一、牛皮肤成纤维细胞的体外培养与冻存（论文文献综述）
余敏洁,杨钰楚,陈轩宇,李强,杨舒慧,张燕,张明[1]（2021）在《四川省3个地方品种牛成纤维细胞系的建立及细胞遗传特性分析》文中研究说明为了实现我国地方牛遗传资源保存,本研究首次采集了峨边花牛、平武黄牛、凉山黄牛的耳缘组织,采用组织块原代培养和差速贴壁法分离牛皮肤成纤维细胞进行传代培养,然后冷冻保存和复苏培养,对培养的细胞进行细胞生物学特性、冷冻保存后复苏率、微生物污染情况和细胞的核型与细胞遗传标记分析,并以分子标记和G带带纹进行了3个地方品种的进化分析。结果表明:牛皮肤成纤维细胞生长曲线呈典型"S"型,培养细胞95.9%±8.3%为成纤维细胞,冷冻后细胞复苏率达到92.3%±2.9%,培养细胞未发现细菌、支原体污染;3个品种的牛皮肤成纤维细胞染色体数目均为60（2n=60）,除X染色体外,其他染色体均为端着丝粒染色体,并且染色体G带和mtDNA-D-loop区构建的3个品种的进化树具有相同的拓扑结构。本实验成功建立了四川峨边花牛、平武黄牛、凉山黄牛皮肤成纤维细胞系,且达到细胞遗传资源库的要求,为后续的遗传学研究提供了宝贵的材料。
闫晓杰[2]（2019）在《沙狐细胞体外培养体系建立及其生物学特性分析》文中进行了进一步梳理沙狐（Vulpes corsac）,又名东沙狐,在维持食物链的稳定等生态学方面有重要作用。目前沙狐种群数量在自然界中大幅缩减,为了保护和发展这一物种资源以及维护生态平衡我们开展了本次实验。有关沙狐的细胞培养建系及其生物学特性分析的研究尚未报道。本实验利用组织块贴壁法对沙狐部分组织进行原代建系并成功建立沙狐气管成纤维细胞系和软骨成纤维细胞系,两种细胞系均符合成纤维细胞的基本特征,主要表现为细胞贴壁生长且呈典型的梭形和多边形。对以上两种组织来源的成纤维细胞进行了相关生物学特性研究。测定了两种组织细胞的贴壁率,冻存前后存活率,绘制了生长曲线且生长曲线为S型。脂质体(LipofectamineTM2000)转染绿色荧光蛋白质粒（PEGFP-C1）的转染效率大于20%,采用常规技术低渗滴片法制备染色体标本,并对沙狐染色体进行了核型及其G带分析,结果显示中期染色体二倍体（2n=36）约占细胞总数的84%,其中17对为常染色体其形态类型为1st+10m+6sm,另1对为性染色体X其形态类型为m。本研究成功建立了沙狐两种成纤维细胞系及其相应的培养体系。通过检测确定所建立细胞系的染色体数符合物种标准,并首次制定了沙狐染色体G带图谱,为沙狐细胞遗传资源库的建立及其遗传资源保护奠定了基础。
崔佳瑜[3]（2019）在《SIRT6基因干扰对水牛成纤维细胞衰老的影响》文中研究指明SIRT6是Sirtuin家族中的一员,具有去乙酰化酶活性和单ADP核糖基转移酶活性。在人和小鼠上的研究表明SIRT6是细胞及个体上调控衰老及寿命的关键基因,参与端粒维护、DNA损伤修复、糖代谢、脂代谢等多项生理活动。但目前尚未有关于水牛SIRT6基因功能的报道。本研究对SIRT6在水牛成纤维细胞衰老上的功能及作用进行了初步探讨,为水牛供体的选择与培养,水牛及相关大型动物基因保护,衰老机制的探讨等,提供实验基础以及理论依据。实验首先克隆了水牛SIRT6基因编码区,探讨不同年龄水牛成纤维细胞的增殖、衰老表型、DNA损伤位点和SIRT6基因相对表达量等差异。结果表明,获得水牛SIRT6基因编码区序列全长1080bp,可编码359个氨基酸,其中亮氨酸及脯氨酸含量（10.3%）最高,酪氨酸含量（1.1%）最低。水牛SIRT6核酸序列与牛,人序列相似性分别为98.4%,85.9%,含有Sirtuin家族特有的Sir2去乙酰化酶的催化结构;通过对水牛SIRT6组织表达谱分析,结果表明SIRT6在心、肝、脾、肺、肾、肠、胃、脑、生殖嵴、皮肤中均有表达,生殖嵴中表达量最高,皮肤与心脏次之,在肝脏中表达量最低。组织贴壁法均可成功分离胎牛、3岁龄水牛、10岁龄水牛皮肤成纤维细胞。对3种不同年龄水牛的成纤维细胞第3代进行相关生物学特性分析。结果表明随着水牛年龄增大,S期细胞与细胞增殖指数显着降低（P<0.05）,β-Gal阳性细胞增多（P<0.05）,衰老基因p16、p21、p53mRNA表达水平均显着升高（P<0.05）,SIRT6表达量显着降低（P<0.05）。免疫荧光结果表明,10岁龄水牛成纤维细胞DNA损伤位点增多,端粒损伤程度增加。上述结果表明,老龄水牛分离出的成纤维细胞较水牛胎儿成纤维细胞（buffalo fetal fibroblast,BFF）细胞增殖速度变慢,衰老表型更显着。SIRT6基因与细胞衰老程度成负相关。构建SIRT6干扰载体,敲低水牛胎儿成纤维细胞SIRT6基因表达,进一步探讨SIRT6在水牛成纤维细胞衰老中的作用。构建干扰SIRT6基因的shRNA慢病毒载体,病毒包装后感染BFF P4筛选干扰载体。定量结果表明,Psi-sh3-LVRU6GP干扰效率最高（P<0.01）。以感染Psi-sh3-LVRU6GP病毒液的BFF P5为实验组（Ps-BFF P5）,感染Psi-LVRU6GP空白质粒病毒液的BFF P5（PN-BFF P5）为对照组进行SIRT6基因功能的探讨。结果表明干扰SIRT6基因表达后,细胞变得粗大,扁平,折光性弱,细胞边缘变得不光滑。增殖速度变慢,传代后细胞汇合度难以长至100%,且培养过程中伴随着大量细胞死亡,生长曲线不再呈正常细胞增殖曲线的S型。周期试验结果表明Ps-BFF P5 S期、G2期细胞以及细胞增殖指数均显着低于PN-BFF P5（P<0.05）,衰老基因0p16、p21、p53mRNA表达水平显着升高（P<0.05）,β-Gal细胞阳性率显着增加（P<0.01）。Ps-BFF P5核型正常率为47%,PN-BFF P5核型正常率为83%,这表明SIRT6下调后核型正常率显着降低（P<0.05）。同时对SIRT6干扰阳性细胞端粒长度以及端粒保护蛋白复合物基因各组分进行了qRT-PCR分析。结果发现,干扰SIRT6后细胞端粒损伤位点及DNA损伤位点增加,损伤面积增大,但端粒长度与对照组相比无显着差异（P>0.05）。端粒保护蛋白复合物基因相对定量结果表明,TRF1、POT1、RAP1、TPP1、TIN2随着细胞SIRT6表达量下降而下降,但TRF2表达量却随着SIRT6表达下降而上升。以上结果表明,SIRT6是调控水牛成纤维细胞衰老的关键基因,干扰SIRT6表达会造成不可逆的DNA损伤以及端粒损伤。结果表明,水牛SIRT6是一个编码区长1080bp,编码359个氨基酸的基因。随着个体年龄越大,分离出的成纤维细胞体外培养寿命更短,呈现出更明显的衰老表型,SIRT6表达量更低。SIRT6是调控水牛成纤维细胞衰老的关键基因,干扰SIRT6表达会造成不可逆的DNA损伤以及端粒损伤。但SIRT6不能调控水牛成纤维细胞端粒长度,推测可能是通过调控DNA损伤及端粒损伤维护细胞基因组稳定,从而调控细胞衰老。
朱雪霏[4]（2019）在《Scriptaid对APN基因编辑猪皮肤成纤维细胞体外生长及其再克隆胚胎发育的影响》文中认为体细胞核移植技术（Somatic cell nuclear transfer,SCNT）在创制基因修饰动物方面已展现出巨大的应用价值,是一种在家畜抗病育种材料创制、疾病模型构建和基础医学研究等方面具有广阔应用前景的技术。以转基因克隆动物的体细胞为核供体进行SCNT,开展再克隆以获得更多转基因动物已被证明是可行的。然而目前关于转基因猪再克隆的研究有限且再克隆效率也不理想。研究表明,利用组蛋白去乙酰化抑制剂Scriptaid处理非转基因供体细胞或SCNT重构胚胎可改善克隆胚胎发育。本实验室前期创建了抗猪传染性胃肠炎的APN基因编辑克隆猪。为建立并优化APN基因编辑克隆猪体细胞制备和再克隆胚胎生产方案,为今后实现APN基因编辑猪扩群提供技术参考,本研究首先从APN基因编辑猪耳部皮肤组织内分离建立了皮肤成纤维细胞系证明了其再克隆的可能性,接着利用Scriptaid处理体细胞或再克隆胚胎,探明了Scriptaid对体细胞体外生长和再克隆胚胎早期发育的影响,具体结果如下:（1）APN猪皮肤成纤维细胞建系及再克隆尝试。通过体外培养成功获得APN猪的皮肤成纤维细胞系,该细胞具有一般成纤维细胞的生物学特征,可进行SCNT操作。APN猪体细胞作供体细胞再克隆SCNT胚胎的卵裂率、囊胚率及囊胚总细胞数与非转基因供体细胞组相比均无显着差异（78.8%、3.56、28 Vs.76.24%、4.11%、34;P>0.05）。（2）Scriptaid处理对APN猪皮肤成纤维细胞及再克隆的影响。发现使用500 nM Scriptaid处理24 h对细胞的生长有抑制作用但对细胞存活、形态影响不明显。处理组细胞再克隆的SCNT胚胎卵裂率、囊胚率及囊胚总细胞数与未处理组相比也无明显差异（P>0.05）。（3）Scriptaid处理APN猪再克隆SCNT胚胎对其体外发育的影响。使用500 nM Scriptaid处理APN再克隆SCNT胚胎14-16 h,发现Scriptaid处理组卵裂率、囊胚率及囊胚总细胞数均显着优于未处理组（80.55%、5.8%、32 Vs.50.93%、3.1%、30,P<0.05）。综上所述,本研究成功建立了 APN基因编辑克隆猪的皮肤成纤维细胞系,并基于Scriptaid干预建立了可促进再克隆胚胎发育的处理方案,即使用细胞代次为3-6代的APN猪皮肤成纤维细胞生产再克隆胚胎,获得的重构胚用Scriptaid处理14-16 h,可提高其发育效率。总之,本研究证实了 APN猪体细胞建系及其再克隆的可行性,为今后开展抗猪传染性胃肠炎的APN猪再克隆工作奠定了坚实的基础。
李昊[5]（2019）在《Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究》文中提出肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）是一种生长因子,属于TGF-β超家族,主要在骨骼肌细胞中表达,对肌肉的生长具有负调控作用。MSTN基因的过表达可引起肌肉萎缩,而MSTN基因发生突变或被敲除时则会使动物的肌肉量增加,产生双肌现象。本研究利用克隆获得的绵羊MSTN基因构建真核表达载体,同时设计合成MSTN干涉序列并构建RNA干涉载体,共转染293GP细胞后经荧光定量PCR检测获得干涉效率最佳的载体;将其线性化后转染绵羊成纤维细胞后,经G418筛选获得MSTN敲低转基因细胞系;以MSTN敲低转基因细胞为核供体,利用细胞核移植的方法获得MSTN敲低转基因绵羊克隆胚和转基因绵羊,以期建立获得肌肉丰满绵羊新品系的方法。此外,本研究利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,为后续利用CRIISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。本研究的结果与结论如下:1、绵羊MSTN基因RNA干涉载体构建和活性分析（1）绵羊Myostatin基因的克隆:参照GenBank中绵羊MSTN基因序列（AF019622.1）,采用RT-PCR扩增技术,克隆绵羊肌肉生长抑制素基因,将其连接到pcDNA3.1（+）载体,获得肌肉抑制素基因真核表达载体;（2）RNA干涉表达载体的构建:参照绵羊MSTN基因的mRNA序列,设计合成RNA干涉序列并与pRNAT-U6载体连接,获得RNA干涉表达载体。与真核表达载体共转染293GP细胞后,通过实时定量PCR检测干涉效率,获得干涉效果最佳序列。（3）RNA干涉载体表达活性检测:将筛选获得的RNA干涉载体线性化,采用显微注射的方式,注射到小鼠原核时期的胚胎中,注射后的胚胎可以分裂为2细胞,经体外培养最终获得表达绿色荧光蛋白的囊胚,表明所构建的RNA干涉载体可以在胚胎中正常表达并支持胚胎的发育。2、绵羊MSTN敲低转基因成纤维细胞系的建立通过脂质体转染法将线性化的RNA干涉载体转染到绵羊成纤维细胞中,经G418筛选,获得转基因阳性细胞;PCR结果显示,构建的基因已整合到细胞基因组中;对获得的转基因阳性细胞的形态学特征、生长曲线以及冷冻复苏后特征的检测结果表明,转基因细胞具有正常细胞的生物学特征。3、绵羊MSTN敲低转基因胚胎的获得（1）供体细胞的修饰和处理:来源于成纤维细胞的核移植胚胎的卵裂率为44.6%,高于MSTN敲低转基因细胞的33.0%,且差异显着,但两者的桑/囊胚率差异不显着（分别为24.1%和15.6%）;供体细胞不需进行血清饥饿处理,使用接触抑制方法可以达到相同效果。（2）重构胚的融合、激活和培养:采用逐个融合（一次一个）的融合方式能显着提高融合效率,但融合后的胚胎发育能力和批量融合（一次多个）方法比差异不显着;采用A23187+6-DMAP激活卵母细胞与采用Ionomycin+6-DMAP激活方法之间的效果差异不大;重构胚融合后培养34 h后再进行激活可有效提高胚胎卵裂和囊胚发育率。KSOM和SOFaa都可以用来进行绵羊克隆胚的体外培养。4、转基因核移植胚胎的移植和胎儿鉴定（1）重构胚的移植:采用输卵管移植方法,将原核期或2-细胞期的核移植胚胎（242枚）移植到同步发情的受体绵羊（23只）体内,以检验其在体内的发育能力。（2）转基因胎儿鉴定:在23只受体中,最终只有1只受体妊娠,但妊娠期间发生流产,未能获得成活个体,获得流产胎儿1只;对流产胎儿进行PCR鉴定,结果显示,胎儿基因组中整合有目的基因。5、肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得（1）Rosa26基因sgRNA的设计和体外验证:根据小鼠Rosa26基因序列设计sgRNA,体外编辑试验表明,所设计的sgRNA可以对Rosa26位点发生编辑作用;（2）肌肉特异打靶载体的构建:通过PCR和同源重组连接,成功构建了肌肉特异表达Cas9蛋白的同源打靶载体Donor-SP-Cas9-DsRed;（3）Rosa26基因编辑胚胎和小鼠的获得:注射Rosa26 sgRNA和Cas9到小鼠胚胎,注射后的胚胎可以正常卵裂并支持囊胚发育,通过PCR和测序结果显示,获得的胚胎为基因编辑胚胎,注射的胚胎经胚胎移植后,获得了 Rosa26基因编辑小鼠;（4）通过将同源打靶载体与Rosa26 sgRNA和Cas9联合注射的方式,获得肌肉特异表达Cas9蛋白的基因打靶胚胎;综上所述,通过构建MSTN基因RNA干涉载体、转染绵羊成纤维细胞建立MSTN敲低转基因细胞系和转基因细胞核移植等程序,可以获得MSTN敲低的绵羊转基因克隆胚,胚胎移植后获得流产胎儿且携带外源基因,表明获得的重构胚具有体内发育能力,可以通过该方法获得MSTN敲低的转基因绵羊。本研究结果为培育MSTN敲低的绵羊新品系提供了依据。此外,通过利用CRISPR/Cas9系统,获得了基因编辑胚胎和小鼠,初步在小鼠上建立了基因编辑和基因打靶体系,为后续利用CRISPR/Cas9系统获得基因打靶绵羊奠定基础。
信吉阁,成文敏,潘伟荣,卿玉波,查星琴,富国文,魏红江,曾养志[6]（2013）在《猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞培养方法的研究》文中研究指明为了研究猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞的分离培养体系,根据取样组织的不同,筛选出最佳的培养方法,试验以猪胎儿和耳皮肤为试验材料,用4种不同的培养分离方法,即胰酶热消化法、胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法和组织块培养法,分离培养猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞,对比培养效果,筛选出最佳的培养方法。结果表明:胰酶室温消化法分离的猪胎儿成纤维细胞存活率显着高于胰酶热消化法和胰酶冷热结合消化法（P<0.05）,细胞贴壁效果好,且操作简单;猪耳皮肤成纤维细胞原代培养中,胰酶热消化法和胰酶室温消化法分离的细胞数量少,组织块培养法所需的组织量少,且较胰酶冷热结合消化法操作简单。试验中培养的细胞呈典型的成纤维细胞形态,生长曲线呈"S"型,经冻存复苏后生长状态良好,说明胰酶室温消化法是猪胎儿成纤维细胞较好的培养方法,胰酶热消化法和胰酶室温消化法是猪耳皮肤成纤维细胞原代培养的理想培养方法。
肖雄,邓玉金,赵海龙,吴有博,李跃民[7]（2012）在《不同冷冻保护剂和冷冻方法对小鼠耳皮肤成纤维细胞冻存效果的影响》文中提出通过比较不同冷冻保存方法和冷冻保护剂对小鼠耳皮肤成纤维细胞冷冻-解冻复苏后细胞存活率、48h贴壁率和细胞生长曲线的影响,筛选适宜的小鼠耳皮肤成纤维细胞冷冻保存方法和冷冻保护剂。结果表明,以100mL/L二甲基亚砜（DMSO）作为冷冻保护剂进行小鼠耳皮肤成纤维细胞冷冻保存时,方法3处理组解冻复苏后细胞存活率和培养48h细胞贴壁率均高于方法2处理组（P>0.05）,并分别极显着高于方法1和方法4。采用方法3进行冷冻保存时,以100mL/L DMSO作为冷冻剂的细胞贴壁率显着高于100mL/L甘油（GL）组（P<0.05）,且冷冻解冻后的细胞呈现正常的分裂增殖生长模式。因此,宜选择100mL/L胎牛血清（FBS）+100mL/L DMSO+DMEM作为冷冻保护液,采用方法3进行小鼠耳皮肤成纤维细胞的冷冻保存。
罗军[8]（2012）在《水牛胎儿成纤维细胞系的建立及其生物学特性的研究》文中认为水牛是中国南方地区较为重要的一种家养动物,在农业耕作上一直将其作为劳力使用。近些年来随着对水牛研究的不断深入,其经济利用价值逐渐显现出来,特别是将其作为生物反应器生产目的蛋白。目前尚未建立生物学特性明确的水牛细胞系,限制了在细胞水平研究和长期保存水牛种质资源,也妨碍了通过将稳定表达外源基因的细胞作为核移植供体,获得基因改造水牛的研究。因此,建立水牛细胞系并对其进行生物学特性的研究非常重要。从南宁市内屠宰场获取88只水牛胎儿,对其耳缘、肾脏、皮肤进行原代培养,从分离获得的成纤维细胞中挑选出形态正常、生长动力学较好的细胞系,最后挑选出2个水牛胎儿皮肤成纤维细胞系（BFSF101107、 BFSF101007）、1个水牛胎儿耳缘成纤维细胞系（BFEF）、1个水牛胎儿肾脏成纤维细胞系（BFKF）、1个水牛胎儿肾脏扁平状成纤维细胞系（BFKF-Flat）。然后对这些细胞系分别进行生长动力学测定、冻存前/复苏后活率测定、微生物污染检测、核型分析、同工酶检测、荧光蛋白转染效率、细胞周期分析。这5个细胞系生长动力学测定结果所绘制的生长曲线都为“S“型；细胞冻存前、复苏后都具有较高的活率；微生物污染检测的结果均为阴性。对这些细胞系进行核型分析和同工酶分析检测是否存在细胞交叉污染,结果显示这些细胞绝大多数含有48条染色体（20代）,同工酶电泳图谱显示细胞系之间没有交叉污染。相同转染条件下,在绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白的表达效率上BFSF101107的最高,在表达强度上BFKF-Flat的最强。接着,对各细胞系第20代细胞进行细胞周期分析,结果BFSF101107与他细胞系相比,细胞之间染色体均一性好、畸变概率低。因此,基于细胞的后续研究可以依据这些细胞系的不同生物学特性进行相应的选择。在无抗生素条件下,成功建立了2个水牛胎儿皮肤成纤维细胞系（BFSF101107、BFSF101007）、1个水牛胎儿耳缘成纤维细胞系（BFEF）、1个水牛胎儿肾脏成纤维细胞系（BFKF）、1个水牛胎儿肾脏扁平状成纤维细胞系（BFKF-Flat）,并成功将各细胞系传至第30代。从各细胞系检测指标上来看,皮肤来源的成纤维细胞要优于其他组织来源的,本研究的结果为其他大型动物成纤维细胞系的建立提供了参考。
吕长荣[9]（2011）在《诱导成年牛皮肤成纤维细胞为多能性干细胞的研究》文中研究表明本研究建立了牛诱导性多能干细胞系（induced pluripotent stem cells, iPS cells）。本研究克隆牛Nanog与Lin28两个转录因子基因,以逆转录病毒载体pMSCVneo携带牛Oct4, Sox2, Nanog与Lin28四个转录因子,诱导成年奶牛皮肤成纤维细胞重编程为牛iPS细胞。为研究牛多能性干细胞生物学特性和牛体细胞重编程机理,提供了理论依据和试验基础。本研究获得以下主要结果：1.克隆得到牛Nanog与Lin28两个转录因子开放性阅读框（ORF）全序列。从50-60日龄牛胎儿体内分离原始生殖嵴组织（PGR）,经RT-PCR扩增,获得牛Nanog基因与Lin28基因ORF全序列。经过鉴定与测序,并与GenBank中参考序列进行变异分析,证明所克隆牛Nanog基因与Lin28基因ORF全序列与参考序列同源性均为100%,没有发生碱基突变。2.牛Nanog基因与Lin28基因逆转录病毒表达载体的构建及其包装。（1）经过酶切、连接、转化与鉴定,成功构建了包含牛Nanog基因与Lin28基因ORF全序列的逆转录病毒表达载体：pMSCV-Nanog （MN）与pMSCV-Lin28 （ML）.（2）重组逆转录病毒质粒MN与ML,经过PT67包装细胞包装,产生具有感染性的病毒颗粒；以NIH3T3细胞作为指示细胞,测定MN与ML的最高感染滴度分别为9.19×107cfu/mL与7.5×107cfu/mL。病毒颗粒在透射电镜下呈现球形与椭球形,直径约为50-100 nm。病毒上清经过二次感染NIH3T3细胞,RT-PCR在NIH3T3细胞上清中,没有检测出野生型病毒颗粒存在。说明逆转录病毒在包装细胞系以外其他细胞内,不能复制包装。3.特定转录因子诱导成年牛皮肤成纤维细胞为iPS细胞并鉴定其生物学特性。（1）以成年雌性Holstein奶牛皮肤组织为材料,通过组织块培养与差速贴壁法,分离纯化得到牛皮肤成纤维细胞（bovine dermal fibroblasts, BDFs）。测定BDFs生长曲线、群体倍增时间与细胞周期等生物学特征；BDFs表达波形蛋白（Vimentin）与纤维连接蛋白（Fibronectin）等成纤维细胞的特异性标志蛋白。（2）以逆转录病毒pMSCVneo为载体,携带牛源性Oct4, Sox2, Nanog与Lin28四个转录因子转染BDFs,成功获得牛iPS细胞系。诱导后平均20.75 d完成重编程,平均重编程效率为0.034%。用脱细胞人羊膜（cell-free HAM）作牛iPS细胞培养支架,代替小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,建立牛iPS细胞无饲养层细胞的培养体系,其效果良好。（3）牛iPS细胞生物学特性鉴定：牛iPS细胞与ES细胞生长行为类似,呈集落样生长,AKP染色为阳性。牛iPS细胞强表达SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60与TRA-1-81等多能性干细胞表面标志；同时表达Oct4, Sox2, Nanog与TERT多能性干细胞特异性蛋白；但不表达SSEA-1与CD117标志蛋白。牛iPS细胞核型为60条XX二倍体核型,符合雌性奶牛细胞的染色体形态与数目标准。牛iPS细胞冻存液以70%牛iPS细胞培养液+20%FBS+10%DMSO效果较好,解冻后其平均存活率为90.9%。4.牛iPS细胞的多能性鉴定。（1） RT-PCR检测牛iPS细胞表达Oct4、Nanog、Sox2、c-Myc、Klf4与Lin28等多能性相关基因；转染的外源性基因在牛iPS细胞中表达微弱或发生沉默。qPCR测定牛iPS细胞中Oct4、Nanog、Sox2、Lin28与TERT基因的表达量显着增加,超出BDFs的103-104倍,c-Myc与Klf4表达量比BDFs增加5-10倍。牛iPS细胞不同代次之间的基因表达量没有显着差异。牛iPS细胞Oct4基因与Nanog基因启动子区域表现为高度去甲基化状态,与多能干细胞甲基化模式类似。Western blotting检测牛iPS细胞能够表达Oct4、Nanog、Sox2、Lin28与Klf4蛋白质。（2）将牛iPS细胞体外悬浮培养7 d,能够形成圆球状与囊腔状类胚体（EBs）结构。EBs贴壁培养后,能够自由分化为纤维样细胞、多突起的神经样细胞与铺路石状的上皮样细胞。免疫细胞化学染色表明,EBs能自由分化为表达AFP,CK7与PDX-1阳性的内胚层细胞；表达a-Actin与Vimentin阳性的中胚层细胞；表达βⅢ-tubulin, Nestin与GFAP阳性的外胚层细胞。通过EBs介导,牛iPS细胞在分别添加全反式维甲酸（RA）和p巯基乙醇（p-Me）两种诱导条件下,均可定向分化为Nestin、GFAP与NSE表达阳性的神经细胞。证明牛iPS细胞在体外具有多分化潜能。（3）将1.3×106个牛iPS细胞,注射到裸鼠皮下形成畸胎瘤。组织切片观察,畸胎瘤组织内包含有横纹肌、腺体、脂肪组织与神经节样组织结构。从畸胎瘤中,RT-PCR扩增出代表三个胚层分化细胞的特异性基因。证明牛iPS细胞在裸鼠体内具有发育多能性。（4）将1.1×106个牛iPS细胞,注射入两只妊娠55天的萨能奶山羊胎儿腹腔,妊娠足月后分娩,其中一只受体母山羊产下1只具有明显的皮毛嵌合体羔羊。经PCR方法对嵌合体羔羊各组织中牛细胞线粒体DNA序列检测,证明嵌合体羔羊体内多数组织中包含有牛细胞。证明牛iPS细胞参与嵌合体动物形成。
陈冬梅[10]（2011）在《不同转录因子组合诱导成年牛体细胞为iPS细胞的研究》文中认为本研究用逆转录病毒将牛Oct4, Sox2, Klf4和c-Myc四个转录因子导入牛皮肤成纤维细胞,首次成功获得重编程牛iPS细胞,经检测这些细胞具有多能干细胞的生长特征和多向分化能力。为了研究相关转录因子对诱导细胞重编程的必要性,本试验从四因子组合中依次减少转录因子的数量,以避免或减少细胞的癌变,分析了3因子（Oct4,Sox2和Klf4）、2因子（Oct4和Sox2）和1因子（Oct4）诱导细胞重编程的能力和效率。（1）.牛Oct4与c-Myc基因克隆及逆转录病毒表达载体的构建通过RT-PCR方法,从Holstein奶牛胎儿原始生殖嵴总RNA中克隆了牛Oct4和c-Myc基因ORF全长。与GenBank中牛Oct4和c-Myc基因编码序列进行BLAST分析,同源性分别为99.4%和99.8%。氨基酸序列同源性分别为98.9%和99.5%。通过酶切位点连接入逆转录病毒载体pMSCV,成功构建的重组质粒分别为pMSCV-Oct4（MO）和pMSCV-Myc（MC）。重组质粒MO与MC经测序分析,表明克隆目的基因序列正确。（2）.感染性重组逆转录病毒的包装与鉴定在用重组质粒MO和MC转染包装细胞的同时,用带绿色荧光蛋白的pMSCVneo-IRES-GFP质粒作对照,即用同样的浓度和方法共同转染包装细胞PT67,可观察到有50%左右表达绿色荧光蛋白的发光细胞。用流式细胞仪分析瞬时转染后的PT67-Oct4和PT67-Myc两株细胞中发荧光的细胞各占53.1%和51.3%。用TRIzol LSReagent提取病毒上清总RNA,进行RT-PCR扩增。分别获得Oct4和c-Myc基因单一的1038bp和1320bp大小的条带。PT67-Oct4和PT67-Myc细胞培养液经磷钨酸负染后透射电镜观察,可见多个病毒颗粒。收集细胞培养上清感染NIHA3T3细胞,测得病毒滴度分别为8.83×107cfu/mL和8.50×107cfu/mL,说明试验获得高感染力的逆转录病毒。（3）.四个转录因子组合诱导成年牛皮肤成纤维细胞重编程为多能干细胞试验用四个转录因子（Oct4, Sox2, Klf4和c-Myc）共同感染牛皮肤成纤维细胞,以hAM为饲养层,添加hLIF和bFGF的iPS细胞培养液获得ES细胞样克隆。经检测表达碱性磷酸酶；通过定量PCR方法,分析其多能性基因表达量与PGCs相当,在感染60天后已经检测不到外源基因的表达。免疫细胞化学检测,表达SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81,以及表达干细胞相关的特异性蛋白OCT4, NANOG, SOX2与端粒酶。Western blotting分析,表达Nanog, Oct4, Sox2, c-Myc和Klf4蛋白。通过亚硫酸氢盐-基因组测序法,检测NANAOG和OCT4基因启动子区甲基化水平处于低甲基化状态,说明多能性基因重新被激活参与基因的表达调控。根据传代计数结果,所得两株牛iPS细胞均呈现指数增长,80天内分别获得细胞数1.5×1011和2.4×1011个。本实验得到的2株牛iPS细胞已经传至第30代冻存。在体外传代大于150天,其形态仍与ES细胞相似,未出现分化迹象。分析第20代BiPSO细胞的核型,具有正常的60XX二倍体核型。（4）.诱导性多能干细胞分化多能性检测通过类胚体介导体外分化,在EB周围已分化细胞中检测出表达βⅢ-tubulin, Nestin和GFAP等标志的神经样细胞,α-Actin标志的心肌样细胞,波形蛋白（Vimentin）标志的成纤维样细胞,α-甲胎蛋白标志的肝上皮样细胞,CK7标志的胃肠上皮细胞和PDX-1为标志的胰岛样细胞。RT-PCR对三胚层细胞特异性基因进行分子生物学检测,表达三个胚层细胞的特异性条带,包括Nestin和βⅢ-tubulin（外胚层）；GATA4和ACTA2（中胚层）；Keratin-14、PDX-1和AFP（内胚层）。说明牛iPS细胞有向三个胚层细胞分化的潜能。对牛iPS细胞用DMSO诱导液进行诱导分化,能提高其体外分化为心肌细胞的效率。用RA诱导液进行诱导分化,能在体外分化出成熟的神经细胞。在裸鼠体内能够形成畸胎瘤,H.E.染色显示,有包含三胚层在内的各种组织,如血管、肌肉、软骨,内脏上皮和神经组织。说明牛iPS细胞在体内有向三个胚层细胞分化的潜能。（5）.减少诱导因子对诱导牛多能干细胞的影响用Oct4, Sox2和KLF4三因子诱导细胞重编程试验显示,在不用c-Myc转录因子也能够获得牛iPS细胞,但重编程效率降低,与四因子诱导时差异极显着（P<0.01）。经过RT-PCR和免疫细胞化学鉴定重编程的细胞表达OCT4, SOX2, NANOG转录因子及SSEA-3和SSEA-4表面抗原。但没有检测到端粒酶的激活。体外分化实验显示检测到神经样细胞,骨骼肌样细胞,腔上皮样细胞。RT-PCR检测显示除了AFP和Nestin,有多种分化基因的表达。体外分化试验显示注入裸鼠皮下的重编程细胞形成畸胎瘤,组织切片观察到肌肉组织和血管样组织,没有观察到外胚层和内胚层的组织结构。说明该株牛iPS细胞有分化三胚层细胞的能力,但不完全。可能三因子诱导的试验只获得了部分重编程的iPS细胞。用Oct4和Sox2两因子诱导细胞重编程时重编程效率极低,不能获得有效传代的牛iPS细胞。只用Oct4一因子诱导细胞重编程的试验没有获得AP染色阳性的iPS细胞集落。
二、牛皮肤成纤维细胞的体外培养与冻存（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、牛皮肤成纤维细胞的体外培养与冻存（论文提纲范文）
（1）四川省3个地方品种牛成纤维细胞系的建立及细胞遗传特性分析（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 组织收集与冻存 |
| 1.3原代培养 |
| 1.4 传代培养和成纤维细胞差速粘附分离 |
| 1.5成纤维细胞鉴定 |
| 1.6细胞冷冻与复苏 |
| 1.7 细胞生长曲线测定 |
| 1.8 培养细胞核型、G带分析 |
| 1.9 细胞细菌和支原体检测 |
| 1.1 0 mtDNA.D-loop扩增和测序 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 牛成纤维细胞形态学观察与鉴定 |
| 2.2 成纤维细胞生长曲线 |
| 2.3 牛成纤维细胞核型分析 |
| 2.4 牛成纤维细胞染色体G带 |
| 2.5 牛耳缘成纤维细胞冻存前及复苏后细胞活率 |
| 2.6 成纤维细胞系微生物污染检测结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（2）沙狐细胞体外培养体系建立及其生物学特性分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 国内外动物遗传资源保护现状 |
| 1.2 动物遗传资源的保护方法 |
| 1.2.1 活体保护法 |
| 1.2.2 生物技术保护法 |
| 1.3 细胞系的构建及鉴定 |
| 1.4 沙狐遗传资源研究现状 |
| 1.5 本研究的目的和意义 |
| 第二章 沙狐组织成纤维细胞体外培养体系的建立 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要器材 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 沙狐部分组织原代细胞建系及培养 |
| 2.3.2 沙狐组织成纤维细胞的纯化 |
| 2.3.3 沙狐组织成纤维细胞传代培养 |
| 2.3.4 沙狐组织成纤维细胞的冻存 |
| 2.3.5 沙狐组织成纤维细胞的复苏 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 沙狐组织成纤维细胞原代培养结果 |
| 2.4.2 沙狐组织成纤维细胞传代培养结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 沙狐组织成纤维细胞生物学特性分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要试剂 |
| 3.1.2 主要器材 |
| 3.1.3 实验材料 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 沙狐组织成纤维细胞的贴壁率 |
| 3.2.2 沙狐组织成纤维细胞的生长曲线绘制 |
| 3.2.3 沙狐组织成纤维细胞冻存前、复苏后存活率测定 |
| 3.2.4 沙狐组织成纤维细胞支原体检测 |
| 3.2.5 沙狐组织成纤维细胞染色体核型G带分析 |
| 3.2.6 沙狐组织成纤维细胞荧光蛋白质粒转染 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 沙狐组织成纤维细胞贴壁率 |
| 3.3.2 沙狐组织成纤维细胞不同代次生长曲线对比 |
| 3.3.3 沙狐组织成纤维细胞冻存前、复苏后存活率 |
| 3.3.4 沙狐组织成纤维细胞支原体检测 |
| 3.3.5 沙狐组织成纤维细胞染色体核型G带分析 |
| 3.3.6 沙狐组织成纤维细胞荧光蛋白质粒转染表达 |
| 3.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词表(Abbreviations) |
| 致谢 |
（3）SIRT6基因干扰对水牛成纤维细胞衰老的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 1. 衰老 |
| 1.1 细胞衰老和个体衰老 |
| 1.2 端粒与衰老 |
| 1.2.1 端粒与端粒结构 |
| 1.2.2 端粒功能 |
| 1.2.3 端粒的维持机制 |
| 1.3 双键断裂修复与衰老 |
| 1.3.1 DNA复制过程产生的损伤 |
| 1.3.2 双键断裂修复 |
| 2. SIRT6及其相关基因研究进展 |
| 2.1 SIRT6研究进展 |
| 2.2 SIRT6与衰老 |
| 第二部分 实验内容 |
| 第一章 水牛SIRT6基因克隆及不同年龄水牛成纤维细胞SIRT6表达差异 |
| 1. 材料和方法 |
| 1.1 主要材料与仪器 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验试剂及配方 |
| 1.1.3 实验耗材及仪器 |
| 1.1.4 使用软件 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 组织RNA提取 |
| 1.2.2 cDNA合成 |
| 1.2.3 引物设计 |
| 1.2.4 SIRT6序列扩增与回收 |
| 1.2.5 目的条带连接pEASY-Blunt-Simple Vector |
| 1.2.6 转化,挑菌,摇菌 |
| 1.2.7 小提质粒 |
| 1.2.8 水牛成纤维细胞培养 |
| 1.2.9 qRT-PCR检测基因相对表达量 |
| 1.2.10 细胞生长曲线的绘制 |
| 1.2.11 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 1.2.12 β-半乳糖甘酶染色 |
| 1.2.13 细胞免疫荧光 |
| 2. 实验结果与分析 |
| 2.1 水牛皮肤组织总RNA提取及SIRT6基因克隆 |
| 2.2 pEASY-SIRT6平端载体构建 |
| 2.3 水牛SIRT6生物信息学分析 |
| 2.4 水牛SIRT6在各组织中的表达差异 |
| 2.5 原代细胞培养与传代培养 |
| 2.6 细胞生长曲线 |
| 2.7 p-半乳糖甘酶染色 |
| 2.8 细胞周期检测 |
| 2.9 细胞衰老基因检测 |
| 2.10 SIRT6 表达差异 |
| 2.11 细胞DNA损伤位点及端粒损伤位点 |
| 3. 结果讨论 |
| 4. 小结 |
| 第二章 SIRT6干扰对水牛成纤维细胞衰老的作用 |
| 1. 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验器材 |
| 1.3 试剂及配方 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 水牛SIRT6 shRNA慢病毒干扰载体构建 |
| 2.2 去内毒素质粒提取 |
| 2.3 慢病毒包装 |
| 2.4 Psi慢病毒液感染水牛胎儿成纤维细胞 |
| 2.5 qRT-PCR相对荧光定量引物设计 |
| 2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.7 细胞核型分析 |
| 2.8 细胞基因组DNA提取 |
| 2.9 qRT-PCR检测端粒长度 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 干扰载体构建 |
| 3.2 Psi慢病毒包装与筛选 |
| 3.3 阳性细胞形态观察 |
| 3.4 细胞生长曲线 |
| 3.5 p-半乳糖甘酶染色 |
| 3.6 衰老相关基因检测 |
| 3.7 细胞周期检测 |
| 3.8 细胞凋亡检测 |
| 3.9 核型分析 |
| 3.10 DNA损伤位点及端粒损伤位点 |
| 3.11 端粒长度及端粒保护蛋白mRNA表达 |
| 4. 分析与讨论 |
| 5. 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士期间发表学术论文 |
（4）Scriptaid对APN基因编辑猪皮肤成纤维细胞体外生长及其再克隆胚胎发育的影响（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文对照表 |
| 文献综述 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 试验细胞 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.1.3 主要耗材 |
| 1.1.4 所需试剂及溶液配制 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 APN基因编辑猪耳缘组织成纤维细胞原代细胞建系及培养 |
| 1.2.2 成纤维细胞的细胞传代 |
| 1.2.3 APN基因编辑猪耳缘成纤维细胞冻存 |
| 1.2.4 APN基因编辑猪耳缘成纤维细胞复苏 |
| 1.2.5 成纤维细胞的生物学特性检测 |
| 1.2.6 猪卵母细胞体外成熟 |
| 1.2.7 显微操作针的制作 |
| 1.2.8 显微操作条带的制作 |
| 1.2.9 SCNT |
| 1.2.10 电融合 |
| 1.2.11 囊胚总细胞数荧光染色计数 |
| 1.3 试验设计 |
| 1.3.1 APN基因编辑猪耳缘细胞建系及生物学特性检测 |
| 1.3.2 Scriptaid对APN猪耳缘成纤维细胞的影响 |
| 1.3.3 不同供体细胞对克隆胚胎体外发育的影响 |
| 1.3.4 Scriptaid处理后的APN猪供体细胞对克隆胚胎早期发育的影响 |
| 1.3.5 Scriptaid对APN克隆胚胎体外发育的影响 |
| 1.3.6 数据统计与分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 APN基因编辑猪的耳缘成纤维细胞鉴定 |
| 2.2 Scriptaid对APN猪耳缘成纤维细胞的影响 |
| 2.3 不同供体细胞对克隆胚胎体外发育的影响 |
| 2.4 Scriptaid处理后的APN猪供体细胞对克隆胚胎早期发育的影响 |
| 2.5 Scriptaid对APN克隆胚胎体外发育的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 APN基因编辑猪细胞系建立的意义 |
| 3.2 Scriptaid对APN基因编辑猪体细胞的影响 |
| 3.3 不同供体细胞对克隆胚胎体外发育的影响 |
| 3.4 Scriptaid处理后的APN猪供体细胞对克隆胚胎早期发育的影响 |
| 3.5 Scriptaid对APN克隆胚胎体外发育的影响 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
（5）Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN) |
| 1.1.1 MSTN基因的发现 |
| 1.1.2 MSTN基因和蛋白结构 |
| 1.1.3 MSTN基因的表达 |
| 1.1.4 MSTN的作用机制 |
| 1.1.5 MSTN的表达调控机制 |
| 1.1.6 MSTN基因的应用前景 |
| 1.2 RNA干涉 |
| 1.2.1 RNA干涉现象的发现 |
| 1.2.2 RNA干涉的作用机制 |
| 1.2.3 RNA干涉的作用特点 |
| 1.2.4 siRNA和shRNA技术优缺点 |
| 1.2.5 哺乳动物的RNA干涉 |
| 1.2.6 RNA干涉的应用前景 |
| 1.3 卵母细胞的体外成熟 |
| 1.3.1 卵母细胞的成熟 |
| 1.3.2 卵母细胞的成熟调控机制 |
| 1.3.3 卵母细胞成熟的特征 |
| 1.3.4 卵母细胞成熟的影响因素 |
| 1.4 哺乳动物细胞核移植 |
| 1.4.1 哺乳动物胚胎细胞核移植研究进展 |
| 1.4.2 哺乳动物胚胎干细胞核移植研究进展 |
| 1.4.3 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1.4.4 哺乳动物转基因细胞核移植研究进展 |
| 1.4.5 影响细胞核移植结果的因素 |
| 1.4.6 核移植存在的问题 |
| 1.5 CRISPR/Cas9 |
| 1.5.1 CRISPR/Cas9的发现 |
| 1.5.2 Cas9蛋白的结构 |
| 1.5.3 CRISPR/Cas9的作用机制 |
| 1.5.4 CRISPR/Cas9面临的问题和挑战 |
| 1.6 研究的目的与意义 |
| 2 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体构建与活性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验动物、细胞和菌株 |
| 2.1.2 实验载体信息 |
| 2.1.3 药品和试剂 |
| 2.1.4 溶液的配制 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 绵羊Myostatin基因克隆与序列分析 |
| 2.2.2 绵羊Myostatin真核表达载体的构建 |
| 2.2.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的构建 |
| 2.2.4 293GP细胞的复苏和传代培养 |
| 2.2.5 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体效率检测 |
| 2.2.6 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体的显微注射 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 绵羊Myostatin基因的克隆与序列分析 |
| 2.3.2 绵羊Myostatin基因真核表达载体的构建 |
| 2.3.3 绵羊Myostatin基因RNA干涉载体测序 |
| 2.3.4 293GP细胞复苏传代与转染 |
| 2.3.5 RNA干涉效率结果与分析 |
| 2.3.6 RNA干涉载体表达活性分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 绵羊Myostatin基因敲低成纤维细胞系的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 主要药品和试剂 |
| 3.1.3 溶液配制 |
| 3.1.4 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA干涉载体的线性化 |
| 3.2.2 绵羊皮肤成纤维细胞的培养 |
| 3.2.3 G418浓度的筛选 |
| 3.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的转染及筛选 |
| 3.2.5 绵羊MSTN敲低转基因细胞系的鉴定 |
| 3.2.6 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻保存 |
| 3.2.7 绵羊MSTN敲低转基因细胞的冷冻复苏 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 绵羊皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 3.3.2 最适G418浓度的筛选 |
| 3.3.3 转基因细胞的生物学特征 |
| 3.3.4 转基因阳性细胞的PCR鉴定 |
| 3.3.5 冷冻复苏的转基因细胞的生物学特征 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 绵羊Myostatin基因敲低细胞核移植 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 药品试剂 |
| 4.1.3 溶液配制 |
| 4.1.4 仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊卵母细胞的获取 |
| 4.2.2 绵羊卵母细胞的体外成熟 |
| 4.2.3 绵羊成熟卵母细胞的孤雌激活 |
| 4.2.4 绵羊皮肤成纤维细胞的复苏 |
| 4.2.5 显微操作前的实验准备 |
| 4.2.6 核供体细胞的准备 |
| 4.2.7 核受体卵母细胞的准备 |
| 4.2.8 卵母细胞的去核和注核 |
| 4.2.9 重构胚的融合与激活 |
| 4.2.10 重构胚的体外培养 |
| 4.2.11 转基因胚胎的分子鉴定 |
| 4.2.12 转基因胚胎的移植 |
| 4.2.13 数据统计 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 卵巢的保存和运输对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.2 绵羊卵母细胞的采集方法和分级对卵成熟的影响 |
| 4.3.3 卵密度和不同成熟液对绵羊卵母细胞成熟的影响 |
| 4.3.4 绵羊卵母细胞成熟时间对成熟和去核的影响 |
| 4.3.5 不同的激活方法对绵羊卵母细胞孤雌激活的影响 |
| 4.3.6 供体细胞修饰和处理对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.7 绵羊重构胚融合方式对核移植胚胎发育的影响 |
| 4.3.8 重构胚激活前培养时间对绵羊重构胚发育的影响 |
| 4.3.9 不同培养液对绵羊核移植重构胚发育的影响 |
| 4.3.10 转基因重构胚的获得和PCR鉴定 |
| 4.3.11 胚胎移植和流产胎儿鉴定 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 卵巢的保存和运输 |
| 4.4.2 卵母细胞的采集、分级和培养 |
| 4.4.3 供体细胞的遗传修饰和处理 |
| 4.4.4 重构胚的融合、激活和培养 |
| 4.4.5 转基因动物的生产 |
| 4.5 本章小结 |
| 5 肌肉特异表达Cas9蛋白打靶胚胎的获得 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物和菌株 |
| 5.1.2 实验载体信息 |
| 5.1.3 药品和试剂 |
| 5.1.4 溶液的配制 |
| 5.1.5 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠Rosa26基因sgRNA的设计与获得 |
| 5.2.2 Rosa26基因sgRNA体外编辑效率检测 |
| 5.2.3 肌肉特异性小鼠Rosa26同源打靶载体的构建 |
| 5.2.4 小鼠胚胎的显微注射 |
| 5.2.5 注射后囊胚的基因分型和检测 |
| 5.2.6 胚胎移植和基因分型检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 sgRNA获得与体外编辑效率检测 |
| 5.3.2 肌肉特异表达同源打靶载体的构建 |
| 5.3.3 小鼠Rosa26基因编辑胚胎的获得 |
| 5.3.4 Rosa26基因编辑小鼠的获得 |
| 5.3.5 肌肉特异表达Cas9蛋白小鼠胚胎的获得 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞培养方法的研究（论文提纲范文）
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 2.1 样品的采集及处理 |
| 2.2 培养 |
| 2.2.1 胰酶热消化法 |
| 2.2.2 胰酶冷热结合消化法 |
| 2.2.3 胰酶室温消化法 |
| 2.2.4 组织块培养法 |
| 2.3 成纤维细胞的传代、培养与纯化 |
| 2.4 成纤维细胞生长曲线的绘制 |
| 2.5 成纤维细胞的冻存、复苏 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 不同培养方法的培养效果 |
| 3.2 成纤维细胞传代、培养与纯化 |
| 3.3 成纤维细胞生长曲线 |
| 3.4 成纤维细胞的冻存、复苏 |
| 4 讨论 |
（7）不同冷冻保护剂和冷冻方法对小鼠耳皮肤成纤维细胞冻存效果的影响（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 小鼠耳皮肤组织的获取 |
| 1.2.2 小鼠耳皮肤成纤维细胞的原代培养 |
| 1.2.3 小鼠耳皮肤成纤维细胞的传代培养 |
| 1.2.4 小鼠耳皮肤成纤维细胞的冻存 |
| 1.2.5 细胞的复苏 |
| 1.2.6 细胞计数和细胞存活率的统计 |
| 1.2.7 细胞贴壁率的统计 |
| 1.2.8 小鼠耳皮肤成纤维细胞的生长曲线绘制 |
| 1.2.9 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同冷冻保存方法和冷冻保护剂对小鼠耳皮肤成纤维细胞冷冻-解冻后细胞存活情况的影响 |
| 2.2 不同冷冻保存方法和冷冻保护剂对小鼠耳皮肤成纤维细胞冷冻-解冻后培养48 h细胞贴壁情况的影响 |
| 2.3 小鼠耳皮肤成纤维细胞的生长曲线 |
| 3 讨论 |
| 3.1 不同冷冻保护剂对耳皮肤成纤维细胞冷冻效果的影响 |
| 3.2 不同冷冻保存方法对耳皮肤成纤维细胞冷冻效果的影响 |
（8）水牛胎儿成纤维细胞系的建立及其生物学特性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 水牛简介(起源、分类及分布) |
| 1.2 水牛相关研究的进展 |
| 1.2.1 水牛核移植 |
| 1.2.2 转基因水牛 |
| 1.2.3 水牛干细胞 |
| 1.3 动物组织体外培养简介 |
| 1.3.1 细胞培养的探索阶段 |
| 1.3.2 培养技术的高速发展、成熟阶段 |
| 1.3.3 细胞大量培养技术的应用 |
| 1.4 成纤维细胞简介及研究进展 |
| 1.4.1 耳部成纤维细胞 |
| 1.4.2 皮肤成纤维细胞 |
| 1.4.3 肾脏成纤维细胞 |
| 1.5 细胞系建立所需生物学相关特性的检测 |
| 1.5.1 细胞生长曲线和细胞活率的测定 |
| 1.5.2 微生物污染检测 |
| 1.5.3 核型分析 |
| 1.5.4 同工酶检测 |
| 1.5.5 细胞转染效率 |
| 1.6 细胞系的具体应用 |
| 1.6.1 在生命科学研究方面的应用 |
| 1.6.2 医学方面的应用 |
| 1.6.3 农业方面的应用 |
| 1.6.4 生物制品的生产 |
| 1.7 本研究的主要目的、内容和意义 |
| 1.7.1 主要目的 |
| 1.7.2 主要内容 |
| 1.7.3 主要意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 设备 |
| 2.1.2 水牛胎儿 |
| 2.1.3 质粒与引物 |
| 2.1.4 培养基与试剂 |
| 2.1.5 其他试剂 |
| 2.2 细胞学操作 |
| 2.2.1 原代组织块培养 |
| 2.2.2 细胞分离、纯化 |
| 2.2.3 细胞传代、冻存、复苏 |
| 2.2.4 细胞生长曲线测定 |
| 2.2.5 细胞活率测定 |
| 2.3 分子生物学操作 |
| 2.3.1 PCR法检测支原体 |
| 2.3.2 细胞类型的免疫组化检测 |
| 2.3.3 细胞转染 |
| 2.4 生物化学操作 |
| 2.4.1 同工酶检测 |
| 2.4.2 核型分析 |
| 2.4.3 细胞周期检测 |
| 2.4.4 Hoechst 33342染色法检测支原体 |
| 2.5 微生物学操作 |
| 2.5.1 细菌、真菌检测 |
| 2.5.2 病毒检测 |
| 第三章 试验结果与分析 |
| 3.1 原代组织块培养所获得的细胞系 |
| 3.1.1 原代组织块培养 |
| 3.1.2 细胞消化、传代 |
| 3.2 各细胞系细胞类型鉴定 |
| 3.3 各细胞系生长曲线 |
| 3.4 各细胞系冻存活率 |
| 3.5 各细胞系微生物检测 |
| 3.5.1 真菌、细菌检测结果 |
| 3.5.2 支原体检测结果 |
| 3.5.3 病毒检测结果 |
| 3.6 各细胞系同工酶检测结果 |
| 3.6.1 乳酸脱氢酶(LDH)检测结果 |
| 3.6.2 苹果酸脱氢酶(MDH)检测结果 |
| 3.7 各细胞系核型分析结果 |
| 3.8 各细胞系细胞周期分析 |
| 3.9 各细胞系转染效率测定 |
| 第四章 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 原代培养材料的选择 |
| 4.1.2 微生物污染及细胞的无抗培养 |
| 4.1.3 细胞培养体系 |
| 4.1.4 细胞操作的优化 |
| 4.1.5 细胞生长动力学特性 |
| 4.1.6 细胞多倍体的产生 |
| 4.1.7 核型分析及同工酶检测 |
| 4.1.8 细胞转染体系的优化 |
| 4.1.9 细胞周期分析 |
| 4.2 结论 |
| 4.3 展望 |
| 附章 水牛诱导多能干细胞(iPSCs)的初步研究 |
| 附.1 研究意义、目的 |
| 附.2 试验材料和方法 |
| 附.2.1 试验材料 |
| 附.2.2 试验方法 |
| 附.3 部分试验结果 |
| 附.3.1 质粒PCR验证 |
| 附.3.2 慢病毒包装体系的优化 |
| 附.4 分析及讨论 |
| 附.4.1 慢病毒包装体系的优化 |
| 附.4.2 慢病毒感染细胞 |
| 附.5 本章试验进展总结 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（9）诱导成年牛皮肤成纤维细胞为多能性干细胞的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 多能性干细胞研究进展 |
| 1.1 产生多能性干细胞的基本策略 |
| 1.1.1 核移植获得多能性干细胞 |
| 1.1.2 体细胞与ES细胞融合重编程为ES细胞 |
| 1.1.3 细胞培养自发性重编程为多能性干细胞 |
| 1.1.4 转染多能性转录因子诱导体细胞为多能性干细胞 |
| 1.2 多能性相关转录因子在维持细胞多能性中的作用 |
| 1.2.1 Oct-3/4的功能 |
| 1.2.2 Sox2的功能 |
| 1.2.3 Nanog的功能 |
| 1.2.4 c-Myc的功能 |
| 1.2.5 Klf4的功能 |
| 1.2.6 Lin28的功能 |
| 1.3 多能性相关转录因子诱导细胞多能性的分子机理 |
| 第二章 转染特定转录因子产生iPS细胞研究进展 |
| 引言 |
| 2.1 转录因子与小分子化合物的选择应用 |
| 2.1.1 转录因子的选择与应用 |
| 2.1.2 小分子化合物的选择与应用 |
| 2.2 重编程中转录因子导入方法 |
| 2.2.1 逆转录病毒转染系统 |
| 2.2.2 慢病毒转染系统 |
| 2.2.3 腺病毒转染系统 |
| 2.2.4 质粒瞬时转染系统 |
| 2.3 靶细胞的种类与选用 |
| 2.4 影响转录因子表达的主要因素 |
| 2.5 iPS细胞培养条件的建立及其应用 |
| 2.6 iPS细胞克隆鉴别方法 |
| 2.7 iPS细胞传代培养方法及其生物学特性的鉴定方法 |
| 2.7.1 形态学鉴定 |
| 2.7.2 分子水平鉴定 |
| 2.7.3 iPS细胞功能方面的鉴定标准 |
| 2.7.4 iPS细胞生物学特性最低鉴定标准 |
| 2.8 iPS细胞重编程效率的评估方法 |
| 试验研究 |
| 第三章 牛Nanog与Lin28基因ORF全序列克隆及变异分析 |
| 引言 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 主要材料与试剂 |
| 3.1.2 主要仪器设备 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 引物设计与合成 |
| 3.2.2 奶牛胎儿原始生殖嵴获得与总RNA提取 |
| 3.2.3 RT反应 |
| 3.2.4 PCR反应 |
| 3.2.5 PCR产物回收与pMD18-T载体的连接 |
| 3.2.6 感受态细胞制备与转化 |
| 3.2.7 重组质粒鉴定 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 奶牛Nanog基因与Lin28基因RT-PCR扩增结果 |
| 3.3.2 含有重组质粒菌落初步鉴定结果 |
| 3.3.3 重组质粒酶切鉴定结果 |
| 3.3.4 重组质粒PCR鉴定结果 |
| 3.3.5 Nanog基因与Lin28基因核苷酸序列测定与变异分析 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 Nanog在维持多能性中的作用 |
| 3.4.2 Lin28在维持多能性中的作用 |
| 3.4.3 转录因子在体细胞重编程中应用 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 牛Nanog与Lin28基因逆转录病毒载体的构建与包装 |
| 引言 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 基因、质粒载体与细胞株 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器设备 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 质粒TN与TL的酶切与回收 |
| 4.2.2 基因片段与逆转录病毒载体的连接 |
| 4.2.3 重组逆转录病毒质粒的转化与克隆扩增 |
| 4.2.4 重组逆转录病毒质粒的鉴定 |
| 4.2.5 G418对PT67细胞与NIH3T3细胞最小致死量的测定 |
| 4.2.6 重组逆转录病毒质粒的包装与转染效率的测定 |
| 4.2.7 重组逆转录病毒感染滴度的测定 |
| 4.2.8 重组逆转录病毒颗粒形态电镜观察 |
| 4.2.9 包装细胞中重组逆转录病毒的表达与鉴定 |
| 4.2.10 重组逆转录病毒液中野生型病毒的检测 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 重组逆转录病毒质粒MN与ML构建与鉴定 |
| 4.3.2 G418对PT67细胞与NIH3T3细胞最小致死量的测定结果 |
| 4.3.3 产毒细胞株筛选与病毒滴度测定 |
| 4.3.4 重组逆转录病毒质粒在PT67包装细胞中转染效率测定结果 |
| 4.3.5 重组逆转录病毒颗粒的形态 |
| 4.3.6 逆转录病毒质粒MN与ML在包装细胞中的表达与鉴定 |
| 4.3.7 重组逆转录病毒液中野生型病毒的检测 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 牛诱导性多能干细胞系的建立 |
| 引言 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 主要试剂 |
| 5.1.2 主要溶液的配制 |
| 5.1.3 主要仪器设备 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 原代牛皮肤成纤维细胞的分离培养 |
| 5.2.2 BDFs的生物学特性鉴定 |
| 5.2.3 脱细胞人羊膜支架的制备 |
| 5.2.4 逆转录病毒转染BDFs |
| 5.2.5 牛诱导性多能干细胞的产生 |
| 5.2.6 牛iPSCs细胞生物学特性的鉴定 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 原代牛皮肤成纤维细胞的获得、纯化与传代培养 |
| 5.3.2 牛皮肤成纤维细胞形态及免疫细胞化学染色 |
| 5.3.3 牛皮肤成纤维细胞生长曲线与群体倍增时间 |
| 5.3.4 牛皮肤成纤维细胞细胞周期测定结果 |
| 5.3.5 脱细胞人羊膜支架结构 |
| 5.3.6 牛诱导性多能够干细胞的获得与传代培养 |
| 5.3.7 牛iPS细胞集落形成时间与重编程效率 |
| 5.3.8 不同冻存液对牛iPS细胞冻存效果的影响 |
| 5.3.9 牛iPS细胞集落形态与AKP染色结果 |
| 5.3.10 牛iPS细胞生物学特性 |
| 5.3.11 牛iPS细胞核型表现 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 牛皮肤成纤维细胞的分离与纯化 |
| 5.4.2 体细胞重编程与牛iPS细胞的产生 |
| 5.4.3 牛iPS细胞培养体系的建立 |
| 5.4.4 牛iPS细胞的重编程效率 |
| 5.4.5 牛iPS细胞生物学特征 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 牛iPS细胞分化潜能的鉴定 |
| 引言 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 牛iPS细胞株 |
| 6.1.2 试剂与试验动物 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 牛iPS细胞基因表达谱检测 |
| 6.2.2 牛iPS细胞多能性基因表达水平分析 |
| 6.2.3 牛iPS细胞多能性蛋白质表达分析 |
| 6.2.4 牛iPS细胞表观遗传特征分析 |
| 6.2.5 牛iPS细胞形成类胚体与体外分化能力测定 |
| 6.2.6 牛iPS细胞形成畸胎瘤与体内分化能力测定 |
| 6.2.7 牛iPS细胞生产牛羊嵌合体动物及其鉴定 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 牛iPS细胞基因表达谱分析 |
| 6.3.2 牛iPS细胞多能性相关蛋白表达 |
| 6.3.3 牛iPS细胞多能性基因表达水平 |
| 6.3.4 牛iPS细胞Nanog与Oct4基因启动子序列甲基化特征 |
| 6.3.5 形成类胚体与体外自由分化能力 |
| 6.3.6 类胚体介导牛iPS细胞定向分化为神经细胞 |
| 6.3.7 形成畸胎瘤与体内分化能力 |
| 6.3.8 牛羊嵌合体动物的产生及其鉴定 |
| 6.4 讨论 |
| 6.4.1 iPS细胞基因及蛋白质表达特征 |
| 6.4.2 牛iPS细胞中Nanog与Oct4基因启动子序列甲基化模式 |
| 6.4.3 牛iPS细胞体外分化能力 |
| 6.4.4 牛iPS细胞体内分化能力 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 创新之处和进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（10）不同转录因子组合诱导成年牛体细胞为iPS细胞的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 前言 |
| 第一章 多能性干细胞与细胞核重编程 |
| 1.1 各种组织来源的多能性干细胞 |
| 1.1.1 胚胎来源的多能性干细胞(ESCs) |
| 1.1.2 原始生殖嵴来源的多能性干细胞(PGCs/EGCs) |
| 1.1.3 雄性生殖腺来源的多能性干细胞(mGSCs) |
| 1.2 细胞核重编程研究方法及进展 |
| 1.2.1 体细胞核移植 |
| 1.2.2 体细胞与胚胎干细胞融合诱导重编程 |
| 1.2.3 细胞提取物诱导重编程 |
| 1.2.4 转录因子诱导重编程 |
| 1.3 细胞核重编程与表观遗传修饰 |
| 1.3.1 重编程过程基因组的去甲基化 |
| 1.3.2 重编程过程X染色体的重新激活 |
| 1.3.3 重编程过程组蛋白修饰的重塑 |
| 1.4 家畜多能性干细胞建系影响因素 |
| 1.4.1 原代多能干细胞分离与鉴别 |
| 1.4.2 培养条件的优化 |
| 1.5 家畜多能性干细胞研究意义 |
| 第二章 诱导性多能干细胞研究进展 |
| 2.1 诱导多能性干细胞研究概述 |
| 2.2 多能性干细胞的诱导方法 |
| 2.3 诱导方法的优化 |
| 2.3.1 减少致癌和突变风险 |
| 2.3.2 重编程效率的提高 |
| 2.4 诱导性多能干细胞鉴定方法 |
| 2.5 诱导性多能干细胞重编程分子机理 |
| 2.5.1 转录因子及调控网络在重编程中的功能 |
| 2.5.2 表观遗传状态的改变 |
| 2.5.3 重编程过程分析 |
| 2.6 诱导性多能干细胞在医学研究和疾病治疗中的应用 |
| 2.7 多能性干细胞应用前景 |
| 试验研究 |
| 第三章 牛OCT4与C-MYC基因克隆及逆转录病毒表达载体构建 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 牛Oct4和c-Myc基因的克隆 |
| 3.2.2 牛Oct4和c-Myc基因的扩增与鉴定 |
| 3.2.3 逆转录病毒真核表达载体的构建与鉴定 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 感染性重组逆转录病毒的包装与鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 G418对RetroPack PT67细胞与NIH3T3细胞最小致死量 |
| 4.2.2 脂质体介导重组质粒转染PT67细胞稳定产毒株的建立 |
| 4.2.3 产毒细胞株和病毒上清中外源基因的表达 |
| 4.2.4 病毒颗粒电镜检测 |
| 4.2.5 重组逆转录病毒滴度测定 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 四个转录因子组合诱导成年牛皮肤成纤维细胞重编程为IPS细胞 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 牛皮肤成纤维细胞的分离培养和鉴定 |
| 5.2.2 病毒感染牛成纤维细胞与克隆的获得 |
| 5.2.3 牛iPS细胞克隆传代、冻存与复苏 |
| 5.2.4 iPS细胞生物学特性鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 牛IPS细胞多分化潜能的检测 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 牛iPS细胞体外自由分化 |
| 6.2.2 牛iPS细胞体外定向诱导分化为心肌细胞 |
| 6.2.3 牛iPS细胞体外定向诱导分化为神经细胞 |
| 6.2.4 畸胎瘤形成与检测 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 减少转录因子数量对诱导牛IPS细胞效果的影响 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 三因子组合诱导多能性细胞的获得 |
| 7.2.2 二因子和一因子组合诱导多能性干细胞 |
| 7.2.3 三因子诱导获得干细胞的生物学特征鉴定 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 结论 |
| 创新之处和进一步研究的课题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 缩略词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
四、牛皮肤成纤维细胞的体外培养与冻存（论文参考文献）
- [1]四川省3个地方品种牛成纤维细胞系的建立及细胞遗传特性分析[J]. 余敏洁,杨钰楚,陈轩宇,李强,杨舒慧,张燕,张明. 中国畜牧杂志, 2021
- [2]沙狐细胞体外培养体系建立及其生物学特性分析[D]. 闫晓杰. 内蒙古大学, 2019(09)
- [3]SIRT6基因干扰对水牛成纤维细胞衰老的影响[D]. 崔佳瑜. 广西大学, 2019(01)
- [4]Scriptaid对APN基因编辑猪皮肤成纤维细胞体外生长及其再克隆胚胎发育的影响[D]. 朱雪霏. 安徽农业大学, 2019(05)
- [5]Myostatin基因敲低克隆绵羊的研究[D]. 李昊. 东北林业大学, 2019(01)
- [6]猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞培养方法的研究[J]. 信吉阁,成文敏,潘伟荣,卿玉波,查星琴,富国文,魏红江,曾养志. 黑龙江畜牧兽医, 2013(09)
- [7]不同冷冻保护剂和冷冻方法对小鼠耳皮肤成纤维细胞冻存效果的影响[J]. 肖雄,邓玉金,赵海龙,吴有博,李跃民. 动物医学进展, 2012(05)
- [8]水牛胎儿成纤维细胞系的建立及其生物学特性的研究[D]. 罗军. 广西大学, 2012(03)
- [9]诱导成年牛皮肤成纤维细胞为多能性干细胞的研究[D]. 吕长荣. 西北农林科技大学, 2011(04)
- [10]不同转录因子组合诱导成年牛体细胞为iPS细胞的研究[D]. 陈冬梅. 西北农林科技大学, 2011(04)