的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、脐带间充质干细胞的旁分泌及对T细胞分泌的影响 |
| 1.1 研究对象和材料 |
| 1.1.1 实验研究对象 |
| 1.1.2 实验耗材 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 主要仪器 |
| 1.1.5 主要试剂盒 |
| 1.1.6 主要溶液 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 脐带间充质干细胞的分离与培养 |
| 1.2.2 脐带间充质干细胞免疫表型 |
| 1.2.3 使用动态成像系统分析脐带间充质干细胞生长曲线 |
| 1.2.4 脐带间充质干细胞培养上清的制备 |
| 1.2.5 脐血T细胞及细胞培养上清的制备 |
| 1.2.6 建立UC-MSCs与脐血T细胞共培养体系 |
| 1.2.7 细胞因子检测 |
| 1.2.8 统计学方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 UC-MSCs体外生长情况及形态学观察 |
| 1.3.2 UC-MSCs免疫表型鉴定 |
| 1.3.3 UC-MSCs的增殖能力分析 |
| 1.3.4 UC-MSCs的细胞因子分泌情况 |
| 1.3.5 共培养组的细胞因子分泌情况 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 间充质干细胞 |
| 1.4.2 脐带间充质干细胞的分离培养及鉴定 |
| 1.4.3 UC-MSCs与 BM-MSCs生物学特性比较 |
| 1.4.4 液相芯片技术的优势 |
| 1.4.5 UC-MSCs的旁分泌作用 |
| 1.5 小结 |
| 二、间充质干细胞移植促进ALPPS术后肝再生 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验研究对象 |
| 2.1.2 实验耗材 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要器械 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.1.6 主要试剂盒 |
| 2.1.7 主要溶液 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养与鉴定 |
| 2.2.2 大鼠模型的制备 |
| 2.2.3 检测指标 |
| 2.2.4 统计学处理 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 骨髓间充质干细胞体外生长情况及形态学观察 |
| 2.3.2 骨髓间充质干细胞免疫表型鉴定 |
| 2.3.3 大鼠术后体重变化及肝再生率 |
| 2.3.4 术后肝功能变化 |
| 2.3.5 术后组织病理学改变 |
| 2.3.6 术后PCNA阳性细胞数变化 |
| 2.3.7 术后右中叶TNFα、IL-6及HGF表达水平 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 骨髓间充质干细胞 |
| 2.4.2 ALPPS手术模型 |
| 2.4.3 细胞移植 |
| 2.4.4 肝再生的评价指标 |
| 2.4.5 本研究的不足和展望 |
| 2.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 间充质干细胞移植促进肝脏再生的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）基于基因打靶技术的人胚胎干细胞向功能性肝细胞分化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第1章 基因打靶技术在人胚胎干细胞中的应用 |
| 1.1 基因打靶的技术基础 |
| 1.2 基因打靶技术的分类 |
| 1.3 基因打靶技术的基本程序 |
| 1.4 TALEN 技术 |
| 1.5 CRISPR/CAS9 技术 |
| 1.6 锌指核酸酶技术 |
| 第2章 人胚胎干细胞向肝脏细胞的定向分化 |
| 2.1 肝脏概述 |
| 2.2 肝实质细胞的来源 |
| 2.3 人胚胎干细胞/多潜能干细胞向肝脏细胞的分化/转分化 |
| 2.4 利用肝细胞重建的人源化模型及应用 |
| 2.5 肝细胞体外模型的展望 |
| 第二篇 实验部分 |
| 第1章 构建 CYP3A4 的 TALEN 及打靶载体 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第2章 在人胚胎干细胞中实现基因打靶 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 利用 CYP3A4 报告体系进行肝脏细胞的定向分化及验证 |
| 3.1 材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 利用报告体系筛选肝脏细胞分化路径中的关键调控因子 |
| 4.1 材料 |
| 4.2 方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻博期间发表的学术论文及其他成果 |
| 导师及作者简介 |
| 致谢 |
（5）活化肝星状细胞促进大鼠肝细胞去分化为肝前体细胞（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 活化肝星状细胞促进肝前体细胞产生 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 活化肝星状细胞促进大鼠肝细胞去分化为肝前体细胞 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（6）骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性肝衰竭的作用研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词对照表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 2 国内外研究概况 |
| 第一部分 |
| 实验材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（8）人脐带间充质干细胞对大鼠脂肪供肝肝移植的保护作用及相关机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 前言 |
| 第一部分 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 |
| 引言 |
| 材料与 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 附图 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 博士在读期间发表的文章 |
| 博士在读期间参加的科研基金 |
| 致谢 |
（9）腺病毒介导的炎性基因miRNAs干预小鼠暴发性肝炎和裸鼠人肝癌皮下移植瘤的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略语对照表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 腺病毒介导的小鼠fgl2-miRNA的构建及在细胞水平的干预效应 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 腺病毒介导的重肝相关炎性基因miRNA对MHV-3诱导的小鼠暴发性肝炎病程的干预效应 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 重组人Ad-hfgl2-miRNA靶向干预裸鼠人肝癌皮下移植瘤的药效学研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文小结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
（10）脂肪间充质干细胞移植对大鼠小体积肝移植术后肝损伤的治疗作用及机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 插图和附表清单 |
| 缩略语表 |
| 目次 |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 研究路线 |
| 2 脂肪间充质干细胞及肝窦内皮细胞的分离培养、鉴定及共培养研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 3 脂肪间充质干细胞移植对小体积肝移植物的保护作用及机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 作者简历及在读期间所取得的科研成果 |
四、肝/肝干细胞移植研究中的若干问题探讨（论文参考文献）
- [1]“髓”为中心的治疗靶点[J]. 李瀚旻,刘建忠. 中华中医药学刊, 2022(01)
- [2]基于PI3K/AkT/mTOR信号通路探讨补肾生髓法促进骨髓间充质干细胞移植治疗肝硬化的机制研究[D]. 李裕珍. 广西中医药大学, 2021(02)
- [3]MSCs促生长及免疫调节相关因子检测和促进ALPPS术后肝再生的实验研究[D]. 牛文惠. 天津医科大学, 2019(02)
- [4]基于基因打靶技术的人胚胎干细胞向功能性肝细胞分化的研究[D]. 尹明. 吉林大学, 2014(09)
- [5]活化肝星状细胞促进大鼠肝细胞去分化为肝前体细胞[D]. 衣桂荣. 第二军医大学, 2014(04)
- [6]骨髓间充质干细胞治疗大鼠急性肝衰竭的作用研究[D]. 袁淑芳. 新疆医科大学, 2013(02)
- [7]我国16个重点病种的国家中医临床研究基地论文统计表（2008年～2013年）[J]. 国家中医药管理局国家中医临床研究基地办公室. 世界科学技术-中医药现代化, 2013(05)
- [8]人脐带间充质干细胞对大鼠脂肪供肝肝移植的保护作用及相关机制研究[D]. 张英才. 中山大学, 2012(09)
- [9]腺病毒介导的炎性基因miRNAs干预小鼠暴发性肝炎和裸鼠人肝癌皮下移植瘤的研究[D]. 王鸣. 华中科技大学, 2012(09)
- [10]脂肪间充质干细胞移植对大鼠小体积肝移植术后肝损伤的治疗作用及机制研究[D]. 马涛. 浙江大学, 2012(09)