一、端粒酶与端粒的研究进展（论文文献综述）
翟留涛[1]（2021）在《假丝酵母端粒酶逆转录酶的结构与功能研究》文中研究指明端粒酶是一种特殊的逆转录酶,它的核心催化区由蛋白质催化亚基—端粒酶逆转录酶（Telomerase reverse transcriptase:TERT）和RNA亚基—端粒酶RNA（Telomerase RNA:TER）两部分组成。与其他逆转录酶相比,端粒酶最大的特点就是能够以自身携带的一段RNA序列为模板,反复合成端粒DNA,从而解决真核生物线性染色体的末端复制问题,维护基因组的完整性。然而,端粒DNA的合成是一个复杂而精致的过程,中间涉及到端粒DNA的延伸、复制的精确终止、DNA-RNA杂交链的解离及DNA与RNA解离后发生移位,使DNA重新和模板区配对,开始新一轮的合成等多个步骤。目前对这些过程的分子机制并不清楚,而高分辨率的三维结构是阐明分子机制的关键。此外,端粒酶的结构与功能具有物种特异性,研究不同物种端粒酶的结构与功能,才能全面而深刻的理解端粒酶的作用机制。但目前对端粒酶的结构知之甚少,尤其是对酵母端粒酶的空间结构更是一无所知。本文以假丝酵母（Candida tropicalis与Candida albicans）端粒酶为研究对象,通过大肠杆菌表达系统获得了高纯度的假丝酵母端粒酶逆转录酶（Candida tropicalis TERT,Ct TERT与Candida albicans TERT,Ca TERT）。然后与RNA组装成有活性的复合体,在体外利用引物延伸实验对其延伸活性进行了研究,结果发现:（1）假丝酵母端粒酶逆转录酶在体外只能延伸一轮,不具有反复合成能力;（2）假丝酵母端粒酶发挥活性不需要TER中的Pseudoknot（PK）及Three-way-junction（TWJ）等结构元件,只要有模板区（Template）的存在就能进行端粒DNA的合成;（3）假丝酵母端粒酶逆转录酶在体外具有典型的逆转录酶功能,能够以任意RNA为模板催化相应DNA的合成。接着,我们利用X射线晶体衍射技术及小角散射技术（Small angle X-ray scattering,SAXS）对假丝酵母端粒酶逆转录酶的结构进行了研究,最终成功解析出包括TERT单蛋白晶体结构(Ct TERT178-879:2.47?,Ct TERT158-745:2.84?)及TERT与TWJ的复合体(Ct TERT158-879-TWJ:2.85?,Ca TERT177-867-TWJ:2.98?,Ca TERT95-867-TWJ:3.46?)在内的多套高分辨率的晶体结构。Ct TERT晶体结构显示,Ct TERT的C端结构域（C-terminal extension,CTE）占据了之前在其他物种TERT结构中观察到的环形腔,呈“闭合”状态。通过晶体结构分析及SAXS实验发现,这种闭合状态并不是晶体堆积造成的,而是TERT的一种固有属性,并且这种“闭合”属性不受RNA的影响。与Ct TERT呈“闭合”状态的空间构象刚好相反,Ca TERT的TRBD-RT-CTE形成环形,呈“开放”状态,并且Ca TERT-TWJ复合体是二聚体。我们通过结构分析及生化实验验证,揭示了Ca TERT-TWJ形成二聚体的结构基础。此外,分析Ct TERT及Ca TERT与TWJ的复合体晶体结构,揭示了酵母中TERT识别TWJ的分子机制。重要的是,我们直接证明了TWJ的P6.1与TERT的CTE之间的相互作用。此后,又通过SAXS及活性测定实验证明了TERT的CTE是可以灵活转动的,并且这种构象变化是TERT的内在属性。有趣的是,分子动力学模拟结果显示,CTE构象的变化能够使RNA与DNA的杂交双链发生解离,随后我们通过功能实验对其进行了验证。在分析Candida TERT晶体结构时,发现在TRBD的N端存在一个U形loop结构,我们把它命名为U-motif,通过结构分析及序列比对发现此结构在端粒酶中非常保守,进一步深入的研究发现U-motif能够调控端粒DNA的合成。最后,我们根据对CTE及U-motif的结构分析及功能实验,提出了端粒酶合成端粒DNA的分子模型。
刘德豪[2]（2021）在《外周血白细胞端粒长度与端粒酶活性对非小细胞肺癌患者预后的影响》文中研究表明目的:探讨非小细胞肺癌（Non-small cell lung cancer,NSCLC）患者外周血白细胞端粒长度以及端粒酶活性对患者预后的影响。方法:本研究病例选取2016年4月至2017年6月期间在保定市第一中心医院心胸外科确诊为NSCLC患者,经纳入标准及排除标准筛选后,选取符合入组标准的患者55例。依据端粒酶活性和端粒DNA长度的特定值进行分组:长链高活性组7例、长链低活性组14例、短链低活性组14例、短链高活性组20例。全部患者均进行一般资料收集、外周血采集以便检测NSCLC患者白细胞端粒长度和端粒酶活性代表物。在患者入院期间以及出院后均对患者生存时间及预后效果进行随访,以明确患者外周血白细胞端粒长度、端粒酶活性与患者治疗后生存时间的相关性。结果:经研究,各组患者之间年龄、性别、肿瘤病理分型、是否吸烟未见明显相关性（P>0.05）,总体对比患者临床TNM分期有统计学意义（P=0.025）。各组患者自身端粒酶活性与端粒长度无相关性（r=-0.112,P=0.228）。不同分组NSCLC患者生存时间:端粒DNA长链端粒酶低活性组患者生存时间为（30.93±1.06）月;端粒DNA长链端粒酶高活性组患者生存时间为（29.48±2.64）月;端粒DNA短链端粒酶高活性组患者生存时间为（14.70±1.65）月;端粒DNA短链端粒酶低活性组患者生存时间为（19.98±1.68）月。整体对比不同组别患者预后生存时间（OS）具有统计学意义（P<0.001）。通过Kaplan-Meier曲线组间两两对比患者预后生存时间发现:整体对比有统计学意义,不同组别之间两两对比:端粒DNA长链高活性组与端粒DNA长链低活性组对比、端粒DNA短链高活性组与短链低活性组对比、端粒DNA长链低活性组与端粒DNA短链低活性组对比均无统计学意义（P>0.05）,端粒DNA长链高活性组与端粒DNA短链高活性组对比、端粒DNA长链低活性组与端粒DNA短链高活性组对比,结果具有统计学意义（P<0.05）。经Cox风险比例回归分析得出:患者年龄、临床TNM分期、端粒长度以及端粒酶活性是影响NSCLC患者预后生存的独立风险因素。结论:评价非小细胞癌患者预后生存的独立风险因子包括患者年龄、肿瘤TNM分期、外周血白细胞端粒长度以及端粒酶活性。其中外周血白细胞端粒长度对于患者治疗效果以及生存时间的影响较其他因素更为明显。
韩森,马旭,方健[3]（2021）在《端粒与端粒酶研究在肺癌中的临床应用前景与挑战》文中研究指明肺癌是世界范围内发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一。端粒和端粒酶与肺癌的发生发展密切相关。虽然端粒酶可能不是导致细胞癌变的直接原因,但在维持端粒长度和肿瘤生长方面起到关键作用。包括肺癌在内的大部分肿瘤端粒长度缩短。端粒长度的变化与肺癌发生风险相关,并可能成为肺癌的治疗靶标和预测指标。针对端粒和端粒酶信号通路的靶向治疗药物正在探索中,以端粒酶抑制剂为代表的小分子药物有希望应用于肺癌的临床治疗中。但是,人们对于端粒和端粒酶的研究还远远不够,端粒长度维持的旁路作用机制可能是下一步需要深入研究的方向。
孟凡渝[4]（2020）在《基于新型无酶生物传感体系的端粒酶及miRNA检测成像技术的研究》文中提出端粒是位于线状染色体两端的DNA-蛋白质帽子结构,能够保证遗传信息以及染色体正常的生理功能。端粒酶作为一类具有逆转录作用的酶,能够决定端粒的长短和活性大小。端粒与端粒酶在细胞衰亡、肿瘤发生以及干细胞能力维持等生命活动中都至关重要,而表达和调控机制的紊乱很可能导致癌症相关疾病的发生。在大部分恶性肿瘤细胞中端粒酶都会过表达,阻止端粒长度缩短和缺失,使癌细胞永生化。由此端粒酶可作为重要的肿瘤标志物,为癌症早期诊断提供依据和相应的治疗靶点,它的检测分析具有广泛的应用价值。本论文依据端粒酶扩增的基本原理,设计相应的核酸纳米结构和分子识别探针,构建基于功能化纳米材料介导的信号放大体系,以电化学和荧光技术作为关键检测手段,开发超灵敏生物传感器,开展针对端粒酶活性相关的定量检测和细胞内成像研究,具体内容如下:1.我们首先利用纳米材料作为信号分子,设计了无PCR参与的基于电化学传感技术的端粒酶活性分析方法。在这项研究里,使用未修饰的金纳米材料（AuNPs）和电化学伏安法定量分析从HeLa细胞中提取的端粒酶的活性。在金电极上,端粒酶可以利用硫醇修饰的端粒酶底物（TS）引物和脱氧核糖核苷酸（dNTPs）的混合物,特异性地促进含有重复核苷酸序列（TTAGGG）n的单链DNA（ssDNA）的延长。在TS引物与阻断剂DNA杂交后,纳米金粒子被ssDNA延伸部分暴露的含氮碱基捕获,并且通过差分脉冲伏安法（DPV）来具体量化端粒酶活性。在分析电化学信号后,获得20到2000个细胞的线性检测范围。这种简单的分析机制的检测极限是20个细胞。此方法无需PCR参与,快速且简单,非常适合在体外灵敏的评估细胞提取物中的端粒酶活性。2.我们接着开发了一种更稳定精确的双信号比率型电化学传感器,设计核酸的发夹结构用于端粒酶活性的超灵敏分析。发夹结构的DNA探针在其5’末端用亚甲基蓝（MB）分子标记后首先被结合在金电极界面上。然后与二茂铁标记（Fc）的端粒酶底物引物（Fc）进行杂交。随着端粒酶的催化反应,重复产生（TTAGGG）n的序列,能够与发夹DNA其余部分结合,进而触发探针的构象转导,打开发夹结构。因此,MB信号从电极表面释放,检测到的氧化峰值电流（IMB）降低。同时,Fc信号不受构象变化影响,保持相对稳定,峰值电流（IFc）可以用作内部对照,提高信号输出的稳定性和准确性。这种智能结构设计可以实现可靠的目标识别,获得的结果表现出出色的分析性能,非常适合低浓度目标物的检测。实验结果发现IMB/IFc与端粒酶浓度对数线性相关,检测限度极低。这种基于核酸结构变化和比率型信号输出的方法,可以成为一种强有力的分析端粒酶活性的实用工具,也可以作为开发其他核酸分析的多功能工具。3.端粒酶催化端粒延伸反应并添加DNA重复序列,诱发癌症或其他疾病,除了体外检测,其细胞内成像分析也具有重大应用价值。因此,开发可靠和方便的端粒酶原位监测方法对于恶性肿瘤的临床诊断至关重要。然而,大多数用于细胞内端粒酶活性测定的电流探针都面临不可避免的假阳性干扰。在这项研究中,我们设计了一种核酸四面体结构,并利用荧光共振能量转移（FRET）效应,来高灵敏度的监测和分析细胞内基于端粒酶表达的自由扩增程序。其中,由DNA四面体作为结构基底和发光DNA作为有效识别序列,构建DNA纳米探针,以实现端粒酶的体外传感检测和细胞内成像,并且避免假阳性干扰的问题。端粒酶可以使其底物引物延伸产生重复序列,发生链置换反应并改变核酸探针的构型,两端标记荧光团的发光DNA被释放游离出来,信号分子之间的距离增加导致荧光的恢复。此方法基于显着的FRET效应建立了简单比率传感器,检测限度可以达到单细胞水平。这种检测系统可以在端粒酶抑制剂的筛选分析中得到应用,在抗癌药物发现中发挥作用。4.端粒酶和miRNA在肿瘤细胞中含量较高,已被公认为常见的肿瘤检测标志物。我们又设计了基于miRNA触发的DNA酶步行器,与纳米金（AuNPs）探针结构相结合,用于端粒酶活性的逻辑门传感分析。通过链置换反应,目标miRNA打开两个发卡结构,循环扩增形成双足DNA酶步行器。在AND逻辑门实验中（实验A）,端粒酶的存在使引物（Tp）被延长,与锁定链结合。双足DNA酶和Mn2+与底物链结合,发生催化剪切作用,被AuNPs抑制的羧基荧光素信号（FAM）释放到溶液中,荧光恢复。在两种目标物或任何一种目标物不存在时,检测体系的荧光皆无法恢复。在OR逻辑门实验中（实验B）,miRNA触发的双足DNA酶可以单独打开AuNPs探针上的发卡结构,在Mn2+作用下,将荧光分子释放出来。端粒酶产生的延伸产物,可以与AuNPs探针上含有FAM的锁定链结合形成双链,释放到溶液中产生荧光。单一目标物存在下,荧光信号皆可恢复,两种目标物存在下,荧光强度增加。除此之外,含有信号分子的AuNPs探针复合物、载有DNA酶和TP引物的二氧化锰（MnO2）纳米片,可被细胞自主摄取,传递到细胞中,用于细胞内成像分析。该方法使用生物逻辑门和DNA酶步行器,极大地提高了荧光探针检测的适用性和灵敏度,已成功应用于端粒酶和miRNA的体外检测和细胞内成像研究,对于临床诊断来说具有重要意义。5.在更进一步的研究中,我们策略性地制造了多功能纳米结构TDNs-Flare探针,来同时灵敏地检测端粒酶和miR-21这两种肿瘤标志物,以及进行相应的细胞内生物成像研究。TDNs-Flare探针主要是由金纳米颗粒（AuNPs）修饰的四面体DNA纳米结构（TDNs）作为基质,包含Flarel（Cy5）和Flare2（CDg）两种不同的反应性应答信号。在存在靶标的情况下,不完全互补的DNA链Flare会竞争性地从四面体框架中被置换下来,从而导致荧光信号的恢复。CDg荧光对应的miR-21线性检测范围从1 fmol到100 pmol,而Cy5荧光可以完成低至10个HeLa细胞的端粒酶浓度分析,动态分析范围从10到5000个HeLa细胞。此外,抗癌药物（Dox）在插入DNA双链后,会随目标物的识别和结合,而释放到细胞中发挥作用。这项研究表明TDNs-Flare探针是定量测定癌症生物标志物的很好的选择,并且已成功在研究中用于响应性生物成像。该纳米结构不仅克服了在细胞水平上同时检测多种生物标志物的障碍,而且在DNA装载抗癌药物的细胞内传递方面有着广阔的应用前景。
陈彪[5]（2020）在《纳米银抗肿瘤活性及对肺组织的毒理学研究》文中认为纳米银由于其独特的理化性能和抗菌活性,在生物医学领域有诸多应用。最近的研究表明,纳米银具有很强的抗肿瘤活性,在一些动物模型中也表现出抗癌活性,但其诱导癌细胞杀伤的分子机制仍待进一步探讨。同时,纳米银在医疗领域的广泛应用,导致其暴露人体的风险增加,其生物安全性也备受关注。本研究以肿瘤细胞为研究对象,探究纳米银的抗肿瘤活性及生物学机制;以人肺正常细胞及小鼠为研究对象,探究低剂量纳米银长期暴露造成肺组织损伤及分子机制。具体研究结果如下:1.纳米银导致肿瘤细胞增殖抑制和细胞死亡:以HeLa细胞为研究对象,纳米银暴露后,检测细胞端粒酶活性、端粒长度、细胞增殖及相关蛋白表达。结果表明,纳米银不仅能在细胞外抑制端粒酶活性,还能诱导癌细胞端粒酶活性下调,小粒径纳米银（25 nm）对端粒酶活性的抑制作用显着高于大粒径纳米银（75 nm）,纳米银抑制端粒酶催化亚基（hTERT）蛋白表达导致端粒酶活性降低;进一步探究发现,纳米银对癌细胞端粒酶活性的持续抑制和对端粒结合蛋白的下调作用导致端粒缩短与功能障碍,干扰癌细胞染色体的稳定,使细胞在分裂后期形成后期桥。通过构建端粒酶过表达细胞、端粒酶敲低细胞、酶活突变细胞及TRF2突变细胞深入研究发现,过表达hTERT可减弱纳米银的抗肿瘤活性,而下调端粒酶活性或干扰端粒可增强纳米银对HeLa细胞的细胞毒性。这些结果表明,纳米银导致的端粒功能紊乱、端粒酶活性抑制参与了纳米银介导的HeLa细胞活性抑制密切相关,为理解纳米银的抗癌机制提供了新的见解。2.纳米银对肺细胞衰老与组织纤维化的的影响:通过检测纳米银暴露后细胞衰老水平变化及相关蛋白表达情况,研究纳米银对正常肺细胞及组织的损害。本研究发现,亚毒性剂量纳米银长期暴露导致肺正常细胞中衰老相关的β半乳糖苷酶活性上调,细胞核中染色质出现异常凝集,衰老相关的分泌因子基因表达上调,这些衰老生物标记物升高表明纳米银暴露可显着诱导肺细胞发生衰老。流式分析结果显示,纳米银暴露后细胞周期阻滞在G2/M期,凋亡细胞数目从3.3%上升到74.3%。进一步通过荧光分析表明纳米银诱导的细胞凋亡与衰老相关。机制研究表明,纳米银通过上调核转录因子NFKB、环氧合酶2（COX2）等蛋白表达,进而合成过多的前列腺素E2（PGE2）,导致肺细胞发生衰老;抑制COX2可将纳米银诱导的细胞衰老降低到正常水平。同时,动物实验也表明,纳米银诱导小鼠肺组织中COX2蛋白表达及声-半乳糖苷酶活性上调,α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达增多及胶原沉积。综上所述,纳米银通过激活NFκB信号通路,上调COX2/PGE2表达与合成诱导肺细胞衰老,并通过凋亡方式清除衰老细胞;纳米银暴露加速小鼠肺部细胞衰老,引起肺组织炎症与轻微肺纤维化。
郑建波[6]（2020）在《肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义》文中进行了进一步梳理研究背景:肾癌是泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一,全世界每年诊断出超过40万名新患者,其中约17万名患者死于肾癌。近些年来肾癌的发病率呈上升趋势,其发病机制仍未被明确。近来发现端粒及端粒酶的活性在肿瘤包括肾癌等疾病的发生发展中可能起到了重要作用。端粒是位于真核细胞染色体末端的DNA-蛋白质复合体,由重复排列的富含鸟嘌呤的六聚体DNA及特定的端粒结合蛋白组成。对维持基因组和染色体稳定起重要作用。端粒酶是一种核糖核蛋白聚合酶,是一种能够延长端粒重复序列的酶,通过在人类染色体末端添加5’-TTAGGG-3’重复序列来维持端粒末端的T-Loop结构。在出生后的体细胞中端粒酶的表达通常受到抑制,如果其失调可能与致癌性有关。虽然它在大多数正常人类细胞中被抑制,但在高达90%的人类恶性肿瘤中可检测到端粒酶活性。端粒酶主要有人端粒酶逆转录酶（hTERT）、人端粒酶RNA组分（hTR）及相关蛋白3个不同的亚基组成,hTERT是端粒酶全酶的催化亚基,是端粒酶活性的限速因子。已知人hTERT基因的表达和功能通过多种途径调节,包括转录因子,启动子甲基化/突变,染色质重塑,交替剪接,蛋白质修饰导等。在这些调节手段中,转录调节是最重要的。自从发现正常细胞上大多数癌基因启动子存在高甲基化后,甲基化的遗传修饰被引起广泛的兴趣。DNA甲基化,一般发生在CpG位点。hTERT启动子区域没有TATA和CAAT盒,但含有一个致密的富含CG的CpG岛,这表明DNA甲基化在hTERT表达调控中可能起潜在的作用。对重亚硫酸氢盐处理后的基因组组测序,Theodora等人研究了 37种细胞系中hTERT的启动子甲基化状态,包括正常细胞,干细胞和癌细胞。虽然他们研究没有发现特异性甲基化位点或区域与hTERT表达相关,却证实了在端粒酶阴性的SUSM-1细胞系中通过去甲基化处理诱导了 hTERT表达。目前一些研究表明hTERT启动子的CpG岛甲基化与体内较低的端粒酶活性有关,然而更多研究表明hTERT启动子区域的超甲基化与hTERT mRNA表达正相关,这与我们通常认为的基因上某个区域的甲基化升高导致该基因的表达降低相反,因此DNA甲基化在hTERT表达和端粒酶活性调节中的潜在作用仍然有待阐明。肾细胞癌（RCC）是肾脏恶性肿瘤中最常见的癌症病理类型,诊断时转移率为25-30%。据报道,hTERT基因表达可以通过各种反式作用元件和顺式作用元件调节,包括 c-Myc,Sp1,WT1,HIF-1α,P53,TGF-β,SMYD3,染色质重塑和启动子突变。然而很少有研究涉及RCC中hTERT启动子的DNA甲基化状态。为此,我们使用焦磷酸测序定量评估了 hTERT启动子区域中转录上游的筛选出的5个CpG位点的甲基化水平,进一步探讨hTERT启动子甲基化百分比和hTERT表达,端粒酶活性,临床分期和患者预后之间的相关性,并对hTERT启动子甲基化水平与其表达和端粒酶活性之间的关系进行了探讨,探索hTERT启动子甲基化在肾肿瘤发生发展中的潜在作用,筛选预测肾肿瘤预后的生物标志物。研究目的:通过收集103例肾细胞癌患者的年龄、性别、肿瘤类型、TNM分期、Fuhrman分级等临床病理特征并随访手术后预后情况,检测肾细胞癌及配对癌旁正常组织的hTERT启动子甲基化水平、hTERT mRNA相对表达丰度,端粒酶活性。分析hTERT启动子甲基化水平与hTERT mRNA相对表达丰度,端粒酶活性3者之间的相互关系及其与肾细胞癌患者年龄、性别、肿瘤类型、TNM分期、Fuhrman分级等特征之间的关系,对hTERT启动子甲基化水平在肾细胞癌中的潜在作用机制进行初步的研究。研究对象及方法:收集2009年至2014年期间,在山东大学齐鲁医院入院手术的103名患者中,通过根治性肾切除术（n=99）或肾单位保留手术（n=4）获得成对的肾肿瘤组织和与肿瘤相邻的正常组织（NAT）。所有标本均通过组织病理学检查确认诊断。将标本在-80℃冷冻直至随后的实验室分析。对这些患者进行随访研究,随访时间从2009年1月1日起,截止时间2016年11月30日。以手术时间作为观察起点,直至患者出现死亡,记录每个病例的年龄、性别、左右、病理类型、TNM分期、Fuhrman分级、生存时间等资料。按照DNeasy组织试剂盒（Qiagen Ltd,Venlo,Netherlands）说明书从冷冻组织标本中提取DNA。通过分光光度法测量DNA浓度并调节至50ng/ml。采用EpiTect Bisulfite试剂盒（Qiagen）,严格按照产品说明书进行基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰。通过采用特异性的引物对亚硫酸氢盐转化的基因组DNA进行PCR,PCR结果确认DNA的亚硫酸氢盐转化成功。使用PyroMark PCR试剂盒（Qiagen）进行 PCR。使用 PyroMark Assay Design Software 2.0 设计引物。对于所有样品,用0.5μl亚硫酸氢盐转化的基因组DNA进行PCR反应。使用生物素标记的引物（反向引物）通过使用链霉抗生物素蛋白包被的Sepharose珠（GE Healthcare,UK）纯化PCR产物。将PCR产物与Sepharose珠结合,纯化,洗涤,用0.2M NaOH溶液变性,并再次洗涤。然后将0.3μM测序引物与纯化的单链PCR产物退火,并根据产品说明在PyroMark Q96（Qiagen）中进行焦磷酸测序。为了总亚硫酸氢盐转化的内部对照,焦磷酸测序的区域中的非CG胞嘧啶也被包括。使用TRizol试剂（Invitrogen）从组织样品中提取总细胞RNA。使用总共1μg的RNA用M-MLV逆转录酶（Thermo,Lithuania）进行逆转录。使用SYBR Green PCR Master Mix（Applied Biosystems,Foster City,CA）在 7000 实时 PCR系统（Applied Biosystems）中进行QPCR。β2-作为内参照物。根据阈值循环值,使用2-△△Ct方法计算标本中hTERT mRNA的相对水平。使用TeloTAGGG端粒酶PCR ELISA试剂盒（Roche Diagnostics）测定端粒酶活性。提取1.0μg蛋白质进行测定,并且在端粒酶-引物延伸反应后进行30个PCR循环。使用ELISA显色反应检测PCR产物。端粒酶活性水平表示为吸光度[测定在450nm上的OD值（参考波长690nm）]。对正态分布的采用t检验。不符合正态分布的未配对组采用Mann-Whitney U检验,配对组采用Wilcoxon秩和检验,3组样本之间比较采用多样本比较的秩和检验,Kruskal-Wallis法来进行整体分析及两两比较。对于指标与预后之间的关系,采用Kaplan-Meier分析,对Log-rank检验有意义的单因素纳入多因素Cox回归分析,报告的所有P值均为双尾检验,并且采用值小于0.05。SPSS 16.0软件统计结果提示P=0.000,做图时按P<0.001显示处理。研究结果:我们提取12个肾癌组织和相对应癌旁正常组织（NAT）的DNA,采用重亚硫酸盐转化后,设计了 3对PCR引物对hTERT启动子的三个区域的14个CpG位点进行焦磷酸测序。在所有14个检查的CpG位点中发现,与NAT相比,我们发现肾癌组织中的hTERT启动子区CpG甲基化百分比更高,按P小于0.05,2组之间均有显着统计学意义。同时在三个区域PCR过程中,我们发现包含位点1至5区域的PCR扩增信号最稳定。以这个区域为研究对象,我们扩大检测样本,使用焦磷酸测序检测了 103名肾癌患者配对样本中位点1至位点5的甲基化百分比。我们发现与NAT相比,肾癌组织中所有5个CpG位点都显着高甲基化。在所有103个肾肿瘤组织和配对NAT中,患者的年龄与MMP1-5（means of methylation percentage of CpG sitel to site2）之间均不存在线性相关性。肾癌组织中MMP 1-5和hTERT全长mRNA表达（R2=0.450）之间观察到较高的正相关。一致地,在MMP 1-5和端粒酶活性之间也发现了正相关（R2=0.446）。我们的数据表明hTERT启动子在肾癌组织中是高甲基化的,并且甲基化水平与hTERT mRNA表达和端粒酶活性密切相关。我们研究hTERT启动子甲基化水平与临床病理特征之间的关联,发现所有患者的甲基化与年龄和性别无关。同时我们发现较高水平的hTERT启动子甲基化水平与疾病阶段显着相关,但是我们的数据发现Fuhrman等级之间与hTERT甲基化水平没有统计学显着差异。同时,透明细胞RCC（ccRCC）和非ccRCC之间的hTERT启动子甲基化水平没有显着差异。肾肿瘤组织与NAT相比,全长hTERT mRNA表达及端粒酶活性有明显的统计学差异,hTERT表达与端粒酶活性之间存在直线相关性。经单因素的分析,患者的TNM分期,细胞Fuhrman分级,hTERT启动子甲基化水平,hTERT mRNA表达水平,端粒酶活性对肾癌术后生存率有影响,经多因素Cox回归分析发现AJCC分期、hTERT启动子甲基化水平是影响肾癌病人预后的独立因素。研究结论:综上所述,我们通过对人肾癌中hTERT启动子甲基化水平、hTERT表达及端粒酶活性与临床特征和预后之间的相关性研究,我们发现hTERT启动子甲基化与hTERT表达/端粒酶活性之间存在正相关,hTERT表达与端粒酶活性之间存在正相关。hTERT启动子甲基化此外,我们发现了 hTERT启动子甲基化、hTERT mRNA表达及端粒酶活性与临床结果之间的密切关联,是肾癌预后不良的危险因素。hTERT启动子CaAvg（按48.3%分层）,AJCC分层是影响肾癌患者手术之后预后的独立因素,hTERT启动子甲基化水平影响hTERT mRNA表达及端粒酶活性,影响肾癌预后,揭示这种表观遗传改变可以作为RCC诊断和预后的有价值的生物标志物。
赵兵[7]（2020）在《基于人胃黏膜端粒调控网络与衰老学说探讨固本通络汤治疗慢性萎缩性胃炎的机制》文中研究说明研究目的:端粒缩短是反应细胞衰老的生物学标志物,研究显示,慢性萎缩性胃炎（CAG）患者胃黏膜端粒长度较同龄正常人缩短,提示CAG或与胃黏膜衰老有关,然相关分子机制尚未阐明。既往临床研究证实,导师根据“胃天年”理论运用固本通络汤治疗CAG在临床上具有较好的疗效,然固本通络汤疗效发挥的机制尚不明确。本研究通过对CAG患者胃黏膜端粒长度与端粒结合蛋白TRF1、TRF2、POT1 mRNA及蛋白表达水平、细胞衰老通路关键因子p53mRNA表达水平的研究,从端粒调控网络与衰老角度探讨CAG的发病机制以及固本通络汤治疗CAG的机制。研究方法:（1）CAG患者胃黏膜端粒长度、TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达与p53mRNA表达水平的病例-对照研究采用病例对照研究的实验设计,收取30例CAG患者及30例CNAG患者作为对照组,所有患者均于中国中医科学院广安门医院行胃镜检查及病理活检,明确诊断。通过填写调查问卷以确定两组患者疾病发生的危险因素,通过检测患者胃窦部黏膜端粒长度、TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达以及细胞衰老通路关键因子p53mRNA表达,探讨人胃黏膜端粒调控网络及衰老与CAG的相关性,以进一步明确CAG发病的分子机制。（2）固本通络汤治疗CAG的机制研究采用自身前后对照的实验设计,回顾性的收取经固本通络汤治疗3个月后胃窦部黏膜病理至少改善一个等级的患者30例,对其治疗前后的胃窦部病理标本进行再切片,通过检测胃窦部黏膜端粒长度、TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达以及细胞衰老通路关键因子p53mRNA表达,探讨固本通络汤对端粒调控网络及细胞衰老通路关键基因p53的影响,从而明确固本通络汤疗效发挥的机制。研究结果:（1）CAG患者胃黏膜端粒长度、TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达与p53mRNA表达水平的病例-对照研究两组患者基线比较:性别、年龄组成无明显差异,基线一致,具有可比性。两组患者相关危险因素比较:与CNAG组相比,CAG患者中有Hp感染史者更多、病程更长,差异有统计学意义（P<0.05）;BMI、吸烟史、饮酒史、熬夜、暴饮暴食、喜食辛辣刺激、生冷及高盐饮食、胃癌家族史及现症感染Hp等危险因素差异均无统计学意义。两组患者病理情况比较:CAG组患者中,伴萎缩22例（占73.3%）、伴肠化29例（占96.7%）、伴异型增生1例（占3.3%）,两组患者胃黏膜病理积分有明显差异（t’=9.682,P<0.001）。两组患者胃黏膜端粒长度比较:两组患者胃黏膜相对端粒长度均不符合正态分布,CAG组相对端粒长度中位数为0.67,CNAG组相对端粒长度中位数为1.06,CAG组较CNAG组相对端粒长度短,差异有统计学意义（U=297.000,P=0.024）两组患者胃黏膜TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达水平的比较:胃黏膜TRF1mRNA在CNAG组高表达,但差异无统计学意义（t=0.788,P=0.434）;TRF2mRNA在CAG组高表达,但差异无统计学意义（t=1.969,P=0.054）;POT1mRNA在CNAG组高表达,但差异无统计学意义（t’=-1.225,P=0.226）;TRF1、TRF2、POT1蛋白在CAG组均高表达,与CNAG组比较差异显着,有统计学意义（P<0.01）。两组患者胃黏膜p53mRNA表达水平的比较:p53mRNA在CAG组高表达,但差异无统计学意义（t=0.260,P=0.796）。胃黏膜端粒长度与年龄的相关性分析:CAG组及CNAG组胃黏膜端粒长度与年龄均无相关性（CAG 组:r=-0.303,P=0.131;CNAG 组:r=-0.195,P=0.302）胃黏膜端粒长度与 TRF1、TRF2、POT1、p53mRNA 及 TRF1、TRF2、POT1蛋白表达的相关性分析:CAG组p53mRNA表达水平与胃黏膜端粒长度存在轻度负相关（r=-0.396,P=0.031）,回归方程Y=-0.321X+1.099（F=3.438,P=0.074）,提示该回归方程无统计学意义,因而不能用p53mRNA表达水平预测CAG胃黏膜端粒长度,CNAG组胃黏膜端粒长度与TRF1、TRF2、POT1及p53mRNA水平均无相关性;CAG组TRF2、POT1蛋白表达量与胃黏膜端粒长度呈负相关,其中TRF2蛋白表达量与端粒长度的线性回归方程为Y=-0.041X+1.249（F=1.741,P=0.198）,提示该回归方程无统计学意义,不能用TRF2蛋白表达量预测CAG胃黏膜端粒长度,POT1蛋白表达量与端粒长度的线性回归方程为Y=-0.103X+1.272（R2=0.206,F=7.249,P=0.012）,CNAG 组胃黏膜端粒长度与 TRF1、TRF2、POT1蛋白表达量均无相关性。胃黏膜病理积分与胃黏膜相对端粒长度、TRF1、TRF2、POT1、p53mRNA表达水平及TRF1、TRF2、POT1蛋白表达水平的相关性:60例受试者胃黏膜病理积分与胃黏膜相对端粒长度呈负相关（r=-0.410,P=0.001）,线性回归方程为Y=-5.018X+11.54（R2=0.181,F=12.81,P<0.001）;胃黏膜病理积分与 TRF1mRNA表达水平无相关性（r=-0.054,P=0.682）,与TRF2mRNA表达水平呈正相关（r=0.339,P=0.008）,与 POT1mRNA 表达水平无相关性（r=0.052,P=0.695）,与p53mRNA表达水平亦无相关性（r=0.037,P=0.778）;胃黏膜病理积分与TRF1、TRF2、POT1蛋白表达量均呈正相关,与TRF1蛋白表达量回归方程为Y=1.974X+0.534（R2=0.437,F=45.04,P<0.001）,与 TRF2 蛋白表达量回归方程为Y=0.848X-1.457（R2=0.138,F=9.312,P=0.003）,与POT1蛋白表达量回归方程为 Y=1.743X+0.814（R2=0.294,F=24.15,P<0.001）。CAG发病的多因素Logistic回归分析:TRF1与POT1蛋白表达阳性为CAG的独立危险因素,TRF1蛋白表达阳性者发生CAG的风险是阴性者的16.54倍（95%CI:1.84-149.03）,POT1蛋白表达阳性者发生CAG的风险是阴性者的9.11倍（95%CI:1.64-50.54）。（2）固本通络汤治疗CAG的机制研究治疗前后病理资料比较:萎缩、肠化、慢性炎症治疗前后的构成比差异显着,具有统计学意义（P<0.01）;萎缩、肠化治疗前后积分及治疗前后总积分差异显着,具有统计学意义（P<0.001）;慢性炎症治疗前后积分无明显差异（P>0.05）;异型增生病例数仅为1例,因而治疗前后差异无统计学意义。治疗前后胃黏膜端粒长度的比较:治疗前胃黏膜相对端粒长度为0.30±0.16,治疗后为0.32±0.19,治疗前后差值为-0.02±0.20,差异无统计学意义（t=-0.549,P=0.587）,无法证明固本通络汤对治疗前后的胃黏膜端粒长度有影响。治疗前后胃黏膜TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达水平比较:治疗前后TRF1表达水平较治疗前下降,差异有统计学意义（P<0.05）,治疗前后TRF2及POT1mRNA表达水平无差异,因此无法证明固本通络汤对TRF2及POT1mRNA表达有影响;治疗前后胃黏膜TRF1、TRF2及POT1蛋白表达量差异均无统计学意义（P>0.05）,无法证明固本通络汤对TRF1、TRF2及POT1蛋白表达有影响。治疗前后胃黏膜p53mRNA表达水平比较:治疗后p53mRNA的表达水平较治疗前下降,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:我们通过对CAG患者胃黏膜端粒长度、TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达与p53mRNA表达水平的病例-对照研究发现:（1）CAG患者胃黏膜端粒长度较CNAG患者缩短,端粒的缩短与CAG的发生密切相关。（2）CAG患者胃黏膜TRF1、TRF2、POT1蛋白表达量显着高于CNAG患者;CAG患者胃黏膜TRF2、POT1蛋白表达量与胃黏膜端粒长度呈负相关,考虑CAG患者胃黏膜端粒缩短与TRF2、POT1蛋白的过表达有关。（3）CAG患者的p53mRNA表达水平与胃黏膜端粒长度存在轻度负相关,CAG患者中端粒长度缩短伴随着p53mRNA表达增高,初步考虑为p53通路的激活以介导细胞衰老,防止端粒过短被识别为DNA损伤,引起染色体不稳定而发生癌变,有待进一步研究证实。（4）本研究60例受试者胃黏膜病理积分与胃黏膜相对端粒长度呈负相关,与TRF2mRNA表达水平及TRF1、TRF2及POT1蛋白表达量均呈正相关,且有统计学意义,因此胃黏膜端粒长度、TRF2mRNA表达水平、TRF1、TRF2、POT1蛋白表达量均可以预测胃黏膜的病变程度。（5）TRF1和POT1蛋白表达阳性是CAG的独立危险因素,TRF1蛋白表达阳性者发生CAG的风险是阴性者的16.54倍,POT1蛋白表达阳性者发生CAG的风险是阴性者的9.11倍。临床上对胃黏膜TRF1及POT1蛋白的免疫组化检测可作为CAG诊断和预后的参考指标。通过对固本通络汤治疗后胃黏膜病理改善者的自身前后对照研究发现:（1）固本通络汤治疗前后胃黏膜相对端粒长度无明显差异,尚不能说明固本通络汤对胃黏膜端粒长度有影响。（2）固本通络汤可以下调TRF1mRNA的表达水平。（3）固本通络汤治疗前后TRF1、TRF2、POT1蛋白表达无明显差异,尚不能说明固本通络汤对TRF1、TRF2、POT1蛋白表达有影响。（4）固本通络汤可以下调p53mRNA表达水平,初步考虑固本通络汤可能是通过延缓端粒缩短的速度,为DNA损伤修复机制提供机会,阻断p53介导细胞衰老通路的激活,从而达到延缓胃衰老、逆转CAG的作用,然其机制尚有待于进行细胞体外和动物体内实验做进一步的验证。
张鑫泽[8]（2020）在《萝卜蚜端粒逆转录酶TERT基因克隆及功能探究》文中认为萝卜蚜Lipaphis erysimi（Kaltenbach）是危害十字花科蔬菜的农业昆虫之一,且繁殖速度快、全球各地均有分布。而端粒逆转录酶TERT是端粒酶中具有催化活性的亚单位,该基因不仅可以诱导端粒酶活性影响细胞衰老、凋亡,还具有除依赖端粒酶以外的其他生物学功能。本研究以萝卜蚜为研究对象,利用基因扩增、RNAi技术、转录组测序及q RT-PCR等方法克隆得到了萝卜蚜端粒酶TERT基因的CDS序列,在m RNA水平上检测了不同处理下TERT基因表达量的动态变化规律,并通过RNAi技术初步探究了TERT基因在萝卜蚜生长发育中的功能,为萝卜蚜的综合防治提供了新的理论依据,主要结论如下:1.根据本地转录组库筛选得到萝卜蚜TERT基因的相关序列,利用基因扩增手段克隆得到了TERT基因的CDS序列。该基因的CDS区全长序列长度为2658 bp,能够编码885个氨基酸残基,其二级结构含41个α-螺旋,60个卷曲螺旋并得到了5种预测的三级结构模型。将其上传至NCBI后比对发现,该基因与麦双尾蚜Diuraphis noxia同源性最高,与其他物种同源性较低。2.利用实时荧光定量PCR技术分析了TERT基因在萝卜蚜不同龄期及不同组织内的相对表达量变化情况。结果显示,萝卜蚜成虫期TERT基因的相对表达量最高,与各龄期均有显着性差异;1龄若虫的表达量显着低于成虫的表达量,但显着高于2龄、3龄、4龄若虫的表达量;4龄若虫表达量最低,但与2龄、3龄若虫的表达量无显着性差异。随后选取发育基本成熟且TERT基因表达量最低的4龄萝卜蚜若虫进行解剖,能够同时在4龄萝卜蚜的头部、胸部、腹部检测到TERT基因的表达,且腹部表达量最高。3.选取2段不同长度的TERT基因不同序列利用RNAi技术对萝卜蚜进行功能探究。研究发现,RNA干扰24 h后,处理组TERT基因的相对表达量分别下调了40.6%和41.3%,均与对照组有显着性差异,且两个不同干扰长度的处理组之间的下调水平并无差异。RNA干扰48 h后,处理组TERT基因相对表达量分别显着下调了73.9%和57.0%,干扰TERT基因片段2的处理组与对照组有显着性差异。RNA干扰72 h后,处理组TERT基因的相对表达量分别下调了69.0%和48.2%,均与对照组有显着性差异,且两个不同干扰长度的处理组之间的下调水平并无差异。生物测试实验结果表明,干扰萝卜蚜TERT基因能够显着提高死亡率,延长发育历期,降低体长、产仔率以及成虫寿命。4.将干扰TERT及EGFP基因72 h后的萝卜蚜,通过Illumina平台进行转录组测序。共得到平均数目为51,190,754及461,296,156条的Cleaning Reads,通过组装得到92371条Unigene序列,平均长度为766 bp。GO注释显示,分子功能类条目注释所占比例最高,其中与ATP结合有关基因注释最多,含4320条序列占8.8%。KEGG注释显示,人类疾病相关条目最多,其中与癌症通路有关的基因注释比例最高,含644条序列占4.9%。KOG注释显示,除了功能未知一类,占比例最大的为信号转导机制条目占全部基因注释的13%。随后选取校正后的P值（FDR）作为筛选差异基因的关键指标,通过筛选一共得到545个差异基因,其中165个基因表达上调,380个基因表达下调。GO分析表明,TERT基因经RNA干扰后抑制了与细胞、有机物、高级分子等相关通路的合成及代谢过程。KEGG分析表明,TERT基因经RNA干扰后诱导了核糖体合成、氧化磷酸化、肌动蛋白细胞骨架调节等相关通路基因的下调。
宋丽爽[9]（2020）在《小鼠、牛及羊克隆胚胎端粒重编程机制研究》文中指出体细胞核移植（Somatic cell nuclear transfer,SCNT）,又称体细胞克隆,作为动物细胞工程的重要技术手段之一,其开发和利用对于动物育种及再生医学都有重要的意义。端粒位于染色体的末端,由高度重复的TTAGGG序列组成,能够维持染色体的稳定性。端粒在细胞生长、发育分化以及细胞重编程方面起重要作用。然而,端粒在SCNT胚胎发育中的作用过程及其机制未见详细报道。为了探究SCNT动物中可能发生的端粒重编程事件,我们设计了三部分试验:首先,以卵胞质内单精子注射（Intracytoplasmic sperm injection,ICSI）胚胎为对照,检测小鼠SCNT胚胎中端粒长度的动态变化以及端粒长度对胚胎发育的影响,并且在牛和羊SCNT胚胎中进行验证;其次,筛选小分子化合物,希望寻找到促进SCNT胚胎端粒延伸的方法;最后,将经小分子处理过的SCNT胚胎进行胚胎移植,检测其对克隆小鼠出生效率的影响。主要结果如下:（1）SCNT胚胎与ICSI胚胎中端粒的延伸主要发生在合子基因组激活（Zygotic genome activation,ZGA）时期,但SCNT胚胎中端粒的长度显着低于ICSI胚胎。通过胚胎活检和端粒长度检测,我们发现SCNT胚胎中端粒的长度直接决定胚胎的发育质量。（2）分别向胚胎培养液中添加小分子化合物曲古抑菌素A（Trichostatin A,TSA）、氮胞苷（Azacitidine,Aza）、褪黑素（Melatonin）、维生素C（Vitamin C,Vc）、丁酸钠（Sodium butyrate,NaB）、MEK抑制剂（Mirdametinib,PD0325901）以及低氧（5%O2）的培养环境,我们发现曲古抑菌素A、褪黑素、丁酸钠、PD0325901以及低氧培养环境（5%O2）均能使SCNT胚胎的端粒相对长度显着延伸,其中褪黑素的作用最为显着。经端粒qPCR和Q-FISH检测发现,褪黑素能使SCNT胚胎的端粒长度延伸至对照组的2倍,并将SCNT囊胚的发育率由10.89%提升至58.12%。（3）进一步通过单细胞转录组测序（Single-cell RNA sequencing,scRNA-seq）发现,褪黑素处理的SCNT胚胎的转录组接近于ICSI胚胎,且褪黑素能够促进SCNT胚胎中ZGA事件的发生。对差异表达基因（Differentially expressed genes,DEGs）进行分析,我们发现褪黑素能够显着激活SCNT胚胎中端粒相关基因Zscan4和Tcstv3的表达。（4）为进一步验证褪黑素在SCNT胚胎中的作用,我们构建了Zscan4的体外转录载体,当SCNT胚胎中直接注射Zscan4的mRNA时,SCNT胚胎中的端粒长度得到显着延伸。但注射Zscan4的SCNT胚胎发育能力不如褪黑素处理组高,其原因是褪黑素除促进端粒延伸外,还能够降低SCNT胚胎中活性氧（Reactive oxygen species,ROS）的水平。（5）免疫荧光（Immunofluorescence,IF）及免疫印迹（Western blot,WB）结果显示,褪黑素处理后,SCNT胚胎中转录抑制性组蛋白H3K9me3修饰和DNA甲基化程度都有所下降,而抑制性组蛋白H3K27me3修饰没有显着性的变化。此外,我们还发现DNA去甲基化酶Tet3的表达在褪黑素处理组中显着上调。并且,我们在牛和羊的克隆胚胎中得到了一致的结果。（6）褪黑素能使尾尖成纤维（Tail-tip fibroblasts,TTFs）细胞产生的克隆小鼠出生率从0.3%提升至0.8%。此外,我们还发现向受体假孕母鼠注射褪黑素,可以进一步提高克隆小鼠的出生率（0.3%vs.1.5%）。与对照组相比,褪黑素使卵丘（Cumulus）细胞产生的克隆小鼠的出生率提高7倍（7.1%vs.1.0%）。综上,本研究成功揭示了SCNT植入前胚胎中端粒的重编程过程及作用机制,并发现褪黑素能够促进端粒延伸,修复重编程过程中异常的表观遗传修饰和ROS水平,最终提高克隆小鼠的出生率。
曹开秀[10]（2020）在《不同脏腑虚损COPD患者衰老程度差异性研究》文中研究指明目的:通过检测不同脏腑虚损COPD患者外周血单核细胞的端粒酶活性和端粒长度,观察不同脏腑虚损COPD患者衰老程度的差异性。方法:纳入稳定期慢阻肺患者71例,健康对照组44例,按照中医脏腑虚损分型标准进行分型,完成信息采集表、（CAT）COPD评估测试量表、（mMRC）呼吸困难量表,检测患者肺功能;采集各组患者外周静脉血分离PBMC,通过FLOW-FISH法测定各组的外周血端粒长度及采用（TRAP-PCR-ELISA）法测定各组的端粒酶活性。结果:1.COPD患者外周血端粒活性明显高于健康对照组,COPD患者外周血端粒酶阳性率明显高于健康对照组,健康对照组与COPD患者外周血端粒长度无差异性（P>0.05）;2.不同气流受限程度外周血端粒酶活性无差异性（P>0.05）;不同吸烟状况COPD患者外周血端粒酶活性、端粒长度无差异性（P>0.05）。3.不同脏腑虚损COPD患者在mMRC（呼吸困难指数）、FEV1、FVC、CAT三组组间有显着差异性（P<0.05）;不同脏腑虚损COPD患者三组组间外周血端粒酶活性、端粒长度比较无差异性（P>0.05）,其中端粒酶活性（OD值）在肺肾气虚组均值最高,在肺气虚组最低,提示随着脏腑虚损程度的加重,外周血端粒酶活性有逐渐增加的趋势。4.不同年龄分层中健康组与COPD组端粒酶活性在中年组有显着差异性（P<0.05）,在老年组不具有显着性差异（P>0.05）。5.经过校正年龄后进行偏相关性分析发现在COPD组患者中,端粒酶活性与近一年急性加重次数呈正相关性（r=0.24,p=0.04）;端粒长度与FEVI（r=0.59,p=0.04）、FVC（r=0.84,p=0.00）呈显着性正相关。结论:1.本研究初步发现COPD患者外周血端粒酶活性明显高于健康正常人,这种差异主要集中在中年组,并且与近一年急性加重次数呈正相关性;COPD患者外周血端粒酶阳性率明显高于健康对照组;还发现COPD患者外周血端粒长度缩短与肺功能（FEV1、FVC）下降程度呈显着正相关,提示外周血端粒酶活性、端粒长度的缩短可以作为预测COPD急性发作与疾病进展的风险指标,也反映出COPD的发病机制复杂、多样,不仅仅是炎症机制,还可能伴有衰老、免疫变化等相关途径的异常改变。2.本研究发现COPD患者随着脏腑虚损程度的渐进性加重,与衰老相关的端粒酶活性可能有逐渐增强的趋势,肺通气功能的一秒用力呼气肺容积与用力肺活量逐渐降低,客观阐释了COPD久病肺虚,肺病迁延至脾、肾亏虚而病情逐渐加重,加速了机体衰老的理论基础。
二、端粒酶与端粒的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、端粒酶与端粒的研究进展（论文提纲范文）
（1）假丝酵母端粒酶逆转录酶的结构与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 端粒 |
| 1.2 端粒酶概述 |
| 1.2.1 端粒酶的发现 |
| 1.2.2 端粒酶的结构组成 |
| 1.2.3 端粒酶的生物学特性 |
| 1.2.4 端粒酶与衰老及疾病 |
| 1.3 端粒酶结构研究进展 |
| 1.3.1 赤拟谷盗TERT晶体结构 |
| 1.3.2 四膜虫端粒酶电镜结构 |
| 1.3.3 人端粒酶电镜结构 |
| 1.4 本课题的研究目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 基因及引物 |
| 2.1.2 载体与菌株 |
| 2.1.3 实验试剂与耗材 |
| 2.1.4 实验仪器 |
| 2.1.5 常用溶液及培养基的配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 基因克隆与载体构建 |
| 2.2.2 蛋白表达纯化 |
| 2.2.3 RNA体外转录与纯化 |
| 2.2.4 端粒酶延伸活性测定 |
| 2.2.5 动态光散射实验(DLS) |
| 2.2.6 分子筛排阻层析实验(SEC) |
| 2.2.7 蛋白酶切消化实验 |
| 2.2.8 氨基酸和RNA序列的生物信息学分析 |
| 2.2.9 晶体的获得 |
| 2.2.10 晶体数据收集与解析 |
| 2.2.11 等温滴定实验(ITC) |
| 2.2.12 X射线小角散射实验(SAXS) |
| 2.2.13 分子建模(Molecular modelling) |
| 第三章 假丝酵母端粒酶逆转录酶体外活性研究 |
| 3.1 Candida TERT体外不具有反复合成能力 |
| 3.2 Candida TERT体外延伸活性不依赖PK和 TWJ |
| 3.3 Candida TERT体外具有典型的逆转录酶功能 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 Candida TERT晶体的获得与结构解析 |
| 4.1 CtTERT晶体的获得与衍射数据的收集及结构解析 |
| 4.1.1 CtTERT晶体初筛与优化 |
| 4.1.2 CtTERT晶体数据收集与结构解析 |
| 4.2 CaTERT晶体的获得与衍射数据的收集及结构解析 |
| 4.2.1 CaTERT晶体初筛与优化 |
| 4.2.2 CaTERT晶体数据收集及结构解析 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 Candida TERT结构与功能分析 |
| 5.1 Candida TERT晶体结构分析 |
| 5.1.1 CtTERT晶体结构分析 |
| 5.1.2 CaTERT晶体结构分析 |
| 5.2 CTE domain结构与功能分析 |
| 5.2.1 CTE空间构象的灵活变化是TERT的内在属性 |
| 5.2.2 CTE的转动可以使RNA-DNA杂交双链解离并调节端粒酶的合成能力 |
| 5.3 U-motif结构与功能分析 |
| 5.3.1 U-motif的结构特征 |
| 5.3.2 U-motif调控端粒DNA的合成 |
| 5.4 端粒酶合成端粒DNA的分子机制 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 讨论与展望 |
| 6.1 讨论 |
| 6.2 展望 |
| 6.2.1 酵母全长TERT的空间结构 |
| 6.2.2 端粒酶小分子抑制剂的筛选 |
| 6.2.3 端粒酶全酶的工作机制 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（2）外周血白细胞端粒长度与端粒酶活性对非小细胞肺癌患者预后的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 端粒长度、端粒酶与非小细胞肺癌患者预后相关性研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）基于新型无酶生物传感体系的端粒酶及miRNA检测成像技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 端粒和端粒酶概述 |
| 1.1.1 端粒和端粒酶的发现 |
| 1.1.2 端粒和端粒酶的组成结构 |
| 1.1.3 端粒和端粒酶的功能 |
| 1.1.4 端粒和端粒酶的研究应用 |
| 1.1.5 端粒酶的测定 |
| 1.2 基于生物传感器的检测方法 |
| 1.2.1 生物传感器的检测原理 |
| 1.2.2 电化学生物传感器检测 |
| 1.2.3 荧光生物传感器检测 |
| 1.2.4 其他生物传感器检测 |
| 1.3 核酸纳米结构在检测中的应用 |
| 1.3.1 核酸纳米结构的可控组装 |
| 1.3.2 核酸纳米结构在体外生物传感中的应用 |
| 1.3.3 核酸纳米结构在细胞内成像中的应用 |
| 1.4 本课题的研究意义 |
| 第2章 基于金纳米粒子的端粒酶直接电化学生物传感 |
| 2.1 背景介绍 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料和化学品 |
| 2.2.2 细胞培养和端粒酶提取 |
| 2.2.3 凝胶电泳 |
| 2.2.4 AuNPs的制备和表征 |
| 2.2.5 工作电极预处理和实验条件优化 |
| 2.2.6 端粒酶延伸和AuNPs捕获 |
| 2.2.7 电化学测量 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 端粒酶活性测定的原理 |
| 2.3.2 AuNPs图像和实验优化 |
| 2.3.3 使用凝胶电泳检测端粒酶活性 |
| 2.3.4 生物传感器构建的表征 |
| 2.3.5 端粒酶活性的量化 |
| 2.3.6 传感器的评估 |
| 2.4 结论 |
| 第3章 基于比率型电化学传感策略的端粒酶活性超灵敏检测 |
| 3.1 背景介绍 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验材料和试剂 |
| 3.2.2 二硫键的还原反应 |
| 3.2.3 细胞培养和端粒酶提取 |
| 3.2.4 端粒酶活性检测过程 |
| 3.2.5 电化学测量 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 端粒酶检测的原理 |
| 3.3.2 电极修饰过程的表征 |
| 3.3.3 比率传感器的表征 |
| 3.3.4 端粒酶活性的检测 |
| 3.3.5 端粒酶抑制剂的分析 |
| 3.3.6 不同细胞系端粒酶活性分析 |
| 3.4 结论 |
| 第4章 基于荧光共振能量转移和DNA纳米探针的比率型传感器用于端粒酶活性分析 |
| 4.1 背景介绍 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料和化学品 |
| 4.2.2 DNA四面体的制备 |
| 4.2.3 细胞培养及端粒酶的提取 |
| 4.2.4 凝胶电泳实验 |
| 4.2.5 DNA探针的毒性检测 |
| 4.2.6 端粒酶活性的体外定量 |
| 4.2.7 原位成像 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 传感原理 |
| 4.3.2 检测体系的适用性 |
| 4.3.3 检测体系的荧光定性分析 |
| 4.3.4 DNA纳米探针的毒性分析 |
| 4.3.5 荧光信号的浓度优化 |
| 4.3.6 端粒酶活性的体外分析 |
| 4.3.7 特异性调查 |
| 4.3.8 细胞内成像 |
| 4.4 结论 |
| 第5章 基于miRNA触发的DNA酶步行器用于端粒酶活性的逻辑门传感检测 |
| 5.1 背景介绍 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验试剂和材料 |
| 5.2.2 AuNPs和MnO_2的合成 |
| 5.2.3 AuNPs探针和DNA酶的预处理 |
| 5.2.4 细胞培养和端粒酶提取 |
| 5.2.5 端粒酶和miRNA的体外检测和分析 |
| 5.2.6 检测体系的特异性和毒性测定 |
| 5.2.7 共聚焦荧光显微镜的细胞内成像 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 实验原理 |
| 5.3.2 检测体系的荧光表征 |
| 5.3.3 反应条件的优化 |
| 5.3.4 端粒酶和miRNA体外传感检测 |
| 5.3.5 检测体系的评估 |
| 5.3.6 细胞毒性实验 |
| 5.3.7 目标物的共聚焦成像 |
| 5.4 总结 |
| 第6章 基于核酸四面体和荧光探针介导的端粒酶与MiR-21的检测和细胞内成像 |
| 6.1 背景介绍 |
| 6.2 实验部分 |
| 6.2.1 化学试剂和仪器 |
| 6.2.2 TDNs-Flare探针的制造 |
| 6.2.3 细胞培养和端粒酶提取 |
| 6.2.4 端粒酶和miR-21的体外评估 |
| 6.2.5 TDNs-Flare探针的细胞特异性和毒性测定 |
| 6.2.6 共聚焦荧光显微镜的细胞内成像 |
| 6.3 结果与讨论 |
| 6.3.1 TDNs-Flare探针检测端粒酶和miR-21的原理 |
| 6.3.2 TDNs-Flare探针的结构和光学表征 |
| 6.3.3 端粒酶和miR-21的体外检测 |
| 6.3.4 检测方法的稳定性和细胞毒性 |
| 6.3.5 TDNs-Flare探针用于原位成像 |
| 6.4 结论 |
| 第7章 论文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与其他研究成果 |
（5）纳米银抗肿瘤活性及对肺组织的毒理学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 纳米银概述 |
| 1.2.1 纳米银合成方法 |
| 1.2.2 纳米银医学应用 |
| 1.3 纳米银抗肿瘤应用前景 |
| 1.3.1 纳米银抗肿瘤研究进展 |
| 1.3.2 纳米银抗肿瘤机制 |
| 1.3.3 靶向端粒/端粒酶抗肿瘤前景 |
| 1.4 纳米银暴露与健康风险 |
| 1.4.1 纳米银肺组织暴露途径 |
| 1.4.2 纳米银长期低剂量暴露的健康风险 |
| 1.4.3 细胞衰老对肺组织慢性疾病的影响 |
| 1.5 论文研究目的和主要内容 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞株 |
| 2.1.2 纳米银 |
| 2.2 主要试剂、抗体、耗材和仪器 |
| 2.2.1 试剂 |
| 2.2.2 抗体及质粒 |
| 2.2.3 耗材 |
| 2.2.4 仪器 |
| 2.3 常用工作液的制备 |
| 2.4 细胞培养 |
| 2.4.1 细胞传代 |
| 2.4.2 细胞冻存 |
| 2.5 纳米银溶液配制及细胞暴露 |
| 2.6 细胞活力实验 |
| 2.7 克隆形成实验 |
| 2.8 稳转细胞株构建 |
| 2.9 荧光法标记衰老细胞 |
| 2.10 一步法TUNEL细胞凋亡检测 |
| 2.11 RNA提取 |
| 2.12 ELISA法测定PGE2浓度 |
| 2.13 蛋白质样品提取与制备 |
| 2.14 组蛋白提取 |
| 2.15 蛋白免疫印迹 |
| 2.16 端粒酶活性检测 |
| 2.16.1 端粒酶提取 |
| 2.16.2 端粒酶活性检测 |
| 2.17 基因组DNA提取 |
| 2.18 端粒长度测定 |
| 2.19 核/质蛋白分离提取 |
| 2.20 PI单染法检测细胞周期 |
| 2.21 Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡 |
| 2.22 动物分组及处理 |
| 2.23 动物样本采集与处理 |
| 2.24 H&E染色 |
| 2.25 石蜡切片免疫组化 |
| 2.26 石蜡切片Masson染色 |
| 2.27 统计分析 |
| 第3章 纳米银调控端粒端粒酶发挥抗肿瘤活性 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 纳米银表征 |
| 3.2.2 纳米银对胞外/胞内端粒酶活性的影响 |
| 3.2.3 纳米银对肿瘤细胞端粒长度及染色体不稳定性的影响 |
| 3.2.4 端粒酶活性变化影响纳米银的肿瘤细胞杀伤能力 |
| 3.2.5 端粒酶活性变化对肿瘤细胞辐射敏感性的影响 |
| 3.2.6 纳米银长期暴露对肿瘤细胞抗性的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 低剂量纳米银长期暴露对肺细胞衰老的影响及机制研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 低剂量纳米银长期暴露对人胚肺成纤维细胞(MRC5)活力的影响 |
| 4.2.2 低剂量纳米银长期暴露诱导的细胞衰老水平变化 |
| 4.2.3 细胞周期阻滞在低剂量纳米银长期暴露诱导的细胞衰老中的作用 |
| 4.2.4 NFκB信号通路在低剂量纳米银长期暴露诱导细胞衰老中的作用 |
| 4.2.5 细胞凋亡在低剂量纳米银长期暴露诱导的衰老细胞清除中的作用 |
| 4.2.6 低剂量纳米银长期暴露对小鼠肺组织衰老的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 总结与展望 |
| 5.1 研究总结 |
| 5.1.1 总结 |
| 5.1.2 创新性 |
| 5.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 图清单 |
| 附录B 缩略词表 |
| 致谢 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（6）肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第一部分 人TERT启动子甲基化水平及其与肾细胞癌病理特征的关系研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人hTERT启动子甲基化水平等影响肾细胞癌预后的多因素分析 |
| 前言 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述 肾癌DNA甲基化研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| 附英文文章 |
（7）基于人胃黏膜端粒调控网络与衰老学说探讨固本通络汤治疗慢性萎缩性胃炎的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词索引 |
| 前言 |
| 附: 技术路线图 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1. 慢性萎缩性胃炎现代医学研究进展 |
| 1.1 GA、GIM、Dys |
| 1.2 病因学 |
| 1.3 临床表现 |
| 1.4 诊断 |
| 1.5 治疗 |
| 1.6 结语与展望 |
| 参考文献 |
| 2. 慢性萎缩性胃炎的中医药研究进展 |
| 2.1 病名溯源 |
| 2.2 病因病机 |
| 2.3 中医药治疗 |
| 2.4 实验研究 |
| 2.5 结语与展望 |
| 参考文献 |
| 3. 端粒调控网络与衰老及慢性萎缩性胃炎相关研究现状 |
| 3.1 端粒概述 |
| 3.2 端粒调控网络与衰老 |
| 3.3 端粒与慢性萎缩性胃炎相关研究 |
| 3.4 结语与展望 |
| 参考文献 |
| 4. 周斌教授从“胃天年”论治慢性萎缩性胃炎经验述要 |
| 4.1 “胃天年”理论的创立及学术思想溯源 |
| 4.2 周斌教授基于“胃天年”理论治疗慢性萎缩性胃炎经验述要 |
| 4.3 结语与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 CAG患者胃黏膜端粒长度、TRF1、TRF2、POT1mRNA及蛋白表达与p53mRNA表达水平的病例-对照研究 |
| 1. 临床资料与方法 |
| 2. 研究结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 固本通络汤治疗CAG的机制探讨 |
| 1. 临床资料与方法 |
| 2. 研究结果 |
| 3. 讨论 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1. 全文结论 |
| 2. 创新点 |
| 3. 局限性与展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附录 |
（8）萝卜蚜端粒逆转录酶TERT基因克隆及功能探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1.前言 |
| 1.1 萝卜蚜概述 |
| 1.1.1 萝卜蚜形态特征 |
| 1.1.2 萝卜蚜生活习性 |
| 1.1.3 萝卜蚜危害 |
| 1.1.4 萝卜蚜综合防治 |
| 1.2 端粒和端粒逆转录酶 |
| 1.2.1 端粒结构与概念 |
| 1.2.2 端粒功能 |
| 1.2.3 端粒酶结构与概念 |
| 1.2.4 端粒酶功能 |
| 1.2.5 端粒逆转录酶TERT基因功能研究 |
| 1.2.6 端粒及端粒酶在昆虫中的研究 |
| 1.3 RNA干扰(RNA inference)简介 |
| 1.3.1 RNAi发现历史 |
| 1.3.2 RNAi的作用机制 |
| 1.4 RNA干扰的常用方法 |
| 1.4.1 显微注射法 |
| 1.4.2 浸泡法 |
| 1.4.3 饲喂法 |
| 1.5 RNAi技术在昆虫学研究中的研究进展 |
| 1.5.1 昆虫中基因功能的研究 |
| 1.5.2 害虫防治 |
| 1.6 本研究的目的意义及创新点 |
| 1.6.1 本研究的目的意义 |
| 1.6.2 本研究创新点 |
| 1.7 研究内容与技术路线 |
| 1.7.1 研究内容 |
| 1.7.2 技术路线 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 供试仪器 |
| 2.1.3 供试试剂及缓冲液配制 |
| 2.1.4 供试引物序列 |
| 2.2 萝卜蚜TERT基因克隆及生物信息学分析 |
| 2.2.1 基因检测样品收集 |
| 2.2.2 萝卜蚜总RNA提取(Trizol法) |
| 2.2.3 cDNA合成 |
| 2.2.4 端粒逆转录酶TERT基因CDS序列克隆 |
| 2.2.5 端粒逆转录酶TERT基因生物信息学分析 |
| 2.3 萝卜蚜TERT基因时间及时空表达 |
| 2.3.1 基因检测样品收集 |
| 2.3.2 萝卜蚜总RNA提取(Trizol法) |
| 2.3.3 cDNA合成 |
| 2.3.4 实时荧光定量PCR分析TERT表达量 |
| 2.4 萝卜蚜端粒逆转录酶TERT基因RNAi研究 |
| 2.4.1 dsRNA表达载体的构建 |
| 2.4.2 dsRNA表达检测 |
| 2.4.3 dsRNA表达纯化 |
| 2.4.4 dsRNA降解情况检测 |
| 2.4.5 萝卜蚜dsRNA饲喂和生物测定 |
| 2.4.6 利用q RT-PCR检测RNA干扰效率 |
| 2.5 转端粒逆转录酶TERT基因拟南芥构建 |
| 2.5.1 转基因表达载体构建 |
| 2.5.2 转基因表达载体检测 |
| 2.5.3 转基因拟南芥的构建 |
| 2.5.4 阳性植株筛选及PCR检测 |
| 2.6 RNA干扰后萝卜蚜转录组分析 |
| 2.6.1 转录组样品收集 |
| 2.6.2 Illumina测序和序列组装 |
| 2.6.3 Unigene功能注释 |
| 2.6.4 基因表达差异分析 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 萝卜蚜端粒逆转录酶TERT基因生物信息学分析 |
| 3.1.1 萝卜蚜端粒酶TERT基因PCR扩增检测 |
| 3.1.2 萝卜蚜TERT基因编码氨基酸残基序列 |
| 3.1.3 萝卜蚜TERT二级结构预测 |
| 3.1.4 萝卜蚜TERT三级结构预测 |
| 3.1.5 萝卜蚜TERT基因同源性比对 |
| 3.1.6 萝卜蚜TERT基因系统发育树构建 |
| 3.2 萝卜蚜TERT基因时间及时空表达检测 |
| 3.2.1 端粒逆转录酶TERT基因在萝卜蚜不同龄期的表达分析 |
| 3.2.2 端粒逆转录酶TERT基因在萝卜蚜不同组织的表达分析 |
| 3.3 沉默TERT基因对萝卜蚜生长发育的影响 |
| 3.3.1 TERT基因的ds RNA表达载体的构建 |
| 3.3.2 Pet-2p-TERT的 ds RNA的表达检测及纯化 |
| 3.3.3 dsRNA降解情况检测 |
| 3.3.4 TERT基因沉默24-72 h后的m RNA表达水平 |
| 3.3.5 TERT基因沉默对萝卜蚜生长发育的影响 |
| 3.4 转TERT基因拟南芥的构建 |
| 3.4.1 转基因拟南芥载体检测 |
| 3.4.2 转基因拟南芥阳性植株筛选 |
| 3.5 RNA干扰后萝卜蚜转录组分析 |
| 3.5.1 RNA完整性检测 |
| 3.5.2 RNA文库检测和定量 |
| 3.5.3 萝卜蚜转录组序列分析和组装 |
| 3.5.4 基因功能注释 |
| 3.5.5 GO分类 |
| 3.5.6 KEGG注释 |
| 3.5.7 KOG注释 |
| 3.5.8 差异表达基因的筛选 |
| 3.5.9 差异表达基因GO和 KEGG富集分析 |
| 3.5.10 分析探究TERT基因调控差异基因表达 |
| 4.讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（9）小鼠、牛及羊克隆胚胎端粒重编程机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第1章 综述:体细胞核移植重编程与端粒研究进展 |
| 1 哺乳动物体细胞核移植重编程研究进展 |
| 1.1 体细胞重编程 |
| 1.2 体细胞核移植技术的发展历程 |
| 1.3 体细胞核移植中的重编程事件 |
| 1.3.1 DNA甲基化重编程 |
| 1.3.2 组蛋白修饰重编程 |
| 2 端粒的研究进展 |
| 2.1 端粒的结构 |
| 2.2 端粒缩短 |
| 2.3 端粒长度的调控机制 |
| 2.3.1 端粒酶依赖的延长 |
| 2.3.2 端粒酶非依赖延长机制(ALT机制) |
| 2.4 端粒在诱导多能干细胞中的重编程 |
| 2.5 端粒在体细胞核移植中的重编程 |
| 第2章 小鼠、牛及羊克隆胚胎端粒重编程机制研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 仪器和设备 |
| 2.2 耗材和试验动物 |
| 2.2.1 耗材 |
| 2.2.2 试验动物 |
| 2.3 相关试剂及配制 |
| 2.3.1 细胞培养相关试剂 |
| 2.3.2 胚胎培养相关试剂及配制 |
| 2.3.3 超数排卵激素 |
| 2.3.4 免疫荧光相关试剂 |
| 2.3.5 HE染色相关试剂 |
| 2.3.6 免疫印迹相关试剂 |
| 2.3.7 免疫荧光及免疫印迹所需抗体 |
| 2.3.8 Q-FISH和 ROS测定相关试剂 |
| 2.3.9 其他分子试验相关试剂 |
| 2.4 试验方法 |
| 2.4.1 小鼠单精注射和体细胞核移植胚胎的制备 |
| 2.4.2 胚胎移植 |
| 2.4.3 牛和羊体细胞核移植胚胎的制备 |
| 2.4.4 胚胎RNA提取和反转录反应 |
| 2.4.5 实时荧光定量PCR |
| 2.4.6 蛋白免疫印迹 |
| 2.4.7 免疫荧光染色 |
| 2.4.8 石蜡切片与HE染色 |
| 2.4.9 胚胎活检技术 |
| 2.4.10 定量荧光原位杂交(Q-FISH) |
| 2.4.11 单胚胎端粒相对长度的测量(T/S法) |
| 2.4.12 核移植胚胎多能性基因的甲基化 |
| 2.4.13 ROS检测 |
| 2.4.14 单细胞RNA-seq |
| 2.4.15 T7体外转录载体的构建 |
| 2.4.16 mRNA体外转录及注射 |
| 2.4.17 数据处理与分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 SCNT小鼠的发育和出生情况 |
| 3.2 SCNT胎儿端粒的相对长度 |
| 3.3 SCNT植入前胚胎中端粒的动态变化 |
| 3.4 端粒的长度对SCNT胚胎发育的影响 |
| 3.5 小分子化合物对端粒长度和胚胎发育的影响 |
| 3.6 褪黑素处理后SCNT胚胎端粒长度的变化 |
| 3.7 褪黑素处理后SCNT胚胎的发育能力 |
| 3.8 褪黑素处理与未处理的SCNT胚胎差异基因表达分析 |
| 3.9 差异表达基因功能分析 |
| 3.10 褪黑素对端粒相关基因表达水平的作用 |
| 3.11 Zscan4 的过表达对端粒长度及SCNT胚胎发育的影响 |
| 3.12 褪黑素对SCNT重编程过程中组蛋白修饰的变化 |
| 3.13 褪黑素对DNA甲基化及相关基因表达的影响 |
| 3.14 褪黑素能够保护SCNT胚胎免受氧化损伤 |
| 3.15 褪黑素处理对克隆小鼠出生率的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 SCNT重编程效率 |
| 4.2 SCNT胚胎中端粒的重编程 |
| 4.3 褪黑素对端粒的调控 |
| 4.4 褪黑素对SCNT小鼠出生效率的影响 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 1.Zscan4基因序列 |
| 2.RNA-seq数据总结 |
| 3.小分子调控物处理后SCNT胚胎的发育率 |
| 4.Zscan4 mRNA注射后SCNT胚胎的发育率 |
| 5.ICSI和 SCNT植入后胚胎的发育 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
（10）不同脏腑虚损COPD患者衰老程度差异性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 研究内容与方法 |
| 1.研究对象 |
| 2.诊断标准 |
| 2.1 COPD诊断标准 |
| 2.2 COPD稳定期的诊断标准 |
| 2.3 肺功能分级标准 |
| 2.4 健康对照组入选标准 |
| 2.5 中医脏腑虚损评定标准 |
| 3.纳入标准 |
| 4.排除标准 |
| 5.研究内容 |
| 5.1 患者信息采集 |
| 5.2 肺功能检测 |
| 5.3 CAT评分标准 |
| 5.4 mMRC评分准 |
| 5.5 端粒酶活性检测与端粒长度 |
| 6.实验方法 |
| 6.1 标本的制备 |
| 6.2 端粒酶活性的检测 |
| 6.3 端粒酶长度的检测 |
| 7.质量控制 |
| 8.统计方法 |
| 9.技术路线图 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的学位论文 |
| 导师评阅表 |
四、端粒酶与端粒的研究进展（论文参考文献）
- [1]假丝酵母端粒酶逆转录酶的结构与功能研究[D]. 翟留涛. 西北农林科技大学, 2021(01)
- [2]外周血白细胞端粒长度与端粒酶活性对非小细胞肺癌患者预后的影响[D]. 刘德豪. 承德医学院, 2021(01)
- [3]端粒与端粒酶研究在肺癌中的临床应用前景与挑战[J]. 韩森,马旭,方健. 中国肺癌杂志, 2021(01)
- [4]基于新型无酶生物传感体系的端粒酶及miRNA检测成像技术的研究[D]. 孟凡渝. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [5]纳米银抗肿瘤活性及对肺组织的毒理学研究[D]. 陈彪. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [6]肾细胞癌组织中hTERT启动子甲基化水平与其临床病理意义[D]. 郑建波. 山东大学, 2020(01)
- [7]基于人胃黏膜端粒调控网络与衰老学说探讨固本通络汤治疗慢性萎缩性胃炎的机制[D]. 赵兵. 中国中医科学院, 2020(01)
- [8]萝卜蚜端粒逆转录酶TERT基因克隆及功能探究[D]. 张鑫泽. 华中农业大学, 2020(02)
- [9]小鼠、牛及羊克隆胚胎端粒重编程机制研究[D]. 宋丽爽. 内蒙古大学, 2020(01)
- [10]不同脏腑虚损COPD患者衰老程度差异性研究[D]. 曹开秀. 新疆医科大学, 2020(07)