一、Prokaryotic Expression and Preparation of Polyantibody of Human Histydyl-tRNA Synthetase Related Gene（论文文献综述）
贾芳[1]（2021）在《布鲁氏菌S19 bvfA基因缺失株免疫保护性及其与睾丸支持细胞互作组学研究》文中研究指明布鲁氏菌病（布病）作为一种全球性的人畜共患病,严重影响着流行地区居民的身体健康和经济发展,因此,布病的防控工作受到越来越多国家的重视。目前,免疫预防是控制布病的主要手段之一。由于现有的动物疫苗存在毒性残留和干扰常规血清学检测等缺点,制备高效、安全的毒力基因缺失活疫苗成为控制布病的新趋势。bvfA（Brucella virulence factor A）基因是布鲁氏菌（Brucella）特有的赋予其在宿主胞内建立复制生态位的毒力基因。但bvfA基因在布鲁氏菌中具体生物学功能尚未明确,特别是bvfA基因在布鲁氏菌感染靶细胞过程中的功能尚处于空白。方法:本研究利用开放性读码框预测软件确定编码BvfA蛋白的基因序列,利用PCR技术测定bvfA基因在临床布鲁氏菌分离株中的分布频率,利用基因同源重组和细菌接合转移原理构建B.abortus S19△bvfA菌株及其回补株,模拟细胞内环境条件检测B.abortus S19△bvfA菌株的应激能力;CCK-8法评估B.abortus S19△bvfA菌株在TM4睾丸支持细胞中的增殖能力,LDH法检测B.abortvs S19ΔbvfA菌株对TM4睾丸支持细胞的损伤性,用ELISA方法评价B.abortus S19△bvfA菌株的免疫原性和免疫反应性,用组织细菌计数法评估B.abortus S19△bvfA菌株对布鲁氏菌强毒株攻击的免疫保护性;HE组织切片染色展示B.abortus S19△bvfA菌株与其它布鲁氏菌对组织损伤的区别。用Illumina Hiseq测序和液相色谱-串联质谱技术在转录组、蛋白质组和代谢组水平上联合分析bfA基因在布鲁氏菌中的作用及其在布鲁氏菌感染宿主时的作用。结果:（1）获得了大小为336 bp的bvfA基因序列,将bvfA基因提交到Genbank中获得基因序列号（MN651999）;确定bvfA基因在临床布鲁氏菌分离株中100%保有。（2）B.abortus S19△bvfA菌株较它的亲本株和回补株生长速度慢;在热刺激、高盐、高渗、强酸和抗菌素条件下,B.abortus S19△bvfA菌株生长均受到抑制,仅在氧化压力下生长良好（p<0.05）。（3）在12 h、24 h和48 h时,B.abortus S19△bvfA菌株入侵TM4睾丸支持细胞富集到的菌落数分别是B.abortus S19菌株的90%、95%和96%;在12 h、24 h和48 h时,TM4睾丸支持细胞感染B.B abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株后的死亡率分别是13.39%和7.14%,14.97%和12.40%,33.8%和31.2%。（4）免疫B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株小鼠血清中抗体效价1～3周均呈上升趋势,4周趋于平稳,两者抗体水平无显着性差异（P>0.05）。血清中IFN-γ含量在1周～2周升高,IL-2在1周～4周升高,IL-4在2周～3周升高。B.abortvs S19△bvfA菌株和.abortusS19菌株免疫小鼠血清抗体与BvfA蛋白反应的抗体效价分别是2.16和4.21（2周）,2.16和4.52（3周）。免疫B.abortus S19△bvfA菌株小鼠脾载菌量是B.abortus S19菌株的86%（1周）、93%（2周）和84%（4周）。小鼠免疫B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株后攻强毒株B.melitensis 16M,脾载菌量是未免疫攻强毒株B.tmeliensis 16M的0.03%和2.9%（1周）,0.75%和0.33%（2周）。小鼠免疫B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株后攻强毒株B.abortus 2308,脾载菌量是未免疫攻强毒株B.abortus 2308的9.8%和6.5%（1周）,6.8%和6.8%（2周）。（5）转录组学和蛋白质组学技术关联分析显示,B.abortuAs S19△bvf菌株RNA聚合酶中的rpoA、rpoC和rpoB基因表达量下调;蛋白质组学和代谢组学技术关联分析显示,B.abortus S19△bvfA菌株和B.S19菌株蛋白质组和代谢组差异主要表现为ABC转运、嘌呤代谢和氨酰-tRNA生物合成。（6）转录组学和蛋白质组学技术关联分析显示,分别感染B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株的TM4睾丸支持细胞之间的差异表现为逆行神经信号通路;蛋白质组学和代谢组学技术关联分析显示,感染B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株的TM4睾丸支持细胞之间的差异表现为逆行神经信号通路,矿物质吸收和鞘脂信号通路。结论:（1）bvfA基因参与了 B.abortus S19菌株在宿主细胞中的增殖和对宿主细胞内环境的适应。B.abortu sS19△bvfA菌株在感染早期（12h）对TM4睾丸支持细胞的损伤强于其他布鲁氏菌。小鼠腹腔注射B.abortus S19△bvfA菌株1周即能引起免疫应答,且具有很好的免疫保护效果。B.S19△bvfA菌株对小鼠脾脏和睾丸的毒性及病理损伤均小于B.abortus S19菌株。（2）bvfA基因主要参与B.abortus S19菌株RNA聚合酶的转录、ABC转运、嘌呤代谢和氨酰-tRNA生物合成;bvfA基因能干扰宿主细胞的矿物质吸收、鞘脂信号通路和线粒体中NADH泛醌氧化还原酶复合体的功能。感染B.abortus S19△bvfA菌株的TM4睾丸支持细胞CatSper2表达量高度下调,推测CatSper通道可能是布鲁氏菌引起不育的主要靶点,P53表达量增加,推测bvfA基因能抑制TM4睾丸支持细胞的凋亡。
钟亦晔[2]（2020）在《宿主WARS蛋白在A型流感病毒H7N9感染过程中的功能分析》文中指出A型流感病毒（Influenza A virus,IAV）是引起人类和动物呼吸道病症的主要病原微生物之一,并以其广泛的宿主范围、较快的传播速度和季节性流行的特点成为威胁公共卫生安全和社会经济发展的主要因素之一。细胞不仅是IAV的宿主,更是对抗IAV感染的重要组成部分之一。因此深入研究宿主细胞与IAV之间的关系,尤其是发掘宿主细胞内具有抗IAV感染功能的限制性因子（Restrictive factors,RFs）具有重要意义。在本实验室前期的IAV感染蛋白质组研究中,发现了 一个在IAV复制过程中表达异常的宿主蛋白人类色氨酰tRNA合成酶WARS。为探究WARS在H7N9病毒感染过程中所发挥的功能和潜在的机制,首先以A549细胞的cDNA为模板,PCR扩增WARS基因,构建原核表达载体pET-28a（+）-WARS。经由大肠杆菌E.coli BL21表达后,采用镍柱变性纯化的方式获得重组蛋白His-WARS,并以其作为免疫原,免疫新西兰大白兔,获得兔抗WARS多克隆抗体。然后对H7N9病毒感染前后WARS的表达量和胞内分布情况进行分析,Western blot和荧光定量PCR实验结果表明,H7N9病毒的感染能够使WARS的表达量显着上调;激光共聚焦实验结果显示在H7N9病毒感染后,WARS出现入核现象。之后构建WARS过表达细胞系并筛选有效敲低WARS的siRNA,同时设置H7N9病毒的感染剂量梯度和感染时间梯度实验组,分别从mRNA、vRNA、蛋白表达和病毒滴度层面证明了 WARS对于H7N9病毒的复制具有负调控的作用。荧光定量PCR实验结果表明,在WARS负调控H7N9病毒复制时,IFN-β、ISG-15和ISG-56的转录水平无明显变化,同时Western blot结果显示RIG-I、p-TBK1、TBK1、p-IRF3、IRF3的蛋白水平也无显着差异。为进一步排除WARS对于Ⅰ型IFN通路的影响,构建了稳定敲低WARS的A549细胞系,并对p-IRF3和IRF3进行了检测,发现并无显着差异。随后进行低温4℃病毒吸附实验,在Western blot检测中,以H7N9病毒PB2蛋白表达量表示吸附在A549细胞表面的H7N9病毒粒子数量,结果显示过表达WARS使PB2蛋白的表达量显着下调,而敲低WARS使PB2蛋白的表达量显着上调;在流式细胞术检测中,以H7N9病毒NP蛋白的荧光强度代表H7N9病毒粒子的吸附数量,结果表明过表达WARS使NP蛋白的荧光峰值出现明显左移,而敲低WARS使NP蛋白的荧光峰值出现明显右移,二者结果共同表明WARS能够负调控H7N9病毒粒子吸附于A549细胞表面这一过程。本研究阐明了宿主蛋白WARS在IAVH7N9感染过程中的负调控作用,并初步证明了 WARS能够抑制病毒粒子的吸附,为深入理解宿主与IAV之间的关系,以及抗IAV药物的研发提供了一定的理论支撑。
唐子清[3]（2019）在《OsGWD1在水稻与水稻尖细潜根线虫互作中的功能分析》文中进行了进一步梳理水稻内寄生线虫是水稻重要的病害之一,受线虫侵染的水稻在地上部分通常无明显症状,但是,水稻线虫会导致植物生长速度减慢,特别是在水稻生长早期,导致水稻的有效分蘖数明显减少,植株黄化、矮化,根部变成黄褐色甚至腐烂。据统计,全球58%的水稻都受到了潜根线虫的侵染,导致水稻减产25%左右。水稻尖细潜根线虫（Hirschmanniella mucronata）是内寄生线虫的一种,它侵染并寄生在水稻的根部,通过分泌多种效应蛋白来降解或修饰水稻根部细胞壁和改变根部细胞蛋白功能来达到侵染和繁殖的目的。同时,水稻为了抵御线虫的侵染也会主动调节体内代谢水平,激活细胞壁修饰酶基因和防卫基因的表达,诱导产生植物激素等途径来抵抗内寄生线虫的侵染。实验室前期通过转录组测序,比较分析了接种与不接种尖细潜根线虫的水稻根部组织差异表达基因。本实验从差异表达基因中选取了OsGWD1基因,通过克隆该基因并表达出编码的蛋白质来寻找与其相互作用的蛋白,为进一步探究该基因在水稻与尖细潜根线虫互作中的作用,以及探索新的潜根线虫防治策略奠定理论基础。主要研究结果如下:1.扩增目的基因OsGWD1,利用TA克隆技术将该基因克隆转化pEASY-T3载体,获得了重组载体T3:OsGWD1。预测分析OsGWD1基因的开放阅读框为462 bp,共编码153个氨基酸,蛋白分子量大小约为18 KD,等电点（pI）为4.83;属于亲水性不稳定蛋白;该蛋白无信号肽且不含跨膜结构,表明其可能不属于膜蛋白或分泌蛋白;肽链中无规则卷曲所占比例较高,具有7个β片层结构;具有高度保守的WD40-repeat结构域,属于WD40-repeat家族;预测与OsGWD1蛋白可能互作的有10个蛋白并模拟形成了相互作用的关系网络图。2.通过克隆转化得到过表达载体pCAMBIA1302:OsGWD1:GFP,亚细胞定位发现目的蛋白定位于细胞核内。利用Gateway技术将RNAi片段重组至植物干扰载体pB7G,获得了重组RNAi质粒。利用农杆菌转化法将过表达重组质粒以及RNAi质粒转染进入水稻日本晴获得转基因水稻植株,为后续进行水稻潜根线虫接种实验提供了原材料。3.将OsGWD1的orf序列克隆重组进入原核表达载体中pCzn1中。提取阳性重组质粒进入含有分子伴侣pTf16的BL21（DE3）感受态细胞中,与分子伴侣蛋白共表达。经过SDS-PAGE分析和Western Blot验证表明成功表达出了18KD的目的蛋白。0.05 mM的IPTG诱导浓度,16℃诱导表达20 h为最优诱导表达条件。4.通过His-tag pull down获得25个可能与OsGWD1互作的水稻蛋白。GO分析发现,这些基因共富集在20个GO条目中,KEGG富集分析表明这些蛋白富集在12条通路中,主要集中在核糖体、氧化磷酸化和吞噬过程等代谢通路。其中,甘油醛-3-磷酸脱氢酶、S-腺苷甲硫氨酸转移酶、热休克家族蛋白Hsp70、Hsp73和延伸因子蛋白eEF1A在代谢通路中起着关键作用,对水稻胁迫反应及防卫反应具有重要意义。
郝英辰[4]（2019）在《烟草NtGCN2的原核表达纯化、抗体制备及性质鉴定》文中提出面对干旱、冷害、盐渍等不良环境,植物通常会调节自身代谢以应对胁迫,维持自身生长,而蛋白质作为生命的物质基础在这种调节中起到了至关重要的作用。GCN2是真核翻译起始因子eIF2α激酶,可以使eIF2α发生磷酸化,从而对蛋白质合成进行调节。酵母和动物中的研究发现,GCN2参与了多种胁迫应答的调节。在植物中,目前研究发现仅有一个eIF2α激酶--GCN2,推测其在植物应对胁迫的代谢通路中起到了重要作用,然而目前有关植物GCN2的研究仍存在许多未知之谜。目前有关植物GCN2的异源表达、纯化、性质鉴定和抗体制备等研究相对较少,一定程度上制约了植物GCN2的进一步研究。因此,本研究在前期研究基础上克隆了烟草NtGCN2（GenBank登录号:KJ706220）的N端1-437aa基因序列,构建了重组质粒pCzn1-NtGCN2（1-437aa）,并在大肠杆菌E.coli BL21（DE3）-Plys中成功表达了 NtGCN2（1-437aa）蛋白。其次,通过包涵体复性和Ni2+-NTA柱层析方法获得了纯化的NtGCN2（1437aa）蛋白质。再次,利用获得纯化蛋白质免疫新西兰大白兔后制备了NtGCN2多克隆抗体,并进行了 western-blot检测。此外,利用纯化的重组蛋白,采用同位素标记的方法对NtGCN2性质进行了体外鉴定。最后,根据酵母双杂交、Co-IP和RNA-seq等研究结果,采用实时荧光定量PCR对NtGCN2的互作蛋白进行了验证。这些结果为进一步研究植物GCN2的功能及其在逆境胁迫应答中的作用奠定了基础。研究的主要结果如下:首先,基于NtGCN2的全长序列的结构域分析,根据N端的（1-437aa）序列设计引物从前期构建的pMD-NtGCN2载体上克隆了 N端（1-437aa）片段,将该片段插入pCzn1载体中,获得了重组质粒pCzn1-NtGCN2（1-437aa）。将该载体转化至大肠杆菌BL21（DE3）Plys中,采用0.5mM的IPTG于37℃下诱导表达4小时,SDS-PAGE检测发现目的蛋白NtGCN2（1-437aa）主要存在于沉淀中。另外,在前期研究中,本研究组对NtGCN2的全长蛋白也进行了原核表达表达,SDS-PAGE检测发现目的蛋白主要存在于大肠杆菌BL21-（DE3）-RIPL的全蛋白上清液中。其次,通过包涵体复性和Ni2+-NTA琼脂糖亲和层析柱对表达的蛋白质进行了纯化,获得了条带单一的NtGCN2（1-437aa）和NtGCN2全长蛋白。将获得的蛋白免疫新西兰白兔后获得了 NtGCN2多克隆抗体。ELISA结果显示制备的两种抗体效价均为1:520 000。Western-blot检测结果发现制备的NtGCN2（1-437aa）和NtGCN2抗体均可成功检测到重组NtGCN2的表达,然而未能检测到烟草中NtGCN2的表达。我们推测其原因可能是原核表达系统缺乏甲基化、糖基化和其他修饰过程,导致抗原结合位点不能正常呈现而造成的。再次,利用实验室前期制备的NtGCN2（激酶功能域）和NteIF2α纯蛋白,采用同位素标记法对NtGCN2的激酶活性进行了体外鉴定。结果发现NtGCN2可以使其底物NteIF2α发生磷酸化,并且NteIF2α磷酸化水平随着反应体系中NtGCN2浓度增加而增加。时间梯度研究结果表明,NteIF2α的磷酸化水平随着反应时间的延长而增加。该研究结果说明重组蛋白NtGCN2可以在体外使eIF2α磷酸化,表明NtGCN2具有激酶活性。最后,我们根据实验室前期进行的酵母双杂交、Co-IP和RNA-seq数据筛选了 NtGCN2可能的互作蛋白,采用实时荧光定量PCR对NtGCN2互作蛋白进行了验证。结果发现,真核翻译起始因子eIF2α,离子转运相关基因HIPP和光呼吸相关基因PHAO的表达量随着NtGCN2表达量的增加而增加,而mRNA稳定性相关基因CCR4的表达量随着NtGCN2表达量的增加略有下降,活性氧相关基因NQO1的表达量无明显变化。该结果表明NtGCN2可能参与了活性氧清除和光呼吸等代谢过程。此外,在干旱处理下,NtGCN2,eIF2α,HIPP和NQO1基因的表达水平显着增高,其中PHAO的表达量增加约6倍,CCR4表达量的下降程度也表现的更为明显。该研究结果同时也表明,NtGCN2,eIF2α,HIPP,NQO1和CCR4等可能协同参与了植物干旱胁迫的调节。推测NtGCN2可能通过调节植物体内的蛋白质合成、mRNA含量、离子传递效率和氧化还原状态等参与了烟草对干旱胁迫应答,这些研究为梳理植物GCN2参与的胁迫调节网络奠定了基础。
喻娟娟[5]（2018）在《星星草（Puccinellia tenuiflora）应答H2O2的生理与氧化还原蛋白质组学研究》文中进行了进一步梳理各种环境逆境都会对植物造成氧化胁迫,研究植物氧化胁迫应答分子调控网络机制具有重要意义。星星草（Puccinellia tenuiflora）是我国北方盐碱地广泛分布的耐盐碱牧草,其盐碱应答生理生态学机制已经被广泛研究。我们的前期研究表明,星星草具有应答盐碱胁迫的特殊信号与代谢机制,但是对其应答盐碱造成的氧化胁迫的分子调控网络并不清楚。本研究通过外源施加H2O2模拟盐碱胁迫造成的氧化胁迫,进而利用氧化还原蛋白质组学方法与分子遗传学手段相结合,分析了星星草氧化胁迫应答的分子生理学机制。通过对蛋白质自由疏基含量、光合特性、叶绿素荧光参数和活性氧（reactive oxygen species,ROS）清除系统的分析,我们发现氧化胁迫对星星草造成了氧化损伤,导致蛋白质自由巯基含量的下降,抑制了星星草的光合速率;并且调控多种抗氧化酶的活性与非酶抗氧化剂的含量应答氧化胁迫。氧化还原蛋白质组学研究表明,在氧化胁迫（5 mM和10 mM H2O2处理6 h）条件下,星星草叶片中62种蛋白质丰度增加,58种蛋白质丰度减少;并且70条肽段氧化水平上升,51条肽段氧化水平下降。同时,游离叶绿体的氧化胁迫（5mM和10mMH2O2处理10 min）结果表明,叶绿体中85种蛋白质丰度增加,58种蛋白质丰度减少;并且20条肽段氧化水平上升,20条肽段氧化水平下降。这些蛋白质的丰度与氧化还原水平变化模式表明,Ca2+介导的激酶信号通路、膜运输和细胞骨架重塑、ROS稳态、胁迫与防御、光合作用、基因表达和蛋白质周转、糖代谢、氨基酸代谢等途径在星星草应答氧化胁迫过程中发挥了重要作用。同时,我们利用分子遗传学方法解析了质外体定位的星星草类萌发素蛋白（PutGLP）在根中优势表达,并受到NaCl、NaHCO3和CdC12胁迫的诱导。PutGLP具有超氧化物歧化酶和草酸氧化酶活性,对维持ROS稳态（O2·-和H2O2）有重要作用。在野生型拟南芥中过量表达PutGLP可以增强根系对盐碱胁迫的抗性。此外,对星星草谷氧还蛋白（PutGrxS10）家族的分析表明;PutGrxS10属于Grx家族第Ⅰ类中的GrxC5/S12亚家族,具有GrxS12亚家族的保守活性基序“WCSYS”。原核表达获得的PutGrxS10蛋白的氧化还原状态受β-巯基乙醇和DTT等还原剂调控。氧化还原蛋白质组学的结果表明,PutGrxS10保守基序中Cys78的氧化水平在氧化胁迫时显着上升,这暗示着Cys78的氧化还原变化可能参与其酶活性调控。我们同时发现PutGrxS10基因在星星草根、茎、叶、花、鞘、穗和种子中均有表达,并且在星星草应答H2O2、NaHCO3和Na2CO3等胁迫时表达量上升。这表明星星草可通过调节PutGrxS10的转录与翻译后修饰参与氧化胁迫应答过程的ROS稳态调节。整合生理学、氧化还原蛋白质组学与分子遗传学的研究结果,我们推测星星草利用多种策略应答氧化胁迫,主要包括:（1）通过调节重要蛋白质的氧化还原与可逆磷酸化水平调控Ca2+介导的信号转导途径,从而调节下游氧化胁迫应答基因的表达;（2）通过蛋白质氧化还原水平的变化调控膜泡运输、蛋白质跨膜转运、脂质运输,以及小分子物质（水分、离子和代谢产物）转运等过程;（3）调节细胞骨架蛋白质丰度引发细胞骨架的动态重塑;（4）改变重要抗氧化酶的丰度和氧化还原状态调节其酶活性,维持细胞内的ROS稳态;（5）调控病程相关蛋白的丰度和氧化还原水平应答氧化胁迫;（6）调控参与光合电子传递、ATP生成和碳同化的蛋白质丰度和氧化还原水平,调节光合效率;（7）增加转录和蛋白质合成相关蛋白质的丰度诱导下游应答基因的表达;增加分子伴侣的丰度避免蛋白质氧化损伤;增加蛋白质降解相关蛋白质的丰度降解氧化损伤蛋白质从而降低其细胞毒性;（8）调控糖代谢、氨基酸代谢,以及四吡咯化合物合成等过程重要酶的丰度与氧化还原状态,应答氧化胁迫。这些结果为深入研究植物盐碱胁迫应答的氧化还原调控网络提供了新的线索,也为耐盐农作物的选育提供了重要信息。
冯明芳[6]（2018）在《寒地粳稻生物反应器建立及FGF21蛋白表达效果研究》文中提出植物分子医药/农业是利用转基因植物以农业规模来生产人类所需的医药蛋白质。与微生物或动物细胞培养相比具有成本低、安全性高、易于规模化生产等优点。水稻除了作为世界上最重要的主要粮食作物之一外,目前还通过农杆菌介导的DNA转化作为分子医药的生物反应器。水稻种子作为植物生物反应器,已用于很多重组蛋白、疫苗和抗体等的生产。成纤维细胞生长因子21（FGF21）对高血糖、肥胖症等代谢疾病和肝癌的早期治疗有重要意义,有望成为治疗糖尿病、肥胖症和脂肪肝的新一代药物。微生物表达FGF21蛋白具有在胞内易形成包涵体、缺乏翻译后修饰、纯化成本高等不利因素。目前,水稻的转录组研究大多集中在生物和非生物胁迫上,而对这种DNA转化方法引起的全基因组功能改变则知之甚少,出于生物安全角度考虑,需要了解外源基因的表达对水稻代谢的影响。本研究首先利用北方寒地粳稻品种建立水稻种子生物反应器平台,然后利用水稻种子表达人源FGF21基因,在获得转FGF21水稻阳性植株和种子后,分别从农艺性状、微观结构、生理水平、转录水平和蛋白水平等不同层面,来阐述转FGF21对水稻代谢有何影响,以期为水稻生物反应器更高效、安全表达外源蛋白奠定基础。本研究获得的主要结果如下:1、高效转化技术的一个前提是组织培养系统的稳健性。不同水稻品种愈伤组织诱导和再生率的提高主要取决于生长调节剂的种类和浓度。本文对寒地粳稻品种东农427、龙稻14、东农428、龙粳25、龙稻17、空育131和垦稻19的生长调节剂组合进行了优化,其最佳组合分别是:东农427,1 mg·L-1 2,4-D+2 mg·L-1 6-BA+4 mg·L-1 KIN+0.2 mg·L-1 NAA;龙稻14,1 mg·L-1 2,4-D+4 mg·L-1 6-BA+4 mg·L-1 KIN+0.5 mg·L-1 NAA;东农428,2 mg·L-1 2,4-D+4 mg·L-11 6-BA+4 mg·L-1 KIN+0.02 mg·L-11 NAA;龙粳25,1 mg·L-11 2,4-D+4 mg·L-1 6-BA+2 mg·L-1 KIN+0.2 mg·L-1 NAA;龙稻17,1 mg·L-11 2,4-D+4 mg·L-11 6-BA+2 mg·L-1KIN+0.02 mg·L-11 NAA;空育131,1 mg·L-1 2,4-D+6 mg·L-1 6-BA+4 mg·L-1KIN+0.5 mg·L-1NAA;垦稻19,2 mg·L-1 2,4-D+2 mg·L-1 6-BA+4 mg·L-1 KIN+0.2 mg·L-1NAA。2,4-D用于诱导培养基,6-BA、KIN和NAA用于分化培养基。其中东农427和龙稻14培养力最高,故用作下一步遗传转化体系研究。2、用含有pCAMBIA 1301质粒的农杆菌EHA 105进行转化。当愈伤组织浸泡在0.272OD600（600nm处测定光密度）10 min时,东农427的转化效率最高;龙稻14愈伤组织在0.592 OD600的菌液中侵染20 min效果最好。两个品种的愈伤组织采用的共培养方式为:愈伤组织于无菌滤纸上1 mL液体共培养液浸湿,共培养时间均为3 d。对两个品种植株的PCR分析,证实了GUS基因的表达。东农427的转化效率优于龙稻14,故选用东农427做转FGF21的水稻遗传转化体系。3、构建植物表达载体,进行农杆菌介导的水稻转化,获得T0代植株,PCR和RT-PCR检测得到转基因阳性植株50株,收集T1代种子。在第二、三年分别种植,获得T2、T3代种子进行Western blot分析,T2代有6个Western blot阳性株系,T3代得到12个Western blot阳性株系。对转基因和野生型植株及种子进行农艺性状分析,除转基因成熟种子粒重比野生型显着降低,其余无显着差异。得到T3代转基因阳性种子,进行生理分析,在淀粉和蔗糖含量及代谢相关酶活方面,转FGF21水稻与野生型水稻未成熟和成熟种子之间存在显着差异。扫描电镜分析发现,转FGF21水稻与野生型水稻成熟种子颖壳结构存在差异,转基因较野生型维管束少且排列不规整。亚细胞定位分析表明,FGF21蛋白在细胞质和细胞核中均有分布。4、将野生型（CK一个株系）及转FGF21的水稻（T1、T2和T3三个株系）未成熟种子进行转录组学分析:KEGG通路分析表明,1762个差异表达基因（DEGs）主要涉及淀粉和蔗糖代谢、植物-病原体相互作用、内吞作用、戊糖和葡萄糖醛酸相互转化以及半乳糖代谢。从6个通路挑选12个候选基因采用qRT-PCR证实了从RNA-Seq推断的候选DEG的差异表达,证明了RNA-Seq数据的准确和可靠。通过对以上5个通路的转录水平分析表明,FGF21转入可影响水稻淀粉和糖类代谢,进而影响种子物质积累,但FGF21转入并未引起水稻免疫应答反应以及胁迫应答响应。5、将野生型（CK）和转FGF21株系T1的成熟种子进行label free蛋白质组学分析,其中CK组共有1298个差异蛋白,其中426个上调,872个下调;T1组共有1209个差异蛋白,500个上调,709个下调;CK与T1共有1135个差异蛋白,426个上调,709个下调。按照差异倍数达到1.5倍以上,且p value<0.05进行筛选后的差异蛋白数为437个。将差异蛋白进行GO富集分析,共有1355个差异蛋白注释到了35个条目中,其中上调蛋白259个,下调蛋白1096个。对鉴定到的差异蛋白进行通路分析,结果鉴定到的996个蛋白（其中227个差异蛋白）注释到了89个通路中,其中前10条具有显着差异（p<0.05）,包括淀粉和蔗糖代谢、氨基糖与核糖代谢、赖氨酸降解、氨酰-tRNA生物合成、色氨酸代谢、过氧化物酶体、泛酸和辅酶A生物合成、不饱和脂肪酸生物合成、脂肪酸代谢和缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸生物合成。分别从淀粉和糖代谢、氨基糖与核糖代谢以及过氧化物酶体三个通路挑选9个基因做qRT-PCR分析,上调基因数为4个,下调基因数为5个,与蛋白质组预测数据吻合,证明蛋白质组数据可靠。CK和T1、T2、T3株系中两种酶OsAGPS1和OsCht5的Western blot分析结果与蛋白质组结果一致。在蛋白水平,转FGF21与野生型没有较大差别,证明转FGF21对水稻是安全的。
曾维佳[7]（2018）在《谷氨酰胺tRNA合成酶剪接体QRS-C13相互作用蛋白的筛选研究》文中研究指明氨酰tRNA合成酶（Aminoacyl-tRNA synthetase,AARS）是一类催化氨酰化反应的酶,它在蛋白质合成过程中将氨基酸连接到对应的同源tRNA上。除了经典功能外,氨酰tRNA合成酶还有许多非经典功能。谷氨酰胺-tRNA合成酶（glutamine tRNA synthetase,Gln RS,QRS）是氨酰tRNA合成酶中的一种。谷氨酰胺-tRNA合成酶存在一种剪接体QRS-C13,它缺失了谷氨酰胺-tRNA合成酶的核心催化结构域,丧失了催化功能。那么QRS-C13与哪些蛋白之间存在相互作用?在细胞内QRS-C13通过什么样的作用机制发挥它的功能?我们通过比较QRS和QRS-C13结合蛋白之间的差异,筛选与QRS-C13特异作用的蛋白,这对了解QRS-C13的功能及其作用机制,发现QRS的非经典功能具有重要意义。本研究在Hela细胞中转染重组质粒p IRESpuro2-QRS-C13和p IRESpuro2-QRS,通过免疫共沉淀比较发现QRS-C13与QRS的结合蛋白之间存在很大差异,选取差异蛋白进行质谱分析,发现与QRS-C13专一作用蛋白可能是真核翻译起始因子3亚基L（Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit L,e IF3L）,亮氨酰tRNA合成酶（leucyl-tRNA synthetase,LRS）。Western-blot验证QRS-C13与e IF3L之间存在相互作用。通过构建重组质粒p ET20b-QRS-C13,p GEx-4T-2-e IF3L,p GEx-4T-2-LRS,在大肠杆菌中成功诱导表达获得了QRS-C13,e IF3L,LRS蛋白。体外GST-pull down实验发现QRS-C13与e IF3L之间为间接相互作用,QRS-C13与亮氨酰tRNA合成酶（LRS）之间存在直接相互作用,e IF3L与LRS之间存在直接相互作用。由此我们推测QRS-C13与e IF3L之间的相互作用需要LRS的参与,QRS-C13,e IF3L和LRS在细胞中形成复合体执行功能。通过细胞定位实验,发现QRS-C13主要集中细胞核中,e IF3L主要集中在细胞质中,我们推测QRS-C13可能参与细胞核内的相关生命活动。本文的研究结果对QRS-C13的功能研究奠定基础,同时也为QRS的非经典功能研究提供参考。
包世俊,丁小琴,邢小勇,伏小平,薛慧文,温峰琴[8]（2017）在《滑液支原体WVU1853株免疫相关膜蛋白的初步分析》文中提出膜蛋白是病原菌膜结构的主要组分,其不仅在病原菌的生命活动中具有重要的生理功能,且部分膜蛋白还与病原菌的感染及免疫应答密切相关。因此,本研究旨在应用免疫蛋白质组学方法分离、筛选并鉴定出滑液支原体免疫相关膜蛋白,以期为滑液支原体感染和免疫机制的研究及相关疾病诊断和防治方法措施的建立奠定基础。笔者应用培养至对数生长中后期的滑液支原体（Mycoplasma synoviae,MS）WVU1853株全菌分别免疫鸡和新西兰兔,制备滑液支原体鸡多抗和兔多抗。提取滑液支原体WVU1853株的膜蛋白,应用二维电泳技术对其进行分离,继而应用所制多抗进行Western blot,筛选出免疫原性膜蛋白,并通过质谱分析进行鉴定。结果表明,在筛选的8个蛋白质点中,3个蛋白质点为延伸因子EF-Tu,其余蛋白质点分别是丙酮酸脱羧酶α亚基、β亚基、NADH氧化酶、组氨酰-tRNA合成酶和二氢硫辛酰胺脱氢酶。其中组氨酰-tRNA合成酶的质谱分析得分太低,尚需进一步验证,而丙酮酸脱羧酶α、β亚基与作为滑液支原体的免疫相关膜蛋白首次被证实。本研究筛选并初步鉴定出滑液支原体7种免疫相关膜蛋白,为深入研究目标蛋白质的生物学特性及新型亚单位疫苗和诊断试剂的研发奠定了基础。
李家松[9]（2014）在《酪氨酰-tRNA合成酶突变体的结构生物学研究和基因编码非天然氨基酸设计荧光蛋白》文中研究表明化学生物学作为一门交叉学科,是利用化学知识和技术解决生命活动中的问题的学科,也是近些年来逐渐兴起的领域。越来越多的研究者尝试把化学和分子生物学尽可能完美的结合在一起,而遗传编码非天然氨基酸作为化学生物学这一领域的杰出代表,被广泛应用于蛋白质翻译后修饰、蛋白荧光标记、蛋白质结构分析、基于荧光蛋白的各种探针等领域。这种新颖而实用的方法可以广泛应用到大肠杆菌、酵母、和动植物中。目前,通过在细胞中引入外源的特殊密码子和相应的tRNA/氨酰tRNA合成酶正交对,已有超过80种具有各种各样的物理、化学、生物学性质的非天然氨基酸被高效的编码到目标蛋白的特定位点。这些非天然氨基酸包括:具有敏感核磁核磁信号的氨基酸、具有反常散射的氨基酸、能螯合金属离子的氨基酸、有荧光特性的氨基酸、具有表观遗传学中各类修饰的氨基酸、具有特殊光化学性质的氨基酸,以及具有氧化还原活性的氨基酸。如果把化学生物学比作一个直角坐标系,横轴是化学学科,纵轴是生命科学学科,那么他们的交叉点应该是结构生物学,结构生物学无疑是直接从原子、分子、化学键的角度来解释、分析生命体系中机制的最有力武器。在遗传编码非天然氨基酸领域更是如此,无论是翻译正交系统的建立,非天然氨基酸的筛选,还是编码非天然氨基酸的特定蛋白质执行功能的结构机理,都离不开结构生物学强有力的支持。第一个成功利用tRNA/合成酶正交对来编码非天然氨基酸的是酪氨酸合成酶及改造后的Mj tRNATyr,来自古细菌詹氏甲烷球菌（Methanococcus jannaschii,简称Mj）,正是基于这个合成酶和对应的tRNA、底物酪氨酸、ATP类似物的复合物结构。2002年发现在古细菌甲烷八叠球菌甲胺甲基转移酶含有TAG stop codon编码的吡咯赖氨酸,之后解析的吡咯赖氨酸合成酶及其底物的复合物结构也为基因密码子扩展的重要基础。在用于筛选各种非天然氨基酸的氨酰tRNA合成酶的突变文库构建以及催化特定非天然氨基酸合成酶的效率改善过程中,氨酰tRNA合成酶与其底物氨基酸或非天然氨基酸的相互作用机制为其提供了可靠而且有指向性的依据。同样,如果编码非天然氨基酸的蛋白与之前的野生型蛋白在性质和功能上有明显的差异,就可以从结构生物学角度阐述加入非天然氨基酸后对蛋白构象的影响,进而解释其性质和功能的变化。生物大分子X射线衍射技术,凭借其独特的优势,已经成为结构生物学的主流研究手段,已经广泛应用于生命科学、化学、医学、药学等诸多领域。作为非专业从事结构生物学的研究者,如何快速、准确的利用好这个有力的技术也成为越来越多科研人员的迫切要求。本文的第一部分从一个非专业者的角度描述了如何学习、掌握结构生物学知识和实验技术的过程。本研究采用遗传编码非天然氨基酸方法,从以下两个方面进行了相关实验:1.酪氨酰-tRNA合成酶突变体的结构生物学研究酪氨酸磷酸化是在蛋白质中特定位点的酪氨酸的酚羟基上共价连接一个磷酸根基团,是最重要的蛋白质翻译后修饰的方式之一,其蛋白质构象变化、蛋白-蛋白相互作用的调节在以及酶的活性调节过程中,扮演着举足轻重的角色。磷酸酪氨酸激酶活性中心的酪氨酸非正常磷酸化会导致许多疾病滋生,尤其与癌症的发生密切相关。细菌中的毒性激活机制也和酪氨酸磷酸化有关系。目前,各种针对酪氨酸激酶活性中心设计的小分子抑制剂是治疗肿瘤的主要方法。但是随着患者的病情发展,酪氨酸激酶中的药物靶点的氨基酸会不断突变,愈来愈多的患者对以前使用的抗肿瘤药物逐渐产生了耐药性,治疗效果也大大削弱。因此,有必要发展更高效灵敏的方法来检测酪氨酸激酶活性中心尤其是药物靶点的构象的变化。19F核磁共振是近几年兴起的一种探究酶的催化作用机制和蛋白构象如何变化的一种有利工具。因为氟在蛋白中的丰度为零,而且在NMR中有着十分敏感的化学信号,并且其对周围的化学环境十分敏感。所以,人们发展了许多化学合成与生物转化的方法来编码含氟的非天然氨基酸。在这些方法中,基因编码非天然氨基酸具有独特的优势,因为其可以在蛋白质的特定位点插入含氟的非天然氨基酸,并且其产量相对来说很高,可以达到每升菌毫克级别。遗憾的是,目前还没有利用19F NMR研究酪氨酸磷酸化的相关报道。在利用大肠杆菌作为宿主表达目的重组蛋白的过程中,我们在加入含有19F的酪氨酸类似物3,5-二氟-L-酪氨酸（F2Y）,并应用基因编码非天然氨基酸的方法实现了原核酪氨酸激酶Etk活性中心Tyr574位点的定点19F标记。这些定点标记的3,5-二氟-L-酪氨酸位点在磷酸化和去磷酸化的不同状态下,其核磁共振的化学位移会表现出差别,而且信号的强度变化可以直接反应相应的磷酸化酪氨酸所占比例的变化。此外,我们应用19F固体核磁共振方法,对一种肿瘤形成中关键的非受体酪氨酸激酶Src进行了磷酸化水平的分析。通过19F NMR的检测,我们发现dasatinib（一种针对c-Src的抗肿瘤药物）与激活状态的c-Src结合后会引起c-Src活性中心的a-loop构象变化。这些研究不仅为研究酪氨酸激酶的激活机制提供了重要的研究手段,也可以基于酪氨酸激酶与底物相互作用关系筛选新的抗肿瘤药物。2.基因编码非天然氨基酸设计荧光蛋白电子传递（ET）涉及生物体内许多重要的生化过程,包括光合作用和细胞色素P450介导的氧化反应等。目前,研究与生命活动相关的蛋白质中的电子转移已经取得了长足的发展。在合成生物学领域,通过改造生物体内的各个元件来实现人为可以控制的高效率的光致电荷分离,是现阶段生产可再生能源的最紧要瓶颈。目前,还只能依靠把探针连接到蛋白质本身的组氨酸或半胱氨酸残基上来测量蛋白质中的电子传递。通常,这也决定了这种方法只能限制在比较小的可溶性蛋白的研究方面,这大大限制了其应用。光致电子传递（PET）产生的荧光淬灭现象是用来探究生物大分子中构象变化的一种可靠方法。高效的光致电子转移需要电子供体和受体之间的距离足够近（小于14埃）,在对生物大分子中构象的微小变化进行研究时,利用光致电子传递引起的荧光淬灭可以弥补荧光共振能量转移（FRET）方法的诸多不足,但由于技术所限,前者只可以用酪氨酸或色氨酸当电子供体。我们把一种结合金属离子的非天然氨基酸3-吡唑基酪氨酸（pyTyr）在大肠杆菌中编码到荧光蛋白中,第一次实现了在荧光蛋白发色团至二价铜离子之间的快速光致电子转移过程,并测定电子转移在1纳秒的时间以内（此速度接近光系统中心的速度）发生。我们获得了 3-吡唑基酪氨酸高效结合二价铜离子的结构生物学基础。这些新方法为金属蛋白设计提供了新的研究手段,为了解析蛋白质动态构象变化研究提供了新的科学视角,为改造生物体内的各个元件来实现人为可以控制的高效率的光致电荷分离提供了新的研究思路。我们还合成了新一代的8-羟基喳啉丙氨酸（HqAla）,其螯合金属离子能力更强。通过基因编码非天然氨基酸的方法,我们在大肠杆菌中实现了将HqAla编码到重组蛋白中。其中,在一些荧光蛋白如sfYFP、sfGFP、PsmOrange和eqFP650的发色团编码8-羟基喹啉丙氨酸,我们发现这些荧光蛋白的最大发射波长均红移大约30nm。其中,eqFP650-67-HQAla的发色团的最大吸收峰红移至680 nm,这是目前为止有文献报导的发射波长最大的荧光蛋白。这些突变体可以作为一种标签,在体内成像研究中,提高检测的灵敏度,可以用于深层组织成像以及作为荧光共振能量转移传感器的能量受体（acceptor）。深入地研究锌离子对生命活动的调控机理需要特异且敏感的锌离子感应器,由于该非天然氨基酸可以在活细胞中编码,所以其可作为选择性检测锌离子的生物传感器。8-羟基喹啉丙氨酸和铜离子结合能力是我们之前报道的3-吡唑酪氨酸的九百万倍,所以这个氨基酸是比3-吡唑酪氨酸更加优良的光致电子转移探针,无疑为探究蛋白质中光致电子转移现象提供了更加有力的技术支持。综上所述,我们的研究成果为利用顺磁共振研究蛋白质动态构象变化提供了有力的技术支持,为蛋白传感器的设计提供了新的工具,也为金属蛋白的理性设计方面提供了更独特的视角。
宋传生[10]（2014）在《泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶及tRNA-异戊烯基焦磷酸转移酶基因研究》文中进行了进一步梳理泡桐丛枝病是由植原体引起的一种重要的林木病害，在中国发生和分布于北至山海关，南到长江流域的广大范围内，是国内极具代表性的植原体病害，给泡桐生产造成了严重危害，具有重要的研究价值。胸苷酸激酶催化磷酰基从ATP转移到dTMP形成dTDP，是三磷酸胸苷从头合成和补救途径的关键酶。该酶广泛存在于各种生物中，是DNA合成过程中的重要限速酶，对于生物的生存必不可缺。本文对泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶基因进行了克隆、测序、多态性分析、原核表达及纯化、体外酶活性测定、对转化大肠杆菌生长和繁殖的影响以及该基因在植原体中的表达等研究，为植原体的繁殖、致病机理研究、病害治疗的新药物设计与筛选及病害综合防治等研究奠定了基础。本研究设计引物并PCR扩增了泡桐丛枝植原体河北平山株系（PaWBPs）和江西吉安株系（PaWBJan）的tmk基因，直接和克隆测定tmk序列，利用DNAMAN、MEGA等软件进行序列多样性、序列变异、蛋白功能域、系统进化等比较分析。结果表明，从PaWBPs和PaWBJan中克隆测序的93条和41条tmk-a中，分别鉴定出52和24种不同的序列，tmk-a ORF可被划分为两类，tmk-a-1为639bp，tmk-a-2为627bp，PaWBPs株系tmk-a-1与tmk-a-2序列条数的比值约为2.5，而PaWBJan株系为3.3，PaWBPs有5个相同的tmk-a-1序列与PaWBJan的一个tmk-a-1序列及枣疯植原体tmk-Y序列完全一致。因多位点突变，PaWBPs含假基因比例达48.1%，PaWBJan的为41.7%；tmk-b基因为单一序列，两株系的tmk-b核酸序列相似性为99.8%，编码蛋白仅有一个氨基酸差异。Tmk-a和tmk-b中都具有胸苷酸激酶的3个保守功能域。系统进化分析显示，泡桐丛枝植原体的两个株系的所有tmk-a序列都与枣疯植原体tmk-X和tmk-Y等聚为一个进化枝I中；而tmk-b与小麦蓝矮tmk-2等聚为另一进化枝III，基于tmk-b序列和基于16S rDNA序列构建的系统进化树一致，tmk-b有助于植原体16Sr组水平的分类，而tmk-a可用于植原体株系变异和遗传多样性分析。对从泡桐丛枝（PaWB）植原体中获得的3个预测的同源蛋白TMK-a-1、TMK-a-2及TMK-b与已报道的小麦蓝矮（WBD）、洋葱黄化（OY-W）植原体的TMK-a、TMK-b的氨基酸序列进行了比对和相似性分析，结果显示PaWBPS TMK-b与WBD TMK-2和OY-W TMK-b之间的相似性分别为95.65%和99.03%；PaWBPS TMK-a-1与PaWBPSTMK-a-2的相似性为90.57%，且二者与WBD TMK-1和OY-W TMK-a之间的相似性为87.32%-94.26%；而PaWBPS、WBD、OY-W三种植原体的TMK-a与TMK-b之间的相似性仅为22.22%-25.95%。构建了PaWBPS TMK-b、TMK-a-1、TMK-a-2的pET28a原核表达载体，对PaWBPS TMK-b、TMK-a-1、TMK-a-2三种蛋白分别进行了原核表达，经Ni-NTA柱纯化后进行了酶催化活性测定，结果表明，PaWBPS TMK-b具有较高的胸苷酸激酶活性，为85.960.74U·mg-1，而PaWBPS TMK-a-1和TMK-a-2几乎没有胸苷酸激酶活性。通过生长曲线的测定，研究了在BL21（DE3）大肠杆菌细胞中表达的PaWB TMK-a-1、TMK-a-2和TMK-b蛋白对细菌生长和繁殖的影响，结果表明，PaWB TMK-a-1、TMK-a-2和TMK-b对对数生长后期大肠杆菌的繁殖都有显着的促进作用，PaWB TMK-b对大肠杆菌繁殖的促进作用最明显，PaWB TMK-a-1和TMK-a-2次之，并且PaWB TMK-a-1和TMK-a-2对细胞繁殖的促进作用的强弱无明显差异。该研究结果也表明，体外测定无胸苷酸激酶活性的PaWB TMK-a-1和TMK-a-2可能在植原体细胞内以不同于TMK-b的方式发挥着重要功能。本研究制备了PaWB tmk-a-1、tmk-b及16S rDNA（对照）基因DNA探针，用泡桐丛枝植原体RNA在42℃和68℃杂交条件下进行的Northern blot结果显示，泡桐丛枝植原体中含有大量表达的16S rRNA；但16S rDNA探针也能从健康泡桐总RNA中检测到杂交信号；然而用PaWB tmk-a-1、tmk-b探针并未检测到PaWB tmk-a-1和tmk-b基因mRNA的杂交信号，这可能是由于tmk-a-1和tmk-b基因表达的mRNA的量很低或该基因存在尚不清楚的特殊时空表达特性导致的。另外，通过对PaWB16S rDNA与拟南芥、烟草、毛果杨等植物叶绿体16S rDNA及线粒体rRNA序列比对分析后发现，PaWB16S rDNA与这些物种的叶绿体16S rDNA序列相似性值均在70%以上，据此推测，用PaWB16SrDNA探针从健康泡桐总RNA中检测到的杂交信号很可能源于和PaWB16S rDNA高度同源的泡桐叶绿体16S rDNA或线粒体rRNA。用纯化的原核表达蛋白免疫德国大白兔，分别制备了PaWB TMK-a-1和TMK-b的多克隆抗体。对泡桐丛枝植原体蛋白进行的Western blot、FITC免疫荧光显微镜及免疫电镜结果表明，表现典型丛枝症状的泡桐组培苗体内仅检测到PaWB TMK-a-1和TMK-b蛋白微弱的表达。然而，利用PaWB TMK-a-1和TMK-b抗体从健康泡桐总蛋白中也检测到了和PaWB TMK蛋白大小相似的Western blot印迹条带，用FITC免疫荧光显微镜在健康泡桐茎部皮层细胞也观测到该蛋白特异荧光。通过对PaWB TMK-a-1、PaWB TMK-b、AtTMPK全长及来源于转录组测序的泡桐TMK蛋白的部分氨基酸序列进行的比对和抗原决定簇序列分析发现，以上4种蛋白为同源蛋白，并且它们的多个抗原决定簇序列之间有高度的相似性，据此可推测，这些高度相似的抗原决定簇可能是健康泡桐总蛋白中出现交叉血清学反应的原因。利用PaWB TMK-a-1和TMK-b抗体进行的免疫电镜表明，泡桐细胞核和叶绿体上有大量的免疫胶体金颗粒，这也从亚细胞水平揭示了健康泡桐在Western blot印迹时出现条带的原因和蛋白可能的存在部位。本研究结果也为植原体与寄主植物可能存在的内共生学说提供了有力的实验证据。tRNA-IPT基因编码的蛋白tRNA-异戊烯基焦磷酸转移酶（EC2.5.1.8）,能催化二甲烯二磷酸（DMAPP）的异戊烯基转移到前体tRNA分子反密码子附近的腺嘌呤残基上。tRNA的这种修饰能够影响蛋白质翻译的保真度及效率；这种被修饰的tRNA降解产生异戊烯基腺嘌呤，可能具有细胞分裂素活性。通过测定转化有PaWB tRNA-ipt基因的大肠杆菌生长曲线，研究了PaWB tRNA-IPT蛋白对细胞生长和繁殖的影响，结果表明，PaWBtRNA-IPT对大肠杆菌的生长和繁殖具有显着的促进作用。比较转化有tRNA-IPT和tRNA-IPT（基因内部发生了碱基突变导致tRNA-IPT蛋白的编码提前终止）的大肠杆菌生长曲线后发现，在0.25至1.0mM IPTG诱导时，转化tRNA-IPT和pET28a空载体大肠杆菌的繁殖都受到IPTG的明显抑制，而转化有tRNA-IPT的大肠杆菌的繁殖几乎未受抑制。该结果表明PaWB tRNA-IPT突变体能够克服IPTG对大肠杆菌生长的抑制作用。为了进一步研究该基因的功能，本研究成功构建了PaWB tRNA-ipt基因的植物表达载体Cam35S-GFP tRNA-IPT。用花粉管介导法进行拟南芥转化试验，对收获种子进行转化效果测定，但结果未检测到外源基因的整合。
二、Prokaryotic Expression and Preparation of Polyantibody of Human Histydyl-tRNA Synthetase Related Gene（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Prokaryotic Expression and Preparation of Polyantibody of Human Histydyl-tRNA Synthetase Related Gene（论文提纲范文）
（1）布鲁氏菌S19 bvfA基因缺失株免疫保护性及其与睾丸支持细胞互作组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 符号与缩略语说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 布鲁氏菌病及其流行病学概况 |
| 1.1.1 布鲁氏菌病概述 |
| 1.1.2 布病流行病学特点 |
| 1.2 布鲁氏菌毒力因子研究进展 |
| 1.2.1 脂多糖 |
| 1.2.2 Ⅳ型分泌系统 |
| 1.2.3 BvrR/BvrS双组分调控系统 |
| 1.2.4 外膜蛋白 |
| 1.2.5 布鲁氏菌毒力因子在生殖疾病中的作用 |
| 1.2.6 布鲁氏菌毒力基因作为候选疫苗保护性抗原的研究 |
| 1.3 布鲁氏菌对宿主免疫反应的调节 |
| 1.3.1 布鲁氏菌与TLRs的识别 |
| 1.3.2 布鲁氏菌对先天免疫反应的调节 |
| 1.3.3 布鲁氏菌对适应性免疫反应的调节 |
| 1.3.4 布鲁氏菌OMPs的免疫反应 |
| 1.4 组学技术在布鲁氏菌疾病中的应用进展 |
| 1.4.1 转录组学 |
| 1.4.2 蛋白质组学 |
| 1.4.3 代谢组学 |
| 1.5 研究意义及技术路线 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.5 技术路线 |
| 第二章 临床布鲁氏菌分离株bvfA基因的分布频率及B.abortus S19ΔbvfA菌株的构建 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 临床布鲁氏菌分离株bvfA基因的检测 |
| 2.2.2 B.abortus S19△bvfA菌株的构建 |
| 2.2.3 B.abortus S19△bvfA/bvfA回补株的构建 |
| 2.2.4 GFP标记B.abortus S19及bvfA基因缺失株和回补株 |
| 2.2.5 bvfA基因的原核表达 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 毒力基因在临床布鲁氏菌分离株中的分布频率 |
| 2.3.2 B.abortus S19ΔbvfA菌株构建结果 |
| 2.3.3 B.abortus S19△bvfA/bvfA回补株构建结果 |
| 2.3.4 GFP标记B.abortus S19及bvfA基因缺失株和回补株结果 |
| 2.3.5 bvfA基因原核表达结果 |
| 2.4 讨论 |
| 小结 |
| 第三章 bvfA基因对B.abortus S19菌株及其宿主生物学特性的影响 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株、细胞系和实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 B.abortus S19△bvfA菌株的生长曲线测定 |
| 3.2.2 B.abortus S19△bvfA菌株体外应激水平检测 |
| 3.2.3 B.abortus S19△bvfA菌株与TM4睾丸支持细胞的相互作用 |
| 3.2.4 统计学分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 bvfA基因缺失减弱了B.abortus S19△bvfA菌株体外增殖活性 |
| 3.3.2 bvfA基因缺失影响了布鲁氏菌的体外应激水平 |
| 3.3.3 B.abortus S19△bvfA菌株入侵和在TM4睾丸支持细胞内增殖能力减弱 |
| 3.3.4 布鲁氏菌没有影响TM4睾丸支持细胞的增殖活性 |
| 3.3.5 B.abortus S19△bvfA菌株对早期感染的TM4睾丸支持细胞杀伤力强 |
| 3.3.6 B.abortus S19△bvfA菌株对小鼠毒力降低 |
| 3.4 讨论 |
| 小结 |
| 第四章 B.abortus S19△bvfA菌株的免疫原性和免疫保护性 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌株与试验动物 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 菌株制备 |
| 4.2.2 制备血清 |
| 4.2.3 抗体水平检测 |
| 4.2.4 细胞因子水平检测 |
| 4.2.5 BvfA蛋白与B.abortus S19AbvfA菌株免疫小鼠血清反应性检测 |
| 4.2.6 B.abortus S19△bvfA菌株免疫保护性检测 |
| 4.2.7 B.abortus S19△bvfA菌株对小鼠脾脏和睾丸的毒性和病理损伤研究 |
| 4.2.8 统计学分析 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 B.abortus S19△bvfA菌株免疫小鼠血清抗体水平 |
| 4.3.2 B.abortus S19△bvfA菌株免疫小鼠血清细胞因子水平的变化 |
| 4.3.3 BvfA蛋白具有区分疫苗免疫和野生毒株感染的能力 |
| 4.3.4 B.abortus S19△bvfA菌株具有针对强毒株攻击的免疫保护作用 |
| 4.3.5 B.abortus S19△bvfA菌株对小鼠脾脏和睾丸的毒性较低 |
| 4.3.6 B.abortus S19AbvfA菌株对小鼠脾脏和睾丸的病理损伤减小 |
| 4.4 讨论 |
| 小结 |
| 第五章 组学分析bvfA基因在B.abortus S19中的作用 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 菌株和细胞系 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 细菌总RNA的提取 |
| 5.2.2 转录组测序 |
| 5.2.3 细菌总蛋白质的提取 |
| 5.2.4 Label free蛋白组学技术 |
| 5.2.5 细菌总代谢物的提取 |
| 5.2.6 LC-MS非靶代谢组学技术 |
| 5.2.7 统计分析 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 转录组质量评估结果 |
| 5.3.2 B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株转录组轮廓分析 |
| 5.3.3 B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株转录组学研究 |
| 5.3.4 布鲁氏菌菌体蛋白质的浓度与质量结果 |
| 5.3.5 B.abortus S19△bvfA菌体和B.abortus S19菌体总蛋白质组学研究 |
| 5.3.6 B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株代谢组学研究 |
| 5.3.7 转录组学与蛋白质组学技术关联分析bvfA基因在B.abortus S19中的作用 |
| 5.3.8 蛋白质学与代谢组学技术关联分析bvfA基因在B.abortus S19中的作用 |
| 5.4 讨论 |
| 小结 |
| 第六章 组学通路下bvfA基因对B.abortus S19感染TM4睾丸支持细胞的影响 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 菌株和细胞系 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 主要仪器 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 细胞样本准备 |
| 6.2.2 转录组测序和转录组质量评估 |
| 6.2.3 蛋白质和代谢产物的提取 |
| 6.2.4 Label free蛋白组学技术和LC-MS非靶代谢组学技术 |
| 6.2.5 平行反应监测和Westen blot对蛋白表达量验证 |
| 6.2.6 统计分析和可视化 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 RNA质量分析 |
| 6.3.2 转录组学揭示bvfA基因在B.abortus S19菌株感染TM4睾丸支持细胞中的作用 |
| 6.3.3 蛋白质组学揭示bvfA基因在B.abortus S19菌株感染TM4睾丸支持细胞中的作用 |
| 6.3.4 代谢组学揭示bvfA基因在B.abortusS19菌株感染TM4睾丸支持细胞中的作用 |
| 6.3.5 转录组学与蛋白质组学关联分析感染B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株TM4睾丸支持细胞差异表达基因功能 |
| 6.3.6 蛋白质组学与代谢组学关联分析感染B.abortus S19△bvfA菌株B.abortusS19菌株TM4睾丸支持细胞差异表达基因功能 |
| 6.3.7 感染B.abortus S19△bvfA菌株和B.abortus S19菌株的TM4睾丸支持细胞差异蛋白质验证 |
| 6.4 讨论 |
| 小结 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简介 |
（2）宿主WARS蛋白在A型流感病毒H7N9感染过程中的功能分析（论文提纲范文）
| 论文创新点 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 A型流感病毒 |
| 1.1 A型流感病毒的结构 |
| 1.2 A型流感病毒的基因组与蛋白组成 |
| 1.2.1 血凝素蛋白HA |
| 1.2.2 神经氨酸酶NA |
| 1.2.3 基质蛋白M1 |
| 1.2.4 基质蛋白M2 |
| 1.2.5 核蛋白NP |
| 1.2.6 聚合酶碱性蛋白PB2 |
| 1.2.7 聚合酶碱性蛋白PB1 |
| 1.2.8 聚合酶酸性蛋白PA |
| 1.2.9 非结构蛋白NS1 |
| 1.2.10 核输出蛋白NEP |
| 1.3 A型流感病毒的生命过程 |
| 2 氨酰tRNA合成酶 |
| 2.1 ARSs的结构与分类 |
| 2.2 ARSs的功能 |
| 2.3 色氨酰tRNA合成酶 |
| 2.3.1 WARS的结构 |
| 2.3.2 WARS的功能 |
| 3 研究目的与意义 |
| 第二章 WARS蛋白的纯化表达及多克隆抗体制备 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒与菌株 |
| 1.2 细胞与实验动物 |
| 1.3 试剂与耗材 |
| 1.4 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 A549细胞cDNA的制备 |
| 2.1.1 A549细胞RNA的提取 |
| 2.1.2 A549细胞RNA的反转录 |
| 2.2 WARS基因的扩增 |
| 2.2.1 特异性引物的设计 |
| 2.2.2 PCR扩增WARS基因 |
| 2.3 WARS基因原核表达载体的构建 |
| 2.4 His-WARS重组蛋白的诱导表达与纯化 |
| 2.4.1 诱导表达与可溶性分析 |
| 2.4.2 重组蛋白的纯化 |
| 2.4.3 SDS-PAGE和Western blot验证分析重组蛋白 |
| 2.5 WARS兔多克隆抗体的制备和鉴定 |
| 2.5.1 新西兰大白兔的免疫 |
| 2.5.2 采血与血清制备 |
| 2.5.3 Western blot检测多克隆抗体与WARS蛋白的反应性 |
| 2.5.4 ELISA检测多克隆抗体的效价 |
| 3 结果 |
| 3.1 WARS基因的扩增 |
| 3.2 WARS基因原核表达载体的构建 |
| 3.3 His-WARS重组蛋白的诱导表达与纯化 |
| 3.4 His-WARS兔多克隆抗体的鉴定 |
| 4 讨论 |
| 第三章 宿主WARS蛋白负调控IAV H7N9的复制 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒与siRNA |
| 1.2 菌株、毒株与细胞 |
| 1.3 试剂与耗材 |
| 1.4 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 H7N9病毒感染对WARS的表达量和胞内分布的影响 |
| 2.1.1 A549细胞接种H7N9病毒 |
| 2.1.2 qRT-PCR检测H7N9病毒感染对WARS表达量的影响 |
| 2.1.3 Western blot检测H7N9病毒感染对WARS表达量的影响 |
| 2.1.4 激光共聚焦检测H7N9病毒感染对WARS胞内分布的影响 |
| 2.2 WARS过表达细胞系的构建 |
| 2.2.1 特异性引物的设计 |
| 2.2.2 PCR扩增WARS基因 |
| 2.2.3 pCDH-Puro-WARS过表达质粒的构建 |
| 2.2.4 慢病毒的包装 |
| 2.2.5 WARS过表达细胞系的筛选 |
| 2.2.6 WARS过表达细胞系的鉴定 |
| 2.3 过表达WARS对H7N9病毒复制的影响 |
| 2.3.1 过表达WARS细胞系接种H7N9病毒 |
| 2.3.2 qRT-PCR检测过表达WARS对H7N9病毒复制的影响 |
| 2.3.3 Western blot检测过表达WARS对H7N9病毒复制的影响 |
| 2.3.4 细胞上清病毒滴度检测过表达WARS对H7N9病毒复制的影响 |
| 2.4 筛选有效敲低WARS的siRNA |
| 2.5 敲低WARS对H7N9病毒复制的影响 |
| 2.5.1 敲低WARS后接种H7N9病毒 |
| 2.5.2 qRT-PCR检测敲低WARS对H7N9病毒复制的影响 |
| 2.5.3 Western blot检测敲低WARS对H7N9病毒复制的影响 |
| 2.5.4 细胞上清滴度检测敲低WARS对H7N9病毒复制的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 H7N9病毒感染使WARS的表达量上调 |
| 3.2 H7N9病毒感染使WARS入核 |
| 3.3 WARS基因的扩增 |
| 3.4 pCDH-Puro-WARS过表达质粒的构建 |
| 3.5 WARS过表达细胞系的筛选与鉴定 |
| 3.6 过表达WARS负调控H7N9病毒的复制 |
| 3.7 有效敲低WARS的siRNA筛选 |
| 3.8 敲低WARS正调控H7N9病毒的复制 |
| 4 讨论 |
| 第四章 宿主WARS蛋白影响IAV H7N9复制的机制研究 |
| 1 材料 |
| 1.1 质粒与siRNA |
| 1.2 菌株、毒株与细胞 |
| 1.3 试剂与耗材 |
| 1.4 仪器 |
| 2 方法 |
| 2.1 过表达WARS对Ⅰ型IFN通路的影响 |
| 2.1.1 过表达WARS后接种H7N9病毒 |
| 2.1.2 过表达WARS对IFN和ISG表达的影响 |
| 2.1.3 过表达WARS对Ⅰ型IFN通路关键蛋白及其磷酸化的影响 |
| 2.2 敲低WARS对Ⅰ型IFN通路的影响 |
| 2.2.1 敲低WARS后接种H7N9病毒 |
| 2.2.2 敲低WARS对IFN和ISG表达的影响 |
| 2.2.3 敲低WARS对Ⅰ型IFN通路关键蛋白及其磷酸化的影响 |
| 2.2.4 稳定敲低WARS细胞系的构建和鉴定 |
| 2.2.5 稳定敲低WARS细胞系中Ⅰ型IFN通路关键蛋白及其磷酸化的检测 |
| 2.3 过表达WARS对H7N9病毒吸附的影响 |
| 2.3.1 过表达WARS后低温吸附 |
| 2.3.2 Western blot检测过表达WARS对H7N9病毒吸附的影响 |
| 2.3.3 流式细胞术检测过表达WARS对H7N9病毒吸附的影响 |
| 2.3.4 过表达WARS对细胞浆和细胞膜中的WARS含量的影响 |
| 2.4 敲低WARS对H7N9病毒吸附的影响 |
| 2.4.1 敲低WARS后低温吸附 |
| 2.4.2 Western blot检测敲低WARS对H7N9病毒吸附的影响 |
| 2.4.3 流式细胞术检测敲低WARS对H7N9病毒吸附的影响 |
| 2.4.4 敲低WARS对细胞浆和细胞膜中的WARS含量的影响 |
| 3 结果 |
| 3.1 过表达WARS不影响干扰素和干扰素诱导基因的表达 |
| 3.2 过表达WARS不影响Ⅰ型IFN通路关键蛋白及其磷酸化 |
| 3.3 敲低WARS不影响干扰素和干扰素诱导基因的表达 |
| 3.4 敲低WARS不影响Ⅰ型IFN通路关键蛋白及其磷酸化 |
| 3.5 稳定敲低WARS细胞系的构建和鉴定 |
| 3.6 稳定敲低WARS不影响Ⅰ型IFN通路关键蛋白及其磷酸化 |
| 3.7 过表达WARS负调控H7N9病毒的吸附 |
| 3.8 敲低WARS正调控H7N9病毒的吸附 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 附录常用试剂与配方 |
（3）OsGWD1在水稻与水稻尖细潜根线虫互作中的功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 1 前言 |
| 1.1 富含谷氨酸植物蛋白研究进展 |
| 1.2 WD40-repeat蛋白 |
| 1.3 大肠杆菌原核表达系统 |
| 1.3.1 表达载体的选择 |
| 1.3.2 表达条件的优化 |
| 1.3.3 分子伴侣助表达作用 |
| 1.4 蛋白质间相互作用研究进展 |
| 1.4.1 酵母双杂交技术 |
| 1.4.2 pull down技术 |
| 1.4.3 免疫共沉淀技术 |
| 1.5 本研究的内容及目的 |
| 1.5.1 课题来源 |
| 1.5.2 试验内容 |
| 1.5.3 试验的目的 |
| 1.5.4 试验技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株与载体 |
| 2.1.3 PCR引物 |
| 2.1.4 酶与各种生化试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 OsGWD1 基因的克隆 |
| 2.2.1.1 水稻根总RNA的提取 |
| 2.2.1.2 c DNA第一条链合成 |
| 2.2.1.3 基因的PCR扩增 |
| 2.2.1.4 目的片段与载体连接转化trans5α |
| 2.2.1.5 菌落PCR鉴定阳性克隆 |
| 2.2.1.6 测序与保种 |
| 2.2.2 生物信息学分析 |
| 2.2.3 植物RNAi载体的构建 |
| 2.2.3.1 入门载体构建 |
| 2.2.3.2 LR重组反应 |
| 2.2.3.3 转化与鉴定 |
| 2.2.4 植物过表达载体的构建 |
| 2.2.4.1 质粒提取 |
| 2.2.4.2 添加酶切位点 |
| 2.2.4.3 PCR产物和载体双酶切 |
| 2.2.4.4 连接反应 |
| 2.2.4.5 转化与鉴定 |
| 2.2.4.6 双酶切鉴定 |
| 2.2.5 OsGWD1 基因亚细胞定位 |
| 2.2.5.1 感受态土壤农杆菌GV3101 制备 |
| 2.2.5.2 冻融法转化农杆菌感受态GV3101 |
| 2.2.5.3 亚细胞定位 |
| 2.2.6 水稻遗传转化 |
| 2.2.7 转基因水稻植株的鉴定 |
| 2.2.7.1 PCR鉴定 |
| 2.2.7.2 快速试纸条鉴定 |
| 2.2.8 原核表达载体的构建 |
| 2.2.8.1 质粒的提取 |
| 2.2.8.2 OsGWD1 基因的PCR扩增 |
| 2.2.8.3 双酶切 |
| 2.2.8.4 连接转化与鉴定 |
| 2.2.8.5 双酶切鉴定 |
| 2.2.9 目的蛋白的表达 |
| 2.2.9.1 原核表达载体在工程菌BL21(DE3)中的诱导表达 |
| 2.2.9.2 SDS-PAGE电泳检测蛋白表达 |
| 2.2.9.3 目的蛋白的可溶性检测 |
| 2.2.10 目的蛋白可溶性探索 |
| 2.2.10.1 含有分子伴侣pTf16 的制备及转化 |
| 2.2.10.2 目的蛋白的小量表达 |
| 2.2.10.3 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 2.2.11 重组蛋白质表达条件的优化 |
| 2.2.12 目的蛋白的大量表达及纯化 |
| 2.2.12.1 目的蛋白的大量表达 |
| 2.2.12.2 目的蛋白的纯化 |
| 2.2.13 目的蛋白的浓缩及透析 |
| 2.2.14 His-tag pull down初步筛选互作蛋白 |
| 2.2.14.1 水稻根部总蛋白的提取 |
| 2.2.14.2 目的蛋白与水稻根部总蛋白浓度的测定 |
| 2.2.14.3 His-tag pull down法捕获的OsGWD1的互作蛋白 |
| 2.2.14.4 互作蛋白功能注释及分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 OsGWD1 基因克隆 |
| 3.1.1 水稻根部总RNA提取结果 |
| 3.1.2 OsGWD1 基因的扩增 |
| 3.1.3 OsGWD1 基因克隆载体的阳性鉴定 |
| 3.2 生物信息学分析 |
| 3.2.1 氨基酸序列理化性质分析 |
| 3.2.2 亲水性与疏水性预测 |
| 3.2.3 OsGWD1 蛋白亚细胞定位 |
| 3.2.4 OsGWD1 信号肽预测 |
| 3.2.5 OsGWD1 蛋白跨膜结构及保守结构域分析 |
| 3.2.6 OsGWD1 蛋白二级结构预测 |
| 3.2.7 OsGWD1 蛋白三级结构预测 |
| 3.2.8 相互作用的蛋白的预测 |
| 3.3 植物RNAi载体构建结果 |
| 3.3.1 入门载体构建结果 |
| 3.3.2 LR重组结果分析 |
| 3.4 植物过表达载体构建结果 |
| 3.5 OsGWD1 基因亚细胞定位 |
| 3.5.1 重组过表达载体转化GV3101 |
| 3.5.2 OsGWD1 基因亚细胞定位检测 |
| 3.6 水稻的遗传转化与鉴定 |
| 3.6.1 水稻的遗传转化 |
| 3.6.2 PCR法检测转基因水稻 |
| 3.6.3 快速试纸条检测转基因水稻 |
| 3.7 原核表达载体的构建 |
| 3.8 目的蛋白的表达 |
| 3.8.1 原核表达载体在工程菌BL21(DE3)中的诱导表达 |
| 3.8.2 目的蛋白的可溶性检测 |
| 3.8.3 共表达体系的构建结果 |
| 3.8.4 重组蛋白的小量表达 |
| 3.8.5 重组蛋白的Western blot鉴定 |
| 3.8.6 目的蛋白质诱导表达条件的优化 |
| 3.8.7 目的蛋白的大量表达及纯化 |
| 3.8.8 BSA蛋白标准曲线的制定 |
| 3.8.9 His-tag pull down捕获OsGWD1 互作蛋白 |
| 3.9 互作蛋白的功能分析 |
| 3.9.1 总蛋白的GO功能分析 |
| 3.9.2 总蛋白的KEGG富集分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 4.1 目的基因的克隆 |
| 4.2 植物表达载体的构建及转基因植株的获得 |
| 4.3 OsGWD1 基因的原核表达与纯化 |
| 4.4 His-tag pull down初步筛选互作蛋白 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（4）烟草NtGCN2的原核表达纯化、抗体制备及性质鉴定（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| 1. 文献综述 |
| 1.1 eIF2α激酶参与的蛋白翻译调控机制 |
| 1.1.1 eIF2参与的蛋白质翻译调控 |
| 1.1.2 eIF2α激酶组成及功能 |
| 1.2 GCN2介导的胁迫应答机制 |
| 1.2.1 GCN2的结构 |
| 1.2.2 GCN2的功能 |
| 1.2.2.1 酵母GCN2介导的胁迫应答 |
| 1.2.2.2 动物GCN2介导的胁迫应答 |
| 1.2.2.3 植物GCN2介导的胁迫应答 |
| 1.3 GCN2抗体制备和性质鉴定现状 |
| 2 引言 |
| 2.1 研究目的与意义 |
| 2.2 研究内容 |
| 2.3 研究的创新点 |
| 3 材料与方法 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 载体、菌株和试剂 |
| 3.1.2 实验仪器与设备 |
| 3.1.3 植物材料 |
| 3.1.4 常用试剂及培养基配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 构建原核表达载体pCzn1-NtGCN2(1-437aa) |
| 3.2.1.1 NtGCN2(1-437aa)基因的引物设计 |
| 3.2.1.2 NtGCN2(1-437aa)序列的扩增 |
| 3.2.1.3 PCR产物纯化 |
| 3.2.1.4 重组载体的连接 |
| 3.2.1.5 大肠杆菌的转化 |
| 3.2.1.6 菌落的PCR验证 |
| 3.2.1.7 质粒的提取 |
| 3.2.1.8 重组质粒的酶切鉴定 |
| 3.2.1.9 重组质粒的DNA测序 |
| 3.2.2 原核表达 |
| 3.2.2.1 将pCzn1-GCN2(1-437aa)载体转化大肠杆菌BL21(DE3) Plys |
| 3.2.2.2 重组蛋白表达 |
| 3.2.3 原核表达蛋白的提取 |
| 3.2.4 蛋白纯化 |
| 3.2.4.1 包涵体蛋白复性 |
| 3.2.4.2 Ni~(2+)-NTA琼脂糖柱纯化蛋白 |
| 3.2.5 SDS-PAGE分析及Western blot检测 |
| 3.2.5.1 SDS-PAGE分析 |
| 3.2.5.2 Western blot |
| 3.2.6 抗体制备及效价检测 |
| 3.2.6.1 抗体制备及纯化 |
| 3.2.6.2 抗体效价检测 |
| 3.2.7 NtGCN2激酶活性鉴定 |
| 3.2.7.1 NtGCN2的浓度梯度酶活鉴定 |
| 3.2.7.2 NtGCN2的时间梯度酶活鉴定 |
| 3.2.8 实时定量荧光PCR |
| 3.2.8.1 烟草样品的处理 |
| 3.2.8.2 烟草总RNA的提取 |
| 3.2.8.3 实时荧光定量PCR |
| 3.2.9 数据分析与处理 |
| 3.2.9.1 酶活鉴定数据处理 |
| 3.2.9.2 qRT-PCR数据处理 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 原核表达载体pCzn1-NtGCN2(1-437aa)的构建 |
| 4.1.1 NtGCN2(1-437aa)序列的克隆 |
| 4.1.2 pCzn1-NtGCN2(1-437aa)的构建 |
| 4.1.3 pCzn1-NtGCN2(1-437aa)的双酶切鉴定 |
| 4.2 NtGCN2(1-437aa)的原核表达及Western Blot鉴定 |
| 4.2.1 NtGCN2(1-437aa)的原核表达 |
| 4.2.2 NtGCN2(1-437aa)重组蛋白的鉴定 |
| 4.3 重组蛋白的纯化 |
| 4.3.1 NtGCN2(1-437aa)蛋白的纯化 |
| 4.3.2 NtGCN2全长蛋白的纯化 |
| 4.4 多克隆抗体的制备及效价检测 |
| 4.4.1 NtGCN2全长蛋白的抗体制备及效价检测 |
| 4.4.2 NtGCN2(1-437aa)的抗体制备及效价检测 |
| 4.4.3 NtGCN2全长多克隆抗体的鉴定 |
| 4.4.4 NtGCN2(1-437aa)多克隆抗体的鉴定 |
| 4.5 NtGCN2的体外性质鉴定 |
| 4.6 NtGCN2互作基因的RT-PCR验证 |
| 5 结论与讨论 |
| 6 小结 |
| 参考文献 |
| 英文摘要 |
（5）星星草（Puccinellia tenuiflora）应答H2O2的生理与氧化还原蛋白质组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 植物盐碱应答调控机制 |
| 1.1.1 植物盐害机制 |
| 1.1.2 植物耐盐机制 |
| 1.2 植物ROS信号的作用机制 |
| 1.2.1 ROS导致蛋白质发生氧化修饰 |
| 1.2.2 植物H_2O_2信号的作用机理 |
| 1.3 植物叶绿体氧化还原调控机制 |
| 1.3.1 叶绿体中ROS的生成 |
| 1.3.2 叶绿体氧化还原调控网络 |
| 1.4 Cys氧化还原蛋白质组学研究进展 |
| 1.4.1 氧化还原蛋白质组学间接法 |
| 1.4.2 氧化还原蛋白质组学直接法 |
| 1.5 氧化还原蛋白质组学揭示植物氧化还原调控机制 |
| 1.5.1 光合电子传递和ATP的生成 |
| 1.5.2 ROS稳态调节 |
| 1.5.3 卡尔文循环 |
| 1.5.4 物质代谢 |
| 1.5.5 蛋白质合成、折叠、运输和降解 |
| 1.5.6 蛋白质氧化还原修饰和可逆磷酸化的关联 |
| 1.6 星星草研究进展 |
| 1.6.1 星星草简介 |
| 1.6.2 星星草盐碱应答生理学与分子生物学研究进展 |
| 1.6.3 星星草盐碱应答高通量组学分析研究进展 |
| 1.7 植物类萌发素蛋白研究进展 |
| 1.8 植物谷氧还蛋白研究进展 |
| 1.9 研究目的与意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 星星草培养与H_2O_2胁迫处理 |
| 2.2 星星草叶片与叶绿体材料收集 |
| 2.2.1 星星草叶片材料处理与收集 |
| 2.2.2 星星草叶绿体材料处理与收集 |
| 2.3 星星草叶片与叶绿体H_2O_2应答生理学分析 |
| 2.3.1 叶片与叶绿体蛋白质自由巯基含量的测定 |
| 2.3.2 叶片光合蒸腾特性测定 |
| 2.3.3 叶片叶绿素荧光参数测定与叶绿素荧光诱导曲线分析 |
| 2.3.4 叶片抗氧化酶活性测定 |
| 2.3.5 叶片抗氧化剂含量测定 |
| 2.3.6 叶绿体H_2O_2含量测定 |
| 2.3.7 叶绿体叶绿素荧光与P700参数的测定 |
| 2.3.8 叶绿体抗氧化酶活性测定 |
| 2.3.9 叶绿体抗氧化剂含量测定 |
| 2.4 星星草叶片与叶绿体H_2O_2应答氧化还原蛋白质组学分析 |
| 2.4.1 叶片与叶绿体蛋白质样品的制备与自由巯基的封闭 |
| 2.4.2 蛋白质还原、脱盐及iodoTMT试剂标记 |
| 2.4.3 电泳分离蛋白质与胶内酶解蛋白质 |
| 2.4.4 iTRAQ试剂标记多肽样品 |
| 2.4.5 多肽样品的分级洗脱 |
| 2.4.6 液相色谱-质谱联用鉴定分级多肽样品 |
| 2.4.7 蛋白质数据库搜索与定量分析 |
| 2.4.8 筛选可信定量结果及数据分析 |
| 2.5 蛋白质亚细胞定位预测 |
| 2.6 蛋白质功能分类 |
| 2.7 H_2O_2应答氧化还原敏感蛋白质三维结构预测 |
| 2.8 PutGLP的表达模式和功能分析 |
| 2.8.1 PutGLP基因克隆和生物信息学分析 |
| 2.8.2 PutGLP基因表达模式 |
| 2.8.3 PutGLP的亚细胞定位 |
| 2.8.4 过表达PutGLP拟南芥的胁迫耐受性 |
| 2.9 PutGrx基因家族、表达特征和氧化还原调控分析 |
| 2.9.1 PutGrx基因家族分析 |
| 2.9.2 植物PutGrx系统进化树和氨基酸序列多重比对分析 |
| 2.9.3 PutGrxS10基因表达模式 |
| 2.9.4 PutGrxS10蛋白表达与纯化 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 星星草叶片H_2O_2应答生理学特征 |
| 3.1.1 叶片H_2O_2应答蛋白质自由巯基含量 |
| 3.1.2 叶片H_2O_2应答光合蒸腾特性 |
| 3.1.3 叶片H_2O_2应答叶绿素荧光参数 |
| 3.1.4 叶片H_2O_2应答OJIP曲线 |
| 3.1.5 叶片H_2O_2应答抗氧化酶活性 |
| 3.1.6 叶片H_2O_2应答抗氧化剂含量 |
| 3.2 星星草叶绿体H_2O_2应答生理学特征 |
| 3.2.1 离体叶绿体分解H_2O_2特征 |
| 3.2.2 叶绿体H_2O_2应答叶绿素荧光参数分析 |
| 3.2.3 叶绿体蛋白质自由巯基含量 |
| 3.2.4 叶绿体H_2O_2应答抗氧化酶活性 |
| 3.2.5 叶绿体H_2O_2应答抗氧化剂含量 |
| 3.3 星星草叶片H_2O_2应答蛋白质氧化还原水平变化模式 |
| 3.3.1 叶片蛋白质和氧化还原多肽鉴定与定量分析 |
| 3.3.2 叶片H_2O_2应答氧化还原敏感多肽的筛选 |
| 3.3.3 叶片H_2O_2应答氧化还原敏感蛋白质的亚细胞定位分析 |
| 3.3.4 叶片H_2O_2应答氧化还原敏感蛋白质的功能分类 |
| 3.3.5 叶片H_2O_2应答氧化还原蛋白质三维结构特征 |
| 3.4 星星草叶片H_2O_2应答蛋白质丰度变化模式 |
| 3.4.1 叶片H_2O_2应答丰度差异蛋白质的筛选 |
| 3.4.2 叶片H_2O_2应答丰度差异蛋白质的亚细胞定位分析 |
| 3.4.3 叶片H_2O_2应答丰度差异蛋白质的功能分类 |
| 3.5 星星草叶绿体H_2O_2应答蛋白质氧化还原水平变化模式 |
| 3.5.1 叶绿体蛋白质和氧化还原敏感多肽鉴定与定量分析 |
| 3.5.2 叶绿体H_2O_2应答氧化还原敏感多肽的筛选 |
| 3.5.3 叶绿体H_2O_2应答氧化还原敏感蛋白质的亚细胞定位 |
| 3.5.4 叶绿体H_2O_2应答氧化还原敏感蛋白质的功能分类 |
| 3.5.5 叶绿体H_2O_2应答氧化还原敏感蛋白质三维结构特征 |
| 3.6 星星草叶绿体H_2O_2应答蛋白质丰度变化模式 |
| 3.6.1 叶绿体H_2O_2应答丰度差异蛋白质的筛选 |
| 3.6.2 叶绿体H_2O_2应答丰度差异蛋白质的亚细胞定位分析 |
| 3.6.3 叶绿体H_2O_2应答丰度差异蛋白质的功能分类 |
| 3.7 星星草叶片和叶绿体H_2O_2应答氧化还原敏感蛋白质比较分析 |
| 3.8 星星草叶片和叶绿体H_2O_2应答丰度差异蛋白质比较分析 |
| 3.9 星星草PutGLP基因功能分析 |
| 3.9.1 PutGLP与同源蛋白的氨基酸序列比对分析 |
| 3.9.2 植物GLP系统进化树分析 |
| 3.9.3 PutGLP亚细胞定位分析 |
| 3.9.4 PutGLP基因在星星草中的表达模式 |
| 3.9.5 PutGLP过表达转基因植株抗性分析 |
| 3.9.6 PutGLP过表达转基因植株SOD与OXO活性分析和ROS含量检测 |
| 3.10 PutGrx家族成员、基因表达和氧化还原调控分析 |
| 3.10.1 PutGrx基因家族分析 |
| 3.10.2 GrxC5/S12亚家族成员的氨基酸序列多重比对分析 |
| 3.10.3 PutGrxS10基因的表达模式分析 |
| 3.10.4 PutGrxS10的氧化还原调控特征分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 蛋白质氧化还原与可逆磷酸化共同调控Ca~(2+)介导的氧化胁迫信号应答 |
| 4.2 蛋白质氧化还原调控细胞内膜系统与细胞骨架动态重塑 |
| 4.3 利用多种抗氧化策略调节ROS稳态 |
| 4.3.1 蛋白质氧化还原调节抗氧化酶活性清除ROS |
| 4.3.2 蛋白质氧化还原影响还原型抗氧化剂和抗氧化酶的再生 |
| 4.3.3 氧化胁迫影响抗氧化酶对有毒代谢物的清除 |
| 4.4 氧化胁迫调控病程相关蛋白丰度与氧化还原水平 |
| 4.5 蛋白质丰度与氧化还原调控光合作用 |
| 4.5.1 氧化胁迫调节光合作用蛋白质的丰度变化 |
| 4.5.2 蛋白质氧化还原调控光合电子传递与ATP合成 |
| 4.5.3 蛋白质氧化还原影响碳同化过程 |
| 4.6 蛋白质氧化还原调节蛋白质合成、加工与周转 |
| 4.7 氧化胁迫影响糖代谢酶类的丰度与氧化还原水平 |
| 4.8 蛋白质氧化还原调控氮代谢等过程 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（6）寒地粳稻生物反应器建立及FGF21蛋白表达效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 1.1 植物生物反应器研究进展 |
| 1.1.1 PMF生产平台种类 |
| 1.1.2 PMF的优点 |
| 1.1.3 PMF的技术策略 |
| 1.1.4 PMF的临床应用 |
| 1.1.5 水稻生物反应器研究进展 |
| 1.2 成纤维细胞生长因子21研究进展 |
| 1.2.1 FGF21的分子生物学性质 |
| 1.2.2 FGF21的生物学作用 |
| 1.2.3 FGF21的治疗研究 |
| 1.3 FGF21表达体系研究进展 |
| 1.3.1 微生物法生产FGF21 |
| 1.3.2 植物生物反应器生产FGF21 |
| 1.4 植物转录组研究进展 |
| 1.5 植物蛋白质组研究进展 |
| 1.5.1 蛋白组学分类 |
| 1.5.2 质谱法定量蛋白质的一般性质 |
| 1.5.3 相对定量的无标签方法 |
| 1.6 本研究的目的与意义 |
| 1.7 本研究技术路线 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 水稻再生体系建立 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 水稻转化体系建立 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.3 FGF21在水稻种子中的表达 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 实验试剂 |
| 2.3.3 实验仪器 |
| 2.3.4 实验方法 |
| 2.4 转FGF21水稻种子转录组学研究 |
| 2.4.1 实验材料 |
| 2.4.2 实验方法 |
| 2.5 转FGF21水稻种子蛋白质组学研究 |
| 2.5.1 实验材料 |
| 2.5.2 实验方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 水稻再生体系建立 |
| 3.2 水稻转化体系建立 |
| 3.2.1 菌液浓度的影响 |
| 3.2.2 侵染时间的影响 |
| 3.2.3 共培养时间的影响 |
| 3.2.4 共培养方式的影响 |
| 3.2.5 PCR结果 |
| 3.3 FGF21在水稻种子中的表达 |
| 3.3.1 植物表达载体构建 |
| 3.3.2 农杆菌介导的水稻遗传转化 |
| 3.3.3 转FGF21水稻的鉴定 |
| 3.3.4 转FGF21水稻的性状分析 |
| 3.3.5 转FGF21水稻的生理分析 |
| 3.3.6 转FGF21水稻的亚细胞定位 |
| 3.3.7 转FGF21水稻的扫描电镜分析 |
| 3.4 转FGF21水稻种子转录组学研究 |
| 3.4.1 序列分析与定位 |
| 3.4.2 差异表达基因DEGs分析 |
| 3.4.3 DEGs的GO功能分析 |
| 3.4.4 DEGs的KEGG途径富集分析 |
| 3.4.5 DEGs的验证 |
| 3.5 转FGF21水稻种子蛋白质组学研究 |
| 3.5.1 水稻成熟种子蛋白浓度及电泳检测结果 |
| 3.5.2 蛋白质鉴定与定量 |
| 3.5.3 肽段、蛋白质鉴定整体分布 |
| 3.5.4 鉴定蛋白质的KOG注释 |
| 3.5.5 差异蛋白分析 |
| 3.5.6 差异蛋白的GO富集分析 |
| 3.5.7 差异蛋白的pathway富集分析 |
| 3.5.8 荧光定量(qRT-PCR)分析 |
| 3.5.9 Western blot分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 水稻再生及转化体系建立 |
| 4.1.1 水稻再生体系建立 |
| 4.1.2 水稻转化体系建立 |
| 4.2 FGF21在水稻种子中的表达 |
| 4.3 转FGF21水稻种子转录组学分析 |
| 4.3.1 淀粉和蔗糖代谢 |
| 4.3.2 植物-病原体相互作用 |
| 4.3.3 内吞作用 |
| 4.3.4 戊糖和葡萄糖醛酸相互转化 |
| 4.3.5 半乳糖代谢 |
| 4.4 转FGF21水稻种子蛋白质组学分析 |
| 4.4.1 淀粉和蔗糖代谢 |
| 4.4.2 氨基糖与核糖代谢 |
| 4.5 本研究的创新点… |
| 4.6 下一步工作展望 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（7）谷氨酰胺tRNA合成酶剪接体QRS-C13相互作用蛋白的筛选研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 综述 |
| 1.氨酰tRNA合成酶 |
| 1.1 氨酰tRNA合成酶的功能 |
| 1.2 氨酰tRNA合成酶的分类与进化 |
| 2.氨酰tRNA合成酶多酶复合体 |
| 3.氨酰tRNA合成酶与疾病的联系 |
| 4.谷氨酰胺tRNA合成酶 |
| 5.研究内容与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 细胞,菌种,质粒及蛋白 |
| 1.2 实验试剂 |
| 2.常用实验方法 |
| 2.1 菌株复苏与保存 |
| 2.2 DH5α和Rosetta感受态细胞制备 |
| 2.3 基因扩增和载体构建相关实验 |
| 2.4 重组质粒的转化 |
| 2.5 质粒抽提 |
| 2.6 切胶回收纯化 |
| 2.7 质粒浓缩 |
| 2.8 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.9 基因测序 |
| 2.10 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) |
| 2.11 目的蛋白的诱导表达与纯化 |
| 2.12 包涵体蛋白的变复性和纯化 |
| 2.13 细胞的复苏与冻存 |
| 2.14 细胞传代 |
| 2.15 细胞转染与收集 |
| 2.16 激光共聚焦制片 |
| 2.17 免疫共沉淀 |
| 2.18 蛋白银染 |
| 2.19 质谱分析 |
| 2.20 westernblot检测 |
| 2.21 GST-pulldown |
| 3.主要仪器设备 |
| 第三章 QRS-C13特异结合蛋白的筛选 |
| 1.实验材料 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 真核表达载体的构建 |
| 2.2 免疫共沉淀 |
| 2.3 质谱鉴定与分析 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 PCR扩增pIRESpuro2-QRS-C13 |
| 3.2 免疫共沉淀分离QRS-C13结合蛋白 |
| 3.3 质谱鉴定和分析 |
| 4.讨论与小结 |
| 第四章 QRS-C13相互作用蛋白的鉴定 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 重组质粒的构建 |
| 2.2 目的蛋白的诱导表达 |
| 2.3 目的蛋白的纯化 |
| 2.4 目的蛋白的验证 |
| 2.5 蛋白体外相互作用验证 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 表达载体pET20b-QRS-C13与pGEx-4T-2-eIF3L的构建 |
| 3.2 QRS-C13,eIF3L,LRS蛋白表达与纯化 |
| 3.3 细胞内QRS-C13与eIF3L之间相互作用的验证 |
| 3.4 体外GST-pulldown验证蛋白相互作用 |
| 4.讨论 |
| 第五章 QRS-C13结合蛋白的细胞定位 |
| 1.试验材料 |
| 2.试验方法 |
| 2.1 pEGFP-N1-QRS-C13,pDsRed2-N1-eIF3L质粒构建 |
| 2.2 目的蛋白的结构预测与分析 |
| 2.3 激光共聚焦观察显微镜观察细胞定位 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 QRS-C13结构预测与分析 |
| 3.2 重组质粒pEGFP-N1-QRS-C13,pDsRed2-N1-eIF3L的构建 |
| 3.3 激光共聚焦显微镜观察QRS-C13与QRS的细胞定位 |
| 3.4 激光共聚焦显微镜观察QRS-C13与eIFL的细胞定位 |
| 4.讨论与小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 1.总结 |
| 2.展望 |
| 参考文献 |
| 研究生期间科研成果 |
| 附录 |
| 致谢 |
（8）滑液支原体WVU1853株免疫相关膜蛋白的初步分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 滑液支原体培养基的配制 |
| 1.2.2 滑液支原体的培养 |
| 1.2.3 MS WVU1853株兔多抗和鸡多抗的制备 |
| 1.2.4 蛋白质样品的制备 |
| 1.2.4. 1 膜蛋白分离: |
| 1.2.4. 2 亲水蛋白的丙酮沉淀: |
| 1.2.4. 3 膜蛋白质的纯化: |
| 1.2.5 蛋白质的二维凝胶电泳 |
| 1.2.6 免疫印迹 |
| 1.2.7 质谱分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 MS WVU1853株膜蛋白及亲水蛋白的二维凝胶电泳 |
| 2.2 MS WVU1853株膜蛋白的Western blot |
| 2.3 质谱结果及数据分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
（9）酪氨酰-tRNA合成酶突变体的结构生物学研究和基因编码非天然氨基酸设计荧光蛋白（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分: 酪氨酰-tRNA合成酶突变体的结构生物学研究 |
| 第一章 X-射线晶体学解析蛋白质结构 |
| 1.1 X-射线蛋白质晶体学概述 |
| 1.2 蛋白质晶体的获得 |
| 1.2.1 高纯度高均一性蛋白的获得 |
| 1.2.2 蛋白质结晶方法 |
| 1.3 蛋白质晶体的筛选与优化 |
| 1.4 蛋白质晶体数据的收集与处理 |
| 1.5 模型的搭建与结构的修正 |
| 第二章 酪氨酰-tRNA合成酶突变体的结构生物学研究 |
| 2.1 背景介绍 |
| 2.1.1 酪氨酸酚裂解酶(TPL)转化合成3,5-二氟-L-酪氨酸 |
| 2.1.1.1 酪氨酸酚裂解酶的发现 |
| 2.1.1.2 酪氨酸酚裂解酶的作用机理 |
| 2.1.1.3 酪氨酸酚裂解酶的应用 |
| 2.1.2 用~(19)F核磁共振研究蛋白质动态构象变化 |
| 2.1.3 突变合成酶的结构研究 |
| 2.2 实验材料和方法 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验方法 |
| 2.2.2.1 TPL的表达纯化 |
| 2.2.2.2 SDS-PAGE检测TPL |
| 2.2.2.3 TPL酶催化反应 |
| 2.2.2.4 转化产物的分离纯化 |
| 2.2.2.5 3,5-二氟-L-酪氨酸化学结构的鉴定 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1. 酪氨酸酚裂解酶转化合成3,5-二氟-L-酪氨酸 |
| 2.3.2 编码3,5-二氟-L-酪氨酸的氨酰-tRNA合成酶的筛选 |
| 2.3.3 F2YRS蛋白的表达与纯化 |
| 2.2.4 复合物晶体的获得与结构解析 |
| 2.2.5 ~(19)F核磁共振研究蛋白质动态构象 |
| 2.4 本章总结 |
| 第二部分: 基因编码非天然氨基酸设计荧光蛋白 |
| 第一章 扩展遗产密码子技术的介绍 |
| 1.1 背景介绍 |
| 1.1.1 正交的tRNA密码子对 |
| 1.1.2 扩展遗传密码子技术的展望 |
| 第二章 荧光蛋白概述 |
| 2.1 绿色荧光蛋白的发现 |
| 2.2 荧光蛋白的基本原理 |
| 2.3 荧光蛋白的应用 |
| 2.4 荧光蛋白和UAA |
| 第三章 基因编码非天然氨基酸探究生物电子转移 |
| 3.1 电子转移概况背景介绍 |
| 3.2 实验材料和方法 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.2.2.1 常用试剂配制和使用方法 |
| 3.2.2.2 3-吡唑基酪氨酸(pyTyr)的合成和鉴定 |
| 3.2.2.3 3-吡唑基酪氨酸(pyTyr)插入系统的构建 |
| 3.2.2.4 GFP-Tyr151pyTyr的结构生物学 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 3-吡唑基酪氨酸插入GFP151的质谱鉴定 |
| 3.3.2 GFP-151pyTyrCu复合物晶体结构的获得与结构解析 |
| 3.3.3 实验结果综合分析 |
| 3.3.3.1 GFP不同位置插入pyTyr电子传递的速率 |
| 3.4 本章总结 |
| 第四章 HqAla拓展荧光蛋白发色团 |
| 4.1 研究背景 |
| 4.2 实验材料和方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.1.1 8-羟基喹啉丙氨酸(HqAla)的转化合成 |
| 4.2.1.2 8-羟基喹啉丙氨酸(HqAla)插入系统的构建 |
| 4.2.1.3 sfGFP-66-HqAla的结构生物学 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 HqAla插入sfGFP66TAG的质谱鉴定 |
| 4.3.2 sfGFP-66-HqAla晶体结构的获得与结构解析 |
| 4.3.3 实验结果综合分析 |
| 4.4 本章总结 |
| 第五章 其它编码非天然氨基酸的蛋白质结构解析及分析 |
| 5.1 PsmOrange的结构生物学研究 |
| 5.1.1 PsmOrange的表达纯化和晶体筛选 |
| 5.1.2 PsmOrange的结构解析 |
| 5.2 iLOV蛋白pka的表征 |
| 5.2.1 背景简介 |
| 5.2.2 iLov486C12Y蛋白晶体结构的获得与结构解析 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
（10）泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶及tRNA-异戊烯基焦磷酸转移酶基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 植原体及植原体病害概述 |
| 1.2 植原体的检测、分类鉴定、发病规律及防控对策 |
| 1.2.1 植原体病害诊断与病原检测 |
| 1.2.2 植原体的分类鉴定 |
| 1.2.3 植原体的发病规律及防控对策 |
| 1.3 植原体基因组及功能基因研究进展 |
| 1.3.1 植原体基因组基本特征 |
| 1.3.2 植原体功能基因及基因缺失 |
| 1.3.3 植原体的物质运输通道及其编码基因 |
| 1.3.4 植原体基因组中特有的潜在移动单元 |
| 1.3.5 植原体进化以及假基因和新基因的形成 |
| 1.3.6 不同植原体代谢基因的共性和多样性 |
| 1.4 植原体与寄主的互作及致病机制研究 |
| 1.4.1 植原体导致的植物症状 |
| 1.4.2 植原体侵染导致的寄主植物生理生化变化 |
| 1.4.3 植原体病害症状形成的分子机理 |
| 1.4.4 植原体与寄主昆虫的互作研究进展 |
| 1.5 胸苷酸激酶及其编码基因研究 |
| 1.5.1 嘌呤和嘧啶代谢 |
| 1.5.2 胸苷酸激酶定义 |
| 1.5.3 胸苷酸激酶研究进展 |
| 1.6 异戊烯基焦磷酸转移酶研究 |
| 1.6.1 细胞分裂素概述 |
| 1.6.2 异戊二烯类 CTKs |
| 1.6.3 Adenylate-异戊烯基焦磷酸转移酶及其编码基因研究 |
| 1.6.4 tRNA-异戊烯基焦磷酸转移酶及其编码基因研究 |
| 1.7 研究目的意义、目标和主要研究内容 |
| 1.7.1 研究目的意义 |
| 1.7.2 研究目标 |
| 1.7.3 主要研究内容 |
| 1.8 技术路线 |
| 第二章 泡桐丛枝植原体河北平山和江西吉安株系胸苷酸激酶基因的克隆、序列测定及多态性分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 植物基因组 DNA 的提取 |
| 2.1.3 PCR 扩增及序列测定 |
| 2.1.4 序列分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 tmk-a 和 tmk-b 基因的 PCR 扩增 |
| 2.2.2 tmk-a 和 tmk-b 的序列多样性 |
| 2.2.3 tmk 基因序列位点变异分析 |
| 2.2.4 TMK 功能域预测 |
| 2.2.5 tmk 基因序列相似性及系统进化分析 |
| 2.3 小结与讨论 |
| 第三章 泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶的原核表达、纯化及体外酶活性测定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 PaWB PS 株系三个 tmk 基因编码蛋白的氨基酸序列比对及相似性分析 |
| 3.2.2 TMK-a-1、TMK-a-2 和 TMK-b 原核表达载体的构建 |
| 3.2.3 PaWBPS TMK-a-1、TMK-a-2 和 TMK-b 蛋白的表达及纯化 |
| 3.2.4 PaWBPS TMK-a-1、TMK-a-2 和 TMK-b 酶活性的测定 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第四章 过量表达泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶对大肠杆菌生长的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 BL21（DE3）大肠杆菌生长曲线的测定及差异显着性分析 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第五章 泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶基因的表达分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶基因 mRNA 转录水平的检测 |
| 5.2.2 泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶抗血清制备以及蛋白表达的检测 |
| 5.2.3 泡桐丛枝植原体 Northern blot 及 Western blot 检测时出现非特异性信号的原因分析 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第六章 泡桐丛枝植原体蛋白 TRNA-IPT 对大肠杆菌生长的影响及其编码基因转化拟南芥初探 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料 |
| 6.1.2 方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 tRNA-IPT 基因原核表达菌株及突变体生长曲线的测定 |
| 6.2.2 泡桐丛枝植原体 tRNA-IPT 基因与寄主泡桐同源基因序列比较 |
| 6.2.3 泡桐丛枝植原体 tRNA-IPT 植物转基因载体的构建和转化拟南芥 |
| 6.3 小结与讨论 |
| 第七章 结论与讨论 |
| 7.1 结论 |
| 7.1.1 两个泡桐丛枝植原体株系胸苷酸激酶基因的克隆、测序及序列分析 |
| 7.1.2 泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶的原核表达、纯化及体外酶活性测定 |
| 7.1.3 泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶对转化大肠杆菌生长的影响 |
| 7.1.4 泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶基因在植原体和染病植物体内的表达分析 |
| 7.1.5 泡桐丛枝植原体 tRNA-异戊烯基焦磷酸转移酶对转化大肠杆菌生长的影响 |
| 7.2 讨论与展望 |
| 7.2.1 植原体 TMK-a 和 TMK-b 酶活性、底物专化性及作为植原体治疗靶标的可能性 |
| 7.2.2 植原体生长、繁殖、致病与 TMK-a、TMK-b 及 tRNA-IPT 蛋白表达之间可能的相关性 |
| 7.2.3 本研究采用的技术、方法对解决问题的作用与优势、存在的问题及解决对策 |
| 7.2.4 植原体研究的难点及其中蕴藏的机遇和优势 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间的学术研究 |
| 致谢 |
四、Prokaryotic Expression and Preparation of Polyantibody of Human Histydyl-tRNA Synthetase Related Gene（论文参考文献）
- [1]布鲁氏菌S19 bvfA基因缺失株免疫保护性及其与睾丸支持细胞互作组学研究[D]. 贾芳. 宁夏大学, 2021(02)
- [2]宿主WARS蛋白在A型流感病毒H7N9感染过程中的功能分析[D]. 钟亦晔. 浙江大学, 2020(01)
- [3]OsGWD1在水稻与水稻尖细潜根线虫互作中的功能分析[D]. 唐子清. 江西农业大学, 2019
- [4]烟草NtGCN2的原核表达纯化、抗体制备及性质鉴定[D]. 郝英辰. 河南农业大学, 2019(04)
- [5]星星草（Puccinellia tenuiflora）应答H2O2的生理与氧化还原蛋白质组学研究[D]. 喻娟娟. 东北林业大学, 2018(01)
- [6]寒地粳稻生物反应器建立及FGF21蛋白表达效果研究[D]. 冯明芳. 东北农业大学, 2018(02)
- [7]谷氨酰胺tRNA合成酶剪接体QRS-C13相互作用蛋白的筛选研究[D]. 曾维佳. 苏州大学, 2018(01)
- [8]滑液支原体WVU1853株免疫相关膜蛋白的初步分析[J]. 包世俊,丁小琴,邢小勇,伏小平,薛慧文,温峰琴. 畜牧兽医学报, 2017(02)
- [9]酪氨酰-tRNA合成酶突变体的结构生物学研究和基因编码非天然氨基酸设计荧光蛋白[D]. 李家松. 中国科学技术大学, 2014(06)
- [10]泡桐丛枝植原体胸苷酸激酶及tRNA-异戊烯基焦磷酸转移酶基因研究[D]. 宋传生. 中国林业科学研究院, 2014(11)