一、转基因动物生产药用蛋白研究现状（论文文献综述）
徐闰[1]（2019）在《输卵管特异性表达γ-IFN的转基因鸡初探》文中研究指明目的:随着转基因技术的不断进步,转基因动物的研究也不断取得新的进展。目前使用常规的转基因生物（如细菌、昆虫等）生产糖基化药用蛋白的生产能力受到很大的限制,利用转基因动物生物反应器生产糖基化药用蛋白的研究逐渐成为研究热点。转基因鸡输卵管生物反应器具有世代周期短、饲养成本低、繁殖快和产量高的优点,使其成为生产药用蛋白的理想选择。输卵管特异性表达的目的蛋白最终在鸡蛋蛋清中表达,而且蛋清中卵清蛋白含量高、组分比较简单,有利于目的蛋白的分离与纯化。以上诸多优点使鸡输卵管生物反应器在生物制药领域拥有良好的应用前景。本研究的目的是通过PiggyBac转座子载体介导的方法将γ-hIFN目的基因整合到鸡的基因组中,最终获得输卵管特异性表达γ-hIFN的转基因鸡。方法:（1）本研究首先根据前人的研究经验,结合本实验室的条件对鸡胚换壳培养体系进行了探索,建立稳定的鸡胚换壳培养操作流程,并对鸡胚盘下腔注射体内感染复合物的注射量进行对比实验,寻找最佳的注射量;（2）利用实验室己构建的pLenti6.4-cERE/cOVP-EGFP和pLenti6.4-CMV-EGFP载体分别转染HEK 293T细胞和原代鸡输卵管上皮细胞验证cERE/cOVP启动子的活性;（3）以实验室保存的pLenti6.4-CMV-γ-hIFN、pLenti6.4-cERE/cOVP-EGFP和PUC57-P2A-RFP载体为模板,分别扩增cERE/cOVP、y-hIFN片段和P2A-RFP片段,通过重叠PCR将γ-hIFN片段和P2A-RFP片段连接起来构建表达盒。然后将cERE/cOVP和γ-hIFN-P2A-RFP片段分别亚克隆至无启动子的PB002G转座子载体Nhel/Mfel和AscI酶切位点之间,构建特异性表达载体PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP,并将γ-hIFN-P2A-RFP表达盒克隆至PB-dual-promotor转座子载体的Mfel与Nhel酶切位点之间构建PB-dual-CMV-γ-hIFN-P2A-RFP表达载体,将PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP 和 PB-dual-CMV-γ-hIFN-P2A-RFP分别转染HEK 293T细胞和原代鸡输卵管上皮细胞,检测γ-hIF N和RFP表达。（4）利用in-vivo jetPEI转染试剂,将PB002G-cER E/cOVP-y-hIFN-P2A-RFP和PBase转座酶质粒进行X期鸡胚胚盘下腔注射,孵化到第14天取鸡胚组织器官提取基因组DNA,PCR检测目的基因在鸡胚的基因组中的整合情况。结果:（1）胚盘下腔显微注射注射量为2.5ul最为合适。（2）p Lenti6.4-cERE/cOVP-EGFP转染细胞后,cERE/cOVP启动子能够成功启动EGFP在HEK 293T细胞和鸡原代输卵管上皮细胞中表达,说明该启动子能够发挥启动功能。（3）成功构建了 PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP 和 PB-Dual-CMV-y-hIFN-P2A-RFP转座子载体,分别转染HEK 293T细胞和鸡原代输卵管上皮细胞,通过显微镜观察荧光表达、RT-PCR、细胞免疫荧光和Western Blot检测到了 y-hIFN和RFP基因的表达。（4）对45枚种蛋进行鸡胚盘下腔注射转座子载体PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP,孵化14天后鸡胚存活17枚,存活率为37.78%,取鸡胚的心脏和性腺组织提取基因组DNA,进行PCR检测目的基因整合效率,最终在4个鸡胚心脏组织、2个性腺组织DNA样本中检测到了γ-hIFN基因的整合,其中1个样本在心脏和性腺组织DNA中同时检测到了γ-hIFN基因的整合。本研究初步证明了转座子载体能够介导γ-hIFN[基因整合至鸡胚基因组,为PiggyBac转座子介导输卵管特异性表达γ-hIFN转基因鸡研究奠定了基础。
廖莎,李国玲,吴珍芳,李紫聪[2]（2018）在《转基因动植物生物反应器研究进展及应用现状》文中研究说明转基因动植物作为生物反应器,有完善的真核表达系统,可以为多种外源蛋白提供正确的翻译后修饰,表达具有生物活性的外源蛋白,可以应用于人或动物的疾病治疗及预防,因其具有成本低、产出高、产品珍贵且需求高的特点而具有广阔的商业前景。目前,转基因动植物生物反应器研究领域已经取得多项成果与突破,以此生产的蛋白制品也有部分被权威机构批准上市应用,还有许多未上市的研究成果已经进入临床试验阶段,为产业化发展做准备。动植物生物反应器已成为重组药用蛋白生产的新趋势。综述了转基因植物和转基因动物作为生物反应器生产重组蛋白的研究进展及应用现状,介绍了生物反应器类型、生产的蛋白种类、已获批应用的动植物生物反应器,讨论了利用动植物生物反应器生产外源蛋白的意义及存在的问题,对其研究及应用前景进行展望。
毛婕[3]（2016）在《乳腺生物反应器在生物制药领域研究进展》文中指出文章综述了乳腺生物反应器的原理、应用、优点、问题,并对其发展方向进行了展望。利用乳腺生物反应器获得的药用蛋白在生物制药工业中具有广阔的应用前景。然而,目前使用的转基因技术由于其固有的局限性,未能使乳腺生物反应器的研究取得了很大的进步。基因打靶和核移植技术已成为乳腺生物反应器的发展注入了新的活力。本文总结了乳腺生物反应器的优点与问题,同时说明乳腺生物反应器在生物制药研究领域的必要性。
商圣哲,赵杰,李宁[4]（2014）在《转基因动物生物反应器研究及产业化进程》文中认为概述了生物反应器的概念与分类,介绍并比较了不同动物生物反应器的研究现状和发展前景,提出乳腺是生产结构和功能复杂的重组蛋白的最佳生物反应器,具有广泛的应用潜力,可在生产新型牛奶和药用珍稀蛋白等方面为人类做出巨大的贡献。同时指出了包括乳腺反应器在内的动物生物反应器存在的问题,对乳腺生物反应器的应用前景进行了展望。
宋政,牛俊伟,孙晓先,龚道清[5]（2013）在《转基因鸡输卵管生物反应器生产药用蛋白研究进展》文中认为与哺乳动物生物反应器相比,鸡输卵管生物反应器因其经济、高效、稳定、周期短等多个潜在优势而被认为是最具开发前景的生产药用蛋白的技术平台之一。本文在介绍转基因鸡输卵管生物反应器生产药用蛋白研究方法的同时,重点分析了转基因鸡生产技术—逆转录病毒载体法、原始生殖细胞（PGCs）介导法和定点基因敲除-敲入技术。逆转录病毒载体法虽有很多优势,但难以掩盖其在生物安全性和实际应用中的不足;而应用piggyBac转座子转导PGCs介导的基因转移和表达系统也具有很大的潜在优势和应用前景;定点基因敲除-敲入技术定点整合的精确性优势使其在转基因动物生产和生物反应器开发方面具有广泛的应用前景。
耿宁[6]（2011）在《我国转基因动物产业化法律监管制度研究》文中认为转基因动物的研究和应用将是21世纪生物技术发展最具活力的领域之一,其在家畜改良、医学研究尤其是药物生产领域显示出巨大的发展前景。随着转基因动物技术研究的不断深入,转基因动物产业化成为不可阻挡的发展趋势。由于转基因动物技术兼具效益性与风险性,因此人们对其进行研究、开发和利用有可能引发的风险问题应不容忽视。转基因动物技术的发展将会对现有的法律制度产生巨大冲击与挑战,从而迫使既有的法学理论、法律制度进行相应调整。我国对转基因动物的研究与应用尚未建立起与其技术发展相适用的法律监管制度体系,现有的转基因生物安全监管制度主要考虑的是转基因植物产业化的发展特点,它并不完全适合对转基因动物产业化进行监管。为推动转基因动物产业化科学发展,保障人们的基本权益不受侵犯,因此,加强对转基因动物产业化法律监管制度的研究势在必行。本研究立足于法学视角,从转基因动物研究试验与产业化应用领域两个阶段的监管展开深层次探讨。在转基因动物研究试验阶段（包括封闭实验、中问试验、环境释放、生产性试验等）的法律监管方面,本文首先对于我国现有的法律监管制度进行剖析,发现已有制度的缺陷与不足,然后确立协调监管、风险预防、分级分类的监管原则,最后以监管主体制度、安全评价制度、风险防范制度、应急管理制度的完善为主要内容,强化我国转基因动物研究试验阶段的监管制度建设。在转基因动物的具体产业应用领域,可分为转基因动物食品生产、转基因动物生物反应器制药、转基因动物器官移植三个方面。在转基因动物食品安全监管方面,本文首先对于我国转基因动物食品安全监管的相关制度进行解读,然后剖析现有制度的不足之处,最后在监管制度完善方面,秉承“从农场到餐桌”的监管理念,以安全评价原则、全过程控制原则、国家责任原则为基本监管原则,建立健全转基因动物食品安全监管制度体系,包括管理体制、市场准入制度、安全监测制度、信息公开制度、追溯与召回制度以及责任追究与损害救济制度。在转基因动物生物反应器制药监管方面,本文首先介绍我国转基因动物生物反应器制药相关法律制度,然后分析转基因动物生物反应器制药与现有监管制度的内在关系,明确对其进行监管的必要性,最后,在遵循“以科学为基础”和“具体问题具体分析”相结合的原则之下,按照药品生产加工、销售适用的不同环节进行具体的制度构建,主要包括药品临床前试验制度、临床试验质量管理制度、药品注册管理制度、市场准入制度、不良反应报告与召回制度、损害救济制度等内容。在转基因动物器官移植法律监管方面,按照转基因动物器官移植人体试验与临床应用两个发展阶段分别进行研究。在人体试验阶段,以维护受试者生命健康为核心,确立人体试验的符合伦理、知情同意、隐私保护等基本监管原则,建立伦理审查制度、知情同意制度、隐私保密制度、损害救济制度等；在临床应用阶段,以维护患者的人身权益为出发点,在坚持符合伦理、知情同意、隐私保护原则的同时,明确技术准入、公平公正、预防与救济等临床阶段监管的特有原则,以构建临床应用的法律监管制度体系,主要包括监管主体制度、技术准入制度、器官质量审查与公平分配制度、责任追究与损害救济制度等内容。本研究贯穿于转基因动物研究与试验、生产与加工、经营与销售等各个环节,为转基因动物产业化发展的不同阶段、应用的不同领域提供了全方位、具体化的制度安排,以期建立和完善我国转基因动物研究及应用的法律监管制度体系,使转基因动物研究及产业应用纳入法制化的科学发展轨道,以促进转基因动物研究应用的健康、安全发展,从而实现经济效益与社会效益的和谐兼顾。
王韵斐[7]（2011）在《无抗性标记的人白血病抑制因子打靶载体的构建及表达研究》文中指出动物乳腺生物反应器是指利用动物乳腺特异性乳蛋白基因的调控序列构建表达载体,来生产转基因动物,指导外源基因在乳腺中特异性高效表达,并能从乳汁中获取重组蛋白的一种生物反应器。而体细胞基因打靶—核移植技术由于能够将外源基因定点整合到受体细胞基因组中,克服随机整合带来的位置效应及多拷贝插入问题,实现外源基因在动物乳腺中特异性高效表达等优势,目前已成为制备动物乳腺生物反应器的主要技术选择。本研究就是利用基因打靶技术将人白血病抑制因子（hLIF）基因定位整合至奶山羊β-酪蛋白基因座,并验证hLIF基因在奶山羊乳腺上皮细胞中的表达,以期为获得能特异性高效表达hLIF基因的乳腺生物反应器打下基础。合成一段两端带有同向LoxP序列的多克隆位点序列,并将其插入到骨架载体pBluescriptSK+中,得到载体pLoxP。然后将克隆得到的山羊β-酪蛋白5′和3′端同源臂,正向筛选标记基因neo和负向筛选标记基因tk插入到载体pLoxP中,得到山羊β-酪蛋白基因座通用打靶载体pLoxP-NT53。再将hLIF基因克隆到载体pLoxP-NT53中从而得到hLIF基因打靶载体pLoxP-NT53L。其中hLIF基因位于山羊β-酪蛋白基因第七外显子下游,neo基因位于两段同向LoxP序列之间,tk基因位于山羊β-酪蛋白3′同源臂外侧。采取泌乳期奶山羊乳腺组织,利用组织块贴壁培养法培养原代奶山羊乳腺上皮细胞。经细胞传代纯化后,将经SwaⅠ酶切线性化后的重组质粒pLoxP-NT53L通过脂质体转染整合至奶山羊乳腺上皮细胞基因组中,利用G418和CANC对转染细胞进行双重抗性筛选,并对获得的抗性细胞克隆进行PCR、实时定量PCR和Western blotting检测,以验证hLIF基因在奶山羊乳腺上皮细胞中的表达情况。酶切和测序分析结果显示,本试验成功构建了hLIF基因打靶载体pLoxP-NT53L。对经筛选获得的抗性细胞克隆进行hLIF基因PCR和实时定量PCR检测,得到14个阳性细胞克隆。将阳性细胞克隆进行激素诱导后利用山羊β-酪蛋白基因启动子指导hLIF表达,进行Western blotting检测,结果有2个阳性克隆成功表达了hLIF蛋白。表明hLIF基因已经成功整合至山羊β-酪蛋白基因座中,并能在奶山羊乳腺上皮细胞中特异性表达hLIF蛋白。从而为无抗性标记的转hLIF基因奶山羊新品种的培育奠定了基础。
张艳丽[8]（2010）在《转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究》文中研究指明人溶酶体β-葡萄糖苷酶（human lysosomal acidβ-glucosidase, GlcCerase）是糖蛋白降解途径的主要外糖苷酶,参与糖蛋白的回收利用。该酶减少或缺失会导致葡萄糖脑苷脂不能有效降解,在各器官中大量沉积,从而使机体发生广泛的病理变化,临床上称为“戈谢病”,酶替代法是目前该病的主要疗法。人体来源的GlcCerase获得极为困难,应用哺乳动物细胞和转基因植物表达系统生产重组人GlcCerase虽然已经有一些成功的报道,但也面临许多难以克服的问题,如在CHO细胞表达重组人GlcCerase,生产成本过于昂贵；在转基因植物中表达,存在重组蛋白质中糖链结构的改变以及下游加工处理困难等限制。如果应用转基因动物乳腺生物反应器生产重组人GlcCerase,在得到天然活性较高产品的同时,将极大地降低生产成本,具有其它表达系统所不能代替的优势。然而,显微注射法的高成本、低效率长期以来制约着转基因动物研究的发展,体细胞转基因与核移植相结合制备动物乳腺生物反应器是当今转基因整合表达的一种有效途径。因此,本研究选取人溶酶体β-葡萄糖苷酶作为研究对象,首先克隆人GlcCerase cDNA序列并对其在COS7细胞中的表达进行初步研究,然后构建含有人GlcCerase cDNA的乳腺表达载体,经体外培养的乳腺上皮细胞验证载体的有效性后,进一步将该载体转染奶山羊胎儿成纤维细胞,筛选稳定转基因细胞克隆株,通过体细胞核移植法生产转基因奶山羊克隆胚胎,以期获得乳腺特异性表达GlcCerase的转基因奶山羊乳腺生物反应器。本研究共分为六个部分,第一、二部分进行了人GlcCerase基因的克隆、表达载体的构建及体外细胞表达研究；第三、四部分主要是分离培养了奶山羊胎儿成纤维细胞,并优化了脂质体法转染该细胞的体系,获得了稳定整合人GlcCerase基因的供体细胞；第五部分利用转人GlcCerase基因的奶山羊胎儿成纤维细胞进行了核移植,研究转基因供体细胞对克隆胚胎体外发育的支持作用,并对克隆胚胎进行了胚胎移植；第六部分探讨了外源基因导入对奶山羊体细胞周期分布、细胞凋亡和基因表达水平的影响。主要的研究结果如下：第一部分人GlcCerase cDNA序列的克隆及真核细胞表达试验中,首先从人胎盘组织中分离提取得到总RNA,利用RT-PCR方法,直接获得人GlcCerase基因的编码序列,经测序分析,所得GlcCerase cDNA与GeneBank中同源性为99%,发现1个碱基差异,导致天冬氨酸到甘氨酸的改变。为了尽快检测所获得的目标基因是否能正常编码获得重组蛋白质,本试验以pEGFP-Cl为基础质粒,构建了含有人GlcCerase基因的真核表达载体pEGFP-GlcCerase。用脂质体介导法将该载体转染入COS7细胞中进行暂态表达研究,可见报告基因GFP顺利表达,经RT-PCR和荧光酶学法进行验证,在细胞中检测到了GlcCerase的mRNA表达,并在细胞裂解产物中检测到了GlcCerase的生物活性。这些结果表明所克隆的人GlcCerase cDNA能够正确编码蛋白,发挥生物学功能,可以用于下一步的乳腺表达载体构建。第二部分人GlcCerase基因乳腺特异性表达载体的构建及乳腺细胞表达试验中,将在体外经真核细胞表达验证正确的GlcCerase基因以及细胞筛选标记基因（Neor）插入含有山羊p-酪蛋白基因调控序列的pBC1载体中,经PCR和酶切鉴定,得到正确的重组质粒pBCl-GlcCerase-Neo。为了检测乳腺表达载体的有效性,将该载体转染入小鼠乳腺上皮细胞系——HC-11细胞中,经G418抗性筛选,获得阳性克隆细胞,将克隆细胞扩大培养后,经PCR检测结果表明,人GlcCerase基因己成功转入到HC-11细胞中。进一步用催乳素、胰岛素及氢化可的松诱导培养转基因细胞,经RT-PCR和Western-blot检测表明,山羊p-酪蛋白基因启动子驱动的人GlcCerase基因能够在乳腺上皮细胞中转录翻译并分泌到胞外。这些结果表明,所构建的人GlcCerase基因乳腺表达载体具有生物学功能,为下一步利用该载体进行转基因供体细胞的建立奠定了基础。第三部分奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及脂质体法转染研究,采用组织块培养法结合胰蛋白酶消化法分离纯化得到奶山羊胎儿成纤维细胞,绘制了生长曲线,鉴定了胎儿细胞性别及核型特征,结果表明：该培养体系可以支持奶山羊胎儿成纤维细胞的体外生长,其细胞形态为梭形,高度汇合后呈火焰状,增殖特性以及核型特征均为正常,性别鉴定显示该奶山羊胎儿细胞为雌性,符合体细胞转基因克隆的基本要求。进一步利用脂质体法将pEGFP-Cl质粒转染入该细胞,研究了脂质体量、质粒量和转染时间对转染效率的影响,获得了脂质体转染该细胞的最佳条件：24孔细胞培养板中采用4.0μL脂质体转染试剂,1.2μg质粒DNA,细胞在复合物中孵育6 h。这为下一步目的基因转染奶山羊胎儿成纤维细胞的研究提供了参考依据。第四部分建立转人GlcCerase基因奶山羊胎儿成纤维细胞的试验,利用上述优化的转染体系,将线性化的乳腺特异性表达载体pBC 1-GlcCerase-Neo转染胎儿成纤维细胞,经G418筛选8-10天后,获得抗性细胞克隆,进一步通过96孔细胞培养板分离得到来源于单个转基因成纤维细胞的细胞克隆,经PCR扩增检测,得到稳定整人GlcCerase基因的转基因供体细胞8株,和对照组细胞比较,转基因过程中没有导致细胞的生长和核型异常。转基因细胞的核型（2n=58+XX）正常比例为66.8%,而第10-12代的非转染细胞核型正常率为70.9%,二者差异不显着（P>0.05）。这些结果表明可以利用这些阳性转基因细胞作供体细胞进行核移植研究。第五部分人GlcCerase转基因克隆胚胎的制备研究,采集屠宰山羊卵巢,获取卵母细胞并体外成熟培养,成熟率为63.3%。以100%汇合2天的转基因体细胞作核供体,以去核的MⅡ期卵母细胞作核受体进行核移植操作。完成核移植的卵母细胞采用122 kV/cm、20μs/次、间隔1s的直流电脉冲进行融合,融合率为83.3%,融合后的重构胚胎进一步用Ionomycin和6-DMAP进行激活处理,然后转移到SOFaa培养液中与单层卵丘细胞共培养,重构胚的卵裂率为89.1%,发育至桑葚胚/囊胚期的比例为36.4%。以正常体细胞来源的核移植胚胎作为对照,其融合率、卵裂率以及桑葚胚/囊胚率分别为77.8%、90.9%和38.9%,两种供体细胞来源的融合率和胚胎发育率差异不显着。手术法将发生卵裂且形态正常的转基因克隆胚（2-细胞期或以上）移植到同期发情的山羊输卵管中,16只受体山羊中有6只一直没有返情,在第40天经B超检测到2只妊娠的结果,但是最终妊娠没有发育到期,胎儿发生流产。第六部分探讨了外源基因转染对供体细胞生物学特性的影响。将构建的乳腺表达载体pBC1-GlcCerase-Neo分别转染体外培养的奶山羊乳腺上皮细胞、胎儿成纤维细胞以及成年皮肤成纤维细胞,获得整合有外源基因GlcCerase的转基因体细胞。以非转染的正常细胞为对照,利用流式细胞仪分析了转基因奶山羊体细胞的细胞周期分布和细胞凋亡的情况,研究结果显示：三种转基因细胞100%汇合2d后,G0/G1细胞的百分比都显着低于对照组细胞（P<0.05）,其中转基因胎儿成纤维细胞的G0/G1期比例高于其它两种转基因细胞；转基因胎儿成纤维细胞凋亡率达22.56%,较对照组细胞有显着提高（P<0.05）；然后进一步利用荧光定量PCR法探讨了外源基因转染对胎儿成纤维细胞基因表达模式的影响,检测的基因分别为基因印记基因（IGF2, IGF2R）、凋亡相关基因（Bax）、应激相关基因（热休克蛋白,Hsp70.1）、细胞连接相关基因（Cx43）和DNA甲基化转移酶1基因（DNMT1）。其中IGF2, IGF2R和Cx43mRNA的转录水平显着高于对照组非转染的对照组细胞（P<0.05）。本研究首次从细胞周期分布、细胞凋亡以及基因表达变化模式等方面探讨外源基因转染对奶山羊体细胞的影响,探索转基因克隆效率低的内在机制,为更好地促进供体细胞的重编程,进一步提高转基因克隆的效率奠定了基础。
刘静[9]（2009）在《动物乳腺生物反应器》文中研究说明应用转基因动物乳腺生物反应器能够获得多种药用蛋白质,具有高效、经济、安全等特点。本文就转基因动物乳腺生物反应器的定义、研究发展简史、药用蛋白生产的特点及存在的主要问题作了简要综述,并对其开发应用前景作了展望。
杨海[10]（2009）在《人抗凝血酶Ⅲ的cDNA克隆、表达、纯化及其重组蛋白对DIC大鼠模型的疗效研究》文中认为与传统的药物相比,重组蛋白质药物具有活性高、特异性强、毒性低、生物功能明确、便于临床应用、可规模化生产的优点,因此,重组药物蛋白的生产是当今国内外药物研究的热点,其中研究的重点则是如何经济、高效的生产和应用这类蛋白。虽然有细菌、真菌、昆虫细胞、动物细胞、转基因动植物等几种外源蛋白表达系统用来生产重组药用蛋白,但它们均存在着一些难以弥补的缺陷。为探讨利用动物乳腺作为表达系统来生产药用蛋白的可行性,本研究选取人血浆中重要的抗凝蛋白-人抗凝血酶（hAT）作为研究对象,构建含有hAT cDNA基因的重组腺病毒载体Ad-hAT,将Ad-hAT注入羊乳腺内,感染羊乳腺上皮细胞,使hAT的cDNA基因在羊乳腺内高效表达,从而在羊乳汁中获得具有生物功能的重组人抗凝血酶（rhAT）。对rhAT进行分离纯化后,作用于弥散性静脉内凝血（DIC）大鼠模型,对rhAT治疗DIC大鼠的疗效进行评判。通过以上试验,为重组腺病毒载体介导人源基因在动物乳腺中高效表达rhAT以及rhAT在人类DIC疾病中的应用提供理论依据和技术支持。本研究主要包括以下内容:（1）提取人胚胎肝脏组织中的总RNA,经RT-PCR,获得用于表达的hAT的cDNA基因序列。对获得的cDNA序列进行测序分析,初步确定所扩增的cDNA的正确性。（2）以pcDNA3.1（+）为基础质粒,构建重组真核表达质粒p3AT,将之转入体外培养的羊乳腺上皮细胞细胞中获得表达,进一步证实hAT的cDNA序列可用于表达rhAT;（3）以pShuttle-CMV为基础质粒,构建重组穿梭载体pShAT,细菌内同源重组法获得重组腺病毒载体质粒pAd-hAT;（4）将pAd-hAT转入HEK293细胞中,通过病毒包装获得重组hAT腺病毒载体Ad-hAT;Ad-hAT在HEK293细胞内大量扩增;（5）将Ad-hAT转入体外培养的羊乳腺上皮细胞中获得表达,进一步证实Ad-hAT可用于高效表达rhAT;（6）将Ad-hAT注入羊乳腺,感染乳腺上皮细胞,在乳汁中获得rhAT,对乳汁中rhAT进行检测;应用肝素琼脂糖凝胶6FF亲和层析法分离乳汁中的重组蛋白,获得rhAT冻干粉;（7）构建大鼠DIC动物模型,分别用人血浆提取的hAT（hpAT）和rhAT进行处理,检测DIC大鼠血浆中DIC指标,进行疗效判定;（8）对hpAT和rhAT对DIC大鼠的疗效进行比较,探索在DIC治疗中,利用rhAT取代hpAT的可行性。进行上述试验研究,取得如下研究结果:（1）通过RT-PCR法从人胚胎肝脏组织中获得了hAT的cDNA基因。经DNA测序分析,所得hAT的cDNA与Genbank中的相应序列（NM000488）一致。（2）以pcDNA3.1+、pIRES和pShuttle-CMV为基础质粒,构建了含有hAT cDNA基因的真核表达载体p3AT以及穿梭表达载体pShAT。载体p3AT含有新霉素抗性筛选标记基因和GFP报告基因,可对已转染的哺乳动物细胞进行抗性筛选,也可对hAT的表达进行实时观测;构建的pShAT质粒含有GFP报告基因,可对腺病毒载体进行实时蛋白表达观测和快速滴度测定,为下一步研究rhAT的表达奠定基础。（3）将所构建并经鉴定正确的pShAT用Pme I酶切线性化,将所获得的线性化片断直接转化处于感受态且含有Adeasy-1质粒的大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组的方法获得了含有hAT cDNA基因的重组腺病毒载体质粒pAd-hAT。证实细菌内同源重组能高效获得重组腺病毒载体质粒。（4）在培养的HEK293细胞中,进行了重组腺病毒Ad-hAT的包装与扩增,获得了重组腺病毒Ad-hAT。（5）质粒表达载体p3AT在体外培养的羊乳腺上皮细胞中获得表达,表达含量达到了700±90 mg/L,rhAT活性为110%～120%,证实了所PT-PCR获得的hAT cDNA可用于hAT的表达;重组腺病毒载体Ad-hAT在体外培养的羊乳腺上皮细胞中获得表达,表达含量达到了900±85 mg/L,rhAT活性为120%～130%,证实了Ad-hAT在羊乳腺上皮细胞中表达的可能性,为下一步在羊乳腺内高效表达hAT奠定了基础。（6）将Ad-hAT注入羊乳腺后,在乳汁中获得了rhAT的高效表达,21 d内共11次的检测平均表达含量达到1.58±0.21 g/L,日检测单次最高3.1 g/L,活性平均为102.5±1.44 %。应用肝素琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化rhAT后,分离纯化后的rhAT回收率达到54.7±1.0%,纯度达到92.5±0.5%。（7）成功构建大鼠DIC动物模型。（8）用rhAT和hpAT处理DIC大鼠后,rhAT和hpAT一样（P>0.05）,均有效地缓解了大鼠DIC病情,对治疗DIC大鼠具有良好的疗效,主要表现为:血浆纤维蛋白原浓度减少和血小板增多的趋势得到有效抑制;血浆内hAT活性和凝血酶-抗凝血酶复合物（TAT）浓度得到相应增加;谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）浓度上升的趋势得到有效抑制。结果说明,在DIC的治疗药物选择中,rhAT具有取代hpAT的可行性。本研究利用腺病毒为载体,在羊乳腺中高效表达了具有生物活性的rhAT;应用肝素琼脂糖凝胶亲和层析法分离纯化rhAT,获得了较高纯度的rhAT冻干粉;应用rhAT作用DIC大鼠模型,取得了和hpAT一样的良好的治疗效果（P>0.05）。研究结果充分说明,本试验确定的重组蛋白表达与分离纯化路线是切实可行的,该方法获得的rhAT在治疗DIC疾病方面具有和hpAT同等的疗效。这些,将促进从人血浆中提取hAT这一传统生产方式的变革,使hAT生产向高效、经济、规模化方向发展;也将进一步拓宽rhAT的应用领域,创造出更大的经济和社会效益。
二、转基因动物生产药用蛋白研究现状（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转基因动物生产药用蛋白研究现状（论文提纲范文）
（1）输卵管特异性表达γ-IFN的转基因鸡初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写符号说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 转基因鸡的研究进展 |
| 1.2 转基因鸡的制备 |
| 1.2.1 外源基因受精卵显微注射 |
| 1.2.2 逆转录病毒介导的转基因 |
| 1.2.3 慢病毒介导的转基因 |
| 1.2.4 转座子介导的转基因 |
| 1.3 鸡胚换壳培养体系 |
| 1.4 鸡输卵管生物反应器的研究进展 |
| 1.4.1 卵清蛋白的简介及表达调控 |
| 1.4.2 卵清蛋白基因的结构 |
| 1.4.3 卵清蛋白启动子 |
| 1.4.4 输卵管特异性表达转基因鸡的研究现状 |
| 1.5 г-干扰素(г-IFN)的研究进展 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 1.7 实验路线 |
| 第二章 鸡胚盘下腔显微注射与换壳培养体系条件的探索与优化 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.2 实验设备 |
| 2.3 非注射鸡胚换壳培养 |
| 2.4 不同注射量对孵化率的影响 |
| 2.5 结果 |
| 2.5.1 非注射鸡胚换壳培养 |
| 2.5.2 不同注射量的鸡胚换壳 |
| 2.6 讨论 |
| 2.7 小结 |
| 第三章 鸡卵清蛋白启动子的活性验证及γ-hIFN转座子载体构建 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 实验仪器设备 |
| 3.2.4 常用试剂的配制 |
| 3.3 启动子活性验证 |
| 3.3.1 HEK 293T细胞转染 |
| 3.3.2 鸡原代输卵管上皮细胞的转染 |
| 3.4 г-IFN转座子载体的构建 |
| 3.4.1 cERE/cOVP引物的设计与合成 |
| 3.4.2 cERE/cOVP片段扩增 |
| 3.4.3 PCR产物的回收与纯化 |
| 3.5 г-HIFN片段和P2A-RFP片段的克隆 |
| 3.5.1 γ-hIFN片段和P2A-RFP片段引物设计与合成 |
| 3.5.2 γ-hIFN片段和P2A-RFP片段的PCR扩增 |
| 3.5.3 PCR产物的回收与纯化 |
| 3.6 重叠延伸PCR拼接г-HIFN和P2A-RFP |
| 3.6.1 γ-hIFN-P2A-RFP聚合酶链式反应 |
| 3.6.2 γ-hIFN-P2A-RFP融合片段与pMD-18T载体连接 |
| 3.6.3 连接产物的转化 |
| 3.6.4 菌液PCR筛选阳性克隆 |
| 3.6.5 阳性质粒的小量抽提 |
| 3.6.6 阳性质粒的酶切鉴定及测序 |
| 3.7 转座子载体的构建 |
| 3.7.1 γ-hIFN-P2A-RFP片段与载体的酶切 |
| 3.7.2 目的片段与载体的连接 |
| 3.7.3 连接产物的转化 |
| 3.7.4 阳性菌落的筛选 |
| 3.7.5 阳性质粒的小量提取 |
| 3.7.6 阳性质粒的酶切鉴定与测序 |
| 3.7.7 阳性重组质粒的中提 |
| 3.7.8 PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP的第二步构建 |
| 3.8 结果 |
| 3.8.1 cERE/cOVP启动子活性验证 |
| 3.8.2 cERE/cOVP启动子的扩增 |
| 3.8.3 γ-hIFN和P2A-RFP片段的扩增 |
| 3.8.4 重叠PCR拼接γ-hIFN和P2A-RFP片段 |
| 3.8.5 pMD-18T-γ-hIFN-P2A-RFP重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.8.6 γ-hIFN-P2A-RFP片段的测序结果 |
| 3.8.7 PB-dual-γ-hIFN-P2A-RFP重组质粒的菌液PCR筛选及双酶切鉴定 |
| 3.8.8 PB-dual-γ-hIFN-P2A-RFP重组质粒测序 |
| 3.8.9 PB002G-γ-hIFN-P2A-RFP连接阳性菌落筛选及双酶切鉴定 |
| 3.8.10 PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP重组质粒菌落PCR及双酶切鉴定 |
| 3.8.11 PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP特异性转座子表达载体的测序 |
| 3.9 讨论 |
| 3.10 小结 |
| 第四章 γ-hIFN转座子表达载体的体外验证及体内表达 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.2.3 实验仪器设备 |
| 4.2.4 常用试剂的配制 |
| 4.3 转座子载体的体外验证 |
| 4.3.1 细胞转染 |
| 4.3.2 RT-PCR检测 |
| 4.3.3 Western Blot检测γ-hIFN蛋白 |
| 4.4 特异性转座子表达载体的体内表达 |
| 4.4.1 特异性转座子表达载体鸡胚盘下腔注射 |
| 4.4.2 14日龄鸡胚组织DNA提取 |
| 4.4.3 目的基因的检测 |
| 4.5 结果 |
| 4.5.1 PB-dual-CMV-γ-hIFN-P2A-RFP转座子载体的体外验证 |
| 4.5.2 PB002G-cERE/cOVP-γ-hIFN-P2A-RFP特异性转座子载体的体外验证 |
| 4.5.3 特异性转座子载体体内感染 |
| 4.6 讨论 |
| 4.7 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）转基因动植物生物反应器研究进展及应用现状（论文提纲范文）
| 1 转基因动物生物反应器的研究及应用 |
| 1.1 转基因动物生物反应器类型 |
| 1.1.1 乳腺生物反应器 |
| 1.1.2 血液生物反应器 |
| 1.1.3 膀胱生物反应器 |
| 1.1.4 唾液腺生物反应器 |
| 1.1.5 家禽输卵管生物反应器 |
| 1.1.6 其他类型动物生物反应器 |
| 1.2 转基因动物生物反应器应用现状 |
| 1.2.1 已获批上市的动物生物反应器 |
| 1.2.2 已批准进行临床试验阶段的动物生物反应器 |
| 2 转基因植物生物反应器的研究及应用 |
| 2.1 转基因植物生物反应器概述 |
| 2.2 植物生物反应器应用现状 |
| 2.2.1 生产疫苗 |
| 2.2.2 生产抗体 |
| 2.2.3 生产其他药用蛋白 |
| 3 展望 |
（3）乳腺生物反应器在生物制药领域研究进展（论文提纲范文）
| 引言 |
| 1 乳腺生物反应器的原理 |
| 2 乳腺生物反应器的应用 |
| 2. 1 人乳铁蛋白 |
| 2. 2 人组织型溶纤酶原激活因子 |
| 2. 3 人血白蛋白 |
| 3 乳腺生物反应器的优点 |
| 3. 1 生物药品高活性、人源化 |
| 3. 2 高产量、高质量 |
| 3. 3 高效益、低成本 |
| 3. 4 低耗能、少污染 |
| 4 乳腺生物反应器存在的问题 |
| 4. 1 外源基因在动物体内的整合位点问题 |
| 4. 2 转基因表达产物的分离纯化问题 |
| 4. 3 目的蛋白的翻译后修饰问题 |
| 4. 4 外源基因在动物乳腺中特异表达问题 |
| 5 展望 |
（5）转基因鸡输卵管生物反应器生产药用蛋白研究进展（论文提纲范文）
| 1 转基因鸡输卵管生物反应器生产药用蛋白的原理和优势 |
| 2 利用转基因鸡输卵管生物反应器生产药用蛋白的研究方法 |
| 2.1 逆转录病毒载体法 |
| 2.1.1 慢病毒载体法的研究现状 |
| 2.1.2 慢病毒载体法存在的问题 |
| 2.2 原始生殖细胞 (PGCs) 介导法 |
| 2.2.1 基本原理 |
| 2.2.2 PGCs介导法研究新进展 |
| 2.3 定点基因敲除-敲入技术 |
| 3 小结 |
（6）我国转基因动物产业化法律监管制度研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 导论 |
| 1.1 研究缘起 |
| 1.1.1 问题的提出 |
| 1.1.2 本研究的目的 |
| 1.1.3 本研究的意义 |
| 1.2 国内外相关研究述评 |
| 1.2.1 国外相关研究综述 |
| 1.2.2 国内相关研究综述 |
| 1.2.3 研究评述 |
| 1.3 研究设计与分析进路 |
| 1.3.1 基本概念界定 |
| 1.3.2 研究方法 |
| 1.3.3 研究路线 |
| 1.4 研究的创新点与难点 |
| 1.4.1 研究的创新点 |
| 1.4.2 研究的难点 |
| 2 转基因动物产业化的基本问题 |
| 2.1 转基因动物的概念及制备方法 |
| 2.1.1 转基因动物的概念 |
| 2.1.2 转基因动物的制备方法 |
| 2.1.2.1 显微原核注射法 |
| 2.1.2.2 逆转录病毒感染法 |
| 2.1.2.3 胚胎干细胞介导法 |
| 2.1.2.4 体细胞核移植技术 |
| 2.2 转基因动物产业化的概念和应用方向 |
| 2.2.1 转基因动物产业化的概念 |
| 2.2.2 转基因动物产业化的应用方向 |
| 2.2.2.1 品种改良与食品生产 |
| 2.2.2.2 医药生产 |
| 2.2.2.3 器官移植 |
| 2.2.2.4 其他应用 |
| 2.3 转基因动物产业化存在的技术问题及展望 |
| 3 转基因动物产业化法律监管的缘由及理论依据 |
| 3.1 转基因动物产业化法律监管的缘由 |
| 3.1.1 保障生命健康权益 |
| 3.1.2 尊重生命伦理规范 |
| 3.1.3 保护生态环境安全 |
| 3.1.4 维护消费者的知情选择权 |
| 3.1.5 促进产业化健康科学发展 |
| 3.2 转基因动物产业化法律监管的理论依据 |
| 3.2.1 风险管理理论 |
| 3.2.2 安全价值理论 |
| 3.2.3 市场规制理论 |
| 3.2.4 可持续发展理论 |
| 4 我国转基因动物研究试验阶段法律监管制度的完善 |
| 4.1 我国转基因动物研究试验法律监管制度的现状 |
| 4.2 我国转基因动物研究试验法律监管制度的不足 |
| 4.2.1 监管对象范围狭窄 |
| 4.2.2 监管主体协调性差 |
| 4.2.3 安全评价制度不合理 |
| 4.2.4 应急管理制度不详细 |
| 4.3 我国转基因动物研究试验法律监管制度的健全 |
| 4.3.1 监管范围的扩大 |
| 4.3.2 监管原则的确立 |
| 4.3.2.1 协调监管原则 |
| 4.3.2.2 风险预防原则 |
| 4.3.2.3 分级、分类监管原则 |
| 4.3.3 监管制度的完善 |
| 4.3.3.1 明确监管主体制度 |
| 4.3.3.2 规范安全评价制度 |
| 4.3.3.3 完善风险防范制度 |
| 4.3.3.4 细化应急管理制度 |
| 5 我国转基因动物食品安全法律监管制度的完善 |
| 5.1 转基因动物食品的概念界定 |
| 5.2 转基因动物食品安全监管的特殊性 |
| 5.3 我国转基因动物食品安全监管的制度现状 |
| 5.3.1 《食品安全法》出台之前的监管制度 |
| 5.3.2 《食品安全法》颁布之后的监管制度 |
| 5.4 我国转基因动物食品安全监管制度存在的问题 |
| 5.4.1 立法体系尚不健全 |
| 5.4.2 管理体制模糊不清 |
| 5.4.3 安全评价制度不详细 |
| 5.4.4 信息公开制度不全面 |
| 5.4.5 标识制度缺乏针对性 |
| 5.4.6 损害赔偿制度力度不够 |
| 5.5 我国转基因动物食品安全监管原则的确立 |
| 5.5.1 安全评价原则 |
| 5.5.1.1 实质等同性原则 |
| 5.5.1.2 个案分析原则 |
| 5.5.1.3 重新评价原则 |
| 5.5.2 全过程控制原则 |
| 5.5.3 国家责任原则 |
| 5.6 我国转基因动物食品安全监管制度的健全 |
| 5.6.1 确立双轨制管理体制 |
| 5.6.2 严格市场准入制度 |
| 5.6.2.1 安全评价制度 |
| 5.6.2.2 上市前人体试食制度 |
| 5.6.2.3 生产与经营许可制度 |
| 5.6.2.4 强制标识制度 |
| 5.6.3 强化安全监测制度 |
| 5.6.4 优化信息公开制度 |
| 5.6.5 健全追溯与召回制度 |
| 5.6.5.1 追溯制度 |
| 5.6.5.2 召回制度 |
| 5.6.6 完善责任追究与损害救济制度 |
| 5.6.6.1 责任追究制度 |
| 5.6.6.2 损害救济制度 |
| 5.6.6.2.1 代表人诉讼制度 |
| 5.6.6.2.2 食品安全责任保险制度 |
| 5.6.6.2.3 国家责任救济制度 |
| 5.6.6.2.3.1 国家赔偿制度 |
| 5.6.6.2.3.2 国家补偿制度 |
| 5.6.6.2.4 食品安全保障基金制度 |
| 6 我国转基因动物生物反应器制药法律监管制度的构建 |
| 6.1 转基因动物生物反应器制药基本问题介绍 |
| 6.1.1 转基因动物生物反应器概念 |
| 6.1.2 转基因动物生物反应器制药的优越性 |
| 6.1.3 转基因动物生物反应器制药的研究进展 |
| 6.2 我国转基因动物生物反应器制药相关监管制度 |
| 6.2.1 我国现有药品监管法律制度现状 |
| 6.2.2 转基因动物反应器制药与现有药品监管制度的关系 |
| 6.3 我国现有监管制度对转基因动物生物反应器制药适用的局限 |
| 6.4 我国转基因动物生物反应器制药法律监管制度的构建 |
| 6.4.1 转基因动物生物反应器制药的立法支持 |
| 6.4.2 转基因动物生产群系的安全监管制度 |
| 6.4.3 转基因动物生物反应器制药具体监管制度构建 |
| 6.4.3.1 药品临床前实验制度(GLP制度) |
| 6.4.3.2 药品临床试验质量管理制度(GCP制度) |
| 6.4.3.3 药品注册管理制度(新药上市许可制度) |
| 6.4.3.4 药品生产与经营市场准入制度 |
| 6.4.3.4.1 药品生产质量管理制度(GMP制度) |
| 6.4.3.4.2 药品经营质量管理制度(GSP制度) |
| 6.4.3.4.3 药品生产经营许可证制度 |
| 6.4.3.4.4 药品标签制度 |
| 6.4.3.5 药品再评价制度 |
| 6.4.3.6 上市后不良反应报告与召回制度 |
| 6.4.3.6.1 不良反应报告制度 |
| 6.4.3.6.2 药品召回制度 |
| 6.4.3.7 药品安全事故救济制度 |
| 7 我国转基因动物器官移植法律监管制度的构建 |
| 7.1 转基因动物器官移植基本问题介绍 |
| 7.1.1 转基因动物器官移植的概念 |
| 7.1.2 转基因动物器官移植的研究进展 |
| 7.2 我国转基因动物器官移植相关立法状况 |
| 7.3 转基因动物器官移植法律监管的必要性和紧迫性 |
| 7.4 我国转基因动物器官移植人体试验监管制度的构建 |
| 7.4.1 转基因动物器官移植人体试验的概念 |
| 7.4.2 转基因动物器官移植人体试验原则的确立 |
| 7.4.2.1 符合伦理原则(不伤害原则) |
| 7.4.2.2 知情同意原则 |
| 7.4.2.3 隐私保护原则 |
| 7.4.3 转基因动物器官移植人体试验监管的具体制度 |
| 7.4.3.1 实施主体制度 |
| 7.4.3.2 伦理审查制度 |
| 7.4.3.3 知情同意制度 |
| 7.4.3.4 受试者个人隐私保密制度 |
| 7.4.3.5 人体试验损害救济制度 |
| 7.5 我国转基因动物器官移植临床应用监管制度的构建 |
| 7.5.1 转基因动物器官移植临床应用原则的确立 |
| 7.5.1.1 技术准入原则 |
| 7.5.1.2 公平公正原则 |
| 7.5.1.3 预防与救济原则 |
| 7.5.2 转基因动物器官移植临床应用监管的具体制度 |
| 7.5.2.1 监管主体制度 |
| 7.5.2.2 技术准入制度 |
| 7.5.2.3 器官质量审查制度 |
| 7.5.2.4 器官公平分配制度 |
| 7.5.2.5 术后定期复查制度 |
| 7.5.2.6 责任追究与损害救济制度 |
| 7.5.2.6.1 责任追究制度 |
| 7.5.2.6.2 损害救济制度 |
| 8 结束语 |
| 8.1 研究结论 |
| 8.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 附录一:研究生在读期间主要学术成果 |
| 一、主要学术成果 |
| 二、参与课题研究情况 |
| 附录二:研究生在读期间主要学术活动及获奖情况 |
| 一、主要学术活动 |
| 二、获奖情况 |
| 致谢 |
（7）无抗性标记的人白血病抑制因子打靶载体的构建及表达研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 第一章 利用转基因动物生产药用蛋白的研究进展 |
| 1.1 利用动物生产药用蛋白的历史 |
| 1.2 转基因动物体系的分类 |
| 1.3 生产转基因动物的方法 |
| 1.4 转基因产物表达的优化 |
| 1.5 重组蛋白在动物乳汁中的其他作用 |
| 1.6 结论和展望 |
| 第二章 动物乳腺生物反应器的研究进展 |
| 2.1 动物乳腺生物反应器的定义 |
| 2.2 利用乳腺生物反应器生产重要特效药用蛋白的研究进展 |
| 2.3 利用转基因技术构建乳腺生物反应器生产重要特效药用蛋白的优势 |
| 2.4 利用乳腺生物反应器生产重要药用蛋白对保障人类健康的紧迫性 |
| 2.5 利用乳腺生物反应器生产白血病抑制因子的现实意义 |
| 第三章 基因打靶技术 |
| 3.1 基因打靶的定义 |
| 3.2 基因打靶技术的国内外研究现状 |
| 3.3 条件重组体系与基因打靶结合的技术优势 |
| 3.4 基因打靶技术的发展前景 |
| 试验研究 |
| 第四章 hLIF 基因打靶载体的构建及鉴定 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 材料 |
| 4.2.2 方法 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 hLIF 基因的扩增结果 |
| 4.3.2 山羊β-酪蛋白基因5′和3′端同源臂的扩增结果 |
| 4.3.3 neo 和tk 基因的扩增结果 |
| 4.3.4 山羊β-酪蛋白基因座通用打靶载体pLoxP-NT53 的酶切鉴定 |
| 4.3.5 hLIF 基因打靶载体pLoxP-NT53L 的酶切鉴定 |
| 4.3.6 Cre/LoxP 系统有效性的检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 奶山羊乳腺上皮细胞的培养、转染及阳性克隆的筛选 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 材料 |
| 5.2.2 方法 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 奶山羊乳腺上皮细胞培养结果 |
| 5.3.2 奶山羊乳腺上皮细胞抗性筛选浓度测定实验结果 |
| 5.3.3 重组质粒转染奶山羊乳腺上皮细胞筛选结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 阳性克隆的检测 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 材料 |
| 6.2.2 方法 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 阳性克隆的PCR 检测结果 |
| 6.3.2 阳性克隆的实时定量PCR 检测结果 |
| 6.3.3 阳性克隆的hLIF 蛋白Western blotting 检测结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论、创新点及不足之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（8）转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略语中英文对照 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 哺乳动物体细胞核移植研究进展 |
| 1 哺乳动物体细胞核移植技术的发展 |
| 2 哺乳动物体细胞核移植的基本技术环节 |
| 2.1 供体细胞的选择 |
| 2.2 核受体胞质的准备 |
| 2.3 供体细胞和受体细胞的重组 |
| 2.4 重构胚的激活 |
| 2.5 重构胚的培养 |
| 3 哺乳动物体细胞核移植有关机理研究进展 |
| 3.1 受体细胞和供体细胞的核质互作 |
| 3.2 体细胞供体核的表观重编程 |
| 4 体细胞核移植技术存在的问题与应用前景 |
| 4.1 体细胞细胞核移植技术存在的问题 |
| 4.2 应用前景 |
| 参考文献 |
| 第二章 转基因动物乳腺生物反应器生产重组药用蛋白的研究进展 |
| 1 转基因动物制药的诞生 |
| 1.1 细菌基因工程药物阶段 |
| 1.2 细胞基因工程药物阶段 |
| 1.3 转基因动物制药阶段 |
| 2 动物乳腺生物反应器的研究简史 |
| 3 乳腺生物反应器的分类 |
| 3.1 啮齿动物乳腺生物反应器 |
| 3.2 反刍动物乳腺生物反应器 |
| 4 乳腺生物反应器表达载体构建的研究 |
| 4.1 与乳腺组织特异性表达有关的调控元件 |
| 4.2 基于普通质粒的表达载体 |
| 4.3 基于人工染色体的表达载体 |
| 4.4 基于基因打靶的表达载体 |
| 5 乳腺生物反应器的制作技术及新方法进展 |
| 5.1 原核期胚胎的显微注射法 |
| 5.2 转座子介导法 |
| 5.3 逆转录病毒介导法 |
| 5.4 精子载体法 |
| 5.5 胚胎干细胞介导法 |
| 5.6 原始生殖细胞介导法 |
| 5.7 转基因克隆动物法 |
| 5.8 体细胞基因打靶制备乳腺生物反应器 |
| 5.9 诱导多能干细胞基因打靶制备乳腺生物反应器 |
| 6 乳腺生物反应器的鉴定 |
| 6.1 DNA水平的检测 |
| 6.2 RNA水平的检测 |
| 6.3 目的蛋白的检测 |
| 7 转基因乳腺生物反应器存在的问题 |
| 参考文献 |
| 第二部分 试验研究 |
| 第三章 人溶酶体β-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在COS7细胞中的表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 人胎盘组织总RNA的完整性 |
| 2.2 GlcCerase cDNA的扩增 |
| 2.3 GlcCerase序列分析结果 |
| 2.4 pEGFP-GlcCerase重组质粒的构建与鉴定 |
| 2.5 荧光显微镜观察COS7细胞中GFP基因的表达 |
| 2.6 转染COS7细胞中GlcCerase基因的mRNA表达 |
| 2.7 转染COS7细胞中GlcCerase基因的蛋白表达 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 人GleCerase基因乳腺表达载体的构建及其在乳腺上皮细胞中的表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 乳腺特异性表达载体的鉴定 |
| 2.2 HC-11细胞的转染与鉴定 |
| 2.3 GlcCerase基因在转基因HC-11细胞中的诱导表达 |
| 3 讨论 |
| 3.1 乳腺特异表达载体的构建 |
| 3.2 乳腺特异表达载体的验证手段 |
| 3.3 乳腺上皮细胞合成乳蛋白的可能机制 |
| 参考文献 |
| 第五章 奶山羊胎儿成纤维细胞的分离培养及脂质体法转染研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 奶山羊胎儿成纤维细胞的一般形态观察 |
| 2.2 胎儿细胞性别鉴定 |
| 2.3 胎儿细胞生长曲线分析 |
| 2.4 胎儿细胞核型分析 |
| 2.5 胎儿细胞转染效率的优化 |
| 3 讨论 |
| 3.1 供体细胞的原代培养与生物学特性分析 |
| 3.2 脂质体转染体细胞效率的优化 |
| 参考文献 |
| 第六章 转人GlcCerase基因奶山羊胎儿成纤维细胞的建立 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 细胞抗性试验 |
| 2.2 外源基因转染山羊胎儿成纤维细胞 |
| 2.3 稳定转染细胞的PCR鉴定 |
| 2.4 转基因细胞的生长曲线 |
| 2.5 转基因细胞的核型分析 |
| 3 讨论 |
| 3.1 转基因阳性细胞克隆的分离 |
| 3.2 转基因阳性细胞的筛选 |
| 3.3 转基因供体细胞的染色体倍性 |
| 参考文献 |
| 第七章 转人GlcCerase基因奶山羊克隆胚的构建及胚胎移植 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 山羊卵母细胞的体外成熟培养 |
| 2.2 山羊转基因体细胞的核移植 |
| 2.3 转基因体细胞克隆胚的体外培养与发育 |
| 2.4 转基因体细胞克隆胚的PCR检测 |
| 2.5 山羊转基因克隆胚的胚胎移植 |
| 3 讨论 |
| 3.1 转染和筛选对转基因克隆胚胎发育的影响 |
| 3.2 技术操作过程对核移植效率的影响 |
| 3.3 重构胚胎培养体系 |
| 参考文献 |
| 第八章 外源基因转染对奶山羊供体细胞生物学特性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 培养细胞的形态与生长曲线 |
| 2.2 稳定转染细胞的PCR鉴定 |
| 2.3 外源基因转染对细胞周期分布的影响 |
| 2.4 外源基因转染对细胞凋亡的影响 |
| 2.5 外源基因转染对细胞基因表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 3.1 外源基因转染对奶羊体细胞周期分布和细胞凋亡的影响 |
| 3.2 外源基因转染对奶羊体细胞基因相对表达水平的影响 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 进一步研究的内容 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（9）动物乳腺生物反应器（论文提纲范文）
| 1 什么是动物乳腺生物反应器 |
| 2 动物乳腺生物反应器的研究发展简史 |
| 3 动物乳腺生物反应器生产药物蛋白的特点 |
| 3.1 生产成本低,周期短 |
| 3.2 产品产量高,易纯化 |
| 3.3 产品活性高,无污染 |
| 3.4 外源基因可稳定遗传,产品利润高 |
| 4 存在的主要问题 |
| 5 开发应用前景 |
（10）人抗凝血酶Ⅲ的cDNA克隆、表达、纯化及其重组蛋白对DIC大鼠模型的疗效研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 重组药用蛋白的表达纯化研究进展 |
| 1.1 重组药用蛋白的表达 |
| 1.1.1 细菌内表达重组蛋白 |
| 1.1.2 哺乳动物细胞培养表达重组蛋白 |
| 1.1.3 植物生物反应器表达重组蛋白 |
| 1.1.4 动物乳腺反应器表达重组蛋白 |
| 1.2 重组药用蛋白的纯化 |
| 1.2.1 样品准备与预处理 |
| 1.2.2 层析技术 |
| 1.2.3 其他方法 |
| 第二章 腺病毒及其载体研究进展 |
| 2.1 腺病毒的生物学特性 |
| 2.1.1 形态结构 |
| 2.1.2 感染周期 |
| 2.1.3 编码基因的转录与复制 |
| 2.2 重组腺病毒载体的构建 |
| 2.2.1 第一代腺病毒载体的构建 |
| 2.2.2 第二代腺病毒载体构建 |
| 2.2.3 第三代腺病毒载体构建 |
| 2.3 腺病毒作为基因工程载体的优势 |
| 2.3.1 宿主细胞种类多，安全性能相对好 |
| 2.3.2 增殖能力强，表达谱广，外源基因表达水平高 |
| 2.3.3 与人类基因同源，无插入致突变性 |
| 第三章 人抗凝血酶(hAT)研究进展 |
| 3.1 hAT 的结构、功能与缺陷症 |
| 3.1.1 hAT 的结构 |
| 3.1.2 AT 的抗凝血功能 |
| 3.1.3 AT 的其它生理功能 |
| 3.1.4 AT 缺陷症 |
| 3.2 rhAT 的表达与分离纯化研究进展 |
| 3.2.1 hAT 基因表达研究进展 |
| 3.2.2 AT 蛋白的分离纯化研究进展 |
| 3.3 对AT 进一步研究的意义 |
| 第四章 hAT cDNA 序列的克隆及其表达载体构建 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 hAT 全长cDNA 的扩增与序列分析 |
| 4.2.2 hAT 表达载体及穿梭载体的构建 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 hAT 基因序列的分离、克隆 |
| 4.3.2 hAT 表达载体的构建 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 细菌内同源重组获得重组腺病毒载体的研究 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 穿梭载体的线性化 |
| 5.2.2 重组腺病毒载体的鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 重组腺病毒载体的构建方法 |
| 5.3.2 细菌内同源重组法构建重组腺病毒载体的优势 |
| 5.3.3 影响大质粒转化的因素 |
| 5.3.4 二次转化提高细菌内同源重组的成功率 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 rhAT 在体外培养的羊乳腺上皮细胞中的表达研究 |
| 6.1 材料和方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 重组腺病毒的包装 |
| 6.2.2 重组腺病毒的扩增 |
| 6.2.3 重组腺病毒的纯化和滴度测定 |
| 6.2.4 重组腺病毒介导rhAT 在羊乳腺上皮细胞中的表达 |
| 6.2.5 重组表达质粒p3AT 介导rhAT 在羊乳腺上皮细胞内的表达 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 腺病毒的生活周期 |
| 6.3.2 影响腺病毒构建的主要因素 |
| 6.3.3 腺病毒载体介导的rhAT 在乳腺上皮细胞中的表达 |
| 6.3.4 表达质粒介导的rhAT 在乳腺上皮细胞中的表达 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 rhAT 在山羊乳腺内的表达以及重组蛋白纯化研究 |
| 7.1 材料和方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 羊乳腺感染病毒后rhAT 的表达 |
| 7.2.2 羊乳中的rhAT 的活性分析 |
| 7.2.3 羊乳中rhAT 的分离纯化 |
| 7.3 讨论 |
| 7.3.1 动物乳腺生物反应器表达重组蛋白的优势 |
| 7.3.2 转基因动物乳腺生物反应器 |
| 7.3.3 以腺病毒为载体构建非转基因动物乳腺生物反应器 |
| 7.3.4 肝素琼脂糖凝胶亲和层析法分离rhAT |
| 7.4 小结 |
| 第八章 rhAT 对 DIC 大鼠模型的疗效研究 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.1.1 材料 |
| 8.1.2 方法 |
| 8.2 结果与分析 |
| 8.2.1 动物模型的建立 |
| 8.2.2 rhAT 对DIC 大鼠血浆中六项DIC 指标的作用效果 |
| 8.2.3 大鼠对LPS 的抵抗作用观察 |
| 8.3 讨论 |
| 8.3.1 LPS 的建模机理 |
| 8.3.2 大鼠对LPS 的抵抗作用 |
| 8.3.3 rhAT 对DIC 大鼠的治疗作用 |
| 8.4 小结 |
| 结论及创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
四、转基因动物生产药用蛋白研究现状（论文参考文献）
- [1]输卵管特异性表达γ-IFN的转基因鸡初探[D]. 徐闰. 广西大学, 2019(01)
- [2]转基因动植物生物反应器研究进展及应用现状[J]. 廖莎,李国玲,吴珍芳,李紫聪. 广东农业科学, 2018(11)
- [3]乳腺生物反应器在生物制药领域研究进展[J]. 毛婕. 西部皮革, 2016(06)
- [4]转基因动物生物反应器研究及产业化进程[J]. 商圣哲,赵杰,李宁. 生物产业技术, 2014(01)
- [5]转基因鸡输卵管生物反应器生产药用蛋白研究进展[J]. 宋政,牛俊伟,孙晓先,龚道清. 中国家禽, 2013(19)
- [6]我国转基因动物产业化法律监管制度研究[D]. 耿宁. 华中农业大学, 2011(08)
- [7]无抗性标记的人白血病抑制因子打靶载体的构建及表达研究[D]. 王韵斐. 西北农林科技大学, 2011(04)
- [8]转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究[D]. 张艳丽. 南京农业大学, 2010(06)
- [9]动物乳腺生物反应器[J]. 刘静. 生物学教学, 2009(12)
- [10]人抗凝血酶Ⅲ的cDNA克隆、表达、纯化及其重组蛋白对DIC大鼠模型的疗效研究[D]. 杨海. 西北农林科技大学, 2009(10)