一、携TGFβ1正、反义基因载体对膀胱癌细胞体外生长的作用（论文文献综述）
廖新惠[1]（2021）在《LncRNA LOWEG通过miR-629/LIFR轴抑制膀觥癌进展的分子机制研究》文中研究表明研究背景和目的:膀胱癌（bladder cancer,BC）是泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤,特点是高复发和浸润进展。10%-20%浅表性膀胱癌会进展为肌层浸润性膀胱癌,肌层浸润性膀胱癌5年生存率<50%。因此,揭示膀胱癌的侵袭转移机制,寻找肿瘤特异性标志物和治疗靶点,应用于膀胱癌的精准治疗迫切重要。研究表明长链非编码RNA（LncRNA）在转录调控、肿瘤发生发展中发挥着重要作用。前期通过对膀胱癌及对应的癌旁正常组织进行高通量测序,筛选了一批LncRNA,发现LOWEG在膀胱癌中的表达有显着差异。LOWEG是一种新发现的LncRNA,首次被发现是在胃肠道肿瘤中。目前LOWEG在膀胱癌中迁移、侵袭的机制尚不清楚。本研究探讨LOWEG在膀胱癌中的表达水平,与膀胱癌患者临床病理特征的相关性;LOWEG对膀胱癌细胞迁移、侵袭、增殖能力及EMT的影响;LOWEG抑制膀胱癌进展的分子机制研究。方法:1.采用RT-qPCR测定LOWEG在膀胱癌组织和膀胱癌细胞中的表达水平,分析LOWEG的表达水平与膀胱癌患者临床病理征的关系。2.通过感染LOWEG慢病毒载体,构建稳转过表达LOWEG的膀胱癌细胞株,采用划痕实验、Transwell实验、CCK-8实验、Edu实验和Western Blot检测LOWEG过表达对膀胱癌细胞迁移、侵袭、增殖能力及EMT的影响。3.通过免疫组化、RT-qPCR检测LIFR在膀胱癌组织及膀胱癌细胞中的表达。通过RT-qPCR、Western Blot检测膀胱癌细胞中LOWEG和LIFR关系。通过高通量测序和生物信息学软件预测、RT-qPCR检测寻找膀胱癌细胞中LOWEG和LIFR可能靶向结合的miRNA。采用RT-qPCR、双荧光素酶报告基因实验、Western Blot检测LOWEG、miRNA和LIFR的作用关系。4.通过Transwell实验检测LIFR对膀胱癌细胞迁移、侵袭的影响。通过Transwell实验检测沉默LIFR对过表达LOWEG的膀胱癌细胞迁移、侵袭的影响。结果:1.膀胱癌组织中LOWEG的表达低于癌旁正常组织。膀胱癌细胞中LOWEG的表达低于人正常膀胱上皮细胞。LOWEG表达水平与患者的性别、组织学分级、肿瘤T分期、T3-T4期患者的淋巴结转移存在相关性,而与患者的年龄、肿瘤大小等临床病理特征无明显相关性。2.过表达LOWEG抑制膀胱癌细胞的迁移、侵袭和EMT,对膀胱癌细胞增殖没有影响。3.LIFR在膀胱癌中低表达。过表达LOWEG促进LIFR在膀胱癌细胞中的表达,LOWEG与LIFR在膀胱癌中的表达呈正相关关系。LOWEG作为miR-629的分子海绵正向调控LIFR的表达。4.LIFR抑制膀胱癌细胞的迁移、侵袭。沉默LIFR逆转LOWEG对膀胱癌细胞迁移和侵袭的抑制。结论:LOWEG在膀胱癌组织和膀胱癌细胞中低表达。LOWEG作为miR-629分子海绵调控LIFR的表达,进而抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭。研究结果表明LOWEG有望作为膀胱癌的治疗的靶点。
黄骥[2]（2021）在《LINC00858在膀胱癌中的作用和机制研究》文中认为全球范围内,膀胱癌是最常见的癌症之一。由于膀胱癌存在治疗后易复发进展等特点,目前膀胱癌患者的死亡率高、5年生存率仍然较低,有必要对膀胱癌的发病机制进行更深入研究,以探索膀胱癌的新治疗靶点,进一步提高对膀胱癌的治疗效果。已有报道长链非编码RNA 00858（LINC00858）为多种癌症疾病的致癌基因,包括骨肉瘤和结直肠癌等。在这些恶性肿瘤中,LINC00858被发现可以诱导肿瘤进展和转移,已成为多个针对肿瘤诊断治疗的生物标志物和新靶点的研究热点。然而,LINC00858在膀胱癌中的表达和功能尚不清楚。本课题拟研究LINC00858在膀胱癌发生和发展中的作用及机制,有望为开发治疗膀胱癌的新靶点及药物提供理论依据。第一部分:LINC00858在膀胱癌发展中的作用研究目的:分析LINC00858在膀胱癌肿瘤组织和细胞中的表达,并探索LINC00858对膀胱癌恶性生物学功能的作用。方法:RT-qPCR法检测LINC00858在膀胱癌组织和癌旁正常组织表达差异,以及在膀胱癌细胞系（5637、T24和J82）和膀胱上皮细胞系（SV-HUC-1）中的表达差异。核质分离实验分析LINC00858在膀胱癌细胞的细胞核、细胞质表达情况。通过基因干扰技术,敲低膀胱癌细胞LINC00858的表达,使用CCK-8实验、克隆形成实验、划痕愈合实验和transwell小室实验检测细胞增殖、迁移和侵袭变化情况。结果:LINC00858在膀胱癌组织表达显着高于癌旁正常组织（P<0.001）,在膀胱癌细胞系中的表达显着高于正常人膀胱上皮细胞系（P均<0.01）。LINC00858主要表达于细胞质中。敲低膀胱癌细胞的LINC00858表达后可显着抑制细胞的增殖活性,并降低细胞迁移和侵袭能力。结论:LINC00858在膀胱癌中高表达,可能介导膀胱癌的恶性生物学功能。第二部分:LINC00858在膀胱癌进展中的机制研究目的:探索LINC00858在调控膀胱癌发生、发展中的分子作用机制。方法:通过starbasev2.0进行生物信息学分析预测与LINC00855结合的miRNA以及下游靶基因。在分子水平上,采用双荧光素酶报告子和RNA免疫沉淀法（RIP）鉴定LINC00858、miR-3064-5p和CTGF（结缔组织生长因子）之间的相互作用。通过基因干扰、基因过表达技术,使用CCK-8实验、克隆形成实验、划痕愈合实验和transwell小室实验验证LINC00858与miR-3064-5p/CTGF之间的作用关系。结果:LINC00858在膀胱癌细胞直接靶向作用于miR-3064-5p。抑制miR-3064-5p可促进膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。RIP实验结果显示,CTGF是miR-3064-5p的直接靶点。miR-3064-5p模拟物可显着降低膀胱癌细胞CTGF的表达,但可被LINC00858的过表达恢复。LINC00858的过表达可显着增强膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而沉默CTGF基因后可拮抗上述生物学行为。结论:LINC00858作为一种竞争性RNA,通过隔离miR-3064-5p提高癌基因CTGF的表达水平,从而介导膀胱癌恶性生物学能力。LINC00858/miR-3064-5p/CTGF信号轴可能是膀胱癌发生、发展的重要通路。
张丽霞[3]（2020）在《长链非编码RNA LINC00963抑制角膜纤维化瘢痕形成的机制研究》文中研究说明目的:角膜严重损伤后容易诱发角膜纤维化瘢痕的形成,严重影响视力。受创面转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）刺激暴露的角膜基质细胞转分化为肌成纤维细胞的形成被认为是角膜瘢痕形成的根本原因。非编码RNA在很多器官的纤维化形成中发挥着重要作用,但其在角膜纤维化瘢痕中的研究罕见报道。本研究旨在探讨TGF-β1诱导的角膜纤维化细胞模型中,长链非编码RNA（long noncoding RNA,LncRNA）LINC00963调控角膜纤维化瘢痕形成的作用和机制。方法:本研究的研究对象为人角膜基质细胞系,参阅最新的文献,采用2 ng/mL的TGF-β1以特定的时间梯度给药刺激构建角膜纤维化瘢痕的细胞模型;实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR）从mRNA水平检测角膜纤维化的特异性标志物α-平滑肌肌动蛋白（alpha-sooth muscle actin,α-SMA）的表达水平,以表达水平的差异变化来验证模型是否构建成功;检测纤维化的角膜基质细胞对比正常角膜基质细胞LINC00963的差异表达;蛋白免疫印记实验（Western blot,WB）从蛋白水平检测α-SMA的表达;免疫荧光实验检测α-SMA的细胞定位和表达;构建LINC00963的过表达质粒,检测过表达LINC00963时对纤维化的影响,以此来验证LINC00963在抑制角膜纤维化瘢痕形成中的作用;生物信息学网站starBase预测LINC00963靶向的下游mi RNA,然后通过荧光素酶报告基因系统验证他们的相互作用关系。最后,设计并合成下游miRNA的激动剂（agomir）和抑制剂（antagomir）,通过qRT-PCR和WB实验验证其在角膜纤维化瘢痕的作用。结果:（1）2 ng/mL的TGF-β1处理人角膜基质细胞24 h后,纤维化标志物α-SMA在mRNA和蛋白水平表达均升高,证明角膜纤维化的细胞模型构建成功。（2）在TGF-β1处理0 h、6 h、12 h及24 h后,LINC00963的表达量随着时间推移逐渐降低,说明在TGF-β1处理建立的角膜纤维化模型中LINC00963可能具有潜在的调控作用。（3）过表达LINC00963能逆转TGF-β1诱导的α-SMA表达的升高,证明了LINC00963可以抑制角膜纤维化。（4）生物信息学starBase网站预测到LINC00963存在与miR-143-3p种子区域的潜在结合位点,荧光素酶报告基因系统验证了他们的结合,说明LINC00963可能通过结合mi R-143-3p来发挥抑制作用。（6）在TGF-β1处理0 h、6 h、12 h及24 h后,miR-143-3p随着时间推移表达量逐渐升高,且过表达miR-143-3p可促进角膜基质细胞α-SMA的表达,敲低miR-143-3p会抑制α-SMA的表达,进一步证明了LIN00963通过结合miR-143-3p来达到抑制的目的。结论:在TGF-β1诱导的角膜基质细胞向肌成纤维细胞转分化的过程中,LINC00963表达下调,而过表达LINC00963可以抑制这种转分化,从而防止角膜纤维化瘢痕形成,证明LINC00963在角膜纤维化瘢痕的形成过程中起明显的抑制作用,其主要是通过靶向miR-143-3p来抑制miR-143-3p对角膜纤维化瘢痕的促进作用而发挥抑制作用的。
印胡滨[4]（2020）在《膀胱癌进展和预后基因模型的构建以及CTHRC1在膀胱癌进展中的作用及机制研究》文中提出第一部分构建基于13-MRNA模型预测膀胱癌疾病进展和预后目的:目前尚缺乏可靠的标准来评价非肌肉浸润性膀胱癌的进展风险。本研究的目的是寻找基于基因表达谱的潜在生物学标志物,以更好地预测膀胱癌患者疾病进展和预后。方法:利用GEO芯片中的转录组表达谱数据,鉴定原发性非肌层浸润性膀胱癌和进展性膀胱癌间的差异基因,随后通过单因素COX回归分析和LASSO回归分析构建基于mRNA的预测模型。采用ROC曲线评价模型诊断效能。采用Kaplan-Meier曲线、单因素和多因素COX回归分析基因模型与膀胱癌预后的相关性。采用基因模型联合其他临床病理参数构建列线图。通过GSEA基因集富集分析与基因模型相关的分子生物学功能和信号通路。构建蛋白质蛋白质相互作用网络,寻找模型中的关键基因。结果:通过差异分析和单因素分析,筛选出47个预后相关的mRNA,使用LASSO回归方法构建出基于13-mRNA的与进展相关的预测模型。根据13基因的特征,将患者分为具有不同预后结果的高风险和低风险组。另一独立的GEO芯片和TCGA队列验证后发现13-mRNA评分模型具有良好的诊断和预后预测价值,多因素COX分析发现13基因模型是总生存期的独立预后因素。ROC分析表明,相较于其他已报道的预测标记物,该模型在验证集中表现更好。基于13基因模型建立的列线图可以很好地预测NMIBC的进展。GSEA分析发现“趋化因子信号传导途径”,“FOXM1途径”,“上皮间质转化”,“炎症反应”等通路富集在高风险组。蛋白质相互作用网络中CTHRC1,MMP11,AEBP1,SNCAIP,COL1A1和S100A8被确定为中心基因。结论:基于13-mRNA的预测模型有助于更好地预测膀胱癌疾病进展和预后,并可能作为膀胱癌治疗的潜在靶点或成为膀胱癌早期筛查的重要生物学标记物。第二部分CTHRC1促进膀胱癌侵袭转移及其分子机制目的:探究CTHRC1在不同类型膀胱癌中表达水平,通过体内外功能实验研究CTHRC1在膀胱癌细胞中发挥的生物学功能及其相关的信号通路。方法:利用公共数据库,联合免疫组化、RT-q PCR、Western blot等方法分析人膀胱癌和癌旁组织,以及人膀胱癌细胞系和正常尿路上皮细胞中CTHRC1表达水平。通过卡方检验分析CTHRC1与临床病理特征的相关性。通过Kaplan-Meier曲线和单因素、多因素COX回归分析CTHRC1对总生存期的影响。通过RNAi和慢病毒载体对膀胱癌细胞CTHRC1水平进行干扰或稳定过表达,利用细胞划痕实验和Transwell法检测CTHRC1对膀胱癌细胞迁移侵袭的影响。构建尾静脉转移瘤模型评价CTHRC1对膀胱癌细胞体内肺转移的影响。GSEA分析预测CTHRC1相关的潜在分子机制。Western blot检测相关信号通路的改变及其功能。结果:TCGA测序数据和Array Express芯片数据分析、免疫组化、RT-q PCR和Western blot结果发现,相较于正常尿路上皮和非肌层浸润性膀胱癌组织和细胞,CTHRC1在肌层浸润性膀胱癌组织和细胞中表达显着上调。CTHRC1过表达与患者TNM分期（P<0.001）、p T分期（P=0.010）和p N分期（P=0.002）密切相关。高CTHRC1表达组中患者总生存期OS明显比低表达组更短（HR=3.23,95%CI:1.825.73,P<0.001）。多因素COX回归分析发现,CTHRC1是预测膀胱癌患者OS（HR=2.91,95%CI:1.545.50,P=0.001）的独立预后因素。随后的细胞功能实验显示,干扰CTHRC1表达后膀胱癌细胞迁移侵袭能力减弱,而过表达CTHRC1则可增强体外膀胱癌细胞恶性生物学行为,并促进膀胱癌细胞体内肺转移能力。GSEA分析显示,细胞黏着斑激酶和FAK通路富集到高CTHRC1表达组。Western blot证实重组CTHRC1可促进膀胱癌细胞FAK和ERK1/2通路发生磷酸化,运用特异性抑制剂阻断FAK和ERK1/2后CTHRC1诱导的细胞迁移侵袭力减弱,伴随MMP9转录水平降低。结论:相较于正常尿路上皮和低浸润性膀胱癌,CTHRC1在浸润性膀胱癌中表达上调。CTHRC1表达与膀胱癌的预后密切相关,且可作为膀胱癌的独立预后因素。调控CTHRC1可影响膀胱癌细胞侵袭转移能力。在机制方面,CTHRC1可激活黏着斑激酶的关键蛋白phospho-FAK及其下游的phospho-ERK1/2,CTHRC1诱导的膀胱癌细胞侵袭转移是由FAK和ERK1/2信号通路介导。第三部分CTHRC1表达上调的上游调控机制目的:深入研究调控CTHRC1转录活性的上游分子机制,阐明CTHRC1在膀胱癌中表达上调的原因。方法:数据库分析CTHRC1与TGFB1相关性。RT-q PCR和Western blot检测TGF-β1对CTHRC1表达的影响。JASPAR和PROMO预测与CTHRC1启动子区域结合的转录因子。pc DNA3.1-Sp1质粒转染膀胱癌UMUC-3细胞后检测CTHRC1表达变化。双荧光素酶报告基因实验、Ch IP、RT-q PCR和Western blot实验探究Sp1与CTHRC1启动子的结合以及TGF-β1对二者结合的作用。结果:对TCGA来源的测序数据进行相关性分析,发现CTHRC1与TGFB1表达呈正相关,Spearman相关系数为0.41。不同浓度的TGF-β1处理UMUC-3细胞后CTHRC1 m RNA和蛋白表达水平增加。JASPAR和PROMO预测发现CTHRC1启动子区域存在Sp1结合元件。转染Sp1后UMUC-3细胞CTHRC1 m RNA和蛋白表达水平较Vector对照组升高。Ch IP证实Sp1与CTHRC1启动子区域存在结合。双荧光素酶报告基因实验发现转染Sp1可增加荧光素酶活性,缺失突变后Sp1诱导的荧光素酶活性减弱。使用特异性抑制剂降低Sp1表达后TGF-β1诱导的CTRHC1表达水平下降。相较于对照组,TGF-β1刺激增强荧光素酶活性以及Sp1与DNA的结合能力。结论:TGF-β1诱导膀胱癌细胞CTHRC1表达。Sp1可与CTHRC1启动子区域结合,导致转录激活。TGF-β1通过Sp1依赖途径增强CTHRC1转录活性。
曾凯旋[5]（2020）在《环状RNA circANKS1B促进乳腺癌细胞上皮间质转化及侵袭转移的作用机制研究》文中研究说明背景和目的乳腺癌（Breast cancer,BC）是全世界女性中最常见的恶性肿瘤之一,同时也是引起女性死亡的主要原因之一。据统计,全球每年大约有120万人确诊为乳腺癌,并且有50万人死于乳腺癌。乳腺癌发病机制复杂,病理类型较多,其中以三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）的恶性程度最高（雌激素受体、孕激素受体和原癌基因HER2均为阴性）,占所有乳腺癌的15%-20%。因其发病机制尚未明确,BC诊断与治疗一直难以取得突破性进展。因此,深入探讨BC发生发展过程中关键基因的失调及其潜在的作用机制,将为临床诊断和治疗提供新的思路和靶标。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类新型的内源性单链RNA,呈封闭环状结构,对核酸外切酶高度抵抗,表达稳定,不易降解。研究发现肿瘤中存在着大量失调的circRNA,其和肿瘤的增殖,迁移,侵袭以及耐药等恶性生物学行为密切相关。CircRNA在肿瘤发生发展中的作用机制已然成为肿瘤分子生物学领域新的研究热点。然而,其在BC中的表达特性以及潜在的生物学功能还知之甚少。为了寻找BC中失调的circRNA,我们在3对TNBC和癌旁正常组织中进行circRNA高通量测序,一共发现了69815个circRNA,其中5033个差异表达的circRNA（倍数≥2,p<0.05）。通过实验验证,我们选择差异表达变化最大的hsacirc0007294（circANKS1B）进行后续研究,探讨其对BC生物学行为的影响及具体的作用机制,为其成为新型的BC生物学标志物及治疗靶点提供可靠的理论依据。本课题主要分以下六个部分进行:第一部分CircANKS1B的鉴定及其临床意义方法:1.在3对TNBC和癌旁正常新鲜冰冻组织中进行circRNA高通量测序,使用Top Hat2,SRPBM,Audics以及R语言软件分析circRNA表达。2.qRT-PCR在20对TNBC和癌旁正常新鲜冰冻组织中验证circRNA高通量测序结果。3.设计divergent和convergent引物进行RT-PCR实验,扩增产物跑琼脂糖胶以及进行Sanger测序,证实circANKS1B的存在。4.用Actinomycin D和RNase R分别处理BC细胞系,检测circANKS1B的半衰期和稳定性;进行FISH实验确定circANKS1B的细胞亚定位。5.qRT-PCR在40例正常和165例BC石蜡包埋组织中检测circANKS1B表达水平,收集BC患者的临床病理信息以及进行随访,分析circANKS1B表达与BC患者病理特征和预后的相关性。结果:1.乳腺组织中存在大量的circRNA（69815个）,87%的circRNA来源于外显子的反向剪接,其中有5033个差异表达的circRNA（3726个下调,1307个上调）。2.和正常组织相比,circANKS1B在TNBC组织中表达差异倍数最大,上调了5.8倍。3.CircANKS1B是由ANKS1B外显子5到8反向剪接产生的,成熟全长为459bp。4.CircANKS1B的半衰期超过24小时,并且对RNase R酶高度抵抗,其主要定位于细胞质。5.相比于BC其他的亚型,circANKS1B只在TNBC中过表达,并且和BC病人的淋巴结转移和TNM分期密切相关,是BC病人总体生存率独立的危险预后因子。结论:细胞质定位的circANKS1B在TNBC中显着上调,并且预示预后不良。第二部分CircANKS1B对BC细胞生物学行为的影响方法:1.qRT-PCR检测正常乳腺上皮MCF-10A细胞和BC细胞系中circANKS1B的表达水平,构建circANKS1B过表达和敲低慢病毒载体,选择circANKS1B表达低的MCF-7和T47D细胞感染circANKS1B过表达慢病毒载体;选择表达高的MDA-MB-231和BT549细胞感染敲低载体。2.CCK-8/EdU和流式细胞术检测circANKS1B对BC细胞增殖和凋亡的影响;划痕和Transwell实验检测circANKS1B对BC细胞迁移和侵袭的影响。3.从裸鼠皮下和尾静脉分别注射circANKS1B稳定过表达/敲低的BC细胞,构建异种移植瘤模型和肺转移模型,观察circANKS1B在体内对BC细胞生长和转移的影响。4.Western blot和免疫荧光检测circANKS1B稳定过表达/敲低的BC细胞系中E-cadherin、Vimentin和Fibronectin蛋白的表达水平。结果:1.和非TNBC细胞系相比,circANKS1B在TNBC细胞系中表达显着上调;qRT-PCR证实了circANKS1B稳定过表达/敲低细胞系构建成功。2.CircANKS1B在体外促进BC细胞迁移和侵袭,但对细胞增殖和凋亡无影响。3.CircANKS1B在体内促进BC细胞肺转移,但对肿瘤的生长无影响。4.CircANKS1B上调了Vimentin和Fibronectin的表达,下调了E-cadherin的表达。结论:CircANKS1B促进BC细胞侵袭转移以及诱导EMT。第三部分CircANKS1B作为miR-148a/152-3p分子海绵调控USF1方法:1.运用CircNet数据库预测和circANKS1B相互作用的miRNAs;RIP,RNA pull-down以及荧光素酶报告基因实验验证数据库预测结果。2.FISH实验检测circANKS1B和miR-148a-3p,miR-152-3p之间是否存在共定位。3.Transwell实验检测BC细胞过表达miR-148a/152-3p及同时过表达circANKS1B后侵袭能力的变化。4.运用miRWalk数据库预测miR-148a-3p和miR-152-3p下游靶基因,qRT-PCR和荧光素酶报告基因实验验证数据库预测结果。5.Western blot实验检测BC细胞过表达miR-148a/152-3p及同时过表达circANKS1B后USF1蛋白表达水平。6.免疫组化检测USF1在40例正常和165例BC石蜡组织中的表达水平,并分析其与circANKS1B表达、BC患者临床病理特征和预后的相关性。结果:1.CircANKS1B在BC细胞中绑定miR-148a-3p和miR-152-3p。2.CircANKS1B和miR-148a/152-3p之间存在共定位。3.过表达miR-148a-3p或miR-152-3p减弱了BC细胞的侵袭能力及下调了USF1的表达,但这一效应被circANKS1B过表达所阻断。4.USF1在BC组织中显着上调,并与淋巴结转移和不良预后密切相关。5.BC组织中USF1和circANKS1B的表达之间呈强正相关。结论:CircANKS1B通过吸附miR-148a-3p或miR-152-3p,上调USF1的表达,促进BC侵袭和转移。第四部分USF1转录上调TGF-β1方法:1.qRT-PCR和Western blot实验分别检测BC细胞中过表达/敲低USF1后TGF-β1的m RNA和蛋白表达水平。2.分析TCGA-BC数据库中USF1和TGF-β1表达的相关性。3.Ch IP和荧光素酶报告基因实验检测USF1是否作用于TGF-β1启动子区。4.Transwell实验检测BC细胞过表达/敲低USF1及同时敲低/过表达TGF-β1后侵袭能力的变化。结果:1.过表达USF1上调了TGF-β1表达,而敲低USF1下调了TGF-β1表达。2.TCGA-BC数据库中USF1和TGF-β1表达之间呈显着地正相关。3.USF1直接绑定在TGF-β1启动子区-962到-956的E-box序列（CACGTG）,增强TGF-β1启动子活性。4.过表达/敲低USF1明显增强/减弱了BC细胞的侵袭能力,但这一效应被TGF-β1敲低/过表达所阻断。结论:在BC中,TGF-β1是USF1直接下游靶基因。第五部分ESRP1促进circANKS1B产生,同时受USF1转录调控方法:1.运用siRNA系统筛选影响circ ANK1B产生的RNA结合蛋白。构建ESRP1过表达载体,转染BC细胞系,qRT-PCR检测circANKS1B的表达水平。2.构建circANKS1B两侧内含子区ESRP1结合位点突变的minigene载体,转染BC细胞系,RIP实验检测ESRP1结合情况,以及qRT-PCR实验检测同时转染ESRP1siRNA后circANKS1B的表达水平。3.免疫组化检测ESRP1在165例BC石蜡组织中的表达,统计其与circANKS1B表达的相关性。4.构建带有ESRP1绑定位点的SYT8和Snail minigene载体,转染BC细胞系,进行RT-PCR实验,扩增产物跑琼脂糖胶以及进行Sanger测序,检测ESRP1是否可以促进其他pre-m RNA成环。5.Ch IP实验检测USF1是否可以直接绑定到ESRP1启动子区,Western blot实验检测过表达/敲低USF1后ESRP1蛋白的表达水平。6.分析TCGA-BC数据库中USF1和ESRP1表达的相关性。结果:1.敲低/过表达ESRP1显着减少/增加了circANKS1B的表达。2.ESRP1直接绑定在circANKS1B两侧内含子区,当ESRP1结合位点突变后,敲低ESRP1对circANKS1B的表达无影响。3.BC组织中ESRP1和circANKS1B的表达呈强正相关。4.ESRP1能够促进SYT8外显子4和Snail外显子2反向剪接成环。5.USF1直接绑定在ESRP1启动子区-555到-550的E-box序列（CACGTG）,过表达/敲低USF1显着增加/减少ESRP1的表达水平。6.TCGA-BC数据库中USF1和ESRP1表达之间呈显着地正相关。结论:在BC中,ESRP1也是USF1直接下游靶基因,其可以促进circANKS1B的产生。第六部分ESRP1/circANKS1B/miR-148a/152-3p/USF1正反馈环通过激活TGF-β1/Smad信号通路促进BC细胞EMT及侵袭转移方法:1.划痕和Transwell实验检测circANKS1B稳定过表达BC细胞分别转染si-ESRP1、miR-148a/152-3p模拟物、si-USF1或用LY2109761处理后的迁移和侵袭能力;以及检测circANKS1B稳定敲低BC细胞分别转染ESRP1/USF1/TGF-β1表达载体或miR-148a/152-3p抑制剂后的迁移和侵袭能力。2.Western blot实验检测circANKS1B稳定过表达BC细胞分别转染si-ESRP1、miR-148a/152-3p模拟物、si-USF1或用LY2109761处理后p-Smad2、p-Smad3、Smad2/3、E-cadherin、Vimentin的表达水平。结果:1.敲低ESRP1/USF1、过表达miR-148a/152-3p或用LY2109761处理细胞后都能够阻断circANKS1B过表达所引起的迁移侵袭能力增强。同样,过表达ESRP1/USF1/TGF-β1或沉默miR-148a/152-3p能够恢复circANKS1B敲低所引起的迁移侵袭能力减弱。2.过表达circANKS1B增加了p-Smad2、p-Smad3和Vimentin的表达,减少了E-cadherin的表达;而这一效应被敲低ESRP1/USF1、过表达miR-148a/152-3p或用LY2109761处理后所阻断。结论:ESRP1/circANKS1B/miR-148a/152-3p/USF1正反馈环能够激活TGF-β1/Smad信号通路,从而促进BC细胞EMT和侵袭转移。
赵博昊[6]（2020）在《lncRNA2919调控毛兔毛囊周期性再生的分子机制研究》文中提出毛囊是哺乳动物生长发育过程中复杂且独特,并一直处于周期性生长的器官。毛囊高度的自我更新能力和明显的结构特征,成为细胞增殖、分化及凋亡等重要生命问题良好的科学模型。兔毛纺织品具有软、暖、细、薄、美和易染色等特点,深受消费者青睐。随着人民生活水平的提高和毛纺织业的不断发展,兔毛的需求量也日益增加,提高兔毛产量和兔毛品质成为目前亟需解决的问题。探寻影响兔毛生长的关键因子,阐明毛囊生长发育的分子机制,对改良毛兔生产性能和提高产业竞争力具有重要意义。长链非编码RNA（Longnon-coding RNAs,lncRNAs）是一类长度大于200个核苷酸的非编码RNA,一般不具备编码蛋白的能力,lncRNA能够调控细胞增殖、凋亡、分化和迁移等多种细胞活动。目前,在人类、小鼠、山羊等物种上,lncRNA能够通过ceRNA网络、DNA甲基化等途径调控毛囊发育相关通路,影响毛乳头细胞和毛囊干细胞等的细胞周期、增殖与分化。而在家兔中,lncRNA参与毛囊生命活动的机制研究尚未报道。鉴于此,本研究通过全转录组测序筛选毛兔毛囊周期不同发育阶段的差异表达ncRNAs和mRNAs,选取新发现的lncRNA2919为研究对象,从细胞水平和个体水平揭示lncRNA2919在毛囊周期性再生的分子机制,探究lncRNA2919启动子区DNA甲基化的表观遗传学调控模式,以及lncRNA2919-STAT1-KRTAP11-1的trans转录调控网络影响毛囊周期性再生的作用方式,以期从长链非编码RNA的角度补充家兔毛囊发育领域的不足。1.基于全转录组测序筛选毛兔毛囊周期性生长的关键因子为了筛选获取毛兔毛囊发育相关因子,通过剪毛对皖系长毛兔进行毛囊周期同期化处理,构建长毛兔毛囊周期同期化模型。通过毛长测量、石蜡切片HE染色和毛囊发育周期特异性基因LEF1、SFRP2、TGF-β1和KRT16的表达量检测,确定毛兔毛囊周期同期化处理后的0～110天为生长期,120～130天和140～150天分别为退行期和休止期。选取不同毛囊周期阶段（90天、130天和150天）的背部皮肤进行全转录组测序,筛选毛囊周期相关的差异表达ncRNAs和mRNAs,共筛选得到111个差异表达lncRNAs（lncRNA2690、lncRNA2919、lncRNA3354 和 lncRNA5484）、247 个差异表达 circRNAs（novelcirc0004876、、novelcirc0026326、novelcirc0034968和 novelcirc0036671）、97 个差异表达 miRNAs（miR-128-3p、miR-200a-3p、miR-27a-3p 和 miR-320-3p）和 1168个差异表达mRNAs（BMP2、HTATIP2、KRT17和SIAH1）。并进一步利用实时荧光定量PCR验证差异表达ncRNAs和mRNAs在毛囊周期不同阶段的表达量与全转录组测序结果相一致。通过GO富集分析,发现差异表达ncRNAs与mRNAs主要富集于毛囊周期、毛囊发育调控和皮肤发育等皮肤与毛囊发育相关GO terms,KEGG信号通路分析显示差异表达的ncRNAs与mRNAs主要富集于Wnt signaling pathway、Hedgehog signaling pathway和MAPK signalingpathway等毛囊生长发育相关信号通路。同时构建lncRNA-miRNA-mRNA 和 circRNA-miRNA-mRNA 的 ceRNA 调控网络,进一步了揭示ncRNAs与mRNA在毛囊周期发育过程中的互作调控。结果中,lncRNA2919能够在长毛兔毛囊周期发育的退行期高度表达,可作为进一步探究毛囊周期发育过程的关键因子。2.lncRNA2919的鉴定及其对毛兔毛囊生长的影响根据全转录组测序结果,选取lncRNA2919作为候选lncRNA。通过RACE实验获取lncRNA2919全长序列,为1933bp,位于14号染色体161144649～161147952位置,生物信息学预测与标签载体验证lncRNA2919不具备编码蛋白的能力,细胞核质分离实验显示lncRNA2919主要定位于细胞核。在家兔毛乳头细胞（Dermal papilla cell,DPC）中lncRNA2919能够极显着下调BMP2、CCND1、LEF1和WNT2基因的表达量（P<0.01）,并且抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。合成lncRNA2919过表达和敲减腺病毒载体,皮下注射至长毛兔毛囊周期同期化模型的背部皮肤中,结果表明lncRNA2919能够使长毛兔毛囊密度减少,毛囊深度明显降低,延缓毛干生长,延长休止期向生长期的过渡,进而抑制毛囊的周期性再生,并能够极显着上调FGF5、KRTAP11-1和STAT1的mRNA表达水平（P<0.01）,极显着下调LEF1和WNT2的表达量（P<0.01）,显着下调BCL2和CCND1的表达量（P<0.05）,说明lncRNA2919在毛兔毛囊周期性再生过程中起到负调控作用。3.DNA甲基化阻止EGR1结合lncRNA2919启动子区,影响其转录调控为揭示lncRNA2919在毛兔毛囊周期性再生过程中上游启动子区的调控机制,通过BSP技术检测长毛兔毛囊周期不同阶段的lncRNA2919启动子区甲基化程度。结果表明lncRNA2919启动子区的两个CpG island中,其中CpG island 2的CpG3位点与lncRNA2919在毛囊周期不同阶段的表达呈显着负相关（Pearson相关系数为-0.99）。通过甲基化转移酶抑制剂5-Aza-dc对DPC进行去甲基化处理,发现其能够极显着抑制DNMT1的表达量（P<0.01）,同时极显着提高细胞中lncRNA2919的表达量（P<0.01）,说明DPC中lncRNA2919处于高甲基化状态。进一步,荧光素酶报告基因对lncRNA2919启动子区进行活性检测,显示lncRNA2919启动子区-2069～-849位置活性值最高,5-Aza-dc处理后该区域活性显着增加,且CpGisland2的CpG3位点位于该区域。经预测,CpGisland 2 的 CpG3 位点为早期生长反应因子（Early growthresponse 1,EGR1）转录因子结合位点。为此,利用点突变、双荧光素酶与EMSA实验证明EGR1特异性结合于lncRNA2919启动子区域（-1121～-1108）,显着上调lncRNA2919的启动子区活性（P<0.05）。利用去甲基化处理和EGR1过表达均能显着上调DPC中lncRNA2919的表达水平（P<0.01）。以上结果揭示DNA甲基化调节EGRl结合lncRNA2919启动子区,调控lncRNA2919的转录,进而参与毛兔毛囊再生过程。4.lncRNA2919招募STAT1形成复合物,调控KRTAP11-1转录表达进一步分析lncRNA2919在毛兔毛囊周期性再生过程下游信号途径,利用RNA pull-down和质谱技术筛选lncRNA2919的互作蛋白,发现了信号转导与转录激活子1（Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1）和角蛋白 16（Keratin 16,KRT16）等毛囊发育相关蛋白。同时lncRNA2919的过表达能够极显着提高STAT1 mRNA和蛋白水平的表达量（P<0.01）,RIP实验证明STAT1与lncRNA2919存在结合关系。根据前期全转录组中trans/cis调控模式预测,发现lncRNA2919与KRTAP11-1基因存在trans调控关系。经预测lncRNA2919位于KRTAP11-1基因下游约160kb处,在毛囊周期不同阶段lncRNA2919与KRTAP11-1基因呈显着正相关（Pearson相关系数为0.96）,过表达lncRNA2919能极显着上调KRTAP11-1的mRNA表达水平（P<0.01）。KRTAP11-1在DPC中能够极显着上调KRT16和KRT17（P<0.01）,极显着下调LEF1、WNT2、CCND1和BCL2的mRNA表达量（P<0.01）,并抑制DPC增殖,促进DPC凋亡。进一步,荧光素酶活性检测表明KRTAP11-1启动子区-2490～-2160区段为启动子核心区域,转录因子预测显示STAT1位于此核心区域,qRT-PCR结果显示STAT1的过表达能够极显着促进KRTAP11-1的表达水平（P<0.01）。通过点突变、双荧光素酶活性与EMSA检测,确定STAT1能够结合启动子区显着上调KRTAP11-1的转录活性（P<0.05）。综合互作蛋白分析与trans关系验证,证明lncRNA2919招募STAT1形成复合物结合于KRTAP11-1启动子区,即通过lncRNA2919-STAT1-KRTAP11-1的trans调控轴,参与长毛兔的毛囊周期性再生。
王蔓蔓[7]（2020）在《快速心房起搏犬心房组织中非编码RNA表达谱功能和作用机制研究》文中指出目的:心房颤动是临床上最常见的心律失常之一,其发病机制复杂,具有高患病率和复发率,严重威胁人类健康。近年来,随着生物测序技术及生物信息学的发展,非编码RNA在心血管疾病中的作用逐渐被发现。本实验中,我们通过分析房颤模型中差异表达的lnc RNAs、circ RNAs和micro RNAs,研究非编码RNA在房颤病理生理过程中的作用机制。方法:（1）将12只健康成年杂种犬随机分为对照组（C,n=6）及快速起搏组（P,n=6）,通过对犬右心房以500次/分快速起搏14天建立房颤模型,HE和Masson染色检测心房组织的形态学变化,电生理检测心房有效不应期及房颤诱发率。（2）采用高通量测序以及生物信息学技术分析在起搏组和对照组犬心房组织中差异表达的lnc RNAs、circ RNAs和micro RNAs,构建差异表达谱并通过“火山图、散点图、热图”将这些差异表达的非编码RNA进行可视化,通过GO和KEGG富集分析阐述这些差异表达非编码RNA在房颤中的作用和功能。构建lnc RNA/circ RNA-miRNA-m RNA共表达网络以探索lnc RNAs/circ RNAs和micro RNAs之间的关系。（3）根据生物信息学预测结果,选择cfa＿circ RNA＿009305作为研究对象,血管紧张素II刺激犬心房成纤维细胞建立体外纤维化模型,RT-PCR检测cfa＿circ RNA＿009305在体内和体外纤维化模型中的表达。分别转染si RNA和质粒以沉默和过表达cfa＿circ RNA＿009305,通过免疫荧光、CCK8、细胞划痕实验研究差异表达cfa＿circ RNA＿009305后成纤维细胞的分化、增殖和迁移情况,蛋白印迹法检测纤维化相关蛋白（Collagen I、Collagen III、MMP2、MMP9、α-SMA）的表达变化。通过生物信息学对cfa＿circ RNA＿009305和miR-433之间的关系进行预测,运用RT-PCR和western blot检测miR-433在纤维化模型中的表达及其对纤维化相关蛋白表达的影响。采用Spearman分析对cfa＿circ RNA＿009305和miR-433的相关性进行分析,并通过双荧光素酶报告基因实验检测是二者否具有直接靶向关系。结果:（1）对犬心房快速右心房起搏14天后,组织形态学实验发现,对照组心房肌细胞排列整齐,未见明显形态改变;与对照组相比,起搏组心房肌细胞排列紊乱,形态异常,胶原纤维沉积,发生明显纤维化改变。电生理结果显示,心房有效不应期缩短,不应期离散度增加,房颤诱发率和持续时间明显增高,出现电重构表现。（2）利用高通量测序,共筛选出10310个lnc RNAs,其中差异表达的lnc RNAs共33个,包括19个表达上调,14个表达下调;检测到15990个circ RNAs,差异表达的circ RNAs有146个,其中106个上调,40个表达下调;共发现351个micro RNAs,差异表达的有101个,表达上调的有65个,表达下调的36个;检测到19856个m RNAs,差异表达的有1154个,334个表达上调,820个表达下调。对这些差异表达的非编码RNA和m RNAs进行了GO和KEGG富集分析,发现它们可能通过参与细胞分裂、细胞外基质、活性氧的反应、磷脂酰肌醇代谢、ATP结合、钙离子结合、钾通道调控活性、钠离子的重吸收、MAPK磷酸化活性、TNF信号、Smad信号、Wnt信号通路、c GMP-PKG信号通路、AGE-RAGE信号通路等多个生物过程影响房颤发生。（3）（1）通过血管紧张素II（Ang II）刺激犬心房成纤维细胞成功建立体外纤维化模型,RT-PCR验证发现在cfa＿circ RNA＿009305在体内和体外纤维化模型中均表达下调。（2）CCK8、细胞划痕和免疫荧光实验证实,下调cfa＿circ RNA＿009305促进了成纤维细胞的增殖、迁移及向肌成纤维细胞的分化,同时western blot显示下调cfa＿circ RNA＿009305促进了纤维化相关指标（Col I、Coll III、MMP2、MMP9、α-SMA）蛋白表达增加,而上调cfa＿circ RNA＿009305可逆转这些指标的变化。（3）生物信息学分析发现cfa＿circ RNA＿009305和miR-433之间有碱基配对结合位点。RT-PCR检测发现miR-433在体内和体外纤维化模型中均表达增加,与cfa＿circ RNA＿009305的表达趋势相反,且western blot显示,上调miR-433促进了上述纤维化相关蛋白表达的增加,表明miR-433具有促纤维化作用。Spearman相关性分析显示,cfa＿circ RNA＿009305和miR-433在体外纤维化模型中的表达呈负相关。双荧光素酶报告基因结果提示二者存在靶向关系。细胞实验证实cfa＿circ RNA＿009305可抑制miR-433的表达。因此,推测cfa＿circ RNA＿009305可作为miR-433的ce RNA参与调控miR-433在房颤中的表达。结论:（1）通过对犬快速右心房起搏14天成功建立房颤模型,利用高通量测序和生物信息学分析发现非编码RNA参与调控与房颤发生相关的多种生物过程;（2）cfa＿circ RNA＿009305在体内和体外纤维化模型中均表达下调,且可作为ce RNA海绵吸附miR-433,参与房颤纤维化的进展。
汪文杰[8]（2020）在《长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究》文中提出背景和目的:胃癌（Gastric cancer,GC）是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率分别位于全球癌症的第四位和第五位。中国的GC发病率和死亡率占到了全世界一半以上。总的来说,GC的发生是遗传因素和环境因素交互作用的结果。目前,手术切除仍然是GC治疗的主要方式。在中国,通常超过80%的患者在初诊时就被诊断为进展期GC,术后5年生存率不到30%。尽管近年来在GC的治疗方面取得了很大的进步,但GC患者的生存率仍然很低。因此,亟需寻找GC新的分子生物标记物和特异的治疗靶点。随着高通量测序技术的发展,以往被认为是转录“噪音”和“垃圾”的长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）引起了许多科学家的关注。研究发现lncRNA具有高度的组织特异性,并且参与了肿瘤细胞的多种生物学过程。此外,lncRNA可以通过表观遗传修饰、转录调控、转录后调控等多种方式参与肿瘤的发生和发展。尽管lncRNA在GC的研究中仍然属于探索阶段,但还是发现了一些lncRNA可能在GC的病变过程中起关键作用,这也为GC的诊断和治疗提供了新思路。因此,lncRNA具有成为GC诊断生物标记物和治疗靶标的巨大潜力。本研究选择lncRNA癌症易感候选物19（Cancer susceptibility candidate 19,CASC19）作为研究对象,CASC19位于被称为基因沙漠的染色体8q24.21区域,目前在GC中的功能未见报道。我们前期对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库进行深入挖掘,发现CASC19在GC中上调,并且与GC的浸润深度、TNM分期、远处转移和总体生存期（Overall survival,OS）显着相关。然后,利用cDNA末端快速扩增（Rapid amplification of cDNA ends,RACE）实验获得了CASC19在GC细胞中存在的717bp全长序列,并通过UCSC确认这是个新的转录本。我们在临床样本,细胞模型和动物模型中对CASC19在GC中作用和调控机制进行一系列实验验证,以期为GC的诊断和治疗提供参考。研究方法:1.通过TCGA数据库获取了375位GC患者的RNA测序和临床性状数据,利用加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）和差异基因表达分析相结合的方法,筛选与GC进展和预后相关的lncRNA。然后,分析目的lncRNA表达与临床病理参数和预后的关系。最后,进行基因集富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）探索lncRNA相关的信号通路。2.收集了联勤保障部队第九四〇医院普通外科和兰州大学第一医院肿瘤外科从2019年9月1日至2020年1月30日手术切除的80对新鲜GC组织和癌旁对照组织。利用实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR,qRT-PCR）检测CASC19在GC组织和癌旁对照组织中的表达水平,并分析CASC19的表达与患者临床病理参数之间的关系以及与下游靶基因NPM1的相关性。采用受试者工作特征（Receiver operator characteristic,ROC）曲线评估CASC19在GC诊断中的意义。3.采用qRT-PCR检测CASC19在人GC细胞系（AGS,BGC-823,MGC-803,HGC-27和MKN-45）和正常胃粘膜上皮细胞系（GES-1）中的表达水平。采用RACE实验鉴定CASC19在GC细胞中的全长序列。制备CASC19 shRNA和过表达慢病毒,shRNA慢病毒感染MKN-45和BGC-823细胞,过表达慢病毒感染HGC-27和AGS细胞,用qRT-PCR检测敲减和过表达效率。采用CCK-8实验、细胞克隆形成实验和EdU细胞增殖实验检测CASC19对GC细胞增殖能力的影响。采用细胞划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验检测CASC19对GC细胞迁移和侵袭能力的影响。采用流式细胞术和蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响。采用WB实验检测CASC19对上皮间质转换（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白E-cadherin,Vimentin和N-cadherin表达的影响。4.用带有Luciferase标签的CASC19 shRNA慢病毒和MKN-45细胞构建稳转细胞株。选用4-5周龄BALB/c-nu雄性裸鼠用于动物实验,将10只裸鼠随机分为sh-CASC19组和sh-NC组两个组,每组5只。将两组细胞注射于裸鼠肩胛下构建裸鼠皮下移植瘤模型,每天测量肿瘤体积,期间利用小动物活体成像仪监测肿瘤生长状态。饲养4周处死裸鼠,取下肿瘤后一半用10%中性福尔马林溶液固定,另一半放入液氮罐保存。采用qRT-PCR实验检测移植瘤中HDAC1和NPM1mRNA的表达。采用IHC实验和WB实验检测移植瘤中Ki-67,PCNA,HDAC1和NPM1蛋白的表达。5.通过基因芯片技术检测CASC19敲减后下游功能基因的表达,进而鉴定CASC19可能调控的下游靶基因,并结合创新途径分析（Ingenuity pathway analysis,IPA）软件进行经典通路分析,上游调控分析,疾病和功能分析,调控效应分析和相互作用网络分析。然后选择30个差异表达的基因（Differentially expressed gene,DEG）进行qRT-PCR验证。6.通过核质分离实验来确定CASC19在GC细胞中的亚细胞定位。采用RNA pull-down实验检测与CASC19相互作用的蛋白质。采用RNA纯化染色质分离（Chromatin Isolation by RNA Purification,ChIRP）实验检测与CASC19同时作用的蛋白质和基因,分别用质谱分析（Mass spectrometry,MS）和测序（Sequencing,Seq）鉴定下游蛋白质和基因。采用WB实验检测RNA pull-down洗脱产物中HDAC1蛋白的表达。采用RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA-binding protein immunoprecipitation,RIP）实验来反向验证HDAC1蛋白与CASC19的相互作用。采用HDAC1的染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验检测与HDAC1相互作用的基因。采用ChIP-qPCR实验验证HDAC1与NPM1启动子的结合。采用双荧光素酶报告基因实验验证CASC19和HDAC1同时与NPM1启动子的结合。采用ChIP-qPCR实验验证MYC与CASC19启动子的结合。研究结果:1.通过WGCNA方法确定CASC19作为核心lncRNA用于接下来的分析和验证。CASC19在TCGA数据库GC样本中上调,其过表达与T分期（P=0.034）,TNM分期（P=0.022）和淋巴结转移（P<0.001）显着相关。CASC19过表达GC患者的OS明显短于CASC19低表达的患者（P=0.015）。Cox分析显示CASC19过表达是影响GC患者OS的独立危险因素（HR=1.524,95%CI=1.003-2.316,P=0.049）。GSEA分析显示CASC19过表达引起变化的下游大多数基因富集在癌症相关信号通路和经典信号通路上。2.CASC19在GC组织中显着上调,其表达量是癌旁对照组织中的4.2倍。CASC19表达与GC肿瘤大小（P<0.001）,浸润程度（P=0.011）,TNM分期（P<0.001）和淋巴结转移（P=0.003）呈正相关。CASC19的结合蛋白HDAC1在GC组织中上调,而CASC19的下游靶基因NPM1在GC组织中下调,并且NPM1的表达与CASC19负相关（R=-0.361,P=0.001）。相对于癌旁对照组织,HDAC1mRNA和蛋白在GC组织中过表达,而NPM1 mRNA和蛋白在GC组织中低表达。CASC19在ROC曲线下的面积（Area under the curve,AUC）为0.952（95%CI:0.920-0.984,P?<?0.0001）,提示CASC19对GC的诊断效果较好。3.CASC19在人GC细胞系中表达上调,其在GC细胞中的全长为717bp。UCSC网站、CPAT工具和ORFfinder网站均显示CASC19不具备蛋白质编码能力。shRNA慢病毒在MKN-45和BGC-823细胞中成功下调CASC19的表达,过表达慢病毒在AGS和HGC-27细胞中成功上调CASC19的表达。CASC19下调会抑制MKN-45和BGC-823细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而促进MKN-45和BGC-823细胞的凋亡。相反,CASC19上调会促进HGC-27和AGS细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而抑制HGC-27和AGS细胞的凋亡。此外,CASC19下调后MKN-45和BGC-823细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和间质蛋白Vimentin和N-cadherin表达降低,而凋亡蛋白Casepase-3,Casepase-7和Casepase-9以及上皮蛋白E-cadherin表达升高。CASC19上调后HGC-27和AGS细胞中Bcl-2,Vimentin和N-cadherin蛋白表达升高,而Casepase-3,Casepase-7,Casepase-9和E-cadherin蛋白表达降低。4.sh-CASC19组裸鼠皮下移植瘤的体积和重量明显小于sh-NC组,HE染色发现sh-NC组肿瘤细胞出现的核体积增大、核分裂像增多、瘤巨细胞等恶性增殖现象明显多于sh-CASC19组。Ki-67和PCNA蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平明显低于sh-NC组。HDAC1 mRNA和蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平与sh-NC组无显着差异。NPM1 mRNA和蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平明显高于sh-NC组。5.CASC19敲减引起1,433个DEG上调,369个DEG下调。IPA分析显示CASC19可能与THBS1和TGFBR2作用,进而影响GC细胞的增殖和凋亡。选择30个DEG进行qRT-PCR验证,与芯片实验结果一致。6.CASC19主要分布于GC细胞核内,提示CASC19可能通过表观遗传调控起作用。RNA pull-down和ChIRP-MS实验确定了96个与CASC19可能结合的蛋白,生物信息学预测到CASC19与组蛋白修饰蛋白HDAC1之间存在结合区域。WB和RIP实验证明HDAC1可直接与CASC19结合,上下调CASC19后HDAC1mRNA和蛋白的表达没有显着差异,证明HDAC1不受CASC19的调控。ChIRP-seq和HDAC1的ChIP-seq实验确定了281个HDAC1与CASC19在基因组上可能共同调控的基因。生物信息学分析表明NPM1基因启动子区域出现peak-calling峰,提示CASC19可能结合在NPM1启动子上。ChIP-qPCR实验发现下调CASC19降低了HDAC1与NPM1启动子的结合。上下调CASC19和HDAC1,qRT-PCR和WB实验证明NPM1受CASC19和HDAC1的调控。双荧光素酶报告基因实验确认CASC19通过招募HDAC1共同结合到NPM1启动子上,从而抑制NPM1的表达。此外,ChIP-qPCR实验表明MYC可结合在CASC19启动子上,qRT-PCR实验证明MYC增加CASC19的表达。结论:本课题通过挖掘TCGA数据库,发现位于染色体8q24.21区域的lncRNA CASC19在GC中上调,并且与GC的进展和预后相关。通过RACE发现CASC19在GC细胞中存在717bp的长度。我们在GC细胞系,GC临床样本和动物模型中对CASC19进行了一系列体外体内验证,证明了CASC19在GC中是一个癌基因。CASC19主要分布于GC细胞核内。在机制上,CASC19通过募集HDAC1至NPM1的启动子区域,使NPM1的启动子区域组蛋白去乙酰化,抑制了NPM1的转录活性,从而降低进NPM1的表达。此外,我们还发现CASC19在上游受到转录因子MYC的调控。我们的研究发现了CASC19通过表观修饰抑制NPM1表达的一种新机制,为更好地理解lncRNA在GC中的作用和机制增加了新的证据。CASC19有望成为GC潜在的诊断标志物和治疗靶点。
缪立英[9]（2019）在《LINC00612在膀胱癌中的生物学功能及机制研究》文中提出膀胱癌（bladder cancer,BC）是一种泌尿系统常见的恶性肿瘤,其发病率和病死率居高不下,严重威胁人体健康。近年来,随着科学技术的发展,我们对BC的认识愈加深入,对其致病机制及发生发展有了更深的理解,在治疗方面也取得了较大的进展,但是BC的预后仍不理想,尤其是晚期患者,无法显着改善其生存情况,因此,深入研究BC发生和发展的分子机制,筛选特异性标志物具有十分重要的理论意义和临床价值。长链非编码RNA（long non-coding RNA,LncRNA）是非编码RNA,长度超过200个核苷酸,可影响调节基因的表达。LncRNA缺乏完整的开放阅读框,没有蛋白编码功能。哺乳动物基因组序列中多达4-9%的序列可以产生LncRNA。LncRNA最初被认为是基因组转录的“暗物质”或“噪音”,没有生物学功能。后来的研究表明,LncRNA参与了许多重要的细胞功能,如X染色体沉默、基因组印记、染色质修饰、转录激活或抑制等,可以促进相关信号通路的分子功能改变,改变细胞的生命活动。上皮-间充质转化（epithelial mesenchymal transition,EMT）是上皮来源的恶性细胞由于迁移和侵袭能力增强,向间充质细胞转化的生物学过程。EMT的特征性改变包括上皮细胞极性的丧失、细胞间连接的降解、细胞骨架结构重组引起的细胞形态学改变、上皮基因表达下调伴间充质基因表达上调。这些变化使细胞具有更强的迁移、侵袭和降解细胞外基质的能力。竞争性内源性 RNA（competitive endogenous RNA,ceRNA）是 LncRNA 的一种重要的调控机制。LncRNA通过吸收多种微小RNA（microRNA,miRNA）,调节靶基因的表达水平。目前LncRNA在BC中已有一些研究,但作为ceRNA在BC的发生发展以及与上皮-间充质转化相关的转移侵袭中的作用仍不明确,有待进一步研究。本研究分为三个部分,第一部分通过LncRNA芯片筛选BC和癌旁组织中差异性表达的LncRNA,检测其在BC组织和细胞中的表达水平,并通过体外实验和体内实验明确其在BC中的生物学功能;第二部分通过体外实验及体内实验明确LINC00612/miR-590/PHF-14构成ceRNA网络对BC发生发展的调控作用;第三部分通过体外实验阐明LINC00612/miR-590/PHF-14轴对BC细胞上皮-间充质转化的影响。第一部分 LINC00612对膀胱癌细胞增殖和侵袭能力的影响[目的]明确BC组织与癌旁组织中LncRNA的表达谱,筛选表达差异最显着的LncRNA,并研究其在BC中的生物学功能。[方法]通过LncRNA微阵列分析,分析13个BC组织与8个癌旁非肿瘤组织中LncRNA的表达差异,选取表达差异最显着的LncRNA,并在BC组织及BC细胞株中应用实时定量反转录酶-聚合酶链锁反应（quantitative reverse transcript-ion-polymerase chain reaction,qRT-PCR）及原位杂交（In Situ Hybridization,ISH）实验进行验证。核质分离实验及荧光原位杂交（Fluorescence In Situ Hybridization,FISH）确定其亚细胞定位。CCK8、集落形成及Transwell实验明确体外LINC00612对BC细胞增殖、侵袭能力的影响。裸鼠成瘤实验及生物荧光体外成像技术验证体内LINC00612对BC细胞增殖、侵袭能力的影响。[结果]选择前60个在BC组织与癌旁组织中差异表达显着的LncRNA（Fold Change>1.5,P<0.01）,其中LINC00612差异表达最显着。BC组织中LINC00612的表达水平明显高于癌旁组织,BC细胞中LINC00612的表达水平明显高于膀胱上皮永生细胞。LINC00612主要定位于细胞质中。体外实验显示:在BC细胞中过表达LINC00612,BC细胞增殖及侵袭能力增强;下调LINC00612,BC细胞增殖及侵袭能力下降。上述结果在体内实验中得到了证实。[结论]LINC00612在BC组织和细胞中表达异常上调,并且在BC中作为促癌基因发挥增强细胞增殖与侵袭能力的作用。第二部分 LINC00612/miR-590/PHF-14构成ceRNA网络调控膀胱癌发生发展的研究[目的]鉴定LINC00612调控的下游miRNA及靶基因,阐明LINC00612构成ceRNA网络调控BC发生发展的机制。[方法]通过生物信息学方法筛选LINC00612可能结合的miRNA,RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）、RNA pull down及双荧光素酶报告基因实验验证LINC00612与目标miRNA的结合关系。调节BC细胞中LINC00612的表达,观察目标miRNA水平的变化。应用生物信息学方法筛选目标miRNA可能调控的下游靶基因,qRT-PCR、RIP和双荧光素酶报告实验验证目标miRNA与靶基因的结合关系。调节BC细胞中目标miRNA的表达,qRT-PCR和western blotting检测靶基因在mRNA和蛋白水平的表达。细胞功能回复实验（挽救实验）和体内实验验证上述结果。[结果]生物信息学方法筛选miR-590是LINC00612下游的目标miRNA,RIP、RNA pull down和双荧光素酶报告实验证明,LINC00612和miR-590可以直接结合。BC细胞中调节LINC00612的表达,miR-590的表达变化呈负性相关。生物信息学方法筛选miR-590下游靶基因,经qRT-PCR、RIP和双荧光素酶报告实验验证,PHF-14是miR-590下游的靶基因。BC细胞中调节miR-590的表达,PHF-14的表达变化呈负性相关。细胞功能回复实验显示LINC00612/miR-590/PHF-14轴可调控BC细胞的增殖及侵袭,该结果在体内实验中也获得了进一步证实。[结论]LINC00612通过海绵样吸附miR-590进一步调控下游靶基因PHF-14的表达,并由此影响BC细胞的增殖及侵袭能力,LINC00612/miR-590/PHF-14构成ceRNA网络调控BC的发生发展。第三部分 LINC00612/miR-590/PHF-14轴调控膀胱癌细胞上皮-间充质转化的研究[目的]研究LINC00612/miR-590/PHF-14轴对BC细胞上皮-间充质转化的调控作用。[方法]通过western blotting及FISH实验检测LINC00612/miR-590/PHF-14轴对E-cadherin、N-cadherin和vimentin表达水平的影响。[结果]LINC00612 下调增强了 E-cadherin 的表达,削弱了 N-cadherin 和 vimentin 的表达,LINC00612过表达抑制了E-cadherin的表达,而N-cadherin和vimentin表达增加,PHF14可以取消LINC00612对E-cadherin和vimentin表达的调控作用。[结论]LINC00612/miR-590/PHF-14轴通过ceRNA机制调控BC细胞上皮-间充质转化。
邢洪顺[10]（2019）在《lncRNA LINC00460竞争性结合miR-539调控MMP-9促进脑膜瘤恶性转化的研究》文中研究说明脑膜瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤之一,源自脑膜及脑膜间隙的衍生物,约占颅内肿瘤的30%40%（十年前统计数据为占颅内肿瘤的13%26%）。根据世界卫生组织（World Health Organization,WHO）的分类,脑膜瘤可被区分为WHO I级、WHO II级、WHO III级,其中III级脑膜瘤（恶性脑膜瘤）占总数的5%,比例非常少,但均为恶性脑膜瘤。虽然绝大多数脑膜瘤是良性肿瘤,仅有一小部分脑膜瘤为恶性,但临床研究发现,恶性脑膜瘤常伴有快速生长、侵袭及转移的特性。近年来,脑膜瘤的诊治取得了显着进展,但由于其发病机制尚不明确,复发率仍旧较高。大部分基因转录的产物是非编码RNA（non-coding RNAs,ncRNAs）,这些ncRNAs根据长度分为短链非编码RNA（Short non-coding RNAs）和长链非编码RNA（long non-coding RNAs,lncRNAs）。越来越多的报道表明lncRNA在多种肿瘤病理的发生发展过程中具有广泛的生物学作用,影响肿瘤的生长、侵袭、转移和复发。尽管脑膜瘤有了一定的深入研究,但目前仅有极少数的lncRNA被发现同脑膜瘤的发生发展有相关性,仍需要更多的研究探索参与调节脑膜瘤病理发展的lncRNA。lncRNA LINC00460在肺癌、鼻咽癌、卵巢癌、甲状腺癌、胃癌、结直肠癌、食管癌、喉鳞状细胞癌等多种人类肿瘤中均被发现具有致癌性的作用,然而,LINC00460在脑膜瘤中的作用尚不清楚。考虑到lncRNA在其他肿瘤发生发展中的重要作用,我们选择LINC00460作为研究对象,探讨其在脑膜瘤细胞表型中的生物学作用。我们拟通过干扰LINC00460表达,验证LINC00460在脑膜瘤发生中的作用。此外,miR-539也被证实是多种癌症的肿瘤抑制因子,且在脑胶质瘤细胞系和组织中的表达下降,过表达miR-539则可明显抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭。我们通过生物信息学发现LINC00460同miR-539具有结合序列,因此我们拟以miR-539/MMP-9为靶点研究LINC00460的作用机制。目的1.本研究首先分析lncRNA LINC00460在脑膜瘤组织和恶性脑膜瘤细胞株中的表达特点,探讨其是否同脑膜瘤恶性性状相关。2.分析lncRNA LINC00460对脑膜瘤细胞株恶性性状的影响,拟通过缺失实验,探讨lncRNA LINC00460的效应作用。3.以竞争性内源RNA靶向吸附microRNA为理论依据,生物信息学分析lncRNALINC00460靶向miR-539的结合序列,并通过荧光素酶等实验在体外恶性脑膜瘤细胞株上探索二者的表达相关性,揭示lncRNA LINC00460促进脑膜瘤恶性转化的分子机制。方法1.收集33例人脑膜瘤组织及10例正常脑膜组织,其中21例WHOⅠ级脑膜瘤,9例WHOⅡ级脑膜瘤,3例WHOⅢ级脑膜瘤,采用荧光定量PCR方法,比较LINC00460在两种组织中的表达差异。2.采用荧光定量PCR方法,检测良性脑膜瘤细胞株Ben-Men-1和2株恶性脑膜瘤细胞株（IOMM-Lee和CH157-MN）中的LINC00460的相对表达水平,对比三者的表达差异。3.设计3条LINC00460 siRNA duplexes,采用脂质体Lipofectamin 2000转染法将其转染到恶性脑膜瘤细胞株（IOMM-Lee和CH157-MN）中,采用荧光定量PCR方法检测转染48 h后的LINC00460的抑制水平,选择抑制效率最高的一条siRNA。4.采用脂质体Lipofectamin 2000将LINC00460 siRNA转染到IOMM-Lee和CH157-MN细胞中,以scramble siRNA转染细胞作为对照,用CCK-8法检测细胞15天的增殖水平（每24 h检测一次）;用Annexin V-FITC/propidium iodide（PI）法和流式细胞仪检测转染48 h的细胞凋亡水平;用EdU染色并显微镜下计数EdU阳性细胞百分比,评估转染48 h细胞的DNA复制水平。5.采用脂质体Lipofectamin 2000将LINC00460 siRNA转染到IOMM-Lee和CH157-MN细胞中,转染24 h后,将细胞种植到Martrigel包被的Transwell小室系统的上室,上室放无血清培养液,下室放含20%胎牛血清的培养液。以scramble siRNA转染细胞作为对照,用结晶紫染色观察24 h的细胞侵袭水平;用荧光定量PCR法和western blot法分别检测侵袭相关分子MMP-2、MMP-9、ZEB1的基因和蛋白表达水平。6.构建IOMM-Lee荷瘤裸鼠,分别在肿瘤内注射2μg的scramble siRNA和LINC00460的siRNA,隔日注射,持续4周,绘制肿瘤生长曲线;用免疫组化方法检测肿瘤中Ki-67的表达水平。7.采用生物信息学软件RNA22 version 2.0预测LINC00460和miR-539,以及miR-539和MMP-9 3’-UTR之间潜在的结合位点,并且构建含突变型或野生型LINC00460的荧光素酶报告基因pGL3载体,同时构建含突变型或野生型MMP-93’-UTR序列的荧光素酶报告基因pGL3载体,将上述pGL3载体同miR-539 mimic或miR NC共转染,用荧光素酶底物检测荧光素酶活性。8.用脂质体Lipofectamin 2000将LINC00460 siRNA转染到IOMM-Lee细胞中,荧光定量PCR方法检测转染48 h后miR-539和MMP-9的基因表达;转染miR-539inhibitor或miR NC到IOMM-Lee细胞中,荧光定量PCR方法检测转染48 h后LINC00460和MMP-9的基因表达;进一步的,将LINC00460 siRNA同miR-539 inhibitor共转染,用western blot检测MMP-9的蛋白表达,观察LINC00460 siRNA对miR-539inhibitor的逆转作用。结果:1.同正常脑膜组织相比,人脑膜瘤组织中LINC00460的表达水平明显增高,结果提示LINC00460同脑膜瘤的发生相关。2.为了在体外水平上证实LINC00460同脑膜瘤的发生相关,并且寻找合适的细胞模型进行体外效应和机制研究,我们检测了1株良性脑膜瘤细胞株和2株恶性脑膜瘤细胞株中LINC00460的表达水平。结果显示,同良性脑膜瘤细胞株相比,2株恶性脑膜瘤细胞株中的LINC00460表达水平明显增高,提示LINC00460同脑膜瘤细胞具有体外相关性,并且IOMM-Lee和CH157-MN可作为研究的对象。3.由于LINC00460的升高同脑膜瘤的发生相关,我们拟敲除LINC00460,观察LINC00460在体外水平上,对恶性脑膜瘤细胞株的影响。首先观察了对细胞增殖及其相关因素的影响。通过敲除实验可知,当LINC00460表达被抑制时,IOMM-Lee和CH157-MN细胞的增殖能力受到抑制,第五天时,LINC00460敲除组细胞同非转染细胞之间的增殖差异最为明显（p<0.05）。当LINC00460表达被抑制48 h后,可见IOMM-Lee和CH157-MN细胞中的凋亡细胞均明显增加（p<0.05）,IOMM-Lee细胞的凋亡比率从（9.8%±0.8%）上升到（22.5%±2.7%）,CH157-MN细胞的凋亡比率从（8.8%±0.7%）上升到（18.2%±2.1%）,凋亡的增加有统计学差异;此外,也可发现LINC00460敲除降低了两株恶性脑膜瘤细胞的DNA复制水平,LINC00460敲除可降低IOMM-Lee细胞中51.5%的增殖细胞,降低CH157-MN细胞中67.3%的增殖细胞,增殖细胞数量的减少有统计学差异（p<0.05）。根据这些结果,表明LINC00460表达同恶性脑膜瘤细胞的增殖相关,通过抑制脑膜瘤细胞的DNA复制和上调细胞凋亡可能是LINC00460 siRNA发挥抗增殖作用的原因,对LINC00460的敲除可以降低脑膜瘤细胞株的恶性增殖性状。4.其次,我们设计观察LINC00460同恶性脑膜瘤细胞株的侵袭及其相关因素的关系。通过敲除实验可知,当LINC00460表达被抑制时,IOMM-Lee和CH157-MN细胞的侵袭能力受到抑制,穿透Transwell小室贴附于下壁中的细胞数量明显减少,IOMM-Lee细胞的侵袭数量从（56.4±6.2）降低到（22.1±2.4）,CH157-MN细胞的侵袭数量从（46.9±5.3）降低到（17.8±3.2）。同时侵袭相关分子MMP-2、MMP-9、ZEB1的基因和蛋白表达水平均明显下降。这些结果表明LINC00460表达同恶性脑膜瘤细胞的侵袭相关,并且推测可通过MMP-2和MMP-9对细胞外基质和基底膜进行降解,以及调控ZEB1转录因子表达,可能影响上皮间充质转化相关的基因表达。5.此外,我们拟验证LINC00460对体内脑膜瘤的影响,由于IOMM-Lee相对恶性程度较高,因此用LINC00460siRNA抑制IOMM-Lee荷瘤裸鼠瘤内的LINC00460表达,结果显示,LINC00460siRNA可以在28天时间内降低肿瘤的生长能力,同时降低Ki-67的表达水平。表明LINC00460siRNA可以抑制体内脑膜瘤的生长,证实LINC00460影响体内脑膜瘤的生长和细胞增殖。6.生物信息学检测出LINC00460和miR-539,以及miR-539和MMP-9 3’-UTR之间存在结合序列。经对结合位点处序列进行基因突变后,并构建到荧光素酶报告基因载体中,经同miR-539 mimic或miR NC共转染,可见仅野生型LINC00460可同miR-539结合,也发现仅野生型MMP-93’-UTR同miR-539发生直接结合,证实miR-539是串联LINC00460和MMP-9的miRNA。7.在证实miR-539同LINC00460和MMP-9均存在直接结合后,进一步研究miR-539和LINC00460的互作,及其对MMP-9的影响,揭示脑膜瘤中LINC00460/miR-539/MMP-9轴的存在。在脑膜瘤细胞中,当LINC00460表达被抑制时,miR-539和MMP-9也受到影响,miR-539表达上调,而MMP-9表达下降;当miR-539表达被抑制时,LINC00460和MMP-9也受到影响,LINC00460和MMP-9表达均上调;证实LINC00460和miR-539存在互作关系,并且MMP-9是LINC00460/MMP-9互作的下游基因。我们进一步用miR-539 inhibitor抑制miR-539表达,再用LINC00460 siRNA干扰miR-539 inhibitor的作用,可见虽然miR-539 inhibitor通过抑制miR-539表达,进而上调MMP-9蛋白表达,但LINC00460 siRNA逆转了miR-539 inhibitor的作用,证实LINC00460是miR-539的竞争性内源RNA,通过释放miR-539,阻断miR-539 inhibitor对MMP-9 mRNA的调控,这一结果证实脑膜瘤细胞株中确实存在LINC00460/miR-539/MMP-9互作的轴向关系。结论:1.LINC00460在脑膜瘤组织和恶性脑膜瘤细胞株中表达水平均显着上调,证实LINC00460同脑膜瘤恶性性状相关。2.下调LINC00460表达,可以抑制体外脑膜瘤细胞增殖和侵袭能力,降低蛋白MMP-2、MMP-9和ZEB1的表达。3.下调LINC00460的表达,可以抑制裸鼠体内脑膜瘤肿瘤的生长能力。4.LINC00460通过靶向miR-539,下调miR-539,上调miR-539靶基因MMP-9mRNA的表达,从而促进脑膜瘤的增殖和转移。
二、携TGFβ1正、反义基因载体对膀胱癌细胞体外生长的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、携TGFβ1正、反义基因载体对膀胱癌细胞体外生长的作用（论文提纲范文）
（1）LncRNA LOWEG通过miR-629/LIFR轴抑制膀觥癌进展的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第1章 LOWEG在膀胱癌中的表达 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 材料 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 LOWEG在膀胱癌组织及对应的癌旁正常组织的表达情况 |
| 1.2.2 LOWEG在不同膀胱癌细胞系中的表达情况 |
| 1.2.3 LOWEG在膀胱癌组织中的表达与临床病理特征的关系 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 参考文献 |
| 第2章 LOWEG对膀胱癌细胞迁移、侵袭、增殖和EMT的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 感染LOWEG慢病毒载体后膀胱癌细胞系中的LOWEG显着过表达 |
| 2.2.2 过表达LOWEG对膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响 |
| 2.2.3 过表达LOWEG对膀胱癌细胞增殖的影响 |
| 2.2.4 过表达LOWEG对膀胱癌细胞EMT的影响 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 参考文献 |
| 第3章 LOWEG在膀胱癌中作为miR-629分子海绵正向调控LIFR的表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 LIFR在膀胱癌组织及对应的癌旁正常组织中的表达情况 |
| 3.2.2 LIFR在T24、5637膀胱癌细胞系中的表达情况 |
| 3.2.3 过表达LOWEG对膀胱癌细胞LIFR表达的影响 |
| 3.2.4 LOWEG和LIFR可能靶向结合miR-629 |
| 3.2.5 下调LOWEG对膀胱癌细胞miR-629表达水平影响 |
| 3.2.6 miR-629和LOWEG靶向结合研究 |
| 3.2.7 miR-629和LIFR靶向结合研究 |
| 3.2.8 LOWEG、miR-629和LIFR在膀胱癌细胞中作用的研究 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 参考文献 |
| 第4章 沉默LIFR逆转LOWEG对膀胱癌细胞迁移和侵袭的抑制 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 过表达LIFR对膀胱癌细胞迁移和侵袭能力的影响 |
| 4.2.2 沉默LIFR逆转LOWEG对膀胱癌细胞迁移和侵袭的抑制 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 长链非编码RNA在膀胱癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩略词表 |
（2）LINC00858在膀胱癌中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词 |
| 绪论 |
| 1 膀胱癌 |
| 2 膀胱癌EMT、侵袭和迁移 |
| 3 lncRNA和膀胱癌 |
| 3.1 lncRNA的生物学功能 |
| 3.2 lncRNA与膀胱癌 |
| 3.3 LINC00858 |
| 4 miRNA-3064-5p和膀胱癌 |
| 4.1 miRNA |
| 4.2 miRNA和膀胱癌 |
| 5 CTGF |
| 6 实验设计 |
| 第一部分 |
| 第二部分 |
| 7 研究意义 |
| 第1章 LINC00858在膀胱癌进展中的作用研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 实验仪器和耗材 |
| 1.3 实验试剂 |
| 1.4 相关实验溶液配制 |
| 1.5 实验方法 |
| 1.5.1 组织样本处理 |
| 1.5.2 细胞培养 |
| 1.5.3 细胞传代和冻存 |
| 1.5.4 实时荧光定量PCR (RT-qPCR) |
| 1.5.5 细胞转染 |
| 1.5.6 CCK-8实验 |
| 1.5.7 克隆形成 |
| 1.5.8 划痕愈合实验 |
| 1.5.9 细胞侵袭实验 |
| 1.5.10 细胞迁移实验 |
| 1.5.11 Western blot |
| 1.5.12 数据分析 |
| 1.6 实验结果 |
| 1.6.1 LINC00858在膀胱癌组织和癌细胞系中表达增加 |
| 1.6.2 观察敲低LINC00858基因对膀胱癌细胞增殖的影响 |
| 1.6.3 观察敲低LINC00858基因对膀胱癌细胞迁移和侵袭的影响 |
| 1.7 讨论 |
| 第2章: LINC00858在膀胱癌进展中的机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验仪器和耗材 |
| 2.3 实验试剂 |
| 2.4 相关实验溶液配制 |
| 2.5 实验方法 |
| 2.5.1 细胞培养 |
| 2.5.2 细胞传代和冻存 |
| 2.5.3 RT-qPCR |
| 2.5.4 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.5.5 细胞转染 |
| 2.5.6 CCK-8实验 |
| 2.5.7 克隆形成 |
| 2.5.8 划痕愈合实验 |
| 2.5.9 细胞侵袭实验 |
| 2.5.10 细胞迁移实验 |
| 2.5.11 Western blot |
| 2.5.12 数据分析 |
| 2.6 实验结果 |
| 2.6.1 LINC00858在膀胱癌细胞直接靶向miR-3064-5p |
| 2.6.2 抑制miR-3064-5p表达可促进膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭 |
| 2.6.3 LINC00858通过与miR-3064-5p竞争性结合来调节CTGF |
| 2.6.4 LINC0085 8/miR-3064-5p/CTGF轴在膀胱癌中的作用 |
| 2.7 讨论 |
| 总结 |
| 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 综述 lncRNA和miRNA在膀胱癌发展中作用 |
| 参考文献 |
（3）长链非编码RNA LINC00963抑制角膜纤维化瘢痕形成的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 实验仪器与设备 |
| 2 实验耗材与试剂 |
| 3 实验细胞 |
| 4 实验试剂 |
| 5 角膜纤维化瘢痕细胞模型的构建 |
| 5.1 人角膜基质细胞复苏、传代和冻存 |
| 5.2 TGF-β1刺激角膜基质细胞向肌成纤维细胞转分化 |
| 5.3 提取RNA、逆转录以及实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR) |
| 5.4 蛋白免疫印迹(Western Blot,WB) |
| 5.5 细胞免疫荧光实验 |
| 6 筛选目的Lnc RNAs实验 |
| 6.1 文献检索 |
| 6.2 qRT-PCR实验验证 |
| 7 LINC00963的功能实验 |
| 8 LINC00963与miR-143-3p相互作用实验 |
| 8.1 设计相关序列 |
| 8.2 共转染实验 |
| 8.3 双荧光素酶报告基因实验 |
| 9 miR-143-3p的功能实验 |
| 10 统计学方法 |
| 结果 |
| 1 角膜纤维化瘢痕细胞模型的构建 |
| 2 筛选与角膜纤维化瘢痕形成有关的LncRNAs |
| 3 LINC00963在调控角膜纤维化瘢痕形成中的作用 |
| 4 LINC00963调控角膜纤维化瘢痕形成的机制 |
| 5 LINC00963与miR-143-3p的物理性结合位点 |
| 6 miR-143-3p在调控角膜纤维化瘢痕形成中的作用 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（4）膀胱癌进展和预后基因模型的构建以及CTHRC1在膀胱癌进展中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 构建基于13-mRNA模型预测膀胱癌疾病进展和预后 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 CTHRC1促进膀胱癌侵袭转移及其分子机制 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 CTHRC1表达上调的上游调控机制 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述:CTHRC1与肿瘤和纤维化疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的文章 |
（5）环状RNA circANKS1B促进乳腺癌细胞上皮间质转化及侵袭转移的作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词中英文对照表 |
| 前言 |
| 文献综述 环状RNA在乳腺癌中的研究进展 |
| 第一部分 CircANKS1B的鉴定及其临床意义 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第二部分 CircANKS1B对BC细胞生物学行为的影响 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第三部分CircANKS1B作为miR-148a/152-3p分子海绵调控USF1 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第四部分USF1转录上调TGF-β1 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第五部分 ESRP1促进circANKS1B产生,同时受USF1转录调控 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第六部分 ESRP1/circANKS1B/miR-148a/152-3p/USF1正反馈环通过激活TGF-β1/Smad信号通路促进BC细胞EMT及侵袭转移 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论着情况 |
| 博士期间参加的全国及境外学术会议 |
| 致谢 |
（6）lncRNA2919调控毛兔毛囊周期性再生的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 哺乳动物毛囊发育的研究进展 |
| 1.1.1 毛囊的生物学特征 |
| 1.1.2 毛囊发育的规律 |
| 1.1.3 毛囊发育的相关调控机制 |
| 1.1.4 家兔毛囊发育的研究进展 |
| 1.2 长链非编码RNA的功能与作用机制 |
| 1.2.1 lncRNA的发现 |
| 1.2.2 lncRNA的功能 |
| 1.2.3 lncRNA的转录调控 |
| 1.3 长链非编码RNA在哺乳动物毛囊发育中的研究进展 |
| 1.3.1 lncRNA与毛囊的生长发育密切相关 |
| 1.3.2 lncRNA在家兔上的研究进展 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 第2章 基于全转录组测序筛选毛兔毛囊周期性生长的关键因子 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 长毛兔毛囊周期同期化模型的构建 |
| 2.2.2 筛选长毛兔毛囊周期不同阶段差异表达ncRNAs和mRNAs |
| 2.2.3 差异表达ncRNAs和mRNAs表达水平验证 |
| 2.2.4 差异表达的ncRNAs和mRNAs生物功能分析 |
| 2.2.5 ceRNA调控网络的构建 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 lncRNA2919的鉴定及其对毛兔毛囊生长的影响 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 lncRNA2919全长序列获取与特征分析 |
| 3.2.2 lncRNA2919对毛囊发育相关基因的调控作用 |
| 3.2.3 lncRNA2919对毛乳头细胞增殖与凋亡的影响 |
| 3.2.4 腺病毒介导lncRNA2919对毛兔毛囊再生的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 第4章 DNA甲基化调控EGR1结合lncRNA2919启动子区的机理 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 毛囊周期不同阶段lncRNA2919启动子区甲基化水平检测 |
| 4.2.2 lncRNA2919启动子区活性检测 |
| 4.2.3 转录因子EGR1对lncRNA2919启动子区活性的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第5章 lncRNA2919-STAT1-KRTAP11-1轴调控毛兔毛囊再生的作用机制 |
| 5.1 材料和方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 RNA pull-down结合质谱筛选lncRNA2919互作蛋白 |
| 5.2.2 lncRNA2919与转录因子STAT1关系验证 |
| 5.2.3 lncRNA2919与KRTAP11-1的相关性分析 |
| 5.2.4 KRTAP11-1对毛兔毛囊周期性再生的影响 |
| 5.2.5 转录因子STAT1对KRTAP11-1启动子区活性的影响 |
| 5.2.6 lncRNA2919抑制毛兔毛囊周期性再生的信号转导图 |
| 5.3 讨论 |
| 全文结论 |
| 主要创新点 |
| 进一步研究设想 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
（7）快速心房起搏犬心房组织中非编码RNA表达谱功能和作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语/符号说明 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、建立快速心房起搏犬房颤模型 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验动物和分组 |
| 1.1.2 实验设备和试剂 |
| 1.1.3 模型建立 |
| 1.1.4 电生理检查 |
| 1.1.5 组织病理学检查 |
| 1.1.6 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 犬心电图及房颤诱发率 |
| 1.2.2 组织形态学变化 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、快速心房起搏犬房颤模型中非编码 RNA 表达谱分析 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验对象 |
| 2.1.2 实验仪器和试剂 |
| 2.1.3 生物技术服务 |
| 2.1.4 上机测序 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 RNA质量检测结果及完整性质控 |
| 2.2.2 犬心房组织差异lnc RNAs表达谱分析 |
| 2.2.3 犬心房组织差异circ RNAs表达谱分析 |
| 2.2.4 犬心房组织差异 miRNAs 表达谱分析 |
| 2.2.5 犬心房组织差异mRNAs表达谱分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 基因测序在疾病中的运用 |
| 2.3.2 Lnc RNAs在房颤模型中的表达 |
| 2.3.3 Circ RNAs在房颤模型中的表达 |
| 2.3.4 Micro RNAs在房颤模型中的表达 |
| 2.3.5 Lnc RNAs、circ RNAs、micro RNAs的交互作用 |
| 2.4 小结 |
| 三、cfa_circ RNA_009305 在心房纤维化中功能和作用机制初步研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验设备及耗材 |
| 3.1.2 实验用试剂 |
| 3.1.3 引物序列 |
| 3.1.4 实验方法 |
| 3.1.5 统计学处理 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 cfa_circ RNA_009305 在体内纤维化模型中表达下调 |
| 3.2.2 细胞实验建立体外纤维化模型 |
| 3.2.3 cfa_circ RNA_009305 在体外纤维化模型中表达下调 |
| 3.2.4 体外抑制cfa_circ RNA_009305 促进细胞纤维化 |
| 3.2.5 体外上调cfa_circ RNA_009305 抑制细胞纤维化 |
| 3.2.6 cfa_circ RNA_009305 具有结合mi R-433 的潜能 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 环状RNA功能及其与房颤心房重构发生机制的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 胃癌流行病学 |
| 1.2 胃癌治疗现状 |
| 1.3 LncRNA的分类与功能 |
| 1.4 LncRNA在胃癌发病中的作用 |
| 1.5 本课题的研究目的和意义 |
| 第二章 生物信息学鉴定CASC19与胃癌进展和预后相关 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 数据的来源与获取 |
| 2.1.2 差异lncRNA筛选过程 |
| 2.1.3 加权基因共表达网络构建过程 |
| 2.1.4 临床重要模块与核心lncRNA的鉴别 |
| 2.1.5 核心lncRNA与 GC临床性状之间的联系 |
| 2.1.6 核心lncRNA的预后分析 |
| 2.1.7 核心lncRNA的 GSEA分析 |
| 2.1.8 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 患者的基线资料 |
| 2.2.2 差异lncRNA筛选结果 |
| 2.2.3 加权基因共表达网络构建结果 |
| 2.2.4 临床重要模块与核心lncRNA的鉴别 |
| 2.2.5 CASC19与GC临床性状之间的联系 |
| 2.2.6 CASC19 过表达GC患者预后差 |
| 2.2.7 CASC19相关的信号通路 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 CASC19在人胃癌组织中的表达及临床意义 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 临床样本收集 |
| 3.1.2 纳入与排除标准 |
| 3.1.2.1 纳入标准 |
| 3.1.2.2 排除标准 |
| 3.1.3 临床病理参数 |
| 3.1.4 组织总RNA提取及质检 |
| 3.1.4.1 组织总RNA提取 |
| 3.1.4.2 组织总RNA质检 |
| 3.1.5 qRT-PCR实验 |
| 3.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 3.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 3.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 3.1.6 HE染色 |
| 3.1.6.1 石蜡包埋 |
| 3.1.6.2 切片 |
| 3.1.6.3 HE染色步骤 |
| 3.1.7 IHC实验 |
| 3.1.7.1 石蜡包埋 |
| 3.1.7.2 切片 |
| 3.1.7.3 IHC步骤 |
| 3.1.8 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 患者临床病理资料 |
| 3.2.2 CASC19在GC组织和癌旁组织中的表达 |
| 3.2.3 CASC19 表达与GC患者临床病理参数之间的关系 |
| 3.2.4 CASC19 表达与NPM1 表达之间的关系 |
| 3.2.5 CASC19在GC诊断中的意义 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 CASC19对胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞培养 |
| 4.1.1.1 细胞复苏 |
| 4.1.1.2 细胞传代 |
| 4.1.1.3 细胞冻存 |
| 4.1.2 慢病毒制备 |
| 4.1.2.1 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 4.1.2.2 CASC19过表达慢病毒制备 |
| 4.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 4.1.4 细胞总RNA提取及质检 |
| 4.1.4.1 细胞总RNA提取 |
| 4.1.4.2 细胞总RNA质检 |
| 4.1.5 qRT-PCR实验 |
| 4.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 4.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 4.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 4.1.6 cDNA末端快速扩增实验 |
| 4.1.6.1 CASC19 PCR扩增及回收 |
| 4.1.6.2 3 ’RACE获取CASC19的3’全长 |
| 4.1.6.3 5 ’RACE获取CASC19的5’全长 |
| 4.1.7 CCK-8细胞增殖实验 |
| 4.1.8 细胞克隆形成实验 |
| 4.1.9 EdU细胞增殖实验 |
| 4.1.10 细胞划痕实验 |
| 4.1.11 Transwell迁移实验 |
| 4.1.12 Transwell侵袭实验 |
| 4.1.13 流式凋亡实验 |
| 4.1.14 蛋白质免疫印迹实验 |
| 4.1.14.1 细胞总蛋白提取 |
| 4.1.14.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 4.1.14.3 电泳 |
| 4.1.14.4 电转 |
| 4.1.14.5 显色 |
| 4.1.15 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 CASC19在GC细胞系中的表达水平 |
| 4.2.2 RACE获得CASC19在GC细胞中的全长 |
| 4.2.3 CASC19的非编码分析 |
| 4.2.4 CASC19慢病毒敲减和过表达效率检测 |
| 4.2.5 CCK-8 实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.6 克隆形成实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.7 EdU实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.8 划痕实验检测CASC19对GC细胞迁移的影响 |
| 4.2.9 Transwell迁移实验检测CASC19对GC细胞迁移的影响 |
| 4.2.10 Transwell侵袭实验检测CASC19对GC细胞侵袭的影响 |
| 4.2.11 流式细胞实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响 |
| 4.2.12 WB实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响 |
| 4.2.13 WB实验检测CASC19对GC细胞EMT的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 CASC19表达对胃癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞培养 |
| 5.1.2 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 5.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.1.5 实验分组 |
| 5.1.6 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 5.1.7 裸鼠活体成像实验 |
| 5.1.8 组织总RNA提取及质检 |
| 5.1.8.1 组织总RNA提取 |
| 5.1.8.2 组织总RNA质检 |
| 5.1.9 qRT-PCR实验 |
| 5.1.9.1 反转录合成cDNA |
| 5.1.9.2 qRT-PCR检测 |
| 5.1.9.3 qRT-PCR引物 |
| 5.1.10 移植瘤HE染色 |
| 5.1.11 移植瘤IHC实验 |
| 5.1.12 移植瘤WB实验 |
| 5.1.12.1 组织总蛋白提取 |
| 5.1.12.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 5.1.12.3 电泳 |
| 5.1.12.4 电转 |
| 5.1.12.5 显色 |
| 5.1.13 统计学方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 CASC19 在稳转MKN-45 细胞株中的表达水平 |
| 5.2.2 CASC19下调可抑制裸鼠皮下移植瘤的生长 |
| 5.2.3 CASC19 下调对移植瘤HE染色的镜下改变 |
| 5.2.4 CASC19 下调对移植瘤中Ki-67 蛋白表达的影响 |
| 5.2.5 CASC19 下调对移植瘤中PCNA蛋白表达的影响 |
| 5.2.6 CASC19 下调对移植瘤中HDAC1 表达的影响 |
| 5.2.7 CASC19 下调对移植瘤中NPM1 表达的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 基于芯片技术鉴定CASC19调控的下游靶基因及信号通路 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验设计及样本的制备 |
| 6.1.1.1 细胞培养与感染 |
| 6.1.1.2 细胞总RNA提取 |
| 6.1.1.3 细胞总RNA质检 |
| 6.1.2 芯片的制备 |
| 6.1.3 芯片实验 |
| 6.1.3.1 反转录合成cDNA |
| 6.1.3.2 体外转录合成标记cRNA |
| 6.1.4 芯片的杂交 |
| 6.1.5 芯片的洗染和扫描 |
| 6.1.6 差异分析 |
| 6.1.7 IPA分析 |
| 6.1.8 qRT-PCR验证芯片结果 |
| 6.1.9 统计学分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 芯片数据的质量评估 |
| 6.2.2 差异分析结果 |
| 6.2.3 IPA分析结果 |
| 6.2.3.1 IPA的经典通路分析结果 |
| 6.2.3.2 IPA的上游调控分析结果 |
| 6.2.3.3 IPA的疾病和功能分析结果 |
| 6.2.3.4 IPA的调控效应分析结果 |
| 6.2.3.5 IPA的相互作用网络分析结果 |
| 6.2.4 qRT-PCR验证结果 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 CASC19 通过募集HDAC1 来抑制NPM1 表达的机制研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 细胞培养 |
| 7.1.1.1 细胞复苏 |
| 7.1.1.2 细胞传代 |
| 7.1.1.3 细胞冻存 |
| 7.1.2 慢病毒制备 |
| 7.1.2.1 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.2 HDAC1 shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.3 MYC shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.4 CASC19过表达慢病毒制备 |
| 7.1.2.5 HDAC1过表达慢病毒制备 |
| 7.1.2.6 MYC过表达慢病毒制备 |
| 7.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 7.1.4 细胞总RNA提取及质检 |
| 7.1.4.1 细胞总RNA提取 |
| 7.1.4.2 细胞总RNA质检 |
| 7.1.5 qRT-PCR 实验 |
| 7.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 7.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 7.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 7.1.6 核质分离实验 |
| 7.1.6.1 分离细胞核和细胞质 |
| 7.1.6.2 RNA抽提及反转录 |
| 7.1.6.3 qRT-PCR检测 |
| 7.1.7 WB 实验 |
| 7.1.7.1 细胞总蛋白提取 |
| 7.1.7.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 7.1.7.3 电泳 |
| 7.1.7.4 电转 |
| 7.1.7.5 显色 |
| 7.1.8 RNA pull-down 实验 |
| 7.1.8.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.8.2 制备生物素标记的RNA |
| 7.1.8.3 标记RNA探针 |
| 7.1.8.4 进行 RNA pull-down 实验 |
| 7.1.8.5 蛋白质谱鉴定 |
| 7.1.9 RNA 纯化染色质分离实验 |
| 7.1.9.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.9.2 超声处理 |
| 7.1.9.3 进行 Ch IRP 实验 |
| 7.1.9.4 DNA分离鉴定 |
| 7.1.9.5 蛋白质分离鉴定 |
| 7.1.10 RNA 结合蛋白免疫沉淀实验 |
| 7.1.10.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.10.2 准备磁珠 |
| 7.1.10.3 RNA结合蛋白免疫沉淀 |
| 7.1.10.4 RNA纯化 |
| 7.1.10.5 qRT-PCR检测 |
| 7.1.11 染色质免疫共沉淀实验 |
| 7.1.11.1 细胞交联 |
| 7.1.11.2 染色质片段化 |
| 7.1.11.3 DNA纯化 |
| 7.1.11.4 免疫沉淀 |
| 7.1.11.5 解交联 |
| 7.1.11.6 qPCR或者测序 |
| 7.1.12 双荧光素酶报告基因实验 |
| 7.1.13 统计学分析 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 CASC19的亚细胞定位 |
| 7.2.2 RNA pull-down实验检测与CASC19 相互作用的蛋白质 |
| 7.2.3 ChIRP实验检测与CASC19 相互作用的蛋白质和基因 |
| 7.2.4 CatRAPID验证CASC19与HDAC1 蛋白相互作用 |
| 7.2.5 WB检测RNA pull-down富集蛋白中HDAC1 的表达 |
| 7.2.6 RIP实验证明CASC19 可以结合HDAC1 蛋白 |
| 7.2.7 HDAC1 的表达不受CASC19 的调控 |
| 7.2.8 ChIP-seq实验检测与HDAC1 相互作用的基因 |
| 7.2.9 CASC19 下调抑制HDAC1与NPM1 启动子的结合 |
| 7.2.10 NPM1 的表达受HDAC1 的调控 |
| 7.2.11 CASC19 通过募集HDAC1 抑制NPM1 的表达 |
| 7.2.12 CASC19上游的调控转录因子预测 |
| 7.2.13 CASC19 的表达受MYC的调控 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 全文结论 |
| 8.1 主要结论 |
| 8.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 综述 染色体8q24.21 区域的lncRNA在癌症中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（9）LINC00612在膀胱癌中的生物学功能及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 LINC00612对膀胱癌细胞增殖和侵袭能力的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 LINC00612/miR-590/PHF14构成ceRNA网络调控膀胱癌发生发展的研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 LINC00612/miR-590/PHF 14轴调控膀胱癌细胞上皮-间充质转化的研究 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 展望 |
| 结论 |
| 综述 长链非编码RNA在膀胱癌中表达的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 缩略词表 |
| 攻读博士期间发表的文章 |
| 已发表英文论文 |
| 致谢 |
（10）lncRNA LINC00460竞争性结合miR-539调控MMP-9促进脑膜瘤恶性转化的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 lncRNA LINC00460 在人脑膜瘤组织中的表达分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 lncRNA LINC00460 调控人脑膜瘤细胞株恶化的功能研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 lncRNA LINC00460 靶向miR-539 调控MMP-9 的表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 英汉缩略语名词对照表 |
| 致谢 |
四、携TGFβ1正、反义基因载体对膀胱癌细胞体外生长的作用（论文参考文献）
- [1]LncRNA LOWEG通过miR-629/LIFR轴抑制膀觥癌进展的分子机制研究[D]. 廖新惠. 南方医科大学, 2021(02)
- [2]LINC00858在膀胱癌中的作用和机制研究[D]. 黄骥. 南昌大学, 2021(01)
- [3]长链非编码RNA LINC00963抑制角膜纤维化瘢痕形成的机制研究[D]. 张丽霞. 青岛大学, 2020(01)
- [4]膀胱癌进展和预后基因模型的构建以及CTHRC1在膀胱癌进展中的作用及机制研究[D]. 印胡滨. 重庆医科大学, 2020(01)
- [5]环状RNA circANKS1B促进乳腺癌细胞上皮间质转化及侵袭转移的作用机制研究[D]. 曾凯旋. 东南大学, 2020(01)
- [6]lncRNA2919调控毛兔毛囊周期性再生的分子机制研究[D]. 赵博昊. 扬州大学, 2020
- [7]快速心房起搏犬心房组织中非编码RNA表达谱功能和作用机制研究[D]. 王蔓蔓. 天津医科大学, 2020(06)
- [8]长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究[D]. 汪文杰. 兰州大学, 2020(01)
- [9]LINC00612在膀胱癌中的生物学功能及机制研究[D]. 缪立英. 苏州大学, 2019(06)
- [10]lncRNA LINC00460竞争性结合miR-539调控MMP-9促进脑膜瘤恶性转化的研究[D]. 邢洪顺. 青岛大学, 2019(07)