一、HBSAg及B_(7-1)双表达逆转录病毒载体的构建及其在真核细胞中表达（论文文献综述）
韦茏芹[1]（2020）在《鸡卵清蛋白启动子功能分析及验证》文中研究说明转基因鸡输卵管生物反应器具有高产蛋能力,转基因鸡群快速扩繁能力和与人类相似的蛋白糖基化形式,在药用蛋白生产方面具有不可替代的作用。到目前为止,相继建立了鸡蛋卵白（eggwhite）中表达干扰素、溶菌酶、抗体、促红细胞生成素、表皮生长因子等重组蛋白的转基因鸡。但是对于不同长度卵清蛋白启动子（OVP）活性,以及雌激素应答元件（ERE）和卵清蛋白上游启动子转录因子（COUP-TF）调控作用缺乏系统研究;其次,作为外源基因转移的有效载体,鸡原始生殖细胞（PGCs）分离培养方法也待探讨。本研究的目的是确定鸡OVP核心区域,筛选高转录活性的OVP;探讨ERE和COUP-TF调控作用;摸索鸡PGCs适宜培养方法;通过体外和体内验证试验,确定可望用于制备输卵管生物反应器的OVP。1.CRISPR-d Cas9-VP64介导的鸡卵清蛋白启动子转录活性分析。将启动子cERE-cOVP-2785、cOVP-2785分别亚克隆至p GL3-Basic载体,构建了荧光素酶表达载体p GL3-cERE-cOVP-2785、p GL3-cOVP-2785。利用Lipofectamine?2000将上述2个质粒以及p GL3cOVP-1548分别与p RL-TK质粒共转染293T细胞,检测荧光素酶活性,评估三个启动子的转录活性。利用在线软件Optimized CRISPR Design,依据鸡卵清蛋白（OVA）基因第一内含子、转录起始位点上游区域DNA序列,共设计11对sg RNA;依据鸡ERE序列设计了2对sg RNA,分别构建了11个p GL3-U6-OVPsg RNA和2个p GL3-U6-EREsg RNA重组质粒;将p GL3-cERE-cOVP-2785、pc DNAd Cas9或pc DNA-d Cas9-VP64质粒分别与单个或多个sg RNA表达质粒共转染293T细胞,检测荧光素酶活性,评估启动子和ERE对荧光素酶表达的影响。结果表明,（1）cERE-cOVP-2785启动子片段的转录活性最高,cOVP-2785次之;（2）d Cas9-VP64对荧光素酶激活效应强于d Cas9;（3）多个sg RNA引导的d Cas9-VP64转录激活效应优于单个sg RNA;（4）第1内含子和转录起始位点上游以及ERE区域每个sg RNA均能靶向激活荧光素酶表达。（5）培养液中添加雌激素显着提升荧光素酶表达水平。2.鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅰ/Ⅱ（COUP-TFⅠ/Ⅱ）功能分析。构建pcDNA3.1-His C-COUP-TFⅠ及pc DNA3.1-His C-COUP-TFⅡ重组质粒,利用Lipofectamine?2000分别或共同将pc DNA3.1-His C-COUP-TFⅠ和pc DNA3.1-His C-COUP-TFⅡ与p GL3-cERE-cOVP-2785或p GL3-cOVP-2785以及p RL-TK质粒共转染293 T细胞,检测荧光素酶活性,以此评估COUPTFⅠ/Ⅱ对荧光素酶表达调控作用。结果表明,（1）COUP-TFI/II与cEREOVP2785联合作用,上调荧光素酶表达,发挥正调控作用;（2）COUP-TF I/II与OVP2785联合作用,下调荧光素酶表达,呈现负调控作用;（3）COUPTFI和COUP-TFII两个转录因子发挥协同作用,调控荧光素酶表达,且COUP-TFⅡ调控作用大于COUP-TFⅠ。3.鸡原始生殖细胞（PGCs）的分离及培养。分别采用Ficoll密度梯度离心法和酶消化法从HH-14期鸡胚血液和HH-28期鸡胚性腺中分离PGCs,分别接种至BRL、STO和CEF饲养层上,比较PGCs增殖能力,并对其生物学特性加以鉴定;此外,对DMSO和乙二醇的冻存效能进行了对比研究。结果表明,（1）来自性腺的PGCs（g PGCs）增殖能力优于来自血液的PGCs（b PGCs）;（2）以BRL为饲养层,在培养基中添加40%BRL条件培养液和细胞因子SCF（6ng/m L）、b FGF（4ng/m L）和LIF（10TU/m L）,可以使PGCs连续培养100天以上,是鸡PGCs培养的优选方法;（3）鸡PGCs对PAS和AKP染色,以及SSEA-1免疫荧光染色均呈现阳性反应,在体外分化培养时能形成类胚体;（4）与10%DMSO相比,用10%乙二醇冻存的鸡PGCs复苏后成活率较高,是鸡PGCs适宜的冻存剂。4.鸡卵清蛋白启动子体内外功能验证。采用X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent,将慢病毒载体p Lenti6.4/cERE-cOVP-2785/c SLP-EGFP与包装质粒ps PAX2和p MD2.G以及p RSV-Rev共转染293T细胞,超速离心法浓缩慢病毒,La SRT法测定慢病毒滴度。慢病毒体外感染鸡OECs、鸡性腺PGCs以及293T细胞,以EGFP表达效率体外验证cERE-cOVP-2785功能;慢病毒注射2.5日龄鸡胚背主动脉,换壳培养,直至出壳。荧光蛋白手电筒和配套滤镜观察鸡胚性腺EGFP表达效率,PCR检测EGFP整合效率,体内验证cERE-cOVP-2785功能。结果表明,（1）EGFP在鸡OECs、性腺PGCs均有表达,但在293T细胞中没有表达,说明该启动子具有组织特异性;（2）EGFP在鸡胚性腺中表达,且EGFP可整合宿主性腺基因组,表明cERE-cOVP-2785能有效驱动外源基因在性腺中表达,但转基因表达稳定性尚需进一步验证。结论:卵清蛋白基因转录起始位点上游-54～-807bp区域和第1内含子均为卵清蛋白启动子核心序列;cERE-cOVP-2785是适宜的卵清蛋白启动子,因为其转录活性高,ERE具有增强子作用;COUP-TFⅠ/Ⅱ与cERE-cOVP-2785,对下游基因发挥正调控作用;以BRL为饲养层,在培养基中添加40%BRL条件培养液和细胞因子SCF（6ng/m L）、b FGF（4ng/m L）和LIF（10TU/m L）,是鸡g PGCs培养的优选方法;启动子cERE-cOVP-2785可以有效驱动EGFP体外和体内特异性表达,有望用于输卵管特异性表达转基因鸡研究。
杨惠[2]（2020）在《绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白诱导细胞自噬参与肿瘤形成的研究》文中提出绵羊肺腺瘤病毒（Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV）囊膜蛋白（Envelope,Env）可在体外诱导细胞转化、体内介导肿瘤形成。JSRVEnv如何打破宿主细胞平衡引起转化,需要从细胞稳态角度探讨致瘤机制。自噬（Autophagy）是维持细胞稳态的重要手段。截至目前,探讨JSRVEnv与自噬的研究仍是空白。因此,本研究旨在探讨JSRV Env转化细胞中自噬的相应变化,开展如下试验:1.针对自然感染OPA肺组织进行RNA-seq分析。结果显示:OPA肺组织中差异转录本与16个受细胞自噬调控的生物学功能模块相关,并与PI3K/Akt-mTOR、MAPK等调控自噬的信号转导通路高度关联。表明自噬可能参与OPA过程。2.JSRV env全基因序列同源重组入pCMV-dR8.91后包装、纯化。通过感染复数（multiplicity of infection,MOI）梯度试验,JSRV env慢病毒感染STCs最适MOI为5,感染NIH 3T3细胞最适MOI为30。表明JSRV env过表达慢病毒构建成功,并能感染STCs及NIH 3T3细胞。3.JSRV env慢病毒感染STCs及NIH 3T3细胞72h后,细胞增殖、迁移、侵袭能力均显着增强（p<0.05）,10d即可在软琼脂中形成明显集落。转化细胞注入裸鼠皮下 28d 形成明显肿瘤（STCs:1.94±0.83 cm3;NIH3T3:3.24±0.47cm3）。表明JSRV env慢病毒感染的STCs及NIH 3T3细胞发生转化。4.针对OPA肺组织和JSRVEnv转化细胞进行自噬因子检测,Beclin-1、p62表达量均显着下调（p<0.05）,LC3表达量下调。JSRV Env转化细胞内自噬体数量显着降低（p<0.05）。JSRV Env与Beclin-1在OPA肺组织中共定位,JSRV Env与Beclin-1在转化细胞中共沉淀。表明JSRVEnv转化细胞的自噬稳态降低,自噬体数量减少,且JSRVEnv与Beclin-1互作。5.当使用PepstatinA抑制自噬体与溶酶体融合,JSRV Env转化细胞中LC3Ⅱ可在短时期内大量积累。p62伴随转染时间延长（0-72h）而大量降解。表明JSRV Env转化细胞中存在完整的自噬流通。6.针对裸鼠成瘤模型（STCs:1.17±0.06 cm3;NIH 3T3:1.23±0.01 cm3）连续给予 3-MA（2mg/kg/d）和 RAPA（1mg/kg/d）28d。与对照组相比,3-MA 组及RAPA组肿瘤体积及重量均显着下调（p<0.05）。在STCs形成的JSRVEnv肿瘤中,3-MA组E-cadherin阳性信号显着大于对照组（p<0.05）,Vimentin 阳性信号显着小于对照组（p<0.05）。RAPA组E-cadherin与Vimentin 阳性信号与对照组相比均无显着差异。表明RAPA作为自噬激活剂及mTOR抑制剂,其对肿瘤进展的影响不仅取决于自噬调控,还可能与mTOR信号转导抑制相关。而3-MA是通过降低细胞自噬稳态影响细胞转化来抑制肿瘤进展。本试验揭示的OPA病肺组织差异表达基因能为未来筛选OPA潜在生物学标志物提供研究基础。本研究构建的JSRVEnv过表达慢病毒、JSRVEnv转化细胞及JSRVEnv裸鼠皮下移植瘤模型均能为今后探讨JSRVEnv分子致病机制提供稳定、高效的基础研究工具。本试验探讨的自噬在JSRVEnv转化细胞中的相应变化及相关作用,可为今后OPA的预防控制提供新思路。
何武兵[3]（2020）在《重组慢病毒介导的BMP2和TGF-β3共转染修饰大鼠骨髓基质干细胞在脊柱融合中成骨分化的协同作用》文中指出背景:组织工程人工骨中骨髓间充质干细胞（BMSCs）、骨生长因子和合适的载体发挥重要作用。研究编码人骨形态发生蛋白2（hBMP2）和转化生长因子β 3（TGF-β3）的慢病毒（LV）对BMSCs的体内外成骨分化,促进骨形成,协同提高脊柱融合效果。方法:构建编码hBMP2和/或hTGF-β3基因的慢病毒并转染大鼠BMSCs。转染后BMSCs成骨分子的表达使用qRT-PCR和蛋白质印迹进行检测。构建大鼠腰椎后外侧横突间融合模型。术后通过放射学、手工触诊、Micro-CT和组织学进行评估融合效果。结果:hBMP2和/或hTGF-β3基因通过聚合酶链反应扩增,DNA测序,以及BLAST分析来确认。编码hBMP2和/或hTGF-β3基因的慢病毒感染的BMSCs可有效地过表达hBMP2和hTGF-β3,以及上调培养上清液中hBMP2和hTGF-β3的水平。共转染hBMP2和hTGF-β3比单独转染hBMP2或hTGF-β3更有效地诱导BMSCs成骨分化。LV-hBMP2和LV-hTGF-β3共转染组（分别编码hBMP2和hTGF-β 3的LV转染的BMSCs混合使用）和LV-hBMP2-hTGF-β3组（编码hBMP2和hTGF-β3融合基因的LV转染的BMSCs）中骨桥蛋白（OPN）,骨钙蛋白（OCN）和骨保护素（OPG）的表达水平显着高于LV-BMP2（LV携带hBMP2转染的BMSCs）组和 LV-hTGF-β3（LV 携带 hTGF-β3 转染的 BMSCs）组（P<0.05）。hBMP2和/或hTGF-β3过表达上调碱性磷酸酶（ALP）活性。大鼠腰椎后外侧植入术后2周、4周、6周、8周通过放射学评估骨生长情况。大鼠腰椎后外侧植入术后8周,通过手工触诊、Micro-CT和组织学进行评估。LV-hBMP2和LV-hTGF-β3组1只（共5只）,和LV-hBMP2-hTGF-β3组4只（共8只）大鼠脊柱全部融合;LV-空载体组6只（共7只）,LV-hBMP2组1只（共8只）和LV-hTGF-β3组1只（共10只）大鼠脊柱全部植入处均未见明显骨痂生长;其余各组大鼠脊柱植入处可见部分骨痂,但是无法融合。结论:本研究表明慢病毒载体能够成功转导hBMP2和/或hTGF-β3基因,靶向基因可在BMSCs中成功过表达。我们的体外实验表明,联合使用hBMP2和hTGF-β3基因可以协同诱导骨分化。本实验条件下,慢病毒携带hBMP2和hTGF-β3基因感染的BMSCs,分别单独产生BMP2和hTGF-β3,在免疫活性大鼠模型中能诱导成骨,但是无法获得脊柱融合。hBMP2和hTGF-β3融合基因转染比hBMP2和hTGF-β3混合转染的BMSCs更能诱导成骨,脊柱融合率更高。免疫活性大鼠模型中,hBMP2和hTGF-β3基因可以联合使用、融合基因效果更佳,均能协同诱导成骨、促进脊柱融合,预计这两种细胞因子的组合将在未来作为一种治疗策略。
阮晨梅[4]（2020）在《Pdx1、Ngn3、Mnx1、Mafa和Pax4组合转染诱导犬ADSCs向IPCs分化的研究》文中认为目前,通过对胰岛β细胞发育调控基因重编程使脂肪间充质干细胞具有胰岛素分泌功能,从而代替胰岛β细胞用于糖尿病治疗已成为一大研究热点。基因Pdx1、Ngn3、Pax4、Mafa等是胰腺发育的主要调控基因,它们的突变缺失都会严重破坏胰腺内分泌细胞的发育。通过转基因技术使这些基因在干细胞中过表达,但结果发现单基因转染的定向诱导作用并不明显,要实现干细胞向胰岛素分泌阳性细胞的定向分化还需要其他基因的配合,进而筛选最佳基因组合并通过多基因共表达实现干细胞向胰岛素分泌细胞分化具有重要意义。前期本研究小组已通过绝对定量转录组测序分析筛选出在犬ADSCs向胰岛素分泌阳性细胞分化中可能起作用的新表达调控基因Foxa2、Insm1和Mnx1。因此,本试验前期构建了基因Foxa2、Insm1和Mnx1的真核过表达载体和腺病毒过表达载体,并对其在犬ADSCs中的过表达功能进行验证,对比筛选出功能最佳的新表达调控基因Mnx1。此外,试验中发现真核表达载体筛选周期长,筛选效率低,而腺病毒过表达载体操作简单,感染效率高。因此后期实验中,将基因Mnx1与级联调控关键基因Pdx1、Ngn3、Pax4、Mafa以2A肽连接,以不同的排列形式构建5组腺病毒介导的多基因共表达载体,包装扩增为高滴度的腺病毒毒液后感染犬脂肪间充质干细胞并对分化效果进行监测。研究结果如下:1. 成功构建重组真核过表达载体pIRES2-EGFP-Foxa2、pIRES2-EGFP-Insm1、pIRES2-EGFP-Mnx1和重组腺病毒过表达载体pAd-Foxa2、pAd-Insm1、pAd-Mnx1,并经PCR鉴定和双酶切鉴定。分别感染犬ADSCs后对比各时间段胰岛β细胞发育调控基因m RNA表达量,显示腺病毒介导的基因Mnx1过表达可显着提高胰岛β细胞发育调控基因Pdx1、Ngn3、Mnx1、Nkx2.2、Nkx6.1、Gata4在犬ADSCs中的表达水平,并发现腺病毒的感染效率明显高于真核过表达载体。2. 成功构建五组多基因共表达腺病毒载体pAd-Pdx1-E2A-Ngn3、pAd-Pdx1-E2A-Ngn3-P2A-Mnx1、pAd-Pdx1-E2A-Ngn3-P2A-Mafa-F2A-Mnx1、pAd-Pdx1-E2A-Ngn3-P2A-Pax4-E2A-Mnx1、pAd-Pdx1-E2A-Ngn3-P2A-Mafa-F2A-Pax4。经过酶切、PCR鉴定和测序正确。通过RT-q PCR和Western blot检测发现各组合中目的基因在m RNA水平和蛋白水平都有明显表达。3. 五组多基因共表达腺病毒载体包装扩增后感染犬ADSCs,荧光定量PCR结果显示组合三中基因Pdx1、Ngn3、Mafa和Mnx1共表达后,胰岛β细胞发育调控基因Pdx1、Mafa、Nkx2.2、Nkx6.1、Gata4、Ins、Pcsk2、Slc30a8、Abcc8、Ksnj8、G6pc2表达量显着提高,与其他组合相比差异性显着。感染25 d后形成的类圆形细胞团双硫腙染色后呈现红棕色,提示有胰岛素分泌。组合三腺病毒感染的犬ADSCs在高糖（25 mmol/L）和低糖（5 mmol/L）刺激下,上清液中胰岛素分泌量分别是101.810±4.39μIU/105cells和49.439±2.5μIU/105cells,其胰岛素刺激释放指数（Stimulation Index,SI）为2.059±0.175,与其他几组呈现显着性差异。结果表明,基因Mnx1过表达可显着提高胰岛β细胞发育调控基因Pdx1、Ngn3、Mnx1、Nkx2.2、Nkx6.1、Gata4在犬ADSCs中的表达水平。腺病毒的感染效率明显高于真核过表达载体。腺病毒介导基因Pdx1、Ngn3、Mafa和Mnx1在犬脂肪间充质干细胞中共表达,可高效调控其向胰岛素分泌阳性细胞分化,为进一步探究糖尿病的干细胞替代疗法奠定了基础。
李姝萍[5]（2020）在《人源化PD-L1 mAb制备和EGFR×PD-L1双靶向嵌合抗原受体构建及表达》文中进行了进一步梳理目的:制备一种抗人程序性死亡配体1（programmed death ligand-1,PD-L1）单克隆抗体（monoclonal antibody,m Ab）,并对其进行人源化,使之适用于临床检测和治疗研究;基于人源化PD-L1抗体,构建肿瘤相关抗原表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）特异性嵌合抗原受体和PD-L1抗体双修饰慢病毒载体表达系统。方法:（1）采用杂交瘤技术获得PD-L1抗体。重组人PD-L1胞外区-Fc融合蛋白常规腹部免疫5只BALB/c小鼠,每只3次,测定效价,取2只高效价鼠,冲击免疫后,取脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0）融合,用PD-L1-his通过包被蛋白间接酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）筛选获得阳性克隆,小鼠腹腔注射杂交瘤制备腹水,经饱和硫酸铵沉淀和Protein G亲和层析纯化抗体,冻干备用。Western blot分析PD-L1抗体与PD-L1表达载体转染293T细胞的结合情况,流式细胞荧光分选技术（fluorescence activated cell sorting,FACS）和竞争ELISA检测PD-L1抗体对PD-1与PD-L1结合的阻断作用,ELISA分析m Ab类别,Fortebio Octet96测定亲和力,选择高分泌株进一步亚克隆,建立稳定系,通过ELISA进一步检测小型化PD-L1-sc Fv与PD-L1蛋白的结合活性。（2）采用互补决定区（complementarity-determining regions,CDRs）移植法,对鼠抗体人源化。抗体全长测序,获取鼠源PD-L1抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的CDR序列,与免疫遗传学数据库（IMGT）比对分析,选择与鼠抗体序列相似度最高人源化抗体框架区（framework region,FR）,将鼠CDR区植入人源化抗体FR,亲本抗体的CDRs嫁接到人受体载体中以获得每种亲本抗体的5个人源化轻链和5个人源化重链,在HEK293T细胞中表达了25个人源化抗体,以在不同浓度下进行亲和力测定,并进行抗体亲和力排序。选择亲和力排序前3种纯化的抗体,最后,纯化与嵌合抗体具有相似结合亲和力的人源化抗体（VH+VL）,鉴定人源化抗体的特性。（3）EGFR和PD-L1双靶向嵌合抗原受体构建及表达。人EGFR m Ab杂交瘤,5’RACE技术扩增其轻链和重链可变区（VL、VH）基因,构建sc Fv,克隆至真核载体pc DNA3.1进行表达鉴定。基因合成EGFR特异性嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR,引入CD137协同信号胞内功能域）与人源化PD-L1-sc Fv借助2A序列连接,克隆入慢病毒p LVX-EF1a-IRES-Zs Green1表达载体,使用Lenti-X Packaging Single Shots（VSV-G）共同转染293T细胞,获得包装病毒,感染293V细胞,流式细胞仪（fluorescence activated cell sorter,FACS）测定CAR膜表达,ELISA检测CAR感染293V细胞上清PD-L1-sc Fv表达。同法将上述目的基因克隆入慢病毒GV401表达载体,制备慢病毒,其中膜表达型慢病毒（KL46407-1）感染激活人外周血T细胞,验证CAR膜表达。结果:（1）经过反复克隆,从初选的10株杂交瘤中,筛选出1株单克隆抗体（11E3）,能够与PD-L1蛋白高亲和力结合,亚类为Ig G2a,亲和力KD值为1.66×10-10mol/L,具备高度配受体封阻性能;（2）11E3经人源化改造后,亲和力稳定(2.67×10-10mol/L);（3）EGFR-sc Fv获得有效表达。进一步构建了EGFR-CAR和PD-L1双修饰慢病毒分泌型CAR（CTC0537-1）及膜表达型CAR（CTC0537-2）,其病毒感染293V细胞阳性率均为10%。对应慢病毒CTZ0431-1感染293V细胞后,细胞膜表面表达EGFR-sc Fv,检测培养上清存在PD-L1-sc Fv;慢病毒CTZ0431-2感染293V细胞后,细胞膜表面EGFR-sc Fv和PD-L1-sc Fv有效表达。膜双表达型慢病毒（KL46407-1）感染活化T细胞的CAR表达率为39.3%。结论:获得一组鼠抗人PD-L1杂交瘤,从中筛选到一株与人PD-L1蛋白具有高亲和力抗体,具有高度配受体封阻性能,潜在的应用于肿瘤PD-L1表型检测和抗PD-1治疗有效性评估;成功构建EGFR-CAR和PD-L1-sc Fv双表达慢病毒载体,EGFR-CAR中度结合亲和力,为EGFR靶向和PD-L1抗体双修饰CAR-T细胞的实体瘤治疗研究提供了关键工具。
申道福[6]（2020）在《基于p53调控点探讨新藤黄酸诱导A549/Cis细胞周期阻滞影响NSCLC顺铂耐药的分子机制》文中研究说明目的:通过体外实验,研究新藤黄酸（GNA）对顺铂耐药非小细胞肺癌（NSCLC）细胞A549/Cis细胞周期、凋亡及顺铂耐药的影响。采用高通量测序（RNA-seq）方法研究GNA影响的A549/Cis细胞转录调控,分析差异基因表达及其功能,探讨GNA引起的A549/C is细胞生物学效应的重要线索,并加以验证。最后,通过在A549/C is细胞中分别过表达MTCYB和沉默TP53来研究二者在GNA介导的生长抑制中的作用,以阐明GNA影响A549/Cis细胞顺铂耐药的潜在调控靶点,为其在治疗顺铂耐药非小细胞肺癌的临床应用提供理论依据。材料与方法:论文一:MTT法验证A549/Cis细胞对顺铂的耐药性。使用不同浓度的顺铂处理A549细胞和A549/Cis细胞,分别于24h、48h、72h后加入MTT（5mg/ml）20μl,37°C孵育4h后,弃上清并加入DMSO溶解甲瓒,然后测定OD值,记录实验结果。MTT法检测GNA对A549细胞、A549/C is细胞生长的抑制作用。Hoechst 33342染色和荧光显微观察检测GNA对A549/Cis细胞形态的影响。GNA分别处理A549/Cis 24h,48h后,用Hoechst 33342（10μg/ml）染色,37?C孵育20min,并通过荧光显微镜观察细胞形态变化。流式细胞术检测GNA对A549/Cis细胞周期分布和凋亡的影响。细胞洗涤并经-20?C预冷的70%酒精固定过夜,用核糖核酸酶（RNase）溶液消化后经碘化丙啶（PI）染色,然后使用流式细胞仪进行细胞周期分析。根据Annexin V-APC/7-AAD凋亡检测试剂盒使用说明对细胞进行染色,并用流式细胞仪检测染色细胞的凋亡率,数据通过Flowjo7.6.1软件进行分析。论文二:GNA处理前后A549/Cis细胞转录组学研究。A549/Cis细胞经4μM GNA处理24 h后,用TRIzol法提取总RNA。RNA-seq通过Illumina X10测序平台进行测序。使用Stringtie来分析m RNA的表达水平。使用R package-Ballgown选择|log2 fold change|≥1且具有统计学意义（P<0.05）的差异表达的m RNA和基因。通过DAVID网站（http://david.ncifcrf.gov/）进行GO功能和KEGG信号通路富集分析。实时荧光定量PCR验证差异基因表达。根据Gene JET RNA纯化试剂盒使用说明提取A549/C is细胞总RNA。使用First Strand c DNA合成试剂盒进行c DNA合成,然后使用SYBR?Select Master Mix Kit试剂盒和实时PCR仪进行q PCR。通过比较性2-ΔΔCT法进行定量分析。Western blot检测细胞周期和凋亡相关蛋白的表达。RIPA裂解缓冲液提取细胞总蛋白。根据核蛋白和细胞质蛋白提取试剂盒使用说明提取核蛋白。BCA蛋白分析试剂盒测定蛋白质浓度。蛋白通过10-12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并转移到PVDF膜。PVDF膜经封闭,特异性一抗孵育,TBST洗涤三次,用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育后通过增强型化学发光底物检测试剂盒进行显色。使用Image J version 1.52软件对蛋白表达水平进行定量分析。论文三:构建MTCYB基因过表达逆转录病毒载体MSCV-PGK-MTCYB-2a-zs Green,转染293T细胞。用经过滤的含病毒293T细胞培养上清液感染A549/Cis细胞,然后通过流式细胞仪分选zs Green表达阳性（绿色荧光）的细胞,并用激光共聚焦显微镜对分选结果进行鉴定。q RT-PCR实验对分选后细胞的MTCYB的m RNA表达进行检测。最后通过MTT法检测过表达MTC YB的细胞对GNA敏感性的变化。构建人TP53基因RNA干扰（RNAi）逆转录病毒载体MSCV-U6-p53sh RNA-EF1-BFP并转染293T细胞,用经过滤的含病毒293T细胞培养上清液感染A549/Cis细胞,然后通过流式细胞仪分选BFP表达阳性（蓝色荧光）的细胞,并通过激光共聚焦显微镜对分选结果进行鉴定。下一步通过Western blot法对分选后的细胞进行p53蛋白表达的测定,鉴定p53沉默效果。最后,采用MTT法检测p53干扰后细胞对GNA的敏感性的变化。结果:论文一1.GNA抑制A549、A549/Cis细胞生长,并诱导A549/C is细胞发生凋亡形态学变化。MTT实验结果显示A549/C is细胞对顺铂的耐药性明显高于亲本细胞（P<0.001）。GNA对A549和A549/C is细胞的抑制效应通过MTT实验被测定,与未处理组相比,GNA显着降低了A549和A549/C is细胞的存活率（P<0.001）。6μM浓度的GNA仅在24h后即能诱导大量的细胞死亡,因此在随后的实验中使用了2μM和4μM浓度的GNA。Hoechst 33342染色实验进一步证明了GNA对A549/C is细胞的抑制作用。与未处理的细胞相比,经GNA处理的A549/Cis细胞增殖受到抑制,并出现明显的形态学改变。此外,在GNA处理的细胞中可观察到核固缩现象。2.GNA诱导A549/Cis细胞周期G1期阻滞和凋亡。为了研究GNA抑制A549/Cis增殖的细胞进程,我们使用流式细胞仪检测了A549/C is的细胞周期和凋亡情况。结果表明,与未处理组相比,GN A处理A549/C is细胞24h和48h后,细胞周期明显被阻滞于G1期（P<0.05）。4μM GNA作用48h后,sub-G1期亚群细胞数明显高于未处理组（P<0.001）。细胞周期阻滞可以诱导细胞死亡,并可通过流式细胞仪进行检测。Annexin V-APC/7-AAD双染色实验结果显示,4μM GNA作用于A549/Cis细胞48h后,凋亡率明显高于对照组（P<0.001）。论文二1.经GNA处理A549/Cis细胞差异基因表达和富集分析结果。为了探究GNA如何抑制A549/Cis细胞的生长和促进其死亡,我们使用对照细胞和经GNA处理的细胞进行了RN A-seq实验。数据分析表明,GNA的处理引发了全局基因表达的变化。我们以P<0.05且|log2 fold change|≥1为筛选条件对以上基因进行了进一步的筛选,满足以上条件的基因视为差异表达基因（DEGs）。与对照组细胞相比,在GNA处理的细胞中,有353个上调的DEGs和425个下调的DEGs。为了进一步研究DEGs的功能,我们进行了GO功能和KEGG信号通路富集分析。经鉴定,在GO富集分析中,蛋白结合（protein binding）、胞质溶胶（cytosol）、细胞周期（cell cycle）是显着富集的类型。KEGG信号通路富集分析中,有26条显着富集（P<0.05）的信号通路。将上述K EGG信号通路按差异显着性排序后,发现DEGs主要富集于内质网蛋白加工（protein processing in endoplasmic reticulum）、蛋白酶体（proteasome）、细胞周期（cell cycle）、Epstein-Barr病毒感染（Epstein-Barr virus infection）、雌激素信号通路（Estrogen signaling pathway）、p53信号通路（p53 signaling pathway）、DNA复制（DNA replication）。其中细胞周期、DNA复制和p53信号通路与肿瘤增殖密切相关。2.q RT-PCR验证RNA-seq结果。为了验证RNA-seq结果,我们选取14个DEGs进行q RT-PCR分析。结果显示,与未处理组细胞相比,4μM GNA组细胞所有基因的表达差异均有统计学意义（P<0.05）。在这些基因中,有4个基因在GNA处理的A549/Cis细胞中表达上调,另外10个基因在GNA处理的A549/Cis细胞中表达下调。共有10个基因[GADD45A、细胞周期蛋白D3（CCND3）、细胞周期蛋白B1（CCNB1）、CDC20、CDC25B、PCNA、PLK1、MCM2、MCM3和MCM 7]参与细胞周期调控,6个基因[GADD45A、CCND3、CCNB1、SERPIN E1、THBS1和TNFRSF10B]与p53信号通路相关,两个基因（CASPASE7和TNFRSF10B）与细胞凋亡相关。q RT-PCR的结果与RNA-seq分析结果一致。3.GNA处理的A549/Cis细胞周期和凋亡相关蛋白的表达。为了进一步研究GNA诱导的细胞周期阻滞和凋亡的潜在作用机制,我们检测了与细胞周期检测点和凋亡相关的蛋白表达水平。结果表明,与未处理组相比,经GNA处理的A549/C is细胞中cyclin D1、cyclin D3、CDK4和CDK6的蛋白表达水平显着下调（P<0.05）,而p21、GADD45A、p53和核p53的蛋白表达显着上调（P<0.05）。此外,我们检测了GNA处理的细胞中凋亡调控蛋白的表达。结果显示,与对照组相比,GNA能显着提高caspase3/7蛋白前体及其活性形式的表达水平（P<0.05）,其下游与DNA修复相关的凋亡标志性蛋白PARP在A549/Cis细胞中显着上调（P<0.05）,其裂解作用也明显增强（P<0.05）。论文三1.在A549/Cis细胞中过表达MTCYB融合基因后,其对GNA的敏感性未发生明显变化。本实验设计合成的MTCYB融合基因成功连接入双酶切线性化的表达载体的特定位点,测序结果显示连接正确,将病毒包装质粒和MTCYB过表达载体共转染293T细胞,产生感染性逆转录病毒颗粒,荧光观察证实逆转录病毒载体转导效率高。然后用293T细胞培养基感染A549/Cis细胞,通过荧光显微镜观察证实A549/Cis细胞成功地感染了逆转录病毒颗粒。流式细胞仪分选zs Green阳性表达的细胞,并通过激光共聚焦显微镜鉴定了阳性细胞率。q RT-PCR实验验证MTCYB的m RNA表达,与对照组和MSCV-PGK-Neo-2a-zs Green载体转染（A549/Cis-NC）组相比,A549/Cis-MTCYB组细胞MTCYB表达升高（P<0.05）。使用MTT法测定MTCYB基因过表达后GNA对A549/Cis细胞增殖和细胞活力的影响。GNA对三组细胞都有明显的抑制作用,但抑制作用无明显差异。2.在A549/Cis细胞中沉默p53后,细胞对GNA的敏感性降低。本实验设计合成的p53干扰片段成功连接入双酶切线性化的逆转录病毒表达载体的特定位点,测序结果显示连接正确,将病毒包装质粒和p53 sh RNA表达载体共转染293T细胞,产生感染性逆转录病毒颗粒,荧光观察证实逆转录病毒载体转导效率高。然后用293T细胞培养基感染A549/C is细胞,通过荧光显微镜观察证实A549/C is细胞成功地感染了逆转录病毒颗粒。随后流式细胞仪分选BFP阳性表达的细胞,并通过激光共聚焦显微镜鉴定了阳性细胞率。Western blot实验检测p53蛋白的表达,结果显示,与阴性对照组和MSCV-U6-EF1-BFP载体转染（A549/Cis-sh RNA-NC）组相比,A549/Cis-p53sh RNA1、2、3三组细胞p53蛋白水平均显着降低（P<0.05）,尤其A549/C is-p53sh RNA2组降低最显着（P<0.001）。MTT法测定p53沉默后GNA对A549/Cis细胞增殖和细胞活力的影响。与对照细胞和A549/Cis-sh RNA-NC细胞相比,A549/Cis-p53-sh RNA2细胞活力受到的抑制作用明显减弱（P<0.05）,对GNA敏感性降低。结论:1.GNA可通过介导细胞周期G1期阻滞并诱导细胞凋亡,从而抑制顺铂耐药非小细胞肺癌A549/Cis细胞的生长。2.转录组学研究表明GNA可显着下调A549/C is细胞中MTCYB基因的表达,且GNA通过调控p53/p21/cyclin D-CDK4/6介导A549/Cis细胞周期G1期阻滞,并通过激活caspase3/7诱导细胞凋亡。3.p53是GNA抑制A549/Cis细胞生长机制中的关键调控因子。
刘美辰[7]（2019）在《NS1与NOLC1相互作用对流感病毒（H1N1）复制的影响》文中研究指明A型流感病毒是引发大规模流感疫情爆发的主要原因,其中NS1蛋白是A型流感病毒编码的一个重要的病毒因子,在被感染的细胞中发挥着重要的作用。人核仁磷酸化蛋白1（NOLC1）是一个高度磷酸化的哺乳动物蛋白。本实验室在前期,已经通过多种试验证明,H5N1亚型NS1蛋白与宿主细胞NOLC1蛋白存在相互作用,但NS1与NOLC1蛋白相互作用对流感病毒复制的影响还尚不清楚。本论文首先通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）技术对H1N1亚型流感病毒NS1蛋白与宿主细胞NOLC1蛋白相互作用进行验证,并深入研究了NS1与NOLC1相互作用对流感病毒H1N1（PR8）复制的影响,结果如下:1.构建并筛选出NOLC1蛋白敲降稳转株（pLKO.1-TRC-NOLC1）和过表达稳转株（pBABE-puro-NOLC1）;确定鸡胚扩增出的流感病毒H1N1（PR8）的病毒滴度为1.0×108,胰酶浓度为2μg.mL-1、MOI=1.0,为流感病毒H1N1（PR8）在宿主细胞中增殖的最适条件。2.用流感病毒H1N1（PR8）分别感染pBABE-puro-NOLC1、pLKO.1-TRC-NOLC1和A549三种细胞系,不同感染时间收集样品,一方面通过TCID50技术检测病毒滴度;另一方面采用Real-time PCR技术检测病毒NP基因的三种RNA表达水平。结果表明,3株细胞系中流感病毒H1N1（PR8）的病毒滴度均在24h时达到最高,随后出现下降趋势;相比较正常细胞,NOLC1过表达稳转株中病毒的滴度增加,病毒NP RNA水平升高,而NOLC1敲降稳转株中病毒的滴度降低,病毒NP RNA水平降低。从上述试验结果中得出病毒的复制水平与宿主内NOLC1的表达量存在正相关关系。3.为了探索NS1与NOLC1相互作用对流感病毒H1N1（PR8）复制的影响,对宿主感染H1N1（PR8）后不同时间内NOLC1mRNA表达水平进行检测,发现病毒感染宿主细胞后的48h内,NOLC1mRNA的表达量整体呈现下降的趋势,结合上述实验结果我们可以得知,在病毒感染过程中,宿主通过NOLC1蛋白与流感病毒的NS1蛋白相互作用,降低了病毒的复制水平,进而影响流感病毒的感染进程。综上,本研究揭示了NOLC1与NS1相互作用对流感病毒感染过程的影响,为开发治疗IAV引起的疾病药物的设计提供新思路。
陶华[8]（2019）在《沉默HDAC6基因通过HSP90抑制食管癌增殖和转移的作机制研究》文中研究表明背景:在中国十大最常见的恶性肿瘤中,食管癌排名第六,仅次于胃肠道肿瘤的胃癌,呈现双高特征,即高发病率和高死亡率,而且往往呈区域聚集性。中两部卫生资源匮乏的农村尤其高发,食管癌高额的医疗费用仍是当地居民的上要疾病负担,严重的威胁个人的生命健康及生活质量,给家庭、社会带来巨大的影响。随着现代医疗水平突飞猛进的提高,临床上,食管癌的预防、诊治工作也取得了显着的进展,治疗方案的制定需要综合患者的临床分期、全身情况、当地吹院的条件设备及医疗水平等因素。外科手术仍是目前食管癌最重要的治疗手段,然而,局部晚期食管癌患者的预后并不理想。针对有手术机会的ⅡA-Ⅲ期食管鳞癌,单纯手术切除5年生存率低,有待进一步提高。由于食管癌对化疗和放疗敏感性较差,术后化疗或术后放疗均未能有效提高食管癌患者的预后。早期诊治成为改善食管癌患者预后的关键。然而食管癌的病因和发病机制尚不完全明了,基因突变、染色体重排、转录调控及修饰等基因遗传学的改变在食管癌中无疑发挥着极其重要的作用。因此,寻找食管癌特异性相关基因将可能为食管癌的诊断和治疗提供新的理论依据、成为针对该肿瘤的防治关键。表观遗传调控并不涉及DNA序列改变,是一个动态可逆、可遗传的过程,与诸多疾病的关系密切,组蛋白去乙酸化酶（Histone deacetylase,HDACs）、组蛋白乙酰化转移酶（histone acetylase,HATs）,不仅是维持核心组蛋白去乙酰化和乙酰化两者之间稳态的基础,而且有利于染色质状态的调节。进而影响基因的表达,因此,乙酰化调控是表观遗传学调控最重要的方式之一。蛋白家族HDACs有众多的成员。组蛋白脱乙酰化酶6（HDAC6）因其结构中含有两个且功能上独立的HDAC催化结构域,归属于一种比较特殊的HDACs成员。HDAC6的主要作用是催化乙酰化αα-微管蛋白、热休克蛋白90（Heat shock protein 90,HSP90）等非组蛋白的脱酰化效应。而组蛋白酰基化作用并不受控于 HDAC6活性的特异性抑制。通过去除组蛋白的乙酰基和其他转录调控,HDAC6在肿瘤的形成中起着重要作用。分裂周期中,发生在细胞中的不适当脱乙酰化、从细胞质到细胞核的再分配,都可能导致转录抑制,并且异常基因表达从而诱导肿瘤的发生、发展。当下研究的焦点、热点问题之一就是HDACs及其抑制剂。已有大量的研究表明,抑制HDACs的表达或活性成为治疗恶性肿瘤行之有效的分子靶点。越来越多的研究表明,许多恶性肿瘤包括乳腺癌、口腔鳞癌、白血病、肺癌等组织中HDAC6表达异常,表明其在参与肿瘤的形成中起着不愈言说的作用。HSP90是对许多蛋白质的稳定性和功能起至关重要的分子伴侣蛋白,以维持细胞蛋白质稳态和细胞存活。同样,在肿瘤发生过程中,HSP90对肿瘤发展中不可缺少的多种致癌蛋白的稳定性和功能至关重要。HSP90在食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）细胞系中的表达量较正常的食管上皮细胞的表达量明显增加。HSP90抑制剂能阻断食管癌细胞的增殖效应,该抑制剂如17-烯丙胺-17-脱甲氧格尔德霉素（17-allyamino-17-demethoxygeldanamycin,17-AAG）。当 HDAC6沉默、失活或敲除时,作为HDAC6的底物HSP90,将发生高乙酰化作用,从而造成HSP90活性的丧失。联合抑制HDAC6和HSP90显示很好的协同作用,在人白血病细胞中,HDAC6和HSP90的联合抑制在抗癌活性中具有协同作用。HSP90-HDAC6的药物治疗可能是食管癌的一种有前景的策略。然而,迄今为止,国内外尚罕见有关HDAC6基因通过HSP90抑制食管癌增殖及转移的作用机制的研究报道。目的:1、探讨HDAC6基因在食管癌中的表达及临床意义;2、构建慢病毒载体并制备,该载体携带HDAC6基因并将其靶向沉默,奠定了后续体内、外实验工具的基石,该表达系统的应用,以期验证其进行食管癌基因治疗的有效性;3、探讨慢病毒介导靶向HDAC6基因沉默联合HSP90抑制的功能学（食管癌细胞生物学特性）影响,为食管癌临床治疗的新靶向系统最终应用提供实验依据和科学理论。方法:1、HDAC6在食管癌的表达及临床意义分别采集10例食管癌及癌旁组织,qRT-PCR和Western blot方法检测组织中HDAC6 mRNA及HDAC6蛋白的表达情况。另外选取90例食管癌标本,IHC检测食管癌中组织中HDAC6的表达情况,分析HDAC6的表达与食管癌患者临床病理的关系。2、靶向沉默HDAC6基因慢病毒载体的构建和制备2.1根据HDAC6基因（NM0001130416.1）序列为标靶,通过BLAST 同源性分析,设计、选择两段寡核甘酸序列,长度为21 nt,作为以HDAC6基因为靶点的shRNA片段序列,以该序列为模板,即能合成两对DNA单链片段,并以次为引物,经退火、双酶切后,也同样的把pLKO.1-增强型绿荧光蛋白（enhanced green fluorescence protein,EGFP）质粒进行双酶切,连接、转化两种双酶切后的产物,获得2个质粒:以HDAC6基因为模板,合成了 2对长引物单链DNA片段,退火后双消化,同一双消化质粒pLKO。1-增强型绿色荧光蛋白（增强型绿色荧光蛋白,EGFP）2.2 qRT-PCR和Western blot方法检测食管正常上皮细胞系（HEEC-1）及KYSE140、KYSE170和KYSE180三株ESCC细胞系中HDAC6基因的表达情况,将转染稳定的细胞筛出。获得的质粒分别转染ESCC细胞系（KYSE140、KYSE180）,分别用qRT-PCR和Western blot方法检测HDAC6mRNA和HDAC6蛋白的表达水平,以HDAC6基因为靶点,筛选出沉默表达效应最显着的质粒;基于该质粒,通过基因克隆技术,可将携带有 HDAC6 基因靶向沉默的 shRNA 片段-pLKO.1-shRNA（HDAC6）-EGFP慢病毒包装质粒构建。2.3采用 Invitrogen公司的共转染系统,进行制备慢病毒表达载体系统（Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP）及其相关的质量检测,qRT-PCR 和 Western blot分别检测转染后KYSE140、KYSE180细胞株中HDAC6mRNA和HDAC6蛋白的表达。3、慢病毒介导靶向HDAC6基因沉默联合HSP90抑制表达对食管癌细胞生物学特性的影响3.1靶向HSP90-HDAC6抑制对食管癌细胞生物学特性体外实验采用构建的Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP慢病毒表达载体系统感染食管癌细胞株 KYSE140和 KYSE180。3.1.1 CCK-8法检测沉默HDAC6的表达对食管癌细胞增殖的影响;3.1.2 Transwell法检测沉默HDAC6的表达对食管癌细胞迁移运动的影响;3.1.3 CCK-8法检测不同浓度的HDAC6抑制剂 Tuabasin A对食管癌细胞增殖的影响;3.1.4 Transwell法检测不同浓度的Tuabasin A对食管癌细胞迁移运动的影响;3.1.5 Western blot及免疫荧光法检测HDAC6 siRNA、不同浓度的Tubastatin A对α微管蛋白乙酰化的影响;3.1.6 免疫共沉淀法（co-immunoprecipitation,CO-IP）检测 HDAC6 siRNA、不同浓度Tubastatin A对HSP90蛋白乙酰化的影响;3.1.7 Western blot检测不同浓度的HSP90特异性抑制剂 PU-H71、Tubastatin A对下游蛋白质表达的影响;3.1.8 CCK-8法检测HSP90-HDAC6抑制剂对食管鳞癌细胞增殖的影响;3.1.9 Transwell法检测 HSP90-HDAC6抑制剂对食管癌细胞迁移运动的影响;3.1.10 Western blot检测HSP90-HDAC6抑制剂对下游蛋白质表达的影响。3.2 HSP90-HDAC6抑制剂对裸鼠皮下食管癌细胞移植瘤生长抑制作用的实验研究建立食管癌细胞KYSE140移植瘤模型,接种2周成瘤后,根据治疗方式的不同,按照随机数字法,将裸鼠分为PU-H71组、TubastatinA组、PU-H71+TubastatinA组,并设赋形剂为对照组,进行腹腔注射,观察其对荷瘤裸鼠移植瘤生长、瘤体大体标本、存活情况及下游蛋白表达的影响。结果:1、HDAC6在食管癌的表达及临床意义1.1 qRT-PCR法检测HDAC6mRNA在ESCC组织及癌旁组织中的相对表达量分别为（5.13±3.78）VS（2.12±2.04）。较之于癌旁组织,在ESCC组织中HDAC6 mRNA的相对表达量显着增加,差异明显,组间差异比较具有统计学意义（P<0.05）。1.2 Western Blot法检测HDAC6蛋白在ESCC组织及癌旁组织中的相对表达量分别为（2.35±1.64）VS（1.21±0.57）。HDAC6蛋白在ESCC组织中的相对表达量较癌旁组织的相对表达量明显增加,差异具有统计学意义（P<0.05）。1.3免疫组织化学检测结果显示HDAC6阳性表达位于癌细胞核。90份食管鳞状细胞癌组织标本中,62份HDAC6阳性表达,表达率为68.9%。1.4在ESCC患者中,食管癌患者的临床病理分期及淋巴结转移与HDAC6的表达有关（P<0.05）;而性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤直径、肿瘤分化、肿瘤浸润深度与HDAC6的表达无关（P<0.05）。2、靶向沉默HDAC6基因慢病毒载体的构建和制备2.1干扰靶点的设计结果人HDAC6特异性shRNA-1序列（正向序列:CCGGGCAGUUAAAUGAAUUCCAUTTCTCGAGAAATGGAATTCACCCAAC TGCTTTTTC、反向序列:AATTGAAAAAGCAGUUAAAUGAAUUCCAUTTCTCGAGAAATGGAATTCA CCCAACTGC）;人HDAC6特异性shRNA-2序列（正向序列:CCGGGGAGUUAACUGGCAGGCAUTTCTCGAGAAATGCCTGCCAGTTAACT CCTTTTTC、反向序列:AATTGAAAAAGGAGUUAACUGGCAGGCAUTTCTCGAGAAATGCCTGCCAG TTAACTCC）。2.2 测序鉴定重组质粒 pLKO.1-shRNA（HDAC6）-EGFP经BLAST软件分析,重组质粒pLKO.1-HDAC6-shRNA测序结果与原始序列比对,设计序列正确插入载体,并无碱基的缺大、突变、移位,证实合成的实验组与对照组干扰靶点均已成功构建成重组质粒,符合预期设计,载体构建成功。2.3采用共转染策略制备经PCR鉴定的Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP慢病毒表达载体系统,确认构建成功,该慢病毒体系具有可重复性好、高滴度、强感染活性的特点。3、HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞生物学特性的影响3.1 HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞生物学特性体外实验3.1.1 CCK-8检测了阴性对照组、干扰靶点1和十扰靶点2 组 ESCC细胞系KYSE140和KYSE180细胞的增殖能力。在两株细胞中,较之于阴性对照组,干扰靶点1和干扰靶点2组的细胞增殖率均明显降低,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）。3.1.2 Transwell检测了阴性对照组、干扰靶点1和干扰靶点2组ESCC细胞系KYSE140和KYSE180细胞的迁移运动能力。在两株细胞中,较之于阴性对照组,干扰靶点1和干扰靶点2组的细胞穿膜数均显着减少,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）。3.1.3一致地,HDAC6抑制剂Tuabasin A,也能抑制食管癌KYSE140细胞和KYSE180细胞的增殖,并呈剂量依赖性。当Tuabasin A的浓度达到500 nM时,较之于阴性对照组,抑制剂组细胞增殖率明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。3.1.4一致地,Tuabasin A也能抑制食管癌KYSE140细胞和KYSE180细胞的迁移运动,并呈剂量依赖性。当浓度达到500 nM时,与阴性对照组比较,抑制组细胞穿膜数均显着减少,差异具有统计学意义（P<0.05）,且在食管癌KYSE140细胞中更为明显（P<0.05）。3.1.5 α-微管蛋白是HDAC6的一个靶点,与细胞运动有关。Western blot法检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞中,干扰靶点1和干扰靶点2组均较阴性对照组表达量增加,差异显着,有统计学意义（P<0.05）。在KYSE140和KYSE180细胞中,阴性对照组、TuabasinA（100 nM）组、TuabasinA（500 nM）组、Tuabasin A（1μM）乙酰化α微管蛋白的相对表达量逐渐增加,差异比较具有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光检测中发现,冷诱导微管破坏后,微管被分解,KYSE140和KYSE180细胞中几乎不能观察到微管。与阴性对照组相比,Tuabasin A处理的细胞中检测到更多微管（P<0.05）。3.1.6免疫共沉淀法检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞中,乙酰化HSP90蛋白在干扰靶点1和干扰靶点2组均较阴性对照组表达增加,差异显着,有统计学意义（P<0.05）。在HDAC6抑制剂的研究中,呈现一致地结果。在KYSE140和 KYSE180 细胞中,阴性对照组、Tuabasin A（100 nM）组、Tuabasin A（500 nM）组、TuabasinA（1 μM）中HSP90蛋白乙酰化量呈现递增的趋势,组间比较差异明显,具有统计学意义（P<0.05）。3.1.7 HSP90抑制剂PU-H71、Tubastatin A调节蛋白质的表达。在KYSE140和KYSE180细胞中,与对照组相比,PU-H71处理的细胞中EGFR、Akt、磷酸激酶和磷酸化ERK水平降低。在KESE140和KYSE180细胞系中,Tubastatin A治疗还可降低蛋白EGFR、AKT、磷酸化AKT（p-AKT）和磷酸化ERK（p-ERK）的表达水平,但抑制的程度较HSP90抑制剂低（P<0.05）。3.1.8 CCK-8检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞系中,阴性对照组、单独 Tubastatin A（100 nM）、单独 PU-H71（100 nM）、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）组的平均细胞增殖率分别为 100.00%、91.45%、78.26%、62.03%,联合Tubastatin A+PU-H71与单独任一种抑制剂治疗相比显着降低了细胞活力（P<0.05）。3.1.9 Transwell检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞系中,阴性对照组、单独 Tubastatin A（100 nM）、单独 PU-H71（100 nM）、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）组细胞穿膜转移数呈逐渐递减的趋势。较之于阴性对照组,抑制剂组细胞穿膜转移数明显减少,差异有统计学意义（P<0.05）。联合Tubastatin A+PU-H71 治疗与单独任一种抑制剂治疗相比显着降低了细胞迁移运动能力（P<0.05）。3.1.10 Western blot检测结果显示,在KYSE140和KYSE180细胞系中,阴性对照组、单独 Tubastatin A（100 nM）、单独 PU-H71（100 nM）、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）组EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达呈逐渐递减的趋势。较之于阴性对照组,抑制剂组EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达水平降低,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）。两种细胞系的实验结果均致的表明,Tuabasin A和PU-H71联合治疗与单独的Tuabasin A或PU-H71治疗相比,EGFR、p-AKT和p-ERK的蛋白表达水平最低。3.2 HDAC6-HSP90 i对食管癌KYSE140细胞荷瘤裸鼠移植瘤的影响3.2.1裸鼠皮下移植瘤的造模选用人食管鳞状细胞癌KYSE140细胞株裸鼠皮下移植,观测移植瘤不同时间段成瘤的大小。裸鼠腹股沟接种区平均2周左右出现移植瘤,3 周后直径约0.2-0.6 cm,接种的所有动物均存活下来,并在体形成了肿瘤,接种点无发热、红肿、破溃等炎症反应。第3周开始,PU-H71+Tubastatin A注射组裸鼠移植瘤直径均明显低于上述其他三对照组移植瘤的直径,差异显着,具有统计学意义（P<0.05）;第6周开始,PU-H71注射组裸鼠移植瘤直径均低于赋形剂注射组、Tubastatin A注射组移植瘤的直径,差异有统计学意义（P<0.05）。仅在 Tuabasin A（10 mg/kg）和 PU-H71（50 mg/kg）联合注射的裸鼠中观察到显着的肿瘤抑制作用。3.2.2观察裸鼠存活情况及皮下移植瘤大体标本对照组、Tuabasin A组、PU-H71组裸鼠活动少,精神状态、食欲差,嗜睡等,而PU-H71组+Tuabasin A组裸鼠活动多,精神状态好,食欲佳。联合PU-H71+Tuabasin A注射显着抑制肿瘤生长,有利于改善裸鼠的生存质量。Tuabasin A和PU-H71联合注射组移植瘤体积较小,瘤体周围能看到较明显完整的包膜形成,形状较规整,有清楚的界限,无明显浸润、粘连的现象,能较完整的剥离肿瘤组织。而瘤体内注射赋形剂、TuabasinA组的裸鼠中,移植瘤的体积则较大,瘤体组织与周围无明显的界限,边缘毛糙,瘤体周围无完整的包膜形成,更有甚至,表面皮肤将受累。3.2.3 HSP90-HDAC6抑制剂对荷瘤裸鼠移植瘤下游蛋白表达的影响荷瘤裸鼠移植瘤中,赋形剂注射对照组、单独Tubastatin A（100 nM）注射组、单独 PU-H71（100 nM）注射组、联合 Tubastatin A（100 nM）+PU-H71（100 nM）注射组瘤体中EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达呈逐渐递减的趋势。较之于阴性对照组,抑制剂组EGFR蛋白、p-AKT蛋白、p-ERK蛋白的表达水平降低,差异显着,比较具有统计学意义（P<0.05）。与其他三组相比,TuabasinA（10mg/kg）和PU-H71（50 mg/kg）联合注射组裸鼠移植瘤中EGFR、p-AKT和p-ERK蛋白表达水平最低。此外,IHC 分析也显示,Tuabasin A（10 mg/kg）+PU-H71（50 mg/kg）联合注射组可显着抑制荷瘤裸鼠移植瘤中EGFR蛋白的表达。结论:1、HDAC6高表达于食管癌组织中,促进食管癌的发生、发展,有望作为食管癌治疗的重要靶点。2、采用共转染策略制备,成功的将慢病毒穿梭质粒载体构建后,制备了 HDAC6基因靶向沉默表达的Lenti-shRNA（HDAC6）-EGFP重组慢病毒载体,经PCR鉴定和Western blot检测方法,确认构建成功,该慢病毒体系具有可重复性好、高滴度、强感染活性的特点,为进一步开展HDAC6基因的食管癌治疗临床前研究提供了必须的实验工具。3、HSP90作为HDAC6的底物,其配体的活性部分能够被HDAC6介导的脱乙酰化效应激活。构建的HDAC6基因靶向沉默慢病毒载体通过RNAi在体外可有效抑制食管癌细胞系KYSE140和KYSE180的增殖和细胞迁移运动能力,沉默HDAC6之后,HSP90的脱乙酰化效应随着沉默,表现出HSP90的乙酰化过度,从而导致HSP90配体活性散失,两者联合抑制具有协同作用。联合HDAC6抑制剂（TubastatinA）和HSP90抑制剂（PU-H71）与单独任一种抑制剂治疗相比显着降低了食管癌细胞系KYSE140和KYSE180的增殖、细胞迁移运动能力及EGFR、p-AKT和p-ERK的蛋白水平。4、食管癌KYSE140细胞荷瘤裸鼠移植瘤造模成功,HSP90-HDAC6抑制剂显着的抑制肿瘤的生长,有利于改善裸鼠的生存质量,HSP90-HDAC6抑制剂显着降低裸鼠移植瘤中EGFR、p-AKT和p-ERK蛋白表达水平。5、靶向沉默HDAC6基因可能通过HSP90的过度乙酰化有效阻断食管癌中细胞信号传导通路EGFR、p-AKT及p-ERK表达谱的变化,开辟了阐述食管癌发病机制的全新分子生物学学说,临床应用前景呈现出一片大好的趋势。
袁伦志[9]（2019）在《人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究》文中提出乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染在全球范围内造成了严重的疾病负担。HBV感染具有严格的宿主种属特异性和肝细胞嗜性,其感染人肝细胞后能够持续复制,诱发宿主免疫耐受状态、逐步形成慢性化、直接或间接诱导一系列病理生理学变化并造成重症肝炎、肝衰竭、肝纤维化、肝硬化和肝癌等终末期肝脏疾病。目前,虽然预防性疫苗的普及已经在很大程度上控制HBV新发感染率,但是已批准上市的临床药物仍然无法彻底清除病毒,实现功能性治愈。由于HBV的天然宿主人类和猩猩等大型灵长类动物用于研究收到严格的伦理限制,因此发展能够最大限度模拟HBV感染和发病的动物模型成为进一步认识HBV感染发病机制,以及研发和评价新一代抗HBV药物所面临的一项挑战。数十年来,研究人员建立了转基因小鼠、尾静脉高压注射小鼠、旱獭、北京鸭和树鼩等替代模型,然而它们都不能完全模拟HBV在人类中感染发病的自然史,因此,建立人源化小鼠动物模型,特别是人肝和人免疫系统双嵌合的人源化小鼠动物模型,用于支持HBV感染发病相关研究具有相当的重要性。然而,目前已有的人源化小鼠动物模型一直存在原代人细胞来源匮乏和体外难以扩增、个体差异大、多种细胞移植不匹配、伦理问题、造模周期长、实验窗口期短和难以模拟HBV感染相关的终末期肝脏疾病等限制。因此,建立一种方便易用的、能够支持HBV感染发病研究的新型人源化小鼠动物模型对于进一步推进HBV相关基础研究和治疗策略的发展十分必要。本论文中,我们利用临床分离的健康人骨髓间充质干细胞（human bone marrow mesenchymal stem cells,hBMSCs）在免疫缺陷小鼠体内同时重建了同源的人源肝脏和免疫系统,并将此种双嵌合人源化小鼠用于乙肝病毒感染及相关病理生理学研究。我们对乙肝病毒的生物学特征、流行病学、感染自然史、相关肝脏疾病、天然宿主动物、感染细胞和动物模型等方面进行综述研究,基于前期研究和对最新研究成果的考察,我们发现hBMSCs具有重建人类肝脏和免疫系统的巨大的潜力,并选择其作为我们构建新型双嵌合人源化小鼠模型的细胞材料。我们使用hBMSCs移植暴发性肝衰竭免疫缺陷FRGS小鼠,发现其能够在小鼠体内迅速转分化为具有活性的人肝细胞和多种人免疫细胞,同时证明暴发性肝衰竭的肝脏微环境是驱动hBMSCs在免疫缺陷FRGS小鼠体内大量快速转分化为人源肝细胞和免疫细胞的重要驱动因素。我们在hBMSCs移植的免疫缺陷FRGS小鼠（hBMSC-FRGS）体内建立了HBV慢性感染,实现A,B,C,D四种常见HBV基因型病毒感染超过50周。我们连续监测了 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清和肝内病毒DNA及蛋白水平,证明被HBV感染的小鼠血清内含有具备感染活力的HBV病毒颗粒。我们初步研究了HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠体内的免疫病理生理学变化,在感染进行和持续和过程中同步分析了小鼠肝内人源免疫细胞、人源细胞因子、肝脏炎症进展和HBV特异性人源抗体水平等指标,证明HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠出现持续的肝脏炎症和免疫耐受状态。我们在HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠体内观察到一系列的指示肝硬化发生发展的典型性指标,包括:肝硬化血清学指标持续增高、小鼠肝脏组织中肝硬化相关人源基因表达持续上调、小鼠肝脏组织中胶原纤维堆积持续增加、纤维结节生成、肝小叶结构被破环、肝板塌陷、肝脏外表粗糙体积固缩等。综上所述,我们建立了肝脏和免疫系统双重人源化的hBMSC-FRGS小鼠模型,将其用于HBV感染和相关免疫病理生理学研究,并通过长期观察发现HBV感染后小鼠产生肝脏炎症并且逐步发展为典型的肝硬化。
李昊[10]（2019）在《Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究》文中研究指明肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显着,但两者的桑/囊胚率差异不显着（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显着提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显着;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
二、HBSAg及B_(7-1)双表达逆转录病毒载体的构建及其在真核细胞中表达（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、HBSAg及B_(7-1)双表达逆转录病毒载体的构建及其在真核细胞中表达（论文提纲范文）
（1）鸡卵清蛋白启动子功能分析及验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 启动子的概念 |
| 1.1.1 核心启动子元件(CPE) |
| 1.1.2 上游启动子元件(UPE) |
| 1.2 鸡卵清蛋白 |
| 1.2.1 卵清蛋白简介 |
| 1.2.2 鸡卵清蛋白的组织特异性与诱导表达 |
| 1.2.3 卵清蛋白增强子序列 |
| 1.3 鸡卵清蛋白上游启动子转录因子 |
| 1.3.1 COUP-TFs作用的分子机制 |
| 1.3.2 COUP-TFs的生理功能 |
| 1.4 启动子研究分析方法 |
| 1.4.1 启动子预测工具 |
| 1.4.2 双荧光素酶报告基因检测 |
| 1.5 CRISPR-d Cas9 与基因转录后调控 |
| 1.5.1 dCas9简介 |
| 1.5.2 CRISPR-d Cas9 转录激活或转录抑制效应元件 |
| 1.6 鸡原始生殖细胞 |
| 1.6.1 鸡胚原始生殖细胞的起源 |
| 1.6.2 鸡胚原始生殖细胞超微结构 |
| 1.6.3 PGCs的分离 |
| 1.6.4 鸡PGCs分离培养相关影响因素 |
| 1.6.5 PGCs的生物学特性 |
| 1.6.6 PGCs在转基因家禽研究中的应用 |
| 1.7 输卵管特异性表达转基因鸡研究 |
| 1.7.1 转基因鸡研究方法 |
| 1.7.2 输卵管特异性表达转基因鸡研究简史 |
| 1.7.3 输卵管特异基因的高通量筛选及其启动子的应用 |
| 1.7.4 CRISPR/Cas9介导的输卵管特异性表达转基因鸡研究 |
| 1.8 本研究的目的与意义 |
| 第二章 CRISPR-d Cas9-VP64 介导的鸡卵清蛋白启动子转录活性分析 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和试剂 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 含雌激素应答元件的启动子片段(cERE-cOVP-2785)的克隆 |
| 2.3.2 重组表达载体p GL3-cERE-cOVP-2785 的构建 |
| 2.3.3 重组表达载体p GL3-cOVP-2785 的构建 |
| 2.3.4 sgRNA的设计 |
| 2.3.5 sgRNA表达载体构建 |
| 2.3.6 重组质粒中量抽提 |
| 2.3.7 转染 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 启动子载体构建结果 |
| 2.4.2 质粒与转染试剂转染最优比例筛选 |
| 2.4.3 不同长度启动子活性的比较 |
| 2.4.4 卵清蛋白启动子(cERE-cOVP-2785)不同区域转录活性分析 |
| 2.4.5 雌激素对启动子的影响 |
| 2.4.6 激活雌激素应答元件不同区域作用结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 鸡卵清蛋白上游启动子转录因子Ⅰ/Ⅱ功能分析 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 转录因子重组表达载体构建 |
| 3.3.2 去内毒素重组质粒提取 |
| 3.3.3 COUP-TFⅠ/Ⅱ调控作用 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 含转录因子载体构建结果 |
| 3.4.2 COUP-TFⅠ与COUP-TFⅡ的调控作用 |
| 3.4.3 两个转录因子协同作用分析 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 鸡原始生殖细胞的分离及培养 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和试剂 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 主要试剂 |
| 4.2.4 有关溶液的配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 饲养层的准备 |
| 4.3.2 从5.5日龄的鸡胚(28期)性腺中分离PGCs |
| 4.3.3 从2.5日龄的鸡胚(14期)血液中分离PGCs |
| 4.3.4 鸡PGCs的体外培养体系 |
| 4.3.5 PGCs的传代 |
| 4.3.6 PGCs的冷冻保存 |
| 4.3.7 PGCs的复苏 |
| 4.3.8 PGCs的鉴定 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 两种不同来源PGCs的分离培养 |
| 4.4.2 两种不同来源PGCs的克隆形成能力 |
| 4.4.3 不同培养体系对鸡PGCs增殖能力的影响 |
| 4.4.4 PGCs的冷冻保存 |
| 4.4.5 PGCs生物学特性鉴定 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 鸡PGCs的分离培养 |
| 4.5.2 鸡PGCs体外长期培养的难点 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 鸡卵清蛋白启动子的功能验证 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与试剂 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 有关溶液配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 慢病毒的包装 |
| 5.3.2 鸡输卵管上皮细胞(OECs)的分离 |
| 5.3.3 慢病毒体外感染鸡OECs及 PGCs |
| 5.3.4 体外感染后外源基因表达情况检测 |
| 5.3.5 慢病毒体内注射 |
| 5.3.6 外源基因表达检测 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 LaSRT法测定病毒滴度 |
| 5.4.2 OECs细胞分离培养 |
| 5.4.3 cERE-cOVP-2785 体外功能验证 |
| 5.4.4 cERE-cOVP-2785 体内功能验证 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白诱导细胞自噬参与肿瘤形成的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 OPA国内外研究现状及尚未解决的问题 |
| 1.2.1 OPA的分布 |
| 1.2.2 OPA人工感染模型及JSRV啮齿动物模型构建 |
| 1.2.3 OPA的预防和控制 |
| 1.3 JSRV国内外研究现状及尚未解决的问题 |
| 1.3.1 JSRV的复制 |
| 1.3.2 JSRV的致瘤机制 |
| 1.4 细胞自噬国内外研究现状及尚未解决的问题 |
| 1.4.1 细胞自噬的分类 |
| 1.4.2 细胞自噬形成过程与自噬相关基因(ATG)调控 |
| 1.4.3 病毒感染与细胞自噬 |
| 1.4.4 肿瘤与细胞自噬 |
| 1.4.5 自噬研究方法 |
| 1.4.6 调节自噬作用的相关药物 |
| 1.5 本研究拟解决的关键问题 |
| 1.6 本研究的意义 |
| 1.7 本试验技术路线 |
| 2 试验一 自然感染绵羊肺腺瘤肺组织的转录组测序分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 仪器设备 |
| 2.1.3 试验试剂 |
| 2.1.4 试验分析软件 |
| 2.1.5 试验方法 |
| 2.2 试验结果 |
| 2.2.1 自然感染OPA病理解剖学和组织病理学特征 |
| 2.2.2 自然感染OPA病例JSRV Env的表达检测 |
| 2.2.3 OPA和健康羊肺组织高质量测序数据的产生和筛选 |
| 2.2.4 自然感染OPA和健康对照之间的转录本比较概况 |
| 2.2.5 DEGs的GO富集分析 |
| 2.2.6 DEGs的KEGG富集分析 |
| 2.2.7 自然感染OPA中上调和下调功能模块分析 |
| 2.2.8 通过RT-qPCR验证RNA-Seq结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 典型OPA病例筛选 |
| 2.3.2 转录组数据分析处理 |
| 2.3.3 差异表达基因筛选 |
| 2.3.4 DEGs富集的生物学功能 |
| 2.3.5 DEGs富集的信号转导通路 |
| 2.3.6 OPA分子致癌机制 |
| 2.4 小结 |
| 3 试验二 JSRV env慢病毒表达载体的构建及最佳转染效率测试 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 细胞与载体 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 仪器 |
| 3.1.4 试验方法 |
| 3.2 试验结果 |
| 3.2.1 重组慢病毒载体构建 |
| 3.2.2 JSRV env重组慢病毒包装 |
| 3.2.3 纯化的重组慢病毒滴度测定 |
| 3.2.4 JSRV env慢病毒感染STCs及NIH 3T3细胞 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 OPA病原分离与复制 |
| 3.3.2 基因过表达基本方式 |
| 3.3.3 慢病毒载体与真核质粒的比较 |
| 3.3.4 JSRV env过表达载体优势 |
| 3.4 小结 |
| 4 试验三 慢病毒介导JSRV env过表达对细胞增殖及迁移侵袭的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞 |
| 4.1.2 试剂与耗材 |
| 4.1.3 仪器 |
| 4.1.4 试验方法 |
| 4.2 试验结果 |
| 4.2.1 噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖 |
| 4.2.2 细胞划痕试验 |
| 4.2.3 Transwell侵袭试验 |
| 4.2.4 琼脂糖克隆形成试验 |
| 4.2.5 裸鼠成瘤试验 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 JSRV Env引起的细胞增殖作用 |
| 4.3.2 JSRV Env引起的细胞转化 |
| 4.3.3 JSRV Env引起的皮下肿瘤 |
| 4.4 小结 |
| 5 试验四 JSRV Env转化细胞相关自噬因子及自噬体检测 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验组织及细胞 |
| 5.1.2 抗体 |
| 5.1.3 试验耗材及仪器 |
| 5.1.4 试验试剂 |
| 5.1.5 主要缓冲液及试剂配制 |
| 5.1.6 试验方法 |
| 5.2 试验结果 |
| 5.2.1 OPA肺组织自噬因子表达分布 |
| 5.2.2 OPA肺组织自噬因子Western blotting检测 |
| 5.2.3 JSRV Env过表达细胞自噬因子Western blotting检测 |
| 5.2.4 JSRV Env与Beclin-1互作 |
| 5.2.5 透射电镜观察JSRV Env转化细胞中的自噬体 |
| 5.2.6 CYTO-ID(?)自噬检测试剂盒检测自噬体 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 细胞自噬因子检测 |
| 5.3.2 自噬体的观察研究 |
| 5.3.3 细胞自噬与病毒感染 |
| 5.4 小结 |
| 6 试验五 JSRV Env转化细胞自噬流通状态检测 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验细胞 |
| 6.1.2 抗体 |
| 6.1.3 试验耗材及仪器 |
| 6.1.4 试验试剂 |
| 6.1.5 主要缓冲液及试剂配制 |
| 6.1.6 试验方法 |
| 6.2 试验结果 |
| 6.2.1 P62降解试验 |
| 6.2.2 LC3 Ⅱ turnover试验 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 细胞自噬流的检测 |
| 6.3.2 自噬与细胞稳态 |
| 6.3.3 病毒感染与细胞自噬流变化 |
| 6.4 小结 |
| 7 试验六 雷帕霉素及3-甲基腺嘌呤调控细胞自噬影响JSRV Env肿瘤形成 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 试验组织及细胞 |
| 7.1.2 抗体 |
| 7.1.3 试验耗材及仪器 |
| 7.1.4 试验试剂 |
| 7.1.5 主要缓冲液及试剂配制 |
| 7.1.6 试验方法 |
| 7.2 试验结果 |
| 7.2.1 JSRV Env皮下移植瘤模型构建 |
| 7.2.2 裸鼠腹腔给药试验 |
| 7.2.3 JSRV Env裸鼠皮下肿瘤Western blotting检测 |
| 7.2.4 JSRV Env裸鼠皮下肿瘤病理组织学观察 |
| 7.2.5 JSRV Env裸鼠皮下肿瘤免疫组织化学观察 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 肿瘤的发生发展 |
| 7.3.2 JSRV Env裸鼠皮下肿瘤生成 |
| 7.3.3 肿瘤与细胞自噬 |
| 7.3.4 细胞自噬在肿瘤治疗中的应用 |
| 7.4 小结 |
| 8 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）重组慢病毒介导的BMP2和TGF-β3共转染修饰大鼠骨髓基质干细胞在脊柱融合中成骨分化的协同作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第1章 构建hBMP2、hTGF-β3以及hBMP2-hTGF-β 3真核表达质粒、病毒的包装和转染BMSCs细胞 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 动物 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.1.4 主要试剂配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 SD大鼠的BMSCs的提取、体外培养和鉴定 |
| 1.2.2 构建PCDH-CMV-EGFP-hBMP2、PCDH-CMV-EGFP-hTGF-β3以及PCDH-CMV-EGFP-hBMP2-hTGF-β3真核表达质粒,并筛选、鉴定、扩增和抽提 |
| 1.2.3 包装病毒的过程 |
| 1.2.4 慢病毒携带重组质粒单个和联合转染BMSCs细胞 |
| 1.2.5 检测经过转染的BMSCs细胞中的目的基因表达 |
| 1.2.6 转染后BMSCs细胞形态变化 |
| 1.2.7 转染后的BMSCs细胞成骨分子的表达 |
| 1.2.8 统计学分析 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 大鼠BMSCs的形态学观察 |
| 1.3.2 大鼠BMSCs的表型鉴定 |
| 1.3.3 目的基因PCR扩增产物电泳分析 |
| 1.3.4 酶切验证重组质粒 |
| 1.3.5 重组质粒经公司测序后结果 |
| 1.3.6 慢病毒包装结果 |
| 1.3.7 慢病毒介导的重组目的质粒感染BMSCs细胞 |
| 1.3.8 免疫印记分析检测目的基因的表达 |
| 1.3.9 实时荧光定量PCR检测BMSCs中目的基因的表达 |
| 1.3.10 感染后的细胞形态变化 |
| 1.3.11 利用细胞爬片和免疫组化染色检测各组细胞转染后的细胞形态和目的蛋白表达 |
| 1.3.12 转染后各组BMSCs的成骨分子的表达 |
| 1.4 讨论 |
| 第2章 慢病毒介导的BMP2和TGF-β3重组质粒感染BMSCs后对大鼠脊柱融合的协同成骨作用 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 主要试剂配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 实验动物分组 |
| 2.2.2 大鼠BMSCs的分离、培养和鉴定 |
| 2.2.3 各组LV转染大鼠BMSCs移植材料的准备 |
| 2.2.4 手术方法 |
| 2.2.5 标本收集 |
| 2.2.6 观察指标 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 X线片观察 |
| 2.3.2 手动测量评估 |
| 2.3.3 微计算机断层扫描(Micro-CT)分析 |
| 2.3.4 组织学观察标本 |
| 2.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间成果 |
| 致谢 |
（4）Pdx1、Ngn3、Mnx1、Mafa和Pax4组合转染诱导犬ADSCs向IPCs分化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 糖尿病概况 |
| 1.2 干细胞与糖尿病治疗 |
| 1.2.1 胚胎干细胞 |
| 1.2.2 诱导多能干细胞 |
| 1.2.3 间充质干细胞 |
| 1.3 胰岛β细胞发育调控基因的研究进展 |
| 1.3.1 Pdx1 |
| 1.3.2 Foxa2 |
| 1.3.3 Insm1 |
| 1.3.4 Ngn3 |
| 1.3.5 Mafa |
| 1.3.6 Mnx1 |
| 1.3.7 Pax4 |
| 1.4 干细胞体外定向分化为胰岛β细胞的研究进展 |
| 1.4.1 诱导剂法 |
| 1.4.2 联合培养法 |
| 1.4.3 转基因法 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 基因Foxa2、Insm1、Mnx1 的功能验证及筛选 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株、质粒和细胞 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 基因Foxa2、Insm1、Mnx1 的合成与体外扩增 |
| 2.2.2 目的序列PCR扩增 |
| 2.2.3 目的序列的鉴定与回收 |
| 2.2.4 重组腺病毒穿梭载体的构建 |
| 2.2.5 重组腺病毒穿梭载体双酶切鉴定及二次转化扩增 |
| 2.2.6 重组腺病毒载体的构建和PacⅠ酶切鉴定 |
| 2.2.7 重组腺病毒的包装、扩增、滴度测定 |
| 2.2.8 感染犬脂肪间充质干细胞 |
| 2.2.9 荧光定量PCR检测胰岛β细胞发育调控基因表达 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 含目的基因的真核过表达载体的构建及鉴定 |
| 2.3.2 含目的基因的腺病毒过表达载体的构建及鉴定 |
| 2.3.3 荧光定量PCR检测胰岛β细胞发育调控基因表达水平 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 多基因共表达重组腺病毒载体的构建 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株、质粒和细胞 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 目的基因的合成和体外扩增 |
| 3.2.2 目的序列的PCR扩增与鉴定 |
| 3.2.3 重组腺病毒穿梭载体的构建 |
| 3.2.4 重组腺病毒穿梭载体的PCR、双酶切鉴定及二次转化扩增 |
| 3.2.5 重组腺病毒载体的构建 |
| 3.2.6 重组腺病毒载体的鉴定和二次转化扩增 |
| 3.2.7 重组腺病毒载体的包装、扩增、滴度测定 |
| 3.2.8 目的基因表达水平的检测 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 目的基因扩增及重组腺病毒穿梭载体PCR鉴定 |
| 3.3.2 重组腺病毒穿梭载体的双酶切鉴定 |
| 3.3.3 重组腺病毒载体的PacⅠ酶切鉴定 |
| 3.3.4 多基因共表达腺病毒的包装与扩增 |
| 3.3.5 病毒滴度 |
| 3.3.6 目的基因表达水平 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 多基因重组腺病毒载体感染犬ADSCs诱导其向IPCs分化 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 细胞 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 重组腺病毒感染犬ADSCs |
| 4.2.2 诱导阶段细胞形态学观察及双硫腙染色 |
| 4.2.3 荧光定量PCR检测胰岛β细胞发育调控基因表达 |
| 4.2.4 葡萄糖刺激胰岛素分泌试验 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 诱导阶段细胞形态学观察及双硫腙染色 |
| 4.3.2 胰岛β细胞发育调控基因表达水平 |
| 4.3.3 葡萄糖刺激胰岛素分泌水平 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）人源化PD-L1 mAb制备和EGFR×PD-L1双靶向嵌合抗原受体构建及表达（论文提纲范文）
| 中英缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 抗人PD-L1单克隆抗体制备 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 抗人PD-L1单克隆抗体人源化 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 EGFR和 PD-L1 双靶向嵌合抗原受体构建及表达 |
| 引言 |
| 实验材料 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基因工程CAR-T细胞治疗实体瘤机遇与挑战 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）基于p53调控点探讨新藤黄酸诱导A549/Cis细胞周期阻滞影响NSCLC顺铂耐药的分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 论文一 新藤黄酸诱导 A549/Cis 细胞周期阻滞及凋亡,影响 NSCLC 顺铂耐药的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文二 基于RNA-seq 技术的新藤黄酸干预下 A549/Cis 细胞转录组学研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 论文三 新藤黄酸影响 A549/Cis 细胞顺铂耐药调控靶点的研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述一 新藤黄酸抗肿瘤作用及机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 非小细胞肺癌化疗中顺铂耐药机制的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简介 |
| 在学期间科研成绩 |
| 致谢 |
（7）NS1与NOLC1相互作用对流感病毒（H1N1）复制的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 0.1 A型流感病毒 |
| 0.1.1 背景 |
| 0.1.2 A型流感病毒的基因组结构 |
| 0.1.3 NS1 蛋白简介 |
| 0.1.4 病毒在宿主细胞中的复制 |
| 0.2 NOLC1 蛋白 |
| 0.3 基因治疗 |
| 0.3.1 背景 |
| 0.3.2 慢病毒载体简介 |
| 0.3.3 RNA干扰技术 |
| 0.4 研究目的及意义 |
| 第1章 NS1 蛋白与宿主NOLC1 蛋白相互作用验证 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与试剂 |
| 1.2.1 细胞株、病毒毒株、载体 |
| 1.2.2 主要试剂 |
| 1.2.3 溶液配置 |
| 1.2.4 仪器及耗材 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 PCAGGS-FLAG-NOLC1 真核表达载体的构建及鉴定 |
| 1.3.2 PCAGGS-HA-NS1、 (120D/195R)、(120D)、(195R)(H1N1)真核表达载体的构建及鉴定 |
| 1.3.3 NS1(H1N1)蛋白与宿主NOLC1 蛋白相互作用以及关键作用位点协同验证 |
| 1.4 实验结果 |
| 1.4.1 PCAGGS-FLAG-NOLC1 真核表达载体的构建及鉴定 |
| 1.4.2 PCAGGS-HA-NS1、(120D/195R)、(120D)、(1955R)(H1N1)真核表达载体的构建及鉴定 |
| 1.4.3 NS1(H1N1)蛋白与宿主NOLC1 蛋白相互作用以及关键位点协同作用验证.. |
| 1.5 结果讨论 |
| 第2章 NOLC1基因慢病毒过表达和敲降表达稳转株的构建以及筛选 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 细胞株、病毒毒株、载体 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 溶液配置 |
| 2.2.4 仪器及耗材 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 慢病毒重组p BABE-puro-FLAG-NOLC1 真核表达载体的构建及鉴定 |
| 2.3.2 慢病毒干扰载体pLKO.1-TRC..NOLC1 的构建及鉴定 |
| 2.3.3 嘌呤霉素工作浓度的确定 |
| 2.3.4 慢病毒包装以及稳转株筛选 |
| 2.3.5 Western Blot技术检测过表达和敲降表达稳转株中NOLC1 蛋白含量 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 慢病毒重组p BABE-puro-FLAG-NOLC1 真核表达载体、慢病毒干扰载体pLKO.1-TRC-NOLC1 的构建以及鉴定 |
| 2.4.2 嘌呤霉素工作浓度的确定 |
| 2.4.3 Western Blot技术检测过表达和敲降表达稳转株中NOLC1 蛋白含量 |
| 2.5 结果讨论 |
| 第3章 流感病毒H1N1(PR8)在宿主细胞中培养条件的优化 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与试剂 |
| 3.2.1 细胞株、病毒毒株、载体 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 溶液配置 |
| 3.2.4 仪器及耗材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 A型流感病毒H1N1(PR8)的扩增及效价检测 |
| 3.3.2 胰酶浓度对流感病毒增殖的影响 |
| 3.3.3 病毒滴度的确定以及感染复数对流感病毒增殖的影响 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 A型流感病毒H1N1(PR8)扩增及效价测定 |
| 3.4.2 胰酶浓度对流感病毒增殖的影响 |
| 3.4.3 病毒滴度的确定以及感染复数对流感病毒增殖的影响 |
| 3.5 结果与讨论 |
| 第4章 NS1与NOLC1 相互作用对流感病毒H1N1(PR8)复制的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与试剂 |
| 4.2.1 细胞株、病毒毒株、载体 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 溶液配置 |
| 4.2.4 仪器及耗材 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 NOLC1 蛋白对病毒增殖的影响 |
| 4.3.2 NOLC1 蛋白对病毒复制的影响 |
| 4.3.3 H1N1(PR8)对NOLC1mRNA表达水平的影响 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 NOLC1 蛋白对病毒增殖情况的影响 |
| 4.4.2 NOLC1 蛋白对病毒复制水平的影响 |
| 4.4.3 H1N1(PR8)对宿主细胞NOLC1 mRNA表达水平的影响 |
| 4.5 结果讨论 |
| 第5章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况 |
| 附录一 试剂及其配制一览表 |
| 附录二 主要仪器与耗材一览表 |
（8）沉默HDAC6基因通过HSP90抑制食管癌增殖和转移的作机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 HDAC6基因在食管癌中的表达及临床意义 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 组织来源及患者资料 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 主要仪器设备 |
| 1.4 主要方法 |
| 1.5 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 HDAC6 mRNA在食管癌组织及癌旁组织中的表达水平 |
| 2.2 食管癌组织及癌旁组织中的HDAC6蛋白的表达水平 |
| 2.3 免疫组织化学检测结果 |
| 2.4 食管癌组织中HDAC6的表达水平与食管癌临床病理特征关系 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 靶向沉默HDAC6基因shRNA慢病毒载体的构建和制备 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 载体及细胞 |
| 1.4 主要仪器及耗材 |
| 1.5 主要溶液配制 |
| 1.6 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 干扰靶点设计结果 |
| 2.2 重组质粒pLKO.1-HDAC6-shRNA测序鉴定 |
| 2.3 HDAC6 mRNA在食管鳞状细胞癌系中的表达 |
| 2.4 HDAC6蛋白在食管鳞状细胞癌系中的表达 |
| 2.5 慢病毒干扰后KYSE140和KYSE180细胞中HDAC6 mRNA和蛋白的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞生物学特性的影响 |
| 第一节 HDAC6 siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞的体外实验研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 主要方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 沉默HDAC6的表达抑制食管癌细胞增殖 |
| 2.2 沉默HDAC6的表达抑制食管癌细胞的迁移运动 |
| 2.3 HDAC6抑制剂Tuabasin A抑制食管癌细胞增殖 |
| 2.4 HDAC6抑制剂Tuabasin A抑制食管癌细胞迁移运动 |
| 2.5 HDAC6siRNA及Tubastatin A增加α微管蛋白的乙酰化作用 |
| 2.6 HDAC6siRNA及Tubastatin A增加HSP90的乙酰化作用 |
| 2.7 HSP90抑制剂和TubastatinA调节下游蛋白质的表达 |
| 2.8 HSP90-HDAC6抑制剂对食管鳞癌细胞增殖的影响 |
| 2.9 HSP90-HDAC6抑制剂对食管鳞癌细胞迁移的影响 |
| 2.10 HSP90-HDAC6抑制剂对下游蛋白表达的影响 |
| 第二节 HDAC6siRNA及HDAC6-HSP90 i对食管癌细胞的体内实验研究 |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 裸鼠皮下移植瘤模型建立 |
| 2.2 HSP90-HDAC6抑制剂对荷瘤裸鼠移植瘤下游蛋白表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 HSP90相关性抑制剂的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 攻读博士学位期间参编的书籍 |
| 攻读博士学位期间获得奖项 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（9）人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 前言 |
| 1. 乙型肝炎病毒 |
| 1.1 HBV的起源与进化 |
| 1.2 HBV的病毒结构 |
| 1.3 HBV的基因组结构及其编码蛋白 |
| 1.4 HBV的感染机制和生命周期 |
| 2. 乙型肝炎病毒感染及其造成的相关肝脏疾病 |
| 2.1 HBV感染的主要宿主 |
| 2.2 HBV的全球流行状况 |
| 2.3 HBV感染的自然历史过程 |
| 2.4 HBV感染慢性化诱发的相关肝脏疾病 |
| 2.5 HBV感染的诊断和治疗 |
| 3. 乙型肝炎病毒感染细胞模型 |
| 3.1 基于人肝癌细胞系的HBV稳定复制细胞系 |
| 3.2 基于原代人肝细胞和原代树鼩肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 3.3 基于人肝脏祖细胞系HepaRG的HBV感染细胞模型 |
| 3.4 基于受体过表达的人肝癌细胞系的HBV感染细胞模型 |
| 3.5 基于受体过表达的原代猪肝细胞和原代猴肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 3.6 基于人干细胞分化获得类肝细胞的HBV感染细胞模型 |
| 4. 乙型肝炎病毒感染动物模型 |
| 4.1 灵长类HBV感染模型 |
| 4.2 树鼩HBV感染模型 |
| 4.3 土拨鼠替代模型 |
| 4.4 北京鸭替代模型 |
| 4.5 HBV转基因小鼠 |
| 4.6 基于病毒基因组转染的HBV复制小鼠模型 |
| 4.7 人类肝脏单嵌合小鼠模型支持HBV感染及抗病毒研究 |
| 4.7.1 免疫缺陷小鼠和细胞移植 |
| 4.7.2 uPA缺陷的免疫缺陷小鼠模型 |
| 4.7.3 HSV-tk/NOG小鼠模型 |
| 4.7.4 Fa~(-/-)Rag2~(-/-)IL2rg~(-/-)(FRG)小鼠模型 |
| 4.7.5 FRGS小鼠模型 |
| 4.8 人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型支持HBV相关疾病研究 |
| 4.8.1 AFC8-hu HSC/Hep小鼠模型 |
| 4.8.2 人肝和人免疫系统双嵌合的FRGN和uPA-NOG小鼠 |
| 4.8.3 A2/NSG-hu HSC/Hep小鼠 |
| 4.8.4 HIS-Hep-FRGN小鼠 |
| 4.8.5 HIS-HUHEP-uPA/NRG小鼠 |
| 5. 人骨髓间充质干细胞的生物学特性 |
| 5.1 人骨髓间充质干细胞的发现 |
| 5.2 人骨髓间充质干细胞的分离纯化和体外培养 |
| 5.3 人骨髓间充质干细胞的多向分化分化潜能和免疫调节功能 |
| 5.4 人骨髓间充质干细胞移植治疗暴发性肝衰竭的分子机制 |
| 6. 本研究的目的、意义和思路 |
| 第二章 材料与方法 |
| 7. 研究中用到的主要仪器、耗材和试剂 |
| 7.1 主要仪器 |
| 7.2 常规耗材 |
| 7.3 生物化学与细胞生物学常规基础试剂 |
| 7.4 定性和定量检测试剂盒 |
| 7.5 实验用主要溶液及培养基配制 |
| 7.6 常规PCR引物 |
| 7.7 常规抗体和荧光素 |
| 7.8 实验动物和细胞 |
| 8. 常规分子生物学及细胞生物学实验方法 |
| 8.1 ELISA/CLEIA检测 |
| 8.2 Western Blot检测 |
| 8.3 细胞免疫荧光实验 |
| 8.4 免疫组化和病理学染色实验 |
| 8.5 常规流式细胞技术 |
| 8.6 常规哺乳动物细胞培养方法 |
| 9. hBMSC-FRGS小鼠模型构建和鉴定 |
| 9.1 hBMSCs分离、传代培养、冻存、复苏和鉴定 |
| 9.2 FHF-FRGS小鼠的构建及hBMSCs移植手术 |
| 9.3 肝脏灌流分离肝内实质细胞和非实质细胞 |
| 9.4 分离鉴定人源细胞及检测相关标志物 |
| 9.5 鉴定人源肝细胞和鼠源肝细胞是否发生融合 |
| 10. HBV感染相关病毒学和病理学检测 |
| 10.1 不同基因型HBV病毒生产与纯化 |
| 10.2 HBV蛋白与核酸检测方法 |
| 10.3 hBMSC-FRGS小鼠人源免疫反应分析 |
| 10.4 肝硬化诊断方法 |
| 11. 数据处理与统计分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 第一部分 hBMSCs移植暴发性肝衰竭FRGS小鼠 |
| 12.1 hBMSCs表型鉴定 |
| 12.2 hBMSCs移植拯救FHF-FRGS小鼠免于死亡 |
| 12.3 hBMSC-FRGS小鼠实现人源肝细胞嵌合 |
| 12.4 hBMSC-FRGS小鼠实现多种人源免疫细胞嵌合 |
| 12.6 嵌合肝脏内的人源肝和鼠源肝细胞未发生融合 |
| 12.7 hBMSC-FRGS小鼠长期安全性评估 |
| 12.8 FHF肝脏微环境是hBMSCs转分化的关键驱动因素 |
| 12.9 第一部分小结 |
| 第二部分 hBMSC-FRGS小鼠支持慢性化HBV感染 |
| 13.1 hBMSC-FRGS小鼠支持多种基因型HBV感染 |
| 13.2 hBMSC-FRGS小鼠支持C基因型HBV感染慢性化 |
| 13.3 第二部分小结 |
| 第三部分 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠免疫病理生理学研究 |
| 14.1 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠肝人源内免疫细胞变化 |
| 14.2 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清和肝内人源细胞因子变化 |
| 14.3 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠发生重症肝炎 |
| 14.4 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠产生特异性针对HBV抗原的T细胞 |
| 14.5 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠血清HBV特异性抗体水平变化 |
| 14.6 第三部分小结 |
| 第四部分 HBV感染hBMSC-FRGS小鼠诱发人源肝硬化 |
| 15.1 HBV感染后hBMSC-FRGS小鼠血清学肝硬化指标变化 |
| 15.2 HBV感染肝hBMSC-FRGS小鼠组织学肝硬化指标变化 |
| 15.3 肝硬化区域种属特异性鉴定 |
| 15.4 第四部分小结 |
| 第四章 讨论 |
| 16. HBV细胞模型和动物模型的发展历程 |
| 17. 基于间充质干细胞的人类肝脏再生和免疫系统重建 |
| 18. HBV感染慢性化和诱导肝脏疾病发生的关键机制 |
| 19. 新型HBV抗病毒治疗策略与关肝脏疾病的防治措施 |
| 第五章 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在校期间科研成果 |
（10）Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) |
| 1.1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 |
| 1.1.4 MSTN的作用机制 |
| 1.1.5 MSTN的表达调控机制 |
| 1.1.6 MSTN基因的应用前景 |
| 1.2 RNA干涉 |
| 1.2.1 RNA干涉现象的发现 |
| 1.2.2 RNA干涉的作用机制 |
| 1.2.3 RNA干涉的作用特点 |
| 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 |
| 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 |
| 1.2.6 RNA干涉的应用前景 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 |
| 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 1.4 哺乳动物细胞核移植 |
| 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 |
| 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 |
| 1.4.6 核移植存在的问题 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 |
| 1.5.2 Cas9蛋白的结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 药品和试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 |
| 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 |
| 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 |
| 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 |
| 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 |
| 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 |
| 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 |
| 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 |
| 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 |
| 3.2.3 G418浓度的筛选 |
| 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 |
| 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 |
| 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 最适G418浓度的筛选 |
| 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 |
| 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 |
| 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 |
| 4.2.5 显微操作前的实验准备 |
| 4.2.6 核供体细胞的准备 |
| 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 |
| 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 |
| 4.2.9 重构胚的融合与激活 |
| 4.2.10 重构胚的体外培养 |
| 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 |
| 4.2.12 转基因胚胎的移植 |
| 4.2.13 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 |
| 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 |
| 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 |
| 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 |
| 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 卵巢的保存和运输 |
| 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 |
| 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 |
| 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 |
| 4.4.5 转基因动物的生产 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 实验载体信息 |
| 5.1.3 药品和试剂 |
| 5.1.4 溶液的配制 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 |
| 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 |
| 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 |
| 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 |
| 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 |
| 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 |
| 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 |
| 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 |
| 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 |
| 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
四、HBSAg及B_(7-1)双表达逆转录病毒载体的构建及其在真核细胞中表达（论文参考文献）
- [1]鸡卵清蛋白启动子功能分析及验证[D]. 韦茏芹. 广西大学, 2020(02)
- [2]绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白诱导细胞自噬参与肿瘤形成的研究[D]. 杨惠. 内蒙古农业大学, 2020
- [3]重组慢病毒介导的BMP2和TGF-β3共转染修饰大鼠骨髓基质干细胞在脊柱融合中成骨分化的协同作用[D]. 何武兵. 南方医科大学, 2020
- [4]Pdx1、Ngn3、Mnx1、Mafa和Pax4组合转染诱导犬ADSCs向IPCs分化的研究[D]. 阮晨梅. 西北农林科技大学, 2020
- [5]人源化PD-L1 mAb制备和EGFR×PD-L1双靶向嵌合抗原受体构建及表达[D]. 李姝萍. 北京市结核病胸部肿瘤研究所, 2020(02)
- [6]基于p53调控点探讨新藤黄酸诱导A549/Cis细胞周期阻滞影响NSCLC顺铂耐药的分子机制[D]. 申道福. 辽宁中医药大学, 2020(01)
- [7]NS1与NOLC1相互作用对流感病毒（H1N1）复制的影响[D]. 刘美辰. 辽宁大学, 2019(01)
- [8]沉默HDAC6基因通过HSP90抑制食管癌增殖和转移的作机制研究[D]. 陶华. 苏州大学, 2019(08)
- [9]人骨髓间充质干细胞移植建立新型人类肝脏和免疫系统双嵌合小鼠模型用于乙型肝炎病毒感染诱发肝硬化初步研究[D]. 袁伦志. 厦门大学, 2019(08)
- [10]Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究[D]. 李昊. 东北林业大学, 2019(01)