一、抑制TIMP-1的硫代反义寡核苷酸在肝纤维化大鼠体内生物学分布及药代动力学研究（论文文献综述）
张兴旺[1]（2021）在《CCL4诱导小鼠肝纤维化模型基因芯片整合分析及核心基因的筛选验证研究》文中研究指明背景与目的:肝硬化（Liver cirrhosis）是肝脏在慢性炎症刺激的作用下肝小叶重建、假小叶和纤维结节形成所导致的病理改变,可能进一步发展为肝癌。肝硬化是一个世界性的卫生问题,它可由多种病因引起,在肝硬化的形成过程中,肝纤维化（Liver fibrosis）是其必经阶段。目前的研究普遍认为肝纤维化是可逆的,随着测序技术的进步和基因数据库中测序数据的不断增加,人们通过对数据的分析发现在肝纤维化病变过程中涉及到部分基因及通路的改变,并且在针对性的增强或抑制某些基因的表达后,肝纤维化得到了不同程度的逆转,这些实验证明通过调控基因表达来治疗肝纤维化是可行的。目前已有许多相关研究揭示了一些重要的基因及通路,如TGF-β（Transforming growth factor-β）通路等,但目前尚无特异性治疗肝纤维化的药物,因此在疾病进展过程中针对基因表达改变的研究仍存在一定的空白和进一步探索的空间。本研究使用生物信息学方法探索并分析小鼠肝纤维化进程中的关键性致病基因,并通过PCR实验验证生物信息学分析结果,为肝纤维化的早期诊断和个体化治疗提供依据。方法:1.在NCBI（National Center for Biotechnology Information）的GEO（Gene Expression Omnibus）数据库中筛选并下载CCL4诱导的小鼠肝纤维化基因芯片数据GSE27640和GSE55747,使用R语言对芯片数据进行进一步的探索,找出其中的差异表达基因,使用David数据库分析差异表达基因参与的细胞功能及通路,使用Cytoscape软件构建调控网络筛选出位于结点的10个核心致病基因,并在NCBI的Gene数据库中查询核心致病基因的功能及研究进展;2.使用CCL4诱导构建小鼠肝纤维化模型,取实验组小鼠肝硬化组织及对照组小鼠健康肝脏健康组织通过PCR实验观察基因表达情况验证我们生物信息学方法分析的结果。结果:1.将两组GEO数据整合分析后得到117个共同差异表达基因（其中108个基因表达上调,9个基因表达下调）。2.对共同差异表达基因进行功能富集分析后发现差异表达基因功能和信号通路在以下几个方面明显富集:1)在生物学进程（biological process,BP）中,共同上调基因明显富集在凋亡过程、转化、蛋白质折叠等过程。2)在分子功能（molecular function,MF）里,共同上调基因在蛋白质结合、poly（A）RNA结合、蛋白质同源二聚化活性等功能中明显富集。3)在细胞组分（cellular component,CC）里,共同上调基因主要见于细胞质、胞外体、细胞外间隙等。对差异表达基因进行信号通路富集分析结果显示共同上调基因主要富集在以下通路:内质网中的蛋白质加工、精氨酸和脯氨酸代谢等通路。3.对差异表达基因绘制蛋白质-蛋白质互作（protein-protein interaction,PPI）网络图,使用Cytoscape软件最终筛选出10个核心致病基因:Lgals3,Actb,Anxa5,Lyz2,Sec61a1,Anxa2,Isg15,Timp1,P4hb,Rpl37。4.PCR验证结果显示筛选出的10个核心基因中有9个在转录水平表达与我们在GEO数据库中下载的基因芯片数据生物信息学分析的结果基本相符。结论:1.整合两组基因芯片数据使用生物信息学方法分析我们得到了117共同差异表达基因,其中上调的108个基因参与细胞凋亡、蛋白质结合等过程;2.从筛选出的共同差异表达基因中我们筛选出了10个核心致病基因,根据在NCBI的Gene数据库中查询到的研究结果如下:1)已明确有文献报道与肝纤维化有关的基因如Lgals3、Actb、Timp-1,2)文献报道与其他器官组织纤维化相关的基因如Lyz2、Anxa2,3)目前研究结果未发现与肝纤维化相关的基因如Anxa5、Isg15、P4hb、Rpl37、Sec61a1;3.通过构建小鼠肝纤维化模型并进行PCR实验,验证了我们生物信息学分析的结果,证明我们筛选出的核心致病基因,可作为肝纤维化诊断、治疗的靶标。
涂丽裙[2]（2020）在《转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用》文中进行了进一步梳理转化生长因子-β2（TGF-β2）对免疫应答有全方位的负调节作用,可调节几乎每一种适应性免疫应答和固有免疫应答的细胞,包括树突状细胞、T细胞、B细胞、粒细胞和固有免疫淋巴样细胞。使用免疫检查点抑制剂治疗肿瘤的成功案例提示我们:抑制免疫抑制性细胞因子TGF-β2可能是一种新的策略去研制新型疫苗佐剂。为了研制出以核酸为基础的TGF-β2的抑制剂,我们设计了三个靶向人鼠的TGF-β2 m RNA3’UTR保守区域的反义寡核苷酸,并将其命名为TIO1,TIO2,TIO3。在小鼠巨噬细胞,人单核细胞及人浆细胞样树突状细胞,TIO1,TIO2及TIO3均明显下调TGF-β2的表达。在小鼠中,TIO3和TIO1,均可显着增强微生物疫苗所诱导的抗体反应。其中TIO3为佐剂的流感疫苗可抵抗流感病毒的攻击并减轻流感病毒引起的急性肺损伤。在小鼠中,TIO3可明显下调淋巴结及脾脏细胞CD4+T细胞及CD19+B细胞上s TGF-β2的表达,上调CD19+B细胞及CD11c+DC表面CD40,CD80,CD86,CD69及MHC II分子的表达,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,促进CD4+T细胞产生IL-4,抑制调节性T细胞（Tregs）的产生,促进CD4+T细胞和CD19+B细胞的增殖与活化,促进流感病毒感染的小鼠的肺脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞表面CD69的表达。总的来说,通过干扰TGF-β2的表达,TIO3或TIO1,可作为新型微生物疫苗佐剂增强疫苗诱导的抗体反应;此外,TIO3为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗可显着延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。TIO3可通过抑制人和小鼠的胶质瘤细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞表达TGF-β2,诱生胶质瘤特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞,激活NK细胞,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,上调胶质瘤细胞表面MHCI分子的表达进而增强胶质瘤疫苗的抗肿瘤功效。单独应用TIO3可通过抑制胶质瘤细胞表达TGF-β2、促进胶质瘤细胞表达MHC I,IL-17A及IFN-α、抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞表达s TGF-β2、抑制Tregs的产生、促进CD4+T细胞及CD8+T细胞的增殖而明显延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。单独应用TIO3可通过抑制胃癌细胞表达TGF-β2,促进MHC I,IL-13,IL-15,IL-17及IFN-γ的表达而显着减少肿瘤体积、延长胃癌背部移植瘤小鼠的生存期。TGF-β2的反义寡核苷酸有潜能作为微生物疫苗和肿瘤疫苗的新型佐剂,或单独治疗胶质瘤和胃癌的候选药物。
张谊[3]（2020）在《miR-222调控MMP1干预增生性瘢痕成纤维细胞增殖的机制研究》文中认为研究背景及目的:增生性瘢痕（hypertrophic scar,HS）是以成纤维细胞的过度增殖和细胞外基质的过度沉积为主要特征的皮肤纤维增生性疾病,其发病机制仍不清楚,目前尚无理想的治疗方法。阐明HS的发病机制,研究针对发病机制的特异性靶点并开发治疗HS的新药有重要临床价值。HS组织中胶原蛋白的沉积显着增多,而胶原蛋白降解的关键酶则是MMP-1,MMP-1的含量多少及活性高低直接影响细胞外基质的降解程度。因此研究MMP-1在HS中的表达和调控对于HS的防治有着重要的意义。MicroRNAs（miRNAs）通过参与转录后基因调控,广泛参与各种皮肤疾病的病理生理过程。目前尚未有miR-222和HS相关的研究报道,本研究的目的是明确miR-222在HS中的表达情况,继而研究miR-222过表达对HS生物学特性的影响,并探讨miR-222参与HS的成纤维细胞增殖调控的相关机制。方法:1、收集36例HS患者的瘢痕组织及邻近正常组织,分离培养成纤维细胞,qRT-PCR 和 Western Blot 检测 Col1A1、Col3A1、MMP1 和 miR-222 的表达。2、采用脂质体法为成纤维细胞分别转染miR-222 mimic、miR-222 inhibitor、scramble control 和 negative control。用 qRT-PCR 检测转染效率,MTT 法检测细胞增殖情况,Western Blot检测PCNA、cyclin D1、cyclin E1和CDK1的表达,流式细胞术检测细胞生长周期和凋亡率。3、生物信息学技术预测miR-222的潜在靶基因。4、采用脂质体法将荧光素酶报告载体MMP1-3’-UTR-Wt或MMP1-3’-UTR-Mut 分别与 miR-222 mimics、miR-222 inhibitor、scramble control 或negative control共转染到HEK 293T细胞中,用双荧光素酶报告基因实验检测荧光值。5、采用qRT-PCR和Western blot检测HS的成纤维细胞转染miR-222 mimic和miR-222 inhibitor及其对照组后MMP1mRNA和MMP1蛋白的表达。6、分别将 miR-222mimic+MMPl,miR-222mimic 和 scramble control 转染HS是成纤维细胞,MTT法检测成纤维细胞增殖速率;流式细胞术检测细胞凋亡率;Western Blot 检测 PCNA、cyclin D1 和 cleaved caspase3 的表达。结果:1、与正常皮肤组织相比,HS组织中miR-222表达显着上调。2、转染miR-222 mimic组的成纤维细胞中miR-222表达上调,成纤维细胞增殖能力显着提高,PCNA、Col1A1、Col3A1mRNA 及其蛋白、cyclin D1、cyclin E1和CDK1表达和成纤维细胞S期的细胞比例均上调,成纤维细胞凋亡率下降,cleaved caspase-3 和 cleaved caspase-9 蛋白表达下调。而转染 miR-222 inhibitor 组各指标均与转染miR-222 mimic组相反。3、靶基因预测发现MMP1是miR-222的潜在靶基因。共转染miR-222mimic和MMP1-3’UTR-Wt后,报告基因的荧光值降低,共转染miR-222 inhibitor和MMP1-3’UTR-Wt后,则显着增高。证实了 MMP1是miR-222的靶基因。4、转染miR-222 mimic组的HS成纤维细胞的MMP1mRNA和MMP1蛋白的表达下调,转染miR-222 inhibitor组的HS成纤维细胞的MMP1mRNA和MMP1蛋白的表达上调。5、转染miR-222mimic+MMP1组与转染miR-222mimic组比较:HS成纤维细胞增殖速度减慢,细胞凋亡率上升,PCNA,cyclin D1表达下调,cleaved caspase3表达上调。结论:miR-222过表达可以促进HS的成纤维细胞增殖,miR-222可能是通过以下途径调控HS的成纤维细胞增殖:1、调控细胞周期,上调HS的成纤维细胞S期细胞的比例;2、降低成纤维细胞的凋亡率;3、提高HS的成纤维细胞的增殖能力,上调增殖相关蛋白PCNA的表达,促进Col1A1、Col3A1的mRNA及蛋白的表达,而实现促进HS的形成。4、miR-222可能是通过绑定其下游靶基因MMP1的3’-UTR负向调控MMP1的表达而发挥其功能。MMP1可逆转miR-222的部分促纤维化作用。本研究为miR-222/MMP1信号通路可能成为HS诊断和治疗的生物标记物和新的靶点提供了数据支持。
张石蕾[4]（2020）在《肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体抗肝纤维化的作用及机制研究》文中研究表明目的:构建CPhGs脂质体,并表征其特性;考察CPhGs和CPhGs脂质体体外释放行为及体内药代动力学特征;采用体内实验,探讨CPhGs脂质体对BSA诱导的大鼠免疫性肝纤维化模型的防治作用及作用机制;采用体外实验,观察CPhGs脂质体对HSCs增殖、细胞凋亡、细胞周期及胶原分泌的影响,并进一步通过观察CPhGs脂质体对rrPDGF-BB刺激HSCs增殖的影响,从细胞和分子水平上探讨CPhGs脂质体对MAPK和FAK/PI3K/Akt信号传导通路的影响,揭示其抗肝纤维化的作用靶点,并阐明其发挥作用的分子机制。方法:（1）采用薄膜分散一次包封法、薄膜分散二次包封法、逆向蒸发法、真空冷冻干燥薄膜分散二次包封法制备CPhGs脂质体,使用透射电镜观察其形态,Malvern激光粒度分析仪测量其粒径,Zeta电位、HPLC法测量药物包封率、载药率,评价并确定其最佳制备方法。（2）以原料药为对照组,采用HPLC检测并阐明CPhGs脂质体的体外释药规律,LC-MS法测定CPhGs脂质体中松果菊苷在大鼠血浆中的血药浓度,分析药代动力学特征。（3）使用BSA建立免疫性肝纤维化大鼠模型,体内观察CPhGs脂质体及CPhGs原料药对BSA诱导的大鼠免疫性肝纤维化的影响,分析血清学指标、肝组织病理、免疫组化指标以及ECM蛋白、MAPK通路、炎症蛋白表达水平的变化,评价CPhGs脂质体抗肝纤维化的作用及可能的分子机制。（4）体外观察CPhGs脂质体对HSCs的增殖和细胞凋亡、细胞周期及对细胞活力、细胞毒性的影响,从细胞学水平阐述CPhGs脂质体抗肝纤维化的作用,研究CPhGs脂质体对rrPDGF-BB/FAK/PI3K/Akt信号通路的影响,探讨其抗肝纤维化的作用靶点,从分子水平阐明其作用机制。结果:（1）采用薄膜分散一次包封法制备的3个不同批次CPhGs脂质体包封率平均值为28.55%,载药率为2.73%;采用薄膜分散二次包封法制备的3个不同批次CPhGs脂质体包封率平均值为38.46%,载药率为3.71%;采用逆向蒸发法制备的3个不同批次CPhGs脂质体包封率平均值为33.88%,载药率为3.28%,薄膜分散二次包封法制备的CPhGs脂质体包封率和载药率均是最高;在以薄膜分散二次包封法制备的CPhGs脂质体基础上,利用真空冷冻干燥法制备了CPhGs脂质体冻干粉,复溶后CPhGs脂质体冻干粉外观形态良好,冻干前后纳米粒的粒径和包封率变化均不大,说明其稳定性良好,为后续实验提供足够的样品量。（2）体外释药结果显示,最适合CPhGs和CPhGs脂质体的模型分别是一级动力学和Higuchi方程,CPhGs脂质体没有显示任何突释效应;大鼠体内的药物代谢动力学相关参数表明,CPhGs原料药和CPhGs脂质体组在相同剂量灌胃给药的情况下,CPhGs脂质体给药后Cmax明显提高（P<0.05）,CPhGs脂质体组给药0.75h之后的血药浓度均远远大于原料药组（CPhGs脂质体组35.95±3.95 ng/ml vs CPhGs原料药组27.14±0.93 ng/ml）,给予CPhGs原料药后大鼠血浆中松果菊苷的浓度较低,CL为2.07±0.39 ml/h/kg,t1/2显着延长（CPhGs脂质体组5.33±0.43h vs CPhGs原料药组2.07±0.61h,P<0.05）,MRT显着延长（CPhGs脂质体组5.87±0.32h vs CPhGs原料药组2.80±0.47h,P<0.05）,Tmax显着增加（CPhGs脂质体组1.60±0.55h vs CPhGs原料药组0.60±0.22h,P<0.05）;CPhGs脂质体组大鼠血浆中24h内药时曲线下面积较CPhGs原料药组显着提高,为原料药组的273.30%。（3）体内药效学实验结果表明,CPhGs脂质体和CPhGs原料药干预均可使肝纤维化模型大鼠肝脏、脾脏指数降低,其中CPhGs脂质体组大鼠肝脏、脾脏指数与CPhGs原料药组相比显着降低;并且,相同剂量的CPhGs脂质体组大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL、TBA、γ-GT、TGF-β、肝纤维化四项LN、HA、PCⅢ、IV-C以及肝组织HYP含量总体上较CPhGs原料药组有明显的下降,大鼠肝脏病理损伤情况也有所改善;免疫组化和WB实验结果均显示CPhGs脂质体组ECM标志性分子α-SMA和CollagenⅠ蛋白表达水平显着降低;与模型组、CPhGs原料药组以及空白脂质体组大鼠相比,CPhGs脂质体给药组大鼠肝组织MAPK信号通路相关蛋白p-ERK 1/2、p-JNK 1/3和p-P38以及炎症相关蛋白NF-κB、AP-1、Cox-2、HMGB1有所下调,IκBα有所上调。（4）体外药效学实验结果表明,CPhGs脂质体对HSCs的增殖抑制率随着药物浓度的升高逐渐升高,24h的IC50值为42.535μg/ml;CPhGs脂质体（29.45、14.72、7.36μg/ml）对HSCs没有明显的毒性作用（P>0.05）。流式细胞仪检测结果显示,浓度为29.45μg/ml的CPhGs脂质体可诱导HSCs晚期凋亡,晚期凋亡细胞比例高于早期凋亡细胞比例;在浓度为14.72μg/ml和7.36μg/ml的CPhGs脂质体组中,早期凋亡细胞比例要明显高于晚期凋亡细胞;细胞周期结果显示,与正常对照组相比,不同浓度的CPhGs脂质体处理HSCs后,G0/G1期细胞比例明显升高（P<0.05）,S期细胞比例明显降低（P<0.05）,G2/M期细胞比例明显降低（P<0.05）。与rrPDGF-BB组比较,不同浓度CPhGs脂质体组均可抑制rrPDGF-BB诱导的HSCs的增殖;荧光定量PCR结果显示,与rrPDGF-BB组相比,29.45、14.72、7.36μg/ml CPhGs脂质体组CollagenⅠ、α-SMA、TIMP-1的mRNA表达水平均降低,MMP-1 mRNA表达水平均增多（P<0.05）。在rrPDGF-BB刺激活化的HSCs中,CollagenⅠ和α-SMA mRNA表达水平显着提升,经三个剂量组的CPhGs脂质体干预均可以减少CollagenⅠ、α-SMA、TIMP-1的mRNA表达水平,尤其是29.45μg/ml高剂量CPhGs脂质体组效果最为明显。WB分析结果显示,与正常对照组比较,模型组CollagenⅠ、α-SMA蛋白表达水平显着升高（P<0.05）;与模型组比较,CPhGs脂质体7.36μg/ml、14.72μg/ml和29.45μg/ml三个剂量组中CollagenⅠ、α-SMA蛋白表达水平显着降低（P<0.05）;三个剂量组的CPhGs脂质体处理HSCs 24小时后,HSCs中p-PI3K和p-Akt水平持续下降;和rrPDGF-BB刺激组相比,rrPDGF-BB刺激+FAK基因过表达组中FAK蛋白表达水平显着升高（P<0.05）,而rrPDGF-BB刺激+FAK基因过表达对照组中FAK蛋白表达水平无显着变化;和rrPDGF-BB刺激+FAK基因过表达组相比,rrPDGF-BB刺激+FAK基因过表达对照组和rrPDGF-BB刺激+FAK基因过表达+CPhGs脂质体给药组磷酸化PI3K和磷酸化Akt蛋白表达水平显着下降（P<0.01）。结论:采用薄膜分散二次包封法制备得到CPhGs脂质体纳米粒,形态圆整、包封率较高、粒径分布小、稳定性好;体外释药实验结果表明,本研究所制备的CPhGs脂质体纳米粒在一定程度上有缓释作用,并且明显改变了CPhGs的药物动力学行为,减缓了药物的消除时间,提高了药物的生物利用度;CPhGs脂质体能不同程度降低肝纤维化大鼠的肝、脾指数,改善血清肝功能酶指标,降低血清肝纤维化标志物含量,减轻肝细胞变性及炎性细胞浸润,抑制胶原纤维的合成与沉积,通过MAPK通路及炎症因子蛋白表达抑制肝纤维化的发展变化;CPhGs脂质体给药组能在无细胞毒性的基础上明显减少HSCs的活化,剂量依赖性地抑制rrPDGF-BB刺激的HSCs的细胞增殖,能通过PDGF/FAK/PI3K/Akt通路对rrPDGF-BB刺激的HSCs中ECM蛋白表达产生调控。研究结果为CPhGs脂质体纳米粒在抗肝纤维化方面的应用提供了科学依据。
熊凯[5]（2019）在《胡黄连苦苷Ⅰ抗肝纤维化作用及药代动力学研究》文中认为目的:肝纤维化是一种肝组织细胞外基质过度堆积而导致肝结构或功能异常的病理过程。中药胡黄连中含有的胡黄连苦苷Ⅰ具有利胆保肝的药理作用,有望成为抗肝纤维化的候选药物。本研究将探讨胡黄连苦苷Ⅰ是否能够抗硫代乙酰胺（TAA）诱导的肝纤维化,利用代谢组学及蛋白质组学手段探讨其作用机制;采用质谱技术研究胡黄连苦苷Ⅰ体内代谢过程和药物动力学规律。方法:1.将小鼠随机分为空白组、模型组（TAA）、阳性药物组（TAA+S-腺苷甲硫氨酸10 mg/kg）、低剂量组（TAA+胡黄连苦苷Ⅰ25 mg/kg）、中剂量组（TAA+胡黄连苦苷Ⅰ50 mg/kg）和高剂量组（TAA+胡黄连苦苷Ⅰ75mg/kg）,TAA（200mg/kg）每周腹腔注射三次,S-腺苷甲硫氨酸或胡黄连苦苷Ⅰ每天灌胃给药一次。8周后检测各组小鼠血清转氨酶及肝纤维四项指标,肝组织切片进行苏木精-伊红染色或天狼星红染色观察形态学变化。2.各组小鼠尿液、血清及肝脏样本经沉淀法处理后进行液质联用分析,所得数据经预处理后进行主成分分析和正交偏最小二乘判别分析,以VIP>1、P<0.05为条件筛选差异代谢物,利用HMDB、Metlin数据库或标准品比对鉴定差异代谢物。3.空白组、模型组、阳性药物组小鼠肝脏样本经提取、酶解、标记后进高p H反相液相色谱分离,所得馏分进入纳升液相色谱串联Q Exative质谱进行分析,质谱数据用Mascot软件实现定性定量,差异蛋白筛选条件为P<0.05且差异倍数<0.83（或>1.2）。部分重要差异蛋白利用蛋白质印迹和实时定量逆转录聚合酶链式反应手段进行验证。4.建立大鼠血浆中胡黄连苦苷Ⅰ的超高效液相串联三重四级杆质谱含量测定方法,并用于口服给药（75mg/kg）后胡黄连苦苷Ⅰ药动学研究。另外利用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱技术检测口服给药后胡黄连苦苷Ⅰ在大鼠尿液、血清、粪便、胆汁中的代谢产物。结果:胡黄连苦苷Ⅰ能在一定程度上逆转肝纤维化引起的小鼠血清转氨酶及肝纤维四项指标（Ⅳ型胶原、Ⅲ型前胶原氨基端原肽、层粘连蛋白及透明质酸）含量升高,减少肝细胞炎症细胞浸润和胶原纤维堆积。经过胡黄连苦苷Ⅰ干预后,肝纤维化小鼠体内三羧酸循环、支链氨基酸代谢、甘油磷脂代谢被调节;上游CYP8B1上调,下游胆酸、牛磺胆酸下调;谷胱甘肽水平上调,转谷氨酰胺酶下调;上游鞘氨醇激酶2上调,下游鞘磷脂水平下调。胡黄连苦苷Ⅰ大鼠口服后吸收迅速,在30 min时即能达到峰值浓度,且消除较快。胡黄连苦苷Ⅰ在体内可检出15个代谢产物,代谢途径涉及羟化、脱氧、水解、葡萄糖醛酸化、硫酸化及甲基化。结论:胡黄连苦苷Ⅰ具有一定的抗肝纤维化作用,能逆转肝纤维化引起的能量、脂质、谷胱甘肽代谢紊乱,调节鞘氨醇信号通路、初级脂肪酸合成、PPAR信号通路。该药物在体内吸收和消除快,呈现出广泛代谢特征。
孔繁磊[6]（2019）在《肝纤维化特异性诊断TTR分子探针制备与初步实验结果》文中研究说明目的:制备靶向TTRmRNA的正电子分子探针[18F]TTR-ASO,并探索该探针靶向TTR mRNA显像的有效性。方法:通过穿膜肽与甲状腺素转运蛋白反义寡核苷酸（TTR-ASO）的非共价键结合构成分子探针主体。首先通过细胞学实验,初步探索其对TTR基因的靶向特性。接着以苯甲醛为载体,在TTR-ASO分子探针主体上标记18F,制备[18F]TTR-ASO正电子分子探针。最后通过表达TTR基因的正常大鼠（S0期）和TTR基因低表达的大鼠肝纤维化（S4期）模型对比,验证[18F]TTR-ASO探针在活体中靶向TTR mRNA显像的有效性。结果:细胞实验证明TTR-ASO分子探针在80min已经进入细胞,12h摄取达到高峰,且具有针对TTR基因的靶向性。动物实验中[18F]TTR-ASO分子探针PET-CT显像表明,注射80min时,正常大鼠（S0）SUVmax、SUVmean明显高于纤维化大鼠（S4）,差异具有统计学意义（P<0.05）,SUVmin在两组大鼠间的差异没有统计学意义（P>0.05）。探针在正常大鼠和模型鼠肝脏的浓聚情况差异与细胞学及免疫组化结果相符。结论:成功制备[18F]TTR-ASO正电子分子探针,该分子探针可以靶向肝细胞质中TTR mRNA显像,有望实现早期肝纤维化无创靶向基因成像。
刘燕[7]（2018）在《用于治疗慢性阻塞性肺病的二烯丙基二硫醚和左旋薄荷醇复方制剂的初步成药性评价》文中认为慢性阻塞性肺病（Chronic obstructive pulmonary disease,COPD）,是一种常见的、可以预防和治疗的疾病,其特征是持续存在的呼吸系统症状和气流受限,原因是气道和/肺泡异常、通常与显着暴露于毒性颗粒和气体相关。吸烟被认为是COPD的首要发病因素,吸烟人群患COPD的概率远高于非吸烟者。吸烟可以引起氧化应激反应、诱发炎症和免疫系统调节异常,激活呼吸道上皮细胞和巨噬细胞,从而引起了炎症介质的大量释放,这最终导致了呼吸道炎症、气流受限以及肺实质的损伤和肺气肿的形成。迄今为止,糖皮质激素类药物是治疗COPD的首选药物,以干粉吸入剂为主,其与支气管扩张剂的联用是常见的治疗策略。这些药物均给COPD患者带来了福音,然而,该类药物同时具有诸多副作用,如加重肺部感染风险、造成口腔真菌感染以及声音嘶哑等。而全身应用糖皮质激素时,还会引发免疫系统的损伤、诱发感染、糖皮质激素抵抗以及骨质疏松等。此外,有相当一部分COPD患者对糖皮质激素不敏感。因此,开发安全、有效、质量可控的治疗COPD的新药仍然极为迫切。本论文所研究的二烯丙基二硫醚和左旋薄荷醇复方制剂组分均来源于天然产物。二烯丙基二硫醚（DADS）是大蒜中含量较高的挥发性有机硫化物,流行病学、临床、生物和动物实验结果表明,大蒜中的有效成分具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗真菌、抗病毒、抗高血压、保护心脏和抗癌等多种药理活性。在本课题组的前期工作中,DADS被确定为是治疗COPD的大蒜吸入疗法的有效成分之一和成药性最高的成分。药理学实验结果表明,DADS对肺炎、肺癌等呼吸系统疾病均具有良好的治疗潜力。左旋薄荷醇（L-menthol）是一种萜类化合物,药理学研究表明,其具有抗炎、抗氧化、抗菌、清凉、镇痛等多种生物活性。此外,L-menthol也是多种复方制剂的主要活性成分,在许多呼吸系统疾病,如支气管炎、过敏性鼻炎、喉炎和鼻窦炎等的临床治疗中取得了较好的效果。结合本课题组的前期工作,L-menthol还可以有效的掩盖DADS的刺激性气味,并改善DADS引起的溶血反应。本论文研究分为以下四个部分:（1）抗COPD的体外药理活性研究,（2）治疗COPD的体内药理活性及分子生物学作用机制考察,（3）药代动力学特征,（4）药物相互作用评价。1.抗COPD的体外药理活性研究:体外研究采用小鼠巨噬细胞Raw264.7和人肺成纤维细胞HFL-1建立了两种细胞模型。通过在Raw264.7细胞培养液中添加脂多糖（LPS）建立了基于LPS诱导的Raw264.7细胞炎症模型,实验结果表明,DADS及L-menthol可以减少巨噬细胞由LPS刺激所分泌的NO、TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子的释放,并呈现剂量依赖性。中性红吞噬实验结果显示,DADS和L-menthol还可以减弱巨噬细胞的吞噬作用,从而减弱炎症反应。通过在HFL-1细胞培养液中添加香烟烟雾提取物（CSE）建立了 HFL-1细胞模型,弹性蛋白酶测定结果表明,DADS和L-menthol可以减少HFL-1细胞分泌的MMP-9和TIMP-1的量,从而对弹性蛋白酶失衡进行调控。2.注射和吸入给药抗COPD的体内药理活性研究:采用给大鼠腹腔注射香烟烟雾提取物（CSE）的方法建立了体内COPD模型。腹腔注射给药的体内研究内容包括评价复方药物针对肺灌洗液、肺匀浆、肺组织中炎症应激和氧化应激的调控效果。采用腹腔注射的给药方式,以布地奈德为阳性对照药物,分别考察了单独给予DADS、L-menthol、DADS 与 L-menthol 二者联用、DADS 与 L-menthol 和布地奈德三者联用的治疗效果。肺灌洗液炎症细胞计数实验结果表明,DADS和L-menthol可以降低肺灌洗液中的炎症细胞总数,尤其是巨噬细胞的数量。ELISA实验结果显示,肺匀浆中的炎症细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的水平治疗后均明显下降。氧化应激标志物的测定结果指出,DADS和L-menthol可以显着降低氧化物的含量,并提高抗氧化剂的水平和机体的总抗氧化能力。以上肺灌洗液和匀浆的实验结果在肺组织形态学和免疫组化研究中得到了进一步证实。DADS和L-menthol治疗后,肺组织形态学变化显着,肺气肿特征明显改善,肺泡间隔显着缩小,肺泡破坏指数降低。免疫组化实验结果表明,DADS与L-menthol可以显着地降低肺组织中MMP-1和TIMP-1的表达,从而证实了二者具有调控COPD的弹性蛋白酶-抗弹性蛋白酶失衡的作用。DADS与L-menthol发挥抗COPD活性的分子生物学机制研究显示,复方药物主要是通过抑制NF-κB和激活Nrf2信号通路而发挥作用。在各种机制的研究中,L-menthol的作用强度弱于DADS,属于非拮抗的关系。与阳性药布地奈德相比较,DADS与L-menthol组避免了布地奈德全身用药所引起的体重降低等副作用。另外,DADS和L-menthol对于COPD大鼠肺组织形态改善作用较为明显,且肺气肿病理特征的改善作用显着优于布地奈德。吸入给药的体内研究主要评价了复方药物针对肺灌洗液中弹性蛋白酶与抗弹性蛋白酶、肺组织形态和肝功能的影响。选用DADS与L-menthol的高、中、低剂量组以及二者与布地奈德联用的高、中、低剂量组进行了对比研究。ELISA法测定肺灌洗液上清中的MMP-9和TIMP-1含量,实验结果表明,给药后二者的含量以及含量比值均显着下降,这说明吸入给药后,肺实质的损伤减少,从而使肺气肿得到了明显改善。组织形态学研究结果显示吸入给药后,给药组的肺泡间隔显着缩小,与腹腔注射给药相比较,具有明显的差异。ALT和AST测定结果表明DADS和L-menthol给药后二者明显降低,证明COPD引起的肝功能损伤得到缓解,低、中、高剂量组治疗效果依次增强。3.药代动力学研究:为了给后期合理用药、剂型设计等工作提供理论依据,DADS和L-menthol药代动力学研究包括静脉注射、口服、吸入等不同给药途径下的药代动力学参数的测定。在大鼠中分别研究了 DADS经静脉注射、口服、吸入给药后的药代动力学,并对其生物利用度进行了计算。DADS体内主要的代谢产物鉴定为甲基烯丙基亚砜（AMSO）和甲基烯丙基砜（AMS02）。药代动力学实验结果表明,与口服给药相比,DADS吸入给药后,AMSO的达峰时间明显缩短,由6h缩短至2 h。以AMSO和AMS02来计算的口服平均生物利用度分别为29.32%和46.14%;AMSO和AMSO2的吸入平均生物利用度分别为15.31%和14.21%。以L-menthol的原型药物来考察其静脉注射和吸入的药代动力学特征,计算所得其吸入生物利用度为50.24%。4.药物相互作用研究:药物相互作用是新药在开发阶段必须进行的重要研究工作。采用体外人肝微粒体孵育模型,以非那西汀、甲苯磺丁脲、奥美拉唑、右美沙芬、氯唑沙宗以及睾酮分别作为CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1和CYP3A4的特异性探针底物,进行了 DADS及其体内代谢产物AM,AMS、AMSO和AMS02以及左旋薄荷醇（L-menthol）对人肝微粒体CYP450代谢酶的抑制作用,推断其可能发生的药物相互作用,为进一步临床合理用药提供指导。实验结果表明,DADS及其代谢产物AM、AMS、AMSO、AMS02均为CYP2E1的中等强度抑制剂,且四种代谢物的抑制强度高于DADS,L-menthol是CYP2D6和CYP1A2的中等强度抑制剂,此外,DADS和L-menthol对最常见的药物代谢酶CYP3A4和CYP2C没有显着的抑制作用。综上所述,本论文针对DADS和L-menthol复方药物在抗COPD的体外药理活性、体内药理活性、分子生物学作用机制、药代动力学特征、药物相互作用等方面开展了初步成药性评价。研究结果表明,DADS和L-menthol是极具开发潜力的、低毒、多靶点的抗COPD药物,针对COPD的四大主要发病机制（炎症、氧化应激反应、弹性蛋白酶失衡和免疫失衡）均有显着的调控作用,成药性较高。首先,复方药物具有较好的抗炎效果,表现为其可以显着减少大鼠体内白细胞总数尤其是巨噬细胞数量、明显降低大鼠体内炎症因子的释放,其作用机制为抑制NF-κB信号通路。其次,复方药物在调控氧化还原失衡方面也表现出了显着效果。氧化应激标志物的测定结果显示,复方药物可以显着降低氧化物的含量,并提高抗氧化物的水平和机体的总抗氧化能力,其作用机制为激活Nrf2信号通路。再次,复方药物改善肺组织形态的作用显着优于阳性药物布地奈德,作用机制是复方药物可以有效调控弹性蛋白酶失衡-抗弹性蛋白酶失衡。此外,复方药物还可以调控免疫细胞在体内的失衡,表现为显着减少CD4+和CD8+T细胞在肺部的募集。复方药物吸入给药与腹腔注射给药的对比研究显示,吸入给药后COPD的大鼠的肺组织形态更趋近于正常大鼠,治疗效果明显优于腹腔注射给药。生物转化和药代动力学研究表明,DADS在体内主要代谢物AMSO和AMSO2,吸入给药后,AMSO的达峰时间由6h缩短至2 h。以AMSO和AMSO2来计算的口服平均生物利用度分别为29.32%和46.14%;吸入平均生物利用度分别为15.31%和14.21%。L-menthol的吸入生物利用度为50.24%。药物相互作用研究结果表明,DADS及其代谢产物AM、AMS、AMSO、AMSO2均为CYP2E1的中等强度抑制剂,且四种代谢物的抑制强度高于DADS,L-menthol是CYP2D6和CYP1A2的中等强度抑制剂,此外,DADS和L-menthol对最常见的药物代谢酶CYP3A4没有明显的抑制作用。
朱颖炜[8]（2016）在《转染TIMP-1-shRNA基因的骨髓间充质干细胞治疗大鼠肝纤维化》文中研究说明【研究背景及目的】慢性肝病发展恶化变成肝硬化,需经共同路径-肝纤维化（hepatic fibrosis）,在此过程中细胞外基质（extracellular matrix,ECM）不正常沉积是主要的病理特征。肝纤维化的病理改变具有可逆性和动态性,但是肝硬化不能够发生逆转。所以对于慢性肝病的防治,重点在于明确肝纤维化的发病机制,阻断、抑制及逆转肝纤维化。干细胞在一定的内环境下能够定向分化为类肝细胞,分泌相关细胞因子,促进受损肝脏的修复和再生。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）是干细胞家族的重要成员,具有低免疫原性和多向分化潜能等特性,是目前研究范围最为广泛的一种成体干细胞。最近几年,骨髓间充质干细胞移植在逆转肝纤维化方面的作用已经得到证实,有望成为肝纤维化治疗的新方法。虽然目前存在研究结果显示,出现组织损伤时多种干细胞会受骨髓的作用移动到发病部位,然后进行自然性、代偿性地修复;但是干细胞移植治疗肝纤维化的疗效仍不确切,其中重要的原因之一是干细胞静脉途径移植后,干细胞很难得到出色的归巢或移行效果,从而影响干细胞的移植治疗,导致疗效较差。因此,要提升干细胞移植的治疗效果,需要进一步提升移植干细胞的“质量”。越来越多的研究把基因治疗的方法和干细胞移植结合起来以提高治疗的精准度。基因治疗是一种新型的治疗手段,它的特点是在靶细胞的染色质基因组内导入正常与野生型的基因,将致病基因置换,或者将缺失基因补偿,最终得到新的表型。RNA干扰（RNA interference,RNAi）的特点是通过内、外源性双链RNA（double stranded RNA,dsRNA）进行诱导,使基因沉默在mRNA的水平上产生,它的特异性较强。小分子干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）具有特异性与高效性,现阶段在基因组功能实验的过程中,它被应用的频率较高。siRNA和以前常用的基因抑制工具的不同点在于,sirna对基因表达的抑制水平与效果更好、更持久,稳定性更出色,得到的基因序列具有更高的特异性。rnai这项新型技术可用于特定基因功能的抑制过程中,在生物体特征改善、药品研究、基因治疗及基因组功能研究等方面均可发挥重要的作用。rnai可由慢病毒载体、质粒介导,前者可以感染类型更多样的细胞,获得更出色的沉默效果,得到更高的转染率,并且利用染色体整合使沉默效果更加稳定与持久,所以在基因治疗与基因表达调控等方面,它的应用频率更高。小发卡或短发卡rna（asmallhairpinrnaorshorthairpinrna,shrna）是一段具有紧密发卡环（tighthairpinturn）的rna序列,常被用于rna干扰沉默靶基因的表达。利用载体把shrna导入细胞,载体中的u6启动子确保shrna总是表达;这种装载了shrna载体可被传递到子代细胞中去,从而使基因的沉默可被遗传。shrna的发卡结构可被细胞机制切割成sirna,然后sirna结合到rna诱导沉默复合物上（rna-inducedsilencingcomplex,risc）,该复合物能够结合到目的mrnas并将其降解,起到基因沉默的作用。干细胞之所以能够在循环后在内皮细胞表面黏附,是病变处表达的粘附因子起到了介导作用,接着趋化因子发挥作用,使干细胞通过内皮细胞转移至相关组织内,最后到达病变部位开始分化与增殖过程。各种自然障碍会在干细胞归巢时相遇,例如基底膜与间质结缔组织之间的ecm。干细胞想要通过emc,必须借助于某些酶的作用,这些酶可以对ecm的构成成分进行降解。所以干细胞生成与分泌的蛋白酶类型与机理是干细胞研究的关键。对于ecm的特异性降解,可以发挥作用的酶包括基质金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶及丝氨酸蛋白酶。最近几年的研究结果显示基质金属酶（matrixmetalloproteinase,mmps）能够降解ecm,而体内天然存在的基质金属蛋白酶抑制剂（tissueinhibitorofmatrixmetalprotease,timps）则可对mmps的活性进行抑制。相关结果显示干细胞穿过基底膜的能力可以通过timp-2、mti-mmp、mmp-2的稳定表达而得到加强,mmp-9不会被干细胞表达,即便被表达,表达量也很低,但是在干细胞的转移与归巢过程中mmp-9发挥了一定的作用。timp-1与timp-2的作用有着显着差异,如果timp-1的表达时间长、表达量高,那么干细胞穿过基底膜的能力会受到抑制,这是因为mmp-9的活性受到了抑制。因此,我们设想通过沉默timp-1,上调mmps的表达增强干细胞穿过基底膜的能力,促进干细胞归巢到纤维化肝脏组织,提高肝纤维化的治疗疗效。本实验在大鼠骨髓间充质干细胞中转染了携带有timp-1-shrna的基因,静脉移植治疗大鼠肝纤维化模型,对转染携带有timp-1-shrna基因的bmscs之后观察肝功能是否得到改善、肝纤维化是否得到抑制,设想是体内增加了骨髓干细胞归巢于纤维化肝脏的数量所致,从而对联合应用rna干扰技术与干细胞移植技术在治疗肝纤维化中的应用前景进行探究,为在更深层次研究干细胞归巢机制打下基础,并进一步探讨干细胞联合rna干扰治疗肝纤维化的机理。【实验方法】1、全骨髓法（贴壁筛选法）进行大鼠bmscs的分离、培养及鉴定大鼠的骨髓mscs分离纯化后,取培养的第二代bmscs,分别加入下列羊抗鼠单克隆抗体:cd34-fitc、cd45-pe、cd73-pe、cd90-pe、cd105-pe、hla-dr-pe,置4℃孵30分钟,pbs洗2次,进行流式细胞仪分析及细胞周期检测;收集培养第三代bmscs,行成骨鉴定等间充质干细胞生物学特性鉴定。2、建立沉默timp-1基因的bmscs稳定转染细胞株。设计、合成3对针对timp-1基因的特异性shrna片段,在293t细胞中转染测序准确的慢病毒与载体质粒包装得到的质粒,收集、纯化和浓缩富含慢病毒的细胞上清液。使用慢病毒包装系统来沉默具有timp-1基因不同位点的3组骨髓间充质干细胞株（sh1、sh2、sh3组）,同时设立转染空载体组,对每组细胞转染先后细胞形态与荧光的表达量进行观测。再抽提蛋白,通过westernblot技术对timp-1蛋白的表达量进行检测。3、制备ccl4损伤大鼠肝纤维化模型本课题组随机将40只sd大鼠40只,体重200-300g,雄性大鼠,分为模型组（n=36）和正常对照组（n=4）,模型组腹腔注射ccl4（1μl/g,橄榄油1:1稀释）,正常对照组腹腔注射等体积生理盐水,每周2次,连续4周,制备大鼠肝纤维化模型。4、静脉注射转染基因治疗大鼠肝纤维化肝纤维化模型组第5周随机分为3组,每组12只,bmscs组（通过鼠尾静脉注射3×106个大鼠bmscs细胞）,timp-1-shrna-bmscs组（通过鼠尾静脉注射3×106个携带timp-1-shrna病毒载体感染的大鼠bmscs细胞）,空白组（通过鼠尾静脉注射生理盐水200μl）。在4周移植之后将全部实验动物处死:将实验组肝脏提取出来进行冰冻切片,gfp标记阳性表达细胞在肝内的分布通过荧光显微镜观察;取各组大鼠肝脏做石蜡切片,he染色检测肝纤维化情况;免疫组织化学检测Ⅰ、Ⅲ型胶原在移植前后肝脏中的表达;肝功能指标检查:将全部动物的血清回收,通过全自动生化仪进行观测,分析ast、alt等肝功指标的情况,从而评价转染timp-1-shrna的bmscs治疗大鼠肝纤维化的效果。【实验结果】1、全骨髓法（贴壁筛选法）进行大鼠bmscs的分离、培养及鉴定原代培养7天的大鼠bmscs贴壁生长,折光性强,细胞呈梭形、三角形和多角形。2周时细胞生长可达80%融合,细胞为大梭形,排列紧密并有一定的方向性,呈成纤维细胞样分布。传代培养后细胞生长速度明显加快,接种3小时后即可出现贴壁。传代培养3天后逐渐形成扁平单层细胞,呈漩涡状生长或成簇生长,随着细胞密度的增加,胞体变得细长,形态类似成纤维细胞。第5天可达到90%融合,细胞形态呈相对均匀一致的长梭形且胞浆丰富、折光度好,呈漩涡状生长或成簇生长,随着细胞密度的增加,胞体变得细长,形态类似成纤维细胞。流式细胞仪检测显示,bmscs表达cd90、cd73、cd105和cd166,不表达cd34、cd45、cd14、cd106和hla-dr。流式细胞仪结果显示,第2代mscs中g0/g1期的细胞为94.1%,g2期的细胞为4.9%,s期的细胞为1.0%,大部分细胞处于静止期,只有少数的细胞处于活跃的增殖期符合干细胞特征。细胞生物学特性检测,具有成骨细胞、成脂细胞及软骨细胞的多向分化潜能,符合骨髓间充质干细胞生物学特性。2.建立沉默timp-1基因的bmscs稳定转染细胞株。慢病毒转染bmscs1周后,每组内均被观察到强荧光,转染前后细胞形态无改变。免疫印迹技术分析蛋白表达,结果表明在3个实验组中,sh3组timp-1蛋白表达最低。3、制备ccl4损伤大鼠肝纤维化模型肝组织苏木精-伊红染色显示:正常大鼠肝小叶结构清晰,无炎症坏死及纤维化;ccl4注射4周可见纤维结缔组织大量增生,形成广泛纤维间隔伴有小叶结构紊乱,假小叶形成。4、静脉注射转染基因治疗大鼠肝纤维化组织学检测结果:肝组织切片中,空白组大鼠肝内胶原纤维在汇管区和中央静脉区增生明显,并向肝实质内延伸,相互联接形成假小叶;实验组大鼠肝脏内部纤维化水平减轻显着,虽然仍有假小叶,但是小叶四周与内部的胶原纤维量显着降低,肝小叶形态基本正常,肝细胞外基质（ecm）排列与正常相似;对照组介于两者之间。免疫组化检测结果:正常组肝组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原主要分布在汇管区,呈褐色,阳性染色区域少;移植4周后对照组Ⅰ、Ⅲ胶原染色显示褐色区域穿插在脂肪变性细胞间,树枝状分布,染色区域明显增多;timp-1-shrna-bmscs组Ⅰ、Ⅲ胶原染色仍在脂肪变性区域,但褐色区域明显减少;bmscs组Ⅰ、Ⅲ胶原染色区域在对照组和实验组间。免疫组化半定量分析结果:正常组和对照组、bmscs组、timp-1-shrna-bmscs组Ⅰ型胶原比较f值分别为0.8899、0.6883、0.3912（p均<0.01）;对照组和bmscs组、timp-1-shrna-bmscs组Ⅰ型胶原比较f值分别为0.2017、0.4988（p均<0.01）;bmscs组和timp-1-shrna-bmscs组Ⅰ型胶原比较f值为0.2971（p<0.01）。正常组和对照组、bmscs组、timp-1-shrna-bmscs组Ⅲ型胶原比较f值分别为0.79853、0.5978、0.3993（p均<0.01）;对照组和bmscs组、timp-1-shrna-bmscs组Ⅲ型胶原比较f值分别为0.1874、0.3859（p均<0.01）;bmscs组和timp-1-shrna-bmscs组Ⅲ型胶原比较f值为0.1985（p<0.01）。经移植治疗后,timp-1-shrna-bmscs组胶原含量明显减少,纤维化程度减轻。血清学检测结果:全自动生化分析仪检测各组大鼠肝功能指标显示:timp-1-shrna-bmscs组、bmscs组和对照组alt、ast水平均显着高于正常对照组（p<0.01）,timp-1-shrna-bmscs组和bmscs组alt、ast水平低于对照组（p<0.05）,timp-1-shrna-bmscs组alt下降明显（（p<0.01））。【结论】1、通过mscs贴壁性质,在体外环境下成功分离、培养和扩增了大鼠骨髓mscs,鉴定符合bmscs的生物学特性,为进一步行干细胞研究奠定基础。2、设计并成功地合成了3组沉默大鼠timp-1基因的短发夹rna,通过慢病毒包装系统成功构建沉默timp-1基因的3组骨髓间充质干细胞株,而且在3组细胞株中成功筛选出沉默TIMP-1基因效率最高的细胞株。3、成功建立CCl4损伤大鼠肝纤维化模型,用于肝纤维化基础及临床研究。4、移植沉默TIMP-1-shRNA基因的BMSCs,比单纯BMSCs移植更能改善肝脏功能,减少ECM在肝脏异常沉积及减轻肝纤维化程度。可能成为治疗肝纤维化的新方法。
王丽娟[9]（2014）在《薯蓣皂苷逆转阿霉素多药耐药、增加甲氨蝶呤吸收的分子药理学机制》文中指出多药耐药是癌症化疗成功的主要障碍,而癌细胞能对结构各异机制不相关的药物产生耐药性,一个主要的原因就是多药耐药（multidrug resistance,MDR）,多药耐药和药物外排转运体MDR1（multidrug resistance 1,MDR1）过表达相关。MDR1是一个被多药耐药1基因编码的170KD的膜糖蛋白,是ATP依赖的具有药物外排功能的转运蛋白。在肿瘤细胞中,MDR1泵出抗癌药物导致肿瘤细胞产生耐药性,NF-κB（nuclear factor κ-B,NF-κB）是作为转录因子介导MDR1导致耐药的蛋白复合物。NF-κB的激活需要IκB-α的磷酸化,即p-IκB-α（phosphorylation of inhibitor κB-α,p-IκB-α）显着的增加导致 NF-κB 激活。克服MDR1介导的耐药性可以通过阻碍外排泵的功能和抑制它的表达来实现。因此,抑制MDR1介导的药物外排将引起化疗药治疗的多药耐药癌细胞的复敏,可以被认为是对具有多药耐药癌症患者的有效治疗方法。目前,临床上的一些抗癌药如生物碱、蒽环类抗生素和表鬼臼毒素很容易产生多药耐药,因此急需开发有效的多药耐药逆转剂。另外,大剂量甲氨蝶呤可以达到常规化疗剂量、化疗方案作用不到的盲区部位,从而提高化疗的效果,但甲氨蝶呤具有潜在的细胞毒性,且剂量越大,出现不良反应的机会越大,会引起胃肠道黏膜损伤,表现出恶心、胀气、呕吐、厌食、腹泻和腹痛等症状,导致患者的体重下降和营养不良。甲氨蝶呤是MDR1的底物,寻找一种多药耐药的抑制剂,抑制MDR1,在降低甲氨蝶呤的剂量的同时提高甲氨蝶吟的小肠吸收,可以有效减轻甲氨蝶呤致消化道黏膜炎。薯蓣皂苷是一个天然药物的有效成分,广泛存在于一些药用植物中,如穿龙薯蓣、盾叶薯蓣和山药中,药理学研究已证实这个化合物具有抗氧化、降脂、抗癌、保肝的作用,而且是合成甾体激素类药物的重要原料,因此含此类成分生药的应用前景十分广阔。多药耐药机制的研究依赖于对经过选择的且对广谱抗癌药存在交叉反应性的癌细胞系的分析。已有研究结果证实,薯蓣皂苷能逆转肝癌细胞HepG2对阿霉素（adriamycin,ADR）的耐药性,其在白血病和乳腺癌中对阿霉素的耐药和甲氨蝶呤吸收的影响还未见报道。我们利用了一个阿霉素敏感的白血病细胞系（Human doxorubicin-sensitive erythroleukemic cells,K562 cells）、来源亲本细胞 K562 的阿霉素耐药的细胞系（Human doxorubicin-res的磷酸化抑制了 NF-κB的活性进而下调了 MDR1的表达。istant erythroleukemic cells,K562/ADR cells）、表达分化的小肠细胞特征的细胞系（human colon adenocarcinoma cells,Caco-2 cells）、一个阿霉素敏感乳腺癌细胞系（human adriamycin-sensitive breast cancer cells,MCF-7 cells）、来源亲本细胞MCF-7的阿霉素耐药的细胞系（human adriamycin-resistant breast cancer cells,MCF-7/ADR cells）等肿瘤细胞模型和大鼠小肠来研究薯蓣皂苷对阿霉素耐药和甲氨蝶呤吸收的影响,旨在阐明此效果及其分子药理学机制即薯蓣皂苷对MDR1表达的影响及MDR1的表达和NF-κB信号通路的关系。第一部分 薯蓣皂苷对人白血病细胞K562/ADR多药耐药的逆转效果及分子药理学机制目的:研究薯蓣皂苷对白血病细胞多药耐药的逆转效果,探讨薯蓣皂苷逆转白血病细胞多药耐药的分子药理学机制。方法:以人红白血病细胞系K562及其阿霉素耐药细胞系K562/ADR为研究对象,采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（噻唑蓝）（3-（4,5-Dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphe-nyltetrazolium bromide,MTT）法检测细胞毒性作用;以流式细胞术测定两种细胞系内薯蓣皂苷对阿霉素细胞内蓄积的影响来反映薯蓣皂苷对MDR1外排功能的影响;Western Blotting检测MDR1、phospho-IκB-α的蛋白表达水平;Quantitative PCR法检测MDR1的mRNA表达水平;双荧光素酶报告分析系统检测MDR1和NF-κB启动子活性。结果:与K562细胞系相比,K562/ADR耐药细胞系中MDR1的mRNA和蛋白均高表达,且耐药细胞中的阿霉素细胞内潴留减少。薯蓣皂苷对K562和K562/ADR表达出大致相同的细胞毒性,由此计算出薯蓣皂苷无毒性的浓度即IC10（10%inhibiting concentration,IC10）为0.3 μM。此浓度的薯蓣皂苷显着增加了阿霉素在耐药细胞中的蓄积,导致阿霉素在耐药细胞中的IC50（50%inhibiting concentration,IC50）值由42.4±2.6 μM减少到2.4±0.1 μM,即薯蓣皂苷显着增加了阿霉素的细胞毒性,表明薯蓣皂苷通过增加阿霉素在耐药细胞内的蓄积增加了阿霉素的细胞毒性。而且,薯蓣皂苷呈浓度依赖性和时间依赖性抑制了 K562/ADR细胞的MDR1的mRNA和蛋白的表达,表明薯蓣皂苷通过抑制MDR1的表达增加了阿霉素的细胞内蓄积进而逆转了阿霉素的耐药。另外,薯蓣皂苷抑制了 MDR1和核因子NF-κB的启动子活性以及IκB-α的磷酸化,表明薯蓣皂苷通过抑制IκB-α的磷酸化抑制了 NF-κB的活性进而下调了 MDR1的表达。结论:薯蓣皂苷在白血病细胞K562/ADR中通过抑制NF-κB信号通路抑制了MDR1转运体,恢复阿霉素的敏感性,逆转了白血病细胞的耐药,表明薯蓣皂苷和阿霉素合用能有效提高白血病的治疗效果,薯蓣皂苷可能是一个新的多药耐药逆转剂和潜在的肿瘤化疗辅助剂。第二部分 薯蓣皂苷对甲氨蝶呤吸收的影响及其分子药理学机制目的:研究薯蓣皂苷在体内外对甲氨蝶呤吸收的增强效果,探讨其分子药理学机制。方法:利用MTT法分析薯蓣皂苷在Caco-2细胞对甲氨蝶呤细胞毒性的影响,Caco-2细胞双向转运实验分析薯蓣皂苷对甲氨蝶呤转运的影响,体外翻转肠和原位肠灌注实验考察薯蓣皂苷对甲氨蝶吟体内外吸收的影响,液相色谱串联质谱（chromatography andem mass spectrometry,LC-MS/MS）方法测定生物样品中甲氨蝶呤的浓度,大鼠小肠切片病理学检查考察薯蓣皂苷对甲氨蝶呤诱导的肠道粘膜损伤的影响,Western blotting、Quantitative RT-PCR（Quantitive Real Time-polymerase chain reaction,Quantitative RT-PCR）、双荧光素酶报告基因分析系统等分子生物学技术考察薯蓣皂苷对甲氨蝶呤吸收影响的分子药理学机制。结果:薯蓣皂苷在Caco-2细胞中72小时细胞毒性作用最明显,72小时作为整个试验的检测时间。用甲氨蝶呤和薯蓣皂苷处理72小时后,仅有甲氨蝶呤和薯蓣皂苷+甲氨蝶呤的IC50值分别是19.5±0.9 μM和7.7±0.1μM,也就是合用薯蓣皂苷减少了甲氨蝶呤的IC50值,表明薯蓣皂苷增加了甲氨蝶呤在Caco-2细胞的毒性。薯蓣皂苷还增加了甲氨蝶吟在吸收方向的转运,减少了甲氨蝶吟在分泌方向的转运,显着抑制了 Caco-2细胞中MDR1的mRNA和蛋白的表达,表明薯蓣皂苷通过抑制Caco-2细胞中MDR1的表达,增加了甲氨蝶呤的吸收方向的转运。而且,薯蓣皂苷抑制了 MDR1和NF-κB启动子的活性以及IκB-α的磷酸化,表明薯蓣皂苷通过抑制IκB-α的磷酸化抑制了 NF-κB信号通路,进而下调了 MDR1的表达,增加了甲氨蝶呤的转运。薯蓣皂苷体内外通过下调MDR1的表达增加了甲氨蝶呤的小肠吸收。另外,尽管甲氨蝶呤吸收进入了肠细胞,但没有观察到毒性的增加,而且,事实上,观察到毒性减少了。结论:薯蓣皂苷通过抑制NF-κB信号通路抑制Caco-2细胞MDR1转运体,增加甲氨蝶吟吸收方向上的转运,在大鼠中薯蓣皂苷通过抑制MDR1转运体,体内外增加了甲氨蝶呤的小肠吸收,但没有增加甲氨蝶呤诱导的肠道粘膜损伤,表明薯蓣皂苷在降低甲氨蝶呤剂量的同时可能提高其治疗效果,其可能作为甲氨蝶呤吸收的多药耐药调节剂。第三部分 薯蓣皂苷对乳腺癌细胞及其耐药细胞的增敏效果及其分子药理学机制目的:研究薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞中对阿霉素活性的增敏效果及其分子药理学机制。方法:利用MTT分析在人乳腺癌细胞MCF-7及其耐药细胞系MCF-7/ADR薯蓣皂苷本身的毒性及薯蓣皂苷对阿霉素活性的影响,Western blotting、Quantitative RT-PCR、双荧光素酶报告基因分析系统等分子生物学方法来检测其分子药理学机制。结果:薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞的IC50分别是6.5±0.4μM和7.3±0.2μM,即薯蓣皂苷对药物敏感的亲本乳腺癌细胞和多药耐药乳腺癌细胞具有大致相同的抗性,由此得出薯蓣皂苷对MCF-7/ADR和MCF-7细胞没有毒性的浓度,即IC10,均为0.4±0.1μM。0.4μM的薯蓣皂苷分别将MCF-7和MCF-7/ADR细胞中IC50 值由 1.5±0.1μM 和 34.7±1.1μM 减少到 0.4±0.1 和 0.7±0.1μM,表明薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞均有增加阿霉素细胞毒性的效果。薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞均呈浓度依赖性和时间依赖性抑制了 MDR1的mRNA和蛋白的表达,表明薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞均是通过抑制MDR1增加阿霉素细胞内的毒性。而且,薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞均抑制了 MDR1和NF-κB启动子的活性和IκB-α的磷酸化,表明薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞均通过抑制IκB-α的磷酸化抑制了 NF-κB信号通路进而下调了 MDR1的表达增加了阿霉素细胞内的毒性。结论:薯蓣皂苷通过抑制NF-κB信号通路下调药物转运体MDR1的表达,增加了 MCF-7和MCF-7/ADR细胞中阿霉素的化学敏感性,表明薯蓣皂苷和阿霉素合用能有效提高乳腺癌的治疗效果,这一发现为薯蓣皂苷作为化疗辅助剂进一步临床应用提供了又一有力的证据。
岑彦艳[10]（2012）在《新型放射增敏剂CpG ODN107的临床前药代动力学研究》文中研究表明脑胶质瘤（gliomas）是世界上发病率最高的脑肿瘤，发病率为十万分之十二。由于脑恶性胶质瘤浸润性很强，手术切除率很低，术后高复发，临床上的标准治疗方法是采用手术切除加术后放射治疗。但是，由于大多数胶质瘤对放射线不敏感或者放射治疗一段时间后对放射线的敏感性降低，即使提高照射剂量仍不能取得满意疗效。因此，研制高效的放射增敏剂，增加射线对肿瘤细胞的杀伤作用，对提高脑胶质瘤的治愈率、延长生存期具有重要意义。含有未甲基化CpG的寡核苷酸片段（CpG oligonucleotides，CpG ODN/CpG DNA）是具有免疫激活作用的寡核苷酸，有文献报道，CpG ODN可以提高肺癌、恶性脑胶质瘤组织对化疗和放疗的敏感性，可增加单次放疗和分次放疗中射线对肿瘤的杀伤作用，具有化疗和放射增敏作用。含12个碱基的硫代寡核苷酸CpG ODN107（CpGoligonucleotide107，5’-TGGCGCGGGGCG-3’）是本实验室经早期筛选的对肿瘤有放射增敏作用的CpG ODN。 CpG ODN107在体内、外的药效学研究均表明CpG ODN107联合射线可抑制肿瘤生长，诱导脑胶质瘤细胞自噬性死亡，延长动物生存时间。CpGODN107作为治疗脑胶质瘤新型放射增敏剂，合成方法简单、毒性低、质量可靠、放射增敏效果显着，研发成功将为脑胶质瘤患者带来福音，并将产生巨大的社会效益和经济效益。本研究项目是国家“重大新药创制”科技重大专项“放射增敏剂候选药物CpGODN107的研究”（2009ZX09103-051）的重要研究内容之一，通过研究CpG ODN107在动物体内的吸收、分布、代谢、排泄过程，阐明其在动物体内的药代动力学特征，为该药物的药效学、毒理学研究以及临床新药报批提供资料，同时也为其他此类化合物的药代动力学研究提供方法参考和新的研究思路。主要研究内容与方法：一、生物样品中CpG ODN107及其代谢物的检测方法建立通过优化和改良色谱和质谱条件，建立高效液相色谱-三重四级杆质谱联用（LC-MS/MS）的方法测定血浆中CpG ODN107及其代谢物（链缩短序列3′N-1、3′N-2、3′N-3和5′N-1）的浓度，并进行方法学确证，包括方法的专属性、灵敏度、定量线性范围、日内及日间精密度、准确度、回收率、样品稳定性和基质效应的考察。在此基础上，针对不同生物样本，如尿、粪、胆汁和组织均浆液，进行药物提取方法的再优化，建立不同生物样品中CpG ODN107药物浓度的测定方法，并进行部分方法学确证。二、CpG ODN107及其代谢物的血浆动力学特征描绘小鼠单次静脉注射四个剂量（2.5、5、10和15mg/kg）的CpG ODN107血药浓度—时间曲线图，以及小鼠单次静脉注射15mg/kg CpG ODN107的代谢物的血药浓度—时间曲线图，采血时间点为给药前和给药后2min、5min、15min、30min、60min、120min、180min、240min、360min、540min和720min；通过房室模型拟合和统计矩的方法计算CpG ODN107在四个给药剂量以及代谢物在15mg/kg给药剂量下的相关药代动力学参数；确定CpG ODN107在四个给药剂量是否存在AUC和Cmax依赖于成正比增高的线性药代动力学。三、CpG ODN107的分布特征①选择高、中、低三个剂量浓度的药物分别与空白小鼠、人血浆以及人血清白蛋白、等孵育，采用超过滤法，经LC-MS/MS检测含量，研究CpG ODN107与不同种属血浆蛋白的结合情况；②选择5mg/kg剂量组，小鼠尾静脉注射给药，在给药后0.5h、1h、2h、4h、10h、24h处死，解剖，提取肝、心、脑、脾、肺、肾、肠、肌肉、生殖腺等重要组织、器官药物，LC-MS/MS药测定物浓度，研究CpG ODN107在各组织器官中的分布特征；③脑内注射荧光标记的CpG ODN107，通过小动物活体荧光成像方法研究CpG ODN107在脑中的分布特征。四、CpG ODN107的排泄特征选择5mg/kg的给药剂量，经尾静脉注射，在小鼠体内分段收集24h的粪、尿；选择3.5mg/kg的给药剂量，经尾静脉注射，在大鼠体内分段收集24h的粪、尿和胆汁；生物样品经处理后LC-MS/MS测定药物的浓度，研究CpG ODN107在尿、粪和胆汁中的排泄特征。主要研究结果：一、生物样品中CpG ODN107及其代谢物的LC-MS/MS检测方法建立和确证优化了CpG ODN107及其代谢物的LC-MS/MS测定条件；改进在血浆和组织中CpG ODN107的提取方法，血浆、尿、粪、胆汁样本经酚仿液-液萃取结合固相萃取提取药物，组织样本经DNA提取试剂盒去除内源性核苷酸后再经固相萃取提取药物；以15个T碱基构成的硫代序列为内标，以乙腈：0.05%氨溶液=20：80为流动相，分析柱为Extend C18柱（150mm×2.1mm,3.5μm），以高纯氮气作为干燥气，ESI源负离子扫描，MRM检测方式进行检测。CpG ODN107在血浆中20～5000ng/mL浓度范围内线性关系良好，在尿、胆汁中20～4000ng/mL浓度范围内线性关系良好，在组织中0.1～40μg/g浓度范围内线性关系良好。3′N-1、3′N-2、3′N-3和5′N-1四种代谢物在血浆中10～2500ng/mL浓度范围内线性关系良好。本方法专属性强、线性关系良好，灵敏度、精密度、准确度均符合《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》的要求，可进行体内药物分析。二、CpG ODN107以及代谢物的血浆动力学特征小鼠单次静脉注射四个剂量（2.5、5、10和15mg/kg）CpG ODN107后，经DAS软件进行房室模型拟合，结果表明CpG ODN107在小鼠体内药动学过程符合静脉注射的三室模型；统计矩法计算得到平均滞留时间MRT（0-t）分别为48.37、58.94、54.19和53.74min；CL分别为0.013、0.012、0.013和0.005L/min/kg；梯形法计算得到的药时曲线下面积AUC（0-t）分别为185974.8，412136.3和732853.5ng/mL*min。AUC0-t和Cmax的线性分析结果表明，CpG ODN107在小鼠体内呈现非线性动力学的特征。小鼠单次静脉注射15mg/kg CpG ODN107后，在血浆中很快检测到3′N-1、3′N-2、3′N-3和5′N-1四种代谢物，其AUC（0–t）分别为215957.9、116663.0、64572.2和105595.5ng/mL*min，MRT（0–t）分别为35.2、78.0、118.2和70.3min。采用AUCm/AUCp表示代谢物相当量，3′N-1、3′N-2、3′N-3和5′N-1分别为6.93%，3.75%，2.07%和3.39%，血浆中主要代谢物为3′N-1。三、CpG ODN107的分布特征①采用超滤法分别测定了CpG ODN107与人、小鼠血浆以及人血浆白蛋白（HAS）的蛋白结合率，结果表明CpG ODN107与各种属来源的血浆蛋白结合率均较高（>96%）。CpG ODN107与HAS的结合率>90%，说明在人血浆中主要与白蛋白结合，并且随着药物浓度的增加，与白蛋白的结合出现饱和现象。②小鼠5mg/kg尾静脉注射CpG ODN107后，主要分布在肝、肾和脾组织。CpGODN107按在给药0→24h的AUC排序由大到小依次为：肝＞肾＞脾＞肌肉＞心＞肺＞睾丸＞肠＞脑。在脑组织中未检测到CpG ODN107，说明其不容易通过血脑屏障。从整个分布情况看，CpG ODN107在肝中浓度较其他组织高，分布与消除均较快；给药后1小时，CpG ODN107在肾脾中的分布在1小时最多，可能与其在肾脏中排泄有关；CpG ODN107在心、肌肉、肺、肠和睾丸组织中分布均较低，在肺中消除最慢。③小鼠0.25mg/kg脑内注射CpG ODN107后，药物主要分布在进针位置，4h可观察到CpG ODN107扩散到整个脑组织，给药48h后仍未完全消除。四、CpG ODN107的排泄特征研究结果表明，该药是以原型药物和缩短的寡核苷酸的形式从小、大鼠体内排泄掉，尿排泄为主要排泄途径。静脉给药24h内，CpG ODN107在小鼠尿和粪中总共排泄的全长序列的量占总给药量的2.70%，尿和粪分别为1.79%，0.91%，以尿排泄为主；CpG ODN107在大鼠尿和粪中总共排泄的全长序列的量占总给药量的0.84%，尿和粪分别为0.63%，0.21%，以尿排泄为主；大鼠胆汁中均未检测出CpG ODN107。研究结论：1.建立了多种生物样品中CpG ODN107和代谢物含量的LC-MS/MS的测定方法。所建方法专属性强、线性关系良好、灵敏度、精密度和准确度均能满足药代动力学研究的要求。2. CpG ODN107在小鼠体内的药代动力学性质符合三室模型，在体内消除过程属于非线性药代动力学；3′N-1是血浆中主要代谢物，代谢物的在血浆中动力学变化趋势与原型药物相似。3. CpG ODN107与不同种属来源的血浆蛋白结合大于96%，主要与白蛋白结合，随药物浓度增加结合呈现饱和性；血管内给药后CpG ODN107主要分布在肝、肾和脾组织，分布与消除快，脑中未见分布；脑内给药后，CpG ODN107主要分布在给药部位的脑组织，且消除慢。4. CpG ODN107在小鼠、大鼠体内，药物以原型药和链缩短的寡核苷酸的形式排泄。尿排泄为主要途径，胆汁中排泄量极低，未能检测到。
二、抑制TIMP-1的硫代反义寡核苷酸在肝纤维化大鼠体内生物学分布及药代动力学研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、抑制TIMP-1的硫代反义寡核苷酸在肝纤维化大鼠体内生物学分布及药代动力学研究（论文提纲范文）
（1）CCL4诱导小鼠肝纤维化模型基因芯片整合分析及核心基因的筛选验证研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 综述 肝纤维化基因诊断及治疗技术的研究进展 |
| 2.1 肝纤维化的基因诊断 |
| 2.1.1 传统肝纤维化诊断方法 |
| 2.1.2 MiRNA与肝纤维化进展的关系 |
| 2.2 肝纤维化的基因治疗策略 |
| 2.2.1 反义寡核苷酸(Antisense oligodeoxynucleotides,ODNs)治疗策略 |
| 2.2.2 基于siRNA(Small interfering RNA)的治疗 |
| 2.2.3 基于miRNA的治疗 |
| 2.2.4 LncRNA在肝硬化基因治疗中扮演的角色 |
| 2.2.5 诱饵ODN疗法 |
| 2.2.6 三股螺旋结构寡核苷酸 (triplehehx forming oligonucleotide,TFO) 策略 |
| 2.3 总结 |
| 第3章 材料和方法 |
| 3.1 基因芯片分析方法和步骤 |
| 3.1.1 筛选差异表达基因 |
| 3.1.2 GO分析和KEGG通路富集分析 |
| 3.1.3 蛋白质-蛋白质互作网络分析和筛选核心基因 |
| 3.2 主要实验器材与试剂 |
| 3.2.1 实验器材 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 实验动物及给药方案 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 RNA提取 |
| 3.3.2 PCR验证 |
| 第4章 结果 |
| 4.1 肝硬化差异表达基因筛选 |
| 4.2 肝硬化差异表达基因GO分析 |
| 4.3 肝硬化差异表达基因信号通路分析 |
| 4.4 核心基因和信号通路的蛋白蛋白互作分析(PPI)和模块分析 |
| 4.5 核心基因表达水平变化 |
| 第5章 讨论 |
| 第6章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用（论文提纲范文）
| 提要 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 文章缩略词表 |
| 引言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 TGF-β的概述 |
| 1.1.1 TGF-β的来源 |
| 1.1.2 TGF-β的表达 |
| 1.1.3 TGF-β的结构 |
| 1.1.4 TGF-β的信号通路 |
| 1.2 TGF-β的生物学活性 |
| 1.2.1 TGF-β对胚胎发育的调节 |
| 1.2.2 TGF-β对免疫应答的负向调节 |
| 1.2.3 TGF-β2对肿瘤的生长,侵袭及迁移的促进作用 |
| 1.2.4 TGF-β对组织损伤修复、创面愈合、瘢痕增生的促进作用及炎症反应的抑制作用 |
| 1.2.5 TGF-β2对纤维化的调节作用 |
| 1.2.6 TGF-β对肿瘤的抑制作用 |
| 1.3 靶向TGF-β2的药物 |
| 1.3.1 TGF-β2的反义寡核苷酸 |
| 1.3.2 TGF-β2的micro RNA |
| 1.3.3 TGF-β2的sh RNA |
| 1.3.4 TGF-β2的抗体 |
| 1.3.5 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
| 1.3.6 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
| 1.3.7 TGF-β2的抑制剂 |
| 1.4 疫苗佐剂的概述及其研究进展 |
| 1.4.1 增强第一信号的佐剂 |
| 1.4.2 增强第二信号的佐剂 |
| 1.4.3 增强第三信号的佐剂 |
| 1.4.4 抑制T细胞抑制信号的佐剂 |
| 1.4.5 改善肿瘤免疫抑制微环境的佐剂 |
| 1.4.6 病毒载体佐剂 |
| 1.4.7 其他佐剂 |
| 1.4.8 多佐剂肿瘤疫苗 |
| 1.4.9 佐剂的接种途径 |
| 1.4.10 佐剂发挥作用的机制 |
| 1.5 RNA靶向性寡核苷酸的研究进展 |
| 1.5.1 反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide) |
| 1.5.2 siRNA |
| 1.5.3 micro RNA |
| 1.5.4 反义寡核苷酸的化学修饰方法 |
| 第2章 材料方法 |
| 2.1 ODN及引物 |
| 2.2 实验试剂,仪器与耗材 |
| 2.3 细胞与细胞系 |
| 2.4 实验动物 |
| 2.5 IAV的扩增 |
| 2.6 IAV TCID50 的测定 |
| 2.7 IAV血凝效价的测定 |
| 2.8 聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 2.9 小鼠PBMC、脾脏及淋巴结单细胞悬液的制备 |
| 2.10 TIO对 TGF-β2 m RNA表达的抑制实验 |
| 2.11 流式细胞术(Flow cytometry) |
| 2.12 蛋白免疫印迹实验(Western Blotting analysis) |
| 2.13 免疫荧光技术 |
| 2.14 TIO在小鼠器官和组织中的分布检测 |
| 2.15 小鼠的免疫 |
| 2.15.1 疫苗的制备 |
| 2.15.2 小鼠的免疫和血清的收集 |
| 2.16 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.17 流感病毒攻毒实验 |
| 2.18 小鼠肺组织的病理学观察 |
| 2.19 脑胶质瘤细胞裂解物(TCL)的制备 |
| 2.20 GL261脑胶质瘤原位模型的建立 |
| 2.21 脑胶质瘤预防模型的建立 |
| 2.22 脑胶质瘤治疗模型的建立 |
| 2.23 肿瘤周围浸润的炎性细胞的检测 |
| 2.24 肿瘤组织病理分析 |
| 2.25 胃癌背部移植瘤模型的建立 |
| 2.26 统计学分析 |
| 第3章 研究结果 |
| 3.1 靶向TGF-β2的反义寡核苷酸的设计与筛选 |
| 3.2 TIOs对 RAW264.7 细胞,U-937 细胞及CAL-1 细胞表达TGF-β2的影响 |
| 3.2.1 TIOs对 IL-4 诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 m RNA表达的影响 |
| 3.2.2 TIOs对 IL-4诱导的RAW264.7细胞Arg1及TNF-αmRNA表达的影响 |
| 3.2.3 TIOs对 LPS诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 mRNA表达的影响 |
| 3.2.4 TIOs对 LPS诱导的U-937 细胞表达TGF-β2 mRNA的影响 |
| 3.2.5 TIOs对甲型流感病毒(IAV)诱导的CAL-1 细胞TGF-β2mRNA表达的影响 |
| 3.2.6 TIOs对 IL-4/LPS诱导的RAW264.7/U-937细胞表达TGF-β2蛋白的影响 |
| 3.3 TIO3在细胞和组织中的分布 |
| 3.4 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
| 3.4.1 TIOs对微生物疫苗诱导的抗体产生水平的影响 |
| 3.4.2 TIO3对流感病毒疫苗诱导的抗流感病毒效率的增强作用 |
| 3.4.3 TIO1和TIO3 的微生物疫苗佐剂效应的可能机制 |
| 3.4.4 TIOs的微生物疫苗佐剂的安全性评价 |
| 3.5 TIO的胶质瘤疫苗的佐剂作用 |
| 3.5.1 TIOs为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗对原位接种脑胶质瘤预防模型小鼠的影响 |
| 3.5.2 TIOs为佐剂的胶质瘤疫苗对原位接种胶质瘤治疗模型小鼠生存期的影响 |
| 3.6 单独应用TIO3的抗胶质瘤及抗胃癌作用 |
| 3.6.1 单独应用TIO3对脑胶质瘤原位移植瘤模型小鼠生存期的影响 |
| 3.6.2 单独应用TIO3对胃癌背部移植瘤模型小鼠体重、肿瘤大小及生存期的影响 |
| 3.6.3 单独应用TIO3对胃癌细胞腹腔种植模型小鼠生存期的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
| 4.1.1 TIO3对CD4~+T细胞表面s TGF-β2 表达的抑制作用 |
| 4.1.2 TIO3 对 CD19~+ B 细胞表面 sTGF-β2 表达的抑制作用 |
| 4.1.3 TIO3的药效动力学分析 |
| 4.1.4 TIO1,TIO2及TIO3 的不同功效的机理分析 |
| 4.1.5 TIO3用于微生物疫苗佐剂的副作用分析 |
| 4.1.6 TIO3用于微生物疫苗佐剂的可行性分析 |
| 4.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应 |
| 4.2.1 TIO3 对胶质瘤细胞MHC I分子表达的上调作用 |
| 4.2.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应的机理分析 |
| 4.3 单独应用TIO3的抗胶质瘤和抗胃癌作用 |
| 4.4 总结和展望 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 附录1 |
| 附录2 The College of Basic Medical Sciences of Jilin University Ethics Committee Approval Form |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（3）miR-222调控MMP1干预增生性瘢痕成纤维细胞增殖的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 miR-222在HS成纤维细胞中的表达特征的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第二部分 miR-222过表达对HS成纤维细胞生物学特性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 第三部分 miR-222促进HS成纤维细胞增殖相关分子机理的探讨 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 英文缩写注解 |
| 全文小结 |
| 攻读博士学位期间成果 |
| 致谢 |
（4）肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体抗肝纤维化的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体的制备及评价研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体对BSA致大鼠肝纤维化的保护作用研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与材料 |
| 1.2 CPhGs脂质体的制备方法 |
| 1.3 空白脂质体的制备 |
| 1.4 肝纤维化大鼠模型的建立与分组 |
| 1.5 血清肝功能指标的检测 |
| 1.6 血清TGF-β、肝纤四项及肝组织HYP检测 |
| 1.7 肝组织标本大体观 |
| 1.8 肝组织病理学检测 |
| 1.9 免疫组化 |
| 1.10 聚合酶链式反应 |
| 1.11 蛋白免疫印迹 |
| 1.12 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体对HSCs增殖、凋亡、周期的影响及分子机制研究 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 仪器与材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（5）胡黄连苦苷Ⅰ抗肝纤维化作用及药代动力学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词 |
| 引言 |
| 1 研究背景和依据 |
| 2 目的意义 |
| 3 主要技术路线图 |
| 第一章 胡黄连苦苷Ⅰ抗肝纤维化作用药效研究 |
| 1 仪器与材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 实验动物 |
| 2 方法与结果 |
| 2.1 动物分组 |
| 2.2 造模与给药 |
| 2.3 肝功能检测 |
| 2.4 肝纤维四项检测 |
| 2.5 组织切片 |
| 3 小结与讨论 |
| 第二章 胡黄连苦苷Ⅰ抗肝纤维化作用的代谢组学研究 |
| 1 仪器与材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 样本 |
| 2 方法与结果 |
| 2.1 样品预处理 |
| 2.2 液质联用分析 |
| 2.3 数据预处理 |
| 2.4 主成分分析 |
| 2.5 正交偏最小二乘判别分析 |
| 2.6 差异代谢物 |
| 3 小结与讨论 |
| 第三章 胡黄连苦苷Ⅰ抗肝纤维化作用的蛋白质组学研究 |
| 1 仪器与材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 样本 |
| 2 方法与结果 |
| 2.1 蛋白质提取、酶解和标记 |
| 2.2 高pH反相液相色谱分离 |
| 2.3 低pH纳升液质联用分析 |
| 2.4 蛋白质定性与定量分析 |
| 2.5 差异表达蛋白筛选 |
| 2.6 生物信息学分析 |
| 2.7 蛋白质印记 |
| 2.8 定量PCR |
| 2.9 组学联合 |
| 3 小结与讨论 |
| 第四章 胡黄连苦苷Ⅰ的药物代谢动力学研究 |
| 1 仪器和材料 |
| 1.1 仪器 |
| 1.2 材料 |
| 1.3 实验动物 |
| 2 方法与结果 |
| 2.1 样品采集 |
| 2.2 药动学研究 |
| 2.3 代谢产物研究 |
| 3.小结与讨论 |
| 3.1 药物动力学研究 |
| 3.2 药物代谢产物研究 |
| 总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 附录一 文献综述 环烯醚萜类天然药物抗肝纤维化的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录二 攻读硕士期间发表论文情况 |
| 附件 |
（6）肝纤维化特异性诊断TTR分子探针制备与初步实验结果（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 细胞培养及大鼠肝纤维化模型建立 |
| 2.2 构建针对TTR mRNA的 TTR-ASO分子探针主体 |
| 2.3 荧光实验评估细胞对TTR-ASO分子探针主体的摄取及时间特异性 |
| 2.4 免疫印迹(Western blotting)评估TTR-ASO分子探针主体对肝细胞TTR基因靶向性 |
| 2.5 ~(18)F正电子核素标记TTR-ASO制备[18F]TTR-ASO分子探针 |
| 2.6 大鼠PET-CT扫描程序及图像处理分析 |
| 2.7 病理及免疫组织化学检查 |
| 2.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 细胞对TTR-ASO分子探针主体的摄取及时间特异性 |
| 3.2 TTR-ASO分子探针主体对肝细胞TTR基因靶向性 |
| 3.3 [~(18)F]TTR-ASO分子探针在大鼠PET-CT扫描及结果分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）用于治疗慢性阻塞性肺病的二烯丙基二硫醚和左旋薄荷醇复方制剂的初步成药性评价（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 综述 |
| 第一章 大蒜挥发性含硫有机化合物的药理活性及治疗慢性阻塞性肺病的理论基础 |
| 一 COPD发病机制及药物应用现状 |
| 1 COPD定义及临床表现 |
| 2 COPD发病机制 |
| 3 COPD治疗药物研究进展 |
| 二 用于治疗COPD的大蒜挥发性有机硫化物筛选 |
| 1 大蒜挥发性有机硫化物的来源及药理活性 |
| 2 DADS药理活性及治疗COPD的理论基础 |
| 三 L-menthol药理活性及作为DADS中和剂的筛选 |
| 四 大蒜有机硫化物生物转化 |
| 五 DADS、L-menthol对CYP450酶影响研究 |
| 1 代谢性药物相互作用的体外研究方法 |
| 2 大蒜有机硫化合物和左旋薄荷醇对Ⅰ相代谢酶的影响 |
| 六. 本论文研究思路 |
| 七 参考文献 |
| 第二部分 DADS、L-menthol体外抗炎活性研究 |
| 前言 |
| 第二章 基于Raw264.7细胞炎症模型的DADS、L-menthol抗炎活性研究 |
| 一 实验仪器与材料 |
| 1 实验仪器 |
| 2 药品与试剂 |
| 3 细胞来源 |
| 二 实验方法 |
| 1 细胞培养 |
| 2 SRB法检测细胞活率 |
| 3 Raw264.7炎症模型建立 |
| 4 DADS、L-menthol对LPS诱导产生的NO含量的影响 |
| 5 DADS、L-menthol对巨噬细胞吞噬中性红能力的影响 |
| 6 DADS、L-menhol对炎症细胞因子释放的影响 |
| 7 Western blot法检测细胞中的相关蛋白 |
| 三 实验结果 |
| 1 DADS、L-menthol对Raw264.7细胞活率的影响 |
| 2 Raw264.7炎症模型的建立 |
| 3 DADS、L-menthol减少Raw264.7炎症模型中NO的生成 |
| 4 DADS、L-menthol减弱Raw264.7巨噬细胞的吞噬功能 |
| 5 DADS、L-menthol抑制Raw264.7巨噬细胞的炎症因子释放 |
| 6 DADS、L-menthol抑制NF-κB并激活Nrf2信号通路 |
| 四 讨论 |
| 五 小结 |
| 第三章 基于HFL-1细胞模型的DADS、L-menthol活性研究 |
| 一 实验仪器与材料 |
| 1 实验仪器 |
| 2 药品与试剂 |
| 3 细胞株 |
| 二 实验方法 |
| 1 细胞培养 |
| 2 SRB法检测细胞活率 |
| 3 香烟烟雾提取物的制备 |
| 4 HFL-1炎症模型的建立 |
| 5 MMP-9、IMP-1细胞因子测定 |
| 6 Western blot法检测DADS、L-menthol对蛋白表达的影响 |
| 三 实验结果 |
| 1 DADS、L-menthol对HFL-1细胞活率的影响(SRB法) |
| 2 HFL-1炎症模型建立(CSE诱导法) |
| 3 DADS、L-menthol减弱HFL-1细胞MMP-9、TIMP-1的生成 |
| 4 DADS、L-menthol抑制MMP-9蛋白的表达 |
| 四 讨论 |
| 五 小结 |
| 六 参考文献 |
| 第三部分 不同给药途径下复方组分DADS、L-menhol体内抗COPD活性研究 |
| 前言 |
| 第四章 腹腔注射给药DADS、L-menthol在大鼠慢阻肺模型的抗COPD活性研究 |
| 一 实验仪器与材料 |
| 1 实验仪器 |
| 2 试剂与药品 |
| 3 实验动物 |
| 二 实验方法 |
| 1 大鼠慢性阻塞性肺病模型的建立 |
| 2 体重曲线、脾脏指数及肝脏指数的研究 |
| 3 血清、肺灌洗液的采集及炎症细胞分类计数 |
| 4 肺组织获取及肝、肺匀浆制备 |
| 5 肺组织形态学研究(HE染色法) |
| 6 ELISA法测定血清中的细胞因子 |
| 7 肺组织匀浆中氧化应激指标的检测 |
| 8 Westen blot法检测肺组织中的相关蛋白 |
| 9 免疫组织化学研究 |
| 10 统计分析 |
| 三 实验结果 |
| 1 DADS及L-menthol对大鼠体重、肝脏指数、脾脏指数的影响 |
| 2 DADS、L-menthol减少BALF白细胞总数和巨噬细胞数量 |
| 3 DADS、L-menthol改善COPD的肺气肿病理特征 |
| 4 DADS及L-menthol减弱COPD大鼠的炎症因子表达 |
| 5 DADS及L-menthol提高COPD大鼠的抗氧化能力并减弱氧化应激反应 |
| 6 Western Blot法考察DADS、L-menthol的分子生物学机制 |
| 7 免疫组化法测定相关蛋白的表达 |
| 四 讨论 |
| 五 小结 |
| 第五章 DADS、L-menthol吸入给药治疗COPD活性研究 |
| 前言 |
| 一 实验仪器与材料 |
| 1 实验仪器 |
| 2 试剂与药品 |
| 3 实验动物 |
| 二 实验方法 |
| 1 大鼠慢性阻塞性肺病模型的建立 |
| 2 肺灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)制备 |
| 3 ELISA法测定肺灌洗液中的MMP-9和IMP-1 |
| 4 肝、肺匀浆制备 |
| 5 ELISA法测定肺匀浆中的炎症细胞因子 |
| 6 组织匀浆中氧化应激指标的检测 |
| 7 肝匀浆中ALT、AST的测定 |
| 8 肺组织形态学研究 |
| 9 免疫组化法检测肺组织中的相关蛋白 |
| 三 实验结果 |
| 1 DADS与L-menthol吸入给药降低BALF中弹性蛋白酶-抗弹性蛋白酶失衡 |
| 2 DADS与L-menthol联合吸入给药降低COPD大鼠炎症因子的释放 |
| 3 DADS与L-menhol联合吸入给药减弱氧化应激失衡 |
| 4 DADS与L-menthol联合吸入给药减弱COPD大鼠的肝损伤 |
| 5 DADS与L-menhol联合吸入给药改善COPD大鼠的肺组织形态 |
| 6 DADS与L-menthol联合吸入给药降低CD4~+、CD8~+、MMP-9和TIMP-1的表达 |
| 四 讨论 |
| 五 小结 |
| 六 参考文献 |
| 第四部分 复方成分DADS、L-menthol生物转化及药代动力学研究 |
| 前言 |
| 第六章 DADS体外血细胞中的代谢研究 |
| 前言 |
| 一 材料与仪器 |
| 1 实验仪器 |
| 2 试剂与药品 |
| 3 实验动物 |
| 4 常用溶液配制 |
| 二 实验方法 |
| 1 DADS代谢部位的确定 |
| 2 二烯丙基二硫醚(Diallyl disulphide,DADS)HPLC分析方法的建立 |
| 3 DADS在大鼠血细胞中的代谢研究 |
| 四 实验结果 |
| 1 方法学验证结果 |
| 2 体外血细胞孵育条件的确定 |
| 3 DADS酶促动力学研究 |
| 五 讨论 |
| 六 小结 |
| 第七章 DADS大鼠体内药代动力学研究 |
| 前言 |
| 一 材料与仪器 |
| 1 实验仪器 |
| 2 试剂与药品 |
| 3 实验动物 |
| 二 实验方法 |
| 1 AMSO、AMSO_2全血样品分析方法的建立 |
| 2 分析方法的确证 |
| 3 大鼠体内药代动力学研究 |
| 三 实验结果 |
| 1 分析方法的验证 |
| 2 口服给药药代动力学 |
| 3 吸入给药药代动力学 |
| 4 静脉注射给药药代动力学 |
| 5 生物利用度初步求算 |
| 四 讨论 |
| 五 小结 |
| 第八章 L-menthol的药代动力学研究 |
| 一 材料与仪器 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验仪器 |
| 3 实验动物 |
| 二 实验方法 |
| 1 L-menthol血浆样品分析方法的建立 |
| 2 分析方法的确证 |
| 3 大鼠体内药代动力学研究 |
| 三 实验结果 |
| 1 分析方法的验证 |
| 2 L-menthol静脉注射和吸入药代动力学 |
| 四 讨论与小结 |
| 五 参考文献 |
| 第五部分 DADS和L-menthol药物相互作用研究 |
| 前言 |
| 第九章 DADS及其代谢产物和L-menthol对人体CYP450代谢酶的抑制作用研究 |
| 一 实验仪器与材料 |
| 1 实验仪器 |
| 2 试剂与药品 |
| 二 实验方法与结果 |
| 1 CYP450酶底物和代谢产物的选择 |
| 2 LC/MS/MS分析方法的建立 |
| 3 分析方法的确证 |
| 4 DADS及其代谢产物、L-menthol对混合人肝微粒体抑制作用的研究 |
| 三 讨论 |
| 四 小结 |
| 五 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）转染TIMP-1-shRNA基因的骨髓间充质干细胞治疗大鼠肝纤维化（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的分离、培养和鉴定 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 构建TIMP1shRNA基因的慢病毒载体及建立沉默TIMP-1 基因的骨髓MSCs |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 转染TIMP1shRNA基因的大鼠BMSCs静脉输入治疗大鼠肝纤维化 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的论文 |
| 中英文缩略语对照表 |
| 致谢 |
（9）薯蓣皂苷逆转阿霉素多药耐药、增加甲氨蝶呤吸收的分子药理学机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分: 薯蓣皂苷对人白血病细胞K562/ADR多药耐药的逆转效果及分子药理学机制 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 一. 材料 |
| 1.1 药品与试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 二. 方法 |
| 2.1 溶液的配置 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 细胞活性的测定 |
| 2.4 Quantitive Real-Time PCR |
| 2.5 Western Blotting |
| 2.6 瞬时转染与荧光素酶活性分析 |
| 2.7 薯蓣皂苷对阿霉素细胞内蓄积的影响 |
| 2.8 统计分析 |
| 结果 |
| 3.1 K562和K562/ADR细胞的特征 |
| 3.2 薯蓣皂苷的细胞毒性 |
| 3.3 薯蓣皂苷对阿霉素细胞毒性的影响 |
| 3.4 薯蓣皂苷对K562/ADR细胞MDR1 mRNA和蛋白表达的影响 |
| 3.5 薯蓣皂苷对阿霉素细胞内积累的影响 |
| 3.6 薯蓣皂苷对NF-κB信号通路的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分: 薯蓣皂苷体对甲氨蝶呤吸收的影响及其分子药理学机制 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 一. 材料 |
| 1.1 药品与试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 1.3 动物及细胞 |
| 二. 方法 |
| 2.1 溶液的配置 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 细胞活性测定 |
| 2.4 经上皮转运研究 |
| 2.5 Quantitive Real-Time PCR |
| 2.6 Western Blotting |
| 2.7 瞬时转染与荧光素酶活性分析 |
| 2.8 大鼠空肠和回肠翻转液囊的制备 |
| 2.9 组织学检查 |
| 2.10 原位肠灌注研究 |
| 2.11 LC-MS/MS分析 |
| 2.12 统计分析 |
| 结果 |
| 3.1 薯蓣皂苷对甲氨蝶呤Caco-2细胞毒性的影响 |
| 3.2 薯蓣皂苷对甲氨蝶吟经Caco-2细胞转运影响 |
| 3.3 薯蓣皂苷对Caco-2的MDR1 mRNA和蛋白表达的影响 |
| 3.4 薯蓣皂苷对Caco-2细胞的NF-κB信号通路的影响 |
| 3.5 薯蓣皂苷在大鼠翻转肠中对甲氨蝶呤吸收的影响 |
| 3.6 薯蓣皂苷对大鼠小肠的MDR1 mRNA和蛋白表达的影响 |
| 3.7 小肠组织病理学 |
| 3.8 原位肠灌注中薯蓣皂苷对甲氨蝶呤吸收的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分: 薯蓣皂苷对乳腺癌细胞及其耐药细胞的增敏效果及其分子药理学机制 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 一. 材料 |
| 1.1 药品与试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 二. 方法 |
| 2.1 溶液的配置 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 细胞活性的测定 |
| 2.4 Quantitive Real-Time PCR |
| 2.5 Western Blotting |
| 2.6 瞬时转染与荧光素酶活性分析 |
| 2.7 统计分析 |
| 结果 |
| 3.1 薯蓣皂苷对MCF-7和MCF-7/ADR细胞毒性的影响 |
| 3.2 薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞对阿霉素毒性的影响 |
| 3.3 薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞对MDR1基因和蛋白表达的影响 |
| 3.4 薯蓣皂苷在MCF-7和MCF-7/ADR细胞对NF-κB信号通路的影响 |
| 3.5 薯蓣皂苷对MCF-7和MCF-7/ADR细胞中NF-kIB信号通路的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
（10）新型放射增敏剂CpG ODN107的临床前药代动力学研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 生物样品中 CpG ODN107 及代谢物测定方法的建立 |
| 1. 材料与试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 4. 讨论 |
| 第二章 CpG ODN107 的药代动力学研究 |
| 1. 小鼠单次静脉注射 CpG ODN107 的血浆动力学特征 |
| 1.1. 材料与试剂 |
| 1.2. 实验方法 |
| 1.3. 实验结果 |
| 1.4. 讨论 |
| 2. CpG ODN107 的分布特征研究 |
| 2.1. 材料与试剂 |
| 2.2. 实验方法 |
| 2.3. 实验结果 |
| 2.4. 讨论 |
| 3. 单次静脉注射 CpG ODN107 的排泄途径研究 |
| 3.1. 材料与试剂 |
| 3.2. 实验方法 |
| 3.3. 实验结果 |
| 3.4. 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 硫代寡核苷酸类药物药代动力学研究进展 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间论文发表情况 |
| 致谢 |
四、抑制TIMP-1的硫代反义寡核苷酸在肝纤维化大鼠体内生物学分布及药代动力学研究（论文参考文献）
- [1]CCL4诱导小鼠肝纤维化模型基因芯片整合分析及核心基因的筛选验证研究[D]. 张兴旺. 吉林大学, 2021(01)
- [2]转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用[D]. 涂丽裙. 吉林大学, 2020(03)
- [3]miR-222调控MMP1干预增生性瘢痕成纤维细胞增殖的机制研究[D]. 张谊. 南方医科大学, 2020(01)
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- [7]用于治疗慢性阻塞性肺病的二烯丙基二硫醚和左旋薄荷醇复方制剂的初步成药性评价[D]. 刘燕. 山东大学, 2018
- [8]转染TIMP-1-shRNA基因的骨髓间充质干细胞治疗大鼠肝纤维化[D]. 朱颖炜. 苏州大学, 2016(11)
- [9]薯蓣皂苷逆转阿霉素多药耐药、增加甲氨蝶呤吸收的分子药理学机制[D]. 王丽娟. 大连医科大学, 2014(05)
- [10]新型放射增敏剂CpG ODN107的临床前药代动力学研究[D]. 岑彦艳. 第三军医大学, 2012(06)