一、缺氧对牛视网膜色素上皮细胞增生和凋亡基因bcl-2表达的影响（论文文献综述）
由佳鑫[1]（2021）在《干细胞外泌体miR-141对视网膜氧化应激损伤的保护作用及机制》文中研究说明背景:年龄相关性黄斑变性（Age related macular degeneration,AMD）是一种常见的致盲性眼病,主要是由于黄斑部的退行性病变引起。目前对AMD的发病因素尚不完全清楚,但有研究发现氧化应激在AMD发生发展机制中发挥重要作用,过度的氧化应激反应会造成视网膜色素上皮细胞（RPE细胞）功能紊乱。视网膜光损伤模型是研究AMD的常用体内模型之一,其发病的重要机制是视网膜感光细胞和RPE细胞中的光敏物质吸收可见光中的过量光子,产生大量的活性氧自由基（reactive oxygen species,ROS）,当ROS物质在细胞内持续聚集并且无法被抗氧化因子所清除时,其介导的氧化应激反应会导致RPE细胞的损伤、蛋白质变性、细胞膜结构破坏最终导致细胞凋亡。RPE细胞是视网膜中主要的细胞成分之一,其功能的改变对视网膜相关疾病（视网膜炎、视网膜变性及营养不良、视网膜剥离）的发生和发展至关重要。目前大多数学者采用白色LED冷光源来诱发光损伤动物模型,选择白光来模拟日光对视网膜的损伤,从而构建类似于AMD的动物模型。氧化应激是机体在遭受各种有害物质刺激时,体内高活性分子如ROS自由基产生过多,使得氧化系统和抗氧化系统动态失衡,从而导致组织损伤。研究发现,NF-E2相关因子2（NF-E2-related factor 2,Nrf2）通过与抗氧化反应原件（anti-oxidative response element,ARE）相互作用调节编码抗氧化蛋白,是重要的内源性抗氧化应激通路之一。生理状态下,Nrf2与Kelch样关联蛋白1（Kelch-like ECH2 associated protein 1,Keap1）结合,并通过Keap1蛋白将其锚定于由肌动蛋白构成的细胞骨架上,从而无法进入细胞核发挥转录活性。当受到ROS刺激时,Keap1与Nrf2解耦联使得Nrf2转移入核,启动下游保护性蛋白基因的转录,提高细胞抗氧化应激能力。微RNA（micro RNA,miRNA）是一类单股的、长20-25个核苷酸短序列,通过与其靶信使核糖核酸（m RNA）的3’UTR完全或不完全配对,在转录后水平调节基因的表达,每个miRNA可以干扰很多m RNAs,反之每个信使核糖核酸可以监管多个miRNA。近年来研究表明,在人类的基因组中大约有900多种独特的miRNA,并且1/3的基因是被miRNAs调控的。miRNAs在人类及动物的各种生理及病理过程中起重要作用,它们可以参与控制一些生物过程,包括细胞生长、凋亡、发育、新陈代谢、压力调适、激素信号通路和分化等。miRNA-141（miR-141）是miRNA-200（miR-200）家族的成员,通过调节不同的信号通路,在生理状态和疾病发生、发展过程中发挥重要作用。骨髓间充质细胞具有高度自我更新、多向分化和免疫调节功能的干细胞,已成为再生医学中组织器官修复研究的热点细胞。干细胞在眼科领域的研究也有报道,如视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性、角膜缘干细胞缺乏和视神经损伤等。而干细胞被证实能够分化为RPE细胞、神经样细胞、光感受器细胞。同时干细胞能够分泌多种细胞因子和神经营养因子,对抗局部炎症反应,起到对视网膜细胞的保护作用,改善视网膜的微环境。骨髓间充质干细胞发挥生物学功能可能是通过旁分泌的外泌体实现的。外泌体是一种由活细胞分泌的脂质双分子层结构,其内包含许多分子调控物质如脂质、蛋白质和核酸。外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型,其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等病理生理学过程。随着外泌体提取及检测技术的不断成熟,干细胞分泌的可改善视网膜微环境的细胞因子均可在干细胞分泌的外泌体中检测出来。新近研究显示,干细胞分泌的外泌体中不仅含有各种保护性营养因子,还含有能够促进这些营养因子转录和翻译的调控因子。因此,针对干细胞外泌体的研究已成为当下研究热点。外泌体作为纳米级别的运输载体,较干细胞相比体积更小,而且免疫原性更低,被认为可能成为未来进行细胞治疗的理想载体。目的:本研究主要探讨骨髓间充质干细胞外泌体中miR-141对视网膜氧化应激损伤的保护作用及机制。方法:1.骨髓间充质干细胞外泌体的提取与鉴定:对骨髓间充质干细胞培养基上清液进行超高速离心,获得囊泡物质。对提取的囊泡物质进行电镜观察及特异性膜蛋白CD9,CD63,CD81的检测。2.骨髓间充质干细胞外泌体对RPE细胞氧化应激损伤的保护作用:将50μg/ml骨髓间充质干细胞外泌体加入到RPE细胞培养基中,对照组RPE细胞培养基中加入等体积PBS溶液。应用H2O2诱导建立RPE细胞氧化应激损伤模型。比较两组RPE细胞活力值,细胞凋亡水平,caspase-9表达水平,Bcl2和Bax的表达水平。3.miR-141/Keap1/Nrf2通路在RPE细胞氧化应激反应中的分子机制:通过查阅文献发现Keap1-Nrf2-ARE通路是抗氧化应激损的经典通路。利用Targe Ssan在线生物信息分析软件对与Keap1有潜在结合位点的miRNA进行预测。通过荧光素酶报告基因实验验证预测的miR-141与Keap1的结合位点。分别过表达或抑制miR-141后,1)q PCR和蛋白电泳检测Keap1、Nrf2、HO-1和NQO1的表达水平。2)MTS检测细胞活力值。3)caspase-9活性试剂盒检测细胞凋亡水平。过表达miR-141后,应用Nrf2抑制物进行补救实验,观察miR-141是否通过Nrf2发挥抗氧化的保护作用。通过q PCR和蛋白电泳检测Keap1、Nrf2、HO-1和NQO1的m RNA和蛋白表达水平,观察RPE细胞活力值以及细胞凋亡水平。4.骨髓间充质干细胞外泌体miR-141对RPE细胞氧化应激损伤的保护作用:分别提取过表达miR-141的骨髓间充质干细胞外泌体、抑制miR-141的骨髓间充质干细胞外泌体和正常的骨髓间充质干细胞外泌体,将三组外泌体分别加入RPE细胞培养基中共培养48h后,用200μM H2O2对RPE细胞诱导6h,之后检测过表达miR-141或抑制miR-141的BMSCs-exo对于RPE细胞氧化应激损伤的作用,1)q PCR和蛋白电泳检测HO-1、NQO1和caspase 9的表达水平。2)MTS检测细胞活力值。3)caspase-9活性试剂盒检测细胞凋亡水平。5.骨髓间充质干细胞外泌体对急性视网膜光损伤的保护作用:用LED灯构建小鼠急性视网膜光损伤模型。将骨髓间充质干细胞外泌体注射入小鼠的玻璃体腔内,对照组为对侧眼等量PBS玻璃体腔注射,组织HE染色观察视网膜形态学改变,q PCR和蛋白电泳检测Bcl2、Bax、HO-1、NQO1和caspase-9的表达水平。结果:1.骨髓间充质干细胞外泌体的提取与鉴定:对超高速离心法提取的骨髓间充质干细胞上清液中的囊泡物质进行鉴定。电镜下发现囊泡为直径大小约100nm左右的双层膜结构,具备外泌体的形态学特征。结合蛋白电泳CD9,CD63和CD81抗体阳性,说明所提取的囊泡为外泌体。2.骨髓间充质干细胞外泌体对RPE细胞氧化应激损伤的保护作用:将50μg/ml骨髓间充质干细胞外泌体加入到RPE细胞培养基中,发现预先加入外泌体的RPE细胞在H2O2的诱导下,较未加入外泌体的RPE细胞的细胞活力值高,细胞凋亡水平下降,m RNA和蛋白水平检测结果显示caspase-9表达降低,Bax表达降低而Bcl2表达升高。3.miR-141/Keap1/Nrf2通路在RPE细胞氧化应激反应中的分子机制:生物信息分析（Target Scan在线预测网站）预测Keap1与miR-141之间有潜在的结合位点。荧光素酶报告基因实验证实miR-141和Keap1在293T细胞中具有可结合性。对miR-141可能通过Keap1激活Nrf2抗氧化应激通路这一推测进行体外实验,发现过表达miR-141能够抑制Keap1,使得Nrf2与Keap1偶联减少,Nrf2转移入核增多,在核内开启HO-1和NQO1的转录和翻译。抑制miR-141能够减少其对Keap1的抑制作用,使得Nrf2转移入核减少,从而降低HO-1和NQO1的转录和翻译。4.骨髓间充质干细胞外泌体miR-141对RPE细胞氧化应激损伤的保护作用:发现和对照组比过表达miR-141的骨髓间充质干细胞外泌体使得H2O2诱导的RPE细胞活力值升高,caspase-9活性降低,HO-1和NQO1的蛋白和m RNA表达水平升高,从而减轻了H2O2诱导的RPE细胞氧化应激损伤。但是抑制miR-141的骨髓间充质干细胞外泌体使得H2O2诱导的RPE细胞活力值降低,caspase-9活性升高,HO-1和NQO1的蛋白和m RNA表达水平降低。5.骨髓间充质干细胞外泌体对急性视网膜光损伤的保护作用:玻璃体腔注射骨髓间充质干细胞外泌体的小鼠和对照组相比在光损伤模型中外核层细胞损伤数目明显减少,并且视网膜内HO-1和NQO1的蛋白和m RNA表达水平升高,而caspase-9的蛋白和m RNA表达水平降低。结论:1.应用超高速离心法可以提取骨髓间充质干细胞外泌体。2.骨髓间充质干细胞外泌体对H2O2诱导的RPE细胞氧化应激损伤具有保护作用。3.荧光素酶报告基因实验证实miR-141与Keap1之间具有可结合性。miR-141/Keap1/Nrf2信号通路在RPE细胞氧化应激过程中起到保护性调控作用。4.骨髓间充质干细胞外泌体中的miR-141对RPE细胞氧化应激损伤具有保护作用。5.体内实验证实骨髓间充质干细胞外泌体对急性视网膜光损伤具有保护作用。
于泳[2]（2021）在《piRNA-1245/PIWIL2通过JAK2/STAT3/VEGF通路调控视网膜新生血管的生成》文中研究表明目的:视网膜新生血管性病变（Retinal neovascularization,RNV）是很多视网膜疾病均有的终末病理改变,是导致各个年龄段视力障碍的主要原因,异常增生的新生血管受到多种因子通过多种机制的调节。虽然当前使用抗VEGF药物能有效抑制新生血管的生成,但是多次使用产生的抵抗性以及药物对视网膜的损伤都是不可逆的。目前,研究者们从基因组学、遗传学和表观遗传学等多角度研究视网膜新生血管的发病机制,针对视网膜新生血管的发病机制和治疗靶点的研究具有重要的意义。在人类基因组中参与编码蛋白质的基因序列少于2%,而非编码蛋白质的基因序列超过98%。其中,大部分序列转录的片段是非编码RNA（non-coding RNAs,nc RNAs）。非编码RNAs一般分为长链非编码RNAs和短链非编码RNAs,长链非编码RNAs为长度大于200nt,而短链非编码RNAs主要包括mi RNAs、sn RNAs、r RNA、t RNA和PIWI-interacting RNAs（piRNAs）,其中piRNAs长度为26-31nt,是新近发现的一类小分子RNA,与mi RNAs和si RNAs不同的是,piRNAs是无发卡结构的单链RNA,不依赖Dicer酶,通过优先结合Argonaute蛋白家族中的PIWI或Aub亚家族起作用,并能在转录及转录后水平调控靶基因的表达。本研究第一部分首先明确在氧诱导视网膜病变小鼠视网膜组织中piRNAs呈现差异表达,差异表达的piRNAs能否参与调节视网膜新生血管的生成。第二部分首先明确piRNA-1245和PIWIL2蛋白在低氧处理的人视网膜内皮细胞中高表达,敲减piRNA-1245能够降低VEGF的表达。同时通过细胞功能学实验证实piRNA-1245影响低氧HRECs细胞的增殖、迁移、凋亡及成管能力。第三部分通过体外动物实验验证piRNA-1245在病变小鼠视网膜组织中高表达,以及通过何种信号通路参与调节视网膜新生血管的生成。本研究旨在探讨氧诱导视网膜病变的发病机制及其发生发展的分子机制,并为临床预防和治疗RNV的治疗提供理论依据。研究方法:构建氧诱导小鼠视网膜病变模型,通过高通量测序筛选差异表达的piRNAs,结合测序结果选取差异表达的piRNAs,通过构建动物模型及低氧处理的人视网膜内皮细胞,应用Real-time PCR测定piR-1245的表达,应用Western blot方法检测PIWIL2和VEGF的表达,通过细胞转染方法构建piR-1245的敲减细胞株,观察细胞增殖、迁移、凋亡以及成管功能的改变。通过向氧诱导小鼠视网膜病变小鼠玻璃体腔内注射慢病毒,观察小鼠视网膜病变情况以及炎症因子的表达。结果:OIR组共有79个piRNAs呈现出明显的差异表达,其中43个piRNAs表达上调,36个piRNAs表达下调。通过生物信息分析,结果提示部分差异表达的基因参与新生血管的调控,部分基因通过多个通路参与到疾病中。PIWIL2和piR-1245在OIR小鼠视网膜组织以及低氧HREC细胞中高表达,敲减piR-1245能够降低VEGF的表达。敲减piR-1245能够减弱低氧HREC的增殖能力,敲减piR-1245能够减弱低氧HREC的迁移及成管能力,敲减piR-1245能够抑制低氧HREC的凋亡。piR-1245和PIWIL2和VEGF在OIR小鼠视网膜组织中高表达。玻璃体腔注射piR-1245慢病毒能够减轻视网膜组织的炎症反应,玻璃体腔注射piR-1245慢病毒能够抑制视网膜新生血管增生。piR-1245激活JAK2/STAT3通路调控VEGF的表达,进而调控视网膜新生血管的生成。结论:piR-1245在OIR小鼠视网膜组织以及低氧处理的HRECs细胞中高表达,敲减piR-1245能够降低细胞的凋亡率、降低细胞的迁移、增殖及成管能力。玻璃体腔注射sh-piR-1245慢病毒能够减少视网膜新生血管的发生,靶向piRNA-1245的药物可能是治疗缺血性视网膜病的新型候选药物。
李丽华[3]（2021）在《青蒿琥酯对糖尿病大鼠视网膜组织自噬的作用及机制研究》文中研究说明目的:自噬是一个复杂的生理过程,它响应应激条件,负责降解细胞内成分,维持细胞内稳态。自噬在糖尿病性视网膜病变进程中扮演重要角色。青蒿琥酯（Artesunate,ART）是从青蒿中提取的水溶性衍生物,1987年我国卫生部批准其上市,临床用于疟疾的治疗,同时它还具备抗炎的活性,使其在自身免疫病和糖尿病及其并发症中也具有一定作用。青蒿琥酯还被发现作为自噬诱导物,抑制成纤维细胞增殖和手术引起的硬膜外纤维化。高血糖是公认的糖尿病性视网膜病发生发展的危险因素,确切机制并没有完全明确。高血糖引起的生化途径改变,例如高级糖基化终产物/受体的通量增加、多元醇途径、蛋白激酶C活化和己糖胺途径的改变,均会使氧化应激增加,同时有助于诱导炎性中间体的产生。实验室和临床证据表明,先于和伴随微血管的变化,炎性介质和氧化应激在糖尿病性视网膜病变的早期阶段即开始损伤视网膜,自由基和促炎性细胞因子的释放导致血管通透性增加,血视网膜屏障分解和毛细血管周细胞丢失,进而血视网膜屏障破裂导致视网膜损伤。因此氧化应激和炎性反应在糖尿病性视网膜病变一系列病理变化中起着至关重要的作用。而在糖尿病引起的视网膜病变过程中,自噬介导着氧化应激和炎症的调节。有效的自噬调控药物成为当前治疗糖尿病性视网膜病变的研究热点。我们在本研究中使用青蒿琥酯对糖尿病性视网膜病变进行研究,针对氧化应激和炎性反应的以及自噬的变化和5’-腺嘌呤核苷酸依赖的蛋白激酶（Adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase,AMPK）/沉默信息调节因子2相关酶1（Silent mating type information regulation 2 homolog-1,SIRT1）信号通路进行了探讨。我们通过实验研究证实青蒿琥酯对糖尿病大鼠视网膜组织的保护作用。本研究分为三部分:首先,我们通过链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）诱导建立大鼠糖尿病模型,成模后进行体内研究,观察青蒿琥酯对糖尿病大鼠视网膜组织层间结构和视网膜屏障渗漏水平的影响,并检测了视网膜组织的活性氧和炎性反应水平。之后,我们还检测了糖尿病大鼠视网膜组织中自噬相关蛋白的表达及AMPK/SIRT1活化的水平。同时,为了进一步证实青蒿琥酯发挥作用的机制,我们进行相应的体外研究。使用高糖诱导人视网膜色素上皮细胞,然后检测青蒿琥酯对细胞氧化应激和炎性反应情况的影响,同时也对自噬水平及AMPK/SIRT1活化情况进行检测。研究方法:1、SD大鼠分成4组,分别为对照组、糖尿病组、及糖尿病加高、低剂量青蒿琥酯治疗组;除对照组,其他组大鼠腹腔注射STZ建立糖尿病模型,治疗组分别给予低、高剂量青蒿琥酯治疗。2、苏木精-伊红染（Hematoxylin-Eosin Staining,HE）染色检测大鼠视网膜的组织形态学变化。3、Evens blue检测大鼠视网膜屏障渗漏情况。4、Lectin染色检测存在于视网膜血管中的白细胞粘附。5、Iba-1免疫组化标记视网膜小胶质细胞。6、RT-qPCR检测大鼠视网膜组织中IL-1β、IL-6mRNA表达水平,酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测大鼠视网膜组织MCP-1表达的变化。7、超氧化物阴离子荧光染色（Dihydroethidium,DHE）染色检测大鼠视网膜组织活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）水平的改变。8、Western blot检测大鼠视网膜组织中Beclin-1、LC3II/I、P62及AMPK、p-AMPK、SIRT1、p-SIRT1的表达水平的变化。9、高糖及青蒿琥酯加高糖处理人视网膜色素上皮细胞。CCK-8实验检测细胞增殖活力的变化。10、流式细胞仪检测青蒿琥酯对高糖作用下细胞凋亡和线粒体膜电位情况的影响。11、对人视网膜色素上皮细胞氧化应激水平包括丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）的生化检测和荧光染色法检测ROS水平进行评估。12、ELISA检测细胞IL-1β、IL-6和MCP-1表达水平。13、单丹磺酰戊二胺染色（Dansylcadaverine,MDC）检测自噬体形成情况。14、Western blot检测青蒿琥酯对细胞Beclin-1、LC3II/I、P62及AMPK/SIRT1活化的影响。15、转染si-SIRT1后检测对青蒿琥酯在高糖作用下的人视网膜色素上皮细胞中发挥作用的影响。结果:1、青蒿琥酯改善糖尿病大鼠视网膜组织结构和减轻血视网膜屏障的渗漏。2、糖尿病大鼠视网膜组织中白细胞粘附增强,小胶质细胞活化增多,IL-1β、IL-6的mRNA水平和促炎细胞因子MCP-1上调;青蒿琥酯干预改善糖尿病引起的视网膜组织的炎性反应水平下降。3、青蒿琥酯降低大鼠视网膜组织中ROS的水平。4、青蒿琥酯增加大鼠视网膜组织的自噬水平以及AMPK/SIRT1信号通路的活化。5、高糖条件抑制人视网膜色素上皮细胞的增殖活力、破坏线粒体膜电位、细胞凋亡增加;青蒿琥酯干预可以改善细胞的增殖活力、保护线粒体膜电位、减轻凋亡水平。6、青蒿琥酯有效改善高糖引起视网膜色素上皮细胞的氧化应激水平,降低促炎因子的表达水平。7、青蒿琥酯激活AMPK/SIRT1信号通路增强高糖作用下自噬的水平。8、SIRT1对于青蒿琥酯在高糖作用下对人视网膜色素上皮细胞发挥保护作用具有重要作用。结论:1、青蒿琥酯对糖尿病大鼠视网膜组织结构层次和血视网膜屏障显示出了保护作用。2、青蒿琥酯能够降低糖尿病大鼠视网膜组织中炎性反应和氧化应激水平,增加AMPK/SIRT1信号通路的活化,增强自噬从而发挥作用。3、青蒿琥酯能够通过SIRT1激活自噬而减轻高糖引起的视网膜色素上皮细胞氧化应激和促炎因子的释放保护细胞。
席晓婷[4]（2020）在《miR-130a通过TNF-α/SOD1信号通路抑制糖尿病视网膜病变的作用机制研究》文中研究表明[背景]糖尿病视网膜病变（Diabetic retinopathy,DR）是糖尿病（diabetes mellitus,DM）的微血管并发症,是导致我国工作年龄人群失明的主要原因,且其发病率还在不断上升,给人类健康和生活质量带来严重威胁。DR的发生和发展是一个错综复杂的过程,受多因素、多基因、多分子通路的影响,其具体机制尚未完全清楚。目前的研究发现,DR可能与多元醇的代谢通路异常、蛋白质非酶糖基化产物的堆积、蛋白激酶C（PKC）的活化、血管紧张素转换酶系统的作用有关,在这些传统通路的上游途径又发现了共同启动因子活性氧（Reactive oxygen species,ROS）。据报道,在DR发病机制的上游,高血糖作为起始因素导致ROS合成增加,ROS又作为一个共同启动因子瀑布式启动相关致病分子通路,而各种通路的激活又可正反馈调节ROS的合成,导致ROS合成增加,这种逐步放大的形式则导致了 DR的发生发展。因此,高糖导致的ROS合成增加是DR发病的中心环节,阻断这一中心环节可以阻断DR的发生和病理进程。视网膜色素上皮（Retinal Pigment Epithelial,RPE）细胞由单层紧密连接的六边形细胞组成,构成了血-视网膜外屏障。RPE细胞特殊的解剖位置和功能使其易受到血糖波动的影响,发生病理和功能的改变。在DR早期,高血糖影响RPE细胞结构,损害血-视网膜外屏障,导致RPE细胞死亡、患者视力丧失。同样,高糖可以导致RPE细胞分泌异常,视网膜血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）增多,血管渗透性增加,微血管瘤和视网膜新生血管形成,最终形成DR。DR的RPE细胞损害与早期糖尿病患者的视功能下降密切相关,探究其中的具体机制有助于DR的早期诊断及治疗。细胞焦亡（pyroptosis）又称细胞炎性坏死,是由gasdermin介导的细胞程序性坏死,表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂,导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。有研究发现,ROS可以诱导细胞焦亡,导致细胞膜孔隙形成、膜破裂以及IL-1β和IL-18的释放。此外,细胞焦亡标志蛋白NOD样受体家族蛋白3（NOD-like receptors,NLRP3）、cleaved-caspase-1 及 IL-1β已被报道在链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）诱导的大鼠视网膜、糖尿病性增生性视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy,PDR）患者的玻璃体中表达增加。这表明,焦亡对于DR的发展尤为重要,可能是导致视网膜细胞死亡和视网膜功能丧失的重要因素,研究DR中ROS诱导的细胞焦亡有助于帮助我们更深入的理解DR发病机制,甚至能帮助我们找到防治DR的新突破点。MicroRNAs（miRNAs）是一类内源性的、进化高度保守的小分子非编码RNA,广泛表达于人体多种细胞,可通过介导mRNA降解和/或翻译抑制在转录后水平上负调控基因的表达,以此参与细胞增殖、分化、侵袭、迁移、凋亡、胰岛素分泌、器官形成、造血等生物学过程的调控。miR-130a已被证实在细胞增殖、凋亡、ROS产生和细胞焦亡的过程中起着重要的调控作用,但其在DR中的作用还尚未被报道。据文献报道,TNF-α/SOD1/ROS信号通路是高糖处理的MPC5足细胞中miR-130a的下游靶标,且TNF-α和SOD1均被证实参与细胞焦亡、氧化应激等过程。因此,miR-130a可能会通过调控TNF-α/SOD1/ROS信号通路来调节视网膜细胞焦亡过程,进而调节DR发展进程。基于以上背景,本研究将采用CCK-8、RT-qPCR、Western blot、流式细胞术、平板克隆形成实验、DHE染色、双荧光素酶报告基因系统、HE染色、视网膜铺片等试验方法,以miR-130a为研究重点,在细胞、动物及临床三个方面,证实miR-130a通过TNF-α/SOD1信号通路抑制DR的作用机制。[目的]（1）检测miR-130a在高糖诱导的视网膜色素上皮（ARPE-19）细胞、DR小鼠模型以及DR患者外周血中的表达水平;（2）寻找并证实TNF-α是miR-130a的靶基因,并验证它们的靶向关系;（3）检测高糖对TNF-α和SOD1表达的影响;（4）探究高糖条件下过表达miR-130a对ARPE-19细胞增殖活力、凋亡、克隆形成能力、氧化应激、细胞焦亡的影响及机制;（5）明确过表达miR-130a对DR小鼠模型视网膜病变的影响;（6）明确miR-130a、TNF-α和SOD1在DR患者外周血中的表达及线性关系;（7）明确miR-130a表达与DR的相关性。[方法]（1）取对数生长期的ARPE-19细胞分别用正常糖（5.5 mM）和高糖（50 mM）培养0h、24 h、48 h、72 h、96 h,在高糖条件下通过慢病毒转染的方法改变ARPE-19 细胞中 miR-130a、TNF-α和 SOD1 表达;CCK-8 检测 ARPE-19 细胞增殖活;流式细胞术检测ARPE-19细胞凋亡率;平板克隆形成实验检测ARPE-19细胞克隆形成能力;DHE染色检测ARPE-19细胞中ROS水平;丙二醛（Malondialdehyde,MDA）试剂盒检测 ARPE-19 细胞中 MDA 表达;L-012 染色检测细胞外NADPH氧化酶衍生的超氧化物水平;RT-qPCR检测ARPE-19细胞中 miR-130a、TNF-α mRNA、SOD1 mRNA 表达;Western blot 检测 ARPE-19细胞中TNF-α、SOD1、增殖相关蛋白、凋亡相关蛋白、焦亡相关蛋白表达;双荧光素酶报告基因验证miR-130a和TNF-α的靶向关系。（2）通过给小鼠腹腔注射STZ诱导建立DR小鼠模型,待成模后通过慢病毒眼内注射过表达miR-130a,在第14天后检测小鼠体重和血糖变化,并处死小鼠,取出右眼,经固定、石蜡包埋后,HE染色进行组织学分析,视网膜铺片检测小鼠视网膜血管病变;取出左眼视网膜组织,采用RT-qPCR检测miR-130a、TNF-α、SOD1 的 mRNA 表达;Western blot 检测 TNF-α、SOD1、焦亡相关蛋白表达;流式细胞术检测小鼠视网膜组织中ROS水平;MDA试剂盒检测小鼠视网膜组织中MDA含量。（3）于昆明医科大学第一附属医院眼科收集3例正常人、30例糖尿病无视网膜病变（Diabetic non-retinopathy,NO DR）患者、30例DR患者外周血,将血样在8℃下以3000 g离心10 min,收集上清,RT-qPCR检测外周血中miR-130a、TNF-α mRNA、SOD1 mRNA 表达,并分析 miR-130a 与 TNF-α以及 miR-130a 与SOD1的线性关系。[结果]（1）细胞实验部分①高糖以时间依赖性显着抑制ARPE-19细胞增殖活力、促进细胞凋亡、抑制细胞克隆形成,过表达miR-130a可以缓解高糖对ARPE-19细胞增殖活力和细胞克隆形成的抑制作用,同时,过表达miR-130a也能缓解高糖诱导的ARPE-19细胞凋亡。同时过表达TNF-α或敲降SOD1可恢复以上作用。②高糖以时间依赖性促进ARPE-19细胞发生氧化应激。高糖能显着上调ARPE-19细胞中ROS和MDA水平,而用ROS清除剂NAC或焦亡抑制剂NSA分别处理ARPE-19细胞后,发现NAC显着抑制高糖诱导的ROS和MDA水平,而NSA对ROS和MDA水平无显着影响,同时,过表达miR-130a显着抑制高糖诱导的ROS和MDA水平,而过表达TNF-α或敲降SOD1恢复了过表达miR-130a的该作用。③高糖可下调miR-130a的表达、上调TNF-α的表达,抑制SOD1表达。且miR-130a靶向下调TNF-α的表达。高糖抑制miR-130a和SOD1mRNA的表达,上调TNF-αmRNA表达,而过表达miR-130a恢复了高糖对miR-130a、TNF-αmRNA和SOD1 mRNA表达的作用,过表达TNF-α或敲降SOD1又可恢复过表达miR-130a的作用;双荧光素酶报告基因和Western blot检测结果显示,miR-130a靶向下调TNF-α表达。④miR-130a通过TNF-α/SOD1/ROS信号通路抑制ARPE-19细胞焦亡。高糖显着上调 TNF-α、Caspase-3、Bax、P27、Caspase-1、Gasdermin D、NLRP3、IL-1β和IL-18的表达,抑制Bcl-2和SOD 1表达,过表达miR-130a缓解了高糖对TNF-α、Caspase-3、Bax、P27、Caspase-1、Gasdermin D、NLRP3、IL-1β、IL-18、Bcl-2和SOD1表达的作用,而过表达TNF-α或敲降SOD1恢复了过表达miR-130a的作用。（2）动物实验部分:与对照组相比,DR组、DR+Ctrl-mimic组及DR+miR-130a mimic组小鼠体重显着降低,血糖浓度显着增加;DR组中miR-130a和SOD1 mRNA的表达较对照组显着降低,TNF-α mRNA表达显着增加,而DR+miR-130 a mimic部分恢复了该作用;Western blot检测结果显示,DR组中TNF-α、Caspase-1、Gasdermin D、NLRP3、IL-1β和 IL-18 的表达较对照组显着上调,SOD1表达显着下调,而DR+miR-130a mimic部分恢复了该作用;HE染色结果显示,与对照组相比,DR组小鼠的视网膜组织中RPE层厚度降低,细胞数量减少、排列紊乱,而DR+miR-130a mimic组部分缓解了 DR组的改变;视网膜铺片结果显示,DR组小鼠血管末端可见微血管瘤及多个无灌注区,而DR+miR-130a mimic部分恢复了该作用;流式细胞术和MDA试剂盒检测结果显示,DR组中ROS和MDA水平较Ctrl组显着增加,而DR+miR-130a mimic部分恢复了该作用。（3）临床样本分析结果显示:DR与患者的性别、年龄、心脏病病史以及高血压病史无关,而与患者的DM病史时间显着相关。RT-qPCR检测DR患者外周血中 miR-130a、TNF-α mRNA 及 SOD1 mRNA 的表达,结果显示,miR-130a和SOD1 mRNA在NO DR患者外周血中异常低表达,在DR患者外周血中的表达更低,TNF-α mRNA在NODR患者外周血中异常高表达,在DR患者外周血中的表达更高;且miR-130a和TNF-α mRNA表达呈负相关,TNF-α mRNA与SOD1 mRNA表达呈负相关,miR-130a与SOD1 mRNA呈正相关。[结论]（1）高糖刺激可抑制ARPE-19细胞增殖活力、抗凋亡力、克隆形成能力,并促进ARPE-19细胞中氧化应激和焦亡的发生。（2）高糖可抑制ARPE-19细胞中miR-130a和SOD1表达,上调TNF-α表达,且呈时间依赖性。（3）miR-130a靶向下调TNF-α表达;（4）miR-130a通过TNF-α/SOD1/ROS信号通路抑制ARPE-19细胞焦亡（5）在STZ诱导的DR小鼠模型视网膜组织中miR-130a表达显着下调,TNF-α和SOD1表达显着上调,且过表达miR-130a可显着抑制DR模型中氧化应激和细胞焦亡;（6）DR与患者的性别、年龄、心脏病病史以及高血压病史无关,而与患者的DM病史时间显着相关。miR-130a和SOD1 mRNA在NO DR患者外周血中异常低表达,且在DR患者外周血中表达更低,TNF-α mRNA表达在NODR患者外周血中异常高表达,且在DR患者外周血中表达更高。
何岁勤[5]（2020）在《决明子水溶性多糖通过调控PI3K/Akt和TLR4/NF-κB信号通路对MNU诱导大鼠视网膜色素变性保护作用的研究》文中认为背景:视网膜色素变性（retinitis pigmentosa,RP）是最具代表性的视网膜变性疾病,其特征是色素上皮发生结构和功能异常,引起视网膜光感受器细胞的凋亡及坏死。主要表现为视网膜色素上皮吞噬功能障碍和神经细胞进行性凋亡,以夜盲、进行性视野缺损、视网膜色素沉着、视盘蜡黄色萎缩等为主要临床特征,最终导致失明。N-甲基-N-亚硝基脲（N-methyl-N-nitrosourea,MNU）作为一种烷基化致癌物,可通过选择性损伤视网膜感光细胞,导致细胞死亡,诱发RP,并在RP研究中得到了广泛的应用。RP患者感光细胞凋亡,视网膜炎症因子上调,因此抗炎、抗凋亡是治疗RP的主要靶点。现阶段,RP主要治疗方法包括基因治疗,干细胞治疗和药物干预。但是RP遗传方式复杂,等位基因过多,干细胞移植尚存在难解决的技术问题,使得基因治疗和干细胞治疗应用受限。因此,通过药物筛选,寻找治疗RP的药物将可能成为一种有效的途径,尤其是中药治疗是一种重要的可能方式,并得到广泛重视。决明子以其有明目之功而名之,是中医眼科治疗眼疾的重要药物,有研究表明,决明子具有抗凋亡、抗炎和抗氧化等的药理作用。决明子多糖（Semen cassiae polysaccharide,SCP）是从决明子中提取的水溶性多糖,是其主要活性成分之一,也是发挥明目作用的主要成分,可用于治疗白内障、视网膜炎、视神经萎缩、青光眼、结膜炎等眼病,但对RP的治疗作用及其机制尚未得到研究。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）是一种脂类激酶,具有磷脂酰肌醇激酶和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的双重活性。AKT又称为蛋白激酶B（PKB）,是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是PI3K下游典型的活性分子,可促进视锥细胞的增殖。研究发现,PI3K/Akt信号通路在多种眼科疾病的发生发展发挥重要作用,可抑制细胞凋亡,诱导细胞增殖,达到细胞保护作用。Toll样受体（TLRs）在炎症反应中起着重要的调节作用,TLR4水平升高可诱导炎性细胞因子,包括肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）等。核转录因子kappa B（NF-κB）是一种与视网膜炎症反应相关的促炎症转录因子,TLR4受体激活后可通过信导激活NF-κB,发挥抗炎免疫调节的作用。因此,决明子水溶性多糖很可能通过调控PI3K/Akt和TLR4/NF-κB信号通路对MNU诱导的的大鼠RP发挥抗凋亡抗炎作用,进而对RP起到治疗和保护作用。目的:1.探讨决明子水溶性多糖对大鼠RP的抗凋亡和抗炎作用,寻找并证实决明子水溶性多糖对RP具有保护作用。2.探讨决明子水溶性多糖治疗大鼠RP的抗凋亡和抗炎的可能机制。验证决明子水溶性多糖可能通过调控PI3K/Akt和TLR4/NF-κB信号通路对MNU诱导的大鼠RP起到治疗和保护作用,为决明子水溶性多糖成为治疗RP的一种潜在的新药提供理论依据。方法:1.选取Sprague-Dawley（SD）大鼠,腹腔注射MNU诱导构建大鼠视网膜色素变性模型。诱导后的大鼠RP模型灌胃给予50mg/kg、100mg/kg、200 mg/kg决明子水溶性多糖,注射MNU后24h及5d对其进行检测,包括视网膜厚度、视网膜感光细胞凋亡,视网膜电图（ERG）等,验证决明子水溶性多糖的药效及其抗凋亡活性。应用Western blot检测Bax和Bcl-2蛋白表达水平,ELISA试剂盒检测Caspase-3蛋白表达水平。脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导Müller细胞作为体外模型细胞,给予50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg决明子水溶性多糖72小时后,用流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测Bax和Bcl-2蛋白表达水平,ELISA试剂盒检测Caspase-3蛋白表达水平。2.MNU诱导后的大鼠RP模型给于50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg决明子水溶性多糖,ELISA试剂盒检测肿瘤坏死因子α（TNF-α）,白介素1β（IL-1β）,白介素6（IL-6）和白介素18（IL-18）表达水平。LPS诱导视网膜小胶质细胞作为体外模型细胞,并给予50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg决明子水溶性多糖2小时和4小时后,用ELISA试剂盒检测TNF-α,IL-1β,IL-6和IL-18表达水平。3.运用基因芯片筛选相关凋亡和炎症基因,再结合生物信息学方法预测得出可能的相关信号通路。通过聚类分析,功能分析和动态网络分析等生物信息学方法,全面挖掘在决明子水溶性多糖调控MNU诱导的大鼠视网膜色素变性起关键作用的基因及其信号通路,并就筛选得到的关键基因的蛋白表达行进一步分析。然后,Western blot检测相关蛋白的表达量,明确决明子水溶性多糖调控MNU诱导的大鼠视网膜色素变性的分子机制。结果:1.决明子水溶性多糖（50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg）能不同程度的抑制MNU注射后24h及5d所致的视网膜病理组织结构损伤,并且这种保护作用表现为剂量依赖性。决明子水溶性多糖（100mg/kg和200mg/kg）可以明显增加视网膜厚度。2.决明子水溶性多糖（100mg/kg和200mg/kg）可显着抑制注射MNU后24h及5d所致的感光细胞凋亡,并呈现剂量依赖性。3.MNU诱导的大鼠RP模型,ERG检测发现a波和b波振幅降低,决明子水溶性多糖（50mg/kg、100mg/kg和200mg/kg）能不同程度的提高MNU注射后24h及5d的ERG的a波和b波振幅。4.造模24小时和5天,决明子水溶性多糖通过调控Bax,Bcl-2,Caspase3,casepase9凋亡蛋白（Bax,Casepase-3表达减少,Bcl-2表达增加）,参与减少视网膜感光细胞的凋亡。在体外研究中,决明子水溶性多糖同样通过调控Bax,Bcl-2,Caspase3凋亡蛋白,降低细胞凋亡率和细胞毒性（细胞外乳酸脱氢酶LDH的水平）。5.造模24小时和5天,决明子水溶性多糖减少视网膜组织炎症因子TNF-α,IL-1β,IL-6和IL-18水平,并呈现剂量依赖性;同时,在体外模型给予决明子水溶性多糖2h和4 h后,视网膜细胞中TNF-α,IL-1β,IL-6和IL-18水平降低,并也呈现剂量依赖性。6.运用基因芯片筛选相关凋亡和炎症基因,再结合生物信息学方法预测筛选得出可能的相关信号通路,PI3K/Akt和TLR4/NF-κB。在大鼠模型中,决明子水溶性多糖增加PI3K和p-Akt蛋白的表达,同时抑制TLR4和NF-κB蛋白表达,均呈现剂量依赖性;在细胞水平上,决明子水溶性多糖同样增加PI3K和p-Akt蛋白的表达和抑制TLR4/NF-κB蛋白表达,同样也呈现剂量依赖性。结论:1.决明子水溶性多糖对MNU诱导的RP具有明显的保护作用。2.决明子水溶性多糖可能通过激活PI3K/Akt通路,从而影响相关凋亡蛋白的表达,进而发挥抗凋亡作用,阻止大鼠RP的发生,并起到治疗作用。3.决明子水溶性多糖可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路,从而降低TNF-α,IL-1β,IL-6和IL-18表达水平,减少视网膜组织和细胞炎症,进而发挥抗炎作用。4.本课题的研究结果有助于进一步理解RP的发病机制,为临床应用决明子水溶性多糖预防和治疗RP提供了实验依据,使决明子水溶性多糖有望成为治疗RP的一种潜在的新药。
陈水龄[6]（2020）在《姜黄素抑制实验性脉络膜新生血管的机制研究》文中指出第一章目的采用 532nm倍频激光建立实验性脉络膜新生血管（Choroidal Neovascularization,CNV）动物模型,为CNV的相关基础研究提供模型参考。方法1.应用532nm倍频激光光凝棕色挪威（Brown Norway,BN）大鼠建立实验性CNV模型,分别在光凝后1d、3d、5d、7d、14d、21d采用眼底照、眼底荧光血管造影（Fundus Fluorescein Angiograph,FFA）和吲哚菁绿血管造影（Indocyanine green Angiography,ICGA）观察光凝后不同时间点 CNV 的变化情况。2.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本,采用HE染色法观察光凝后不同时间点CNV中央厚度。3.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本,采用免疫组织化学染色法观察光凝后不同时间点CNV眼组织中CD105因子表达的情况。结果1.光凝后1d光斑处无荧光素渗漏;光凝后3d、5d仅有少量光斑处有荧光素渗漏。光凝后7d CNV生成率为70.18%,荧光素渗漏平均光密度值为128.30±11.21。光凝后14d CNV生成率为78.18%,平均光密度值为182.12±6.59,与光凝后7d组比较差异有统计学意义（P<0.05）。光凝后21d,CNV生成率和荧光素渗漏平均光密度值与光凝后14d组比较差异无统计学意义。2.HE染色结果显示:随着光凝后时间的增加,CNV中央厚度逐渐增加,光凝后7d CNV厚度为48.92±2.81μm,较光凝后1d显着增加（P<0.05）;光凝后14d CNV厚度为61.98±5.06μm,较光凝后7d显着增加（P<0.05）;光凝后21d CNV厚度为61.78±4.03μm,与14d组比较差异无统计学意义。3.CD105免疫组化结果显示:正常组视网膜组织CD105表达呈阴性,光凝后1d、3d、5d组光斑处可见少量棕黄色反应物表达,光凝后7d组光斑处棕黄色反应物逐渐增多（P<0.05）,光凝后14d组较光凝后7d组比较显着增加（P<0.05）,光凝后21d组与光凝后14d组比较差异无统计学意义。结论1.应用532nm激光光凝可以成功建立BN大鼠实验性CNV动物模型。2.CNV在光凝后7d至14d生长迅速,至21d逐渐稳定,此模型具有成模速度快,成模率高、重复性好、成本低的优点,可作为CNV基础研究的动物模型。3.眼底照、FFA、ICGA、HE染色和免疫组化检查可以动态观察CNV的变化。第二章目的观察中药单体姜黄素对BN大鼠实验性CNV的抑制作用,以及对AKT/p-AKT/HIF-1 α/VEGF信号通路活性的影响,为姜黄素治疗CNV提供实验依据。方法1.应用532nm倍频激光光凝诱导BN大鼠建立CNV模型,造模后的大鼠被随机分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低剂量组、姜黄素中剂量组和姜黄素高剂量组,在光凝后14d进行眼底照、FFA与ICGA检查。2.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本,采用HE染色法观察不同组CNV中央厚度。3.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本,采用免疫组织化学法观察不同组CNV眼组织中AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子蛋白的表达情况。4.采用RT-qPCR法检测CNV眼组织中AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子mRNA的相对表达量。5.采用蛋白免疫印迹（Western blot）法检测CNV眼组织中AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子蛋白的相对表达量。结果1.正常组未打激光,模型组,雷珠单抗组,姜黄素低、中、高剂量组CNV生成率分别为78.18%、73.21%、77.19%、75.86%、74.55%,组间比较差异无统计学意义;荧光素渗漏平均光密度值分别为182.12±6.59、119.22±8.03、166.45±8.33、164.34±5.69、149.22±6.45;雷珠单抗组较模型组显着降低（P<0.05）;姜黄素低、中、高剂量组较雷珠单抗组显着升高（P<0.05）,其中姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）。2.HE染色结果显示:正常组BN大鼠视网膜组织各层结构清晰、排列整齐。光凝后14d,雷珠单抗组CNV中央厚度较模型组显着减少（P<0.05）;姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素高剂量组较模型组显着减少（P<0.05）,较雷珠单抗组显着增加（P<0.05）。3.免疫组化结果显示:正常组BN大鼠视网膜组织结构中AKT、p-AKT、HIF-1α、VEGF因子表达呈阴性,未见棕黄色反应物。光凝后14d,模型组光斑处AKT、p-AKT、HIF-1α、VEGF因子的表达高于正常组（P<0.05）;雷珠单抗组低于模型组（P<0.05）;姜黄素低剂量组、中剂量组AKT、p-AKT、HIF-1α、VEGF因子的表达与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素高剂量组的表达较模型组显着降低（P<0.05）;较雷珠单抗组显着增加（P<0.05）。4.mRNA结果显示:光凝后14d,模型组AKT、HIF-1α和VEGF mRNA相对表达量均高于正常组（P<0.05）;雷珠单抗组均低于模型组（P<0.05）;姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）,较雷珠单抗组显着增加（P<0.05）。5.Westernblot结果显示:光凝后14d,AKT蛋白各组间比较差异无统计学意义。p-AKT蛋白相对表达量模型组较正常组显着增加（P<0.05）;雷珠单抗组较模型组显着降低（P<0.05）;姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）。HIF-1α蛋白相对表达量模型组较正常组显着增加（P<0.05）,雷珠单抗组较模型组显着降低（P<0.05）,姜黄素低、中剂量与模型组比较差异无统计学意义,姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）,较雷珠单抗组显着增加（P<0.05）。VEGF蛋白相对表达量模型组较正常组显着增加（P<0.05）,雷珠单抗组较模型组显着降低（P<0.05）,姜黄素低剂量组与模型组比较差异无统计学意义,姜黄素中、高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）。结论1.高剂量姜黄素（400mg/Kg/d）对激光诱导的BN大鼠实验性CNV的形成具有抑制作用。2.姜黄素抑制BN大鼠实验性CNV的机制可能与抑制AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路的激活,降低相关因子的表达有关。第三章目的观察姜黄素对氯化钴（CoCl2）诱导的人视网膜色素上皮细胞株-19（adult retinal pigment epithelial cell line-19,ARPE-19）细胞缺氧模型中 AKT、HIF-1 α 和VEGF因子mRNA及蛋白表达的影响。方法1.采用CoCl2诱导ARPE-19细胞建立化学性缺氧模型,应用CCK-8法筛选造模试剂CoCl2、实验药物姜黄素和阳性对照药雷珠单抗的浓度,同时检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞活性的影响。2.将ARPE-19细胞分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组,应用RT-qPCR法检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞缺氧模型AKT、HIF-1α和VEGF mRNA表达量的影响。3.将ARPE-19细胞分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组,应用Westernblot法检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞缺氧模型AKT、p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白表达量的影响。结果1.CCK-8细胞活性检测:随着CoCl2浓度的增加,ARPE-19细胞活性呈现先增长后抑制,当CoCl2终浓度≥200μM时,细胞活性显着降低（P<0.05）。姜黄素终浓度在0-100μM时,ARPE-19细胞活性未见异常;当浓度≥200μM时,细胞活性显着降低（P<0.05）。雷珠单抗在终浓度为20μg/mL时,细胞活性较CoCl2组显着降低（P<0.05）,与正常组比较差异无统计学意义;当浓度为40μg/mL、80μg/mL时,细胞活性较CoCl2组和正常组均显着降低（P<0.05）。因此,我们选择终浓度100μM的CoCl2作为造模浓度;终浓度6.25μM、25μM、100μM的姜黄素作为低、中、高剂量组浓度;终浓度为20μg/mL的雷珠单抗作为阳性对照药物的浓度。2.RT-qPCR结果显示:模型组AKT、HIF-1α和VEGF mRNA相对表达量均高于正常组（P<0.05）;雷珠单抗组均低于模型组（P<0.05）;姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义（P<0.05）;姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）;与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。3.Westernblot结果显示:AKT蛋白相对表达量各组间比较差异无统计学意义。p-AKT和HIF-1α蛋白相对表达量模型组均高于正常组（P<0.05）,雷珠单抗组均低于模型组（P<0.05）,姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义（P<0.05）,姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）,与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。VEGF蛋白相对表达量模型组高于正常组（P<0.05）,雷珠单抗组低于模型组（P<0.05）,姜黄素低剂量与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素中、高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）,与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。结论1.应用CoCl2可成功建立APRE-19细胞化学缺氧模型。2.CoCl2在终浓度为100μM时可增加细胞中AKT、HIF-1α和VEGF mRNA及p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白的表达量。3.高剂量姜黄素（100μM）可降低CoCl2诱导的ARPE-19细胞中AKT、HIF-1α和 VEGF mRNA 及 p-AKT、HIF-1α 和 VEGF 蛋白的表达。4.姜黄素（100μM）对CoCl2诱导ARPE-19细胞缺氧具有保护作用。第四章目的观察ARPE-19细胞的各组条件培养液对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）细胞增殖、迁移、侵袭和管腔形成的影响。方法1.将ARPE-19细胞条件培养液分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组,分别作用于HUVEC细胞;采用CCK-8法观察ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞活性的影响。2.采用细胞划痕实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的水平迁移的影响。3.采用Transwell小室迁移实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的垂直迁移的影响。4.采用Transwell小室侵袭实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的侵袭的影响。5.采用Matrigel基质胶管腔形成实验,观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞管腔形成的影响。结果1.ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞活性的影响,组间差异无统计学意义。2.HUVEC细胞水平迁移实验结果显示:与正常组比较模型组HUVEC细胞水平迁移显着增加（P<0.05）;与模型组比较雷珠单抗组水平迁移显着减少（P<0.05）;姜黄素条件培养液低（6.25μM）、中（25μM）、高（100μM）剂量组水平迁移较模型组显着减少（P<0.05）,其中,高剂量组与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。3.HUVEC细胞垂直迁移实验结果显示:与正常组比较模型组HUVEC细胞垂直迁移显着增加（P<0.05）;与模型组比较雷珠单抗组垂直迁移显着减少（P<0.05）;姜黄素条件培养液低（6.25μM）、中（25μM）剂量组垂直迁移与模型组比较差异无统计学意义,姜黄素条件培养液高（100μM）剂量组垂直迁移较模型组显着减少（P<0.05）,与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。4.HUVEC细胞侵袭实验结果显示:与正常组比较模型组HUVEC细胞侵袭显着增加（P<0.05）;与模型组比较雷珠单抗组细胞侵袭显着减少（P<0.05）;姜黄素条件培养液低（6.25μM）、中（25μM）剂量组细胞侵袭与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素条件培养液高（100μM）剂量组较模型组细胞侵袭显着减少（P<0.05）,与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。5.HUVEC细胞管腔形成实验结果显示:模型组管腔形成较正常组显着增加（P<0.05）;雷珠单抗组管腔形成较模型组显着较少（P<0.05）;姜黄素条件培养液低（6.25μM）剂量组管腔形成与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素中（25μM）、高（100μM）剂量组管腔形成与模型组比较显着减少（P<0.05）,与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。结论1.ARPE-19细胞姜黄素低（6.25μM）、中（25μM）、高剂量组（100μM）条件培养液可显着抑制HUVEC细胞水平迁移;其中高剂量组条件培养液可显着抑制HUVEC细胞垂直迁移。2.ARPE-19细胞姜黄素高剂量组（100μM）条件培养液可抑制HUVEC细胞侵袭。3.ARPE-19细胞姜黄素中（25μM）、高剂量组（100μM）条件培养液可抑制HUVEC细胞管腔形成。4.姜黄素可在细胞水平抑制血管的生成。
高晔[7]（2020）在《人参皂苷Rg1对糖尿病小鼠视网膜细胞凋亡的保护作用研究》文中提出糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）是糖尿病常见的微血管并发症之一,也是糖尿病视力丧失的主要原因。由于糖尿病视网膜病发病初期临床特征不显着,未得到足够重视,加之发病机制复杂及治疗难度大,如何有效防治DR已经成为医药学界共同关注的重大课题之一。人参作为我国名贵中药材具有的调节神经功能、抗细胞凋亡、改善缺血再灌注损伤等药理作用已经被逐渐应用于心血管疾病的防治中。其中,人参皂苷Rg1作为人参和三七的皂苷类活性成分之一,在抗凋亡、抗氧化和降低血糖等方面具有独特的疗效。此外,人参皂苷Rg1还可通过抑制心肌细胞凋亡来改善糖尿病心肌病。在以往的文献中很少评估人参皂苷Rg1对糖尿病视网膜病的影响研究,因此在前期研究的基础上,本课题旨在探讨人参皂苷Rg1对糖尿病视网膜损伤的保护作用,为研究其确切分子机制及药物开发提供依据。本实验利用自发性2型糖尿病模型db/db小鼠,我们首先检测了小鼠空腹血糖值及血脂水平变化,结果证实,人参皂苷Rg1能显着降低小鼠血糖水平,降低血清中甘油三脂水平,提示我们人参皂苷Rg1在改善糖尿病环境下的高血糖及高血脂方面确有效果。为了探究糖尿病小鼠视网膜的病理性改变,本实验采用ISOCT眼科超显微成像系统及荧光素眼底血管造影技术,通过观察模型组小鼠视网膜中是否有渗漏及微血管瘤等视网膜损伤的发生,以评价人参皂苷Rg1对于视网膜生理结构改变是否具有改善作用。实验结果表明,人参皂苷Rg1给药后能显着降低糖尿病小鼠的视网膜通透性,维持正常的生理结构,改善糖尿病视网膜病变。为进一步观察糖尿病视网膜病变的形态学变化,本实验还利用免疫组化方法及TUNEL实验对视网膜不同组织层进行分析,结果发现,与对照组db/m小鼠相比,模型组小鼠视网膜中出现了视网膜各层间排列紊乱、视网膜细胞变性和数量减少等形态学的改变,并在视网膜的神经节细胞层及内核层出现了明显的视网膜变薄现象,提示这两层存在视网膜细胞凋亡的现象。而经过人参皂苷Rg1治疗后,视网膜的形态学改变及视网膜损伤现象明显改善。最后,本实验利用免疫荧光技术及Western Blot验证凋亡相关蛋白的表达情况,证实视网膜中存在细胞凋亡现象,尤其是在视网膜的神经节细胞层和内核层,人参皂苷Rg1能调节凋亡蛋白的表达水平,减少糖尿病小鼠的视网膜细胞凋亡,从而缓解视网膜损伤。最终研究表明,人参皂苷Rg1能降低糖尿病小鼠的血糖水平及血脂水平,降低视网膜通透性,改善糖尿病视网膜病变的早期病理变化及视网膜损伤,人参皂苷Rg1显示出较强的视网膜保护作用,其药效学基础可能与抑制视网膜神经节细胞层和内核层细胞凋亡相关。
郑德华[8]（2020）在《EPO对AGEs诱导的hPDLSCs细胞周期、凋亡及成骨分化能力的影响及机制研究》文中提出目的:研究促红细胞生成素（EPO）对糖基化终末产物（AGEs）诱导的牙周膜干细胞（PDLSCs）细胞周期、凋亡、氧化应激损伤、成骨分化能力降低的逆转作用,p38 MAPK和Wnt/β-catenin信号通路的调控作用以及促红细胞生成素对糖尿病牙周炎牙周骨吸收的抑制作用。AGEs对PDLSCs成骨分化中差异基因和富集通路的影响。方法;（1）人牙周膜干细胞的分离培养和成骨成脂分化诱导,检测间充质干细胞表面标志物CD44、CD90和CD105的表达及造血干细胞表面标志物CD34和CD45的表达。（2）检测EPO对AGEs诱导的PDLSCs氧化应激损伤（ROS、MDA、SOD）的逆转作用。（3）使用流式细胞仪检测AGEs干预PDLSCs 24h后对细胞周期和细胞凋亡的作用以及 EPO 的逆转作用,Westemblot 检测 Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、p21、p53和CyclinDl蛋白的表达。（4）采用 GeneChip HTArray 2.0（Affymetrix,美国）芯片筛选 AGEs 作用下的成骨诱导组与单纯成骨诱导组PDLSCs的差异基因,并通过聚类分析、差异基因功能分析和信号通路分析等分析方法对AGEs造成的牙周膜干细胞成骨分化能力下降进行初步分析。（5）使用 Realtime PCR和 Westernblot 检测 AGEs 诱导及 EPO 干预 7d 和 14dALP、Runx2、Osterix、OCN的表达,茜素红染色和定量分析矿化结节的形成情况,同时检测p38 MAPK信号通路和Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白β-catenin、CyclinD1、p-p38、p-GSK3β、p38 和 GSK3β 的表达。（6）建立糖尿病牙周炎大鼠模型,并在EPO干预后使用苏木素-伊红染色和免疫组化染色检测大鼠牙周组织中RANKL-OPG、iNOS、TNF-β的表达。结果:（1）使用组织块法培养并纯化PDLSCs,成骨成脂诱导成功,CD44、CD90和CD105均呈阳性表达阳性率均在98%以上。CD45及CD34均呈阴性表达（<1%）。（2）经 AGEs 诱导 24h 后,PDLSCs 内 ROS、MDA 升高,SOD 下降,EPO 能够发挥显着的抗氧化剂作用,降低ROS、升高SOD,显着提高细胞对氧自由基的清除能力,并降低细胞内MDA含量。（3）AGEs能够显着增加处于G1/Go期的PDLSCs细胞数,减少处于G2/M期的细胞数,引发G1/G0期阻滞,抑制PDLSCs细胞增殖。50U/ml、100U/ml和200U/ml EPO组同时加入20μg/ml AGEs干预后,PDLSCs的G1/Go期阻滞发生逆转,处于G1/G0期的PDLSCs细胞数明显减少,随着EPO浓度的升高p53蛋白和p21蛋白表达逐渐下降,CyclinD1蛋白的表达逐渐升高,细胞周期趋于正常。AGEs能够通过改变Bax/Bcl-2关键蛋白比率,激发下游的Caspase级联效应诱导PDLSCs凋亡。EPO能够增强PDLSCs中Bcl-2的蛋白表达,以对抗由AGEs诱导的Bax过表达,同时抑制Bax-Bcl-2下游的Caspase级联效应,减弱由AGEs诱导的凋亡启动（Caspase-9）和凋亡效应（Caspase-3）信号达到减少细胞凋亡的作用。（4）我们筛选了 AGEs+成骨诱导与单纯成骨诱导组间的差异基因并通过聚类分析、差异基因功能分析和信号通路分析等分析方法寻找AGEs对PDLSCs生物学行为调控的潜在靶点,为后续我们对EPO逆转AGEs诱导的牙周膜干细胞成骨分化能力下降的研究提供了基础。（5）AGEs能够明显抑制PDLSCs的成骨分化能力,主要表现为Runx2、OCN和Osterix三者的表达水平在成骨诱导14d后明显低于单纯诱导组,茜素红矿化沉积染色也明显低于单纯诱导组。在加入50U/ml EPO后,我们发现EPO能够部分逆转AGEs造成的PDLSCs的成骨分化能力下降,提高Runx2、OCN和Osterix成骨相关蛋白的的表达,增加矿化沉积。AGEs浓度升高（0μg/ml、1Oμg/ml、50μg/ml）p38磷酸化和GSK3β磷酸化受到阻滞,随着EPO浓度的增加,能够明显升高PDLSCs中β-catenin蛋白和CyclinD1蛋白的表达,增加p38磷酸化和GSK3β磷酸化,对PDLSCs的成骨分化能力起到一定的保护作用。（6）与正常对照组大鼠的牙周组织相比,糖尿病牙周炎大鼠牙周组织中OPG蛋白表达量明显下降,染色程度明显减弱,RANKL阳性表达细胞明显增多,RANKL-OPG比例明显升高,iNOS呈明显阳性,NO浓度明显升高,TGF-β1活性受到抑制,破骨细胞活跃,骨吸收明显。EPO干预后,OPG蛋白表达量明显升高,染色程度明显增强,RANKL阳性表达细胞明显减少,染色程度减弱,iNOS表达明显减弱,NO浓度降低,TGF-β1活性升高。结论:（1）EPO能够逆转AGEs诱导的PDLSCs的细胞周期阻滞和凋亡,其主要机制是抑制AGEs诱导的PDLSCs氧化应激损伤及p53活化途径及下游的凋亡启动和凋亡效应蛋白的表达。（2）EPO能够激活Wnt/β-catenin信号通路促进PDLSCs成骨分化,升高PDLSCs中成骨相关因子OCN、Osterix、Runx2表达,并增加钙盐沉积形成矿化结节;EPO能够部分逆转AGEs造成的PDLSCs成骨分化能力下降,其机制主要是EPO同时调控Wnt/β-catenin信号通路和p38-MAPK信号通路。（3）EPO能够部分逆转高糖和牙周炎症引起的牙槽骨吸收,起到一定的骨稳态维持作用和牙周组织保护作用。
李园媛[9]（2020）在《水蛭提取液对视网膜母细胞瘤的抑制作用及相关分子机制研究》文中认为目的:通过水提法制备水蛭提取液,分别采用凝血酶间接检测提取液中水蛭素含量（根据2015版药典）和高分辨液质联用QE技术检测提取液成分,以确定水蛭提取液的主要成分。通过观察水蛭提取液对人视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma RB）WERI-RB-1细胞活性、周期、凋亡、侵袭作用的影响,验证水蛭提取液抑制WERI-RB-1细胞生长和侵袭的作用。通过水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor VEGF）、缺氧诱导因子-1a（hypoxia inducible factor-1a HIF-1a）、基质金属蛋白酶-9（Matrix metalloproteinase-9 MMP-9）的影响及对磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶（Phosphatidylinositol 3kinase/Protein Kinae B PI3K/AKT）通路的影响,阐明水蛭提取液抑制WERI-RB-1细胞可能的分子机制。通过观察水蛭提取液对人脐静脉内皮细胞（Human Vascular endothelial cells HUVEC）的活性影响及表达VEGF和血管内皮生长因子受体2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2 VEGFR2）的影响,以此来研究水蛭提取液抑制肿瘤血管生成的潜能。方法:1.水蛭提取液的制备和检测:水提法制备水蛭提取液,并利用凝血酶间接测定水蛭素的含量;高分辨液质联用-QE技术分析水蛭的主要成分。2.水蛭提取液对WERI-RB-1细胞活性、周期、凋亡、侵袭作用的影响: 将WERI-RB-1细胞与不同浓度的水蛭提取液（0.02U/ml、0.04U/ml、0.08U/ml、0.16U/ml）共培养0、24、48、72h,经CCK-8筛选最佳药物干预浓度和时间点; 以0.04U/ml和0.08U/ml 2个水蛭提取液浓度、48h为药物干预条件,采用流式细胞仪检测药物对细胞周期的影响; 以2个实验浓度、48h为药物干预条件,采用流式细胞仪检测药物对细胞凋亡的影响; transwell侵袭实验检测2个实验浓度对WERI-RB-1细胞侵袭作用的影响。对照组细胞仅在培养基中培养,无添加药物。3.水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达VEGF的影响及相关分子机制研究: 0.04U/ml和0.08U/ml 2个水蛭提取液浓度干预WERI-RB-1细胞48h,Elisa实验检测水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达VEGF的影响; 以实验组水蛭提取液浓度干预WERI-RB-1细胞48h,RT-PCR检测水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达HIF-1a和MMP-9 m RNA水平的影响; 以实验组水蛭提取液浓度干预WERI-RB-1细胞48h,Western Blot检测蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达HIF-1a、MMP-9、PI3K、人磷酸化AKT蛋白（Human phosphorylated AKT protein p-AKT）蛋白含量的影响。对照组细胞仅在培养基中培养,无添加药物。4.水蛭提取液对HUVEC细胞活性及表达VEFG和VEGFR2的影响: 将HUVEC细胞与不同浓度的水蛭提取液（0.02U/ml、0.04U/ml、0.08U/ml、0.16U/ml）共培养0、24、48、72h,经CCK-8筛选最佳药物干预浓度和时间点; 0.04U/ml和0.08U/ml 2个水蛭提取液浓度干预HUVEC细胞48h后,RT-PCR检测水蛭提取液对HUVEC细胞表达VEGF和VEGFR2 m RNA水平的影响; 以实验组水蛭提取液浓度干预HUVEC细胞48h后,Western Blot检测蛭提取液对HUVEC细胞表达VEGF和VEGFR2蛋白含量的影响。结果:1.水蛭提取液的制备和检测:根据2015版《中华药典》中使用凝血酶测定水蛭提取液中水蛭素的浓度,经过多次反复提取及测定,水蛭提取液中水蛭素浓度保持相对稳定。高分辨液质联用分析仪-QE分析结果表明:水蛭提取液中包含有核苷类、氨基酸类、肌苷类、嘌呤类、维生素类等多种成分。2.水蛭提取液对WERI-RB-1细胞活性、周期、凋亡、侵袭作用的影响: 0.04U/ml、0.08U/ml的水蛭提取液组在48h对RB细胞的抑制率分别是9.70%、9.92%,与对照组比较,差异具有统计学意义（OD值P<0.05）。 实验组药物浓度干预的RB细胞主要阻滞在G2/M期。对照组、0.04U/ml水蛭提取液组、0.08U/ml水蛭提取液组处于G2/M期的阳性细胞率（%）分别为3.00±2.32、12.59±5.36、14.79±4.12（对照组与水蛭提取液组比较,P<0.01）。 实验组水蛭提取液浓度均可诱导RB细胞凋亡率上调,以上3组细胞凋亡率依次分别为4.64±2.56、37.91±3.44、33.05±2.25（与对照组比较,P<0.01）。 实验组Transwell下室中移行的、每高倍视野细胞数目均较对照组显着减少,3组检测结果（OD值）依次分别为1.21±4.36、0.44±2.08、0.53±3.42（与对照组比较,P<0.01）。3.水蛭提取液对WERI-RB-1细胞表达VEGF的影响及相关分子机制研究: Elisa实验结果显示:与对照组比较,0.04U/ml和0.08U/ml2个水蛭提取液浓度培养基上清中VEGF的表达降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。 RT-PCR结果显示:与对照组比较,HIF-1a和MMP-9 m RNA水平降低,差异具有统计学意义（P<0.05）; Western Blot结果显示:与对照组比较,HIF-1a、MMP-9、PI3K、p-AKT的蛋白含量降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。4.水蛭提取液对HUVEC细胞活性及表达VEFG和VEGFR2的影响: 0.04U/ml和0.08U/ml水蛭提取液干预WERI-RB-1细胞48h后,细胞的抑制率分别为12.96±1.59、14.81±2.17,与对照组比较差异具有统计学意义（OD值P<0.05）。 RT-PCR结果显示:与对照组比较,VEGF、VEGFR2的m RNA水平降低,差异具有统计学意义（P<0.05）; Western Blot结果显示:与对照组比较,VEGF、VEGFR2的蛋白含量降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:1.水提法提取的水蛭提取液中水蛭素含量相对稳定。水蛭提取液中包含有核苷类、氨基酸类、肌苷类、嘌呤类、维生素类等多种成分。2.水蛭提取液通过抑制WERI-RB-1活性、引起周期阻滞、诱导细胞凋亡、抑制细胞侵袭等作用对视网膜母细胞瘤WERI-RB-1细胞发挥抑制作用。3.水蛭提取液通过VEGF/PI3K/AKT通路抑制WERI-RB-1细胞,同时抑制WERI-RB-1细胞中HIF-1a、MMP-9活性。4.水蛭提取液可抑制HUVEC细胞活性,抑制HUVEC细胞表达VEGF、VEGFR2蛋白活性。综上所述,在体外实验中,水蛭提取液在一定程度上可能通过VEGF/PI3K/AKT通路和HIF-1a、MMP-9因子影响WERI-RB-1细胞周期分布、凋亡、侵袭作用,从而发挥抑制RB的作用。同时发现水蛭提取液可能通过抑制VEGF、VEGFR2表达抑制脐静脉内皮细胞。我们的研究结果表明:水蛭提取液对RB细胞具有抑制作用,同时可能对RB血管也有抑制作用。从中医理论上进一步验证了其活血化瘀、其破血消瘕的作用。以上研究结果为开发新型抗肿瘤制剂水蛭提供了一定的临床前研究资料。
李倩[10]（2019）在《高糖诱导人视网膜内皮细胞炎性凋亡机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy,DR）是目前糖尿病最常见的微血管并发症之一,视网膜内皮细胞（Retinal endothelial cells,RECs）在视网膜中发挥许多重要功能,是构成血-视网膜屏障的重要组成部分。在DR早期,RECs功能障碍,促进了DR的进展。研究发现,RECs的炎性凋亡改变在疾病发生发展过程中扮演了重要角色。细胞在免疫炎性反应的刺激下,会发生包括形态学改变在内的一系列变化,引起白细胞介素IL-1,IL-6,IL-8及TNF等炎性因子的表达,通过激活相应的信号传导通路来发挥生物学效应,随着疾病严重程度加重,视网膜内皮细胞炎性反应加重,最终出现细胞凋亡现象。其中p53信号传导通路和NF-κB信号传导通路是诱发细胞凋亡和炎症反应的两条最重要的途径。P53是机体中重要的抑癌基因之一,其可以导致细胞周期停滞、诱导凋亡,在抑制机体多种肿瘤的发生和组织损伤中发挥着重要的作用。P53的蛋白产物可以通过与细胞凋亡相关的靶基因P21、MDM2、Bax相互作用而发挥出潜在的功能,p53能诱导促凋亡基因如Bax、PUMA的表达,亦可以抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达,直接或间接地导致线粒体膜的去极化,参与细胞凋亡过程。p53亦可以转移到线粒体,导致线粒体膜的去极化,释放促凋亡因子,诱导细胞凋亡的发生。P53基因在DNA修复、阻滞细胞周期、抑制血管生成以及促进细胞非程序性凋亡过程中均扮演了重要的角色。我们的前期实验结果证实,高糖培养的视网膜内皮细胞中促凋亡蛋白Bax及Cl-caspase-3表达升高,而抑凋亡蛋白Bcl-2表达出现下降趋势,随着葡萄糖浓度的进一步升高,细胞凋亡趋势增加,此变化是否受p53诱导调控?我们将通过进一步实验加以证实。目前诸多研究已经证实p53与糖尿病及其并发症的发生与发展具有重要的关联性,在这一过程中,P53是否与一些信号通路之间协同发挥作用还是单独起到作用需进一步研究加以证实。NF-κB是一种多向功能调节的转录因子,其主要功能是调控多种基因的表达,包括炎性反应基因、病毒相关基因和原癌基因等的转录表达。NF-κB能被多种因子所激活,引起炎性因子表达的普遍升高,诸如IL-8、IL-6及TNF-α等。我们的前期实验已经证实,高糖诱导的视网膜内皮细胞中IL-1、IL-6、IL-8以及肿瘤坏死因子TNF-α的表达随葡萄糖浓度的升高而增加,是否意味着通过激活NF-κB而发挥转录调控作用,尚有待于进一步加以证实。p53是否和NF-κB信号通路在控制相关疾病炎性和细胞凋亡过程中具有协同作用引起了相关学者的兴趣。有研究结果表明,两者在诸多癌症细胞的发生发展过程中表现出相互拮抗,但是在糖尿病相关疾病的研究中表现出协同作用。目前在糖尿病性视网膜病变细胞凋亡机制的研究中二者关系如何未见类似的报道。基于此,本研究采用高浓度葡萄糖作为致炎性因子,模拟视网膜病变的发生与发展过程,对RECs进行形态学观察、凋亡率检测,并检测细胞内炎性因子和凋亡相关蛋白的表达,确定细胞炎性效应及细胞凋亡的基础,在第二部分旨在探讨视网膜内皮细胞凋亡发生机制,了解p53信号传导通路与细胞经典回路NF-κB在其过程中的作用,以期发现二者之间的关系。目的探究高糖诱导下人视网膜内皮细胞的炎性凋亡效应,研究p53和NF-κB细胞通路蛋白在人视网膜内皮细胞凋亡中的表达机制和相互关系。材料与方法第一部分:检测高糖诱导下人视网膜内皮细胞的炎性凋亡效应将培养对数生长期人视网膜内皮细胞分为三组:实验组为高糖浓度组（HG,30mmol/L）,另设正常对照组（Control,5.5mmol/L）、以及以甘露醇（Mannitol）作为高渗对照组（Mannitol,24.4mmol/L）。部分实验根据研究内容不同,设置不同浓度葡萄糖组（15mmol/L、30mmol/L、60mmol/L、90mmol/L）。于6孔板内加入上述不同成分培养基培养后进行检测。具体检测内容如下:HE染色检测各组细胞形态学变化;透射电镜检测各组细胞细胞器变化;LDH法检测细胞膜损伤;DNA倍体法检测细胞周期;流式细胞仪检测各组细胞凋亡;Western-blot法检测细胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2及Cl-caspase-3浓度表达;ELISA法检测白细胞介素IL-1、IL-6、IL-8及肿瘤坏死因子TNF-α浓度表达。进行统计学分析。第二部分:检测高糖诱导人视网膜内皮细胞炎性凋亡机制实验细胞同第一部分,对细胞进行如下分组:1、高糖浓度组（HG,30mmol/L）:细胞在30mmol/L葡萄糖浓度培养基培养12小时;2、高糖+p53抑制剂组（HG+pifithrin-α）:细胞培养基内加入10μmol/Lpifithrin-α预处理1小时,然后在30 mmol/L葡萄糖浓度培养基培养12小时;3、正常对照组（Control,5.5mmol/L）:细胞在正常葡萄糖浓度培养基中继续培养12小时;4、p53抑制剂对照组（pifithrin-α）:细胞培养基内加入10μmol/Lpifithrin-α预处理1小时,然后在正常葡萄糖浓度培养基中继续培养12小时。具体检测项目如下:透射电镜检查细胞形态学变化;Western-blot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Cl-caspase-3蛋白浓度;Western-blot法检测p53、p-p53、p65、p-p65、IκB、p-IκB蛋白浓度;免疫荧光法检测P53和NF-κB p65蛋白在视网膜内皮细胞的免疫荧光共定位及表达阳性率;q-PCR法检测p53、p65蛋白的mRNA转录水平。进行统计学分析。结果第一部分:检测高糖诱导下人视网膜内皮细胞的炎性凋亡效应1、HE染色分析:培养细胞至48小时可以在光学显微镜下见到显着形态学差异,正常对照组细胞呈现正常生长状态,细胞形状均一,有丝分裂活跃,数量较多,细胞间融合较好。随着高浓度葡萄糖溶液培养时间延长,可以观察到视网膜血管内皮细胞整体密度较低,细胞周围出现空隙,细胞内逐渐出现大量空泡和颗粒,细胞形态学发生显着的改变。2、透射电镜分析:在高糖环境中培养12小时后的RECs细胞,细胞膜出现明显凸起现象,细胞内线粒体及高尔基体肿大,线粒体体积增大,视网膜内皮细胞周围可以明显的观察到脂质沉淀,细胞内出现了脂质沉淀累积和明显的空泡现象,同时伴随着大量的初级溶酶体、次级溶酶体甚至是吞噬体出现。3、LDH检测:高糖培养后细胞LDH漏出率显着增加,提示细胞膜损伤,上述改变呈现出浓度依赖性和时间依赖性。4、DNA倍体法检测细胞周期:当高浓度葡萄糖溶液充分作用后,细胞周期的阻滞效应明显,主要停留在G2期,并可见DNA片段形成显着增多,大量凋亡小体形成。5、流式细胞术检测细胞凋亡:高糖诱导视网膜内皮细胞凋亡效应显着,正常细胞比例显着降低,细胞死亡以凋亡为主,凋亡细胞比例显着增多。6、Western-blot检测:高糖溶液培养的RECs,细胞内促凋亡蛋白Bax及caspase-3蛋白的表达显着上升,抑凋亡蛋白Bcl-2下降,结果有显着差异。7、ELISA检测结果:随着葡萄糖浓度的提升,白细胞介素IL-1、IL-6、IL-8以及肿瘤坏死因子TNF-α的表达均有不同程度的提升,且差异具有统计学意义。第二部分:检测高糖诱导人视网膜内皮细胞炎性凋亡机制1、透射电镜:高糖培养下的视网膜内皮细胞出现明显的凋亡形态学变化,表现为线粒体中的空泡化,染色质浓缩和内质网的脱颗粒,而在高糖+抑制剂组上述变化显着减轻;2、Western-blot检测凋亡相关蛋白表达:应用pifithrin-α抑制p53蛋白表达后,促凋亡蛋白Bax、Cl-caspase-3表达减少,凋亡抑制蛋白Bcl-2表达升高;3、Western-blot检测p53和NF-κB通路蛋白:在高糖培养下的RECs细胞,p53、p-p53、p65、p-p65、IκB、p-IκB表达量均有不同程度升高,pifithrin-α抑制p53蛋白表达后,p53表达量显着降低,p-p53/p53比值显着升高,且NF-κB通路蛋白p65、IκB表达量显着降低,p-p65/p65和p-IκB/IκB比值显着降低。4、免疫荧光检测p53和NF-κB p65蛋白表达共定位:高糖组,p53、p65荧光信号呈现强阳性,较正常对照组显着增强,抑制p53蛋白后高糖培养下的RECs细胞p53、p65荧光信号显着降低,以p53蛋白荧光信号降低明显,在细胞核及细胞质内仍可观察到p65荧光信号。5、q-PCR检测p53、p65 mRNA转录水平:高糖组p53、p65的mRNA表达显着升高;抑制p53蛋白后高糖培养下的RECs细胞p53和p65的mRNA表达水平明显降低。结论高浓度葡萄糖可以对视网膜内皮细胞造成实质性损伤,早期即导致其形态学改变;高浓度葡萄糖可激活视网膜内皮细胞凋亡通路和炎症反应通路,导致视网膜内皮细胞凋亡率上升、炎症因子表达增加。P53信号通路参与高糖培养的视网膜内皮细胞的凋亡过程;高糖环境促进p53蛋白以及NF-κB通路活性,使细胞发生炎性反应及细胞凋亡产生;p53抑制剂可抑制p53信号通路和NF-κB信号通路转导,二者在高糖诱导的视网膜内皮细胞炎性凋亡过程中可能起到一定协同作用。
二、缺氧对牛视网膜色素上皮细胞增生和凋亡基因bcl-2表达的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、缺氧对牛视网膜色素上皮细胞增生和凋亡基因bcl-2表达的影响（论文提纲范文）
（1）干细胞外泌体miR-141对视网膜氧化应激损伤的保护作用及机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略表 |
| 第1章 绪论 |
| 1 年龄相关性黄斑变性 |
| 2 氧化应激中的Keap1/Nrf2通路 |
| 3 microRNA |
| 4 骨髓间充质干细胞 |
| 5 外泌体分子功能及其在眼科疾病中的研究进展 |
| 5.1 外泌体的由来 |
| 5.2 外泌体的功能 |
| 5.3 外泌体与眼科疾病 |
| 5.4 外泌体作为眼科疾病的生物标志物 |
| 5.5 外泌体作为药物载体 |
| 6 总结 |
| 第2章 骨髓间充质干细胞外泌体的提取与鉴定 |
| 概述 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 骨髓间充质干细胞外泌体对RPE细胞氧化应激损伤的保护作用 |
| 概述 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 miR-141/Keap1/Nrf2通路在RPE细胞氧化应激反应中的分子机制 |
| 概述 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 骨髓间充质干细胞外泌体miR-141对RPE细胞氧化应激损伤的保护作用 |
| 概述 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.2 研究方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第6 章 骨髓间充质干细胞外泌体对急性视网膜光损伤的保护作用 |
| 概述 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.3 结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第7章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）piRNA-1245/PIWIL2通过JAK2/STAT3/VEGF通路调控视网膜新生血管的生成（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:piRNAs在小鼠视网膜新生血管病变模型中的表达研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 构建氧诱导小鼠视网膜病变模型 |
| 2.2.2 视网膜制备及荧光染色 |
| 2.2.3 石蜡切片HE染色 |
| 2.2.4 RNA提取及测序准备工作 |
| 2.2.5 结果分析 |
| 2.2.6 PCR验证 |
| 2.2.7 统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 视网膜新生血管的评价 |
| 3.2 血管内皮细胞的定量分析 |
| 3.3 差异表达基因筛选结果 |
| 3.4 差异表达基因验证结果 |
| 3.5 KO分析 |
| 3.6 蛋白互相作用网络分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:piRNA-1245调控低氧处理人视网膜内皮细胞的生物学行为研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验细胞株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养与传代 |
| 2.2.2 细胞冻存 |
| 2.2.3 细胞计数 |
| 2.2.4 细胞分组 |
| 2.2.5 低氧诱导细胞实验 |
| 2.2.6 细胞转染 |
| 2.2.7 细胞划痕实验 |
| 2.2.8 细胞流式实验 |
| 2.2.9 细胞成管实验 |
| 2.2.10 细胞EdU实验 |
| 2.2.11 细胞总RNA的提取和qRT-PCR |
| 2.2.12 细胞总蛋白提取及蛋白变性 |
| 2.2.13 蛋白免疫印迹实验 |
| 2.2.14 细胞Transwell实验 |
| 2.2.15 统计方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 细胞转染情况 |
| 3.2 piRNA-1245/PIWIL2和VEGF在低氧组HREC细胞中高表达 |
| 3.3 敲减piRNA-1245能够抑制低氧HRECs的凋亡 |
| 3.4 敲减piRNA-1245能够减弱低氧HRECs的迁移及成管能力 |
| 3.5 敲减piRNA-1245能够减弱低氧HRECs的增殖能力 |
| 3.6 piRNA-1245激活JAK2/STAT3通路调控VEGF的表达 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:piRNA-1245通过JAK2/STAT3/VEGF调控OIR小鼠视网膜新生血管的生成 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂和仪器 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 实验动物分组 |
| 2.2.2 小鼠玻璃体腔注射慢病毒 |
| 2.2.3 视网膜组织总蛋白提取及蛋白变性 |
| 2.2.4 蛋白免疫印迹实验 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 piRNA-1245和PIWIL2和VEGF在OIR小鼠视网膜组织中高表达 |
| 3.2 玻璃体腔注射piRNA-1245慢病毒能够抑制视网膜新生血管的生成 |
| 3.3 玻璃体腔注射piRNA-1245慢病毒能够减轻视网膜组织的炎症反应 |
| 3.4 piRNA-1245激活JAK2/STAT3通路调控VEGF的表达调控视网膜新生血管的生成 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 非编码piRNA在视网膜新生血管病变中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）青蒿琥酯对糖尿病大鼠视网膜组织自噬的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:青蒿琥酯对糖尿病大鼠视网膜组织的影响 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 饲养条件 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 实验试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 糖尿病大鼠模型建立及治疗 |
| 2.2.2 大鼠眼球玻璃体腔注射 |
| 2.2.3 大鼠眼球组织编号、固定、保存 |
| 2.2.4 HE染色 |
| 2.2.5 Evans Blue |
| 2.2.6 Lectin染色 |
| 2.2.7 Iba-1免疫组织化学 |
| 2.2.8 大鼠视网膜组织全蛋白提取及定量 |
| 2.2.9 大鼠视网膜组织MCP-1的ELISA检测 |
| 2.2.10 大鼠视网膜组织IL-1β和IL-6的RT-qPCR |
| 2.2.11 DHE染色 |
| 2.3 统计学处理 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 青蒿琥酯对糖尿病大鼠视网膜组织病理学的影响 |
| 3.1.1 青蒿琥酯对糖尿病大鼠视网膜组织层间结构的作用 |
| 3.1.2 青蒿琥酯对糖尿病大鼠血视网膜屏障的作用 |
| 3.2 青蒿琥酯对糖尿病大鼠视网膜组织炎性反应的影响 |
| 3.2.1 青蒿琥酯对糖尿病大鼠视网膜组织的白细胞粘附的作用 |
| 3.2.2 青蒿琥酯对糖尿病大鼠视网膜组织小胶质细胞活化的作用 |
| 3.2.3 青蒿琥酯对糖尿病大鼠视网膜组织IL-1β与IL-6 mRNA及炎性因子MCP-1表达的影响 |
| 3.3 青蒿琥酯对糖尿病大鼠视网膜的氧化应激的影响 |
| 3.3.1 青蒿琥酯对糖尿病大鼠视网膜组织ROS水平的作用 |
| 4 讨论 |
| 第二部分:青蒿琥酯对糖尿病大鼠视网膜组织自噬及AMPK/SIRT1信号通路的影响 |
| 5 前言 |
| 6 实验材料及方法 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 实验仪器 |
| 6.1.2 实验试剂 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 蛋白质免疫印迹(Western blot) |
| 6.3 统计学处理 |
| 7 实验结果 |
| 7.1 青蒿琥酯对糖尿病大鼠视网膜组织自噬水平的影响 |
| 7.1.1 各组大鼠视网膜自噬相关蛋白Beclin-1、LC3II/I和P62表达 |
| 7.2 青蒿琥酯对糖尿病大鼠视网膜组织AMPK/SIRT1通路的影响 |
| 7.2.1 青蒿琥酯对糖尿病大鼠视网膜组织AMPK表达的作用 |
| 7.2.2 青蒿琥酯改善糖尿病引起的视网膜SIRT1磷酸化抑制 |
| 8 讨论 |
| 第三部分:青蒿琥酯对高糖诱导的人视网膜色素上皮细胞的影响 |
| 9 前言 |
| 10 实验材料与方法 |
| 10.1 实验材料 |
| 10.1.1 细胞株 |
| 10.2 实验方法 |
| 10.2.1 细胞培养 |
| 10.2.2 实验分组及处理 |
| 10.2.3 CCK8 实验 |
| 10.2.4 MDA实验 |
| 10.2.5 SOD实验 |
| 10.2.6 ROS荧光染色 |
| 10.2.7 MCP-1、IL-1β、IL-6的ELISA检测 |
| 10.2.8 细胞凋亡检测 |
| 10.2.9 线粒体膜电位检测 |
| 10.2.10 MDC染色 |
| 10.2.11 ARPE-19细胞透射电镜 |
| 10.2.12 ARPE-19细胞SIRT1的RT-qPCR |
| 10.2.13 Western blot |
| 10.3 数据分析 |
| 11 实验结果 |
| 11.1 青蒿琥酯对高糖作用下的视网膜色素上皮细胞增殖活力、细胞凋亡、线粒体膜电位的影响 |
| 11.1.1 不同浓度梯度葡萄糖对细胞增殖活力的影响 |
| 11.1.2 不同浓度葡萄糖对ARPE-19细胞自噬的影响 |
| 11.1.3 不同浓度青蒿琥酯对细胞增殖活力的影响 |
| 11.1.4 青蒿琥酯对高糖作用下ARPE-19增殖活力的作用 |
| 11.1.5 青蒿琥酯对高糖作用下的ARPE-19细胞凋亡的作用 |
| 11.1.6 青蒿琥酯对高糖作用下的ARPE-19线粒体膜电位的影响 |
| 11.2 青蒿琥酯对高糖作用下ARPE-19氧化应激的影响 |
| 11.2.1 青蒿琥酯对高糖作用ARPE-19细胞MDA水平的作用 |
| 11.2.2 青蒿琥酯对高糖作用下ARPE-19细胞SOD的作用 |
| 11.2.3 青蒿琥酯对高糖作用下ARPE-19ROS的影响 |
| 11.3 青蒿琥酯对高糖作用下的ARPE-19炎性反应的影响 |
| 11.3.1 青蒿琥酯对高糖作用下ARPE-19炎性因子IL-1β、IL-6、MCP-1水平的作用 |
| 11.4 青蒿琥酯对高糖作用下的ARPE-19细胞自噬的影响 |
| 11.4.1 青蒿琥酯对高糖作用下的ARPE-19自噬的作用 |
| 11.5 青蒿琥酯对高糖作用下ARPE-19细胞AMPK/SIRT1通路的影响 |
| 11.6 si-SIRT1对于ART在高糖作用下ARPE-19发挥作用的影响 |
| 11.6.1 SIRT1的siRNA构建及转染效果 |
| 11.6.2 SIRT1对ART在HG诱导下的ARPE19细胞增殖活力的影响 |
| 11.6.3 SIRT1对ART在HG诱导下的ARPE19细胞MDA、SOD的影响 |
| 11.6.4 SIRT1对ART在HG诱导下的ARPE-19细胞MCP-1、IL-1β、IL-6的影响 |
| 11.6.5 SIRT1对ART在HG诱导下的ARPE-19细胞自噬相关蛋白的影响 |
| 11.6.6 SIRT1对ART在HG诱导下的ARPE19细胞AMPK相关蛋白的影响 |
| 12 讨论 |
| 结论 |
| 创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 自噬在糖尿病视网膜病变中的研究现状 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）miR-130a通过TNF-α/SOD1信号通路抑制糖尿病视网膜病变的作用机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 miR-130a通过调控TNF-α/SOD1缓解高糖诱导的视网膜色素上皮细胞死亡 |
| 1 前言 |
| 2 材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第二章 miR-130a通过调控TNF-α/SOD1对小鼠糖尿病视网膜病变的影响 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三章 miR-130a在DR患者血清中的表达及对DR病变生物学行为的影响 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料 |
| 3 实验方法 |
| 4 结果 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 总结与展望 |
| 综述 糖尿病视网膜病变对视网膜色素上皮(RPE)细胞功能影响的研究进展 |
| 引言 |
| 一、糖尿病视网膜病变(DR)对RPE细胞的屏障功能的影响 |
| 二、糖尿病视网膜病变(DR)对RPE细胞的分泌功能的影响 |
| 三、总结、展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）决明子水溶性多糖通过调控PI3K/Akt和TLR4/NF-κB信号通路对MNU诱导大鼠视网膜色素变性保护作用的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一部分 决明子水溶性多糖对 MNU 诱导大鼠视网膜色素变性抗凋亡作用的研究 |
| (一)前言 |
| (二)材料与方法 |
| (三)结果 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| (六)参考文献 |
| 第二部分 决明子水溶性多糖对MNU诱导大鼠视网膜色素变性抗炎作用的研究 |
| (一)前言 |
| (二)材料与方法 |
| (三)结果 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| (六)参考文献 |
| 第三部分 决明子水溶性多糖对 MNU 诱导大鼠视网膜色素变性保护机制的研究 |
| (一)前言 |
| (二)材料与方法 |
| (三)结果 |
| (四)讨论 |
| (五)结论 |
| (六)参考文献 |
| 综述 视网膜色素变性的诊疗进展和研究现状 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表文章情况 |
| 致谢 |
（6）姜黄素抑制实验性脉络膜新生血管的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 532nm倍频激光诱导BN大鼠脉络膜新生血管模型的建立 |
| 1. 实验动物、仪器、耗材与试剂 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器及耗材 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 532nm倍频激光建立CNV模型 |
| 2.3 眼底照相、FFA及ICGA观察CNV变化 |
| 2.4 制备病理学标本 |
| 2.5 HE染色 |
| 2.6 免疫组织化学检测 |
| 3. 图像分析与统计学方法 |
| 3.1 眼底照、FFA及ICGA图像 |
| 3.2 HE染色图像 |
| 3.3 免疫组化图像 |
| 3.4 统计学方法 |
| 4. 结果 |
| 4.1 眼底照、FFA与ICGA结果 |
| 4.2 HE染色结果 |
| 4.3 CD105免疫组化结果 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 CNV模型建立的方法 |
| 5.2 532nm倍频激光诱导BN大鼠建立实验性CNV模型的机制 |
| 5.3 532nm倍频激光诱导BN大鼠CNV模型的评价 |
| 6. 结论 |
| 第二章 姜黄素通过AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路抑制BN大鼠CNV的实验研究 |
| 1. 实验动物、仪器、耗材与试剂 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器与耗材 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.0 实验药物配制 |
| 2.1 实验分组及给药 |
| 2.2 532nm倍频激光建立实验性CNV模型 |
| 2.3 眼底照相、FFA及ICGA观察CNV变化 |
| 2.4 病理学标本制备 |
| 2.5 HE染色 |
| 2.6 免疫组织化学检测 |
| 2.7 RT-qPCR检测mRNA表达 |
| 2.8 Westernblot检测蛋白表达 |
| 3. 图像分析与统计学方法 |
| 3.1 眼底照、FFA与ICGA图像 |
| 3.2 HE染色图像 |
| 3.3 免疫组化图像 |
| 3.4 RT-qPCR结果分析 |
| 3.5 Westernblot结果分析 |
| 3.6 统计学方法 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 眼底照、FFA与ICGA结果 |
| 4.2 HE染色结果 |
| 4.3 免疫组化结果 |
| 4.4 RT-qPCR结果 |
| 4.5 Westernblot结果 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 新生血管与中药单体 |
| 5.2 姜黄与姜黄素 |
| 5.3 姜黄素与眼部新生血管 |
| 5.4 CNV的中医认识 |
| 5.5 姜黄素抑制CNV的机制 |
| 6. 结论 |
| 第三章 姜黄素对CoCl_2诱导的ARPE-19细胞缺氧模型中AKT、HIF-1α和VEGF因子的影响 |
| 1. 实验细胞、试剂、药物及仪器 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验药物及溶液的配制 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 ARPE-19细胞复苏、传代与冻存 |
| 2.2 造模试剂CoCl_2、实验药物姜黄素及阳性对照药雷珠单抗浓度的筛选 |
| 2.3 实验分组与干预 |
| 2.4 CCK-8法检测实验各组ARPE-19细胞的活性 |
| 2.5 RT-qPCR检测 |
| 2.6 Westernblot检测 |
| 3. 结果分析与统计学方法 |
| 3.1 CCK-8检测细胞活性结果分析 |
| 3.2 RT-qPCR结果分析 |
| 3.3 Westernblot结果分析 |
| 3.4 统计学方法 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 正常ARPE-19细胞形态 |
| 4.2 CoCl_2对ARPE-19细胞活性的影响 |
| 4.3 姜黄素对ARPE-19细胞活性的影响 |
| 4.4 雷珠单抗对CoCl_2诱导的ARPE-19细胞活性的影响 |
| 4.5 RT-qPCR结果 |
| 4.6 Westernblot结果 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 细胞缺氧模型的建立 |
| 5.2 CoCl_2诱导ARPE-19细胞缺氧模型的机制 |
| 5.3 姜黄素对CoCl_2诱导ARPE-19细胞缺氧的保护作用 |
| 6. 结论 |
| 第四章 非接触共培养体系观察ARPE-19细胞姜黄素的条件培养液对HUVEC细胞形态学的影响 |
| 1. 实验细胞、药物、试剂及仪器 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验试剂的配制 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 HUVEC细胞株复苏培养、传代与冻存 |
| 2.2 CCK-8检测 |
| 2.3 划痕实验检测细胞水平迁移 |
| 2.4 Transwell小室法检测细胞垂直迁移 |
| 2.5 Transwell小室法检测细胞侵袭 |
| 2.6 Matrigel基质胶法检测细胞管腔形成 |
| 3. 统计学方法 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 正常HUVEC细胞形态 |
| 4.2 CCK-8结果 |
| 4.3 划痕实验细胞水平迁移结果 |
| 4.4 Transwell小室实验细胞垂直迁移结果 |
| 4.5 Transwell小室实验细胞侵袭结果 |
| 4.6 Matrigel基质胶实验细胞管腔形成结果 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 细胞迁移 |
| 5.2 细胞侵袭 |
| 5.3 细胞管腔形成 |
| 6. 结论 |
| 参考文献 |
| 创新性 |
| 不足与展望 |
| 综述一 脉络膜新生血管的发病机制及中西医治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 姜黄素在眼科疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生期间学术表现 |
| 致谢 |
| 附: 查新报告 |
（7）人参皂苷Rg1对糖尿病小鼠视网膜细胞凋亡的保护作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 糖尿病视网膜病概述 |
| 1.2.1 糖尿病视网膜病的诱导因素 |
| 1.2.2 糖尿病视网膜病的分类 |
| 1.2.3 糖尿病视网膜病的发病机制 |
| 1.3 人参皂苷Rg1 概述 |
| 1.3.1 人参皂苷Rg1 的来源 |
| 1.3.2 人参皂苷Rg1 的主要药理作用 |
| 1.4 课题来源及研究意义 |
| 1.5 研究内容及方法 |
| 2 人参皂苷Rg1对db/db小鼠体重、血糖及血脂水平的影响研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 材料、试剂及仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 人参皂苷Rg1对db/db小鼠体重及血糖水平的影响 |
| 2.3.2 人参皂苷Rg1对db/db小鼠血脂水平的影响 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 人参皂苷Rg1对db/db小鼠视网膜功能及形态学的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 材料、试剂及仪器 |
| 3.2.2 实验方法 |
| 3.3 结果分析 |
| 3.3.1 人参皂苷Rg1 对视网膜血管通透性及微血管瘤的影响 |
| 3.3.2 人参皂苷Rg1对db/db小鼠视网膜组织学改变的影响 |
| 3.3.3 人参皂苷Rg1对db/db小鼠视网膜厚度变化的影响 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 人参皂苷Rg1对db/db小鼠视网膜凋亡相关蛋白表达水平的调节作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 材料、试剂及仪器 |
| 4.2.2 实验方法 |
| 4.3 结果分析 |
| 4.3.1 人参皂苷Rg1 对视网膜组织中Bax、Bcl-2 表达水平的影响 |
| 4.3.2 人参皂苷Rg1 对视网膜组织中凋亡蛋白caspase-3 表达水平的影响 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 人参皂苷Rg1对db/db小鼠视网膜GCL层及INL层细胞凋亡的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 材料、试剂及仪器 |
| 5.2.2 实验方法 |
| 5.3 结果分析 |
| 5.3.1 TUNEL检测视网膜GCL层及INL层细胞凋亡情况 |
| 5.3.2 免疫荧光技术验证人参皂苷Rg1 对视网膜GCL层及INL层细胞凋亡的影响 |
| 5.4 本章小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（8）EPO对AGEs诱导的hPDLSCs细胞周期、凋亡及成骨分化能力的影响及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 人牙周膜干细胞的体外培养和鉴定 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 EPO对AGEs诱导PDLSCs细胞周期和凋亡的影响及作用机制 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 AGEs调控PDLSCs成骨分化中差异基因的表达及富集通路的分析 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 AGEs诱导PDLSCs成骨分化能力下降和EPO的拮抗作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第五部分 EPO对糖尿病牙周炎大鼠牙槽骨吸收的影响 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表的学术论文目录 |
| 附件 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（9）水蛭提取液对视网膜母细胞瘤的抑制作用及相关分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 水蛭提取液的制备和主要成分分析的初步研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.1.3 实验仪器 |
| 1.1.4 试剂配制 |
| 1.2 实验方法与步骤 |
| 1.2.1 水蛭提取液的制备和含量检测 |
| 1.2.2 高分辨液质联用-QE分析水蛭提取液成分 |
| 1.3 结果 |
| 1.3.1 水蛭提取液的制备和水蛭素含量测定 |
| 1.3.2 高分辨液质联用-QE分析水蛭提取液主要成 |
| 1.4 讨论 |
| 1.4.1 水蛭提取液的制备和检测的初步研究 |
| 1.4.2 高分辨液质联用-QE分析水蛭提取液成分 |
| 第二部分 水蛭提取液对WERI-Rb-1 细胞活性、周期、凋亡、侵袭的影响 |
| 2.1 实验细胞、试剂及配制、仪器设备和耗材 |
| 2.1.1 实验细胞 |
| 2.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 2.1.3 主要实验设备仪器 |
| 2.1.4 试剂配制 |
| 2.2 细胞培养、传代和冻存 |
| 2.2.1 细胞培养和传代 |
| 2.2.2 细胞冻存 |
| 2.3 实验方法与步骤 |
| 2.3.1 CCK-8法检测水蛭提取液对细胞的活性影响 |
| 2.3.2 水蛭提取液对 WERI-RB-1 细胞周期的影响 |
| 2.3.3 水蛭提取液对 WERI-RB-1 细胞凋亡的影响 |
| 2.3.4 水蛭提取液对 WERI-RB-1 侵袭能力的影响 |
| 2.4 统计分析 |
| 2.5 结果 |
| 2.5.1 不同浓度药物对WER-Rb-1细胞活性的影响 |
| 2.5.2 流式细胞技术检测药物对细胞周期的影响 |
| 2.5.3 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞凋亡的影响 |
| 2.5.4 transwell 实验检测水蛭提取液对 WER-Rb-1 细胞侵袭能力的影响 |
| 2.6 讨论 |
| 2.6.1 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞活性的影响 |
| 2.6.2 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞周期的影响 |
| 2.6.3 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞凋亡影响 |
| 2.6.4 细胞凋亡与增殖 |
| 2.6.5 水蛭提取液对WER-Rb-1细胞侵袭能力的影响 |
| 第三部分 水蛭提取液对WER-Rb-1 细胞表达VEGF的影响及相关分子机制研究 |
| 3.1 实验细胞、试剂、耗材和仪器设备 |
| 3.1.1 实验细胞 |
| 3.1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 3.1.3 主要实验设备仪器 |
| 3.2 实验方法与步骤 |
| 3.2.1 Elisa 实验检测水蛭提取液对 WERI-RB-1 细胞表达 VEGF 的影响 |
| 3.2.2 HIF-1a、MMP-9、VEGFR2 的实时定量RT-PCR检测 |
| 3.2.3 Western Blot法检测HIF-1a、MMP-9、PI3K、p-AKT蛋白表达 |
| 3.3 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Elisa 检测培养基上清中 VEGF 蛋白的表达 |
| 3.4.2 HIF-1a基因表达 |
| 3.4.3 MMP-9基因表达 |
| 3.4.4 Western Blot 检测各组 PI3K 和 p-AKT 蛋白的表达 |
| 3.4.5 Western Blot 检测各组 HIF-1a 和 MMP-9 蛋白的表达 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 VEGF、HIF-1a和 MMP-9 在肿瘤生成中的作用 |
| 3.5.2 PI3K/AKT信号通路在肿瘤疾病中的作用 |
| 3.5.3 水蛭素通过VEGF/PI3K/AKT通路及HIF-1a、MMP-9 因子抑制RB细胞 |
| 第四部分 水蛭提取液对HUVEC细胞活性及表达VEFG和VEGFR2的影响 |
| 4.1 实验细胞、试剂和仪器设备 |
| 4.1.1 实验细胞 |
| 4.1.2 主要实验试剂 |
| 4.1.3 主要实验设备仪器 |
| 4.2 实验方法与步骤 |
| 4.2.1 CCK-8法检水蛭提取液对测细胞活性的影响 |
| 4.2.2 RT- PCR 检测 VEGF 和 VEGFR2 基因表达 |
| 4.2.3 Western Blot法检测VEGF、VEGFR2 的蛋白表达 |
| 4.3 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 CCK-8法检水蛭提取液对测细胞活性及抑制率的影响 |
| 4.4.2 VEGFR2基因表达 |
| 4.4.3 VEGF基因表达 |
| 4.4.4 水蛭提取液对 HUVEC 细胞表达 VEGF 和 VEGFR2 蛋白的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 VEGF和 VEGFR2对血管生成的调控 |
| 4.5.2 水蛭提取液对HUVEC细胞表达VEGF和 VEGFR2的影响 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 附件 1 文献综述 水蛭的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附件二 文献综述 视网膜母细胞瘤的生物标志物 |
| 参考文献 |
| 附件3 在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
| 附件4 倒置显微镜下细胞形态 |
（10）高糖诱导人视网膜内皮细胞炎性凋亡机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 糖尿病早期视网膜血管改变 |
| 1.1.1 发病机制及分子生物学改变 |
| 1.1.2 细胞因子对血管损伤的调节 |
| 1.1.3 血管活性物质对血管损伤影响 |
| 1.2 糖尿病性视网膜病变与炎症 |
| 1.2.1 高血糖诱导视网膜微血管病变机制 |
| 1.2.2 炎症因子破坏视网膜细胞的机制 |
| 1.2.3 糖尿病性视网膜病变相关炎症因子的分类 |
| 1.3 糖尿病性视网膜病变与细胞凋亡 |
| 1.3.1 细胞凋亡的机制 |
| 1.3.2 细胞凋亡的基本形式 |
| 1.3.3 NF-κB 在细胞凋亡中的作用 |
| 1.3.4 抑癌基因p53 与凋亡的关系 |
| 1.3.5 P53 通路和NF-κB 信号转导通路的联系 |
| 1.4 本研究的目的、内容和意义 |
| 第2章 高糖诱导人视网膜内皮细胞炎性凋亡效应 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 研究对象 |
| 2.2.2 实验试剂及设备 |
| 2.2.3 实验试剂 |
| 2.2.4 实验仪器 |
| 2.3 实验过程 |
| 2.3.1 研究方法 |
| 2.3.2 溶液配制 |
| 2.3.3 细胞原代培养与分离 |
| 2.3.4 HE染色光镜标本制作 |
| 2.3.5 透射电子显微镜样品制备 |
| 2.3.6 LDH检测 |
| 2.3.7 DNA倍体法检测细胞周期 |
| 2.3.8 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.3.9 Western-blot检测分析 |
| 2.3.10 ELISA检测分析 |
| 2.3.11 统计分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 HE染色结果 |
| 2.4.2 透射电镜结果 |
| 2.4.3 LDH检测结果 |
| 2.4.4 DNA倍体法检测细胞周期结果 |
| 2.4.5 流式细胞仪检测细胞凋亡结果 |
| 2.4.6 Western-blot检测结果 |
| 2.4.7 ELISA检测结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 高糖诱导人视网膜内皮细胞炎性凋亡机制 |
| 3.1 研究背景 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 研究对象 |
| 3.2.2 实验试剂及仪器 |
| 3.3 实验过程 |
| 3.3.1 透射电镜检查 |
| 3.3.2 Western blot检测凋亡蛋白 |
| 3.3.3 Western blot检测p53和NF-κB 通路蛋白 |
| 3.3.4 P53和NF-κB 在视网膜内皮细胞的免疫荧光共定位 |
| 3.3.5 q-PCR反应 |
| 3.3.6 统计学分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 透射电镜结果 |
| 3.4.2 Western-blot检测Bax、Bcl-2、cl-caspase-3 的表达变化 |
| 3.4.3 Western-blot检测p53/p-p53、p65/p-p65、IκB/p-IκB 结果 |
| 3.4.4 荧光免疫共定位检测p53与NF-κB p65 蛋白在细胞内的表达及定位 |
| 3.4.5 q-PCR检测RECs细胞内p53和p65的mRNA转录水平 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 抑制p53 蛋白表达对高糖培养RECs细胞形态学的影响 |
| 3.5.2 抑制p53 蛋白对凋亡通路蛋白的影响 |
| 3.5.3 RECs细胞内p53 信号通路蛋白的表达变化 |
| 3.5.4 NF-κB 信号通路蛋白及其抑制蛋白的表达变化 |
| 3.5.5 RECs细胞炎性凋亡机制分析 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
四、缺氧对牛视网膜色素上皮细胞增生和凋亡基因bcl-2表达的影响（论文参考文献）
- [1]干细胞外泌体miR-141对视网膜氧化应激损伤的保护作用及机制[D]. 由佳鑫. 吉林大学, 2021(01)
- [2]piRNA-1245/PIWIL2通过JAK2/STAT3/VEGF通路调控视网膜新生血管的生成[D]. 于泳. 中国医科大学, 2021(02)
- [3]青蒿琥酯对糖尿病大鼠视网膜组织自噬的作用及机制研究[D]. 李丽华. 中国医科大学, 2021(02)
- [4]miR-130a通过TNF-α/SOD1信号通路抑制糖尿病视网膜病变的作用机制研究[D]. 席晓婷. 昆明医科大学, 2020
- [5]决明子水溶性多糖通过调控PI3K/Akt和TLR4/NF-κB信号通路对MNU诱导大鼠视网膜色素变性保护作用的研究[D]. 何岁勤. 大连医科大学, 2020(06)
- [6]姜黄素抑制实验性脉络膜新生血管的机制研究[D]. 陈水龄. 中国中医科学院, 2020(01)
- [7]人参皂苷Rg1对糖尿病小鼠视网膜细胞凋亡的保护作用研究[D]. 高晔. 哈尔滨商业大学, 2020
- [8]EPO对AGEs诱导的hPDLSCs细胞周期、凋亡及成骨分化能力的影响及机制研究[D]. 郑德华. 山东大学, 2020(09)
- [9]水蛭提取液对视网膜母细胞瘤的抑制作用及相关分子机制研究[D]. 李园媛. 成都中医药大学, 2020(01)
- [10]高糖诱导人视网膜内皮细胞炎性凋亡机制研究[D]. 李倩. 吉林大学, 2019(02)