一、高浓度葡萄糖对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响（论文文献综述）
董中华[1]（2020）在《人工虫草CPD0300活性组分对糖尿病肾病的治疗作用及其制剂研究》文中研究说明现代人的不良饮食习惯和生活方式造成了全球糖尿病患病率的惊人增长,糖尿病已成为继高血压之后的第二大类疾病,给患者带来了沉重的生活和经济负担。糖尿病肾病是糖尿病的主要微血管并发症,也是终期末端肾病首要诱因。糖尿病肾病的特征表现为蛋白尿,肾基底膜增厚、系膜扩张,持续性的肾纤维化和进行性的肾功能下降。糖尿病肾病所带来的肾功能减退不但会缩短患者的预期寿命,还会增加心血管疾病的发病风险,严重影响患者的生活质量。目前,糖尿病肾病的治疗尚无针对性的特效药物,主要通过改善生活方式、控制血糖、控制血压、纠正脂质代谢紊乱等方式来延缓糖尿病肾病的病情进展。因此,糖尿病肾病防治药物的研究具有重要的社会和经济意义。中药在我国具有悠久的历史,各种中药及其提取物对糖尿病肾病的治疗作用已有较多的研究,对中药发挥治疗作用的物质基础和分子机制的探索成为当前研究的热点。冬虫夏草是一味具有补肺益肾效果的传统中药,而通过发酵工艺制备的人工虫草弥补了野生虫草产量的严重短缺,这些野生和人工虫草已被广泛用于包括糖尿病肾病在内的各类肾脏疾病的治疗,并取得了良好的临床效果。目前对冬虫夏草治疗糖尿病肾病的活性组分、作用机制和药用制剂的研究仍然处于起步阶段。多数研究仅停留在冬虫夏草菌粉及其粗提物治疗糖尿病肾病的研究上,而市场上的虫草制剂也仅是填充有虫草粉末的简单胶囊剂。尽管有关虫草多糖的少量研究见诸报端,但是仍然缺乏对冬虫夏草治疗糖尿病肾病的具体活性组分、作用机制和高端制剂的系统性研究。为了进一步探索虫草作为糖尿病肾病防治药物的奥秘,本课题以医药市场上常用的人工虫草为原料药开展了抗糖尿病肾病的人工虫草活性组分分离、活性筛选、作用机制以及改良制剂的研究。本课题的研究内容主要由以下四个部分构成:（1）人工虫草各组分的分离纯化及初步抗糖尿病肾病活性筛选;（2）人工虫草活性组分对实验性糖尿病肾病的治疗作用及机制研究;（3）人工虫草改良制剂的制备及其药物动力学研究;（4）活性成分麦角甾醇纳米制剂的制备、表征及体内药物动力学和体外药效评价。（1）人工虫草各组分的分离纯化及初步抗糖尿病肾病活性筛选本部分的工作重点是对人工虫草中含量丰富且具有良好生物活性的多糖类、核苷类和甾醇类组分（有效部位）进行分离纯化以及初步抗糖尿病肾病活性筛选。多糖类组分是通过水提醇沉法将多糖从冬虫夏草中初步分离出来,再经过Sevage试剂脱蛋白、双氧水脱色、透析法去除小分子物质进行纯化得到纯化的多糖样品。对所制备的人工虫草多糖样品进行质量评价,发现样品中的多糖含量为49.73%（以葡萄糖计）,样品中含有糖类物质、不含还原性的单糖和蛋白质。核苷类组分是通过将冬虫夏草水提后分别过大孔树脂柱和葡聚糖凝胶柱而得到纯化后的冬虫夏草核苷提取物（CS-N）。采用LC-DAD法和LC-MS法对样品中的核苷类成分进行了定性和定量分析,鉴定出的10种核苷类化合物分别是尿嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、胞苷、尿苷、腺苷、2’-脱氧腺苷、鸟苷和胸苷,其中鸟苷含量最高。甾醇类组分通过乙醇提取将甾醇类成分从冬虫夏草中提取出来,然后经过乙酸乙酯萃取、硅胶柱分离、重结晶纯化得到冬虫夏草甾醇提取物。采用LC-DAD法和GC-MS法对甾醇提取物中的甾醇类成分进行分析,结果表明其主要成分是麦角甾醇,含量可以达到92%,故用市售麦角甾醇进行后续研究。对上述人工虫草组分的抗糖尿病肾病活性初筛工作包括体外建模及活性筛选。以高糖诱导的大鼠肾系膜细胞为模型,以细胞外基质性成分纤连蛋白和1型胶原蛋白为筛选指标。初步活性筛选结果表明在三类主要有效组分中核苷提取物和甾醇提取物（麦角甾醇）对细胞外基质表达的抑制作用更为明显。（2）人工虫草活性组分对实验性糖尿病肾病的治疗作用及机制研究鉴于虫草多糖研究的文献报道较多,本课题重点考察了核苷提取物和甾醇提取物（麦角甾醇）对实验性糖尿病肾病的治疗作用,并初步探索了其作用机制。核苷提取物（CS-N）的抗糖尿病肾病研究包括体内外建模以及对作用功效、信号通路的探索。体外研究选择了高糖刺激的HK-2细胞模型,其功效研究结果表明CS-N治疗能够有效抑制高糖诱导的上皮间质转分化和细胞外基质积聚。体内模型为STZ诱导的C57BL/6小鼠模型,CS-N灌胃给药40、80mg/kg/day,连续给药8周。体内研究结果表明,CS-N治疗能够有效恢复糖尿病肾病小鼠的体重,改善其肾功能;高血糖导致的小鼠肾脏细胞损伤、肾小球肥大、系膜扩张和糖原胶原沉积状况在CS-N给药治疗下也得到明显改善;信号通路研究结果显示CS-N给药抑制了 p38和ERK信号通路的活化,进而减轻了上皮间质转分化和细胞外基质的沉积。甾醇提取物（麦角甾醇）抗糖尿病肾病研究中的体内外建模和作用功效与核苷提取物（CS-N）的研究内容相似,主要不同点在于其作用机制的差异。体外研究通过高糖刺激肾系膜细胞构建了糖尿病肾病细胞模型。体外功效研究结果表明麦角甾醇可以抑制高糖诱导的肾系膜细胞异常增殖和细胞外基质性成分的过度表达;作用机制研究发现麦角甾醇能够下调TGF-β1的表达,抑制Smad2的磷酸化水平并调节其下游信号来发挥其抗糖尿病肾病作用。体内研究对STZ诱导的C57BL/6糖尿病小鼠灌胃给药麦角甾醇10,20,40 mg/kg/day,连续给药8周。体内研究结果表明,麦角甾醇给药可以增加糖尿病肾病小鼠的体重,改善小鼠胰岛β细胞功能,恢复肾功能;另外,麦角甾醇还能显着改善STZ诱导的糖尿病小鼠肾组织中肾小球体积增大、系膜基质扩张、肾小管间质损伤以及糖原和胶原沉积的状况;体内的作用机制研究显示麦角甾醇在体内通过与体外同样的信号通路来起到治疗糖尿病肾病的作用。（3）人工虫草改良制剂的制备及其在大鼠体内的药物动力学研究麦角甾醇是冬虫夏草治疗糖尿病肾病的重要活性成分,但水溶性极差,这将影响冬虫夏草口服给药后麦角甾醇从菌粉中的溶解和释放以及在胃肠道的吸收,从而影响口服生物利用度。因此,需要制备一种能够增加麦角甾醇溶解度的人工虫草改良制剂,该制剂的研究工作主要是对增溶剂的筛选。我们首先考察了不同增溶技术对麦角甾醇的增溶作用,测定了麦角甾醇在几种常用增溶剂和潜溶剂中的溶解度;结果表明SDS对麦角甾醇的增溶效果最好,故选择将SDS用于冬虫夏草提取物中制备改良制剂。改良制剂的药代动力学研究包括方法学的建立以及药代动力学参数的考察。我们建立了大鼠血浆中麦角甾醇的LC-MS含量测定方法,方法学验证结果表明所建方法的线性关系良好、专属性强、精密度和准确度高、回收率高、稳定性好,可以用于麦角甾醇的药物动力学研究;在大鼠体内的药物动力学研究表明,人工虫草改良制剂能显着提高冬虫夏草口服给药时麦角甾醇的血药浓度和生物利用度。由此推测,相比于人工虫草菌粉直接给药,人工虫草改良制剂用于糖尿病肾病的治疗可能能够降低给药剂量、提高治疗效果。（4）麦角甾醇纳米脂质载体的制备和评价鉴于麦角甾醇具有良好的抗糖尿病肾病活性,本部分的研究制备了麦角甾醇纳米脂质载体（ERG-NLC）,以提高麦角甾醇的溶解度和口服生物利用度。这些工作为后续麦角甾醇相关产品的开发奠定了理论和实验基础。麦角甾醇纳米脂质载体的研究工作包括剂型选择、工艺和处方优化、制剂表征和体内外评价。我们选择生物相容性良好、稳定性高的纳米脂质载体作为麦角甾醇纳米制剂的剂型。制剂的工艺和处方研究以包封率为主要考察指标,对工艺和处方进行了单因素筛选和正交设计优化,最终选择以单硬脂酸甘油酯和癸酰基/辛酰基甘油酯作为脂质材料、以吐温80、Pluronic F68和卵磷脂作为乳化剂、采用乳化-超声法制备ERG-NLC。所制备的ERG-NLC分散液为近澄明有淡蓝色乳光的液体,纳米颗粒呈球形、表面圆整、无粘连,包封率和载药量分别为92.9%和6.51%,粒径为85.72 nm,zeta电位为-30.77 nmV,制剂稳定性良好。为方便包装、储存和运输,通过冻干保护剂的筛选,确定以5%的甘露醇作为冻干保护剂将ERG-NLC制备成冻干制剂。所制备的ERG-NLC冻干产品具有良好的外观和再分散性;质量评价结果表明冻干过程对制剂包封率、载药量、粒径、电位和微观形态影响较小;DSC和X-射线衍射的物相分析结果表明麦角甾醇已被包裹或吸附在纳米脂质载体中,形成了新的物相。以大鼠为药物动力学研究模型,考察口服药物动力学参数的变化;通过MTT法和Western blot法研究ERG-NLC对高糖诱导的RMC细胞增殖和细胞外基质积累的影响。药代动力学和体外药效研究结果表明ERG-NLC显着增加了麦角甾醇的口服生物利用度,增强了其对高糖诱导的肾系膜细胞的增殖和细胞外基质积聚的抑制作用,提高了体外抗糖尿病肾病活性。综上所述,本课题对人工虫草的各组分进行了分离纯化和初步活性筛选,并研究了核苷类组分和甾醇类组分对糖尿病肾病的治疗效果和作用机制:核苷提取物能够通过抑制p38/ERK信号通路的活化来减轻上皮间质转分化和细胞外基质的沉积,麦角甾醇则通过调节TGF-β1/Smad2通路抑制肾系膜细胞的过度增殖和细胞外基质的积聚;针对抗糖尿病肾病活性成分麦角甾醇水溶性差的问题,本课题分别制备了人工虫草改良制剂和麦角甾醇纳米脂质载体:人工虫草改良制剂能有效提高麦角甾醇的口服生物利用度,麦角甾醇纳米脂质载体显着增加了麦角甾醇的口服生物利用度、提高了其体外抗糖尿病肾病活性。本课题为冬虫夏草抗糖尿病肾病的物质基础和作用机制的研究提供了实验数据,为后期虫草制剂的改良和麦角甾醇相关产品的开发提供了理论和实验依据。
王菁[2]（2020）在《海带低分子量褐藻多糖硫酸酯对糖尿病肾病的作用机制研究》文中认为糖尿病肾病（DN）是主要的糖尿病微血管疾病,是最早出现的糖尿病并发症,也是慢性肾衰和终末期肾病需要透析的最主要病因。DN是糖尿病持续高血糖引起的代谢障碍并发症,其产生过程与多种病理过程相关。从海带中提取的低分子量褐藻多糖硫酸酯（LMWF）属于一类高度硫酸化杂多糖,由岩藻糖、硫酸基、半乳糖等组成。LMWF因结构独特具有多种生物活性,包括抗凝血、抗炎症、抗氧化、抗肿瘤等。LMWF作为天然褐藻多糖通过影响多种细胞因子抑制DN的发展速度,但LMWF对DN的治疗机制尚不清楚。本论文从体外细胞模型水平与体内动物模型水平入手,探讨LMWF改善DN的作用与机制。体外细胞实验结果证明LMWF能够显着改善晚期糖基化终末产物（AGEs）引发的人体肾小球系膜细胞（HRMCs）异常增殖与肥大,降低细胞培养基中内毒素含量与乳酸脱氢酶（LDH）活性,从而改善HRMCs损伤;通过定量蛋白质组学KEGG富集分析,发现细胞外基质-受体相互作用（ECM-receptor interaction）信号通路与LMWF关联性最大,其中纤维连接蛋白（FN）表达量变化受LMWF影响最显着;通过细胞免疫荧光和表面等离子体共振（SPR）检测发现LMWF与FN存在特异性结合,平衡解离常数KD为453.7μmol/L;结果证明带正电荷的鱼精蛋白硫酸盐（PS）能够促进LMWF与HRMCs结合,增强LMWF改善HRMCs损伤的治疗作用。在体内动物实验方面,通过STZ诱导成年雄性Wistar大鼠建立DN早期模型证实LMWF较微晶纤维素（MC）可更好地缓解DN大鼠多饮、多食、体态消瘦等症状,但其对血清生化指标影响不大,未产生明显改善DN大鼠高血糖的效果。在肾脏功能方面,LMWF能够明显改善DN大鼠多尿、尿蛋白排泄量过多、尿微量白蛋白与尿肌酐比值（ACR）过高等DN早期病理症状;能够抑制肾小球基底膜病变,阻止肾小球系膜及基底膜增厚,缓解肾小球结构病变,下调DN大鼠肾皮质层FN、肌营养不良聚糖蛋白（DG）、层粘连蛋白（LAMC1）、白细胞介素-6（IL-6）、细胞间黏附分子-1（ICAM1）等促炎症因子的水平,而LMWF与抗生素（Anti）联用时其改善DN的效果受到影响且大幅降低。LMWF能够改善DN大鼠肾脏功能损伤,降低肾脏组织因炎症引起的病变,且这种作用与肠道菌群相关。体内动物实验结果证实LMWF能够显着抑制DN大鼠肠道通透性增大、粪便量增多、结肠长度缩短等肠道功能损伤症状。通过对DN大鼠粪便16S r DNA测序并进行聚类统计分析,结果证明LMWF显着提高拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度并降低厚壁菌门（Firmicutes）丰度,缓解DN大鼠肠道菌群紊乱,显着提高拟杆菌目S24-7（Bacteroidales S24-7 group）和瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）等可产生短链脂肪酸（SCFAs）的菌种丰度,且LMWF对DN的治疗作用与肠道菌群存在关联性。综上所述,LMWF能够有效缓解DN细胞病变及肾脏损伤,其通过结合FN抑制细胞外基质-受体相互作用信号通路,缓解由AGEs引起的HRMCs异常增殖与肥大,LMWF能够调节肠道菌群结构并抑制肠道屏障损伤,下调肾脏FN和IL-6等ECM相关的促炎症因子水平,减轻肾脏病理改变程度。本研究结果为进一步探讨褐藻多糖等治疗DN的作用机理及开发大分子活性物质作为海洋药物提供参考。
赵宇[3]（2019）在《活性维生素D3通过TREM-1调控糖尿病肾病巨噬细胞功能及表型的研究》文中指出目的糖尿病肾病（DN）是一种慢性炎症性疾病,巨噬细胞浸润是DN重要病理特征,也是导致DN进展的关键因素。巨噬细胞主要通过粘附和迁移过程进入肾组织。糖尿病肾组织中的巨噬细胞主要存在两个表型,即M1/M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞介导炎症反应,参与组织损伤;M2型巨噬细胞则具有组织修复作用。研究发现,糖尿病肾病（DN）肾组织存在M1/M2巨噬细胞表型失衡并以M1型浸润为主。因此,探讨巨噬细胞的调节机制,达到减少肾组织M1型巨噬细胞浸润的目的,以及寻找有效可行的调节巨噬细胞的药物是解决问题的关键。活性维生素D3对糖尿病肾病具有显着的肾保护作用,但其机制尚未阐明。本研究通过构建STZ诱导的糖尿病肾病大鼠模型及体外巨噬细胞培养模型两方面,观察活性维生素D3对糖尿病肾病巨噬细胞的调节作用,同时探讨可能机制。方法体内实验:通过建立STZ诱导的糖尿病肾病大鼠模型,将雄性SD大鼠随机分为三组:对照组（NC组）、DN组、VD干预组（DN+VD组,骨化三醇0.1μg·kg-1·d-1灌胃）、VD对照组（骨化三醇0.1μg·kg-1·d-1灌胃）,干预后18w末处死,PAS染色观察肾脏病理改变。免疫组化法检测肾组织CD68+巨噬细胞浸润以及;Western Blot检测CD68以及M1巨噬细胞特异性标志物iNOS、TNF-α表达,M2巨噬细胞特异性标志物Arg-1、MR表达以及TREM-1、STAT-1、p-STAT-1表达。免疫共聚焦检测CD68和iNOS,CD68和MR,CD68和TREM-1共表达。体外实验:采用体外培养小鼠永生系RAW264.7巨噬细胞,对巨噬细胞予不同的刺激,观察1,25（OH）2D3、TREM-1siRNA,TREM-1过表达质粒,以及STAT-1siNA,STAT-1激活剂对高糖诱导的巨噬细胞粘附、迁移以及M1/M2表型的影响。粘附实验、transwell迁移实验测巨噬细胞的粘附和迁移能力,免疫荧光和Western Blot检测不同干预条件下TREM-1,STAT-1,p-STAT-1以及M1标志物（iNOS、TNF-α）M2标志物（Arg-1、MR）的表达。结果体内实验:与对照组相比,DN组Scr、BUN、24小时尿蛋白及肾小球系膜基质增生程度显着增加（均P<0.05）。VD干预后能明显改善上述病理现象（均P<0.05）。与对照组相比,DN大鼠组肾组织CD68+巨噬细胞浸润数量明显增加,M1型巨噬细胞标志物iNOS、TNF-α表达,TREM-1表达以及p-STAT-1表达显着增加,VD能显着降低DN肾组织巨噬细胞浸润,降低iNOS、TNF-α、TREM-1以及p-STAT-1的表达。体外实验:为了探究高糖状态下巨噬细胞浸润及表型转化的机制,体外培养RAW264.7巨噬细胞。结果发现,与对照组相比高糖组巨噬细胞粘附迁移数量显着增加（P<0.05）;M1型巨噬细胞标志物显着增加（P<0.05）;巨噬细胞TREM-1和p-STAT-1表达显着增加（P<0.05）。为进一步确定TREM-1和STAT-1对巨噬细胞粘附迁移以及巨噬细胞M1/M2表型的调节作用,分别用TREM-1siRNA和STAT-1siRNA干预巨噬细胞观察巨噬细胞粘附迁移和M1/M2表型的变化。实验结果显示,高糖环境下,TREM-1siRNA组与TREM-1siRNA阴性对照组相比,巨噬细胞粘附和迁移数量显着下降（P<0.05）。M1型巨噬细胞标志物显着下降（P<0.05）,但是巨噬细胞STAT-1表达无显着差异。高糖环境下,STAT-1 siRNA组与STAT-1 siRNA阴性对照组相比,巨噬细胞粘附和迁移数量显着下降（P<0.05）;M1型巨噬细胞标志物显着下降（P<0.05）同时,巨噬细胞TREM-1表达显着下降（P<0.05）。上述实验结果证实,TREM-1和STAT-1参与巨噬细胞粘附迁移和M1/M2表型的调节,同时STAT-1是TREM-1上游调控因子。为了观察VD对巨噬细胞的调节作用发现,与高糖组相比,VD能显着降低高糖诱导的巨噬细胞粘附迁移数量（P<0.05）;显着降低高糖诱导的巨噬细胞TREM-1和p-STAT-1的表达（P<0.05）;显着降低高糖诱导的巨噬细胞M1型巨噬细胞标志物的表达（P<0.05）。为了进一步探究VD调节巨噬细胞的机制发现,在高糖环境下,TREM-1质粒过表达组与质粒空载阴性对照组相比,巨噬细胞粘附和迁移数量显着升高（P<0.05）;M1型巨噬细胞标志物显着升高（P<0.05）,但是巨噬细胞STAT-1表达并无明显变化。高糖环境下,STAT-1激活剂组与正常对照组相比,巨噬细胞粘附和迁移数量显着升高（P<0.05）;M1型巨噬细胞标志物显着升高（P<0.05）,同时巨噬细胞TREM-1表达显着升高。结论1.糖尿病肾病大鼠肾组织巨噬细胞浸润增多,并且以M1型浸润为主。2.高浓度葡萄糖环境下,STAT-1/TREM-1信号通路的上调促进巨噬细胞粘附迁移以及向M1型转化。3.活性维生素D3能够通过抑制高糖诱导的STAT-1/TREM-1信号通路,降低巨噬细胞粘附迁移并抑制其向M1型转化,从而缓解糖尿病肾病的进展。
叶太生[4]（2019）在《基于miR-21靶向Akt/mTOR信号通路探讨补气生血法调控自噬防治早期糖尿病肾病临床和实验研究》文中指出目的:糖尿病肾病（diabeticnephropathy,DN）是终末期肾病的主因,发病率高,防治意义重大。自噬是细胞清除受损物质,避免凋亡和坏死的自稳机制,参与了早期DN中肾细胞对抗损伤的过程,所以,自噬活性是防治早期DN的新靶点之一,目前国内外研究进展不多,中医认为DN是气虚血不足而瘀,进而肾“阴阳失和”的病证,治以补气生血而化瘀,本研究以补气生血法（当归补血汤）为基础,分为理论探讨、临床研究、实验研究三部分。先在理论研究基础上,分析医疗机构中治疗早期DN的临床处方,分析当归补血汤的组成“黄芪-当归”药对的应用规律;再通过动物实验研究当归补血汤能否通过调控自噬活性治疗早期DN,并比较该方防治早期DN以补气为主,使肾精得固而“阴阳自和”的过程,与干预肾组织中miR-21靶向Akt/mTOR信号通路调控自噬保护肾脏的过程是否一致,由此揭示其药效机制,探讨自噬是否为“阴阳自和”理论的微观基础之一,为中医药防治DN研究提供思路。理论探讨:1、基于中医气血理论:补气生血法能补阳气以生阴血,起到调和阴阳,促进“阴阳自和”的作用。2、当归补血汤:是补气生血的代表方,原方主治血虚发热,重用黄芪意在针对气虚为主的病机特点,也符合早期DN的基本病机。3、自噬活性:是维持细胞内环境稳定的自我稳定机制,理论上与“阴阳自和”的核心思想异曲同工。4、基于系统生物学思维:从临床到实验研究是中医药防治疾病研究的重要方法,也是阐释中医药理论科学内涵的有效途径。方法:1、临床研究:以2017年1月到2017年12月湖北省中医院内分泌科糖尿病肾病病例为样本库,基于真实世界的研究方法,筛选处方时,选择糖尿病为主要诊断,筛选合并早期糖尿病肾病的病例,且临床有效的治疗处方,处方的录入与核对将按照上述要求进行整理,并由中医药专业人员录入“中医传承辅助系统（V2.5）”进行药物频次分析、组方规律分析和新方分析等。2、实验研究:1)体外细胞实验:分别制备正常大鼠血清（Ⅰ）、当归补血汤高剂量（7g/Kg-d）含药血清（Ⅱ）、当归补血汤低剂量（1.75g/Kg·d）含药血清（Ⅲ）、格列齐特（2mg/Kg·d）含药血清（Ⅳ）。体外培养大鼠肾足细胞分为:正常对照组（A组）、高糖组（B组）、当归补血汤高剂量组（C组）、当归补血汤低剂量组（D组）、格列齐特组（E组）。A组加Ⅰ血清+5mmol/L葡萄糖;B组加Ⅰ血清+30mmol/L葡萄糖;C组加Ⅱ 血清+30mmol/L葡萄糖;D组加Ⅲ 血清+30mmol/L葡萄糖;E组加Ⅳ 血清+30mmol/L葡萄糖。分别培养12h、24h、48h、72h后收集细胞检测。采用MTT法检测不同时段各组足细胞增殖情况,应用流式细胞仪检测不同时段各组足细胞凋亡情况,透射电镜观察足细胞自噬形态。应用Western-Bolt检测细胞中Belcin-1、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ 蛋白的表达,RT-PCR分别检测Belcin-1、LC3-I和LC3-Ⅱ的mRNA表达水平。2)体内动物实验:制备当归补血汤的醇提取物,在早期DN大鼠模型造模成功后,将SD大鼠随机分为A组:空白组;B组:模型组;C组:当归补血汤高剂量组[7g/（kg·d）];D组:当归补血汤低剂量组[1.75g/（kg·d）];E组:格列奇特组[2mg/（Kg·d）]。每组10只,连续灌胃4周后取材。检测血尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、尿白蛋白排泄率（UAER）,并观察一般情况、肾脏组织病理（PAS染色）,电镜观察肾足细胞的自噬体情况;Western-Blot法分析 Akt（protein kinaseB）、mTOR（mammalian target of rapamycin）的表达,RT-PCR法检测miR-21以及Akt、mTOR的mRNA表达。结果:1、临床研究:提示早期DN临床多见症状:神疲乏力、口干、浮肿、腰酸、畏寒等均为糖尿病肾病常见症状,脉象多为沉、细脉。治疗早期DN的常用药物:黄芪、当归、丹参、玄参、山药、茯苓、地黄等,当归补血汤中药对“黄芪-当归”为用药之首,用药四气特点提示温、寒为主次,五味特点甘、苦为序,用药归经频率提示脾、肝、肾、心、肺为顺序。2、实验研究:1)实验一（体外细胞实验）:（1）当归补血汤能抑制高糖刺激的肾足细胞增殖,与B组比较有显着性差异（P<0.05）,同时C组效果最为显着,与D、E组比较具有显着性差异（P<0.01）,并且发现48h增殖情况差异性最为显着;（2）足细胞在高糖诱导下凋亡明显,不同药物干预对比提示当归补血汤高剂量组可以明显减缓凋亡,由于高糖刺激后肾足细胞损伤,出现细胞凋亡,给予药物干预后再孵育48h后,各实验组肾足细胞细胞凋亡率统计分析结果为:A组4.79%、B组39.28%、C组13.66%,D组为19.43%、E组为12.82%;（3）电镜观察相对A组,B组肾小球球囊粘连,有肾间质纤维化,自噬体减少,C、D、E组病变均较模型组轻,而且发现自噬体增多。2)实验二（体外细胞实验）:经过高糖干预的肾足细胞自噬标志蛋白表达下降（P<0.05）,其中当归补血汤高剂量组对自噬调控结果提示蛋白标志物Belcin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ明显增加（P<0.05）,其中C组效果最为明显（P<0.01）。3)实验三（体内动物实验）:（1）一般情况是A组SD大鼠动作敏捷灵活,饮食、皮毛及大小便情况均正常;B、C、D、E各组SD大鼠造模约7天开始活动减少,体重开始下降,逐渐消瘦,皮毛失去光泽,部分出现多饮、多食,多尿等表现,3周后上述表现非常突出;分组给药后的C、D、E各组情况较B组好转,给药1周后C、D组动物反应活跃,食量增加明显,毛发开始光亮,多饮改善,体重逐渐增加;（2）生化指标方面,B组和A组比较,也具有统计学意义（P<0.05）,药物干预的C、D、E组均与B组比较有显着性差异（P<0.01）,对比C组,E组降糖效果明显。血尿素氮、肌酐,B组和A组对比,差异有统计学意义（P<0.05）,B组和A组比较,也具有统计学意义（P<0.05）,药物干预的C、D、E组均与B组比较有显着性差异（P<0.01）,有统计学差异;（3）肾PAS染色,A组肾脏基本正常,未见明显系膜增生或毛细血管变性。B组肾脏可见明系膜基质增生明显,局部可见球囊融合,与A组相比肾脏病变明显,且全部有病变,说明造模成功。C、D、E组肾脏可见明显病变,表现为轻重不一的肾小球、肾小管病变,系膜基质轻度增生。PAS 阳阳性区系膜基质面积变化提示与A组比较B组系膜增生明显（P<0.05）,与B组比较,C、D、E各组均能改善系膜增生P<0.05),其中C组效果最好（P<0.01）;（4）电镜观察,相对A组,B组肾小球球囊粘连,有肾间质纤维化,自噬体减少,C、D、E组病变均较模型组,而且发现自噬体增多,三组差别不明显;（5）Nephrin蛋白免疫荧光染色,A组足细胞裂孔蛋白Nephrin在肾小球中沿毛细血管袢呈均匀连续的线状分布,B组与A组比较Nephrin组蛋白表达减少,C、D、E组Nephrin蛋开始增加白表达,由连续线状分布变为弥散的颗粒状分布,各组之间提示与A组比较B组Nephrin蛋白明显（P<0.05）,与B组比较,C、D、E各组均能改善系膜增生（P<0.05）,其中C组效果最好（P<0.01）。4)实验四（体内动物实验）:（1）Akt、mTOR的表达均下降,与B组比较差异有统计学意义（P<0.05）,与D组比较,C组大鼠肾组织Akt、mTOR的表达有统计学意义（P<0.05）。（2）miR-21及Akt、mTOR的mRNA表达,发现B组和A组比较,差异有统计学意义（P<0.05）,C、D、E组均与B组比较有显着性差异（P<0.01）;就下调AktmRNA、mTORmRNA表达而言,发现B组和A组比较,差异有统计学意义（P<0.05）,C、D、E组均与B组比较有显着性差异（P<0.01）。结论:1、运用数据分析软件——中医传承辅助系统（v2.5）,对临床治疗DN方剂的组方用药规律进行分析,说明了治疗早期DN基本病机气虚血不足而瘀及“补气生血”而化瘀治法的综合优势,尤其符合当归补血汤中药对“黄芪胃当归”的用药特点,还可减少或避免西药的副作用,也是进一步实验研究的基础。2、实验研究:1)体外细胞实验提示高糖诱导了肾足细胞的凋亡,而肾足细胞受损是DN的病理基础之一,保护肾功能可以从保护肾足细胞入手,而补气生血法（当归补血汤）含药血清的作用在于干预了自噬体的形成,促进了肾足细胞的自我修复能力,也是维持细胞功能的基础,所以当归补血汤对足细胞保护作用的机制除影响细胞凋亡以外,还和自噬有关,高糖刺激后Beclinl、LC3-Ⅱ表达明显低于正常组,提示自噬活性受到抑制,正常状态下自噬维护细胞内环境稳定的能力下降,给予当归补血汤干预后发现自噬标志蛋白增加,提示自噬活性增强。综上所述,自噬在肾脏病中扮演着重要的角色,或许参与DN的发生、发展,而当归补血汤可能阻止高浓度葡萄糖引起的自噬活性下降,提示其通过自噬延缓DN肾损害的作用。2)体内动物实验提示足细胞的损伤和自噬活性下降,当归补血汤治疗后延迟了肾脏的这种损伤的程度,生化指标改善明显,病理结构变化及Nephrin蛋白变化提示与干预自噬有关,基于此,本研究从生化指标和病理形态上说明:补气生血法（当归补血汤）能明显改善早期DN大鼠肾功能,当归补血汤减少蛋白尿作用略优于格列齐特;同时发现当归补血汤能改善Nephrin的抑制状态,发挥减少蛋白尿作用,同时当归补血汤抑制肾组织miR-21表达,进而调控了病理状态下Akt/mTOR信号通路的失衡,保持了肾足细胞自噬活性,抑制了高糖刺激引起的肾系膜增生,起到延缓肾损害的作用,以上表明补气生血法（当归补血汤）能抑制miR-21的表达,靶向Akt/mTOR信号通路调控了肾足细胞自噬活性,这可能是其治疗治疗早期DN的重要机制之一,也说明补气生血法（当归补血汤）防治DN可能是通过调控自噬实现的,而自噬活性可能是“阴阳自和”理论的微观基础之一。
周健[5]（2017）在《PTHrP参与糖尿病肾病中氧化应激和炎症的调控》文中认为目的本实验室已有的研究表明,甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP）对于糖尿病肾病的进展有着双重的作用,短期处理会抑制转化生长因子（TGFβ）信号通路,但长期处理则会失去抑制TGFβ信号通路的作用,甚至还通过激活TGFβ通路,促进糖尿病肾病的进展。ROS与炎症分子在糖尿病肾病的进展过程中发挥重要作用,但是PTHrP是否对ROS与炎症分子的生成有调控作用尚不清楚。本论文通过培养肾小球系膜细胞和建立链脲佐菌素诱导的大鼠1型糖尿病肾病模型,探讨PTHrP是否通过ROS和炎症分子来参与糖尿病肾病的发病过程。方法 1.采用PTHrP的氨基末端短肽PTHrP（1-34）100 nmol/L刺激系膜细胞1-24小时,然后裂解细胞并提取总蛋白,Western blot分别检测NADPH氧化酶亚基p47phox和炎症分子IL-1β、TNFα的蛋白表达水平。2.采用高浓度葡萄糖（30 mmol/L）刺激系膜细胞1-24小时,然后裂解细胞并提取总蛋白,Western blot分别检测p47phox、IL-1β和TNFα的蛋白表达水平。3.观察PTHrP（1-34）对于高糖诱导NADPH氧化酶亚基p47phox和IL-1β、TNFα的表达上调是否有影响。具体实验安排为:首先加PTHrP 100 nmol/L预处理系膜细胞30分钟,然后分别进行高糖处理1、3、6小时和24小时。4.建立链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型,分为正常组、糖尿病组、小剂量PTHrP（1-34）给药组（40μg/kg）、中剂量PTHrP（1-34）给药组（80μg/kg）和大剂量PTHrP（1-34）给药组（160 μg/kg）。分别取PTHrP（1-34）给药15天、90天的肾皮质研磨,随后裂解并提取总蛋白,采用Western blot检测不同剂量PTHrP处理15天和90天的大鼠肾皮质p47phox、IL-1β和TNFα的表达是否有变化。5.同上建立链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型,采用免疫组化的方法检测IL-1β和TNFα的表达是否有变化。结果 1.高糖刺激系膜细胞3小时p47phox的蛋白表达开始升高;PTHrP（1-34）处理系膜细胞6小时可诱导p47Phox的蛋白表达升高。2.高糖刺激系膜细胞6小时IL-1β的蛋白表达开始升高;PTHrP（1-34）处理系膜细胞12小时可诱导IL-1β的蛋白表达升高。3.高糖刺激系膜细胞1小时TNFα的蛋白表达开始升高;PTHrP（1-34）处理系膜细胞3小时可诱导TNFα的蛋白表达升高。4.PTHrP（1-34）预处理可抑制高糖处理3小时诱导的p47phox上调,不能抑制高糖处理24小时诱导的p47phox表达升高。PTHrP（1-34）预处理不能抑制高糖处理6小时和24小时诱导的IL-1β上调。PTHrP（1-34）预处理可抑制高糖处理1小时诱导的TNFα上调,但不能抑制高糖处理24小时诱导的TNFα表达升高。5.不同剂量的PTHrP（1-34）处理15天可抑制糖尿病大鼠肾皮质p47phox、IL-1β和TNFα的蛋白表达上调,且存在剂量依赖性;但是PTHrP（1-34）给药3个月不能抑制大鼠肾皮质p47phox、IL-1β和TNFα的蛋白表达上调。结论PTHrP（1-34）短期给药可抑制糖尿病大鼠肾皮质p47phox的表达来降低NADPH氧化酶NOX1和NOX2的活性,减少ROS产生;并抑制炎症因子IL-1 β和TNFα的表达上调。PTHrP（1-34）长期给药不能抑制糖尿病大鼠肾皮质NADPH氧化酶的活性和炎症因子IL-1β和TNFα的表达上调。这与前期发现的PTHrP（1-34）对TGFβ信号通路的双重作用类似,说明PTHrP在糖尿病肾病的发病过程中存在着不依赖于高血糖的调控机制。
张贝[6]（2017）在《KATP在高糖诱导的肾系膜细胞增殖和基质蛋白合成中的作用》文中认为随着糖尿病的日益流行,糖尿病肾病发病率不断增加,糖尿病已经成为终末期肾病的主要病因之一。因此关于糖尿病肾病的发病机制的探讨也在不断深入,血流动力学改变、代谢通路的改变、炎症/氧化应激、其他（自噬等）是目前公认的糖尿病肾病的发病机制,但是现有的发病机制的探讨并没有改善糖尿病肾病发病率不断增加的现状,因此可能有其他我们尚未引起重视的机制存在。研究表明ATP敏感性钾通道（ATP-sensitive potassium channels,KATP）是一类对细胞内外ATP敏感的由异源性多聚体组成的钾通道,表达于包括心肌、胰岛、肾脏、神经元等全身多种组织和细胞,主要是介导细胞代谢状态和膜的兴奋度,参与多种重要的生物学过程。KATP可以调控胰岛素和胰高血糖素等的分泌,KATP通道功能障碍在糖尿病的发生中起着至关重要的作用,但KATP在糖尿病并发症中的作用则鲜见报道。研究表明在慢性肾脏疾病（Chronic kidney disease,CKD）中,KATP通道开放剂可通过减少炎症细胞浸润、减轻氧化应激等方式保护肾脏避免进一步损伤。而应用KATP通道开放剂尼可地尔则对eNOS缺陷糖尿病大鼠肾脏病理改变有改善作用,且临床数据显示早期糖尿病肾病患者应用KATP通道开放剂尼可地尔肾功能及尿白蛋白水平均有显着改善。提示KATP功能障碍可能在糖尿病肾病发病中起着重要作用。KATP通道是介导细胞能量状态和细胞兴奋性的重要介质,AMP激活的蛋白激酶（AMP activated protein kinase,AMPK）是细胞能量代谢通路重要的组件。越来越多的证据表明AMPK的活化抑制糖尿病肾病的发生发展。既往的研究报道AMPK的激活剂或172位苏氨酸的磷酸化的增加活化能够提高胰岛β细胞、心室肌细胞等多种细胞中KATP通道的活性,且免疫共沉淀和质谱分析表明AMPK的α亚基和KATP通道亚基相结合。提示AMPK可能是KATP通道活性的重要调控因子,在糖尿病肾病的发病过程中起着重要的作用。鉴于以上AMPK和KATP通道活性的调控在糖尿病肾病的发生发展中可能起到重要的作用,提出假设:糖尿病环境下,肾细胞中AMPK的表达受到抑制,从而降低KATP通道的活性,诱发一系列病理反应,促进糖尿病肾病的发生和发展。研究目的:系膜细胞外基质分泌增多和系膜细胞的过度增殖是糖尿病肾病早期的主要病理学特征之一。我们以肾小球系膜细胞（Glomerular mesangial cells,GMC）为研究对象,首先证实KATP通道在肾系膜细胞中的存在和定位,确定合适的葡萄糖处理浓度和时间。其次,通过高浓度葡萄糖处理系膜细胞,使用KATP通道开放剂,确定KATP通道的活性对高浓度葡萄糖处理的肾系膜细胞的增殖和基质蛋白的表达等的影响。最后通过对AMPK的激活,证实KATP通道的作用是否受AMPK所调控。研究方法:1.从SD大鼠肾小球分离系膜细胞进行原代培养,通过Realtime-PCR测定KATP的各亚基（Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2A和SUR2B）的m RNA的表达,通过荧光双染结合confocal显微镜观察KATP通道在系膜细胞上的分布和定位。将系膜细胞分别加入0mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L葡萄糖培养12、24小时（h）,观察细胞增殖（CCK-8法）,凋亡（Annexin V-FITC/PI法）,细胞周期变化（碘化丙啶Propidium PI染色,随后做细胞流式分析）,测定基质蛋白纤维粘连蛋白（fibronectin,FN）的含量（ELISA分析法）,以建立高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖模型。2.（1）在大鼠肾小球系膜细胞中,加入或不加入30mmol/L葡萄糖处理,分为高糖组和空白对照组,培养24 h后,观察细胞的增殖,测定基质蛋白FN和IV型胶原（type IV collagen,IV-C）的含量（ELISA分析法）,通过Western-blot法测定pAMPK/AMPK,分析AMPK的表达和活性,全细胞电流记录法测定KATP通道的活性,Realtime-PCR法测定其各亚基（Kir6.1、Kir6.2、SUR1、SUR2A和SUR2B）的mRNA的表达。（2）大鼠肾小球系膜细胞高糖处理后分为葡萄糖处理组（葡萄糖组）、葡萄糖+溶剂组（KATP通道开放剂的溶剂DMSO）（葡萄糖+DMSO组）、KATP开放剂diazoxide（DZX）+葡萄糖培养组（DZX+葡萄糖组）和DZX+KATP阻断剂5-羟基癸酸（5-HD）+葡萄糖培养组（DZX+5-HD+葡萄糖组）。培养24h后收集细胞,检测细胞的增殖,细胞中基质蛋白FN、IV-C含量,KATP的活性及其各亚基的mRNA的表达。3.大鼠肾小球系膜细胞高糖处理后分为葡萄糖处理组（葡萄糖组）、葡萄糖+溶剂组（AMPK激活剂的溶剂DMSO）（葡萄糖+DMSO组）、AMPK激活剂5-amino-4-imidazolecarboxamide riboside（AICAR）+葡萄糖培养组（AICAR+葡萄糖组）。培养24h后收集细胞,测定各组AMPK的表达和活性,以及KATP的活性测定。研究结果:1.荧光双染显示KATP通道在肾小球细胞膜和线粒体膜上均有表达,Realtime-PCR结果显示在肾小球系膜细胞上KATP通道亚基主要以Kir6.1/SUR2A和/或Kir6.1/SUR2B形式存在。葡萄糖梯度培养显示30mmol/L葡萄糖培养24小时增殖率较0、10、20mmol/L葡萄糖培养组显着增高（p<0.01）,凋亡率较20mmol/L葡萄糖组无显着差异,细胞周期G1期细胞较0mmol/L组显着减少（p<0.01）,基质蛋白FN在30mmol/L24小时组含量最高（p<0.01）。2.（1）高糖培养后系膜细胞增殖显着（p<0.01）,基质蛋白FN、IV-C水平显着增高（p<0.01）,KATP的活性及其Kir6.1、SUR2A、SUR2B亚基的mRNA的表达下降（p<0.01）,pAMPK/AMPK下降（p<0.01）。（2）DZX+葡萄糖组与葡萄糖组和葡萄糖+DMSO组相比,细胞增殖显着下降（p<0.01）,基质蛋白FN、IV-C含量显着降低（p<0.01）,KATP的活性显着增高（p<0.05）,Kir6.1表达无显着差异,SUR2A/SUR2B显着下降（p<0.01）。DZX+5-HD+葡萄糖组与DZX+葡萄糖组相比细胞增殖显着升高（p<0.01）,基质蛋白FN、IV-C含量显着升高（p<0.01）,KATP的活性下降（p<0.05）,SUR2A/SUR2B表达较DZX+葡萄糖组显着增高（p<0.01,p<0.05）。3.AICAR+葡萄糖组与葡萄糖组和葡萄糖+DMSO组相比,p AMPK/AMPK显着升高（p<0.01）,KATP的活性显着增高（p<0.01）。结论:KATP通道主要以Kir6.1/SUR2A和/或Kir6.1/SUR2B形式在肾小球系膜细胞膜和线粒体膜上表达,30mmol/L高糖诱导下肾小球系膜细胞增殖明显,基质蛋白合成增加,KATP的活性及其各亚基的mRNA的表达下降,AMPK的活性下降。加入DZX后KATP的活性明显提高,细胞增殖显着下降,基质蛋白FN、IV-C显着降低,5-HD可以逆转上述效应,提示KATP开放剂可以改善高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖和基质蛋白合成增加。AMPK的激活剂可以提高KATP通道的活性,提示AMPK可能对KATP通道在肾小球系膜细胞中起到的是正调控的作用。KATP通道可能在糖尿病肾病发生发展过程中起着重要作用,AMPK与KATP存在调控关系。
肖幸[7]（2017）在《从CPN1在5/6肾切除大鼠中的表达变化探讨升清降浊胶囊的药物作用机制》文中研究说明目的:近年来,慢性肾脏疾病（CKD）的发病率呈现出稳步上升之势,CKD因早期临床症状及生化指标改变不明显,患者不重视,待发展到中后期时就诊,延误治疗,增加家庭和社会负担。因此,CKD疾病的早诊断早治疗对于降低其危害性具有极为重要的意义。本课题组前期研究利用蛋白质组学方法对原发病为慢性肾小球肾炎的CKD患者的尿液进行了全面的蛋白质谱分析,观察到随着CKD病情的进展,CPN1蛋白在CKD患者尿液中的水平具有明显的变化趋势。然而,目前还缺乏相关实验研究判断CPN1是否可成为提示CKD疾病发生发展的相关指标。现代医学中的CKD疾病多与中医学中“癃闭”、“关格”、“水肿”等概念相对应。广东省名医洪钦国教授根据中医学对于CKD脾肾亏损,浊毒瘀阻,本虚标实病机的判断,创立了治疗CKD的有效制剂升清降浊胶囊,现已在临床应用30余年。升清降浊胶囊主要药物组成包括黄芪、大黄、丹参、法夏、枳壳、土茯苓等,针对CKD病机攻补兼施,疗效卓着。前期临床研究及动物实验均表明升清降浊胶囊具有保护肾功能、延缓CKD进展的作用,通过对比慢性肾小球肾炎CKD患者在升清降浊胶囊治疗前后的尿液蛋白质谱发现,升清降浊胶囊可以影响CKD患者尿CPN1的水平,但CPN1在升清降浊胶囊延缓CKD进展中的作用还未阐明。故本研究的目的主要包括:（1）通过观察CPN1在5/6肾切除大鼠尿液及肾组织中的表达水平变化,初步探讨其成为CKD诊断生物标志物的可能性以及在CKD发生发展过程中的作用。（2）研究升清降浊胶囊与5/6肾切除大鼠CPN1的关系及作用机制。方法:（1）大鼠模型的建立及实验分组正常对照组:正常饲养的SD大鼠;手术组:采用5/6肾切除法建立CKD大鼠模型;假手术对照组:麻醉、消毒等措施与手术组相同,分离皮下组织及肌肉,剥离肾脏包膜及肾上腺等肾周组织,暴露左肾,不行手术切除,逐层缝合肌层和皮肤,一周后行右肾暴露,方法步骤同上;给药大鼠分组:5/6肾切除大鼠术后随机分为升清降浊胶囊低浓度组、升清降浊胶囊中浓度组和升清降浊胶囊高浓度组;（2）采集实验标本:于术后第1周末、第2周末、第4周末、第8周末采集实验标本,包括大鼠血液、尿液、残肾组织等;（3）实验室检查肾功能采用全自动生化分析仪测定,尿液分析采用尿液分析仪测定;肾脏病理学检查:采用HE染色、Masson染色;肾组织CPN1 mRNA的表达水平:采用RT-PCR法;尿CPN1和肾组织CPN1蛋白的表达水平:采用Mouse CPN1 ELISA试剂盒测定。结果:（1）升清降浊胶囊对5/6肾切除大鼠肾功能及尿蛋白影响在升清降浊胶囊干预8周后,低浓度给药组（800 mg/kg）、中浓度给药组（1200 mg/kg）浓度组均较手术组显着降低血清肌酐、血清尿素氮和24 h尿蛋白水平,其中中浓度组降低幅度较大。高浓度给药组（1600 mg/kg）显着降低尿素氮水平、但无明显降低血肌酐和24 h尿蛋白的作用。因此,综合血肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白三个指标来说,中浓度给药组效果最优,低浓度给药组效果次之,高浓度给药组相对较差。（2）升清降浊胶囊对5/6肾切除大鼠肾脏病理形态的影响在升清降浊胶囊干预8周后,与手术组大鼠相比,中浓度给药组（1200 mg/kg）肾脏发生的病理改变程度最轻,低浓度给药组（800mg/kg）次之,均可见肾小球基底膜增厚及系膜增生,少数肾小管萎缩、坏死,间质炎症细胞浸润及纤维结缔组织增生。高浓度给药组（1600 mg/kg）肾小球系膜增生、基底膜增厚较为明显,部分肾小管坏死,肾间质可见大量炎症细胞浸润及纤维结缔组织增生,与手术组大鼠肾脏病理改变相似。故在延缓5/6肾切除大鼠肾脏纤维化方面,以升清降浊胶囊中浓度组干预效果最优。（3）升清降浊胶囊对5/6肾切除大鼠肾组织CPN1表达的影响mRNA水平:在升清降浊胶囊干预8周后,肾组织中CPN1 mRNA表达量较手术组均有上升,上升趋势为:低浓度给药组（800mg/kg）<高浓度给药组（1600mg/kg）<中浓度给药组（1200mg/kg）。因此,从上调大鼠CPN1 mRNA表达量方面来说,中浓度给药组效果最优。蛋白水平:在升清降浊胶囊干预8周后,各给药组尿液及肾组织中CPN1蛋白表达量均较手术组显着上升,且随药物浓度增高而呈现梯次上升趋势,但各给药组组间数据并无统计学差异,因此,从提高CPN1蛋白在尿液及肾组织中的表达量来说,药物浓度越高其效果越好。结论:升清降浊胶囊中浓度给药组（1200mg/kg）干预8周后,能够较好的降低5/6肾切除大鼠血清肌酐、尿素氮及24h尿蛋白水平,在一定程度上恢复大鼠的肾脏功能;减轻5/6肾切除大鼠肾小球和肾小管病理改变,延缓肾脏纤维化进展;同时提高5/6肾切除大鼠CPN1 mRNA和蛋白表达水平,提示升清降浊胶囊通过调节CPN1的表达,从而起到肾脏保护功能。尿液CPN1水平指标基本符合CKD潜在生物标志物选定原则,但其特异性、重复性等方面仍有待进一步探索研究。
辛彩虹[8]（2017）在《益气解毒活络中药组分配伍对人肾小球系膜细胞损伤的保护作用研究》文中认为目的:探讨益气解毒活络中药组分配伍对人肾小球系膜细胞损伤的保护作用,阐明益气解毒活络中药组分配伍防治糖尿病肾病的疗效机制,为临床防治糖尿病肾病提供新的思路,同时为将来新药的开发提供理论实验基础。方法:1.细胞来源人肾小球系膜细胞株（HBZY-1）惠赠自辽宁中医药大学基础医学院实验室2.实验药物黄芪甲苷:产品批号201314,辽宁北方药检科技开发有限公司盐酸小檗碱:产品批号15010411,北京盈泽纳新化工技术研究院水蛭素:产品批号V0145,格雷西亚（成都）化学技术有限公司木樨草苷:产品批号15012204,购自北京盈泽纳新化工技术研究院3.细胞培养将人肾小球系膜细胞（GMC）用吸管将细胞悬混液移入100ml培养瓶中复苏后,加入完全培养液（DMEM+10 mL/dL胎牛血清含100 U/mL青、链霉素）。每日在倒置显微镜中观察细胞生长状态,当细胞大部分贴壁时（80%）,用移液管吸出培养液,加入0.25%胰蛋白酶消化3分钟,倒置显微镜下观察细胞逐渐脱落时,加入DMEM（低糖完全培养基）溶液终止消化,用移液管轻轻吹打至悬混液状态,将细胞悬混液移入15mL离心管,1200转/分离心10分钟,去上清后,加入DMEM（低糖完全培养基）调整细胞浓度至1×105/mL,按1:3比例接种于25mL细胞培养瓶中将培养瓶放入5%CO2、37℃的培养箱中培养,每2d传代1次,约传代4次以后开始进行试验。4.实验分组1.在实验一、二、三中将人肾小球系膜细胞按4因素3水平正交设计方案分为以下11组:正常组（5.6mM葡萄糖）高糖高脂模型组（30mM葡萄糖+20mg/L LPC）1组:盐酸小檗碱（低）黄芪甲苷（低）水蛭素（低）木樨草苷（低）2组:盐酸小檗碱（低）黄芪甲苷（中）水蛭素（中）木樨草苷（中）3组:盐酸小檗碱（低）黄芪甲苷（高）水蛭素（高）木樨草苷（高）4组:盐酸小檗碱（中）黄芪甲苷（低）水蛭素（中）木樨草苷（高）5组:盐酸小檗碱（中）黄芪甲苷（中）水蛭素（高）木樨草苷（低）6组:盐酸小檗碱（中）黄芪甲苷（高）水蛭素（低）木樨草苷（中）7组:盐酸小檗碱（高）黄芪甲苷（低）水蛭素（高）木樨草苷（中）8组:盐酸小檗碱（高）黄芪甲苷（中）水蛭素（低）木樨草苷（高）9组:盐酸小檗碱（高）黄芪甲苷（低）水蛭素（中）木樨草苷（高）盐酸小檗碱低、中、高剂量分别为20μM、60μM、180μM;黄芪甲苷低、中、高剂量分别为20μM、60μM、180μM;水蛭素低、中、高剂量分别为0.5μM、1.5μM、4.5μM;木犀草苷低、中、高剂量分别为60μM、180μM、540μM。2.根据实验一、二、三分析结果,选取益气解毒活络中药最佳配伍方案进行实验四,现分组如下:正常组（5.6mM葡萄糖）高糖高脂模型组（30mM葡萄糖+20mg/L LPC）第一组:盐酸小檗碱（低）黄芪甲苷（低）水蛭素（低）木樨草苷（高）第二组:盐酸小檗碱（低）黄芪甲苷（低）水蛭素（低）木樨草苷（低）第三组:盐酸小檗碱（低）黄芪甲苷（中）水蛭素（中）木樨草苷（中）盐酸小檗碱低、中、高剂量分别为20μM、60μM、180μM;黄芪甲苷低、中、高剂量分别为20μM、60μM、180μM;水蛭素低、中、高剂量分别为0.5μM、1.5μM、4.5μM;木犀草苷低、中、高剂量分别为60μM、180μM、540μM。5.指标检测实验一:MTT法检测各组24h、48h、72h GMC增殖情况。实验二:qRT-PCR法检测各组FN、COLIV 24、48h mRNA表达ELISA法检测各组FN、COLIV、AGEs 48h蛋白活性表达实验三:qRT-PCR法检测各组TGF-β1、MCP-1 24、48h mRNA表达ELISA法检测各组TGF-β1、MCP-1 48h蛋白活性表达实验四:qRT-PCR法检测各组PPAR-γ24、48h mRNA表达WesternBlot法检测各组PPAR-γ24、48h蛋白活性表达WesternBlot法检测高糖高脂模型组0、15、30、60、90、120min NF-κB蛋白表达,选出NF-κB表达最高时间点。WesternBlot法检测各组60、90min NF-κB蛋白表达核转染法检测各组60、90min NF-κB核转染情况6.数据处理采用SPSS17.0统计软件处理实验数据,所有数据以±s表示,各组数据均用正交设计方差分析,各组间均数比较运用LSD法,P<0.05具有统计学意义。结果:1.益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂诱导GMC细胞增殖情况的影响通过MTT法观测各组各时间点GMC增殖情况变化发现:与模型组比较在24、48、72h三个时间点各中药配伍组GMC细胞增殖均显着降低（P<0.01）。与正常对照组比较模型组各时间点GMC细胞增殖显着升高有显着差异（P<0.01）;24h时间点1、2、3组未见明显差异（P>0.05）,其余各组均有显着差异（P<0.01）;48h时间点1、2组未见明显差异（P>0.05）,其余各组均有显着差异（P<0.01）;72h时间点各中药配伍组均未见显着差异（P>0.05）。各中药配伍组组间比较发现:24h时间点7、9组GMC细胞增殖下降最明显（P<0.01）;48h时间点6、7、8组GMC细胞增殖下降明显（P<0.01）;72h时间点除第5、7组组间有统计学差异（P<0.05）,其余各组组间比较均无统计学差异（P<0.01）。24h、48h、72h三个时间点比较正常组48h细胞增殖高于24h及72h（P<0.01）,模型组72h细胞增殖高于24h及48h（P<0.01）到达增殖巅峰,中药组分配伍6、7、8组48h细胞增殖高于24h及72h（P<0.01）。2.益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂诱导GMC细胞FN mRNA表达影响24h:与正常组比较,除1组外,模型组及各中药配伍组FN mRNA变化具有显着差异（P<0.01）;与模型对照组比较,各中药中药组分配伍组FN mRNA相对表达量均有显着下降（P<0.01）;各中药配伍组组间比较发现1、2组下调FN mRNA表达最明显（P<0.01）。48h:与正常组比较,模型组及各中药配伍组FN mRNA变化均有显着差异（P<0.01）;与模型对照组比较,中药配伍组FN mRNA相对表达量均有明显下降（P<0.01）;各中药配伍组组间比较发现1、2组下调FN mRNA表达最明显（P<0.01）。正常组及模型组24、48h两个时间点FN mRNA表达未见显着差异（P>0.05）;中药组分配伍1组与2组48h FN mRNA表达均低于24h FN mRNA表达（P<0.01）。3.益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂诱导GMC 48h FN蛋白活性表达影响与正常对照组比较,模型对照组及中药配伍各组均有明显上升（P<0.01）;与模型组比较,各中药中药组分配伍组比较FN蛋白活性表达均有显着下调;各中药正交组组内比较发现,第1组下调FN蛋白活性表达作用最大（P<0.01）。4.益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂诱导GMC细胞COLIV mRNA表达影响24h:与正常组比较,除去1组,模型组及各中药配伍组COLIV mRNA变化均有显着差异（P<0.01）,与模型组相比较各中药配伍组COLIV mRNA相对表达量均有明显下调（P<0.01）,中药配伍组组间比较发现2组和3组,6组和8组之间无显着差异（P>0.05）,其中1、2组COLIV mRNA下调最明显（P<0.01）。48h:与正常组比较,模型组及各中药配伍组COLIV mRNA变化均有显着差异（P<0.01,第1组P<0.05）,与模型组比较中药配伍组COLIV mRNA相对表达量均有明显下调（P<0.01）,中药配伍组组间比较发现第2、3组组间无统计学差异（P>0.05）,且COLIV mRNA下调最明显（P<0.01）。正常组、模型组及中药组分配伍1组24、48h两个时间点ColIV mRNA表达未见显着差异（P>0.05）;中药组分配伍2组与3组48h FN mRNA表达均低于24h FN mRNA表达（P<0.01）。5.益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂诱导GMC细胞48h COLIV蛋白活性表达的影响与正常组比较,除1组未见明显差异（P>0.05）,模型对照组及中药配伍组均有明显上升（P<0.01）;与模型组比较各中药配伍组比较COlIV蛋白活性表达均有显着下调;各中药配伍组组内比较发现,1组下调COlIV蛋白活性表达作用最大（P<0.01）。6.益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂诱导GMC细胞48h AGEs蛋白活性表达的的影响与正常组比较,除1组外,模型组及各中药配伍组AGEs蛋白活性表达均显着增高（P<0.01）;与模型组比较各中药配伍组AGEs蛋白活性表达均显着下调（P<0.01）;各中药配伍组组间比较发现第1组下调AGEs蛋白活性作用优于其余各中药配伍组（P<0.01）。7.益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂诱导GMC细胞TGF-β1 mRNA表达影响与正常对照组相比较,模型组及各中药配伍组24、48h TGF-β1 mRNA变化均有显着差异（P<0.01）;与模型对照组比较,各中药配伍组24、48h TGF-β1 mRNA相对表达量均有明显下降（P<0.01）;中药配伍组组间比较,2组下调24、48h TGF-β1 mRNA表达最明显（P<0.01）。正常组及模型组24、48h TGF-β1 mRNA表达未见显着差异（P>0.05）;中药组分配伍2组48h TGF-β1 mRNA表达显着低于24h（P<0.01）8.益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂诱导GMC细胞48h TGF-β1蛋白活性表达影响与正常组比较,模型组及中药配伍组TGF-β1蛋白活性表达均有明显上升（P<0.01）;与模型组比较,各中药配伍组TGF-β1蛋白活性表达均有显着下调（P<0.01）;各中药配伍组组内比较发现,2组下调TGF-β1蛋白活性表达作用最佳（P<0.01）。9.益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂诱导GMC细胞MCP-1 mRNA表达影响24h:与正常组比较,除1组（P>0.05）,模型组及其余各中药配伍组均有显着差异（P<0.01）;与模型组比较各中药配伍组MCP-1 mRNA相对表达量均有明显下降（P<0.01）;中药配伍组组间比较发现1组下调MCP-1 mRNA表达最明显（P<0.01）。48h:与正常组相比较,模型组及中药配伍组均有显着差异（P<0.01）,与模型组比较各中药配伍组MCP-1 mRNA相对表达量均有明显下降（P<0.01）,中药配伍组组间比较发现1组MCP-1mRNA下降最明显（P<0.01）。正常组及模型组24、48h MCP-1 mRNA表达未见显着差异（P>0.05）;中药组分配伍1组48h MCP-1 mRNA表达显着低于24h（P<0.05）。10.益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂环境下GMC细胞PPAR-γmRNA表达影响24h:与正常组比较模型组及中药配伍组均有显着差异（P<0.01）;与模型组比较各中药配伍组PPAR-γmRNA表达均明显上升,且有显着差异（P<0.01）;各中药配伍组组间比较发现第一组PPAR-γmRNA表达最高（P<0.01）。48h:与正常组比较除去第一组未见明显差异（P>0.05）,模型组及其余各用药组均有显着差异（P<0.01）;与模型组比较各中药配伍组PPAR-γmRNA表达均明显上升,且有显着差异（P<0.01）;各中药配伍组组间比较发现第一组PPAR-γmRNA表达最高（P<0.01）。正常组24h、48h两时间点PPAR-γmRNA表达未见显着差异（P>0.05）,模型组及第一、二、三组48h PPAR-γmRNA表达显着高于24h PPAR-γmRNA表达（P<0.01）。10.高糖高脂环境对GMC细胞NF-κB蛋白表达的影响通过WesternBlot法对高糖高脂模型组0、15、30、60、90、120min这6个时间点NF-κB蛋白表达检测,发现第90min NF-κB蛋白表达最显着。11.益气解毒活络中药组分配伍对高糖脂环境下GMC细胞NF-κB蛋白表达的影响与正常组比较模型组60min、90min蛋白表达水平显着增高,各中药配伍组比较发下60min时第三组下调NF-κB蛋白表达水平最显着;90min时第一、三组下调NF-κB蛋白表达水平最显着。12.益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂环境下NF-κB核转染变化的影响与正常组比较模型组60min、90min NF-κB亚基p65主要分布在细胞核内,而正常组及各中药配伍组p65大多分布在细胞核外。结论:1.益气解毒活络中药组分配伍能够抑制高糖高脂诱导的人肾小球系膜细胞（GMC）异常增殖,并下调GMC细胞外基质纤维黏连蛋白（FN）、四型胶原蛋白（COLIV）mRNA及蛋白水平表达,下调晚期糖基化终末产物（AGEs）蛋白活性表达水平。提示益气解毒活络中药组分配伍能够通过抑制GMC细胞外基质及AGES合成起到延缓肾小球动脉硬化的作用。2.益气解毒活络中药组分配伍能够抑制GMC细胞TGF-β1、MCP-1、NF-κB表达,上调PPAR-γ表达水平。提示益气解毒活络中药组分配伍能够通过调节相关细胞因子及信号通路的表达起到防治DN的作用。3.益气解毒活络中药组分配伍可能是通过抑制TGF-β/NF-κB信号途径下调MCP-1、FN、COLIV、AGEs的表达及上调PPAR-γ表达水平的作用来保护受损的GMC,从而起到减缓DN病程进展,保护受损肾脏的作用。4.益气解毒活络中药组分配伍最佳配伍方案为盐酸小檗碱（低剂量20μM）黄芪甲苷（低剂量20μM）水蛭素（低剂量0.5μM）木樨草苷（高剂量540μM）。
贺克强[9]（2017）在《黄芪甲苷对高胰岛素致肾损伤的影响及机制研究》文中研究表明第一部分黄芪对高胰岛素血症致早期2型糖尿病患者肾损伤的影响目的:评价黄芪（astragalus）对高胰岛素血症（hyperinsulinemia,HINS）致早期2型糖尿病患者肾损伤的影响。方法:早期2型糖尿病患者68例,采用多次皮下注射胰岛素（Multiple subcutaneous insulin injection,MDI）的方式,给予强化血糖治疗。强化治疗的标准为空腹血糖（FPG）<7.0 mmo L/L,餐后两小时血糖（2 h PG）<10.0 mmo L/L。所有患者血糖达标后,继续强化治疗3周,查患者空腹胰岛素（fasting insulin,FINS）水平≥15m U/L,即符合高胰岛素血症的诊断。将这些达到诊断标准的患者随机分成两组,即黄芪颗粒组（AG组）和高胰岛素血症组（HINS组）,每组20例,于分组后次日清晨（黄芪颗粒干预前,T0时间点）抽血检查空腹血糖（FPG）、餐后两小时血糖（2h PG）、糖化血红蛋白（Hb A1c）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、血肌酐（CREA）、血尿素氮（BUN）、视黄醇结合蛋白（RBP）、胱抑素C（Cys-C）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、超氧化物歧化酶（SOD）。留晨尿检测尿微量白蛋白（Ualb）。AG组患者在每天胰岛素强化治疗的基础上,服用黄芪颗粒,用法是每次4g,每天两次;HINS组患者继续进行胰岛素强化治疗,不加任何其他药物。两组患者均继续强化治疗9周。未达到高胰岛素血症诊断标准的28例患者可以自行选择继续治疗的方式,不再列入实验对象进行干预。AG组和HINS组于强化治疗结束后（黄芪颗粒干预后,T1时间点）抽血复查T0时间点的所有指标。结果:在T1时间点,与HINS组比较,AG组RBP、Cys-C、Ualb、MDA值均小于HINS组,而GSH-PX、SOD值均大于HINS组,具有统计学意义（P<0.05）。两组患者的FPG、2h PG在各自的组内,从T0到T1,有升高趋势,而Hb A1c有下降趋势（P<0.05）;在HINS组内,从T0到T1,RBP、Cys-C、Ualb、MDA有升高趋势,而GSH-PX、SOD有下降趋势（P<0.05）。结论:对早期2型糖尿病患者使用胰岛素进行强化治疗,血糖达标后,继续治疗超过3周,患者可以出现高胰岛素血症,这种高胰岛素血症持续9周以上,可以对肾脏有轻微的损伤作用,具体表现在可以使得RBP、Cys-C、Ualb等指标升高;也使得体内氧化应激水平增高,具体表现在MDA升高,GSH-PX、SOD降低。黄芪颗粒能够阻止高胰岛素血症下的RBP、Cys-C、Ualb水平的升高,还能够阻止高胰岛素血症下体内的氧化应激的增强,对肾脏有保护作用。第二部分黄芪甲苷对高胰岛素血症致实验性糖尿病大鼠肾损伤的影响及机制研究目的:在建立的高胰岛素血症的糖尿病大鼠模型上,研究AS-Ⅳ对高胰岛素血症诱导的肾脏损伤的影响,分析AS-Ⅳ保护肾脏作用的可能机制。方法:成功建立实验性糖尿病大鼠模型（腹腔注射STZ 55 mg/kg）,一周以后,采用皮下注射地特胰岛素（6U/day）的方式控制血糖,一直持续4周。4周后测量大鼠清晨的胰岛素水平,当INS>30μU/ml,认为高胰岛素血症大鼠模型成功建立。符合高胰岛素血症诊断的大鼠随机被分成5组,即高胰岛素血症组（HINS）、AS-Ⅳ（2.5、5和10 mg/kg/day,ig）组和Tempol（60mg/kg/day,ig）组;正常组（Control）作为空白对照。除了正常组外,所有的高胰岛素血症大鼠继续维持胰岛素治疗12周。血糖每隔1、2或4周测量一次,在第12周周末,检测Hb A1c、血清INS、CREA、BUN、ALT、AST、TG和TC。采用代谢笼法,在第4周、8周、12周周末收集24h尿液,测量24h尿白蛋白排泄率。检测肾脏上极组织的MDA、GSH-Px、SOD、IL-1β、TNF-α和COl-Ⅳ。使用HE、PAS染色观察常规肾脏病理切片;使用透射电镜观察肾小球超微结构。使用Western blot的方法,检测Nox4、p ERK1/2和TRPC6的蛋白表达。结果:1.与正常组比较,HINS组大鼠尿蛋白排泄率较高,有统计学意义（P<0.05）。AS-Ⅳ可以在一定程度上减轻白蛋白尿的症状。2.与正常组比较,HINS组MDA水平增加,GSH-Px和SOD水平降低,有统计学意义（P<0.05）。AS-Ⅳ可以明显减少MDA,增加GSH-Px和SOD。3.与正常组比较,HINS组IL-1β和TNF-α水平增加,有统计学意义（P<0.05）。AS-Ⅳ可以明显减少IL-1β和TNF-α。4.与正常组比较,HINS组Col-Ⅳ和LN水平增加,有统计学意义（P<0.05）。AS-Ⅳ可以明显减少Col-Ⅳ和LN。5.与正常组比较,HINS组出现轻度的肾小球系膜细胞增生,AS-Ⅳ可以阻止肾小球系膜细胞的增生。6.与正常组比较,HINS组肾小球基底膜增厚,足突细胞有少量融合,AS-Ⅳ可以阻止肾小球基底膜增厚以及足突细胞融合。7.与正常组比较,HINS组Nox4蛋白,p ERK1/2蛋白水平增加,TRPC6蛋白水平降低,有统计学意义（P<0.01）。AS-Ⅳ可以明显抑制Nox4和p ERK1/2蛋白的表达,而增加TRPC6蛋白的表达。结论:1.STZ诱导的糖尿病大鼠经过胰岛素强化治疗4周,可以出现高胰岛素血症,这种状态持续12周可以对肾脏造成损伤。2.AS-Ⅳ对高胰岛素血症对大鼠肾脏的损伤具有保护作用,其可能与抑制氧化应激、促炎症因子生成,下调Nox4和p ERK1/2蛋白的表达,增加TRPC6蛋白的表达有关。第三部分高胰岛素致人肾小球系膜细胞损伤的机制研究及黄芪甲苷的干预作用目的:研究NADPH氧化酶/ROS/ERK信号通路在高胰岛素致MCs损伤中的作用,探讨黄芪甲苷对此通路的干预调控及对高胰岛素致MCs损伤的影响。方法:1.将常规培养的MCs细胞分为以下6组:NG（5.6 m M葡萄糖）组,胰岛素（12.5、25、50、100、200 n M）组。将MCs分别孵育12h、24h、36h、48h、72h后,使用MTT的方法,检测各组细胞的增殖情况。2.将常规培养的MCs分为以下5组:（1）NG,（2）HINS（100n M）12h,（3）HINS（100n M）24h,（4）HINS（100n M）36h,（5）HINS（100n M）48h。采用实时荧光定量PCR法检测Nox4 m RNA和TRPC6 m RNA的表达;采用Western blot法检测Nox4蛋白和TRPC6蛋白的表达。3.将常规培养的MCs分为以下6组:（1）NG,（2）HINS（100n M）0.5h,（3）HINS（100n M）1h,（4）HINS（100n M）3h,（5）HINS（100n M）24h,（6）HINS（100n M）48h。分别给予高胰岛素培养至相应时间,HINS分别刺激0.5h、1h、3h、24h、48h,采用Western blot法检测相应时间MCs中ERK1/2蛋白的磷酸化水平。4.将常规培养的MCs细胞分为以下7组:（1）NG组,（2）NG+DPI（10μM）组,（3）NG+Tempol（100μM）组,（4）HINS（100n M）组,（5）HINS（100n M）+DPI（10μM）组,（6）HINS（100n M）+Tempol（100μM）组,（7）HINS（100n M）+U0126（10μM）组。分别给药48h后,采用MTT法对各组细胞的增殖情况进行检测。5.将常规培养的MCs细胞分为以下8组:（1）NG组,（2）NG+DPI（10μM）组,（3）NG+Tempol（100μM）组,（4）NG+U0126（10μM）组,（5）HINS（100n M）组,（6）HINS（100n M）+Tempol（100μM）组,（7）HINS（100n M）+DPI（10μM）组,（8）HINS（100n M）+U0126（10μM）组。分别给药48h后,采用DCFH-DA荧光探针法检测各组细胞的ROS水平。6.将常规培养的MCs分为以下5组:（1）NG组,（2）HINS（100n M）组,（3）HINS（100n M）+U0126 10μM组,（4）HINS（100n M）+DPI 10μM组,（5）HINS（100n M）+Tempol 100μM组。分别给药48h后,采用光度法检测各组细胞NADPH氧化酶活性,采用Western blot法检测各组细胞的Nox4蛋白、TRPC6蛋白的表达情况以及ERK1/2蛋白的磷酸化水平。7.将常规培养的MCs细胞分为以下5组:（1）NG组,（2）HINS（100n M）组,（3）HINS（100n M）+AS-Ⅳ25μM组,（4）HINS（100n M）+AS-Ⅳ50μM组,（5）HINS（100n M）+AS-Ⅳ100μM组。48h后,采用MTT法分别检测各组细胞的增殖情况。8.将常规培养的MCs分为以下6组:（1）NG组,（2）HINS（100n M）组,（3）HINS（100n M）+AS-Ⅳ25μM组,（4）HINS（100n M）+AS-Ⅳ50μM组,（5）HINS（100n M）+AS-Ⅳ100μM组,（6）HINS（100n M）+Tempol 100μM组,分别给药48h后,采用DCFH-DA荧光探针法检测各组细胞ROS水平。9.将常规培养的MCs分为以下6组:（1）NG组,（2）HINS（100n M）组,（3）HINS（100n M）+AS-Ⅳ25μM组,（4）HINS（100n M）+AS-Ⅳ50μM组,（5）HINS（100n M）+AS-Ⅳ100μM组,（6）HINS（100n M）+OAG 100μM组。给药48h后,采用实时荧光定量PCR法进行检测各组细胞的TRPC6 m RNA的表达水平,采用Western blot法进行检测各组细胞的TRPC6蛋白的表达水平。10.将常规培养的MCs分为以下6组:（1）NG组,（2）HINS（100n M）组,（3）HINS（100n M）+AS-Ⅳ25μM组,（4）HINS（100n M）+AS-Ⅳ50μM组,（5）HINS（100n M）+AS-Ⅳ100μM组,（6）HINS（100n M）+DPI 10μM组。分别给药48h后,采用光度法检测各组细胞NADPH氧化酶活性,采用实时荧光定量PCR法检测各组细胞的Nox4 m RNA的表达水平,采用Western blot法检测各组细胞的Nox4蛋白的表达水平。11.将常规培养的MCs分为以下6组:（1）NG组,（2）HINS（100n M）组,（3）HINS（100n M）+AS-Ⅳ25μM组,（4）HINS（100n M）+AS-Ⅳ50μM组,（5）HINS（100n M）+AS-Ⅳ100μM组,（6）HINS（100n M）+U0126 10μM组。给药48h后,采用Western blot法检测各组细胞ERK1/2蛋白的磷酸化水平。结果:1.高浓度胰岛素培养一定时间后,MCs的增殖显着升高,并可促进ROS的生成。高胰岛素促进系膜细胞增殖的作用能够被NADPH氧化酶抑制剂、ROS抑制剂和ERK通路抑制剂抑制。2.高浓度胰岛素培养一定时间后,MCs中Nox4 m RNA及蛋白表达水平显着上调。使用特异性信号分子抑制剂后,高胰岛素环境下MCs内Nox4蛋白和ROS的生成均显着降低,提示高胰岛素促系膜细胞增殖作用可能是通过上调Nox4亚基的表达,从而促进ROS生成来实现的。3.高浓度胰岛素培养一定时间后,MCs中ERK1/2蛋白的磷酸化水平显着上调,激活ERK信号通路。NADPH氧化酶抑制剂和ROS抑制剂均能显着抑制高胰岛素环境下MCs中ERK1/2蛋白的磷酸化,提示高胰岛素对MCs中ERK信号通路的调控作用与NADPH氧化酶性ROS具有密切的相关性。ERK通路被抑制时,对高胰岛素环境下MCs中Nox4蛋白表达水平以及ROS水平均没有明显影响,仅能抑制细胞异常增殖。提示在上述信号通路中ERK1/2活化处于NADPH氧化酶性ROS通路的下游。4.高浓度胰岛素培养一定时间后,MCs中TRPC6 m RNA和蛋白表达水平显着下调。当Nox4或p ERK1/2表达被抑制时,高胰岛素下调的TRPC6蛋白表达水平显着升高;此外当采用NADPH氧化酶抑制剂、ROS抑制剂、ERK通路抑制剂时均能显着增强高胰岛素环境下MCs中TRPC6蛋白的表达,提示高胰岛素可能是通过激活NADPH氧化酶/ROS/ERK信号通路来发挥对MCs中TRPC6蛋白表达的抑制作用。5.AS-Ⅳ可以抑制高胰岛素诱导的MCs异常增殖、Nox4亚基的表达上调、ROS生成、ERK1/2蛋白磷酸化以及TRPC6蛋白表达下调,从而发挥对系膜细胞中高胰岛素环境下的NADPH氧化酶/ROS/ERK信号通路的抑制作用。结论:1.高浓度胰岛素可以诱导MCs的异常增殖,并显着抑制系膜细胞TRPC6蛋白的表达。高胰岛素诱导系膜细胞损伤的作用可能是通过调节NADPH氧化酶/ROS/ERK信号通路来实现的,在该信号通路中,NADPH氧化酶性ROS生成可能是存在于ERK信号通路的上游。2.AS-Ⅳ对高胰岛素诱导的MCs异常增殖以及TRPC6蛋白下调减少具有有效的抑制作用。黄芪甲苷可能是通过抑制NADPH氧化酶/ROS/ERK信号通路来发挥其保护作用。
张慧杰[10]（2016）在《虫草益肾颗粒对人肾小球系膜细胞megsin及p38MAPK信号通路影响的研究》文中指出目的：基于三焦气化理论益肾泄浊法拟虫草益肾方制成虫草益肾颗粒并观察其对高糖培养下人肾小球系膜细胞（human glomerular mesangial cell, HMC）丝氨酸蛋白酶抑制剂serpinB7（megsin）及丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases signal pathway,p38MAPK）信号通路的影响,探讨虫草益肾颗粒对人肾小球系膜细胞保护作用的机制。方法：将50只雄性wistar大鼠随机分为正常组、虫草益肾颗粒高、中、低剂量组及福辛普利组5组,每组10只,每组大鼠灌胃给药：虫草益肾颗粒高、中、低剂量组中药溶液0.972g/（kg·d）.0.486g/（kg·d）.0.243g/ （kg·d）（含颗粒量）,福辛普利0.9 mg/（kg·d）水溶液,正常组等体积生理盐水,连续给药7天后根据血清药理学方法制备动物含药血清。将常规培养的HMC分为6组并给与相应处理：正常组（10%正常大鼠血清+RPMI-1640培养液）、高糖组（10%正常大鼠血清+30 mmol/L D-葡萄糖+RPMI-1640培养液）、虫草益肾颗粒高剂量组（10%虫草益肾颗粒高剂量组大鼠血清+30 mmol/L D-葡萄糖+RPMI-1640培养液）、虫草益肾颗粒中剂量组（10%虫草益肾颗粒中剂量组大鼠血清+30 mmol/L D-葡萄糖+RPMI-1640培养液）、虫草益肾颗粒低剂量组（10%虫草益肾颗粒低剂量组大鼠血清+30 mmol/L D-葡萄糖+RPMI-1640培养液）、福辛普利组（10%福辛普利组大鼠血清+30 mmol/L D-葡萄糖+RPMI-1640培养液）,MTT法检测24h、48h及72h细胞增殖情况,根据细胞增殖的差异性选取48h、72h两个时间点进行后续实验。于相应因素干预作用后的48h、72h,采用免疫细胞化学法检测各组细胞中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK（磷酸化丝裂原活化蛋白激酶）蛋白表达与分布,real-time PCR法检测serpinB7 mRNA.p38MAPK mRNA基因转录,采用western blot法检测megsin、 p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达。结果：（1）MTT结果显示：与正常培养环境相比,高糖（30 mmol/L D-葡萄糖）环境可刺激HMC增殖（P<0.05,P<0.01）；24h、48h、72h时,与高糖组相比,虫草益肾颗粒组及福辛普利组大鼠含药血清对HMC增殖均有抑制作用（P<0.05,P<0.01）；虫草益肾颗粒高剂量组抑制效果优于福辛普利组（P<0.05）；（2）免疫细胞化学结果显示：megsin与p38MAPK蛋白主要在HMC胞浆中表达,p-p38MAPK蛋白在HMC胞核与胞浆中均有表达48h、72h时,与正常组相比,高糖组HMC中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达均增加（P<0.01）,与高糖组相比,虫草益肾颗粒组与福辛普利组HMC中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达均降低（P<0.05,P<0.01）,且以虫草益肾颗粒高剂量组降低效果明显；（3）Real-time PCR结果显示：在正常环境培养下,HMC中即有serpinB7 mRNA、p38MAPK mRNA基因的转录48h、72h时,与正常组较比,高糖组HMC中serpinB7 mRNA、p38MAPK mRNA基因的转录明显增加（P<0.01）,与高糖组相比,虫草益肾颗粒组及福辛普利组HMC中serpinB7 mRNA、p38MAPK mRNA基因的转录降低（P<0.05,P<0.01）,且以虫草益肾颗粒高剂量组降低效果明显；72h时,虫草益肾颗粒高、中剂量组下调HMC中serpinB7 mRNA、p38MAPK mRNA基因的转录作用优于福辛普利组（P<0.05）；（4） Western blot结果显示：在正常环境培养下,HMC中megsin、 p38MAPK、p-p38MAPK蛋白均有表达48h、72h时,与正常组相比,高糖组HMC中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白的表达明显升高（P<0.01）；与高糖组相比,虫草益肾颗粒组及福辛普利组HMC中megsin、 p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达均降低（P<0.05,P<0.01）,且以虫草益肾颗粒高剂量组降低效果最明显（P<0.01）；观察含药血清对降低HMC中megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达作用方面,48h时,虫草益肾颗粒高剂量组优于福辛普利组（P<0.05）,72h时,虫草益肾颗粒高、中剂量组优于福辛普利组（P<0.05）。结论：（1）虫草益肾颗粒对高糖培养下HMC增殖具有抑制作用,且虫草益肾颗粒抑制效果优于福辛普利。（2）虫草益肾颗粒可抑制高糖培养下HMC增殖,其作用与下调HMC中 serpinB7 mRNA、p38MAPK mRNA基因的转录有关。（3）虫草益肾颗粒可抑制高糖培养下HMC增殖,其作用与降低megsin、p38MAPK蛋白的表达、抑制p38MAPK磷酸化,从而抑制p38MAPK信号向细胞核内转导的通路有关。（4）虫草益肾颗粒的对高糖培养下HMC增殖的抑制效果在一定程度上呈时间依赖性和剂量依赖性关系。（5）虫草益肾颗粒可通过影响megsin及p38MAPK信号转导通路从而抑制高糖环境HMC的增殖可能是其降低细胞外基质堆积减轻肾间质纤维化的机制之一。
二、高浓度葡萄糖对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、高浓度葡萄糖对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响（论文提纲范文）
（1）人工虫草CPD0300活性组分对糖尿病肾病的治疗作用及其制剂研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 1. 糖尿病肾病 |
| 1.1 糖尿病肾病的流行病学 |
| 1.2 糖尿病肾病的病情进展 |
| 1.3 糖尿病肾病的发病机制 |
| 2. 冬虫夏草 |
| 2.1 冬虫夏草的药理作用 |
| 2.2 冬虫夏草的活性成分 |
| 3. 本课题的研究意义和设计思路 |
| 参考文献 |
| 第一部分 人工虫草CPD0300菌粉体外抗糖尿病肾病活性部位的筛选 |
| 前言 |
| 第一章 提取工艺的考察 |
| 一、实验材料 |
| 1.1 药品和试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验细胞 |
| 二、实验方法 |
| 2.1 供试品的制备和试剂的配制 |
| 2.2 体外活性评价 |
| 2.3 统计学分析 |
| 三、结果 |
| 3.1 不同工艺提取物对RMC细胞活力的影响 |
| 3.2 不同工艺提取物对ECM表达的抑制作用 |
| 四、讨论 |
| 五、本章小结 |
| 第二章 人工虫草CPD0300菌粉各组分分离纯化及抗糖尿病肾病活性筛选 |
| 一、实验材料 |
| 1.1 药品和试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验细胞 |
| 二、实验方法 |
| 2.1 多糖的分离纯化及鉴别 |
| 2.2 核苷类组分的分离纯化及成分分析 |
| 2.3 甾醇类组分的分离纯化及成分分析 |
| 2.4 各组分抗糖尿病肾病活性筛选 |
| 2.5 统计学分析 |
| 三、结果 |
| 3.1 多糖的质量评价 |
| 3.2 核苷提取物的成分分析 |
| 3.3 甾醇提取物的成分分析 |
| 3.4 各组分抗糖尿病肾病活性筛选 |
| 四、讨论 |
| 五、本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 人工虫草活性组分对糖尿病肾病的治疗作用及机制研究 |
| 前言 |
| 第三章 核苷提取物对糖尿病肾病的治疗作用及机制研究 |
| 一、实验材料 |
| 1.1 药品和试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 细胞和动物 |
| 二、实验方法 |
| 2.1 试剂配制 |
| 2.2 糖尿病模型小鼠的建立及分组 |
| 2.3 肾功能指标的测定 |
| 2.4 肾脏组织病理检查 |
| 2.5 细胞培养和给药 |
| 2.6 Western blot法测定蛋白表达 |
| 2.7 RT-PCR测定mRNA表达 |
| 2.8 统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 核苷提取物对糖尿病肾病小鼠体重和血糖的影响 |
| 3.2 核苷提取物对糖尿病肾病小鼠肾功能的影响 |
| 3.3 核苷提取物对糖尿病肾病小鼠肾脏组织病理变化的影响 |
| 3.4 核苷提取物对上皮间质转分化的影响 |
| 3.5 核苷提取物对细胞外基质积聚的影响 |
| 3.6 核苷提取物通过p38/ERK通路抑制EMT和ECM积累 |
| 四、讨论 |
| 五、本章小结 |
| 第四章 麦角甾醇对糖尿病肾病的治疗作用及机制研究 |
| 一、实验材料 |
| 1.1 药品和试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 细胞和动物 |
| 二、实验方法 |
| 2.1 试剂配制 |
| 2.2 糖尿病模型小鼠的建立及分组 |
| 2.3 代谢参数和肾功能参数的测定 |
| 2.4 肾脏组织病理检查 |
| 2.5 细胞培养和给药 |
| 2.6 MTT法测定细胞增殖 |
| 2.7 Western blot法测定蛋白表达 |
| 2.8 RT-PCR测定mRNA表达 |
| 2.9 统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 麦角甾醇对糖尿病肾病小鼠体重和血糖的影响 |
| 3.2 麦角甾醇对糖尿病肾病小鼠肾功能参数的影响 |
| 3.3 麦角甾醇对糖尿病肾病小鼠肾脏组织病理变化的影响 |
| 3.4 麦角甾醇对糖尿病状态下肾系膜细胞增殖的影响 |
| 3.5 麦角甾醇对糖尿病状态下细胞外基质积聚的影响 |
| 3.6 麦角甾醇通过TGF-β1/Smad2通路抑制肾系膜细胞增殖和ECM积聚 |
| 四、讨论 |
| 五、本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 人工虫草改良制剂的制备及其在大鼠体内的药物动力学研究 |
| 前言 |
| 第五章 人工虫草改良制剂的制备及其在大鼠体内的药物动力学研究 |
| 一、实验材料 |
| 1.1 药品和试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 实验动物 |
| 二、实验方法 |
| 2.1 麦角甾醇在不同增溶溶液中的溶解度测定 |
| 2.2 血浆中麦角甾醇含量测定方法的建立 |
| 2.3 药物动力学实验 |
| 2.4 统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 麦角甾醇在不同增溶溶液中的溶解度 |
| 3.2 血浆中麦角甾醇含量测定方法的建立 |
| 3.3 药物动力学实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、本章小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 麦角甾醇纳米脂质载体的制备和评价 |
| 前言 |
| 第六章 麦角甾醇纳米脂质载体制备工艺的研究 |
| 一、实验材料 |
| 1.1 药品和试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 二、实验方法 |
| 2.1 ERG-NLCs含量测定方法的建立 |
| 2.2 包封率和载药量测定方法的建立 |
| 2.3 ERG-NLCs制备方法的考察 |
| 2.4 ERG-NLCs最优处方的验证及质量评价 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 ERG-NLCs含量测定方法的建立 |
| 3.2 包封率和载药量测定方法的建立 |
| 3.3 ERG-NLCs制备方法的考察 |
| 3.4 ERG-NLCs最优处方的验证及质量评价 |
| 四、讨论 |
| 五、本章小结 |
| 第七章 麦角甾醇纳米脂质载体冻干制剂的研究 |
| 一、实验材料 |
| 1.1 药品和试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 二、实验方法 |
| 2.1 冻干工艺的确定 |
| 2.2 冻干产品的评价 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 冻干工艺的确定 |
| 3.2 冻干产品的评价 |
| 四、讨论 |
| 五、本章小结 |
| 第八章 麦角甾醇纳米脂质载体的体内药物动力学和体外药效评价 |
| 一、实验材料 |
| 1.1 药品和试剂 |
| 1.2 实验仪器 |
| 1.3 细胞和动物 |
| 二、实验方法 |
| 2.1 血浆中麦角甾醇含量测定方法的建立 |
| 2.2 药物动力学实验 |
| 2.3 细胞培养 |
| 2.4 MTT法测定细胞毒性 |
| 2.5 MTT法测定细胞增殖 |
| 2.6 Western blot法测定蛋白表达 |
| 2.7 统计学分析 |
| 三、实验结果 |
| 3.1 血浆中麦角甾醇含量测定方法的建立 |
| 3.2 药物动力学实验结果 |
| 3.3 ERG-NLCs的细胞毒性 |
| 3.4 ERG-NLCs对高糖诱导的RMC细胞增殖抑制作用 |
| 3.5 ERG-NLCs对高糖诱导的RMC细胞ECM积聚的影响 |
| 四、讨论 |
| 五、本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（2）海带低分子量褐藻多糖硫酸酯对糖尿病肾病的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 糖尿病肾病 |
| 1.2 糖尿病肾病药物治疗现状 |
| 1.3 褐藻多糖硫酸酯特性 |
| 1.4 褐藻多糖硫酸酯生物活性 |
| 1.4.1 抗凝血作用 |
| 1.4.2 抗炎症作用 |
| 1.4.3 抗氧化作用 |
| 1.5 褐藻多糖硫酸酯对糖尿病肾病治疗研究进展 |
| 1.6 表面等离子体共振技术介绍 |
| 1.7 肠道菌群 |
| 1.7.1 肠道菌群与糖尿病 |
| 1.7.2 肠道菌群与肾病 |
| 1.7.3 肠道菌群与多糖 |
| 1.8 研究目的及意义 |
| 1.9 技术路线 |
| 第2章 LMWF抑制肾小球系膜细胞病变的作用机理研究 |
| 前言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验试剂盒 |
| 2.1.5 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 HRMCs在含不同浓度FBS培养基中生长状况 |
| 2.2.2 LMWF抑制HRMCs异常增殖 |
| 2.2.3 LMWF抑制HRMCs肥大 |
| 2.2.4 LMWF电负性变化及中和条件选择 |
| 2.2.5 LMWF降低内毒素含量 |
| 2.2.6 LMWF降低乳酸脱氢酶活性 |
| 2.2.7 蛋白质组学分析 |
| 2.2.8 差异表达蛋白验证 |
| 2.2.9 FN在 HRMCs中分布情况 |
| 2.2.10 LMWF在 HRMCs中分布情况 |
| 2.2.11 LMWF与 FN共定位 |
| 2.2.12 SPR检测LMWF与 FN特异性结合 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 LMWF改善AGEs引起的HRMCs异常生长 |
| 2.3.2 PS中和LMWF电负性 |
| 2.3.3 LMWF降低AGEs带来的细胞损伤 |
| 2.3.4 聚焦细胞外基质-受体相互作用及FN |
| 2.3.5 LMWF与 FN相互作用 |
| 2.3.6 PS促进LMWF改善HRMCs损伤 |
| 第3章 LMWF对大鼠糖尿病肾病的治疗效果研究 |
| 前言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验材料 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 实验试剂 |
| 3.1.5 实验试剂盒 |
| 3.1.6 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 生长相关指标 |
| 3.2.2 血清生化指标 |
| 3.2.3 葡萄糖耐量 |
| 3.2.4 胰岛素耐量 |
| 3.2.5 肾脏功能相关指标 |
| 3.2.6 肾脏形态学观察 |
| 3.2.7 肾脏炎症因子 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 LMWF未降低DN大鼠血糖水平 |
| 3.3.2 LMWF改善糖尿病大鼠肾脏损伤 |
| 3.3.3 LMWF抑制肾脏炎症细胞因子上调 |
| 3.3.4 LMWF缓解DN与肠道菌群相关 |
| 第4章 LMWF对 DN大鼠肠道功能及肠道菌群的影响 |
| 前言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验材料 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 实验试剂 |
| 4.1.5 实验试剂盒 |
| 4.1.6 实验方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 肠道通透性 |
| 4.2.2 内毒素 |
| 4.2.3 24 h粪便量 |
| 4.2.4 结肠长度 |
| 4.2.5 LMWF对 DN大鼠肠道菌群的影响 |
| 4.2.6 肾脏功能相关指标与肠道菌群关联性分析 |
| 4.2.7 LMWF对粪乳杆菌生长的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 LMWF改善DN大鼠肠道病变 |
| 4.3.2 LMWF调节DN大鼠肠道菌群 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词表 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 发表的学术论文与研究成果 |
（3）活性维生素D3通过TREM-1调控糖尿病肾病巨噬细胞功能及表型的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语注释表(Abbreviations) |
| 绪论 |
| 参考文献 |
| 文献综述一:活性维生素D3通过免疫调节防治糖尿病肾病研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述二:髓样细胞触发受体在肾脏疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 文献综述三:信号转导子和转录激活子与肾脏疾病 |
| 参考文献 |
| 第一部分 高糖状态下巨噬细胞功能和表型的变化 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 研究内容 |
| 1.4 结果 |
| 1.5 讨论 |
| 1.6 结论 |
| 1.7 参考文献 |
| 第二部分 STAT-1/TREM-1 在高糖调节巨噬细胞功能和表型中的作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 研究内容 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 结论 |
| 2.7 参考文献 |
| 第三部分 活性维生素D对高糖状态下巨噬细胞功能、表型、STAT-1及TREM-1表达的调节作用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 研究内容 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 结论 |
| 3.7 参考文献 |
| 第四部分 STAT-1/TREM-1通路在活性维生素D调节巨噬细胞功能和表型中的作用 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.3 研究内容 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 4.7 参考文献 |
| 全文总结与展望 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）基于miR-21靶向Akt/mTOR信号通路探讨补气生血法调控自噬防治早期糖尿病肾病临床和实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1 补气生血法 |
| 2 现代医学对早期DN及自噬的认识 |
| 3 中医药学对早期DN及自噬的认识 |
| 4 总体思路及探究问题 |
| 参考文献 |
| 第二部分 临床研究 基于中医辅助传承系统的早期糖尿病肾病临床用药规律分析 |
| 1 方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 实验研究 |
| 实验一 当归补血汤含药血清对高糖作用下肾足细胞增殖、凋亡及自噬的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验二 当归补血汤含药血清对高糖作用下肾足细胞自噬相关蛋白的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验三 当归补血汤对早期DN大鼠肾功能及足细胞自噬的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 实验四 当归补血汤干预miR-21靶向Akt/mTOR信号通路对早期DN大鼠足细胞自噬活性影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 附录 |
| 一、文献综述 |
| 参考文献 |
| 二、在校期间发表的论文情况 |
| 致谢 |
（5）PTHrP参与糖尿病肾病中氧化应激和炎症的调控（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 主要缩略词表 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间公开发表学术论文目录 |
| 致谢 |
（6）KATP在高糖诱导的肾系膜细胞增殖和基质蛋白合成中的作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一部分 KATP通道在肾小球系膜细胞上的分布和定位以及高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖模型的建立 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 KATP通道开放剂对高糖诱导下肾小球系膜细胞增殖及基质蛋白合成的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 高糖状态下AMPK的激活对于肾小球系膜细胞KATP通道活性的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结与展望 |
| 综述一 |
| 参考文献 |
| 综述二 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学位论文和科研成果 |
| 致谢 |
（7）从CPN1在5/6肾切除大鼠中的表达变化探讨升清降浊胶囊的药物作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 CKD的现代医学研究进展 |
| 一、CKD的流行病学研究 |
| 二、CKD的定义与分期 |
| 三、CKD的发病机制 |
| 四、CKD的防治 |
| 第二节 CKD的中医研究进展 |
| 一、古代医家对CKD病因病机的认识 |
| 二、近现代医家对CKD病因病机的认识 |
| 三、近现代中医对CKD辨治方药的认识 |
| 第三节 升清降浊胶囊治疗CKD的研究进展 |
| 一、升清降浊胶囊药物组成分析 |
| 二、升清降浊胶囊治疗CKD的研究 |
| 第四节 CPN1相关研究进展 |
| 一、羧肽酶N (Carboxypeptidase N,CPN)的发现 |
| 二、CPN1相关生理功能的研究 |
| 三、CPN1与CKD的研究 |
| 第五节 CKD动物模型构建的研究进展 |
| 一、5/6肾切除肾病动物模型 |
| 二、腺嘌呤肾病动物模型 |
| 三、阿霉素肾病动物模型 |
| 第二章 动物实验部分 |
| 实验一 升清降浊胶囊对5/6肾切除大鼠肾功能及尿蛋白影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计分析 |
| 四、实验结果 |
| 实验二 升清降浊胶囊对5/6肾切除大鼠肾脏病理形态的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、切片观察 |
| 实验三 升清降浊胶囊对5/6肾切除大鼠肾组织CPN1 mRNA表达的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| 实验四 升清降浊胶囊对5/6肾切除大鼠尿液、肾组织CPN1蛋白表达的影响 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| 第三章 讨论部分 |
| 第一节 5/6肾切除动物肾病模型的探讨 |
| 第二节 升清降浊胶囊药物作用机制的探讨 |
| 一、升清降浊胶囊对5/6肾切除大鼠肾功能及尿蛋白影响 |
| 二、升清降浊胶囊对5/6肾切除大鼠肾脏病理形态的影响 |
| 三、对CPN1在5/6肾切除大鼠中表达量改变情况的分析 |
| 四、升清降浊胶囊上调CPN1水平在CKD进展中的作用机制探讨 |
| 五、对实验结果中出现问题的分析 |
| 结语 |
| 一、全文小结 |
| 二、创新点 |
| 三、不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 研究生在学期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（8）益气解毒活络中药组分配伍对人肾小球系膜细胞损伤的保护作用研究（论文提纲范文）
| 中文论着摘要 |
| 英文论着摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 理论研究：中医糖尿病肾病病名及病因病机研究 |
| 论文一 益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂环境下人肾小球系膜细胞增殖活性的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果(附论文图片) |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 益气解毒活络中药组分配伍对高糖环境下人肾小球系膜细胞ECM合成的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂环境下人肾小球系膜细胞MCP-1、TGF-β1mRNA及蛋白表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文四 益气解毒活络中药组分配伍对高糖高脂环境下人肾小球系膜细胞PPAR-γmRNA及NF-κB蛋白表达影响 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 科技查新报告 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（9）黄芪甲苷对高胰岛素致肾损伤的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分：黄芪对高胰岛素血症致早期2型糖尿病患者肾损伤的影响 |
| 1、资料 |
| 2、方法 |
| 3、结果 |
| 4、小结 |
| 第二部分：黄芪甲苷对高胰岛素血症致实验性糖尿病大鼠肾损伤的影响及机制研究 |
| 1、材料 |
| 2、方法 |
| 3、结果 |
| 4、小结 |
| 第三部分：高胰岛素致人肾小球系膜细胞损伤的机制研究及黄芪甲苷的干预作用 |
| 1、材料 |
| 2、方法 |
| 3、结果 |
| 4、小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 综述 |
| 参考文献 |
（10）虫草益肾颗粒对人肾小球系膜细胞megsin及p38MAPK信号通路影响的研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 1. 中医学对糖尿病肾脏疾病的研究进展 |
| 1.1 中医学对糖尿病.肾脏疾病病名的认识 |
| 1.2 中医学对糖尿病肾脏疾病病因的认识 |
| 1.3 中医学对糖尿病肾脏疾病病机的认识 |
| 1.4 中医学对糖尿病肾脏疾病的研究进展 |
| 2. 现代医学对糖尿病肾脏疾病的认识 |
| 2.1 糖尿病肾脏疾病流行病学研究 |
| 2.2 糖尿病肾脏疾病的病因与发病机制研究 |
| 2.3 现代医学对糖尿病肾脏疾病的研究进展 |
| 3. Megsin、p38MAPK信号转导通路与糖尿病肾脏疾病 |
| 3.1 Megsin与糖尿病肾脏疾病 |
| 3.2 p38MAPK信号转导通路与糖尿病肾脏疾病 |
| 附图 |
| 实验研究 |
| 实验一 虫草益肾颗粒对高糖培养下人肾小球系膜细胞增殖影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 实验二 免疫细胞化学法检测虫草益肾颗粒对人肾小球系膜细胞megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 实验三 Real-time PCR法检测虫草益肾颗粒对人肾小球系膜细胞SerpinB7 mRNA、p38MAPK mRNA表达影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 实验四 Western blot法检测虫草益肾颗粒对人肾小球系膜细胞megsin、p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表达影响 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 实验结果 |
| 讨论 |
| 1. 实验设计 |
| 1.1 中药血清药理学方法评价 |
| 1.2 细胞模型的选择 |
| 1.3 检测时间的选择 |
| 1.4 对照组药物的选择 |
| 1.5 实验方法与检测技术的选择 |
| 2. 虫草益肾颗粒方药分析 |
| 2.1 组方分析 |
| 2.2 药理研究 |
| 3. 虫草益肾颗粒对高糖培养下HMC增殖的影响 |
| 4. 虫草益肾颗粒对HMC中megsin、p38MAPK信号转导通路的影响 |
| 4.1 对HMC中megsin的影响 |
| 4.2 对HMC中p38MAPK信号转导通路的影响 |
| 4.3 探讨megsin与p38MAPK信号通路的关系 |
| 5. 不足与展望 |
| 结论 |
| 基金 |
| 创新点说明 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 个人简历 |
四、高浓度葡萄糖对大鼠肾小球系膜细胞增殖的影响（论文参考文献）
- [1]人工虫草CPD0300活性组分对糖尿病肾病的治疗作用及其制剂研究[D]. 董中华. 山东大学, 2020(08)
- [2]海带低分子量褐藻多糖硫酸酯对糖尿病肾病的作用机制研究[D]. 王菁. 中国科学院大学(中国科学院海洋研究所), 2020(01)
- [3]活性维生素D3通过TREM-1调控糖尿病肾病巨噬细胞功能及表型的研究[D]. 赵宇. 东南大学, 2019(05)
- [4]基于miR-21靶向Akt/mTOR信号通路探讨补气生血法调控自噬防治早期糖尿病肾病临床和实验研究[D]. 叶太生. 湖北中医药大学, 2019(03)
- [5]PTHrP参与糖尿病肾病中氧化应激和炎症的调控[D]. 周健. 武汉大学, 2017(06)
- [6]KATP在高糖诱导的肾系膜细胞增殖和基质蛋白合成中的作用[D]. 张贝. 第二军医大学, 2017(06)
- [7]从CPN1在5/6肾切除大鼠中的表达变化探讨升清降浊胶囊的药物作用机制[D]. 肖幸. 广州中医药大学, 2017(05)
- [8]益气解毒活络中药组分配伍对人肾小球系膜细胞损伤的保护作用研究[D]. 辛彩虹. 辽宁中医药大学, 2017(05)
- [9]黄芪甲苷对高胰岛素致肾损伤的影响及机制研究[D]. 贺克强. 安徽医科大学, 2017(12)
- [10]虫草益肾颗粒对人肾小球系膜细胞megsin及p38MAPK信号通路影响的研究[D]. 张慧杰. 黑龙江中医药大学, 2016(08)