一、胶原凝胶包埋肝细胞体外培养和腹腔移植（论文文献综述）
甄爽[1]（2020）在《微流控制备海藻酸钠-肠道类器官微球治疗炎症性肠病的研究》文中研究指明背景炎症性肠病（inflammatory bowel disease,IBD）主要包括克罗恩病（Crohn′s disease,CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis,UC）,其发病率和患病率逐年增加,并且极大地影响患者的生活质量和社会生产能力。由于发病原因尚不明确,目前对于IBD的治疗方法也很局限,主要是通过抗炎、调节机体免疫等药物治疗,但这些方法副作用较多,效果也不理想。近年来,干细胞移植治疗成为了IBD的新治疗手段,但是在临床应用中仍然存在细胞滞留、存活率低导致移植效率低等问题。微流控技术的发展为此难题的解决带来了可能。将含有肠道干细胞的肠道类器官包裹在水凝胶微球中,可提高细胞在移植过程中的存活率,提高移植效率,应具有很好的应用前景。本论文应用微流控电喷技术制备包裹有类器官的水凝胶微球应用于干细胞移植,并探究它们在治疗IBD中的作用。方法首先体外建立小鼠肠道的类器官培养体系,得到培养成熟、具有肠道上皮细胞结构和功能的肠道类器官,并构建毛细管微流控装置,以海藻酸钠（sodium alginate,Na-alg）溶液为外相,以小鼠肠道类器官与Matrigel及羧甲基纤维素钠（carboxymethylcellulose,CMC）混合相为内相,利用电喷技术将类器官及周围基质包裹于海藻酸钠内,并以2%Ca Cl2收集使海藻酸钠凝胶化,制成海藻酸钠装载类器官微球。利用光学显微镜、扫描电镜等检测微球的形貌、结构。进行微球裂解实验评估微球的裂解性能,细胞实验评估微球的生物相容性。之后在葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium,DSS）诱导的结肠炎小鼠模型中,分别用不含类器官的磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution,PBS）、含类器官的PBS以及含包裹类器官的微球的PBS进行灌肠,并通过大体观察、组织学分析、细胞因子检测等,评估这些不同方法修复DSS诱导的肠炎的效果。结果我们成功地建立了体外培养小鼠肠道类器官的体系,提取的肠道隐窝能稳定在体外培养传代,并能分化发育成各种类型的肠道上皮细胞。制备的海藻酸钠微球具有良好的球形形态和单分散性;在裂解实验中,微球在p H较低的模拟胃液中几乎不裂解,而在体外的模拟肠液中能迅速裂解,达到在特定p H环境中快速释放微球内容物的目的;细胞实验证实,微球具有很好的生物相容性,使得细胞在微球内也能正常生长;在小鼠溃疡性结肠炎模型中,通过微球的装载保护作用,类器官能够在不被破坏的情况下被运输移植到小鼠体内,并能改善小鼠结肠炎表现。结论微流控技术制备的微球能够为类器官提供保护性的环境,提高移植成功率,提供了IBD治疗的新平台。
买买艾力·玉山[2]（2020）在《rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs促进大鼠股骨牵张成骨的研究》文中指出目的:1)建立一个合理的可重复的大鼠负重长骨牵张成骨（Distraction Osteogenesis,DO）模型,为今后进一步探讨和深入研究促进牵张成骨区骨再生与矿化的方法以及分子机制奠定基础;2)建立稳定的大鼠骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）的获取和体外培养体系,并进一步扩增,纯化及鉴定。通过人重组血小板衍生生长因子-BB（rhPDGF-BB）基因慢病毒体外转染BMSCs并观察对BMSCs的影响;3)以大鼠自体BMSCs作为载体,通过体外携带rhPDGF-BB基因的慢病毒转染后,将rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs导入大鼠股骨牵张间隙中,探讨rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs对大鼠股骨牵张间隙新生骨再生矿化的影响,进一步为临床上应用牵张成骨技术（骨传送技术）治疗四肢大段骨缺损探讨一种快速而有效的缩短治疗周期的治疗方法。方法:1)大鼠单侧股骨牵张成骨动物模型的建立:选择雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠为实验动物,<6月龄,350-400g。使用自行研制的延长型外固定器,用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后,选择大鼠右侧股骨中段行截骨后用4枚螺钉固定延长型外固定器。术后经过7天潜伏期后进行缓慢牵张,速度为0.5mm/天（分两次）,连续牵张14天,共牵张延长7mm,牵张结束后固定牵张器。分别于牵张结束后第0周,2周,4周及8周四个时间点处死3只动物,处死前麻醉状态下行X线检查,处死后取出右侧股骨标本进行大体观察,组织学HE染色及番红固绿染色观察;2)大鼠BMSCs的分离培养,鉴定及rhPDGF-BB基因体外转染:大鼠自体BMSCs的培养和传代,通过细胞活性检测,碱性磷酸酶（ALP）染色及茜素红染色方法进行细胞鉴定,通过应用密度梯度离心法获取生长状态良好第3代大鼠BMSCs经上述方法鉴定后进一步应用基因转染和下一步的治疗。构建同时携有绿色荧光蛋白（GFP）报告基因和rhPDGF-BB基因的重组慢病毒载体后经体外扩增,纯化后转染大鼠BMSCs观察其体外对BMSCs的影响;3)rhPDGF-BB修饰的骨髓MSCs促进大鼠股骨牵张成骨效果的检测:应用自行研制的延长型外固定器将54只SD大鼠随机分为3组,每组于术后21天分别在牵张区局部注射等剂量rhPDGF-BB修饰的骨髓MSCs（实验组）,骨髓MSCs（实验对照组）,PBS（空白对照组）,活体X线检查于DO牵张结束后不同时间点进行4次,检测时间点为牵张结束（术后天21天）,矿化期2周（术后第35天）,矿化期4周（术后第49天）,矿化期8周（术后第77天）。矿化期第8周末处死动物取双侧股骨,并小心剔除骨组织表面肌肉进行Micro-CT,生物力学及组织病理学检测分析。结果:1)纳入本次实验研究的实验动物活体观察提示所有入组实验动物均耐受手术且顺利完成术后牵张成骨过程,观察期间所有实验动物的饮食及大小便均正常,牵张结束后延长侧股骨较对侧相比达到预定目标长度。通过标准X线检查和组织学观察证实大鼠股骨牵张模型牵张间隙成骨良好;2)应用密度梯度离心法成功分离了大鼠BMSCs,细胞活性检测结果提示细胞生长良好,碱性磷酸酶（ALP）染色及茜素红染色结果提示表达高水平的ALP活性,矿化细胞外基质,形成矿化结节。构建出的rhPDGF-BB基因体外转染鉴定过的大鼠BMSCs,转染后对细胞的生长无明显影响;3)rhPDGF-BB基因修饰的大鼠BMSCs局部应用于大鼠股骨牵张模型。X线片显示,矿化期第8周实验组10只延长区均达到骨性愈合,实验对照组和空白对照组分别为5只和4只达到骨性愈合的标准。生物力学测试（三点力学测试）结果表明实验组所有抗扭强度指标均显着优于其他两个对照组,且实验组抗扭强度指标与自体对侧未牵张正常股骨的抗扭强度相当。Micro-CT扫描后获得的数据结果分析提示矿化期第8周实验组牵张区间隙内新生骨骨痂的主要构成结构由皮质骨构成而松质骨结构极为少见,此外牵张间隙新生骨矿化区可见骨髓腔部分或全部与牵张两骨端骨髓腔基本贯通,其构成和结构与自身长骨管状骨的结构基本类似,而其他两对照组牵张区间隙内新生的骨组织以松质骨结构为主且骨髓腔结构改建较差。矿化期第8周获取的股骨标本行组织学切片后HE和Safranin O染色结果提示,实验组牵张间隙新生骨痂内软骨组织残留较少而两个对照组牵张区间隙新生骨组织结构上仍有部分软组织结构,新生骨已经矿化,皮质骨已连续,骨髓腔开始重建,提示rhPDGF-BB基因修饰的大鼠BMSCs治疗处理后新生骨痂矿化明显。免疫组化结果提示三组中实验组OPN、OCN、VEGF和CD31表达高于两对照组。结论:1)自制延长型外固定器能够满足大鼠单侧股骨牵张的要求,牵张成骨的潜伏期成骨与骨折愈合过程类似,但牵张成骨在其特有的牵张期和矿化期的时间段里牵张区间隙新骨再生具有其特有的组织学变化特点。本实验部分通过所获得的大鼠股骨参数,自制研发出适用于研究SD大鼠股骨牵张成骨模型的微型单边可延长型外固定装置,并顺利构建出可重复性较高适合大批量SD大鼠DO实验研究的动物模型,为今后利用DO动物实验模型并通过细胞或基因治疗缩短治疗周期或DO过程中的细胞分子机制的研究提供动物模型实验平台;2)密度梯度离心法获取的大鼠BMSCs体外培养结果提示其增殖活性较强,鉴定结果提示其可作为本次实验研究进行细胞治疗以及基因治疗较为理想的种子细胞。目的基因靶细胞转染后在不同时间点通过不同倍数荧光显微镜下观察结果提示,脂质载体介导的瞬时转染可以使rhPDGF-BB基因在BMSCs中成功表达;3)X线,Micro-CT,生物力学,组织学和免疫组织化学观察都证实,与单纯BMSCs及PBS相比,rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs可较为有效的促进大鼠股骨牵张间隙区成骨过程中新骨的形成和矿化。应用rhPDGF-BB基因体外转染BMSCs于牵张结束后局部应用能够促进牵张成骨中的骨再生从而缩短DO治疗周期,为临床上应用牵张成骨（骨传送）技术治疗骨缺损提供了一个新的策略。
陈笑艳,王经琳,施晓雷[3]（2019）在《胶原凝胶复合骨髓间充质干细胞对小鼠急性肝衰竭的疗效与机制研究》文中进行了进一步梳理目的探讨移植胶原凝胶复合骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,MSCs对小鼠急性肝功能衰竭（acute liver failure,ALF）的治疗效果与机制。方法 105只雄性C57BL/6小鼠随机分为5组:对照组、ALF组、ALF+胶原凝胶组、MSCs组和胶原凝胶-MSCs组,每组21只。ALF组、ALF+胶原凝胶组、MSCs组和胶原凝胶-MSCs组采用腹腔注射D-氨基半乳糖苷（D-Gal）12 h后,分别于肝脏多点注射200μL PBS、200μL胶原凝胶、1×106 MSCs和1×106胶原凝胶-MSCs。记录各组小鼠7 d存活率,全自动生化仪检测肝功能水平,HE染色检测肝脏组织病理学改变,免疫组化检测肝细胞凋亡和增殖情况,利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测肝脏炎症因子水平,Western blotting检测PI3K-AKT信号通路表达。结果扫描电镜示胶原凝胶与MSCs具有较好的相容性,动物活体成像检测显示胶原凝胶-MSCs移植的信号强于单独MSCs移植的ALF小鼠。D-Gal处理后,胶原凝胶-MSCs组和MSCs组的小鼠生存率明显提高（P<0.05）,小鼠血清AST、ALT在胶原凝胶-MSCs组和MSCs组的小鼠明显优于ALF组和ALF+胶原凝胶组（P<0.05）,且肝功能指标明显改善,胶原凝胶-MSCs组要更优于MSCs组（P<0.05）。HE染色提示胶原凝胶-MSCs组肝脏的病理改变（肝细胞坏死部位和范围）轻于MSCs组,Western blotting、Ki-67和cleavedCaspase3免疫组化结果显示,胶原凝胶-MSCs组肝细胞增殖能力强于MSCs组,同时肝细胞凋亡程度要低于MSCs组,相应的胶原凝胶-MSCs组肝脏内IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS和CCL2等炎性因子水平也低于MSCs组。且胶原凝胶-MSCs移植能明显激活肝脏内的PI3K-AKT通路。结论胶原凝胶复合MSCs移植能增强MSCs的肝脏定植能力,通过抑制细胞凋亡和促进细胞增殖减轻肝损伤,并调控AKT信号通路改善肝细胞功能,因此胶原凝胶复合MSCs移植优于单纯MSCs移植治疗ALF。
陈笑艳[4]（2019）在《胶原凝胶复合骨髓间充质干细胞治疗急性肝衰竭的作用与机制研究》文中研究表明研究背景:急性肝功能衰竭（acute liver failure,ALF）是由多因素所引发的迅速和严重的肝损伤,临床上如何治疗ALF一直是难以解决的问题。现阶段治疗ALF最有效的方法是肝脏移植,但其受到供体短缺和手术费用高昂等因素的限制,无法常规应用。骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）移植作为一种新兴细胞移植疗法,成为了治疗ALF的研究热点,然而,研究表明移植的MSCs仅有少量细胞募集到受损组织,其治疗效果受到移植后的低细胞利用率和存活率的限制。胶原凝胶具有良好的生物相容性和特有的拓扑三维结构,既可以为细胞的靶向递送提供载体,同时也可以提供细胞生长所需的三维环境,进而维持并提高MSCs的存活能力与功能。然而,目前移植胶原凝胶复合MSCs是否对ALF具有更好的治疗效果缺乏研究。本研究建立以D-氨基半乳糖苷（D-Galactosamine,D-Gal）诱导的小鼠ALF模型,通过检测胶原凝胶复合MSCs移植在治疗小鼠ALF中取得的疗效,为胶原凝胶复合MSCs移植应用于临床治疗ALF提供实验基础和依据。研究目的:本研究主要探讨移植胶原凝胶复合MSCs对ALF小鼠的治疗作用及相关作用机制。研究方法:分离C57BL/6小鼠的骨髓MSCs,体外贴壁培养,每3天换液,用传至3-6代的MSCs进行实验。将MSCs与胶原凝胶混合制备,通过扫描电子显微镜检测胶原凝胶与MSCs的生物相容性。将经荧光预处理的MSCs、胶原凝胶复合MSCs分别肝脏多点注入ALF小鼠的肝脏,进行小动物活体成像检测,探究MSCs在肝脏中定植情况。将105只C57BL/6小鼠随机分为5组:（1）对照组（生理盐水）;（2）D-Gal+PBS组;（3）D-Gal+胶原凝胶组;（4）D-Gal+MSCs组;（5）D-Gal+胶原凝胶-MSCs组。组（1）中的小鼠腹腔注射生理盐水,另外4组小鼠腹腔注射D-Gal,建立小鼠ALF模型。于造模12小时后,4组ALF小鼠分别肝脏多点注射200μLPBS、200μL胶原凝胶、1×106MSCs、包含1×106MSCs的胶原凝胶-MSCs,统计各组小鼠的生存率。检测各组小鼠的ALT、AST和炎症因子水平,Western bloting、组织病理学染色检测各组小鼠肝脏组织中肝细胞的增殖和凋亡水平。结果:扫描电镜发现胶原凝胶与MSCs具有较好的相容性,小动物活体成像检测发现几乎所有信号均集中于肝脏,脾脏位置无信号,胶原凝胶复合MSCs移植的信号强于单独MSCs移植的ALF小鼠。经D-Gal处理后,小鼠血清中AST和ALT水平显着增高,并且在给药后第3天达到峰值。肝功能指标在D-Gal+胶原凝胶-MSCs组和D-Gal+MSCs组的小鼠明显优于D-Gal+PBS组和D-Gal+胶原凝胶组（P<0.05）,D-Gal+胶原凝胶-MSCs组比较D-Gal+MSCs组有明显改善（P<0.05）。HE染色提示D-Gal+胶原凝胶-MSCs组和D-Gal+MSCs组的肝脏损伤程度轻于D-Gal+PBS组和D-Gal+胶原凝胶组,D-Gal+胶原凝胶-MSCs组轻于D-Gal+MSCs组。D-Gal+PBS组和D-Gal+胶原凝胶组小鼠3天生存率不足15%,两组之间无显着差异,MSCs治疗组小鼠7天生存率为44%,而胶原凝胶复合MSCs治疗组小鼠生存率相比较单纯MSCs治疗组显着提高（7天生存率76%）。Western Bloting和免疫组化均显示D-Gal+胶原凝胶-MSCs组肝细胞增殖率明显优于D-Gal+MSCs组、D-Gal+PBS组及D-Gal+胶原凝胶组,同时,肝细胞凋亡明显低于D-Gal+MSCs组,相应的肝脏内IL-1β、IL-6、TNF-α、i NOS和CCL2等炎性因子水平D-Gal+胶原凝胶-MSCs也低于D-Gal+MSCs组。进一步的研究发现,D-Gal+胶原凝胶-MSCs通过激活PI3K/AKT信号通路发挥治疗作用。实验表明,尽管胶原凝胶本身对ALF无治疗作用,但胶原凝胶复合MSCs移植能增强MSCs的肝脏定植能力,并能对小鼠ALF产生更好的治疗效果,本研究的顺利进行,为解决MSCs移植治疗ALF提供了新的思路。结论:（1）胶原凝胶复合MSCs移植能增强MSCs的肝脏定植能力,从而更有效的减轻小鼠ALF;（2）胶原凝胶复合MSCs可通过抑制细胞凋亡,促进细胞增殖来减轻肝损伤;（3）移植胶原凝胶复合MSCs调控PI3K/AKT信号通路改善肝细胞功能。
沈翀[5]（2019）在《内质网应激对间充质干细胞体外培养扩增过程中成软骨能力影响的研究》文中认为目的:间充质干细胞是近年来治疗软骨缺损的潜力巨大的种子细胞,其可来源于多种组织,大多数研究为获得足够多的细胞数量,治疗前均先将干细胞进行体外扩增,然而体外扩增会引起干细胞的衰老并影响其分化能力,既往研究显示骨髓间充质干细胞体外扩增至第三代后其成软骨能力和软骨修复治疗效果较原代骨髓间充质干细胞均有下降,但其中的具体调控机制尚不明。本研究旨在通过转录组测序比较骨髓间充质干细胞体外扩增与否产生的差异基因和不同通路,查找出影响软骨分化能力的关键基因和通路,并通过实验进一步验证其结果。方法:先进行骨髓间充质干细胞的提取,6只2.5～3kg大小2月龄新西兰大白兔,麻醉后用16G骨穿针在双侧股骨髁、胫骨上段进行穿刺,每只穿刺抽取约20ml骨髓,使用兔骨髓干细胞分离试剂盒提取骨髓间充质干细胞,将干细胞分成2组:P0组:新鲜提取的兔原代骨髓间充质干细胞,未经扩增和冻存;P3组:使用扩增传代至第三代的兔骨髓间充质干细胞,未经冻存。提取P0组和P3组细胞RNA,进行转录组测序。测序完成后通过生物信息学技术,筛选出差异基因,进行KEGG通路分析查找出相关通路,结合文献报道选择内质网应激的未折叠蛋白反应通路作为关键通路,用qRT-PCR验证相关基因表达差异。根据结果进行下一步实验:取60只新西兰大白兔提取骨髓间充质干细胞,方法同前,将干细胞分成4组:P0组;P0+4-PBA组:首先每日通过灌胃方式给予兔0.25 g/kg剂量的内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-phenylbutyrate,4-PBA）,连续喂服20天之后,提取兔原代骨髓间充质干细胞用于后续实验;P3组;P3+TM组:使用传至第三代的兔骨髓间充质干细胞,孵育0.25 μg/ml的内质网应激激动剂衣霉素（tunicamycin,TM）48小时后用于后续实验。将以上4组干细胞转移至15ml离心管中,计数调整细胞量一致后离心后去除上清液,每管滴入胶原水凝胶并充分混匀,成胶后加入软骨诱导液,培养7天,14天,21天。每个时间点提取样品,进行如下检测:（1）用qRT-PCR技术检测软骨形成过程中软骨相关基因（ACAN,SOX9,COL2A1,COL1A1）和内质网应激相关基因（ATF4,ATF6,XBP1）的表达情况;（2）通过免疫印迹Western blot和免疫荧光染色检测内质网应激相关蛋白（ATF4,ATF6,XBP1）和软骨形成特异性蛋白COL2A1的表达情况;（3）采用MTT实验和DNA含量检测各组之间的细胞增殖情况;（4）番红O染色和DMMB检测细胞分泌软骨特异基质糖胺聚糖的含量。通过以上实验手段,检测各组骨髓间充质干细胞在体外成软骨能力和内质网应激水平的差异。为进一步研究内质网应激对骨髓间充质干细胞软骨缺损修复能力的影响,本研究进行了兔软骨缺损修复的体内实验。先将90只新西兰大白兔进行全身麻醉,手术切开双侧膝关节暴露股骨滑车,在其中部造成4mm软骨层缺损模型,然后将胶原水凝胶混合不同组骨髓间充质干细胞填补于缺损软骨处。根据不同的干细胞将兔子分成4组:P0组:软骨缺损部位植入的细胞为原代干细胞;P0+4-PBA组:该组兔子之前先连续20天服用剂量为0.25 g/kg的4-PBA,提取骨髓原代干细胞混合胶原水凝胶进行软骨缺损修补;P3组:软骨缺损部位植入的细胞为第三代干细胞;P3+TM组:软骨缺损部位植入的细胞为经衣霉素孵育48小时后的第三代干细胞。在手术后第4、12、26周取材,进行如下检测:（1）大体评分:对关节的软骨修复部位进行大体评分,大体检测软骨缺损修复情况;（2）生物力学检测:通过检测修复区新生软骨的力学性能反映修复效果;（3）番红-固绿染色及评分:检测修复部位的干细胞成软骨分化情况和软骨特异基质糖胺聚糖的分泌情况等评价修复效果;（4）使用免疫组织化学检测新生软骨组织Ⅱ型胶原的分泌情况。通过以上检测手段,反映体外扩增与否的、不同内质网应激水平的自体骨髓间充质干细胞对兔软骨缺损修复的效果差异。结果:转录组测序结果分析显示,扩增至第三代的干细胞P3相比原代干细胞P0,共4324个差异基因,其中1143个为上调基因,3181个为下调基因。将差异基因进行KEGG通路分析,发现差异基因富集于以下通路中:粘着斑通路、PI3K-Akt通路、细胞周期通路、肌动蛋白细胞骨架的调节通路、MAPK通路、内质网应激通路、toll样受体通路,缺氧诱导因子-1通路等。其中内质网应激相关基因,在P3组中大部分都比P0组降低。结合文献报道结果,我们将内质网应激的未折叠蛋白反应通路作为本课题研究的目的通路。随后,我们用qRT-PCR验证测序结果,发现ATF4、XBP1、和ATF6三个未折叠蛋白反应关键基因在P3组中表达均低于P0组,这与测序结果相一致。使用qRT-PCR、Western blot和免疫荧光染色检测各组未折叠蛋白反应相关基因和蛋白可知,PO组的未折叠蛋白反应相关基因和蛋白（ATF4,ATF6,XBP1）的表达水平高于P3组,P0+4-PBA组表达水平显着低于P0组,说明4-PBA能明显抑制兔原代骨髓间充质干细胞的内质网应激水平,P3+TM组内质网应激相关基因和蛋白在各时间点表达水平明显高于P3组（P<0.05）,说明TM能明显提升兔第三代骨髓间充质干细胞的内质网应激水平。通过qRT-PCR、Western blot、免疫荧光染色、GAG/DNA和番红O染色检测成软骨相关结果可知,各组干细胞成软骨诱导成功。P0组在各时间点成软骨水平高于P3组,P0+4-PBA成软骨能力低于P0组,P3+TM成软骨能力强于P3组。说明抑制原代骨髓间充质干细胞的内质网应激水平会损害其软骨分化能力,而提高第三代骨髓间充质干细胞的内质网应激水平能促进其软骨分化能力。构建兔体内软骨缺损模型,通过大体评分、修复软骨生物力学检测、番红-固绿染色及组织学评分和Ⅱ型胶原免疫组织化学染色可知,在4周、12周、26周,P0组评分均高于P3组,提示原代间充质干细胞的软骨修复能力强于第三代间充质干细胞,同时在各个时间点,P0+4-PBA组的软骨修复效果差于P0组,而P3+TM组的修复效果则好于P3组,说明初始的干细胞内质网应激水平对软骨再生有较强的影响,抑制原代骨髓间充质干细胞的内质网应激水平影响软骨修复,而提高第三代干细胞的内质网应激水平促进软骨修复。结论:骨髓间充质干细胞体外培养扩增通过影响内质网应激水平导致成软骨能力下降,增强第三代骨髓间充质干细胞的内质网应激能促进成软骨分化和软骨缺损的修复,抑制原代骨髓间充质干细胞的内质网应激会减弱成软骨分化和软骨缺损的修复效果。
韦佼君[6]（2018）在《聚合物短纤维作为可注射药物载体和细胞球培养支架的研究》文中指出药物筛选和组织修复是生物医学领域中的重要研究课题。在药物筛选方面,体外检测药物的药效和毒性是药物进入临床研究前的一个重要环节。细胞二维（2D）培养是目前常用的体外药物筛选模型,但通过该模型得到的检测结果与动物实验结果,甚至是临床实际效果相差甚远。在组织修复领域,通常采用器官移植的方式来实现组织或器官修复,而大部分替代的组织器官主要来源于器官捐献、自身组织或动物组织等。然而采用器官移植的方法修复组织,常常受限于器官供体的数量有限,移植后与宿主发生免疫排斥反应以及使用自身组织修复容易造成机体的二次伤害等。因此构建具有与组织器官相似功能结构的类组织,则能够为药物筛选提供理想的体外模型以及替代器官移植实现组织修复。因此本论文旨在一方面以短纤维作为支架培养肝细胞球体、肿瘤细胞球体以及间充质干细胞球体,用于药物筛选、类肿瘤组织模拟、软骨修复和治疗关节炎,另一方面以可注射短纤维作为药物控释载体通过瘤内注射的方式治疗肿瘤,并且实现药物的局部缓释。建立一种可靠的,肝细胞球状体大小可控的以及可适用于高通量筛选的体外肝模型用于药物筛选仍存在巨大的挑战挑战性。本论文设计将短纤维作为支架,用于制备尺寸可控的,且具有肝特异性功能和表型的肝细胞球体。短纤维的长度、半乳糖和RGD的接枝密度能够调控细胞球体的大小及功能,长度为50 μm、PSMA混纺比例为95%、半乳糖和RGD接枝密度分别为135.7±4.5 nmol/mg和14.8±0.5 pmol/mg的短纤维培养得到的肝细胞球体具有最佳的肝特异性功能表达。短纤维分布在整个细胞球体中,与肝细胞紧密地相互作用从而形成较为致密的细胞球体。与不含支架的肝细胞球体相比,在对五种药物（甲苯磺丁脲、S-华法林、咪达唑仑、睾酮和对乙酰氨基酚）代谢清除率的考察过程中,含短纤维的细胞球体作为药物模型具有更高的代谢清除率,能够更好地预测体内药物清除率,其体内体外相关值（R2）为0.886。此外,这些肝细胞球体的药物代谢能力还表现在对药物代谢酶的诱导剂和抑制剂具有高度敏感,并且在20天的培养过程中一直保持对药物的响应性,为确定药物-药物的相互作用提供了一种有效的体外模型。因此,通过与短纤维共培养得到的肝细胞球体是一种能够在体外长时间维持肝细胞功能的简便操作方法,可推广至传统的多孔板和微芯片设备中培养,后用于高通量药物筛选。肝脏能够调节葡萄糖代谢和脂代谢。利用半乳糖修饰的PSMA/PS短纤维（gSF）作为支架分别与小鼠原代肝细胞（rPH）和肝癌细胞系（HepG2）共培养获得肝细胞球体模拟肝组织用于糖脂代谢的研究。与HepG2细胞球体相比,rPH细胞球体在葡萄糖消耗、糖原合成、糖异生、对胰岛素和胰高血糖素等葡萄糖调节激素的敏感性方面,表现出较强的葡萄糖代谢能力。HepG2细胞球体则显示出比rPH细胞球体更强的胆固醇和甘油三酯合成水平。通过对磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）和腺苷5’-单磷酸激活的蛋白激酶（AMPK）的活性表征,验证了上述实验结果。采用该模型研究药物的敏感性,含半乳糖修饰的短纤维肝细胞球体对升血糖药物（地塞米松）、降血糖药物（二甲双胍）、胰岛素增敏剂（吡格列酮）以及降脂药物（二甲双胍和洛伐他汀）均表现出较好的响应性。因此rPH和HepG2细胞球体可分别用作体外葡萄糖和脂质代谢研究模型,并且可用于筛选代谢紊乱疾病（如糖尿病和肥胖症等）的治疗药物。在全身性给药后,只有一小部分药物进入肿瘤,有许多障碍因素阻止药物向肿瘤内渗透。为克服这些障碍,通过在瘤内注射含抗癌药物的载药短纤维,使药物在靶点部位积累,从而达到治疗效果。制备了 5（FF-5）、20（FF-20）和50 μm（FF-50）的载HCPT短纤维,分散到2%海藻酸钠溶液中,注射性好。FF-5、FF-20和FF-50的药物释放曲线趋势相似,但纤维长度越长药物释放速度越慢。体外细胞毒性实验表明,FF-5和FF-20比FF-50会引起更高的细胞毒性和细胞凋亡率。短纤维瘤内注射小鼠H22皮下肿瘤后,长度越长的短纤维在瘤内的滞留效果更好。然而,载HCPT的纤维膜虽然在瘤内的滞留效果最好,但其抗肿瘤活性较低。与FF-5和FF-50相比,FF-20在瘤内释放HCPT在肿瘤内具有最佳的空间分布效果,这对动物存活、肿瘤生长抑制和肿瘤细胞凋亡诱导等具有显着的影响。上述结果表明肿瘤内注射载药短纤维是一种有效的治疗实体肿瘤的策略,通过调控载药短纤维在肿瘤内的滞留效果以及释放药物在肿瘤组织内的空间分布,来降低药物的全身毒性并提升治疗效果。为构建类肿瘤模型,以聚乳酸-聚乙二醇共聚物/聚环氧乙烷（PELA/PEO）混纺短纤维作为支架,携载促乳腺癌细胞系（MCF-7）增殖的17β-雌二醇（E2）药物,与细胞共培养构建MCF-7球体。PEO的含量和E2载药量会影响药物的释放速度、细胞的活力、增殖及粘附。结果表明PEO添加比例为3%、E2载药量0.01%的短纤维与MCF-7共培养6天后,即可得到直径为250 μm的成熟类恶性肿瘤细胞球体。该细胞球体在结构和因子表达上与恶性肿瘤类似,即中心细胞生长密集、内部缺氧,与恶性肿瘤的相似性较高;通过表征E-钙粘蛋白表达、恶性因子分泌、上皮-间充质转化相关基因表达等,证明该细胞球体具有恶性侵袭转移的倾向;癌症干细胞（CSC）表型基因表达和体内肿瘤构建表明该细胞球体具有较强的致瘤性。所有结果表明MCF-7球体与恶性实体瘤类似,因此可以作为体外类肿瘤模型用于新药的研发和肿瘤疾病的研究。采用组织工程的方法修复软骨缺损,将载有软骨诱导药物kartogenin（KGN）的PELA短纤维作为支架与骨髓间充质干细胞（BMSC）共培养得到有软骨分化潜能的细胞球体,为避免细胞流失,以可注射水凝胶包裹BMSC球体填充软骨缺损部位。结果表明KGN的载药浓度、水凝胶的机械性能和注射过程会影响BMSC球体的活力和分化能力,其中通过调节凝胶的浓度、反应比例以及在凝胶中添加短纤维可有效调控凝胶的机械强度。最终凝胶浓度为3%,巯基/丙烯双键（HS/Acr）反应比例为1/1.2,短纤维掺杂浓度为1%,以及KGN短纤维载药量为0.1%的复合支架在体外诱导BMSC分化成软骨细胞的效果最理想;体内缺损软骨修复结果表明,该复合凝胶携载BMSC球体治疗6周后缺损部位被大量的成熟新生软骨填充,12周后缺损部位得到了完全的修复。随后将该组织工程软骨与抗关节炎药物塞来昔布（CLX）结合并治疗骨关节炎,将CLX载入增强凝胶力学强度的短纤维上,调节药物浓度对BMSC无毒副作用;结果表明二者的协同作用能够较大程度地抑制关节炎的发展,12周后关节炎症状缓解并且病变引起的软骨缺损得到了修复。综上所述,本论文以短纤维作为可注射的药物控释载体用于瘤内注射治疗皮下肿瘤;作为体外三维培养细胞球体的支架,分别构建了肝脏、肿瘤以及软骨相关的细胞球体,可有效用于药物代谢模型、降糖降脂药物的筛选、类肿瘤的构建、软骨组织的修复和关节炎治疗;研究结果为体外药物筛选模型、器官修复和疾病治疗等提供了新思路和手段。
陈费[7]（2015）在《小鼠肝干细胞的识别鉴定及其分化谱系的研究》文中提出组织干细胞对于哺乳动物机体稳态的维持具有重要意义,然而肝脏作为体内最重要的消化器官之一,成体肝脏干细胞怎样参与肝脏细胞的更替与修复却是领域内未解决的基本问题,甚至“肝干细胞是否存在”也一直备受争议。研究成体肝干细胞的主要困难有：首先成熟肝细胞本身具有极强的复制能力,在肝脏遭受机械性损伤或者切除时,肝细胞可自我复制,完成肝脏修复；并且这种修复并不只是局限于一次损伤,有研究证明经历了连续十二次肝切手术的大鼠,其肝脏仍可恢复至原来程度。其次,肝脏和肌肉组织、神经组织类似属于高度慢性更替组织,在正常生理状态下小鼠肝细胞寿命可维持300天左右,因此研究肝干细胞对肝脏的贡献有着较长的时间跨度；而且随着这300天的进程,小鼠已步入衰老状态,肝干细胞是否也会随着机体而衰老导致不参与细胞更替,都是未知的。第三,现有的标志物并不能严格的区分胆管上皮细胞和肝干细胞,而只是笼统的包括在内,给追踪肝干细胞命运造成很大难度和一定程度的偏向性；甚至有人认为Lgr5、CD133等肝干细胞标志物会不同程度的丢失,导致目的细胞“失联”。第四,不同实验室研究肝干细胞时所采用的模型均不一致,有急性损伤比如三分之二肝切手术、四氯化碳注射、胆管结扎,也有慢性药物损伤包括DDC （3,5- diethoxycarbonyl-1,4-dihydrocollidine,1,4-二氢-3,5-吡啶二甲酸二乙酯）饲料、CDE饮食（choline-deficient diet supplemented with ethionine,胆碱缺乏、甲硫氨酸补充饲料）、肝纤维化等等；这些模型之间的差异直接导致了所观察的目的细胞在响应不同损伤时的差别,无疑增加了研究肝干细胞的复杂程度。第五,在人类的许多肝脏疾病中,均可观察到被称为“胆管反应”的现象,也就是肝脏实质有许多“胆管细胞样”细胞的出现,这些细胞究竟是什么、起何作用仍是未知的。总结这些因素来看,缺少特异的肝干细胞标志物、不同损伤模型之间的差异、肝实质损伤程度、肝干细胞和人类肝病的关系是肝干细胞研究领域的核心。本课题围绕“肝干细胞是什么”这一领域内基本问题开展研究,试图揭开这一神秘面具并未将来肝干细胞的临床应用提供线索和奠定基础。针对目前肝干细胞研究领域的不足,本研究采用了对肝脏中各类细胞的单细胞深度测序方法,来解决这一问题。首先,利用Cre/LoxP示踪小鼠体系来示踪细胞的命运。基于之前的报道,肝干细胞的共性是表达角蛋白19（Krtl9）,因此我们使用了八周龄的Krt 19CreERT/Rosa26R-GFP示踪小鼠进行腹腔注射4毫克他莫昔芬（tamoxifen）,来观察表达或者曾经表达Krt19细胞的命运。诱导两天后检测小鼠绿色荧光蛋白（GFP）表达情况或者开始进行损伤；对他莫昔芬诱导后两天的小鼠进行急性损伤（腹腔注射1微升／克体重的四氯化碳）和慢性肝损（含有1%DDC （w/w）的饲料饲喂3周）处理。第二是Krt19谱系细胞的分选、单细胞建库、深度测序和转录组分析。使用流式细胞分选（FACS）方法,将示踪小鼠肝脏的GFP阳性细胞分选后,挑选单个细胞,构建每个细胞单独的cDNA文库（cDNA libraries）;利用已知标志物对每个单细胞进行聚合酶链式反应（PCR, Polymerase Chain Reaction）鉴定,初步判断细胞的身份；对候选细胞进行深度测序;测序数据经映射至小鼠转录组（mm9）后进行无监督的层级聚类分析（unsupervised hierarchical clustering analysis）、加权基因共表达网络分析（WGCNA）和差异表达基因分析（differential expression analysis）。第三,针对单细胞转录组分析结果,将候选细胞分类,绘制肝干细胞分化图谱,筛选得到候选肝干细胞表面标志物及其活化相关因子。最后,对筛到的候选相关标志物和活化因子进行实验验证。该研究得到的主要结果包括：1)通过观察Krtl 9CreERT/Rosa26R-GFP示踪小鼠肝脏中GFP阳性细胞的命运,我们发现Krt19谱系细胞可以标记肝脏内的胆管细胞、肝细胞和潜在的干细胞。2)我们将小鼠中Krt19谱系细胞通过流式细胞分选仪分选下来,进行单细胞挑选,共计得到了1094个单细胞；我们构建了每个单细胞的cDNA文库,利用已报道的相关标志物进行经鉴定后,选取了39个候选细胞（包括潜在的干细胞、肝向分化细胞和胆管细胞）并进行单细胞深度测序和转录组分析。3)根据39个细胞的转录组特征可以将得到的细胞分为六群,分别是：静息、活化的两类肝干细胞,肝前体细胞,不成熟肝细胞,成熟肝细胞,胆管细胞。4)根据各群细胞的转录组特点,重构了肝干细胞分化图谱、描绘了各群细胞的分子标签、筛选得到了肝干细胞的特异表面标志物CD63、CD56以及激活静息肝干细胞的关键通路：VEGF和MAPK.5)通过原位染色、体外培养、细胞移植和体内示踪实验,我们证明了CD63是全新的肝干细胞表面标志物。6)CD56可以区分肝脏中静息和活化的肝干细胞：CD63+CD56+是活化的肝干细胞,CD63+CD56是静息的肝干细胞。7)生长因子VEGF和bFGF,作为VEGF和MAPK两条通路的关键调控因子,可以激活静息的肝干细胞。总的来说,通过小鼠肝脏的单细胞转录组分析,我们描绘了小鼠肝干细胞的分化谱系,得到了小鼠肝脏中每类细胞中特异表达的标志基因,证明了CD63是肝干细胞表面标志物以及CD56是活化的肝干细胞标志物；另外bFGF和VEGF可以激活静息（CD63+CD56"）的肝干细胞。该研究为成体组织干细胞的研究提供了新的思路和方法,补充了成体组织干细胞中关于肝脏干细胞的内容,开拓了肝干细胞新的研究方向,同时为人的肝干细胞研究奠定了基础。
徐兵,吴林岚,杨晓梅,黄素钦,吴开木[8]（2015）在《猪胰岛移植于大鼠肝包膜下人工囊腔治疗糖尿病的研究》文中研究说明目的建立一种新的免疫隔离法用于将猪胰岛移植于大鼠肝包膜下人工囊腔,并观察其治疗糖尿病大鼠的效果。方法用链脲霉素诱导建立大鼠糖尿病模型。用V型胶原酶消化猪胰腺,梯度离心法分离纯化猪胰岛。检测纯化猪胰岛的胰岛素刺激指数。取18只糖尿病大鼠和6只正常大鼠,手术暴露大鼠肝脏,从肝叶一侧边缘切开并分离肝包膜,将人工囊腔（纤维素酯透析袋,袋内置一中空纤维球,袋两端用线扎紧）两端从肝包膜切口分别塞入两边肝包膜下,囊腔两端连线从肝叶对侧边缘肝包膜开孔穿出并相互连接,绑于肝叶;使囊腔平铺在肝实质表面,中段含纤维球部分位于皮下肝包膜切口间。将含胰岛（4000 IEQ）的胶原溶液（pH 7.4）注入糖尿病大鼠肝包膜下人工囊腔,作为实验组（n=12）;将不含胰岛的胶原溶液注入糖尿病大鼠（糖尿病对照组,n=6）或正常大鼠肝包膜下人工囊腔（正常对照组,n=6）。缝合切口（囊腔中胶原溶液变成胶原凝胶）。首次移植后8周,实验组各大鼠再经皮向肝包膜下人工囊腔注射胰岛（2000 IEQ）悬液1次。各组大鼠每周断尾取血检测空腹血糖值。结果纯化猪胰岛的胰岛素刺激指数为2.2±0.2。首次移植后18周,实验组大鼠各时间点空腹血糖值明显低于糖尿病对照组大鼠（P<0.01）。首次移植后13周,肉眼观察大鼠肝包膜下人工囊腔周围,未见明显纤维组织增生。结论纤维素酯透析袋植入肝包膜下13周对周围组织没有明显刺激。猪胰岛在大鼠肝包膜下人工囊腔中可受到免疫隔离,并正常生长,发挥降血糖功能。可经皮注射将猪胰岛移植于大鼠肝包膜下人工囊腔。
徐兵,吴林岚,魏建威,黄素钦,陈怡,赵芝萍,蒋晓织,郑登滋,杨梅玉[9]（2014）在《两种含胶原凝胶的人工肝生物反应器的功能比较》文中研究表明目的改进中空纤维型人工肝生物反应器。方法将大鼠肝细胞与胶原溶液混合并注入中空纤维反应器管外腔,待混合物在管外腔中形成胶原凝胶将肝细胞悬浮其中,构成胶原凝胶混悬肝细胞反应器（Ⅰ组）;另将大鼠肝细胞混悬液注入涂有胶原层的中空纤维反应器管外腔,构成胶原涂层加肝细胞反应器（Ⅱ组）。两组反应器均由管内腔循环灌注培养液,置孵箱培养9 d,每24 h换液一次,每48 h取灌注液检测白蛋白（Alb）、尿素、乳酸脱氢酶（LDH）浓度,以检验反应器的肝细胞功能。采用统计软件SPSS 13.0进行统计学分析,计量数据以均数±标准差（x±s）表示,两组资料比较用配对t检验。结果Ⅰ组和Ⅱ组的Alb值均在灌注第3天达峰值,分别为（1.41±0.08）和（0.65±0.05）g/L,39 d各时间点Alb值Ⅰ组均明显高于Ⅱ组（P值均<0.01）。Ⅰ组和Ⅱ组的尿素值分别在灌注第5天和3天达峰值,分别为（1.73±0.14）和（1.56±0.18）mmol/L,59 d各时间点尿素值Ⅰ组均明显高于Ⅱ组（P值均<0.01）。Ⅰ组和Ⅱ组的LDH值在灌注第9天达峰值,分别为（32.03±9.13）和（70.17±25.28）U/L,19 d各时间点LDH值Ⅰ组均明显低于Ⅱ组（P值均<0.01）。提示胶原凝胶混悬肝细胞反应器（Ⅰ组）比胶原涂层加肝细胞反应器（Ⅱ组）有更好的肝细胞合成代谢功能,肝细胞酶漏出也更少。结论胶原凝胶混悬固定肝细胞更适用于构建中空纤维型人工肝生物反应器。
胡玮[10]（2012）在《胶原/丝素纳米纤维材料肝细胞培养与多功能生物人工肝研究》文中研究指明人工肝主要分为非生物型人工肝、生物型人工肝。生物反应器是生物人工肝支持系统的核心部分,其性能直接关系到人工肝支持的效率和效果,生物反应器设计必须满足两个基本功能,一是为肝细胞提供良好的生长、代谢环境；二是为肝衰竭患者血液或血浆与肝细胞作用,进行物资交换提供理想的场所。体外肝细胞理想的培养条件应尽可能模拟体内肝细胞生长微环境,天然细胞外基质的胶原蛋白纤维尺寸为50～500nm.因此纳米尺度、具有合适的孔尺寸、高孔隙率支架能最大程度地仿生体内细胞外基质的特点。静电纺丝技术制备的纳米级材料比表面积大、孔隙率高,纳米纤维支架与细胞外基质在形态结构上非常相似,作为组织工程支架材料不仅能够起到支撑细胞的作用,还能发挥模板功能,为细胞提供黏附、生长、分化和增殖的场所。本研究采用静电纺丝的方法,制备胶原/丝素电纺纳米纤维膜,观察其对肝细胞体外培养的作用,为其在人工肝生物反应器中的应用提供理论依据；同时设计完成制作多功能生物人工肝支持系统,使其既具备血浆置换、血液灌流、血液滤过、血液透析、连续性血液透析滤过、白蛋白透析等非生物人工肝功能,又能与生物反应器配合使用,具备生物型人工肝功能。研究内容如下：1,以HFIP为溶剂,以胶原蛋白、丝素蛋白为材料,通过静电纺丝方法制备人工肝支架,研究静电纺丝的参数设定,并对材料进行物理、生物性能鉴定,主要包括交联后材料表面、交联特性、力学特性等；同时进行大鼠皮下植入实验,考察材料生物学性能。2,分离提取新鲜大鼠原代肝细胞,以胶原/丝素电纺纳米纤维膜作为基底材料进行体外肝细胞培养,考察肝细胞在材料界面上生长增殖情况。3,用已经成熟的肝细胞系HepG2细胞进行胶原/丝素电纺纳米纤维支架材料体外肝细胞培养,考察已经成熟的肝细胞株在材料界面上的生长情况。4,通过超声振荡方法制备胶原/丝素纳米纤维微载体,将微载体与胶原凝胶细胞培养技术结合,观察纳米纤维载体/胶原凝胶复合体系对肝细胞体外培养的作用。5,按照三重循环方式设计多功能生物人工肝支持系统,划分出功能单元分模块进行设计。进行样机制作,制定产品标准,完成样机检测。研究结果显示：1,以HFIP为溶剂,在溶液浓度为10%,电压为16kV,喷速为2ml/h,接收距离为12cm的条件下,胶原蛋白与再生丝素比例分别为10：0,7：3,5：5,3：7,0：10,电纺五种配比的胶原/丝素溶液,制备的复合纤维直径在550-1100nm之间,其中纯胶原和纯丝素的纤维平均直径分别为569±99nm和1058±240nm,纤维平均直径随着丝素含量的增加而增加。2,大鼠原代肝细胞培养结果显示,常规培养组在第二天细胞数量与细胞功能达到高峰,之后迅速下降,而胶原/丝素纳米纤维支架组在第二天达到高峰后,之后3-5天内维持平稳缓慢下降状态,其尿素合成、蛋白分泌与常规培养组有明显差别。3, HepG2细胞培养结果显示细胞在材料表面生长状态良好并与支架材料紧密结合。随培养时间延长,常规培养组细胞在第5天后逐渐死亡,失去细胞功能,胶原/丝素纳米纤维支架组细胞在4-9天内能够维持稳定状态,其尿素合成、蛋白分泌与常规培养组有明显差别,其中丝素含量为50%组的细胞状态和细胞功能高于其它组。4,纳米纤维载体/胶原凝胶复合培养观察结果显示,培养12d,纳米纤维载体/胶原凝胶复合培养组白蛋白分泌功能稳定,持续增高,于第9天达到峰值,之后缓慢下降；而胶原凝胶培养组培养液中白蛋白含量至第3天达到峰值,之后迅速下降,至第6天大部分细胞死亡,失去白蛋白分泌功能。镜下观察纳米纤维载体/胶原凝胶复合培养组细胞聚集于纳米纤维载体周围生长,形成聚集体,细胞维持稳定状态至12d；胶原凝胶培养组中细胞均匀分布,至培养第3天细胞数量到达峰值,之后细胞逐渐萎缩死亡。5,多功能生物人工肝设计图、产品标准见文章第三部分。综上所述,采用静电纺方法能够制备出纳米级别胶原/丝素复合纤维膜,而肝细胞在胶原/丝素电纺纳米纤维膜表面贴附牢固,生长状态良好并维持功能,部分细胞向膜材料表面孔径内迁移,较之常规培养细胞增殖效果明显,维持功能表达时间延长,丝素含量为50%组细胞活性最好,电纺胶原/丝素纳米纤维制备成微载体后,与胶原凝胶培养方式结合,能够进一步增强细胞培养功能,复合培养组细胞围绕微载体聚集生长,形成细胞聚集体,依附于微载体上肝细胞微囊包载体肝细胞形态,12d培养周期内细胞生长状态良好,12d后依然维持三维形态,细胞形态良好。胶原/丝素纳米纤维材料有望用于改善人工肝生物反应器中的细胞活性,维持细胞功能表达。多功能生物人工肝支持系统,既具备多种非生物人工肝功能,又能与生物反应器配合使用,具备生物型人工肝功能。
二、胶原凝胶包埋肝细胞体外培养和腹腔移植（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、胶原凝胶包埋肝细胞体外培养和腹腔移植（论文提纲范文）
（1）微流控制备海藻酸钠-肠道类器官微球治疗炎症性肠病的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 IBD的发生机制 |
| 1.1.1 遗传因素 |
| 1.1.2 环境因素 |
| 1.1.3 肠道微生物 |
| 1.1.4 免疫机制 |
| 1.2 IBD的治疗现状 |
| 1.2.1 IBD的传统药物治疗 |
| 1.2.2 粪便微生物群移植治疗IBD |
| 1.2.3 干细胞移植治疗IBD |
| 1.3 肠道类器官在IBD诊治中的发展 |
| 1.3.1 肠道干细胞:治疗IBD的干细胞领域新星 |
| 1.3.2 ISC移植待解决的问题 |
| 1.4 药物传递的微流控技术 |
| 1.4.1 药物递送系统的构建 |
| 1.4.2 药物封装与释放 |
| 1.4.3 器官芯片 |
| 1.5 本论文的主要研究工作 |
| 参考文献 |
| 第二章 肠道类器官体外培养体系的建立研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 主要实验材料 |
| 2.2.2 主要实验仪器 |
| 2.2.3 小鼠肠道隐窝的提取及分离 |
| 2.2.4 小鼠肠道隐窝培养 |
| 2.2.5 肠道标志物的测定 |
| 2.2.6 类器官的传代 |
| 2.2.7 统计分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 小鼠肠道隐窝的提取及分离 |
| 2.3.2 小肠类器官体外培养体系的建立 |
| 2.3.3 小肠类器官中肠道标志物的测定 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 微流控制备海藻酸钠-小肠类器官微球的研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 主要实验材料 |
| 3.2.2 主要实验仪器 |
| 3.2.3 毛细管微流控装置的构建 |
| 3.2.4 电喷溶液的配制 |
| 3.2.5 静电喷射装置的构建 |
| 3.2.6 电喷装置的使用与微球的制备及表征 |
| 3.2.7 海藻酸钠微球的细胞相容性实验 |
| 3.2.8 海藻酸钠微球的溶胀和裂解实验 |
| 3.2.9 统计分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 电压、液体流速及接受距离对微球直径的影响 |
| 3.3.2 海藻酸钠微球的表征 |
| 3.3.3 海藻酸钠微球的细胞相容性 |
| 3.3.4 海藻酸钠微球的溶胀和裂解 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四章 海藻酸钠-类器官微球治疗小鼠炎症性肠病 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 主要实验材料 |
| 4.2.2 主要实验仪器 |
| 4.2.3 DSS诱导小鼠结肠炎模型条件优化 |
| 4.2.4 动物模型的构建与病理指标评估 |
| 4.2.5 小鼠粪便的隐血检测 |
| 4.2.6 微球的制备及灌肠实验 |
| 4.2.7 收取小鼠肠道组织标本 |
| 4.2.8 肠道特异性标志物的测定 |
| 4.2.9 肠道组织中炎症因子的测定 |
| 4.2.10 肠道病理组织标本的HE染色 |
| 4.2.11 统计分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 DSS诱导小鼠结肠炎模型的建立条件 |
| 4.3.2 建立DSS诱导小鼠结肠炎模型 |
| 4.3.3 海藻酸钠-类器官微球对结肠炎小鼠疾病表型的影响 |
| 4.3.4 海藻酸钠-类器官微球对结肠炎小鼠肠道上皮细胞的影响 |
| 4.3.5 海藻酸钠-类器官微球对结肠炎小鼠肠道组织病理学的影响 |
| 4.3.6 海藻酸钠-类器官微球对结肠炎小鼠肠道炎症因子的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 全文总结 |
| 博士期间发表论文情况 |
| 博士期间获得奖项情况 |
| 致谢 |
（2）rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs促进大鼠股骨牵张成骨的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠单侧股骨牵张成骨动物模型的建立 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验设备 |
| 1.3 实验动物及伦理 |
| 1.4 单边可延长式微型外固定架的设计与研制 |
| 1.5 大鼠股骨牵张成骨模型的建立 |
| 1.6 观察与检测指标 |
| 1.7 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养、鉴定及慢病毒介导RHPDGF-BB体外转染 |
| 1 内容与方法 |
| 1.1 实验材料与试剂 |
| 1.2 实验设备 |
| 1.3 实验动物 |
| 1.4 实验方法 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 rh PDGF-BB基因转染BMSCS促进大鼠股骨牵张成骨区新生骨矿化的作用 |
| 1 内容与方法 |
| 1.1 实验试剂 |
| 1.2 实验设备 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 实验动物及分组 |
| 1.5 观察与检测指标 |
| 1.6 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（3）胶原凝胶复合骨髓间充质干细胞对小鼠急性肝衰竭的疗效与机制研究（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 试剂与仪器 |
| 1.2.1 实验试剂： |
| 1.2.2 实验仪器： |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 小鼠MSCs的分离、培养扩增及鉴定： |
| 1.3.2 扫描电镜观察： |
| 1.3.3 小鼠ALF模型构建与分组： |
| 1.3.4 肝功能检测： |
| 1.3.5 组织病理学检查： |
| 1.3.6 蛋白免疫印迹（Western blotting）检测： |
| 1.3.7 RT-qPCR检测： |
| 1.3.8 小动物活体成像： |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 MSCs的培养和鉴定 |
| 2.2 胶原凝胶促进MSCs肝脏定植 |
| 2.3 胶原凝胶复合MSCs移植能有效减轻小鼠ALF |
| 2.4 胶原凝胶复合MSCs通过抑制细胞凋亡和促进细胞增殖减轻肝损伤 |
| 2.5 移植胶原凝胶复合MSCs调控PI3K/AKT信号通路改善肝细胞功能 |
| 3 讨论 |
（4）胶原凝胶复合骨髓间充质干细胞治疗急性肝衰竭的作用与机制研究（论文提纲范文）
| 英文略缩词 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 骨髓间充质干细胞的修饰在治疗急性肝功能衰竭的研究进展及现状 |
| 参考文献 |
| 硕士学位期间论文发表情况 |
| 致谢 |
（5）内质网应激对间充质干细胞体外培养扩增过程中成软骨能力影响的研究（论文提纲范文）
| 个人简历 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 利用转录组测序技术筛选骨髓间充质干细胞体外培养扩增过程中影响成软骨分化的相关通路 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料和方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 内质网应激对骨髓间充质干细胞在体外培养扩增过程中成软骨分化能力影响的体外研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料和方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 内质网应激对骨髓间充质干细胞软骨缺损修复能力影响的体内研究 |
| 1. 引言 |
| 2. 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4. 讨论 |
| 5. 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
（6）聚合物短纤维作为可注射药物载体和细胞球培养支架的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 三维类组织的体外构建 |
| 1.1.1 体内组织和器官的结构特点 |
| 1.1.2 体外构建三维类组织的方法 |
| 1.1.3 体外构建三维类组织的应用 |
| 1.2 细胞球体 |
| 1.2.1 细胞球体的特点 |
| 1.2.2 细胞球体的构建方式 |
| 1.2.3 细胞球体用于药物筛选体外模型 |
| 1.2.4 细胞球体用于组织修复和细胞治疗 |
| 1.3 电纺丝纤维的生物医学应用 |
| 1.3.1 电纺纤维的特点 |
| 1.3.2 电纺纤维作为药物载体的研究现状 |
| 1.3.3 电纺纤维作为组织工程的支架 |
| 1.4 课题的立题意义和研究内容 |
| 1.4.1 研究目的和意义 |
| 1.4.2 研究内容 |
| 1.4.3 论文的创新点 |
| 第二章 短纤维培养原代肝细胞球体用于体外药物筛选 |
| 2.1 实验部分 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 短纤维的制备 |
| 2.1.3 短纤维表面修饰半乳糖和RGD |
| 2.1.4 短纤维的表征 |
| 2.1.5 短纤维与原代肝细胞的共培养 |
| 2.1.6 原代肝细胞球体的表征 |
| 2.1.7 原代肝细胞球体功能的测定 |
| 2.1.8 原代肝细胞球体药物代谢表征 |
| 2.1.9 药物代谢的诱导和抑制实验 |
| 2.1.10 数据统计分析 |
| 2.2 结果与讨论 |
| 2.2.1 短纤维的表征 |
| 2.2.2 短纤维长度对肝细胞球体功能的影响 |
| 2.2.3 短纤维长度对原代肝细胞球体形貌的影响 |
| 2.2.4 半乳糖和RGD接枝密度对肝细胞球体功能的影响 |
| 2.2.5 表征原代肝细胞球体 |
| 2.2.6 原代肝细胞球体用于药物代谢研究 |
| 2.2.7 诱导剂和抑制剂对原代肝细胞球体药物代谢的影响 |
| 2.3 本章小结 |
| 第三章 原代肝细胞和HepG2细胞球体作为体外葡萄糖和脂质代谢模型 |
| 3.1 实验部分 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 短纤维的制备和表征 |
| 3.1.3 原代肝细胞和人肝癌细胞球体培养 |
| 3.1.4 肝细胞球体的表征 |
| 3.1.5 肝细胞球体的功能和活力表征 |
| 3.1.6 肝细胞球体研究葡萄糖代谢 |
| 3.1.7 肝细胞球体研究脂质代谢 |
| 3.1.8 肝细胞球状体的酶活性分析 |
| 3.1.9 肝细胞球体的激素响应和药物敏感性表征 |
| 3.1.10 肝细胞球体葡萄糖代谢和脂质代谢相关基因的表达 |
| 3.1.11 数据统计分析 |
| 3.2 结果与讨论 |
| 3.2.1 肝细胞球体的表征 |
| 3.2.2 肝细胞球体肝特异性功能的表征 |
| 3.2.3 肝细胞球状体的葡萄糖代谢 |
| 3.2.4 肝细胞球体对葡萄糖代谢激素的响应 |
| 3.2.5 肝细胞球体的脂质代谢表征 |
| 3.2.6 肝细胞球体的PEPCK和AMPK酶活性 |
| 3.2.7 肝细胞球体对血糖调节药物和降脂药物的响应 |
| 3.3 本章小结 |
| 第四章 瘤内注射载药短纤维的抗肿瘤效果 |
| 4.1 实验部分 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 载药短纤维的制备 |
| 4.1.3 载药短纤维的表征 |
| 4.1.4 载药短纤维的体外药物释放 |
| 4.1.5 载药短纤维的细胞毒性和细胞凋亡 |
| 4.1.6 瘤内注射载药短纤维对肿瘤进行治疗 |
| 4.1.7 载药短纤维的体内抗肿瘤效果 |
| 4.1.8 药物和短纤维在组织及肿瘤内的分布 |
| 4.1.9 肿瘤组织学分析 |
| 4.1.10 数据统计分析 |
| 4.2 结果与讨论 |
| 4.2.1 载药短纤维的表征 |
| 4.2.2 载药短纤维的体外药物释放 |
| 4.2.3 载药短纤维的细胞毒性和细胞凋亡 |
| 4.2.4 短纤维释放的药物在组织中的分布 |
| 4.2.5 纤维释放药物和载药短纤维在肿瘤中的空间分布 |
| 4.2.6 载药短纤维抑制肿瘤生长 |
| 4.2.7 载药短纤维对动物存活率和体重的影响 |
| 4.2.8 载药短纤维对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响 |
| 4.3 本章小结 |
| 第五章 体外三维培养MCF-7细胞球体构建类肿瘤模型 |
| 5.1 实验部分 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 载药短纤维的制备 |
| 5.1.3 载药短纤维的表征 |
| 5.1.4 载药短纤维促肿瘤细胞增殖 |
| 5.1.5 肿瘤细胞球体的培养 |
| 5.1.6 肿瘤细胞球体的表征 |
| 5.1.7 肿瘤细胞球体的基因表达分析 |
| 5.1.8 肿瘤细胞球体的致瘤性 |
| 5.1.9 数据统计分析 |
| 5.2 结果与讨论 |
| 5.2.1 药物浓度对肿瘤细胞增殖的影响 |
| 5.2.2 载药短纤维的表征 |
| 5.2.3 载药短纤维对肿瘤细胞增殖的影响 |
| 5.2.4 肿瘤细胞球体的表征 |
| 5.2.5 肿瘤细胞球体的组织学评价 |
| 5.2.6 肿瘤细胞球体的增殖效果 |
| 5.2.7 肿瘤细胞球体恶性肿瘤因子基因的表达 |
| 5.2.8 表征肿瘤细胞球体的上皮间充质转化和癌症干细胞表型 |
| 5.2.9 肿瘤细胞球体在体内的成瘤表征 |
| 5.3 本章小结 |
| 第六章 可注射凝胶携载干细胞球体和短纤维用于软骨缺损和关节炎的治疗 |
| 6.1 实验部分 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 载药短纤维的制备 |
| 6.1.3 短纤维的表征 |
| 6.1.4 水凝胶的制备 |
| 6.1.5 可注射凝胶的表征 |
| 6.1.6 载药短纤维及凝胶包裹载药短纤维的药物释放 |
| 6.1.7 干细胞球的体外培养 |
| 6.1.8 干细胞球体的体外软骨分化 |
| 6.1.9 软骨缺损和关节炎的治疗 |
| 6.1.10 软骨缺损的修复效果和组织学评价 |
| 6.1.11 修复缺损软骨的生物化学和生物力学分析 |
| 6.1.12 检测关节炎中的炎症表达 |
| 6.1.13 数据统计分析 |
| 6.2 结果与讨论 |
| 6.2.1 水凝胶的表征 |
| 6.2.2 短纤维增强水凝胶力学强度的表征 |
| 6.2.3 水凝胶的形貌表征 |
| 6.2.4 短纤维和水凝胶性质对BMSC分化成软骨的影响 |
| 6.2.5 考察骨髓间充质干细胞体外软骨分化效果 |
| 6.2.6 缺损软骨修复效果的评估 |
| 6.2.7 修复软骨组织的生物化学和生物力学分析 |
| 6.2.8 塞来昔布体外药物释放及细胞毒性 |
| 6.2.9 关节炎中炎症的抑制效果 |
| 6.2.10 骨关节炎的治疗效果 |
| 6.3 本章小结 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士期间发表的论文 |
（7）小鼠肝干细胞的识别鉴定及其分化谱系的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 一、肝脏干细胞的研究背景和研究现状 |
| 二、肝脏的可塑性 |
| 三、其它组织干细胞研究给我们的启示 |
| 四、本课题的研究背景方法和目的 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 实验结果 |
| 一、肝脏中曾经表达角蛋白19细胞的谱系示踪 |
| 二、角蛋白19谱系示踪细胞的单细胞扩增及其鉴定 |
| 三、单细胞转录组分析确定角蛋白19谱系细胞的类型 |
| 四、肝脏干细胞分化谱系的重构 |
| 五、表面标志物CD63可以用来鉴定肝干细胞 |
| 六、CD63~+CD56~+细胞是活化状态的肝干细胞 |
| 七、CD63~+CD56~-静息干细胞可被bFGF和VEGF激活 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间文章发表情况 |
| 致谢 |
（9）两种含胶原凝胶的人工肝生物反应器的功能比较（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 大鼠肝细胞的制备[5, 11] |
| 1.3 鼠尾胶原的制备和灭菌[5, 12] |
| 1.4 胶原凝胶混悬肝细胞反应器 (Ⅰ组) 的构建及灌注 |
| 1.5 胶原涂层加肝细胞反应器 (Ⅱ组) 的构建及灌注[13] |
| 1.6 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 灌注液肝功能指标检测 |
| 2.2 相差显微镜下观察反应器中肝细胞形态 |
| 3 讨论 |
（10）胶原/丝素纳米纤维材料肝细胞培养与多功能生物人工肝研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 符号/缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、胶原/丝素纳米纤维的制备与性能 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 纤维直径检测结果 |
| 1.2.2 材料孔径检测结果 |
| 1.2.3 交联度观测 |
| 1.2.4 力学性能检测结果 |
| 1.2.5 皮下埋植结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、胶原丝素纳米纤维体外肝细胞培养研究 |
| 2.1 胶原丝素电纺膜大鼠原肝细胞培养 |
| 2.1.1 材料和方法 |
| 2.1.2 结果 |
| 2.1.3 讨论 |
| 2.2 胶原丝素电纺膜体外肝细胞培养 |
| 2.2.1 材料与方法 |
| 2.2.2 实验结果 |
| 2.2.3 讨论 |
| 2.3 胶原丝素纳米纤维微载体体外肝细胞培养 |
| 2.3.1 材料和方法 |
| 2.3.2 实验结果 |
| 2.3.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 三、多功能生物人工肝支持系统设计研究 |
| 3.1 生物人工肝治疗模式讨论 |
| 3.1.1 循环模式 |
| 3.1.2 硬件配置 |
| 3.2 生物人工肝应用范围讨论 |
| 3.2.1 血浆置换 |
| 3.2.2 血浆或血液吸附 |
| 3.2.3 血液透析、滤过加吸附 |
| 3.2.4 MARS |
| 3.2.5 单纯BAL |
| 3.3 生物人工肝硬件设计 |
| 3.3.1 血液净化装置部分 |
| 3.3.2 人工肝装置部分 |
| 3.4 多功能生物人工肝支持系统标准研究 |
| 3.5 总结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 附录 |
| 综述 人工肝支持装置综述 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
四、胶原凝胶包埋肝细胞体外培养和腹腔移植（论文参考文献）
- [1]微流控制备海藻酸钠-肠道类器官微球治疗炎症性肠病的研究[D]. 甄爽. 南京大学, 2020(09)
- [2]rhPDGF-BB基因修饰的BMSCs促进大鼠股骨牵张成骨的研究[D]. 买买艾力·玉山. 新疆医科大学, 2020(07)
- [3]胶原凝胶复合骨髓间充质干细胞对小鼠急性肝衰竭的疗效与机制研究[J]. 陈笑艳,王经琳,施晓雷. 肝胆胰外科杂志, 2019(10)
- [4]胶原凝胶复合骨髓间充质干细胞治疗急性肝衰竭的作用与机制研究[D]. 陈笑艳. 南京医科大学, 2019(04)
- [5]内质网应激对间充质干细胞体外培养扩增过程中成软骨能力影响的研究[D]. 沈翀. 广西医科大学, 2019(08)
- [6]聚合物短纤维作为可注射药物载体和细胞球培养支架的研究[D]. 韦佼君. 西南交通大学, 2018
- [7]小鼠肝干细胞的识别鉴定及其分化谱系的研究[D]. 陈费. 第二军医大学, 2015(06)
- [8]猪胰岛移植于大鼠肝包膜下人工囊腔治疗糖尿病的研究[J]. 徐兵,吴林岚,杨晓梅,黄素钦,吴开木. 中华器官移植杂志, 2015(02)
- [9]两种含胶原凝胶的人工肝生物反应器的功能比较[J]. 徐兵,吴林岚,魏建威,黄素钦,陈怡,赵芝萍,蒋晓织,郑登滋,杨梅玉. 临床肝胆病杂志, 2014(10)
- [10]胶原/丝素纳米纤维材料肝细胞培养与多功能生物人工肝研究[D]. 胡玮. 天津医科大学, 2012(12)