一、喹乙醇诱导鲤肝细胞凋亡的研究（论文文献综述）
李尧[1]（2019）在《黄芩苷对氧化应激诱导罗非鱼肝损伤的保护作用》文中研究指明肝脏是鱼类物质和能量代谢的重要器官,也是机体重要的屏障器官,其解毒和吞噬功能对机体有着重要保护作用。肝损伤或者病变往往导致机体代谢机能紊乱和抗病力降低,极易造成继发传染性疾病的爆发。近年来肝胆综合症、脂肪肝、化学性肝损伤等疾病在多种鱼中频繁发生,其病因复杂,但其共同点为均伴随着严重的氧化应激。因此氧化应激被认为是多种肝损伤疾病的共同发病机制。养殖环境中多种因子,如养殖密度、温度、盐度、重金属、细菌、病毒等均能诱导机体活性氧自由基（ROS）生成,引起氧化应激。氧化应激状态下,过多的ROS会攻击生物膜、蛋白质和DNA,造成机体组织损伤,进而影响鱼类正常的生理和行为活动。过度或长期的氧化应激可导致机体免疫力下降,诱发多种疾病甚至死亡,不利于水产养殖业的健康发展。因此深入研究氧化应激致鱼类肝损伤的机制以及有效防治措施对提高水产养殖效率具有重要的意义。本实验以罗非鱼为研究对象,利用过氧化氢（H2O2）构建氧化应激损伤动物模型。同时选用中草药黄芩苷,探讨黄芩苷对H2O2诱导的罗非鱼（Oreochromis niloticus）肝损伤的保护作用。主要研究内容和结果如下:1 肝损伤模型的构建:给实验罗非鱼注射不同浓度的H2O2（0、40和300 mM）,24、48和72小时后采集血液和肝脏,测定其生化参数和基因表达。结果表明,注射24h后,在血清中,高浓度H2O2（300mM）显着提高了谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）活性,抑制了总蛋白（TP）和白蛋白（Alb）生成;在肝组织中,H2O2（300 mM）显着降低了超氧化物岐化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽S转移酶（GST）和总抗氧化能力（T-AOC）的水平,同时促进了丙二醛（MDA）形成。基因表达数据表明,300 mM H2O2的处理抑制了Nrf2/keap1信号通路,并下调其下游基因（HO-1、NQO1和GSTa）。同时,H2O2促进了肝组织炎症反应,上调TNF-α、IL-1β和IL-8的mRNA基因表达。此外,低剂量的H2O2（40 mM）处理24小时和48小时后,Nrf2及其后的抗氧化基因或酶（如HO-1、NQO1、GST、CAT和SOD）的水平轻微或强烈增高。2黄芩苷对罗非鱼抗氧化能力的影响:将实验罗非鱼随机分为4组,空白对照组、黄芩苷处理组（0.4、0.8、1.6 g/kg）。饲喂60 d后,分别采集血液、肝、鳃和肌组织,并测定抗氧化指标。结果显示:在血清中,黄芩苷显着提高了超氧化酶SOD活力以及T-AOC和GSH含量;在肝组织中,黄芩苷显着提高了 SOD活力和GSH含量,同时降低了 MDA形成;在鳃组织中,黄芩苷显着提高了T-AOC水平。结果表明黄芩苷可提高罗非鱼抗氧化能力。3黄芩苷对H2O2诱导罗非鱼肝损伤的保护作用:将实验罗非鱼随机分为空白组、H2O2组、3个黄芩苷处理组（0.4、0.8、1.6g/kg）。喂养60天后,空白对照组腹腔注射生理盐水,其他实验组均腹腔注射H2O2。注射24小时后,采集罗非鱼血液和肝组织,检测其生化指标和基因表达。结果表明,黄芩苷处理能够降低GPT、GOT、AKP、MDA 含量;提高 TP、Alb、SOD、T-AOC 和 GSH 含量;对H2O2诱导的肝损伤和氧化应激具有保护作用。同时,黄芩苷处理抑制了核因子Kb（Nf-Kb）、TNF-α和IL-1β等炎症介质的表达。以上结果显示,H2O2诱导罗非鱼,引起明显的肝损伤,而黄芩苷处理后,罗非鱼肝损伤明显缓解。这些结果表明,黄芩苷可有效预防罗非鱼肝损伤,同时,这种保肝作用与其增强抗氧化能力、抑制炎症反应有关。
张莎莎[2]（2018）在《喹乙醇对雄性小鼠生殖系统的损伤及VE、APS对其致毒作用的干预》文中指出喹乙醇（olaquindox,OLA）有较好的抗菌促生长作用,在经济利益的驱动下常被一些生产者违规滥用,近年来养殖业中关于喹乙醇中毒的事件时有发生。大量研究表明喹乙醇可以引起机体氧化损伤,还能诱导生精细胞凋亡。本试验假设喹乙醇对小鼠睾丸具有氧化损伤作用,通过建立不同剂量喹乙醇中毒模型和维生素E（VE）、黄芪多糖（APS）干预试验,研究喹乙醇对雄性小鼠生殖功能的影响及VE、APS对其致毒作用的干预作用。将80只25g左右的雄性小鼠,随机分为空白对照组、阴性对照组（OLA 0mg/kg）、低OLA组（OLA80mg/kg）、中OLA组（OLA 120mg/kg）、高OLA组（OLA240mg/kg）、APS组（OLA 240mg/kg+APS 20mg/kg）、VE组（OLA 240mg/kg+VE 15mg/kg）、VE+APS组（OLA 240mg/kg+VE 15mg/kg+APS20mg/kg）,每组10只,连续灌胃35天,染毒结束24h后,颈椎脱臼法处死小鼠。试验分为喹乙醇及VE、APS干预对小鼠生长发育和生精功能的影响、对小鼠睾丸和附睾组织形态学的影响、对睾丸组织抗氧化功能和睾酮合成的影响四部分进行。1、喹乙醇及VE、APS干预对小鼠生长发育和精液品质的影响试验通过测定小鼠试验期末体重、睾丸系数、精囊腺系数及精子参数（精子畸形率、活力、活率和密度）等指标研究喹乙醇及VE、APS干预对小鼠生长发育和生精功能的影响。试验结果显示:（1）雄性小鼠试验期末体重中OLA组、低OLA组和空白对照组、阴性对照组没有显着性差异。高OLA组显着低于低OLA组（P<0.05）。高OLA组和APS+VE组、VE组及APS组之间没有显着性差异。（2）睾丸系数低OLA组和空白对照组没有显着性差异。中OLA组和高OLA组显着低于空白对照组（P<0.05）。高OLA组和APS+VE组、VE组及APS组之间没有显着性差异。精囊腺系数随喹乙醇浓度增加呈下降趋势。低OLA组和空白对照组没有显着性差异。中OLA组显着低于空白对照组（P<0.05）,高OLA组极显着低于空白对照组（P<0.01）。高OLA组和APS+VE组、VE组及APS组之间没有显着性差异。（3）精子密度随喹乙醇浓度增加呈下降趋势。高OLA组、中OLA组显着低于空白对照组（P<0.05）,低OLA组和空白对照组没有显着性差异。高OLA组和APS+VE组、VE组及APS组之间没有显着性差异。精子活率随喹乙醇浓度增加呈下降趋势。低OLA组和空白对照组没有显着性差异,中OLA组显着低于空白对照组（P<0.05）,高OLA组极显着低于空白对照组（P<0.01）。高OLA组和APS+VE组、VE组及APS组之间没有显着性差异。精子活力随喹乙醇浓度增加呈下降趋势。高OLA组极显着低于空白对照组（P<0.01）,中OLA组和低OLA组显着低于空白对照组（P<0.05）。高OLA组和APS+VE组、VE组及APS组之间没有显着性差异。精子畸形率随喹乙醇浓度增加呈上升趋势。低OLA组和空白对照组没有显着性差异。中OLA组显着高于空白对照组（P<0.05）,高OLA组极显着高于空白对照组（P<0.01）。高OLA组和APS+VE组、VE组及APS组之间没有显着性差异。结果表明,喹乙醇中毒会造成雄性小鼠生长发育缓慢、睾丸系数和精囊腺系数降低,精子密度下降,活动率降低和精子畸形率升高,且随染毒剂量增加精液品质越差;VE、APS对喹乙醇所致的长发育缓慢、睾丸系数和精囊腺系数降低及精液品质下降没有明显的保护作用。2、喹乙醇及VE、APS干预对小鼠睾丸和附睾组织形态学的影响试验进行了小鼠睾丸和附睾组织的HE染色制片观察。（1）睾丸组织HE染色切片显示:空白对照组睾丸组织,曲细精管排列整齐,各级生精细胞层次分明,排列紧密,间质细胞形态正常,基膜完整、连续,管腔内有大量精子。低OLA组睾丸组织曲细精管结构、形态正常,与空白对照组比无明显形态学改变。中OLA组睾丸组织曲细精管形态结构发生明显病理变化,生精细胞层数减少,各级生精细胞排列紊乱,生精细胞数量减少,细胞间隙增大,细胞出现肿胀、空泡化甚至凋亡,管腔内有少量细胞坏死物质和少量发育成熟的精子,基膜变薄、甚至缺失。高OLA组曲细精管结构严重破坏,各级生精细胞变性坏死明显增多,凋亡程度及空泡化极显着,管腔内有大量细胞坏死物质和极少量发育成熟的精子,基膜变薄、缺失严重。高OLA组和APS+VE组、VE组及APS组之间没有显着性差异。（2）附睾组织HE染色切片显示:空白对照组和阴性对照组附睾显示正常组织学结构,细胞紧密排列、规则有序,附睾头主细胞胞质饱满,呈高柱状,腔面有较多细长静纤毛,附睾官腔有大量成熟精子,低OLA组的附睾上皮与对照组相比未见明显的病理变化。中OLA组的附睾上皮出现明显的病理变化,细胞肿胀、空泡化明显,管腔内精子显着减少,降解的细胞增多。高OLA组组织病变加重,大量细胞肿胀、空泡化,细胞坏死、脱落,染色质浓缩,管腔内精子极少或无精子,空泡化程度显着增加,静纤毛显着缩短。高OLA组和APS组之间没有显着性差异,APS+VE组、VE组比高OLA组受损伤程度减轻,管腔内有少量精子。结果表明,中、高剂量喹乙醇组均可对小鼠睾丸、附睾结构造成病理形态学损伤,破坏各级生精细胞,影响睾丸、附睾的正常功能,其中高OLA组影响极为明显,其对睾丸组织、附睾组织及细胞损害程度都极为严重。VE、APS对睾丸结构没有明显的干预作用,VE对附睾结构有轻微的保护作用。3、喹乙醇及VE、APS干预对睾丸组织抗氧化功能的影响试验通过对睾丸组织SOD、GSH-Px活性及MDA、LPO含量及SOD、GSHPx表达水平的测定分析喹乙醇及VE、APS干预对睾丸组织抗氧化功能的影响。试验结果显示:（1）SOD的活性随喹乙醇浓度增加呈上升趋势,高OLA组和中OLA组极显着高于空白对照组（P<0.01）。空白对照组和阴性对照组没有显着性差异。APS+VE组和VE组显极着低于高剂量（P<0.01）,APS组极显着高于高OLA组（P<0.01）。GSH-Px的活性随喹乙醇浓度增加呈下降趋势,中OLA组显着低于空白对照组（P<0.05）。低OLA组、高剂量极显着低于空白对照组、阴性对照组（P<0.01）。高OLA组和APS+VE组、APS组没有显着性差异,VE组显着高于高OLA组（P<0.05）。（2）LPO的含量随喹乙醇浓度增加呈上升趋势,低OLA组和空白对照组没有显着性差异。中OLA组、高剂量显着高于空白对照组（P<0.05）。高OLA组和VE组、APS组、APS+VE组没有显着性差异。MDA的含量随喹乙醇浓度增加呈上升趋势,低OLA组、中OLA组和高OLA组显着高于空白对照组、阴性对照组（P<0.05）。低OLA组、中OLA组和高OLA组没有显着差异,高OLA组和APS+VE组、APS组没有显着性差异,VE组显着高于高OLA组（P<0.05）。（3）SOD的表达随喹乙醇浓度增加呈下降趋势,中OLA组、低OLA组和空白对照组没有显着性差异。高OLA组显着低于空白对照组（P<0.05）。高OLA组和APS+VE组、VE组及APS组之间没有显着性差异。GSH-Px的表达随喹乙醇浓度增加呈上升趋势。低OLA组、中OLA组和高OLA组极显着高于空白对照组（P<0.01）。高OLA组极显着高于APS+VE组、VE组及APS组。结果表明,高剂量喹乙醇引起小鼠睾丸组织发生严重的氧化应激,抗氧化酶活性发生改变,氧化产物生成增多,导致精液品质下降、生精细胞凋亡,造成机体生殖功能障碍。VE、APS对小鼠生殖系统没有明显的抗氧化保护作用。4、喹乙醇及VE、APS干预对雄性小鼠睾酮合成相关基因表达量的影响试验通过荧光定量PCR对睾丸组织17?-HSD、P450scc、Star、3?-HSD、P450c17五种睾酮合成相关酶基因表达水平的测定分析喹乙醇及VE、APS干预对睾酮合成的影响。试验结果显示:（1）17?-HSD的表达随喹乙醇浓度增加呈下降趋势。低OLA组和中OLA组显着低于空白对照组和阴性对照组（P<0.05）。高OLA组极显着低于空白对照组（P<0.01）。高OLA组和APS+VE组、VE组及APS组之间没有显着性差异。（2）P450scc的表达随喹乙醇浓度增加呈下降趋势。中OLA组和高OLA组显着低于空白对照组（P<0.05）,低OLA组和空白对照组没有显着性差异,高OLA组和APS+VE组、VE组及APS组之间没有显着性差异。（3）Star的表达随喹乙醇浓度增加呈下降趋势。高OLA组显着低于空白对照组（P<0.05）,中OLA组、低OLA组和空白对照组没有显着性差异,高OLA组和APS+VE组、VE组及APS组之间没有显着性差异。（4）3?-HSD的表达随喹乙醇浓度增加呈先升高后下降的趋势,低OLA组显着低于空白对照组（P<0.05）。中OLA组、高OLA组和空白对照组没有显着性差异,VE组、APS组和APS+VE组极显着低于高OLA组（P<0.01）。（5）P450c17的表达随喹乙醇浓度增加呈下降的趋势,高OLA组显着低于空白对照组（P<0.05）,低OLA组、中OLA组和空白对照组没有显着性差异,高OLA组和VE组、APS组、APS+VE组没有显着性差异。结果表明,高剂量喹乙醇抑制小鼠睾丸组织睾酮合成相关酶基因的表达,机体睾酮合成减少,导致睾丸、精囊腺严重萎缩,精液品质严重下降,生精细胞和附睾上皮细胞大量变性坏死,造成小鼠生殖系统结构和功能都发生严重损伤。VE、APS对小鼠睾酮合成没有明显的保护作用。
李道稳[3]（2018）在《喹乙醇诱导细胞凋亡和周期阻滞的分子调控机制研究》文中研究说明喹乙醇（Olaquindox）属喹恶啉-1,4-二氧化物,作为一种抗菌饲料添加剂,用来治疗动物细菌性感染和促进动物生长。喹乙醇已被证明具有遗传毒性,且已被部分国家和地区禁止使用,我国也于2017年禁止喹乙醇作为饲料添加剂使用。但是,由于其生产成本低、抗菌促生长效果良好,现还在我国养殖业非法使用,并且其毒性分子机制仍不清楚,对人类健康构成严重威胁。本文以小鼠与人肝癌HepG2细胞为模型,对喹乙醇诱导的肝毒性及细胞凋亡和周期阻滞过程中的信号转导通路进行研究,并对姜黄素降低喹乙醇毒性作用的机制进行初探。本文研究结果分为下列五个部分:（1）本研究成功建立喹乙醇小鼠模型,用三个浓度（100、200和400 mg/kg）喹乙醇连续灌胃28天,证明喹乙醇能明显诱导小鼠肝氧化应激与线粒体损伤,且具有一定的剂量依赖性,证实了喹乙醇诱导小鼠肝损伤通过激活线粒体凋亡通路,激活p53/GADD45a/p21、Nrf2/HO-1、AKT、NF-kB、MAPK等信号通路及自噬通路。（2）本研究成功建立了 GADD45a低表达稳定转染细胞系,证明了 GADD45a可以调控喹乙醇诱导的ROS产生和线粒体凋亡通路。干扰GADD45a基因后,增加喹乙醇诱导的细胞凋亡和DNA损伤,且进一步激活JNK/p38通路。JNK抑制剂（SP600125）和p38抑制剂（SB203580）抑制JNK/p38通路后,显着抑制GADD45a的激活,同时增加喹乙醇诱导的细胞凋亡、DNA损伤和S期阻滞,表明JNK/p38通路在喹乙醇诱导的细胞凋亡中具有保护作用,证实了 JNK/p38通路部分参与了 GADD45a调控的喹乙醇诱导的细胞凋亡和S期阻滞。（3）本研究成功建立p21低表达稳定转染细胞系,证实了喹乙醇通过p53非依懒性方式抑制p21蛋白表达,AKT可以使p21磷酸化,并且诱导p21蛋白从细胞核转移到胞浆中,发挥抗凋亡的作用。喹乙醇通过激活AKT和Nrf2/HO-1信号通路参与诱导HepG2细胞线粒体凋亡和S期阻滞,进一步验证了小鼠试验结果。PI3K/AKT抑制剂（LY294002）和Nrf2/HO-1抑制剂（ZnPP-IX）抑制AKT通路和HO-1信号通路后,增加喹乙醇诱导的细胞凋亡和周期阻滞,表明AKT和Nrf2/HO-1信号通路的抑制发挥促凋亡的作用。干扰p21基因后通过进一步激活AKT通路、抑制Nrf2/HO-1信号通路,增加喹乙醇诱导的线粒体凋亡和S期阻滞。（4）喹乙醇诱导细胞毒性调控中GADD45a和p21调控方式主要是p53非依赖性的。进一步研究证实,p53在喹乙醇诱导的毒性中具有促凋亡的作用,p53基因缺失后减少喹乙醇诱导的线粒体凋亡,使用p53基因缺失小鼠模型进一步验证了 p53的促凋亡作用。p53可能是通过抑制自噬通路,激活JNK/p38信号通路发挥它的促凋亡作用。（5）小鼠与细胞模型证明,姜黄素明显降低喹乙醇诱导的氧化应激与细胞内ROS水平、caspase激活及细胞凋亡。姜黄素通过上调Nrf2/HO-1通路,下调NF-kB通路及抑制NF-kB核转位增强其抗氧化能力。进一步研究证实,姜黄素通过激活Nrf2/HO-1通路,抑制NF-kB、p53通路保护喹乙醇诱导的线粒体凋亡,从而改善喹乙醇诱导的肝损伤。综上所述,本研究从体内和体外评价喹乙醇的毒性,证实GADD45a和p21通过p53非依赖性调控喹乙醇诱导细胞凋亡与周期阻滞,同时JNK/p38、AKT及Nrf2/HO-1通路参与调控喹乙醇诱导细胞凋亡与周期阻滞。本研究为评估喹乙醇及其他喹恶啉类药物对食品动物和人的安全性提供科学依据。
曹丽萍[4]（2018）在《建鲤急性肝损伤模型的构建及几种中草药饲料添加剂对肝脏的保护作用》文中提出随着水产集约化养殖的高度发展,环境污染、高蛋白、高脂肪或霉变饲料的使用,以及抗生素和杀虫剂的滥用均可导致鱼类肝脏受损,破坏肝细胞的正常功能,导致肝细胞破裂,肝组织发生病变,肝脏功能下降,最终导致鱼类的死亡。研究证实,在多种肝病的肝细胞损伤中,多种酶、自由基以及脂质过氧化反应均发生较大的变化;同时,肝损伤发生发展过程中,一系列的细胞因子被激活,既能直接损伤肝细胞,又可通过诱生炎性介质间接产生毒性作用,在疾病的进程中发挥了重要的作用。目前,各种抗生素、杀虫剂和抗病毒药物都不能有效地控制鱼类肝病的发生。因此,利用具有生物学活性的肝损伤模型,快速而高通量地筛选护肝药物并探索其作用原理具有重要意义。动物模型的建立方法有很多,如用四氯化碳（CCl4）、异种蛋白、乙醇、二甲基亚硝胺、复合因素致肝纤维化模型等。其中CCl4是最早、最广泛应用于实验性肝损伤动物模型的选择性肝毒性物质,其成模率高,重复性好,易操作。20世纪60年代后期,中药作为免疫增强剂而引起人们的关注。研究表明中药能调节多种细胞因子,增强机体内抗氧化系统功能,具有良好的抗病毒、抗肿瘤和抗衰老作用。最近10年,中草药已广泛地应用于水产动物的病害防治及其健康养殖中,其天然、毒副作用小、无残留,在鱼类的肠炎防治、免疫力增强方面效果显着。目前,研究发现中草药在防治鱼类肝损伤方面也同样具有良好的效果,并且优势独特,有望在不久的将来成为广为利用的治疗鱼肝病的高效药。本研究构建了CC14诱导的建鲤（Cyprinus carpio.Jian）急性肝（细胞）损伤模型,在此基础上筛选了25种中草药（提取物）,并进一步研究了其中三种中草药的保肝作用及联合应用,为开发水产上保肝中药饲料配方奠定理论基础。1.CCl4诱导的建鲤急性肝损伤模型的构建以四氯化碳为肝毒剂,建立建鲤体内外急性肝损伤模型。方法:体内,采用腹腔注射法造模,按 0.1mL/10g 一次性分别注射 0、6.25%、12.5%、15%、18.75%和 25%CCl4-橄榄油溶液（V/V）,于造模后24～144h取血,测定建鲤血清中谷丙转氨酶（GPT）、谷草转氨酶（GOT）、乳酸脱氢酶（LDH）和丙二醛（MDA）水平;体外,0、2、4、8、16、32mMCCl4分别作用于原代培养的建鲤肝细胞4h,或0、2、4、6、12、24mMCCl4作用于体外培养建鲤精密肝切片（precision-cut liver slices PCLS）4 h,用噻唑蓝（MTT）法检测细胞或PCLS生存状况,同时收集细胞培养上清或切片,测定GPT、GOT、LDH、MDA、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）活力。结果:显示,12.5%、15%CC14-橄榄油溶液腹腔注射建鲤24 h后即能引起血清中GOT、GPT和MDA显着升高（P<0.05或P<0.01）,15%CCl4溶液造模组48 h能显着提高血清中LDH水平（P<0.05）,4个指标均在CCl4作用96 h后恢复到接近正常水平;8～32 mMCCl4作用体外培养肝细胞4h时,细胞上清中GPT、GOT、LDH和MDA含量显着升高、SOD和GSH活力显着下降,肝细胞存活率显着下降,分别为空白对照组的66.29%、54%和37%,且有剂量依赖性;4～24mMCCl4作用4h后,建鲤精密肝切片培养上清液的GOT、GPT、LDH和MDA含量升高,SOD和GSH水平下降,与对照组相比,差异显着（P<0.05或P<0.01）,浓度为12mM的CCl4,损伤4h,肝切片的活力维持在65%以上。结论:分别采用15%CCl4-橄榄油,按0.1ml/10g腹腔注射建鲤72 h、8 mM CCl4作用体外培养肝细胞4 h及12mM的CCl4损伤PCLS 4 h可以构建体内外急性肝损伤模型。这为高效大批量筛选保肝中药提供了可能。2.基于CCl4诱导的建鲤肝细胞损伤模型对25味中草药（提取物）的初筛利用构建的CCl4诱导的建鲤急性肝细胞损伤模型对25味中草药（提取物）进行了初筛。方法:采用8mMCCl4作用体外培养肝细胞4h造模,用含有低、中、高剂量中草药（提取物）的L-15培养基进行前处理、前后处理及后处理孵育4h后,通过测定肝细胞活力和细胞培养上清中LDH、GPT、GOT、SOD和GSH-PX等生化指标来观察这25味中草药（提取物）的保肝效果。结果:中草药对CC14诱导的肝细胞损伤的保护作用规律类似,中药能显着抑制CC14导致的细胞增值活性的降低（P<0.05或P<0.01）;能显着抑制培养上清中GPT、GOT和LDH活性的升高（P<0.05或P<0.01）,显着恢复上清中GSH-PX和SOD水平（P<0.05或P<0.01）,抑制MDA生成（P<0.05）;中药提取物与CCl4的给予顺序影响着中草药提取物对肝细胞的保护效果,前后处理组对损伤肝细胞的保护效果明显要优于前和后处理组;杜仲提取物的保肝效果不明显。结论:大都数的中草药（提取物）对CCl4诱导的建鲤肝细胞损伤有保护作用,该作用与它们的清除自由基和抗氧化能力有关;中草药提取物对肝损伤的预防作用比治疗作用更重要。3.甘草次酸的保肝作用研究利用CC14诱导的建鲤精密肝切片损伤模型,评价甘草次酸（Glycyrrhetinic acid,GC）对建鲤精密肝切片的抗氧化及缓解炎症反应的效果。方法:采用12 mMCCl4损伤PCLS 4 h造模,用含GC（2.5、5和10μg/ml）和PDTC（4μg/ml）的L-15培养基预孵6h,然后收集肝切片和细胞培养上清,分别测定肝切片活力、培养上清和肝组织匀浆中肝损伤生化酶含量及采用实时定量PCR法和Western blots测定肝组织中核转录因子NF-kB/C-Rel及细胞因子iNOS、IL-1β、IL-6和IL-8的mRNA表达和蛋白水平的变化。结果:甘草次酸预处理精密肝切片6h能显着抑制CC14的细胞毒性,5和10 μg/ml的甘草次酸能极显着提高切片的增值活性;甘草次酸能缓解CC14诱导的精密肝切片的氧化应激程度,5和10 μg/ml的甘草次酸能显着促进匀浆中SOD、GSH活性水平的恢复（P<0.05）,同时极显着抑制MDA合成（P<0.01）;5和10 μg/ml的甘草次酸均能显着抑制CC14诱导的NF-kB/C-Rel、iNOS、IL-1β3、IL-6和IL-8等炎症细胞因子的mRNA表达量的升高,也能显着抑制C-Rel的蛋白水平（P<0.05或P<0.01）;核转录因子NF-kB抑制剂PDTC（4μg/ml）作用精密肝切片6h后,NF-kB表达量受到显着的抑制（P<0.01）,其下游的iNOS、IL-1β、IL-6和IL-8的表达也相应的显着下调,切片的增值活性显着提高（P<0.05或P<0.01）,甘草次酸结果与其一致。结论:甘草次酸对建鲤精密肝切片有保护作用,与其抗击炎症和降低细胞毒性作用有关。4.姜黄素的保肝作用研究利用CC14诱导的建鲤体内肝损伤模型,对姜黄素的保肝作用行深入研究。方法:用含姜黄素（0.1、0.5和1.0%）的饲料饲喂鲤60 d,再腹腔注射30%CC14混合液,然后抽血及采集肝组织,分别测定肝指数、肝细胞DNA损伤程度、血清和肝组织匀浆中肝损伤生化酶含量、肝组织病理切片及采用实时定量PCR法测定肝组织中核转录因子NF-kB/C-Rel及细胞因子IL-1β、TNF-α和IL-12的mRNA表达水平的变化。结果:0.5和1.0%的姜黄素能显着抑制CC14导致的肝指数增大（P<0.05）,同时能有效减少肝细胞DNA断片的产生,对肝细胞彗星的慧尾长、尾部DNA百分含量、尾矩及Olive尾炬等损伤指标均有显着改善作用;姜黄素能明显减轻CC14作用导致的肝组织广泛性空泡变性、细胞轮廓不清、核固缩和核溶解等组织学病变;0.5和1.0%的姜黄素能显着抑制CC14诱导的鲤血清中GOT含量升高及促进肝组织匀浆中SOD水平的恢复（P<0.05）,而1.0%的姜黄素能显着降低鲤血清中GPT和LDH含量（P<0.05）、显着提高匀浆中T-AOC和GSH水平（P<0.05）、显着抑制MDA合成（P<0.05）;0.5和1.0%的姜黄素能显着抑制CC14诱导的NF-kB/C-Rel、IL-1β和TNF-α的表达量的增加（P<0.05）,而低、中、高浓度的药物均能显着下调IL-12的表达量（P<0.05）;随着姜黄素浓度的增大,肝指数、酶指标、病理切片及细胞因子的mRNA表达均表现出剂量效应。结论:姜黄素对建鲤肝组织有保护作用,其能有效改善肝细胞DNA的损伤程度,调节其抗氧化能力及相关细胞因子的分泌。5.香菇多糖对鲤鱼离体培养免疫细胞的活性调节作用采用Percoll密度离心等技术,对鲤鱼（Cyprinus carpio）的头肾巨噬细胞和外周血白细胞进行分离纯化,并离体培养,来研究香菇多糖对鲤鱼离体培养免疫细胞的活性调节作用。方法:体外暴露不同浓度的香菇多糖后,分别采用MTT法测定它们对鲤鱼外周血白细胞增殖的影响;NBT（nitroblue tetrazolium）还原法和Griess试剂显色法测定对头肾巨噬细胞的呼吸爆发的影响;实时定量PCR法测定头肾巨噬细胞细胞因子IL-1β诱导表达的影响。结果:香菇多糖作用头肾巨噬细胞24 h后浓度为1,10和100 μg/mL时能显着诱导巨噬细胞的氧爆发活性（P<0.05或P<0.01）;作用头肾巨噬细胞96 h后,其低浓度对巨噬细胞生成一氧化氮无显着影响,当作用浓度为1000 μg/mL表现出显着的高浓度抑制作用（P<0.01）;浓度为100和1000 μg/mL的香菇多糖作用外周血白细胞24 h后,可以显着促进鲤鱼外周血白细胞的增殖（P<0.01）,且在作用巨噬细胞24 h后浓度为100 μg/mL能显着增强IL-1β3的体外诱导表达（P<0.01）。结论:香菇多糖对离体培养鲤鱼免疫细胞有明显活性作用,对鲤鱼非特异性免疫和特异性免疫具有促进作用,是一种有潜力的鱼用免疫增强剂。6.姜黄素、甘草次酸和香菇多糖联合对CC14诱导的建鲤肝损伤的保护作用以四氯化碳构建建鲤体内急性肝损伤模型,对姜黄素、甘草次酸和香菇多糖联合护肝作用进行研究。方法:分别用含有姜黄素、甘草次酸、香菇多糖和低、中、高剂量组联合中草药饲料投喂60 d后,各组腹腔注射30%的CC14,注射剂量为每10 g鱼体注射0.05 mL。禁食72 h,以诱导肝损伤。通过测定各组生长指标、血清和肝组中的生化酶及肝组织炎性细胞因子mRNA的表达情况来观察联合用药组的保肝效果。结果:甘草次酸单味用药组及中、高剂量姜黄素+甘草次酸+香菇多糖联合用药组能显着提高建鲤的相对增重率和特定生长率（P<0.05）,显着降低饵料系数（P<0.05）:与模型组相比,各用药组能显着抑制CC14导致的血清清中GPT、GOT和LDH活性的升高（P<0.01）,显着恢复肝组织中GSH和SOD水平（P<0.01）,抑制MDA生成（P<0.05或P<0.01）,能显着抑制 C-Rel、iNOS、IL-1β、TNF-α、IL-6 和 IL-8 表达量的升高（P<0.05 或P<0.01）;与姜黄素、甘草次酸或香菇多糖单味用药组相比较,姜黄素+甘草次酸+香菇多糖联合用药组保肝效果更明显（P<0.05或P<0.01）,随着联合用药组剂量的升高,作用愈加显着（P<0.05或P<0.01）。结论:姜黄素、甘草次酸和香菇多糖联合用药后,对CCl4诱导的建鲤肝损伤具有协同放大的保护作用。
任胜杰[5]（2017）在《黄芪多糖和当归多糖对鲫鱼细胞凋亡的影响》文中进行了进一步梳理细胞凋亡是细胞的主动消亡过程,是生物体细胞维持机体平衡的关键,其过程极为复杂涉及一系列调控因子。中药多糖为中草药提取物的主要活性成分,因其具有毒副作用较小,耐药性低等优良特性而引起国内外学者的关注,中药多糖能够促进水产动物的生长,增强饵料利用率,提升先天性免疫反应,增加抗菌活性等。本试验通过研究黄芪多糖（Astragalus Polysacharin,APS）和当归多糖（Angelica sinensis polysaccharide,ASP）对维氏气单胞菌（Aeromonas veronii,简称维氏菌）诱导的鲫（Carassius auratus）细胞凋亡的影响及对细胞凋亡途径和抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因BAX的表达调控影响,探究中药多糖对鲫细胞凋亡的影响效果和影响凋亡的作用机制,从而为中药多糖在水产病害防治等方面提供科学依据。1黄芪多糖和当归多糖对维氏气单胞菌诱导的鲫细胞凋亡的影响试验设阴性对照组、阳性对照组,黄芪多糖组和当归多糖组四个处理组,每个处理组设三个平行组,每个平行30尾鲫,通过对鲫用维氏菌攻毒处理,用流式细胞仪测定血细胞的凋亡比例和细胞周期变化,并用荧光显微镜和透射电镜观察凋亡细胞的形态。结果显示:维氏菌攻毒后阳性对照组鲫血细胞的细胞凋亡率均极显着高于多糖组和阴性对照组（P<0.01）;多糖组能显着降低鲫的细胞凋亡且黄芪多糖组的效果更显着;攻毒后鲫肝细胞和肾脏淋巴细胞出现染色质凝集,细胞核固缩边集和细胞空泡化及凋亡小体;同阴性对照组相比维氏菌攻毒可以引起鲫血细胞周期中S/G2+M期细胞比例极显着下降,sub-G1极显着升高,抑制细胞分裂诱发凋亡;多糖组则G0/G1期细胞极显着降低,S/G2+M期细胞极显着升高,sub-G1极显着降低,促进细胞分裂抑制凋亡。黄芪多糖和当归多糖添加量在1%时能抑制维氏菌攻毒引起的细胞凋亡。2黄芪多糖和当归多糖对维氏气单胞菌诱导的鲫细胞凋亡通路的影响试验设阴性对照组、阳性对照组,黄芪多糖组和当归多糖组四个处理组,每个处理组设三个平行组,每个平行30尾鲫,维氏菌攻毒处理后用ELISA法测定鲫血细胞的细胞色素C（cyt-c）含量变化,用流式细胞仪测定血细胞的凋亡比例、线粒体膜电位、胞内pH、胞内游离钙离子浓度,并对血细胞caspase-9、caspase-3的酶活力进行测定。结果显示:在相同检测时间点阳性对照组血细胞凋亡率均极显着高于多糖组和阴性对照组（P<0.01）,且攻毒后24h鲫血细胞凋亡率最高为21.40%,此时出现细胞核染色质凝集和边缘化形成特异性的“新月形”边集及凋亡小体的凋亡细胞和明显的不均等有丝分裂;攻毒能够显着诱导鲫血细胞胞内酸化和胞内游离Ca2+浓度上升,进而造成线粒体膜电位显着降低和cyt-c含量caspase-9、caspase-3酶活力的依次显着升高（P<0.05）,从而诱发鲫血细胞线粒体通路细胞凋亡。黄芪多糖和当归多糖添加量在1%时能够通过抑制线粒体细胞通路来降低维氏气单胞菌诱导的细胞凋亡。3黄芪多糖和当归多糖对鲫凋亡基因BAX和Bcl-2表达的影响通过同源克隆测序获得鲫凋亡基因BAX和Bcl-2部分mRNA序列,采用RT-PCR方法检测鲫BAX和Bcl-2基因在六种组织中的相对表达量。维氏菌攻毒处理后检测鲫血细胞的凋亡比例变化,观察凋亡血细胞的形态并测定BAX和Bcl-2基因在鲫血细胞中的表达变化。结果表明:通过序列比对发现鲫同鲤鱼的Bcl-2基因核苷酸序列相似性最高达96%,系统进化分析显示鲫和鲤形目的鱼类紧密聚在一支同鲤鱼的亲缘关系最近,较其他物种鲫和鲤形目以及鲈形目等进化地位较低的硬骨鱼类亲缘关系较近;BAX基因在鲫六种组织中的表达量从高到低分别为血液>肝脏>头肾>心脏>脾脏>肌肉,Bcl-2基因从高到低分别为血液>肝脏>头肾>心脏>肌肉>脾脏;攻毒后能够引起显着的细胞凋亡且24h凋亡率达到最高21.70%,此时能够引起鲫血细胞出现细胞皱缩,细胞核边集等显着的细胞凋亡形态变化;攻毒后Bcl-2和BAX基因相对表达量均表现出先升高后降低的趋势,Bcl-2/BAX在阳性对照组中出现显着降低,且在攻毒后24h和48h间出现最低点,在黄芪多糖组和当归多糖组均出现显着升高,分别在攻毒后24h和72h出现最高值。黄芪多糖和当归多糖在饲料中添加量为1%时可通过促进增大Bcl-2/BAX来有效抑制维氏菌诱导的细胞凋亡。
杨洋[6]（2014）在《喹乙醇诱导HEK-293细胞DNA链断裂损伤产生氧化应激及溶酶体线粒体相关机制探讨》文中认为目的：喹乙醇是一种人工合成的抗菌促生长剂，因其具有效率高、毒性低、残留少等特点，在中国作为饲料添加剂广泛使用。喹乙醇药物毒性作用原理和相关机制尚不明确，对药物使用剂量范围没有明确规定。由于喹乙醇药物使用不当，大量动物中毒死亡事件时有发生，直接或间接危及人类健康。本试验对喹乙醇诱导人胚肾HEK-293细胞毒性相关指标进行检测，通过观察细胞氧化应激的产生和溶酶体、线粒体膜稳定性的改变，从而探讨喹乙醇对DNA链断裂损伤可能遗传毒性机制，为进一步评估喹乙醇对人类健康的影响提供试验依据。方法：在本次试验中，选择人胚肾HEK-293细胞为研究对象，通过单细胞凝胶电泳（SCGE）试验技术检测并观察喹乙醇对细胞DNA的损伤情况；WesternBlotting免疫印记技术用于检测DNA损伤相关蛋白p53的表达水平；Real-timePT-PCR技术用于检测DNA损伤相关基因ATM和p53的表达水平。为探讨其可能的遗传毒性机制，荧光分光光度计对以下指标进行检测：吖啶橙（AO）染色法用于检测细胞内溶酶体膜稳定性；2’，7’—二氢二氯荧光素（DCFH-DA）染色法用于检测细胞内ROS水平；苯二醛（OPT）染色法用于检测细胞内GSH水平；罗丹明123（Rhodamine123）染色法用于检测细胞内线粒体膜电位。地昔帕明（50μM）和N-乙酰半胱氨酸（N-Acetylcysteine,NAC）（10mM）分别作为溶酶体膜稳定性和氧化损伤的保护剂，对HEK-293细胞进行预处理，为探讨喹乙醇诱导HEK-293细胞DNA链断裂损伤相关途径机制提供依据。试验结果用SPSS13.0进行统计分析。结果：HEK-293细胞经不同浓度喹乙醇（200、400、800μg/ml）药物处理2h，试验结果分析得出：尾长（Tail Length）分别为42.88μm，74.10μm，84.16μm；尾DNA百分含量（Tail DNA％）分别为34.06%，36.30%，50.83%；尾矩（Tailmoment）分别为15.69μm%，28.72μm%，43.95μm%，与空白对照组比较，200-800μg/ml药物处理组均有统计学差异（P＜0.01）且呈剂量依赖关系。喹乙醇（200，400，800μg/ml）作用细胞2h，与空白对照组比较，细胞内AO的荧光强度分别增加了24.66%，34.93%，48.07%（P＜0.05，P＜0.01）；浓度为800μg/ml药物处理组ROS水平升高了67.89%（P＜0.01）；浓度为400μg/ml和800μg/ml药物处理组GSH水平分别下降了26.92%和41.58%（P＜0.01）。喹乙醇（200，400，800μg/ml）作用细胞12h，与空白对照组比较，浓度为400μg/ml和800μg/ml药物处理组细胞内线粒体膜电位分别下降了30.08%和44.95%（P＜0.01）；浓度为400μg/ml和800μg/ml药物处理组p53蛋白表达量显着增加（P＜0.01），p53和ATM基因的表达水平显着升高（P＜0.01），呈剂量依赖关系。地昔帕明（50μM）预处理HEK-293细胞1h，与喹乙醇（800μg/ml）单独染毒剂量组相比，细胞内AO荧光强度下降了42.21%（P＜0.01）；NAC（10mM）预处理HEK-293细胞1h，与喹乙醇（800μg/ml）单独染毒剂量组相比，ROS水平下降了36.74%（P＜0.01），而GSH水平相对升高了70.65%（P＜0.01）；两种保护剂的干预都可以有效减轻喹乙醇引起的DNA链断裂损伤，使彗星拖尾明显减小。结论：喹乙醇可以诱导人胚肾HEK-293细胞DNA损伤，使DNA损伤相关蛋白p53和损伤基因ATM、p53表达上调。喹乙醇诱导细胞DNA损伤的作用机制与溶酶体途径有关：喹乙醇通过改变溶酶体膜通透性，释放一些酸性水解酶，从而导致DNA损伤。地昔帕明作为酸性鞘磷脂酶的抑制剂，通过抑制溶酶体的水解酶类，从而保护溶酶体膜稳定性，抑制p53蛋白的表达，减轻喹乙醇诱发的DNA链断裂损伤；喹乙醇诱导细胞DNA损伤与细胞内氧化损伤有关：NAC作为一种有效的抗氧化剂，可以降低细胞内氧化应激水平，升高GSH水平，使p53蛋白表达量减少，从而抑制喹乙醇对HEK-293细胞DNA损伤；喹乙醇诱导细胞DNA损伤与线粒体途径有关：喹乙醇可以通过降低线粒体膜稳定性，从而导致DNA链断裂损伤。通过时间点试验验证，喹乙醇作用HEK-293细胞2h可以引起溶酶体膜稳定性的改变并使细胞处于氧化应激状态，而线粒体膜稳定性未发生明显变化；药物作用时间延长至12h,细胞线粒体膜稳定性显着下降。由此推出：喹乙醇诱导HEK-293细胞DNA链断裂损伤，首先使溶酶体膜遭到破环，产生ROS，漏出的酸性水解酶和氧化自由基共同作用线粒体，使线粒体膜稳定性下降。
金丽丽[7]（2014）在《Cathepsin B在喹乙醇致肝损伤中的作用研究》文中指出目的本研究通过建立喹乙醇（Olaquindox，OLA）中毒大鼠模型，初步探讨喹乙醇对实验大鼠的肝脏功能、炎症反应、氧化损伤、凋亡状况和组织蛋白酶B（Cathepsin B）蛋白表达的影响。采用体外细胞培养研究和应用cathepsin B抑制剂（CBI）干预观察其对细胞凋亡的影响，探讨cathepsin B蛋白在喹乙醇诱导的肝细胞凋亡机制中的作用。本研究结果将为进一步阐明喹乙醇肝损伤机制提供线索和依据，同时也为寻找预防靶点提供新的信息。方法1建立雄性SD大鼠OLA中毒模型：SPF雄性SD大鼠32只，体重180～220g，适应性喂养一周后随机分为4组，分别为对照组、20mg/kg OLA染毒组、40mg/kg OLA染毒组和60mg/kg OLA染毒组，每组8只。染毒组分别灌胃给不同浓度等体积的OLA水溶液，对照组同样方法灌胃给双蒸水，连续四周。2应用ELISA方法和试剂盒方法检测大鼠肝组织中cathepsin B、白介素-6（IL-6）和肿瘤坏死因子（TNF-）的含量和血清中谷丙转氨（ALT）酶、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）和乳酸脱氢酶（LDH）活性；同时应用南京检测试剂盒检测肝组织总抗氧化能力（T-AOC）和超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）活性。3HE染色方法观察大鼠肝组织病理变化。4应用流式细胞仪和透射电镜检测大鼠肝组织细胞凋亡水平。5应用免疫组化方法检测大鼠肝脏cathepsin B蛋白表达水平。6建立OLA致人肝癌细胞HepG-2细胞损伤模型：采用37℃、5%CO2恒温培养箱培养HepG-2细胞，实验细胞分为五组：对照组、100ug/ml OLA组、200ug/ml OLA组、400ug/ml OLA组、400ug/ml OLA+CBI组，培养24h后用0.25%胰酶消化细胞，进行指标检测。7MTT法检测不同浓度喹乙醇染毒的HepG-2细胞增殖率。8应用流式细胞术检测各组HepG-2细胞早期凋亡率和活性氧含量。9应用ELISA方法检测各组HepG-2细胞cathepsin B蛋白含量。10Western blot方法检测cathepsin B、caspase-3蛋白表达水平。结果1OLA染毒对大鼠肝脏功能的影响：与对照组比较，随着OLA染毒剂量的增加，大鼠血清中ALT、AST、ALP和LDH活性逐渐升高（P＜0.05），且ALT和AST活性与OLA染毒剂量正相关（r=0.967P=0.033， r=0.980P=0.020）。2OLA染毒对大鼠肝脏氧化损伤的影响：与对照组比较，20mg/kg组、40mg/kg组和60mg/kg组大鼠肝组织中T-AOC和SOD、CAT活性下降（P＜0.05），40mg/kg组和60mg/kg组大鼠肝组织中GSH-PX活性下降（P＜0.05）。3OLA染毒对大鼠肝脏炎症反应的影响：染毒组大鼠肝脏汇管区都有不同程度的炎性细胞浸润；随着OLA染毒剂量的增加大鼠肝组织中TNF-和IL-6含量逐渐升高（P<0.05）。4OLA染毒对大鼠肝细胞凋亡状况的影响：OLA可诱导大鼠肝细胞凋亡，随OLA染毒剂量的增加早期凋亡率逐渐升高，40mg/kg组和60mg/kg组早期凋亡率分别升高了231.25%和478.12%（P＜0.05）)。5OLA染毒大鼠肝脏cathepsin B蛋白含量及表达变化：Cathepsin B主要表达在大鼠肝脏汇管区及坏死病灶周围的细胞胞浆中，随着OLA剂量的增加，棕黄色颗粒明显增多，60mg/kg OLA组细胞胞浆中棕黄色颗粒沉淀多而密集。与对照组比较，40mg/kg组和60mg/kg组cathepsin B蛋白含量分别升高了34.04%、72.34%（P＜0.05）。6不同浓度OLA对HepG-2细胞增殖的影响：OLA可抑制HepG-2细胞增殖，随着染毒剂量的增加，细胞相对存活率明显降低（P＜0.05）。7CBI对OLA染毒的HepG-2细胞增殖的影响：与对照组比较，OLA染毒组和CBI组细胞存活率均降低，CBI组细胞存活率高于OLA染毒组（P＜0.05）。8CBI对OLA诱导的HepG-2细胞凋亡和ROS含量的影响：随着OLA染毒剂量的增加，细胞凋亡率和ROS含量逐渐升高，且400μg/mlOLA+2.5μg/mlCBI组细胞凋亡率和ROS含量均低于400μg/mlOLA组（P＜0.05）。9CBI对OLA染毒的HepG-2细胞内cathepsin B、caspase-3蛋白表达水平的影响：随着OLA染毒剂量的增加，HepG-2细胞内cathepsin B蛋白含量逐渐升高。400μg/mlOLA+2.5μg/mlCBI组蛋白含量明显低于400μg/mlOLA组（P＜0.05）。与对照组比较，OLA染毒组cathepsin B和caspase-3表达水平升高：400μg/mlOLA+2.5μg/mlCBI组cathepsin B和caspase-3表达水平高于对照组，但是低于400μg/mlOLA组（P＜0.05）。结论1OLA可致大鼠肝脏氧化损伤，诱发肝脏炎症反应，导致肝细胞凋亡，肝组织cathepsin B蛋白表达水平升高，cathepsin B蛋白可能参与了喹乙醇诱导的大鼠肝脏损伤。2OLA可诱导HepG-2细胞凋亡，凋亡相关蛋白cathepsin B和caspase-3表达水平上调，cathepsin B蛋白可能参与了OLA诱导的细胞凋亡。
董玉良[8]（2013）在《镉和五氯酚对原代培养鲫鱼肝细胞毒性及联合作用效应研究》文中指出随着工业生产的迅速发展和人民生活水平的不断提高,大量含持久性生物累积性有毒污染物（Persisitent Bioaccumulative Toxic Pollutants, PBT）的污水直接或间接进入水体,使水环境受到了日益严重的污染。由于PBT污染物具有“环境持久性”,在环境中可以长期积累,所以环境系统中积累几种PBT污染物也随之日益普遍。因此,多种PBT污染物在环境系统中的联合毒理效应及其机理的研究,受到了人们越来越多的重视。虽然有人研究了PBT污染物对细胞的毒性及其诱导细胞凋亡的机制,但PBT污染物联合作用对细胞的毒性效应鲜见报道,且其诱导细胞凋亡的具体作用机制尚不清楚,因此本文采用胰蛋白酶分离法成功的分离鲫鱼肝细胞,并以原代培养鲫鱼肝细胞为研究对象,研究了不同浓度镉（Cadmium, Cd）（0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L）和五氯酚（Pentachlorophenol, PCP）（0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L）及其联合作用（0.1、1、10μmol/L）对原代培养鲫鱼肝细胞的毒性效应及其诱导细胞凋亡的机理。主要研究内容和结果如下：（1）探讨了原代培养鲫鱼肝细胞的分离、培养、鉴定,研究了Cd和PCP单独及联合作用对原代培养鲫鱼肝细胞活力的影响,同时测定Cd和PCP单独及联合作用下鲫鱼肝细胞形态学的变化。结果表明,0.25%胰蛋白酶消化法可以分离出鲫鱼肝实质细胞,但含有大量的肝非实质细胞和细胞碎片,用差速离心法提纯3次,可使肝细胞纯度达到92%以上。肝细胞活力随着Cd或PCP浓度的增大,细胞活力逐渐降低,并呈现剂量-效应关系。与对照相比,低浓度Cd或PCP处理差异不大,高浓度处理组差异达到显着性水平。联合染毒组表现出交互作用,析因分析结果表明交互作用为协同效应。利用透射电子显微镜检测到原代培养鲫鱼肝细胞的凋亡特征,如观察到明显的胞浆浓缩,核染色质凝聚,核膜消失,线粒体肿胀和空泡化,线粒体嵴断裂或消失,凋亡小体的出现等。（2）利用微量热法研究了Cd和PCP单独及联合作用对原代培养鲫鱼肝细胞的毒性作用。结果发现,不同浓度Cd和PCP作用下,鲫鱼肝脏细胞代谢均出现停滞期、活性恢复期、稳定期和活性衰减期四个时期；鲫鱼肝细胞代谢活性恢复期速率常数k,最大放热功率pmax,总产热量（Q）,传代时间（tG）,均受到Cd和PCP的影响。随着Cd和PCP浓度的升高,速率常数k值逐渐减小,总产热量（Q）下降,而代谢抑制率和传代时间逐渐增加。这说明鲫鱼肝细胞在代谢过程中受到Cd和PCP的抑制作用,并且Cd对鲫鱼肝细胞的毒性作用高于PCP,二者的交互作用表现为协同作用。（3）研究了Cd和PCP单独及其联合作用对原代培养鲫鱼肝细胞CAT、POD、SOD及GSH代谢相关酶的活性,同时测定了MDA、GSH、GSSG的含量。CAT、POD活性均表现出相同的趋势,即在低浓度Cd和PCP作用下CAT、POD活性被激活,随着浓度的增高CAT、POD活性逐渐减弱直至受到抑制。SOD和GST活性随着Cd和PCP浓度的增大呈下降趋势。低浓度的Cd对GSH-Px活性有诱导作用,当浓度大于1μmol/L, GSH-Px活性被显着抑制,差异达极显着水平：而在PCP单独作用下,浓度小于10μmol/L时,差异变化不大,高浓度时GSH-Px活性被显着抑制。GR活性随着Cd浓度的增大逐渐降低：PCP浓度较低时,GR活性有被激活的趋势,当浓度大于1μmol/L时GR活性显着降低。在Cd和PCP单独作用下,GST活性表现出相同的趋势,即随着污染物浓度的增加活性逐渐降低。MDA含量随着Cd和PCP浓度的升高逐渐增加。GSH含量随着浓度的升高逐渐降低,呈现良好的剂量-效应关系。在Cd单独作用下,GSSG含量先增大后降低,当Cd浓度为100μmol/L时,差异达显着性水平（P<0.05）；在PCP单独作用下,GSSG含量逐渐增大,呈现良好的剂量-效应关系。析因分析表明Cd和PCP联合作用时表现出交互作用。（4）研究了Cd和PCP单独及联合作用对原代培养鲫鱼肝细胞Na+,K+-ATPase、 Ca2+,Mg2+-ATPase活性和[Ca2+]i含量的影响。研究发现在Cd单独作用时,Na+,k+-ATPase活性逐渐减弱；PCP作用时,Na+,k+-ATPase活性先增强后减弱。Cd和PCP对Ca2+,Mg2+-ATPase活性表现出相同的变化趋势,即Ca2+,Mg2+-ATPase在低浓度Cd和PCP时,酶活性有所增强,高浓度时酶活性显着降低。[Ca2+]i的含量在低浓度Cd或PCP下变化不大,高浓度时[Ca2+]i含量显着增大。Cd和PCP联合作用下鲫鱼肝细胞Na+,K+-ATPase、Ca2+,Mg2+-ATPase活性都低于对照组,析因分析表明,Cd和PCP之间存在着交互作用,表现为协同效应。Cd和PCP联合作用组[Ca2+]i含量要高于对照组,析因分析表明,Cd和PCP联合作用对[Ca2+]i含量的影响同对ATPase活性的影响一样,也存在着协同作用。（5）研究了Cd和PCP单独及联合作用对原代培养鲫鱼肝细胞SOD、ΔΨm、DNA Ladder和凋亡率的变化,探讨Cd和PCP诱导原代培养鲫鱼肝细胞凋亡的分子机制。原代培养鲫鱼肝细胞△Ψm随着Cd和PCP浓度的增高逐渐降低,差异达极显着水平。凋亡率在Cd和PCP较低浓度下不明显,当Cd和PCP浓度达到10时,凋亡明显增加,在100μmol/LCd或PCP作用下,凋亡比率显着升高,差异达到极限制水平。DNA Ladder显示在高浓度Cd和PCP时呈现典型的“梯状”条带,结果同凋亡率相一致。在Cd和PCP联合作用下,△Ψm降低,析因分析表明,在Cd和PCP浓度低时,交互作用不明显,当浓度为10μmol/L时交互作用明显,表现出协同作用。联合作用组凋亡率增大,析因分析表明,在Cd和PCP浓度低时,交互作用不明显,当浓度为10μmol/L时交互作用明显,表现出协同作用。
于常艳[9]（2013）在《内质网应激在喹乙醇致HK-2细胞凋亡中的作用研究》文中研究表明喹乙醇（Olaquindox, OLA）系一种邻硝基苯胺类抑菌促生长剂,广泛用于动物疾病治疗和畜牧业生产。随着集约化养殖业的发展,兽药可以通过原型、代谢产物的形式借助于环境转归和食物链传递等途径最终到达人体,损害人类健康。毒理学研究表明：喹乙醇具有遗传毒性、生殖毒性、蓄积毒性和对肝、肾的靶器官毒性,欧盟已认定喹乙醇为致突变物和可疑致癌物。毒代动力学资料显示,喹乙醇主要代谢途径是经肾脏排出,动物实验也显示其对肾脏的实质性损伤。人源肾小管上皮细胞（Human Kidneys, HK-2）来源于正常人肾小管近端上皮组织,保留了肾小管上皮细胞的多种酶学、电生理学和表型特征,是研究肾脏毒性作用机制的典型细胞系。本研究以喹乙醇代谢产生活性氧为切入点,运用体外细胞培养的方法构建HK-2细胞损伤模型,通过检测内质网应激及凋亡标志蛋白的变化,初步探讨喹乙醇对HK-2细胞毒效应的作用机制,从体外角度为喹乙醇所致肾损伤的可能效应路径提供技术依据。1.喹乙醇染毒浓度和时间对HK-2细胞凋亡的影响1)喹乙醇对HK-2细胞有增殖抑制效应,24h ⅠCso值为6.8μmol/ml,R=0.9721;2)与DMSO对照组比较,喹乙醇染毒1μmol/ml组细胞早期凋亡率无明显变化（p>0.05）,喹乙醇染毒（2、3和4μmol/ml）组细胞早期凋亡率升高（p<0.05）,两两比较显示：染毒2μmol/ml组和3μmol/ml组、3μmol/ml组和4μmol/ml组,组间细胞早期凋亡率有差异（p<0.05）,喹乙醇可呈剂量依赖性的诱发HK-2细胞凋亡；3)与染毒0h的对照组比较,喹乙醇（3μmol/ml）染毒6h组细胞早期凋亡率无明显变化（p>0.05）,染毒（12和24h）组细胞早期凋亡率升高（p<0.05）,两两比较显示：染毒6h组和12h组、12h组和24h组,组间细胞早期凋亡率有差异（p<0.05）,喹乙醇可呈时间依赖性的诱发HK-2细胞凋亡。2.喹乙醇染毒浓度和时间对HK-2细胞内ROS含量的影响1)与DMSO对照组比较,喹乙醇染毒（1、2、3和4μmol/ml）组细胞内ROS含量均升高（p<0.05）,两两比较显示：染毒1μmol/ml组和2μmol/ml组、2μmol/ml组和3μmol/ml组、3μmol/ml组和4μmol/ml组,组间细胞ROS含量有差异（p<0.05）,喹乙醇可呈剂量依赖性的诱发HK-2细胞内ROS含量增加；2)与染毒Oh对照组比较,喹乙醇（3μmol/ml）染毒（6、12和24h）组细胞内ROS含量升高（p<0.05）,两两比较显示：染毒6h组和12h组、12h组和24h组,组间细胞ROS含量有差异（p<0.05）,喹乙醇可呈时间依赖性的诱发HK-2细胞内ROS含量增加。3.喹乙醇对HK-2细胞中内质网应激及凋亡蛋白表达的影响1)与DMSO对照组比较,喹乙醇染毒1μmol/ml组GRP94、GRP78、CHOP和Caspase-4蛋白表达无明显变化（p>0.05）,喹乙醇染毒（2、3和4μmol/ml）组GRP94、GRP78、CHOP和Caspase-4蛋白表达升高（p<0.05）；2)与染毒0h对照组比较：喹乙醇（3μmol/ml）染毒6h组GRP94、GRP78和Caspase-4的蛋白表达量无明显变化（p>0.05）,染毒（12和24h）组GRP94、 GRP78和Caspase-4的蛋白表达量升高（p<0.05）,染毒（6、12和24h）组CHOP的蛋白表达量升高（p<0.05）：3)喹乙醇可诱导HK-2细胞中内质网应激及凋亡标志性蛋白表达增加。4.喹乙醇对HK-2细胞中内质网应激及凋亡蛋白转录水平的影响1)与DMSO对照组比较,喹乙醇染毒1和2μmol/ml组GRP94和GRP78的mRNA水平无明显变化（p>0.05）,喹乙醇染毒（3和4μmol/ml）组GRP78和GRP94的mRNA水平上调（p<0.05）,喹乙醇染毒1μmol/ml组Caspase-4的mRNA水平无明显变化（p<0.05）,喹乙醇染毒（2、3和4μmol/ml）组Caspase-4的mRNA水平上调（p<0.05）；2)与染毒0h对照组,喹乙醇（3μmol/ml）染毒6h组GRP78和Caspase-4mRNA水平无明显变化（p>0.05）,染毒（12和24h）组GRP78和Caspase-4mRNA水平上调（p<0.05）,染毒（6、12和24h）组GRP94mRNA水平上调（p<0.05）；3)喹乙醇可诱导HK-2细胞中内质网应激和凋亡标志性蛋白转录水平上调；4)内质网应激及凋亡相关蛋白GRP78、GRP94、Caspase-4蛋白表达变化与mRNA水平变化趋势相似。5.ROS抑制剂在喹乙醇（3μmol/ml）致HK-2细胞凋亡中的作用1)NAC预处理组与对照组比较：细胞内ROS含量、细胞早期凋亡率显着均减少（p<0.05）, GRP94、GRP78、Caspase-4和CHOP蛋白表达量均减少（p<0.05）；2)喹乙醇诱导的HK-2细胞凋亡与细胞内ROS增加有关,ROS可能是内质网应激及其凋亡的关键因素。
赵文霞,张朝明,汤树生,张婷,孙雨,靳溪,肖希龙[10]（2012）在《p38 MAPK在喹乙醇诱导HepG2细胞凋亡中的作用》文中研究指明目的:研究p38 MAPK信号通路在喹乙醇诱导的HepG2细胞凋亡中的作用。方法:分别用不同浓度（0、200、400、800μg/ml）的喹乙醇染毒HepG2细胞24 h和800μg/ml喹乙醇染毒HepG2细胞不同时间（0、0.5、1、2、4、6、12、24 h）后,采用Westernblot法检测细胞内磷酸化p38蛋白和p38总蛋白的表达情况,以p38 MAPK磷酸化水平反映p38 MAPK信号通路的活性。分别采用0、10、20μmol/L的p38 MAPK特异性抑制剂SB203580预处理HepG2细胞1 h后,再用800μg/ml喹乙醇染毒24 h,采用Annexin VFITC/PI法检测细胞凋亡。结果:随着喹乙醇染毒浓度和时间的增加,HepG2细胞的p38磷酸化蛋白表达量逐步增加,其中800μg/ml喹乙醇染毒细胞24 h的实验组与对照组相比,p38磷酸化蛋白的表达量明显上调（P<0.01）。10、20μmol/L的SB203580对喹乙醇诱导细胞凋亡有促进作用,细胞的凋亡率分别为35.4%±2.83%、40.2%±3.98%,较喹乙醇对照组（23.1%±3.59%）明显升高（P<0.05）。结论:喹乙醇能激活p38 MAPK信号通路,且p38 MAPK信号通路的激活参与抑制喹乙醇介导的HepG2细胞凋亡的过程。
二、喹乙醇诱导鲤肝细胞凋亡的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、喹乙醇诱导鲤肝细胞凋亡的研究（论文提纲范文）
（1）黄芩苷对氧化应激诱导罗非鱼肝损伤的保护作用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 氧化应激对鱼类健康的影响 |
| 1.1 氧化应激的产生 |
| 1.2 氧化应激对鱼类生理活动与功能的影响 |
| 1.3 氧化应激对鱼类行为活动的影响 |
| 1.4 氧化应激对鱼类生长的影响 |
| 2 氧化应激对肝损伤的影响 |
| 2.1 氧化应激肝损伤模型的构建 |
| 2.2 氧化应激对肝组织的影响 |
| 3 过氧化氢(H_2O_2)对动物肝损伤的影响 |
| 3.1 H_2O_2肝损伤模型的建立 |
| 3.2 过氧化氢(H_2O_2)对动物肝损伤的影响 |
| 4 黄芩苷的药理作用 |
| 4.1 中草药对水产动物肝脏的保护机制研究 |
| 4.2 黄芩苷的药理作用 |
| 4.3 黄芩苷的保肝现状研究 |
| 5 实验目的与意义 |
| 6 技术路线 |
| 第二章 氧化应激对罗非鱼肝损伤的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验设计 |
| 1.3 肝损伤参数分析 |
| 1.4 氧化应激参数分析 |
| 1.5 实时荧光定量PCR |
| 1.6 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 肝损伤参数的变化 |
| 2.2 肝脏中抗氧化指标的变化 |
| 2.3 Nrf2/Keap1信号通路相关基因的表达 |
| 2.4 炎症因子相关基因的表达 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 黄芩苷对罗非鱼抗氧化能力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验设计 |
| 1.3 生化指标检测 |
| 1.4 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 黄芩苷对罗非鱼血清中TP和Alb的影响 |
| 2.2 黄芩苷对罗非鱼血清抗氧化能力和脂质过氧化的影响 |
| 2.3 黄芩苷对罗非鱼肝组织中抗氧化能力和脂质过氧化的影响 |
| 2.4 黄芩苷对罗非鱼鳃组织中抗氧化能力和脂质过氧化的影响 |
| 2.5 黄芩苷对罗非鱼肌肉组织中抗氧化能力和脂质过氧化的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 黄芩苷对氧化应激致罗非鱼肝损伤的保护作用 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验设计与取样 |
| 1.3 血清生化测定 |
| 1.4 肝脏生化检测 |
| 1.5 基因表达测定 |
| 1.6 数据分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 黄芩苷对血清中GPT、GOT和AKP的影响 |
| 2.2 黄芩苷对血清中TP和Alb的影响 |
| 2.3 黄芩苷对血清中TNF-α和IL-1β的影响 |
| 2.4 黄芩苷对抗氧化状态的影响 |
| 2.5 黄芩苷对肝组织炎症相关基因表达的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间取得的学术成果 |
（2）喹乙醇对雄性小鼠生殖系统的损伤及VE、APS对其致毒作用的干预（论文提纲范文）
| 英文缩略表 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 喹乙醇的简介 |
| 1.1.1 喹乙醇的应用 |
| 1.1.2 喹乙醇的检测 |
| 1.2 喹乙醇的危害 |
| 1.2.1 喹乙醇的氧化毒性和生殖毒性 |
| 1.2.2 喹乙醇蓄积毒性 |
| 1.2.3 喹乙醇的遗传毒性 |
| 1.2.4 喹乙醇的生态毒性 |
| 1.2.5 喹乙醇毒性的分子机制 |
| 1.3 自由基的产生 |
| 1.4 自由基的清除 |
| 1.5 自由基的危害 |
| 1.5.1 氧化应激相关因子研究 |
| 1.5.2 氧化应激对生精功能的影响 |
| 1.6 VE的抗氧化作用 |
| 1.7 黄芪多糖的抗氧化作用 |
| 1.8 协同抗氧化作用 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究的背景与意义 |
| 2.2 研究思路 |
| 第三章 喹乙醇及VE、APS干预对小鼠生长发育和精液品质的影响 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 饲料配方 |
| 3.1.3 主要仪器和试剂 |
| 3.1.4 主要试剂的配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 试验动物模型的建立 |
| 3.2.2 小鼠睾丸、附睾和精囊腺的采集 |
| 3.2.3 小鼠精液品质的测定方法 |
| 3.2.4 数据处理 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 雄性小鼠试验期末体重的变化 |
| 3.3.2 雄性小鼠睾丸系数系数的测定结果 |
| 3.3.3 雄性小鼠精囊腺系数的测定结果 |
| 3.3.4 雄性小鼠精精液品质的测定结果 |
| 3.4 分析与讨论 |
| 3.4.1 喹乙醇及VE、APS干预对小鼠生长状况的影响 |
| 3.4.2 喹乙醇及VE、APS干预对小鼠睾丸系数和精囊腺系数的影响 |
| 3.4.3 喹乙醇及VE、APS干预对小鼠精液品质的影响 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 喹乙醇及VE、APS干预对小鼠睾丸和附睾组织形态学的影响 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 主要试剂及仪器 |
| 4.1.3 主要试剂的配制 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 试验动物模型的建立 |
| 4.2.2 睾丸组织切片的制作 |
| 4.2.3 附睾组织切片的制作同睾丸 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.4 分析与讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 喹乙醇及VE、APS干预对小鼠抗氧化功能及睾酮合成相关酶基因表达量的影响 |
| 5.1 试验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 主要仪器和设备 |
| 5.1.3 试验器具的准备 |
| 5.1.4 试剂配制 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 睾丸组织匀浆的制备 |
| 5.2.2 小鼠睾丸组织抗氧化指标的检测 |
| 5.2.3 睾丸组织内基因表达量测定方法 |
| 5.2.4 荧光定量PCR扩增 |
| 5.2.5 数据处理 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 睾丸组织抗氧化指标测定结果 |
| 5.3.2 睾丸组织抗氧化酶荧光定量PCR表达结果 |
| 5.3.3 睾丸组织睾酮合成相关基因荧光定量PCR表达结果 |
| 5.4 分析与讨论 |
| 5.4.1 喹乙醇及VE、APS干预对小鼠睾丸组织抗氧化功能的影响 |
| 5.4.2 喹乙醇及VE、APS干预对睾丸组织中睾酮合成相关酶基因表达量的影响 |
| 5.4.3 VE、APS对高剂量OLA引起的睾丸氧化损伤没有明显保护作用 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
（3）喹乙醇诱导细胞凋亡和周期阻滞的分子调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 喹乙醇 |
| 1.1.1 喹乙醇研究概况 |
| 1.1.2 喹乙醇毒性作用及机制 |
| 1.2 细胞凋亡 |
| 1.2.1 细胞凋亡的概念 |
| 1.2.2 细胞凋亡的分子机制 |
| 1.2.3 细胞凋亡调控的信号通路 |
| 1.3 细胞周期 |
| 1.3.1 细胞周期的概念 |
| 1.3.2 细胞周期调控机制 |
| 1.4 GADD45A基因 |
| 1.4.1 GADD45a基因结构与功能 |
| 1.4.2 GADD45a基因与细胞凋亡的关系 |
| 1.4.3 GADD45a基因在细胞周期调控中的作用 |
| 1.4.4 p53基因对GADD45a基因的调控作用 |
| 1.5 P21基因 |
| 1.5.1 p21基因的结构与功能 |
| 1.5.2 p21基因与细胞凋亡的关系 |
| 1.5.3 p21基因在细胞周期调控中的作用 |
| 1.5.4 p53基因对p21基因的调控作用 |
| 1.6 姜黄素 |
| 1.6.1 姜黄素研究概况 |
| 1.6.2 姜黄素对细胞凋亡的调控作用 |
| 1.7 研究目的与意义及内容 |
| 1.7.1 目的与意义 |
| 1.7.2 研究内容 |
| 第二章 喹乙醇对小鼠肝毒性的分子机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 药物 |
| 2.2.2 实验动物 |
| 2.2.3 试剂盒 |
| 2.2.4 主要试剂 |
| 2.2.5 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 试剂配制 |
| 2.3.2 动物处理 |
| 2.3.3 血清AST及ALT检测 |
| 2.3.4 肝组织病理学检测 |
| 2.3.5 氧化应激标志物检测 |
| 2.3.6 Caspase-3和-9活性测定 |
| 2.3.7 肝组织超微结构观察 |
| 2.3.8 Western blot检测蛋白表达 |
| 2.3.9 免疫组化检测 |
| 2.3.10 数据分析 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 临床观察结果 |
| 2.4.2 喹乙醇对小鼠肝功能影响 |
| 2.4.3 小鼠肝脏线粒体超微结构的变化 |
| 2.4.4 细胞凋亡、细胞周期、细胞自噬等相关信号通路蛋白表达变化 |
| 2.5 讨论 |
| 2.5.1 喹乙醇的肝损伤与氧化应激 |
| 2.5.2 喹乙醇诱导细胞凋亡的主要信号通路 |
| 2.5.3 喹乙醇诱导细胞周期阻滞的信号通路 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 GADD45A基因在喹乙醇诱导细胞凋亡和周期阻滞中的作用研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 药物 |
| 3.2.2 细胞株 |
| 3.2.3 试剂盒 |
| 3.2.4 主要试剂 |
| 3.2.5 主要仪器 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 试剂配制 |
| 3.3.2 细胞培养 |
| 3.3.3 Western blot检测蛋白表达 |
| 3.3.4 慢病毒包装干扰细胞系制作 |
| 3.3.5 Real-Time qPCR检测mRNA表达 |
| 3.3.6 细胞存活率检测 |
| 3.3.7 细胞凋亡检测 |
| 3.3.8 细胞内ROS检测 |
| 3.3.9 线粒体膜电位检测 |
| 3.3.10 DNA损伤检测 |
| 3.3.11 细胞周期检测 |
| 3.3.12 数据分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 喹乙醇对HepG2细胞GADD45a蛋白表达的影响 |
| 3.4.2 GADD45a基因对喹乙醇诱导细胞活性与细胞凋亡的影响 |
| 3.4.3 GADD45a基因对喹乙醇诱导DNA损伤的影响 |
| 3.4.4 GADD45a基因对喹乙醇诱导ROS产生的影响 |
| 3.4.5 GADD45a基因对喹乙醇诱导线粒体功能失调的影响 |
| 3.4.6 GADD45a基因对喹乙醇诱导caspase激活的影响 |
| 3.4.7 GADD45a基因对喹乙醇诱导细胞周期分布的影响 |
| 3.4.8 GADD45a基因对喹乙醇诱导MAPK通路的影响 |
| 3.4.9 JNK/p38通路在喹乙醇诱导HepG2细胞凋亡与周期阻滞中的作用 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 GADD45a基因调控喹乙醇诱导的细胞凋亡 |
| 3.5.2 GADD45a基因调控喹乙醇诱导的DNA损伤 |
| 3.5.3 GADD45a基因调控喹乙醇诱导的细胞周期阻滞 |
| 3.5.4 GADD45a与JNK/P38通路在喹乙醇诱导细胞凋亡与周期阻滞中的作用 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 P21基因在喹乙醇诱导细胞凋亡和周期阻滞中的作用研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 药物 |
| 4.2.2 细胞株 |
| 4.2.3 试剂盒 |
| 4.2.4 主要试剂 |
| 4.2.5 主要仪器 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 试剂配制 |
| 4.3.2 细胞培养 |
| 4.3.3 Western Blot检测蛋白表达 |
| 4.3.4 慢病毒包装干扰细胞系制作 |
| 4.3.5 免疫荧光检测蛋白表达 |
| 4.3.6 细胞存活率检测 |
| 4.3.7 细胞凋亡检测 |
| 4.3.8 细胞内ROS检测 |
| 4.3.9 线粒体膜电位检测 |
| 4.3.10 细胞周期检测 |
| 4.3.11 数据分析 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 喹乙醇对HepG2细胞p21、p-p21和p53蛋白的影响 |
| 4.4.2 p21稳定干扰HepG2细胞系建立的结果 |
| 4.4.3 p21基因对喹乙醇诱导的细胞成活率与凋亡率的影响 |
| 4.4.4 p21基因对喹乙醇诱导氧化应激的影响 |
| 4.4.5 p21基因对喹乙醇诱导线粒体功能失调的影响 |
| 4.4.6 p21基因对喹乙醇诱导caspase激活的影响 |
| 4.4.7 p21基因对喹乙醇诱导细胞周期的影响 |
| 4.4.8 p21基因对喹乙醇诱导AKT和Nrf2/HO-1通路的影响 |
| 4.4.9 PI3K/AKT和Nrf2/HO-1通路对喹乙醇诱导细胞周期和细胞凋亡的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.5.1 喹乙醇对p21蛋白表达的影响 |
| 4.5.2 p21基因调控喹乙醇诱导的细胞凋亡 |
| 4.5.3 p21基因调控喹乙醇诱导的细胞周期阻滞 |
| 4.5.4 p21基因调控AKT与Nrf2/HO-1信号通路 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 P53基因调控GADD45A与P21在喹乙醇诱导细胞凋亡中的作用研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 药物 |
| 5.2.2 细胞株 |
| 5.2.3 实验动物 |
| 5.2.4 试剂盒 |
| 5.2.5 主要试剂 |
| 5.2.6 主要仪器 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 试剂配制 |
| 5.3.2 细胞培养 |
| 5.3.3 细胞存活率检测 |
| 5.3.4 细胞凋亡检测 |
| 5.3.5 细胞内ROS检测 |
| 5.3.6 线粒体膜电位检测 |
| 5.3.7 Western Blot检测蛋白表达 |
| 5.3.8 动物处理 |
| 5.3.9 血清AST及ALT检测 |
| 5.3.10 肝组织病理学检测 |
| 5.3.11 氧化应激标志物检测 |
| 5.3.12 caspase-3和-9活性测定 |
| 5.3.13 免疫组化检测 |
| 5.3.14 p53小鼠基因型鉴定 |
| 5.3.15 免疫荧光检测蛋白表达 |
| 5.3.16 数据分析 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 p53基因对GADD45a与p21的调控作用 |
| 5.4.2 p53基因对喹乙醇诱导的细胞成活率和凋亡率的影响 |
| 5.4.3 p53基因对喹乙醇诱导ROS产生的影响 |
| 5.4.4 p53基因对喹乙醇诱导线粒体凋亡调控机制的影响 |
| 5.4.5 p53基因对喹乙醇诱导的MAPK通路和自噬通路的影响 |
| 5.4.6 p53基因敲除小鼠模型验证结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.5.1 在喹乙醇诱导细胞凋亡中p53与GADD45a、p21的调控机制 |
| 5.5.2 p53在喹乙醇诱导细胞凋亡的调控作用 |
| 5.6 小结 |
| 第六章 姜黄素对喹乙醇诱导细胞凋亡的影响及机制研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料 |
| 6.2.1 药物 |
| 6.2.2 细胞株 |
| 6.2.3 实验动物 |
| 6.2.4 试剂盒 |
| 6.2.5 主要试剂 |
| 6.2.6 主要仪器 |
| 6.3 方法 |
| 6.3.1 试剂配制 |
| 6.3.2 细胞培养 |
| 6.3.3 细胞存活率检测 |
| 6.3.4 细胞凋亡检测 |
| 6.3.5 细胞内ROS检测 |
| 6.3.6 线粒体膜电位检测 |
| 6.3.7 Western Blot检测蛋白表达 |
| 6.3.8 动物处理 |
| 6.3.9 血清AST及ALT检测 |
| 6.3.10 肝组织病理学检测 |
| 6.3.11 氧化应激标志物检测 |
| 6.3.12 caspase-3和-9活性测定 |
| 6.3.13 Real-Time qPCR检测mRNA表达 |
| 6.3.14 免疫荧光检测蛋白表达 |
| 6.3.15 数据分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 姜黄素对喹乙醇诱导小鼠肝损伤的影响 |
| 6.4.2 姜黄素对喹乙醇诱导HepG2细胞凋亡的影响 |
| 6.5 讨论 |
| 6.5.1 姜黄素调控喹乙醇诱导的氧化应激机制 |
| 6.5.2 姜黄素对喹乙醇诱导的细胞凋亡作用 |
| 6.5.3 姜黄素对喹乙醇诱导的p53及NF-kB通路的调控 |
| 6.6 小结 |
| 第七章 结论与研究展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 研究展望 |
| 第八章 创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（4）建鲤急性肝损伤模型的构建及几种中草药饲料添加剂对肝脏的保护作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一章 鱼肝损伤模型的构建与中草药及其提取物保肝作用的研究 |
| 1 肝损伤动物模型研究进展及应用 |
| 1.1 CCl_4肝损伤模型 |
| 1.2 氨基半乳糖肝损伤模型 |
| 1.3 刀豆蛋白肝损伤动物模型 |
| 1.4 脂多糖(LPS)损伤动物模型 |
| 1.5 酒精性肝损伤动物模型 |
| 1.6 缺血再灌注肝损伤动物模型 |
| 2 鱼肝损伤模型的构建 |
| 2.1 鱼肝细胞的分离和培养 |
| 2.2 肝(细胞)损伤模型的建立 |
| 3 中草药及其提取物对鱼类保肝作用的研究现状 |
| 3.1 鱼类肝病现状及防治 |
| 3.2 中草药及其提取物保肝作用的研究 |
| 3.3 中草药及其提取物保肝机理的研究 |
| 参考文献 |
| 第二章 CCl_4诱导的建鲤急性肝损伤模型的构建 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 基于CCl_4诱导的建鲤肝细胞损伤模型对25味中草药(提取物)的初筛 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 甘草次酸的保肝作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 姜黄素的保肝作用研究 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 香菇多糖对鲤鱼离体培养免疫细胞的活性调节作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 姜黄素、甘草次酸和香菇多糖联合对CCl_4诱导的建鲤肝损伤的保护作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文、申请专利及专着 |
（5）黄芪多糖和当归多糖对鲫鱼细胞凋亡的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 细胞凋亡概念的提出及研究进展 |
| 1.2 细胞凋亡的研究价值 |
| 1.3 细胞凋亡与其他细胞程序性死亡及坏死的关系 |
| 1.4 细胞凋亡的常见通路形式 |
| 1.5 细胞凋亡常见诱发因素 |
| 1.6 细胞凋亡常见的研究方法 |
| 1.7 细胞凋亡在水产养殖方面的研究 |
| 1.8 研究预测与展望 |
| 第2章 引言 |
| 2.1 研究背景 |
| 2.2 研究目的与意义 |
| 2.3 研究内容与方法 |
| 第3章 黄芪多糖和当归多糖对维氏气单胞菌诱导鲫细胞凋亡的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论与分析 |
| 第4章 黄芪多糖和当归多糖对维氏气单胞菌诱导鲫细胞凋亡通路的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论与分析 |
| 第5章 黄芪多糖和当归多糖对鲫凋亡基因BAX和Bcl-2 表达的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论与分析 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 硕士期间发表论文情况 |
（6）喹乙醇诱导HEK-293细胞DNA链断裂损伤产生氧化应激及溶酶体线粒体相关机制探讨（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 1.主要药品与试剂 |
| 2.主要仪器 |
| 3.试验方法 |
| 4.统计方法 |
| 结果 |
| 1.MTT细胞活性试验 |
| 2.喹乙醇诱发HEK-293细胞DNA链断裂损伤 |
| 3.喹乙醇对HEK-293细胞溶酶体膜稳定性的影响 |
| 4.喹乙醇对HEK-293细胞中ROS水平的影响 |
| 5.喹乙醇对HEK-293细胞内GSH水平的影响 |
| 6.喹乙醇对HEK-293细胞内线粒体膜电位的影响 |
| 7.喹乙醇对HEK-293细胞p53蛋白表达的影响 |
| 8.RT-PCR检测喹乙醇诱导的HEK-293细胞p53、ATM基因表达情况 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（7）Cathepsin B在喹乙醇致肝损伤中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第1章 Cathepsin B 在喹乙醇致肝损伤中的作用研究 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 主要仪器和试剂 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.1.3 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 OLA 染毒对大鼠肝脏损伤的影响 |
| 1.2.2 OLA 对 HepG-2 细胞凋亡的影响 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 OLA 染毒对大鼠肝脏功能的影响 |
| 1.3.2 OLA 染毒对大鼠肝脏炎症反应的影响 |
| 1.3.3 OLA 染毒对大鼠肝脏氧化损伤的影响 |
| 1.3.4 OLA 染毒导致大鼠肝细胞凋亡 |
| 1.3.5 OLA 染毒对大鼠肝组织 Cathepsin B 蛋白表达的影响 |
| 1.3.6 OLA 对 HepG-2 细胞增殖的影响 |
| 1.3.7 CBI 对 OLA 诱导的 HepG-2 细胞凋亡和细胞内 ROS 含量的影响 |
| 1.3.8 Cathepsin B 在 OLA 诱导的凋亡中的作用 |
| 1.4 结论 |
| 参考文献 |
| 第2章 综述 喹乙醇的肝毒性研究进展 |
| 2.1 喹乙醇的理化性质及其肝毒性 |
| 2.1.1 喹乙醇的理化性质 |
| 2.1.2 喹乙醇肝脏代谢 |
| 2.1.3 喹乙醇肝毒性 |
| 2.2 喹乙醇肝损伤机制 |
| 2.2.1 喹乙醇致肝氧化损伤机制 |
| 2.2.2 喹乙醇诱导肝细胞凋亡机制研究 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 学位论文数据集 |
（8）镉和五氯酚对原代培养鲫鱼肝细胞毒性及联合作用效应研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1 绪论 |
| 1.1 PBT污染及特性概述 |
| 1.2 Cd和PCP的污染及毒性效应研究进展 |
| 1.2.1 Cd的性质及污染概况 |
| 1.2.2 Cd的毒性效应研究进展 |
| 1.2.3 Cd的致毒机理研究进展 |
| 1.2.4 PCP的性质及污染概况 |
| 1.2.5 PCP的毒性效应研究进展 |
| 1.2.6 PCP的致毒机理研究进展 |
| 1.3 复合污染及联合毒性效应研究进展 |
| 1.3.1 复合污染概述 |
| 1.3.2 联合效应研究进展 |
| 1.3.3 联合效应毒性机理研究进展 |
| 1.3.4 联合效应评价方法 |
| 1.4 原代培养细胞在PBT研究中的毒性研究进展 |
| 1.4.1 原代细胞培养的研究进展 |
| 1.4.2 鱼类原代细胞培养在水体污染中的应用研究进展 |
| 1.5 本论文研究设计思路及技术路线 |
| 2 Cd和PCP对原代培养鲫鱼肝细胞毒性效应实验体系的建立 |
| 2.1 实验部分 |
| 2.1.1 实验仪器和设备 |
| 2.1.2 实验药品和试剂 |
| 2.1.3 实验动物 |
| 2.1.4 鲫鱼肝细胞提取 |
| 2.1.5 鲫鱼肝细胞培养及染毒处理 |
| 2.1.6 鲫鱼肝细胞形态学观察 |
| 2.1.7 肝细胞活力测定 |
| 2.1.8 统计学方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 鲫鱼原代肝细胞的提取培养 |
| 2.2.2 鲫鱼肝细胞的培养鉴定 |
| 2.2.3 Cd和PCP单独及联合作用下鲫鱼肝细胞形态学上的变化 |
| 2.2.4 Cd和PCP单独及联合作用对原代培养鲫鱼肝细胞活力的影响 |
| 2.2.5 讨论 |
| 2.3 本章小结 |
| 3 Cd和PCP对原代培养鲫鱼肝细胞毒性效应的微量热研究 |
| 3.1 实验部分 |
| 3.1.1 实验仪器和设备 |
| 3.1.2 实验药品和试剂 |
| 3.1.3 实验动物 |
| 3.1.4 鲫鱼肝细胞提取 |
| 3.1.5 微量热的测定 |
| 3.1.6 统计学处理 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 原代培养鲫鱼肝细胞的产热曲线 |
| 3.2.2 Cd和PCP单独作用下原代培养鲫鱼肝细胞的产热曲线 |
| 3.2.3 Cd和PCP联合作用下原代培养鲫鱼肝细胞的产热曲线 |
| 3.2.4 Cd和PCP单独作用下原代培养鲫鱼肝细胞的生长速率常数及抑制率 |
| 3.2.5 Cd和PCP联合作用对原代培养鲫鱼肝细胞生长代谢热的影响 |
| 3.2.6 讨论 |
| 3.3 本章小结 |
| 4 Cd和PCP对原代培养鲫鱼肝细胞抗氧化系统的毒性及联合效应 |
| 4.1 实验部分 |
| 4.1.1 实验仪器和设备 |
| 4.1.2 实验药品和试剂 |
| 4.1.3 实验处理 |
| 4.1.4 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 Cd和PCP单独对原代培养鲫肝细胞的氧化损伤 |
| 4.2.2 Cd和PCP联合作用对原代培养鲫鱼肝细胞的氧化损伤 |
| 4.2.3 讨论 |
| 4.3 本章小结 |
| 5 Cd和PCP对肝细胞ATPase活性和[Ca~(2+)]_I的毒性及联合效应 |
| 5.1 实验部分 |
| 5.1.1 实验仪器和设备 |
| 5.1.2 实验药品和试剂 |
| 5.1.3 实验处理 |
| 5.1.4 实验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 Cd和PCP单独及联合作用下鲫鱼肝细胞ATPase的变化 |
| 5.2.2 Cd和PCP单独及联合作用下鲫鱼肝细胞[Ca~(2+)]_i的影响 |
| 5.2.3 讨论 |
| 5.3 本章小结 |
| 6 Cd和PCP单独及联合作用诱导原代培养鲫鱼肝细胞凋亡的研究 |
| 6.1 实验部分 |
| 6.1.1 实验仪器和设备 |
| 6.1.2 实验药品和试剂 |
| 6.1.3 实验处理 |
| 6.1.4 实验方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 Cd和PCP单独及联合作用对原代培养鲫鱼肝细胞ROS的影响 |
| 6.2.2 Cd和PCP单独及联合作用对原代培养鲫鱼肝细胞△Ψ_m的影响 |
| 6.2.3 Cd和PCP单独及联合作用对鲫鱼肝细胞凋亡率的影响 |
| 6.2.4 细胞DNA ladder |
| 6.2.5 讨论 |
| 6.3 本章小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（9）内质网应激在喹乙醇致HK-2细胞凋亡中的作用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一部分 OLA染毒浓度和时间对HK-2细胞凋亡的影响 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 内质网应激及凋亡在OLA诱导HK-2细胞凋亡中的作用研究 |
| 第一节 内质网应激及凋亡相关蛋在OLA诱导HK-2细胞凋亡中的表达变化 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二节 内质网应激及其凋亡相关蛋白在OLA致HK-2细胞凋亡中的转录水平变化 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 ROS在OLA致HK-2细胞凋亡中的作用 |
| 引言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、喹乙醇诱导鲤肝细胞凋亡的研究（论文参考文献）
- [1]黄芩苷对氧化应激诱导罗非鱼肝损伤的保护作用[D]. 李尧. 南京农业大学, 2019(08)
- [2]喹乙醇对雄性小鼠生殖系统的损伤及VE、APS对其致毒作用的干预[D]. 张莎莎. 西南大学, 2018(01)
- [3]喹乙醇诱导细胞凋亡和周期阻滞的分子调控机制研究[D]. 李道稳. 中国农业大学, 2018(12)
- [4]建鲤急性肝损伤模型的构建及几种中草药饲料添加剂对肝脏的保护作用[D]. 曹丽萍. 扬州大学, 2018(05)
- [5]黄芪多糖和当归多糖对鲫鱼细胞凋亡的影响[D]. 任胜杰. 西南大学, 2017(02)
- [6]喹乙醇诱导HEK-293细胞DNA链断裂损伤产生氧化应激及溶酶体线粒体相关机制探讨[D]. 杨洋. 大连医科大学, 2014(01)
- [7]Cathepsin B在喹乙醇致肝损伤中的作用研究[D]. 金丽丽. 河北联合大学, 2014(04)
- [8]镉和五氯酚对原代培养鲫鱼肝细胞毒性及联合作用效应研究[D]. 董玉良. 武汉大学, 2013(01)
- [9]内质网应激在喹乙醇致HK-2细胞凋亡中的作用研究[D]. 于常艳. 中国疾病预防控制中心, 2013(04)
- [10]p38 MAPK在喹乙醇诱导HepG2细胞凋亡中的作用[J]. 赵文霞,张朝明,汤树生,张婷,孙雨,靳溪,肖希龙. 癌变·畸变·突变, 2012(01)