一、Tumor suppressor gene PTEN affects anoikis via both PKB and FAK in human lung carcinoma cell lines（论文文献综述）
陈凯[1]（2021）在《miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究》文中研究表明一、研究背景肝细胞性肝癌（HCC）是世界范围内最常见恶性肿瘤之一,目前在最致命肿瘤中致死率排名第二。在过去的几十年,针对肝癌已经有了众多治疗手段,如精准的肝段切除术,肝移植术,肝动脉栓塞化疗及肝癌射频消融术等,但是肝癌患者的预后仍然不令人满意,据统计,肝癌患者5年总生存率低于20%。肝癌起病隐匿,肿瘤进展快,容易复发和肝内转移都是导致肝癌预后较差的可能原因。因此,探究肝癌进展,转移的分子学机制有利于寻找潜在的肝癌治疗分子靶点,开发可能的早期肝癌诊断标志物对肝癌的系统治疗非常重要。微小RNA（miRNA）是以由一类进化保守的,由约22个核苷酸组成的非编码小RNA,微小RNA可结合在靶基因信使RNA（m RNA）的3?端的非翻译区（UTR区）通过降解信使RNA或抑制信使RNA翻译的方式发挥转录后调控作用。研究显示微小RNA几乎参与了肿瘤细胞发生发展的全部过程,包括细胞的干性,肿瘤发生,细胞的增殖,细胞的凋亡,细胞的迁移和侵袭,细胞的转移等等。也有越来越多的研究显示各种肿瘤中均有不同微小RNA的异常表达,包括肝癌。例如,miR-876被发现在胆管癌（CCA）中表达降低,并能通过抑制BCL-XL的表达诱导细胞的增殖;miR-589被发现在肝细胞性肝癌中表达增高并能通过STAT3信号通路来促进细胞的干性和化疗抵抗。然而,在肝细胞性肝癌中异常表达和对诊断或者预后有指示作用的miRNA仍然缺乏有待进一步研究。骨膜蛋白（POSTN）,也称为成骨细胞特异性因子2,是一大小为93.3k Da的细胞外基质（ECM）蛋白。POSTN能通过和众多其他蛋白如纤维结合蛋白,胶原蛋白及腱生蛋白等互相联系进而对细胞外基质进行改造。POSTN对胶原纤维的发生,细胞粘附,细胞迁移和上皮间质转换等都有重要作用。目前研究发现多种肿瘤中亦有POSTN的异常表达,包括头颈部肿瘤,肺癌,神经纤维瘤,乳腺癌,结直肠肿瘤及肝细胞性肝癌等,对肿瘤细胞的生存,上皮间质转换,血管生成和肿瘤微环境的形成都有重要作用。例如:研究发现胰腺癌细胞能刺激间质细胞分泌POSTN,进而促进肿瘤基质成绩和上皮间质转化进而促进肿瘤进展。然后,在肝细胞性肝癌中POSTN的表达及调控机制的研究尚少,有待进一步研究。在本文中,我们通过对TCGA数据库中异常表达的miRNA进行筛选,鉴定出了一异常表达的miRNA,即miR-876。我们还进一步探求了其细胞功能和对下游靶基因的调节机制。我们还在众多临床肝细胞性肝癌的临床组织标本中监测了miR-876和其靶基因POSTN的表达,分析了他们的表达和肝细胞性肝癌患者的临床病理参数和预后的关系。我们的研究提示miR-876及POSTN在肝细胞性肝癌中异常表达,可能作为一潜在的诊断性分子标志物和治疗靶点。二、研究方法1.分析49对肝癌及对应的癌旁样本的TCGA数据库,分析异常表达的miRNA,筛选出表达差异倍数最高的前20个微小RNA。2.收集了从2006年到2010年在西南医院肝胆科因患原发性肝细胞性肝癌而行原发性肝癌切除术的共计127例患者的组织样本,本研究说包含的所有病人术前均未接收放疗或者化疗。所有患者术后均定期性影像学（即超声或CT）即血液AFP检测。本研究团队及西南医院临床研究中心完成患者的预后随访,随访为结合到我院复查情况,定期（每2-3月）电话随访。3.采用实时定量PCR的方法检测了肝癌组织样本中miR-876和POSTN的表达水平;采用免疫组化（IHC）方法在原发性肝细胞性肝癌组织样本中检测了样本中POSTN及EMT标志物（E钙粘蛋白,N钙粘蛋白,波形蛋白）的表达情况,并在肝癌合并肝硬化样本中检测了POSTN的表达。4.采用Kaplan-Meier曲线分析（单因素）和Cox回归（多因素）方法分析了影响HCC患者预后的危险因素及独立危险因素,并进一步分析了miR-876和POSTN共表达对HCC预后的影响。5.采用了生物信息学及双荧光素酶报告基因实验研究了miR-876可能的调控靶基因,并进一步采用实时定量PCR及Western Blotting（WB）方法进行验证。6.Mi R-876的具体体内生物学行为在裸鼠实验中进行检测,最终成瘤效果以活体成像方式进行检测验证。7.采用WB方法分析了miR-876的表达对EMT标志物的影响,并在人肝星状细胞系LX-2中检测了纤维化蛋白α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,胶原蛋白-I的表达。采用transwell小室侵袭实验研究了miR-876对肝癌细胞系的侵袭能力的影响。三、研究结果1.通过对49对肝癌患者的TCGA数据库进行分析,我们筛选出了表达差异倍数排名前20的高表达及低表达miRNA,进一步筛选鉴定出miR-876。2.我们发现miR-876在肝癌细胞系及肝癌组织中低表达。首先,我们发现miR-876在人正常肝细胞系L02中表达高,而在肝癌细胞系SMMC-7721,Hep G2,Huh-7及HCC-LM3中表达较低;接下来我们在50对肝癌及癌旁样本中检测了miR-876的表达,发现miR-876在肝癌组织/癌旁组织的比率62%有降低,16%变化不明显,而仅有22%表达升高。3.miR-876的低表达和肝硬化、癌栓及肝癌TNM分期相关。我们在127例HCC组织样本中检测了miR-876的表达,分析了其表达水平和HCC患者临床病理参数的相关性。发现miR-876的表达和肝硬化（P=0.026）、肝癌癌栓形成（P=0.031）及TNM分期（P=0.021）相关。而和其他病理参数,如患者性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤数量、乙肝、AFP水平、肝Child分级未发现显着相关性。我们还进一步在肝硬化及癌栓患者中检测了miR-876的表达水平,发现miR-876在肝硬化组织样本中表达较非肝硬化患者显着低（P=0.0294）,而其在有肝癌癌栓患者中表达亦显着低（P=0.0367）。4.miR-876抑制细胞侵袭、EMT及细胞纤维化。我们通过构建了miR-876过表达及干扰细胞株,通过transwell细胞侵袭实验发现过表达miR-876的肝癌细胞侵袭力减弱,而干扰miR-876后侵袭力增强,进一步通过WB实验发现过表达miR-876后N-钙粘蛋白及波形蛋白表达减弱,而干扰miR-876后E-钙粘蛋白表达亦减弱。在人星状细胞系LX-2中干扰miR-876表达后发现α-SMA及胶原蛋白-I表达减弱。5.miR-876靶向POSTN,并抑制其表达。我们通过生物信息学分析发现POSTN的3?UTR存在2个能与miR-876种子区结合的序列,进一步双荧光素酶报告基因实验发现野生型p GL3 POSTN荧光素酶质粒和miR-876共转染入293细胞后其萤火虫荧光信号/海肾荧光素酶荧光信号比值显着性降低,进一步WB实验证实当干扰miR-876后HCC细胞POSTN表达升高,而过表达组POSTN显着降低。我们进一步在127例肝癌临床组织标本中同时检测了miR-876和POSTN的表达,发现两者表达呈显着负相关,R值为-0.477,相关线性方程为y=-0.486x+0.394。6.miR-876通过POSTN抑制EMT及细胞纤维化。首先,我们发现过表达POSTN的肝癌细胞侵袭力增强,并促进了EMT标志物及纤维化标志物的表达。其次,我们在过表达POSTN的基础上转染了miR-876,发现共转染miR-876后抵消了侵袭力增加及EMT及纤维化标志物蛋白的表达。7.miR-876在体内动物实验下减弱HCC细胞肿瘤成瘤能力及抑制肿瘤进展。HCC细胞其miR-876过表达的HCC细胞被注入裸鼠肝包膜下,进行动物实验,1月后行活体成像检测,我们发现对照组（无干预的HCC细胞）成瘤数量多,活体成像荧光强度强,而实验组行miR-876过表达后,裸鼠原位肝脏成瘤明显减少,活体检测荧光信号弱,表明在体内实验条件下,miR-876能抑制HCC的成瘤及肿瘤进展。8.POSTN和肝组织EMT及肝硬化相关。我们进一步在127例肝癌组织中检测了POSTN的表达,发现同miR-876类似,POSTN表达和肿瘤数量、肝硬化、肝癌癌栓形成及TNM分期相关,而和其他临床标识物未发现明显相关性,进一步非参数检验验证了肝硬化或肿瘤癌栓组HCC患者的POSTN表达明显增高。IHC实验发现POSTN主要表达与肝癌间质,部分肝癌细胞亦有表达,POSTN高表达的样本N钙粘蛋白及波形蛋白表达增高,而E钙粘蛋白表达降低。而在肝癌伴肝硬化标本中发现POSTN亦有强表达。9.miR-876和POSTN和肝癌患者术后预后相关。进一步KM单因素生存分析发现肿瘤大小（P=0.037）、肝硬化（P=0.041）、肝癌癌栓状态（P=<0.01）、TNM分期（P=0.001）、miR-876低表达（P=0.022）及POSTN高表达（P=0.012）均是影响HCC患者预后的危险因素,多因素回归分析发现肝癌癌栓（风险比=2.530,95%CI区间=1.433-4.468,P=0.001）及POSTN的表达（风险比=1.717,95%CI区间=1.008-2.926,P=0.047）是影响肝癌预后的独立危险因素。进一步共表达分析提示miR-876低表达和POSTN高表达的HCC患者预后较之于miR-876低表达和POSTN高表达更差。四、研究结论综上所述,我们从公开的TCGA数据库中鉴定出了肝癌中一显着性低表达的miRNA,即miR-876。并探索了其对细胞的功能,即能抑制细胞侵袭,EMT和纤维化。而miR-876这些功能是通过调控POSTN的表达实现的。miR-876在体内动物实验下能抑制肝癌的成瘤及进展;我们还在众多肝癌临床标本中从m RNA及蛋白水平证明了miR-876和POSTN的异常表达和肝癌的EMT水平,纤维化水平及进展相关,而miR-876和POSTN的异常表达和HCC的预后相关,而联合miR-876和POSTN检测可能更好预测HCC的预后以及作为潜在的治疗靶点。
陶鹏先[2]（2021）在《PAI-1通过PTEN/PI3K/AKT信号通路引起肝癌失巢凋亡抵抗的相关研究》文中研究说明肝癌是世界排名第5的高致死性恶性肿瘤,因高侵袭性、高复发性而着称,其中肝细胞肝癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）占约90%以上。而作为与肿瘤浸润、转移密切相关的失巢凋亡（anoikis resistance,AR）抵抗在肝癌中的研究一直处于边缘领域。作为HCC发生发展中的重要凝血相关纤溶因子PAI-1既往证实与HCC的浸润转移密切相关,但其临床预后意义及与基础研究往往相左。是否PAI-1因子在HCC中发挥其浸润转移重要调控作用是通过引起肿瘤细胞AR表型引起,既往并无相关报道。目的 探索PAI-1在肝癌中的生物学意义及其是否调控肝癌细胞失巢凋亡抵抗表型和具体调控机制。方法 1、使用免疫组化（IHC）分析PAI-1在肝癌组织中表达情况,并结合临床基线资料统计其与肝癌患者临床预后（总体生存率,OS）结局;2、使用Western-blot,RT-PCR技术验证PAI-1在HCC细胞中的相对mRNA及蛋白表达水平;验证PAI-1调控HCC细胞中的凋亡蛋白表达水平（cleaved caspase-3）,EMT蛋白表达水平（E-cahdarin,N-cahdarin,Vimentin）;以及验证PAI-1调控HCC细胞AR的信号通路蛋白表达（PTEN,PI3K,p-85α,AKT及p-AKT）;3、使用慢病毒载体工具构建PAI-1 RNAi及Ovexpression HCC稳转细胞株进一步验证PAI-1调控HCC细胞mRNA及蛋白表达水平;4、使用流式Annexin V-FITC/PI法检测HCC细胞的anoikis表型以及PAI-1调控HCC anoikis表型;5、使用细胞划痕愈合实验、Transwell实验以及CCK-8实验验证PAI-1调控HCC细胞的增殖、浸润、转移表型;6、使用生物信息学技术分析在HCC中PAI-1调控PTEN/PI3K/AKT信号通路的下游蛋白分子及临床意义;7、通过构建体内HCC肝内转移模型,验证PAI-1在体内调控HCC浸润转移表型及相关调控机制。结果 1、通过本课题组分析统计174例肝癌患者临床资料及IHC结果,发现PAI-1表达与HCC患者生存预后呈正相关,PAI-表达越低,肝癌患者预后越差（Log-rank,p=0.027）;测量肝癌患者IHC切片Mean-IOD值,验证癌旁vs癌组织（p<0.000）,并且随着临床分期的升级,PAI-1表达呈明显下降趋势;使用COX单因素回归分析PAI-1表达（HR=1.662,95%CL=1.380-2.546,p=0.000）,多因素COX回归分析PAI-1表达（HR=2.303,95%CL=1.852-2.654,p=0.000）,提示相较其他因素,PAI-1可以作为独立的预后因子,低表达是高表达预测风险的1.662倍/2.303倍。2、PAI-1基因在蛋白及mRNA表达水平上基本一致（VS L02）在PLC/PRF/5、SMMC 7721以及MHCC-97H表达均为低表达;慢病毒构建稳转株:PAI-1高表达细胞组（Hep G2、Huh 7）共设三个敲减靶点,敲减效率最低达到80%以上（Hep G2 sh-PAI-1#53.3%,sh-PAI-2#84%,sh-PAI-3#23%;Huh sh-PAI-1#71%,sh-PAI-2#83.3%,sh-PAI-3#66.1%）,低表达组（SMMC 7721以及MHCC-97H）过表达效率达到70%以上（MHCC-97H 84%,SMMC 7721 76.2%）。高表达细胞系悬浮48h后PAI-1表达明显下降,而低表达组sus 48h却呈明显上升趋势（p<0.001,VS贴壁48h组）,对高表达细胞系敲减PAI-1基因后,细胞悬浮48h PAI-1表达明显下降（p<0.001,VS sh-NC sus 48h,悬浮sus（suspension））。而对低表达组过表达PAI-1基因后,细胞悬浮48h PAI-1表达明显上升（p<0.001,VS OV-NC sus 48h）;验证cleaved-caspase 3表达,在高表达细胞系中,敲减PAI-1细胞系sus 48h凋亡率明显下降（VS sus 48h sh-NC,p<0.001）,而在低表达细胞系中缺恰恰相反（VS sus 48h OV-NC,p<0.001）;探索EMT表型蛋白（N-cadherin,E-cadherin,Vimentin）表型蛋白变化,细胞悬浮48h后EMT,发现PAI-1表达越高,悬浮细胞浸润及转移能力越差,反之越强（VS sh-NC sus 48h/OV-NC sus48h,p<0.001）;分别对PTEN,PI3K,PI3K磷酸化蛋白p85α,AKT,AKT磷酸化蛋白p-akt表达水平分析,sh组细胞悬浮48h后,PTEN表达明显降低（VS sh-NC sus 48h,p<0.001,***）,而p85α和p-akt表达升高（VS sh-NC sus 48h,p<0.001,***）。相较sh-NC组,sh组细胞贴壁48h后,PTEN表达明显降低,p85α和p-akt表达升高,但相较悬浮组,细胞悬浮后信号通路下游蛋白激活更为明显;与之相反,相较OV-NC组,OV组细胞悬浮48h后,PTEN表达增高,p85α和p-akt表达降低（VS OV-NC sus 48h,p<0.001,***）,而贴壁48h PTEN表达虽然也有增高,p85α和p-akt表达降低趋势,变化趋势并不太明显（VS OV-NC sus 48h,p>0.05）,未磷酸化蛋白PI3K,AKT相较NC组却未发生明显改变。3、使用流式Annexin V-FITC/PI凋亡检测高表达细胞经过PAI-1基因敲除后,sus 48h凋亡率明显下降（sus 48h sh-NC-Hep G2 43.32%±4.23%VS sus 48h shPAI-1-Hep G2 15.38±1.68%、sus 48h sh-NC-Huh 7 53.7%±7.23%VS sus 48h sh-PAI-1-Huh 7 15.35.7%±3.33%,p<0.001）,而对于低表达细胞系,则恰恰相反（sus48h OV-NC-SMMC 7721 21.41%±3.36%VS sus 48h OV-PAI-1-SMMC 772144.41±4.35%、sus 48h OV-NC-MHCC-97H 17.21%±3.63%VS sus 48h OV-PAI-1-MHCC-97H 32.16%±3.88%,p<0.001）。4、划痕实验可见PAI-1高表达细胞,当PAI-1基因敲除后,相较sh-NC组,Hep G2划痕相对面积愈合速度明显加快（0.86 cm2±0.21 cm2 VS 0.14 cm2±0.06cm2,p<0.001）,Huh 7趋势同前（0.98 cm2±0.16 cm2 VS 0.57 cm2±0.21 cm2,p<0.001）;而对于PAI-1低表达细胞,相较OV-NC组,趋势则恰恰相反,MHCC-97H划痕相对面积愈合速度明显降低（0.12 cm2±0.02 cm2 VS 0.38 cm2±0.11 cm2,p<0.001）,SMMC 7721趋势同前（0.29 cm2±0.17 cm2 VS 0.74 cm2±0.18 cm2,p<0.001）。Transwell实验可见,PAI-1高表达细胞,当PAI-1基因敲除后,相较sh-NC组,Hep G2浸润及转移能力明显增强（invasion:32±4 VS 8±3,p<0.001;migration:22±2 VS 6±3,p<0.001）,Huh 7趋势同前（invasion:298±14 VS 78±13,p<0.001;migration:324±22 VS 85±16,p<0.001）;PAI-1低表达细胞,当过表达PAI-1基因后,相较OV-NC组,趋势则恰恰相反,MHCC-97H浸润及转移能力明显降低（invasion:23±5 VS 107±21,p<0.001;migration:21±4 VS 94±15,p<0.001）,SMMC 7721趋势同前（invasion:112±22 VS 198±13,p<0.001;migration:124±18VS 237±26,p<0.001）。使用cck-8检测HCC增殖率,细胞增殖表型基本相同NC组（OV-MHCC 97H VS OV-NC组,p=0.017;OV-SMMC 7721 VS OV-NC组,p=0.024）。5、根据各种在线生物信息学预测网站,我们预测AKT1作为PTEN及PAI-1主要调控蛋白,可能参与PAI-1激活/失活PTEN,调控PI3K/AKT信号通路。6、为构建PAI-1调控体内肝癌细胞转移瘤模型,我们对OV-NC及OV-PAI-1 MHCC-97H荷瘤NOD/SCID小鼠肝脏标本进行HE染色并对两组肝癌转移灶拍照比对。相较OV-PAI-1组,OV-NC组小鼠肝脏肝癌细胞转移灶明显增多,并且质地明显较硬。使用小动物成像技术显影小鼠CDX成瘤强度及分析其肿瘤平均ROIs值。可见OV-NC组显影强度明显高于OV-PAI-1组,相较OV-NC组,OV-PAI-1组ROIs显着降低（3648±457 VS 9874±688,p<0.001）。为验证体内PAI-1调控HCC预后,绘制Kaplan-Meier生存曲线,相较OV-NC组,OV-PAI-1组小鼠生存周期明显延长（VS OV-NC,p=0.0037）。使用western-blot验证OVNC及OV-PAI-1两组小鼠荷瘤组织蛋白中PAI-1,PTEN,PI3K,p-85α,AKT及p-AKT蛋白表达水平。相较OV-NC组,OV-PAI-1组PAI-1表达明显升高,PTEN蛋白表达升高,而p-85α及p-AKT蛋白表达降低（p<0.001）,而PI3K及AKT表达水平无明显变化。结论 本课题组通过临床、体内、体外三个层面对PAI-1在肝癌中调控作用做了系统的分析、验证,证实:1、PAI-1在HCC中普遍低表达,与患者预后呈正相关;2、PAI-1参与HCC的浸润、转移、增殖表型,从而与HCC的AR表型密切相关;3、PAI-1通过调控PTEN/PI3K/AKT信号通路介导了肝癌细胞AR表型发生,从而促进肝癌的浸润转移能力。
孙天宇[3]（2020）在《PC4通过FOXO1和FOXO3a降低肺腺癌对顺铂药物敏感性的机制研究》文中指出目的1.探索转录辅助因子4（positive cofactor 4,PC4）在调控肺腺癌的生物学功能中的作用;2.阐释PC4对FOXO1和FOXO3a的调控作用以及PC4通过FOXO1和FOXO3a调控肺腺癌对顺铂药物敏感性的机制;3.探究叉头框转录因子O1（forkhead O transcription factor 1,FOXO1）和叉头框转录因子O3a（forkhead O transcription factor3a,FOXO3a）在介导肺腺癌对顺铂的药物敏感性中的作用及机制,以及它们介导PI3K/Akt通路抑制剂LY294002协同增强顺铂细胞毒作用的机制。方法以肺腺癌A549、PC-9、H1299细胞为研究对象,采用慢病毒感染构建PC4、FOXO1、FOXO3a干扰或过表达的稳定细胞株,流式细胞技术检测细胞凋亡和细胞周期,CCK-8检测细胞增殖,Transwell检测细胞侵袭,Western Blot检测相关蛋白表达,通过裸鼠皮下植瘤构建动物模型。结果在本研究中,我们发现干扰PC4表达后,PC-9细胞侵袭与自噬均减弱,经顺铂处理后细胞凋亡多于对照组,存活率低于对照组;过表达PC4后,H1299细胞侵袭能力与自噬均增强,经顺铂处理后细胞凋亡少于对照组,存活率高于对照组。动物实验发现过表达PC4后肿瘤对顺铂敏感性降低。此外,干扰PC4增加了肺癌细胞内FOXO1和FOXO3a蛋白表达,也增加了FOXO1和FOXO3a蛋白在细胞核内的分布;过表达PC4抑制了FOXO1和FOXO3a蛋白水平,也减少了细胞核内FOXO1和FOXO3a含量。FOXO蛋白抑制剂AS1842856削减了PC4干扰诱导的细胞对顺铂药物敏感性增加。PI3K/Akt通路抑制剂LY29402、蛋白酶体抑制剂硼替佐米、CBP/p300抑制剂A-485未能逆转PC4对FOXO1和FOXO3a的调控作用。免疫共沉淀结果显示PC4与FOXO3a蛋白质间有相互作用。另一方面,顺铂在早期增加了肺腺癌细胞中FOXO1和FOXO3a的表达和细胞核内含量。干扰FOXO1和FOXO3a表达在体外和体内均显着降低了细胞对顺铂的敏感性。FOXO1和FOXO3a调控顺铂诱导的细胞凋亡的机制不依赖于其下游促凋亡蛋白Bim。此外,LY294002通过增加FOXO1和FOXO3a的表达和细胞核内的分布,协同增加了顺铂的细胞毒性作用。干扰FOXO1和FOXO3a表达明显减弱了LY294002对顺铂细胞毒性作用的协同增强作用。结论1.PC4能增强肺腺癌细胞侵袭能力,促进自噬,并降低肺腺癌细胞对顺铂的药物敏感性。2.PC4通过抑制FOXO1和FOXO3a降低了肺腺癌对顺铂的药物敏感性,且PC4对FOXO1和FOXO3a蛋白的抑制作用不依赖于PI3K/Akt通路、蛋白酶体降解、CBP/p300乙酰化修饰。3.FOXO1和FOXO3a增加了肺腺癌对顺铂的敏感性,并介导了LY294002对顺铂的协同增强作用。
谷旭宇[4]（2020）在《长链非编码RNA LINC01207调控胃癌肝转移作用及机制研究》文中提出目的:胃癌是我国常见恶性肿瘤之一,其高发病率和高死亡率严重威胁人类的健康。根据2018年的最新癌症统计数据表明,胃癌（GC）在我国的发病率及死亡率均处于第二位。研究资料显示,肝转移是胃癌治疗失败的主要原因之一。出现肝转移后,患者的生存期很短,未治病例的生存仅为3月5月,从而给临床诊治带来较大的难度。因此,从分子水平早期发现癌细胞肝转移,并探讨其分子机制,将可能为胃癌肝转移预警预测、干预阻断提供新的分子标志或靶点,从而提高胃癌的综合诊疗水平。研究提示,自噬作为肿瘤发生发展中重要的影响因素,能够增强肿瘤的抗失巢凋亡能力,自噬受到相关分子的调控。研究发现,抗失巢凋亡是肿瘤细胞获得侵袭、转移能力的首要因素。课题组前期利用Human LncRNA Microarray建立胃癌肝转移相关LncRNAs表达谱,发现胃癌患者体内LncRNA LINC01207呈现高表达状态,但相关机制的研究并未获得突破性进展。方法:1.选择胃癌同时性和异时性肝转移胃癌患者各3例,采用高通量lncRNA芯片检测组织中癌及其配对的癌旁组织中lncRNAs的表达情况。从中选择高表达的lncRNA LINC01207进行研究。2.候选分子LINC01207临床意义研究:对150对胃癌及其癌旁配对正常组织进行检测,运用荧光实时定量PCR法,检测LINC01207、自噬相关分子LC3B、ATG7基因mRNA水平,分析LINC01207与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径、Lauren分型、组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移、肝转移数目、肝转移发生时间、TNM分期、幽门螺杆菌（HP）感染、CEA水平及自噬相关分子LC3B、ATG7基因相关性。3.LINC01207细胞水平研究:（1）检测正常胃细胞株GFS-1及常见胃癌细胞株,运用定量PCR法,确定LINC01207表达情况,选择AGS及BGC7901用于后续研究。（2）构建LINC01207小干扰RNA及过表达载体,脂质体转染法处理AGS、BGC7901细胞株,观察下调、上调对增殖、克隆、迁移、侵袭影响,并利用裸鼠模型,观察了对肝转移的影响。4.LINC0120分子机制研究:从自噬及失巢凋亡抵抗角度,探讨了LINC01207过表达促进胃癌肝脏转移的分子机制。结果:1.LncRNA芯片检测发现,与正常组织比较,LINC01207在胃癌中高表达,为36.1108±0.0005（P=0.0128）。2.对150例胃癌及其配对正常组织的检测结果,按照LINC01207表达情况,将标本平均分为两组。结果发现,LINC01207与肿瘤浸润深度（P=0.009）、淋巴结转移（P=0.001）、TNM分期（P=0.000）、肝转移个数（P=0.022）、胃癌术后肝转移发生时间（P=0.003）明显相关。还发现,LINC01207高表达与自噬相关分子ATG7表达水平（P=0.000）及LC3表达水平（P=0.002）密切相关,但与性别（P=0.403）、年龄（P=0.239）、肿瘤部位（P=0.134）、肿瘤直径（P=0.102）、Lauren分型（P=0.934）、分化程度（P=0.106）、癌胚抗原（CEA）（P=0.361）无明显相关。3.胃癌细胞不同于GES-1,LINC01207虽有所增高,但在不同细胞系中程度不同。后续应用AGS和SGC7901为细胞研究模型。4.分子表型研究显示:胃癌AGS和SGC7901细胞经siRNA转染处理后,与空白对照组及空载对照组比较,siRNA组癌细胞增殖明显减弱,克降数量大幅度减少,细胞迁移受到抑制,侵袭能力显着下降。而分子过表达组呈现相反现象,与空白对照组及空载对照组比较,LINC01207组癌细胞增殖明显,克隆数量大幅度增加,细胞迁移有所增强,侵袭能力显着提升。动物实验存在同样现象,LINC01207 siRNA组裸鼠肝转移灶减少,而过表达组肝转移灶增多。还发现,与对照组比较,LINC01207过表达对胃癌失巢细胞凋亡抵抗具有促进作用;LINC01207过表达组细胞自噬体明显增加,自噬相关分子LC3B、ATG7明显增加。5.分子机制研究发现,单纯转染过表达LINC01207组细胞失巢凋亡数明显减少,而LINC01207、ATG7 siRNA共转染组细胞失巢凋亡数升高。WB检测发现,单纯转染过表达LINC01207组LC3B、survivin蛋白明显升高,而共转染组LC3B、survivin蛋白明显降低。结论:1.体内外研究结果提示,LINC01207可能是胃癌肝转移的重要分子标志物之一。2.LINC01207可能通过激活自噬,后者促进失巢凋亡抵抗,从而促进胃癌肝转移。
吴幸冬[5]（2020）在《黄芪、莪术配伍对肿瘤细胞迁移能力及黏附作用影响探究》文中认为目的:本研究选用中医益气活血法中的经典补气药黄芪与经典活血药莪术配伍,选用小鼠结肠癌细胞CT26、小鼠肺癌细胞Lewis与小鼠肝癌细胞Hepa1-6进行体外实验,然后分别检测在药物处理后3种细胞中黏附因子E钙黏素（E-cadherin）、抗癌基因KAI1、PTEN、免疫球蛋白分子CD147、低氧诱导因子-1 α（HIF-1 α）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的蛋白表达和mRNA表达,从而探讨黄芪与莪术配伍对肿瘤细胞的迁移和黏附能力的影响及作用机制。方法:1.采用CCK-8法检测不同浓度黄芪、莪术配伍对肿瘤细胞活力的影响,以选择合适的给药浓度进行后续实验;2.通过划痕实验,观察黄芪、莪术药对处理后肿瘤细胞的愈合情况以判断该药对对肿瘤细胞迁移能力的影响;3.通过细胞黏附实验,检测黄芪、莪术药对处理后肿瘤细胞与细胞间黏附能力及与细胞外基质黏附能力的影响;4.采用Western blot与Real-Time PCR法检测肿瘤细胞中黏附相关因子E-cadherin、KAI1、PTEN、CD147、HIF-1 α、MMP-9 的蛋白表达和 mRNA 表达水平。结果:1.各浓度组的黄芪、莪术药对对肿瘤细胞活力均有不同程度抑制作用,为尽量减少药物对细胞活力的影响,最终选择0.0125,0.025,0.05 g/ml浓度组进行后续实验;2.划痕实验结果显示,CT26、Hepa1-6细胞经药物处理后迁移率显着降低,且呈浓度依赖性;Lewis细胞只有0.05 g/ml组迁移率降低显着。3.细胞黏附实验结果显示,CT26、Hepa1-6细胞经药物处理后与细胞间黏附率显着升高,且呈浓度依赖性;Lewis细胞只有0.025 g/ml组与细胞间黏附率升高显着;CT26、Hepa1-6、Lewis细胞经药物处理后与细胞外基质黏附率显着下降,且呈浓度依赖性4.药物处理后能上调CT26、Lewis细胞E-cadherin、PTEN、KAI1的蛋白和mRNA表达,下调 CD147、HIF-1 α、MMP-9 的蛋白和 mRNA 表达;上调 Hepa1-6 细胞 E-cadherin、PTEN、KAI1的蛋白和mRNA表达,下调CD147的蛋白和mRNA表达,下调HIF-1 α、MMP-9的mRNA表达。结论:黄芪、莪术配伍能够降低CT26、Hepa1-6细胞的迁移能力,对于Lewis细胞迁移能力的影响存在不确定性;可以增强CT26、Hepa1-6细胞与细胞间黏附能力并降低CT26、Lewis、Hepal-6细胞与细胞外基质的黏附能力,对于Lewis细胞与细胞间黏附能力还有待进一步探究;其影响细胞迁移和黏附能力的潜在机制可能与黏附相关因子E-cadherin、KAI1、PTEN 上调和 CD147、HIF-I α、MMP-9 的下降有关。
李宜儒[6]（2020）在《MIST1在人类黑色素瘤中与失巢凋亡的关系作用及机制研究》文中研究表明研究背景:恶性黑色素瘤在近十年来该发病率急速的攀升增长,我国黑色素瘤多原发于皮肤（60%70%）和粘膜（22.6%）,其中皮肤恶性黑色素瘤（CMM）为恶性黑色素瘤中最常出现的类型,占皮肤恶性肿瘤中的排名第三名,是来源于黑素细胞,恶性程度较高的恶性肿瘤。其中澳大利亚的发病率明显是最高的。目前已知的危险因素有:1.阳光辐射:是CMM最重要的的病因。一般多聚集在皮肤长期曝光部位,以发病部位的比例而言,男性大多是以躯干部为主,其中以上背部为较常见的好发部位。而女性的部分,除了上背部之外,其中反而较常见的好发部位是小腿的位置。2.性激素及性别的差异:男性病患的生存率低于女性病患。有研究报告指出,雌激素及雌激素前体其受体,经由性激素可影响皮肤恶性黑色素瘤。3.遗传相关因素:有超过一半以上患者亲属也成为患有皮肤恶性黑色素瘤的病患,透过基因检测,可发现其中抑癌基因P16明显的突变。4.肤色种族差异因素:在发病患者中可发现,一些明显的特征发病率高于其它人,其中最显而易见的就是白种人的发病率远高于其它肤色的人种,尤其是与黑人相比。5.其它可能因素:内分泌的严重失调,任何因素导致的免疫功能低落,摩擦部位的不当刺激,病毒感染刺激等。根据之前一些研究报告中提示,在疾病发展过程中,抵抗失巢凋亡是肿瘤细胞转移的关键步骤。因为肿瘤细胞对失巢凋亡的不敏感,肿瘤细胞可以通过失巢凋亡逃逸在血管和淋巴中得以存活,最终在远端组织中形成克隆。近年来,随着黑色素瘤相关基因突变和详细深入研究的发现,靶向治疗为恶性黑色素瘤带来了新的方向。研究目的:明确MIST1与失巢凋亡是否具有相应的关联性,探讨人类正常细胞和黑色素瘤细胞中MIST1和SNAI1之间具体的关联性;并通过各种细胞学实验探讨MIST1和SNAI1是否有助于人类黑色素瘤细胞脱离细胞外基质并绕过失巢凋亡,进而造成其促进或抑制远端转移的形成;并试阐述MIST1和SNAI1降低人类黑色素瘤细胞对失巢凋亡敏感性的分子机制。研究方法:1.首先使用人类黑素瘤细胞系A375和MV3及人体正常细胞HUVEC和NHEM进行细胞培养,通过细胞学实验进行细胞黏附测定,提取蛋白进行Western blot,及RNA分离和PCR等实验方法来检测MIST1和SNAI1在人类黑色素瘤细胞和正常细胞中的表达水平。2.使用293T细胞慢病毒包装系统,然后使用此系统转染HUVEC和NHEM以内源性表达MIST1和SNAI1,促使MIST1和SNAI1过度表达,通过Wesrern blot确认其过表达,后藉由细胞行为实验检测MIST1和SNAI1过度表达后细胞粘附力及其细胞凋亡水平的粘附力与失巢凋亡的关系。3.采用sh RNA降低A375和MV3人类黑素瘤细胞中MIST1和SNAI1的表达,为通过免疫印迹分别检测MIST1及SNAI1的敲除,并进行纤连蛋白粘附检测细胞学实验以确认MIST1及SNAI1对ECM附着的影响。4.藉由MIST1及SNAI1在HUVEC和NHEM细胞中异位过度表达,及在A375和MV3中的个别载体敲除以确定MIST1及SNAI1这两者之间的相关性及其表达与对失巢凋亡的影响。5.为研究降低其失巢凋亡敏感性的分子机制,检测了PI3K的下游底物Akt激酶的活化。采用LY294002竞争性抑制剂,抑制AKT磷酸化（Ser473）后,通过相应的Wesrern blot检测及细胞学实验来检验MIST1对失巢凋亡敏感性。6.MIST1在A375和MV3中的载体敲除,检测PTEN在人类黑素瘤细胞系A375和MV3中的表达及p-AKT（Ser473）水平,接着靶向PTEN的sh RNA用于降低PTEN表达,检测p-AKT（Ser473）水平及其对由MIST1敲除引起的失巢凋亡的影响。7.为检测MIST1刺激SNAI1的表达的具体机制,根据JASPAR数据库预测,MIST1结合基序存在于ENCODE数据库预测的结合序列中。采用ChIP测定法来检测是否与PCR方法结果相同,来证实MIST1可调控SNAI1表达具体机制。研究结果:1.人类黑素瘤细胞系A375和MV3中,MIST1和SNAI1在RNA和蛋白质中高度表达。正常细胞和肿瘤细胞,在具有低附着表面的培养皿中培养24小时后,MIST1和SNAI1的表达均显着增加,保留基质可刺激细胞表达MIST1和SNAI1。2.使用293T细胞慢病毒包装系统转染HUVEC和NHEM以内源性表达MIST1和SNAI1使其过表达后,皆导致正常人HUVEC和NHEM对纤连蛋白的粘附力降低已及失巢凋亡的抗性明显提高。3.内源性MIST1和SNAI1的敲除抑制人类黑素瘤细胞的锚定非依赖性并提高了其对失巢凋亡的敏感性。4.在正常细胞中MIST1过度表达能促使SNAI1表达增加,但反之则不成立。在增强MIST1或SNAI1的表达后,失巢凋亡抗性明显提高。在人类黑色素瘤细胞MIST1的敲除降低A375和MV3中SNAI1的表达,但SNAI1的敲除不影响MIST1水平。在敲除MIST1或SNAI1后,对失巢凋亡的抗性明显降低。MIST1的变化改变SNAIL1,而非相反。5.正常人HUVEC细胞系中MIST1过度表达后,Ser473残基处的AKT磷酸化明显增强。MIST1和SNAI1对PTEN的下调作用。LY294002作为PI3K的竞争性抑制剂,通常用于抑制p-AKT（Ser473）,本研究中采用10μM浓度以抑制p-AKT（Ser473）。在抑制AKT磷酸化（Ser473）后,MIST1引起的对失巢凋亡敏感性降低能力得以恢复。敲除MIST-1后,PTEN在人类黑素瘤细胞系A375和MV3中的表达增加。相应地,p-AKT（Ser473）水平明显降低。靶向PTEN的shRNA用于降低PTEN表达,这消除MIST1敲除导致的p-AKT（Ser473）水平的降低。此外,PTEN的敲除同时抑制由MIST1敲除引起的失巢凋亡增加。6.根据JASPAR数据库预测,MIST1结合基序存在于ENCODE数据库预测的结合序列中。采用ChIP测定法证实MIST1可直接调节SNAI1。选择靠近转录起始位点的七个区域。运用蛋白G PLUS-琼脂糖与MIST1抗体的结合,提取DNA结合片段。采用Ch IP测定法,利用MIST1在HUVEC和NHEM中过度表达,SNAI1启动子上R5片段的扩增强度显着高于其它DNA片段的扩增强度,这与PCR方法证实的一致。用荧光素酶报告载体转染高度表达MIST1的A375和MV3。含有-1,199至-753bp片段的载体显示荧光素酶报告信号增强。研究结论:1.在正常和黑色素瘤细胞中,MIST1表达与SNAI1存在正相关,MIST1和SNAI1可以帮助细胞在丧失固定到其物理环境后绕过失巢凋亡。2.MIST1和SNAI1能够促进正常人细胞的锚定非依赖性。失去锚定后,MIST1和SNAI1保护细胞免于失巢凋亡。3.MIST1和SNAI1有助于人类黑素瘤细胞从ECM分离并绕过失巢凋亡,这可能导致发生远处转移。4.MIST1是SNAI1的上游基因,MIST1可通过调节SNAI1促进细胞的锚定非依赖性。5.PTEN/Akt信号通路参与MIST1和SNAI1介导人类黑素瘤细胞抵抗失巢凋亡的机制。6.MIST1通过结合其启动子调节SNAI1的表达,最终赋予人类黑素瘤细胞对失巢凋亡抗性。
陈艳[7]（2019）在《miR-32靶向ITGA6抑制肺癌生长和转移的作用及机制研究》文中认为[目的]分析miR-32、ITGA6的表达水平之间的相关性以及与NSCLC患者临床病理参数的相关性,并通过体外、体内实验研究miR-32靶向调节ITGA6表达在NSCLC生长和转移中的作用及其机制,为临床NSCLC诊治提供新的分子标志物和潜在的重要靶点。[方法]1、qPCR技术检测NSCLC患者癌组织、配对远端对照肺组织中miR-32的表达水平,收集整理患者临床病理参数。2、采用 miR-32-5p mimics、miR-32-5p inhibitors、pGpU6/GFP/Neo-miR-32,通过脂质体瞬时转染NSCLC细胞,荧光显微镜和qPCR评价转染效果;采用CCK实验、平板克隆实验、划痕实验、Transwell侵袭实验研究miR-32对NSCLC细胞增殖能力、成瘤能力、迁移和转移能力的影响。3、采用生物信息学分析软件（PITA、RNA22、TargetScan、picTar、miRanda、microT）和在线数据库分析miR-32潜在的靶基因;构建野生型和突变型ITGA6 3’UTR,与miR-32-5p mimics、miR-32-5p inhibitors共转染297T,进行双荧光素酶报告基因检测;miR-32-5p mimics、miR-32-5p inhibitors 通过脂质体瞬时转染 A549 和XWLC-05细胞后,qPCR和Western blot技术检测miR-32、ITGA6的表达水平;分析qPCR检测NSCLC患者肿瘤组织中miR-32与ITGA6表达水平之间的相关性;采用免疫组织化学技术检测NSCLC患者癌组织、配对远端对照肺组织中ITGA6、ITGB4的表达水平,收集整理患者临床病理参数;采用MTS实验、软琼脂克隆实验、Transwell体外侵袭和迁移实验等体外实验研究整合素α6β4对NSCLC细胞增殖能力、成瘤能力、转移和迁移能力的影响;采用裸鼠皮下移植瘤模型和SCID小鼠肺原位移植瘤模型,体内实验研究整合素α6β4在NSCLC生长和转移中的作用。4、通过慢病毒感染构建具有GFP和LUC标记稳定表达miR-32、miR-NC的A549细胞,并采用qPCR和Western blot技术检测miR-32、ITGA6表达水平,评价筛选结果;通过皮下注射GFP标记的实验组（LV-miR-32）、对照组（LV-miR-NC）的A549细胞,构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察裸鼠一般情况,测量裸鼠体重、瘤体大小。接种肿瘤细胞后22天时处死裸鼠,测量瘤体重量和大小,肿瘤组织一部分速冻,进行qPCR检测miR-32表达,另一部分10%中性甲醛固定,进行HE染色;通过尾静下注射LUC标记的实验组（LV-miR-32）、对照组（LV-miR-NC）的A549细胞,构建SCID小鼠肺转移模型。接种肿瘤细胞后30天进行小动物活体成像,并处死小鼠,肺组织固定后进行HE染色。5、miR-32-5p mimics、miR-32-5p inhibitors及其阴性对照通过脂质体瞬时转染A549 和 XWLC-05 细胞,qPCR 和 Western blot 技术检测 miR-32、ITGA6、FAK、pFAK、E-cadherin、Vimentin、SLUG 表达水平。并通过 Rescue 实验,qPCR 和Western blot 技术检测 miR-32、ITGA6、FAK、pFAK、AKT、p-AKT、ERK1/2、p-ERK1/2、E-cadherin、Vimentin、SLUG 表达水平,进一步研究 miR-32 在 NSCLC进展中的作用机制。[结果]1、miR-32在94例NSCLC组织中的相对表达量为0.79（0.14,1.71）,而在配对远端对照肺组织中的相对表达量1.00（0.37,3.65）,差异具有统计学意义（P<0.01）;miR-32在37例宣威NSCLC组织中的相对表达量明显低于配对远端对照肺组织（P<0.05）,而37例宣威NSCLC组织中miR-32相对表达量与57例非宣威NSCLC比较,差异无统计学意义（P>0.05）;miR-32的表达水平与患者年龄、性别、临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移、病理类型之间均没有相关性（分别P>0.05）。2、qPCR结果显示,miR-32在NSCLC细胞中的表达水平低于正常支气管上皮细胞16HBE,差异有统计学意义（分别P<0.01）。转染miR-32-5p mimics、pGpU6/GFP/Neo-miR-32 的 A549、XWLC-05、H157、YTMLC 细胞中 miR-32 的表达水平均高于阴性对照组（分别P<0.001）。CCK实验结果显示,转染miR-32-5p mimics的A549、XWLC-05细胞增殖明显受到抑制（分别P<0.001）,而转染miR-32-5p inhibitors的A549、XWLC-05细胞增殖率明显高于其阴性对照inhibitors NC（分别P<0.001）。平板克隆形成实验结果显示,转染miR-32-5p mimics的A549、XWLC-05、H157细胞克隆数明显低于阴性对照组miR-NC（分别P<0.001）。划痕实验结果显示,转染 pGpU6/GFP/Neo-miR-32 的 A549、XWLC-05、H157、YTMLC细胞伤口愈合速度明显慢于阴性对照组（分别P<0.001）。Transwell侵袭实验结果显示,转染 pGpU6/GFP/Neo-miR-32 的 A549、XWLC-05、H157、YTMLC侵袭细胞数明显低于阴性对照组（分别P<0.001）。3、4 个数据库（PITA、TargetScan、miRanda、microT）预测 ITGA6 具有 miR-32的结合位点;双荧光素酶报告基因检测结果显示,miR-32-5p mimics可明显抑制野生型ITGA6 3’UTR质粒荧光素酶活性（P<0.001）,而突变型ITGA6 3’UTR质粒活性则无明显变化（P>0.05）。相反,miR-32-5p inhibitors则可明显促进野生型ITGA6 3’UTR质粒荧光素酶活性（P<0.001）;qPCR结果显示,转染miR-32-5p mimics的A549和XWLC-05中miR-32表达水平均明显高于阴性对照组（分别P<0.001,P<0.05）,而ITGA6表达水平均明显低于阴性对照组（分别P<0.01）。转染miR-32-5p inhibitor的A549和XWLC-05中miR-32表达水平则均明显低于阴性对照组（分别P<0.001,P<0.05）,而ITGA6的表达水平均明显高于阴性对照组（分别P<0.001,P<0.01）;Western blot 结果显示,转染 miR-32-5p mimics后,A549和XWLC-05中ITGA6蛋白的表达水平均低于阴性对照组。NSCLC肿瘤组织中miR-32和ITGA6的相对表达呈现负相关关系（r=-0.34,P<0.001）;整合素α6β4在NSCLC肿瘤组织中的表达均高于配对远端对照肺组织（分别P<0.05,P<0.001）。整合素α6β4的表达均与NSCLC患者复发转移密切相关（分别P<0.01）;整合素α6β4在NSCLC细胞株中均有表达。抑制整合素α6β4表达的实验组H460SM细胞软琼脂克隆形成率、迁移率、侵袭率均低于与阴性对照组（分别P<0.05）;抑制ITGA6、ITGB4表达的实验组裸鼠皮下移植瘤体积小于阴性对照组（分别P<0.05）;抑制ITGA6、ITGB4表达的的实验组SCID小鼠肺癌原位移植瘤转移率低于阴性对照组（分别P<0.05）。4、qPCR和Western blot技术检测稳定表达miR-32和miR-NC的A549细胞中miR-32、ITGA6的表达,结果显示实验组（A549/LV-miR-32）miR-32的表达均明显高于对照组(（A549/LV-miR-NC）,而ITGA6的表达则均明显低于对照组（分别P<0.001）。裸鼠皮下移植瘤模型结果显示,与对照组(（A549/LV-miR-NC）比较,实验组（A549/LV-miR-32）小鼠皮下移植瘤增长趋势明显受到抑制,差异有统计学意义（P<0.01）。实验组移植瘤离体肿瘤重量、肿瘤体积均小于对照组（分别P<0.01,P<0.05）。qPCR结果显示,实验组移植瘤离体肿瘤miR-32表达水平明显高于对照组（P<0.01）。SCID小鼠尾静脉注射肺转移模型实验结果显示,对照组肺脏肿瘤结节数明显多于实验组（P<0.001）。5、瞬时转染 miR-32-5p mimics 的 A549 和 XWLC-05 细胞中 ITGA6、pFAK（Y397）、pFAK（Y925）、Vimentin表达水平均低于阴性对照组,E-cadherin则高于阴性对照组（分别P<0.05）,而瞬时转染miR-32-5p inhibitors的A549和XWLC-05细胞中ITGA6、pFAK（Y397）、pFAK（Y925）、Vimentin 表达水平均高于阴性对照组,E-cadherin则低于阴性对照组阴性对照组（分别P<0.05）;与miR-NC和过表达对照质粒瞬时共转染比较,miR-32-5p mimics和过表达对照质粒瞬时共转染A549和 XWLC-05 细胞,ITGA6 蛋白及其下游 pFAK（Y397）、pFAK（Y925）、p-AKT、p-ERKl/2表达水平降低,E-cadherin表达水平升高而Vimentin、SLUG表达水平降低（分别P<0.00l,P<0.0l）。与miR-32-5p mimics和过表达对照质粒瞬时共转染比较,miR-32-5p mimics和ITGA6过表达质粒瞬时共转染A549和XWLC-05细胞,可部分逆转由于miR-32-5p mimics所造成的ITGA6蛋白表达的抑制,增加下游 pFAK（Y397）、pFAK（Y925）、p-AKT（ser473）、p-ERK1/2（pT202/Y204）磷酸化蛋白表达水平,增加Vimentin、SLUG表达,降低E-cadherin表达。[结论]1、miR-32在NSCLC肿瘤组织中呈低表达,提示miR-32在NSCLC发生发展中可能发挥抑癌miRNA的作用。2、过表达miR-32可抑制NSCLC生长和转移。3、整合素α6β4信号通路可促进NSCLC生长和转移。ITGA6是miR-32新的靶基因。miR-32可抑制ITGA6表达,抑制整合素α6β4信号通路的活化,抑制AKT、ERK激活,降低SLUG的表达,进而抑制NSCLC的侵袭和转移。
张华[8]（2019）在《转录因子SPIB调控非小细胞肺癌细胞失巢凋亡抵抗的机制研究》文中研究指明目的:失巢凋亡是细胞脱离细胞外基质引发的一种程序性死亡,获得失巢凋亡抵抗能力是肿瘤侵袭和转移的一个关键机制。在癌症晚期,自噬通过增强细胞对各种环境压力的适应能力促进肿瘤的进展。一般认为肿瘤细胞脱离基质诱导的自噬水平升高能够增强细胞失巢凋亡抵抗进而促进肿瘤转移。我们在前期的研究中发现淋巴细胞特异表达的转录因子SPIB异位表达于肺癌细胞且促进肺癌的转移,由此推测SPIB可能在肺癌细胞失巢凋亡抵抗过程中发挥功能,但SPIB发挥功能的机制尚不清楚。因此,本研究主要探讨SPIB调控非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）细胞抵抗失巢凋亡过程中的转录调节机制及可能的自噬机制,旨在以SPIB为潜在靶点的NSCLC临床诊断和治疗提供理论和实验依据。方法:第一部分,验证SPIB的失巢凋亡抵抗功能。首先利用q RT-PCR和western blot检测肺癌细胞系中SPIB的表达,选取SPIB表达量不同的5个细胞系用细胞死亡实验检测细胞失巢凋亡。随后,将H1703、A549和H1975细胞悬浮后检测SPIB表达。在H1703和H460细胞中敲低SPIB,在H1975细胞中过表达SPIB,再将细胞分别进行贴壁和悬浮处理后检测细胞失巢凋亡。用全细胞裂解液分析SPIB下调的H1703和H460细胞中凋亡蛋白full-length PARP、cleaved-PARP和cleaved-CASP3的表达变化。Transwell实验检测SPIB对悬浮培养的NSCLC细胞侵袭能力的影响。免疫组化染色分析27例肺原位瘤和对应的淋巴结转移瘤中SPIB的表达差异。第二部分,SPIB执行失巢凋亡抵抗功能的自噬调节机制。首先将稳定表达GFP-LC3-RFP-LC3ΔG的4个肺癌细胞系分别贴壁和悬浮培养24 h后,通过荧光显微镜观察并记录绿色红色斑点的数量、强度及面积变化,分析细胞自噬流量的变化。随后,RNA-seq（RNA sequencing）分析SPIB下调后贴壁和游离的H1703细胞中基因转录本的变化。为了进一步验证SPIB在自噬过程中的功能,我们利用荧光显微镜技术分析稳定表达GFP-LC3的细胞中LC3-II聚集点变化,用免疫印迹技术检测自噬标记蛋白LC3B-II、SQSTM1、ATG7、ATG5和BECN1表达变化,利用自噬激活剂trehalose和自噬抑制剂bafilomycin A1（Baf A1）综合处理细胞分析自噬流量变化。最后,用透射电子显微镜技术检测相应处理后H1703细胞内超微结构变化。第三部分,SPIB执行失巢凋亡抵抗功能的转录调节机制。利用Ch IP-seq（Ch IP sequencing）分析SPIB在全基因组富集的情况,分离出SPIB在启动子区域结合的基因,并用GSEA（gene set enrichment analysis）进行基因功能分析。从中筛选自噬和失巢凋亡相关基因,用q RT-PCR检测基因转录水平变化。随后,选取m RNA水平变化显着的基因进行Ch IP-PCR验证。分析SPIB在SNAP47启动子上的结合位点,构建SNAP47启动子质粒并检测启动子活性。此外,在贴壁和悬浮培养的肺癌细胞中下调SPIB,检测SNAP47蛋白水平变化。最后,利用自噬抑制剂Baf A1处理细胞,检测自噬降解与CLDN2蛋白水平的相关性,用细胞死亡实验确定CLDN2在细胞失巢凋亡中的作用。结果:第一部分,SPIB增强NSCLC细胞失巢凋亡抵抗。SPIB在NSCLC细胞系中存在差异表达。SPIB的表达水平与细胞抵抗失巢凋亡的能力呈正相关。脱离基质诱导SPIB高表达;反之,下调SPIB增强失巢凋亡标志蛋白分子cleaved-CASP3和cleaved-PARP的表达,并促进失巢凋亡。SPIB对细胞失巢凋亡抵抗的调节增强了NSCLC细胞的侵袭能力和转移潜能。第二部分,下调SPIB抑制细胞自噬。下调SPIB阻碍悬浮培养诱导的细胞自噬增强,增加细胞内肿胀的自噬泡的积累,改变一系列自噬相关基因的表达。第三部分,SPIB通过促进SNAP47的转录和CLDN2的自噬降解增强NSCLC失巢凋亡抵抗。SPIB在BOK、BMF和SQSTM1等自噬和失巢凋亡相关基因的启动子区域富集。SPIB结合在SNAP47基因转录起始位点（transcriptional start site,TSS）上游0.5 kb的位置。悬浮细胞中下调SPIB抑制SNAP47的转录活性并且减少SNAP47的蛋白表达。SPIB水平的降低促进CLDN2的表达并抑制其通过自噬降解。积累的CLDN2促进NSCLC细胞发生失巢凋亡。结论:NSCLC细胞脱离基质诱导SPIB表达,高表达的SPIB激活SNAP47转录,加速自噬过程。同时,SPIB抑制CLDN2表达并且促进其通过自噬降解。SPIB通过以上两种途径介导细胞失巢凋亡抵抗,进而增强细胞侵袭和转移潜能。这一研究发现了NSCLC细胞抵抗失巢凋亡的新机制,将为肺癌转移临床治疗和药物开发提供新的实验证据和靶点。
曹小仁[9]（2019）在《基于AKT信号通路研究蟾酥内酯对黑色素瘤细胞的作用及其分子机制》文中认为背景和目的 黑色素瘤是临床最常见的皮肤恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率在世界上所有肿瘤中较高,每年经紫外线辐射所引起的皮肤恶性黑色素瘤患者数量急剧上升。目前临床常用的黑色素瘤治疗方法包括药物治疗,手术切除,放疗,化疗等,但是这些治疗策略通常具有治疗不彻底,药物及放化疗造成患者恶心、呕吐、头晕等不良反应,病情易反复发作,其临床治疗效果无法令患者满意,也在一定程度上增加了公共卫生负担。为此,当前全球的诸多医药科学研究者致力于寻求药效理想的药物来改进治疗,减少副作用,并降低黑色素瘤的死亡率。尤其近年来,肿瘤研究领域不断地探索分子靶向治疗、中西医结合治疗等新疗法和理念。临床研究证明,中医药在治疗黑色素瘤方面具有特有的优势,包括对放疗、化疗的减毒与增效作用。因此,在众多的天然药物和传统中药中筛选出能够治疗黑色素瘤的药物,是目前国内外的研究热点之一。蟾酥内酯是由采集于蟾蜍的皮肤和腮腺毒液的蟾酥经提取分离而得到的天然活性成分。传统中医学中,蟾酥主要用于强心、镇痛、升血压、抗菌、局部麻醉及抗肿瘤等各种临床疾病的治疗。蟾酥化学成分分离与鉴定以及药理学作用研究发现蟾酥内酯是蟾酥的主要药理成分,在相关的报道中,蟾酥内酯化合物具有阻滞肿瘤细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡的作用,蟾酥内酯亦可显着抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞发生自噬等,同时蟾酥内酯还可对一系列细胞信号通路进行有效的调控,从而发挥显着抗肿瘤作用也在文献中多有报道。基于此前的研究,本研究选择了诸多肿瘤细胞信号通路中常见的AKT信号通路,旨在探讨蟾酥内酯是否能够通过抑制AKT信号通路影响黑素瘤细胞活力并增加细胞凋亡和自噬,确认其抗肿瘤效应。实验方法 采用黑色素瘤A-375细胞株进行体外培养,采用CCK-8实验、免疫蛋白印记检测（western bloting,WB）和流式细胞术（flow cytometry,FCM）等实验方法,检测了A-375细胞的细胞活力、自噬蛋白、凋亡水平和凋亡蛋白的变化以及蟾酥内酯对AKT信号通路相关蛋白表达的影响。实验结果 在黑色素瘤A-375细胞中,CCK-8检测结果显示不同浓度蟾酥内酯均对黑色素瘤A-375细胞具有明显的抑制作用,且具有时间-剂量依赖性,二者统计学具有显着差异（p<0.05）。流式细胞术显示随着蟾酥内酯浓度的增加,黑色素瘤A-375细胞出现凋亡细胞数量增多。Western blot结果显示A-375细胞经不同浓度的蟾酥内酯处理后,促凋亡相关蛋白BAX和野生型p53水平逐渐增加;而抑凋亡相关蛋白Bcl-2、caspase3水平逐渐减少;自噬相关蛋白LC3-II水平显着增高,p62蛋白被蟾酥内酯显着抑制。另外,经Western blot结果显示经蟾酥内酯作用于A-375细胞后,AKT信号通路及其下游相关蛋白AKT,phospho-AKT（p-pAKT）,mTOR,p70S6K,phospho-p70S6K（p-p70S6K）,GSK-3β,phospho-GSK-3β（p-GSK-3β）,cyclinD1的水平均不同程度的发生了变化,表明蟾酥内酯对AKT信号通路进行了调控。实验结论 蟾酥内酯具有显着抑制人黑色素瘤细胞的作用,蟾酥内酯能通过抑制AKT信号通路降低黑色素瘤细胞活力并促进黑色素瘤细胞发生凋亡和自噬。本研究是针对黑色素瘤治疗的一种新天然药物的探索、挖掘,希望为有效治疗人黑色素瘤提供具有潜在价值的治疗药物。
王豪[10]（2017）在《GFI1在肺癌发生发展中的功能及调控机制的研究》文中认为背景:GFI1作为一个锌指蛋白,在许多造血、淋巴和髓系祖细胞以及成熟淋巴和髓细胞中广泛表达,起转录抑制因子作用。C端锌指结构域介导其与DNA的相互作用,N端SNAIL/GFI-1（SNAG）结构域则帮助其行使抑制作用。在内皮细胞向造血细胞转化过程中,GFI1能够帮助细胞脱离原始基质。GFI1与多种血液系统疾病相关,包括嗜中性白血球减少症和白血病。GFI1在胚胎晚期周围神经系统的发育中起着重要的作用,主要调控内耳毛细胞、视网膜神经细胞、肺神经内分泌细胞的发育。最近发现GFI1与MYC协同作用,促进髓母细胞瘤的形成。GFI1在淋巴造血系统最早期的发育中发挥重要作用,其表达于造血干细胞中,能够调控造血干细胞的自我更新。我们首次发现GFI1在肺癌细胞中广泛异位表达。进而对其在肺癌发生发展中发挥的具体功能和禁止进行了进一步的探究。目的:明确GFI1在肺癌病人组织以及肺癌细胞系中表达特点;阐明GFI1在肺癌细胞系中异位表达所发挥的功能,以及其行使其功能的具体机制;探讨GFI1在肺癌细胞中异位表达的表观遗传学机制;判断其是否有可能成为肺癌早期诊疗、预后的标记物以及治疗的靶点。方法:1.用PCR、western检测GFI1在不同肺癌细胞系中表达的差异,用免疫组化的方法检测GFI1在不同类型的肺癌组织中表达的差异,探究GFI1在不同类型的肺癌细胞系以及病理组织中的表达特点,明确GFI1与肺癌进展的关系。2.通过鼠尾静脉注射将过表达GFI1的人类肺癌细胞系注入BALB/C裸鼠体内,观察得出小鼠的生存曲线,研究在动物体内GFI1在肿瘤形成过程中所发挥的功能。3.利用Microarray检测A549过表达GFI1相对于对照组转录谱的变化,并利用实时定量PCR进行验证。4.在表达GFI1较低的肺癌细胞系中过表达该基因,而在表达量高的细胞系中敲低其表达,进行一系列细胞行为学方面的实验,包括划痕实验、增殖实验、侵袭实验、失巢凋亡检测、体外成瘤实验,明确GFI1的表达具体作用于肿瘤发生发展中的哪一具体环节。5.用western检测探究GFI1影响的下游通路,以及抑制下游通路后所发生的回复实验。6.利用Luciferase Assay、Ch IP技术明确GFI1的启动子区域,3C、DNA甲基研究GFI1表达的具体表观遗传机制。结果:1.GFI1与肺癌淋巴结远端转移以及不良预后相关。（1）造血系统特异性的转录因子GFI1在肺癌细胞系及病人组织中均有表达。并且淋巴结转移越高的病人中GFI1表达越高。GFI1表达高的病人生存时间明显缩短。（2）通过鼠尾静脉注射将过表达GFI1的A549注入BALB/C裸鼠体内,实验组小鼠生存时间明显变短。这说明,GFI1在动物体内能够帮助肿瘤的形成。2.GFI1的表达帮助细胞逃避失巢凋亡。（1）A549细胞中过表达GFI1后,细胞形态发生明显的改变,趋于变圆,细胞与与细胞之间,以及细胞与基质之间的粘附能力明显降低。而在高表达GFI1的H1155敲低GFI1的表达,细胞的粘附能力明显提高。（2）A549细胞中过表达GFI1进行Microarray分析显示细胞粘附相关通路被下调,实时定量PCR也能证明一系列整合素蛋白表达被下调。（3）HUVEC、HBEC、A549、H460细胞中过表达GFI1,细胞在低吸附的培养皿中存活能力显着增强。而悬浮状态的小细胞肺癌细胞系H209中敲低GFI1的表达,细胞的凋亡水平有所上升。而在接下来的通路研究当中,过表达GFI1能够促进Erk磷酸化水平的上升,加入Erk磷酸化抑制剂u0216能够使细胞抵抗失巢凋亡的能力发生一定回复。这些数据共同说明,GFI1能够通过激活Erk磷酸化来帮助细胞提高在脱离基质环境中的生存能力。3.GFI1基因结构上的相互作用导致GFI1在小细胞肺癌细胞系中表达的增高。（1）利用Ch IP研究组蛋白修饰与Luciferase报告基因技术共同验证,发现GFI1的第三个启动子活跃。（2）利用3C技术检测了A549、H209中GFI1的染色质空间高级构象的差异。H209中GFI1启动子区域形成明显的环状结构,而A549中则不存在这种结构。而Luciferase实验显示H209中第三个启动子位置与其上游1.5kb的位点形成环状结构。（3）DNA甲基化检测发现,在低表达GFI1的A549、H460细胞系中启动子区域甲基化水平明显较高,而高表达GFI1的H1155、H209中则很低。DNA甲基化有可能是调控GFI1的表达的机制之一。结论:GFI1在肺癌细胞中异位激活,而且与淋巴结转移密切相关。在GFI1功能的研究中我们发现,GFI1通过激活Erk磷酸化来帮助细胞逃避失巢凋亡,最终形成远端转移。而GFI1在小细胞肺癌细胞系中基因结构相互作用的形成屏蔽了上游沉默子对GFI1转录的抑制。启动子区甲基化水平也是调控GFI1转录的机制之一。我们的研究拓宽了对肺癌发生发展的认知,为进一步的临床研究与治疗提供了一定的理论依据。
二、Tumor suppressor gene PTEN affects anoikis via both PKB and FAK in human lung carcinoma cell lines（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、Tumor suppressor gene PTEN affects anoikis via both PKB and FAK in human lung carcinoma cell lines（论文提纲范文）
（1）miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略语表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 HCC中抑癌miR-876从TCGA数据库的筛选鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 miR-876在HCC细胞及组织中低表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 miR-876 的异常表达和HCC进展及纤维化相关 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 miR-876 抑制HCC的 EMT及纤维化 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 miR-876 靶向调控POSTN |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 miR-876 通过POSTN抑制HCC的 EMT及纤维化 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.2 结果 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第八章 POSTN高表达和HCC组织EMT及肝硬化相关 |
| 8.1 材料与方法 |
| 8.2 结果 |
| 8.3 讨论 |
| 8.4 小结 |
| 第九章 miR-876及POSTN的异常表达和HCC预后相关 |
| 9.1 材料与方法 |
| 9.2 结果 |
| 9.3 讨论 |
| 9.4 小结 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 骨膜蛋白(POSTN)的结构功能及其在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（2）PAI-1通过PTEN/PI3K/AKT信号通路引起肝癌失巢凋亡抵抗的相关研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语表 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 PAI-1在肝癌中的临床意义 |
| 1.实验材料及方法 |
| 1.1 临床资料 |
| 1.2 实验仪器及试剂 |
| 1.3 S-P(streptavidin-perosidase)法免疫组织化学技术 |
| 1.4 IHC切片定性及定量方法 |
| 2.结果 |
| 2.1 生物信息学分析PAI-1在肝癌组织中m RNA水平表达 |
| 2.2 生物信息学分析PAI-1在肝癌患者预后 |
| 2.3 IHC检测PAI-1在临床HCC患者中的表达情况及生存预后 |
| 3.讨论 |
| 4.结论 |
| 第三章 PAI-1在肝癌细胞系中的作用及介导anoikis现象的研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 主要试剂溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 构建悬浮细胞模型 |
| 2.2 细胞培养、传代、冻存 |
| 2.3 RT-PCR(适时定量聚合酶链扩增反应) |
| 2.4 Western Blot(蛋白印迹)检测 |
| 2.5 RNAi慢病毒构建与过表达慢病毒构建 |
| 2.6 流式Annexin V-FITC/PI法检测HCC细胞系anoikis表型 |
| 2.7 划痕实验验证PAI-1在HCC细胞系中的增殖、迁移表型 |
| 2.8 Transwell实验验证PAI-1在HCC细胞系中的浸润、转移表型 |
| 2.9 CCK8测定PAI-1在HCC细胞中增殖表型以及筛选PAI-1抑制剂IC50 |
| 2.10 统计学方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 PAI-1在肝癌细胞系中表达水平 |
| 3.2 验证待遴选肝癌细胞系悬浮表型 |
| 3.3 PAI-1在遴选细胞系中敲减/过表达细胞悬浮后蛋白表达水平 |
| 3.4 PAI-1调控HCC细胞系的anoikis表型 |
| 3.5 PAI-1调控HCC细胞的浸润转移表型 |
| 3.6 PAI-1抑制剂回复HCC细胞的浸润转移表型 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第四章 PAI-1通过PTEN/PI3K/AKT信号通路调控HCC细胞AR及生物信息学工具预测PAI-1调控相关蛋白的研究 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 主要实验仪器 |
| 1.3 主要实验试剂 |
| 1.4 主要试剂溶液配制 |
| 2.实验方法 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 PAI-1通过激活PTEN调控PI3K/AKT信号通路来调控HCC细胞AR表型 |
| 3.2 PTEN特异性抑制剂(bpV(HOpic))回复PAI-1调控PTEN蛋白来激活/失活PI3K/AKT信号通路来调控HCC细胞AR表型 |
| 3.3 生物信息学工具预测PAI-1在HCC调控互作蛋白 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 第五章 体内验证PAI-1调控HCC细胞AR表型 |
| 1.实验材料 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 实验器械 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 动物蛋白提取 |
| 2.2 构建肝癌细胞肝内转移模型及标本处理 |
| 3.实验结果 |
| 3.1 构建PAI-1调控体内肝癌细胞转移瘤(cell-line-derived xenograft,CDX)模型 |
| 3.2 体内验证PAI-1表达影响肝癌细胞转移瘤(cell-line-derived xenograft,CDX)模型的小鼠生存周期 |
| 3.3 体内验证PAI-1通过PTEN/PI3K/AKT信号通路调控HCC浸润转移表型 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 小结与展望 |
| 参考文献 |
| 文献综述 PAI-1在肿瘤浸润转移中作用的研究 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（3）PC4通过FOXO1和FOXO3a降低肺腺癌对顺铂药物敏感性的机制研究（论文提纲范文）
| 略缩词表 |
| Abstract |
| 摘要 |
| 第一章 转录辅助因子4对肺腺癌的恶性表型和顺铂敏感性的影响 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 材料与方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 结论 |
| 第二章 FOXO1和FOXO3a在肺腺癌细胞对顺铂药物敏感性中的调控作用及机制研究 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 PC4 通过FOXO1和FOXO3a调控肺腺癌细胞对顺铂药物敏感性的机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 重新评估FOXO蛋白在肿瘤中的作用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的科研成果 |
| 致谢 |
（4）长链非编码RNA LINC01207调控胃癌肝转移作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 胃癌的流行病学及诊疗现状 |
| 1.2 胃癌肝转移 |
| 1.2.1 胃癌肝转移的诊断和治疗 |
| 1.2.2 胃癌肝转移的生物学过程 |
| 1.3 LncRNA在胃癌肝转移中的研究 |
| 1.3.1 LncRNA的生物学特性 |
| 1.3.2 LncRNA参与胃癌的发生发展 |
| 1.3.3 LncRNA通过EMT调节胃癌肝转移 |
| 1.4 失巢凋亡抵抗:胃癌肝转移的必要前提 |
| 1.4.1 整合素和失巢凋亡抵抗 |
| 1.4.2 EMT和失巢凋亡抵抗 |
| 1.4.3 生长因子受体和失巢凋亡抵抗 |
| 1.5 自噬与胃癌肝转移 |
| 1.6 本研究目的、思路与内容 |
| 1.6.1 研究目的 |
| 1.6.2 研究思路及内容 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 病例来源及临床病理资料 |
| 2.1.2 组织样本 |
| 2.1.3 胃癌细胞株 |
| 2.1.4 主要试剂及缓冲液 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 组织总RNA抽提 |
| 2.2.2 RNA质量检测 |
| 2.2.3 LncRNA芯片杂交 |
| 2.2.4 芯片洗涤与扫描 |
| 2.2.5 芯片数据的采集及分析 |
| 2.2.6 组织lncRNA qRT-PCR检测 |
| 2.2.7 LINC01207 对胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 2.2.8 统计 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 胃组织总RNA的提取和质控 |
| 3.2 LncRNA芯片初筛结果 |
| 3.3 LncRNA芯片检测结果 |
| 3.4 LINC01207 定量PCR体系的构建 |
| 3.5 LINC01207 在胃癌组织中表达及临床意义 |
| 3.6 LINC01207 在正常胃细胞株及不同胃癌细胞系中表达 |
| 3.7 LINC01207 对胃癌增殖的影响 |
| 3.8 LINC01207 对胃癌细胞克隆形成的影响 |
| 3.9 LINC01207 对胃癌细胞迁移的影响 |
| 3.10 LINC01207 对胃癌细胞侵袭的影响 |
| 3.11 LINC01207 过表达胃癌细胞肝转移及自噬相关基因ATG7 的影响 |
| 3.12 LINC01207 对胃癌细胞失巢凋亡的影响 |
| 3.13 LINC01207 升高或降低对胃癌细胞自噬的影响 |
| 3.14 LINC01207 通过自噬促进胃癌细胞失巢凋亡抵抗 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 胃癌肝转移的预后 |
| 4.2 LncRNA芯片筛选-LINC01207 临床意义 |
| 4.3 LncRNA LINC01207 在胃癌中的表达及临床意义 |
| 4.4 LINC01207 对胃癌增殖、侵袭、迁移的影响 |
| 4.5 分子机制方面的讨论 |
| 4.5.1 LINC01207 与自噬 |
| 4.5.2 LINC01207 与失巢凋亡抵抗 |
| 4.5.3 LINC01207 促进胃癌生物学行为的机制 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间发表的学术论文及其他科研成果 |
（5）黄芪、莪术配伍对肿瘤细胞迁移能力及黏附作用影响探究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 第一章 黏附相关因子在肿瘤细胞黏附及转移过程中的作用研究进展 |
| 1. 肿瘤黏附作用在肿瘤转移过程中起到的的关键作用值得引起重视 |
| 2. 黏附相关因子E-cadherin、KAI1、PTEN、CD147、HIF-1α、MMP-9在肿瘤细胞黏附和转移过程中的所发挥的重要作用 |
| 第二章 黄芪与莪术影响肿瘤细胞黏附能力的作用机制研究进展 |
| 1. 中医益气活血法在肿瘤治疗中的研究 |
| 2. 黄芪、莪术配伍治疗肿瘤的理论依据 |
| 2.1 黄芪、莪术配伍的理论研究 |
| 2.2 黄芪对肿瘤细胞黏附能力的影响 |
| 2.3 莪术对肿瘤细胞黏附能力的影响 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第一章 黄芪、莪术配伍对肿瘤细胞CT26、Lewis、Hepa1-6的迁移及黏附能力的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 药物与试剂 |
| 1.3 仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 CCK-8法检测CT26、Lewis、Hepa1-6细胞活力 |
| 2.3 划痕实验检测CT26、Lewis、Hepa1-6细胞迁移能力 |
| 2.4 细胞-细胞间黏附实验观察细胞同源性黏附率 |
| 2.5 细胞-细胞外基质黏附实验观察细胞与细胞外基质的黏附率 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 黄芪、莪术配伍对CT26、Lewis、Hepa1-6细胞活力的影响 |
| 3.2 黄芪、莪术配伍对CT26、Lewis、Hepa1-6细胞迁移能力的影响 |
| 3.3 黄芪、莪术配伍对CT26、Lewis、Hepa1-6细胞—细胞间黏附能力的影响 |
| 3.4 黄芪、莪术配伍对CT26、Lewis、Hepa1-6细胞—细胞外基质黏附能力能力的影响 |
| 4 讨论 |
| 第二章 黄芪、莪术配伍对肿瘤细胞CT26、Lewis、Hepa1-6中E-cadherin、KAI1、PTEN、CD147、HIF-1 α、MMP-9的蛋白表达和mRNA表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 试剂 |
| 1.2 仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞E-cadherin、KAI1、PTEN、CD147、HIF-1α、MMP-9蛋白表达 |
| 2.2 Real-Time PCR法检测细胞E-cadherin、KAI1、PTEN、CD147、HIF-1 α、MMP-9 mRNA表达 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 各组细胞E-cadherin、KAI1、PTEN、CD147、HIF-1α、MMP-9蛋白表达比较 |
| 3.2 各组细胞E-cadherin、KAI1、PTEN、CD147、HIF-1α、MMP-9 mRNA表达比较 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 1 本论文共有两部分: 理论研究和实验研究 |
| 2 实验的不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录: 主要缩略语中英文对照表 |
| 攻读硕士学位期间取得的研究成果 |
| 发表文章 |
| 参与课题 |
| 致谢 |
（6）MIST1在人类黑色素瘤中与失巢凋亡的关系作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 1.引言 |
| 1.1 失巢凋亡 |
| 1.2 MIST1 |
| 1.3 转录因子SNAI1 |
| 1.4 皮肤恶性黑色素瘤转移侵袭的理论发展 |
| 1.5 蛋白的调控机制 |
| 1.6 PI3K/AKT 信号通路 |
| 2.材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 设备 |
| 2.3 研究步骤与方法 |
| 2.3.1 细胞复苏,培养,传代及冻存 |
| 2.3.2 细胞粘附测定 |
| 2.3.3 ELISA检测细胞凋亡水平 |
| 2.3.4 RNA分离和聚合酶链反应(PCR)分析 |
| 2.3.5 蛋白提取 Western blot |
| 2.3.6 过表达构建和载体敲除 |
| 2.3.7 染色质免疫沉淀(ChIP)测定 |
| 2.3.8 荧光素酶报告基因技术 |
| 2.3.9 统计分析 |
| 3.结果 |
| 3.1 在人体正常细胞和黑素瘤细胞中,MIST1与SNAI1 的表达及其影响 |
| 3.2 MIST1和SNAI1 过度表达后及其对失巢凋亡的影响 |
| 3.3 MIST1 和SNAI1 的敲除对人类黑色素瘤细胞及其对失巢凋亡的影响 |
| 3.4 MIST1 与SNAI1 之间的关系及失巢凋亡抗性影响 |
| 3.5 PTEN/ AKT信号通路对MIST1和SNAI1 及失巢凋亡的影响 |
| 3.6 MIST1调控SNAI1表达的具体机制 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.参考文献 |
| 7.附录 |
| 7.1 个人简历 |
| 7.2 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
| 综述 抑制黑色素瘤细胞的侵袭和转移相关研究进展 |
| 参考文献 |
（7）miR-32靶向ITGA6抑制肺癌生长和转移的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 1. 肺癌研究概况 |
| 2. 上皮间质转化与肺癌进展 |
| 3. 整合素α6β4信号通路在肿瘤生长和转移中的作用及其机制 |
| 4. microRNA与肺癌相关性研究 |
| 5. ITGA6与miRNA |
| 6. miR-32与肿瘤相关性研究 |
| 第一部分 miR-32在非小细胞肺癌患者中的表达及其临床意义研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第二部分 miR-32对非小细胞肺癌生物学行为的影响 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第三部分 ITGA6作为miR-32直接靶基因的研究及其在非小细胞肺癌生长和转移中的作用 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第四部分 过表达miR-32抑制非小细胞肺癌生长和转移体内实验研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 第五部分 miR-32靶向ITGA6抑制非小细胞肺癌生长和转移机制研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 MicroRNA与肺癌相关研究最新进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（8）转录因子SPIB调控非小细胞肺癌细胞失巢凋亡抵抗的机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、SPIB的表达与失巢凋亡抵抗相关性研究 |
| 1.1 对象和方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验仪器 |
| 1.1.3 实验试剂 |
| 1.1.4 实验耗材 |
| 1.1.5 溶液配制 |
| 1.1.6 实验方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 NSCLC细胞的失巢凋亡与SPIB的表达量呈负相关 |
| 1.2.2 SPIB增强NSCLC细胞失巢凋亡抵抗 |
| 1.2.3 SPIB介导的失巢凋亡抵抗增强NSCLC细胞侵袭和转移潜能 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 SPIB增强NSCLC细胞失巢凋亡抵抗能力 |
| 1.3.2 SPIB促进NSCLC细胞发生转移 |
| 1.4 小结 |
| 二、SPIB调控NSCLC细胞失巢凋亡抵抗的自噬机制研究 |
| 2.1 对象和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验耗材 |
| 2.1.5 溶液配制 |
| 2.1.6 实验方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 脱离基质增强NSCLC细胞自噬过程 |
| 2.2.2 下调SPIB引起自噬相关基因转录水平改变 |
| 2.2.3 下调SPIB阻断NSCLC细胞自噬流量 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 NSCLC细胞脱离细胞外基质激活自噬 |
| 2.3.2 下调SPIB阻断自噬流量 |
| 2.3.3 自噬对肿瘤转移具有重要意义 |
| 2.4 小结 |
| 三、SPIB转录调控下游基因表达的机制研究 |
| 3.1 对象和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.1.4 实验耗材 |
| 3.1.5 溶液配制 |
| 3.1.6 实验方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 SPIB在自噬和失巢凋亡相关基因的启动子区域富集 |
| 3.2.2 SPIB激活SNAP47转录 |
| 3.2.3 CLDN2参与SPIB介导的自噬和失巢凋亡抵抗 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 SPIB激活SNAP47 转录 |
| 3.3.2 CLDN2参与SPIB介导的自噬和失巢凋亡抵抗 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 自噬与调节性细胞死亡的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）基于AKT信号通路研究蟾酥内酯对黑色素瘤细胞的作用及其分子机制（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 研究流程图 |
| 第一部分:体外实验研究蟾酥内酯抗黑色素瘤的药物活性 |
| 第二部分:体外实验初步研究蟾酥内酯在黑色素瘤细胞中的分子机制 |
| 第一部分:体外实验研究蟾酥内酯抗黑色素瘤细胞的药物活性 |
| 材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验药品 |
| 1.3 实验材料 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 实验仪器 |
| 1.6 相关抗体 |
| 2.实验方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 显微镜观察细胞形态 |
| 2.3 细胞活力CCK-8 测定 |
| 2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 |
| 2.5 免疫蛋白印迹实验(Western Blot,WB) |
| 3.统计学方法 |
| 实验结果 |
| 1. 蟾酥内酯抑制A-375 黑素瘤细胞的活力 |
| 2. 不同浓度的蟾酥内酯可促进A-375 细胞的凋亡 |
| 3. 蟾酥内酯促进A-375 细胞凋亡相关蛋白的变化 |
| 4. 蟾酥内酯对A-375 细胞中自噬相关蛋白的调控 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 1. 蟾酥内酯抑制肿瘤细胞增殖 |
| 2. 蟾酥内酯诱导和促进肿瘤细胞周期阻滞和凋亡 |
| 3. 蟾酥内酯引发肿瘤细胞发生自噬 |
| 第二部分:体外实验初步研究蟾酥内酯在黑色素瘤细胞中的分子机制 |
| 材料和方法 |
| 1. 材料 |
| 1.1 实验细胞株 |
| 1.2 实验药品 |
| 1.3 实验材料 |
| 1.4 实验试剂 |
| 1.5 实验仪器 |
| 1.6 实验抗体 |
| 2. 方法 |
| 2.1 细胞培养 |
| 2.2 免疫蛋白印迹实验(Western Blot,WB) |
| 3. 统计学方法 |
| 实验结果 |
| 1.蟾酥内酯对AKT信号通路下游相关蛋白的影响 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件1.文献综述 |
| 参考文献 |
| 附件2.硕士研究生在读期间论文公开发表情况 |
（10）GFI1在肺癌发生发展中的功能及调控机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略语 |
| 前言 |
| 研究现状、成果 |
| 研究目的、方法 |
| 一、GFI1与肺癌淋巴节远端转移以及不良预后相关 |
| 1.1 材料和方法 |
| 1.1.1 实验材料 |
| 1.1.2 实验方法 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.2.1 GFI1在肺癌细胞系中异位表达 |
| 1.2.2 GFI1在人肺癌组织中异位表达 |
| 1.2.3 肺腺癌中GFI1的表达与临床病理特征的关系 |
| 1.2.4 肺腺癌临床样本中GFI1与患者OS以及DFS之间的关系 |
| 1.2.5 GFI1促进小鼠肺部成瘤 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 二、GFI1通过激活ERK磷酸化来帮助细胞逃避失巢凋亡 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 过表达GFI1能够导致细胞形态的改变以及粘附能力的降低 |
| 2.2.2 过表达GFI1能够导致细胞粘附能力的降低 |
| 2.2.3 过表达GFI1能够降低细胞之间的连接以及促进细胞体外克隆形成 |
| 2.2.4 三维培养时GFI1能够促进细胞极性消失,帮助细胞抵抗失巢凋亡 |
| 2.2.5 GFI1能够帮助细胞逃避失巢凋亡 |
| 2.2.6 过表达GFI1抑制细胞的增殖 |
| 2.2.7 过表达GFI1抑制细胞的侵袭性 |
| 2.2.8 过表达GFI1抑制细胞的迁移 |
| 2.2.9 GFI1基因表达谱变化 |
| 2.2.10 GFI1通过激活ERK磷酸化来帮助细胞逃避失巢凋亡 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 三、GFI1表达的调控机制 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 肺癌细胞系A549和H209中GFI1第三个启动子活跃 |
| 3.2.2 肺癌细胞系中GFI1染色质高级结构存在差异 |
| 3.2.3 H209中GFI1的染色质高级结构能够屏蔽上游沉默子的作用 |
| 3.2.4 DNA甲基化是GFI1表达差异机制之一 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 全文结论 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 综述 GFI1基因研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、Tumor suppressor gene PTEN affects anoikis via both PKB and FAK in human lung carcinoma cell lines（论文参考文献）
- [1]miR-876调控POSTN促进肝癌进展和纤维化的机制研究[D]. 陈凯. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [2]PAI-1通过PTEN/PI3K/AKT信号通路引起肝癌失巢凋亡抵抗的相关研究[D]. 陶鹏先. 兰州大学, 2021(09)
- [3]PC4通过FOXO1和FOXO3a降低肺腺癌对顺铂药物敏感性的机制研究[D]. 孙天宇. 中国人民解放军陆军军医大学, 2020(07)
- [4]长链非编码RNA LINC01207调控胃癌肝转移作用及机制研究[D]. 谷旭宇. 江苏大学, 2020
- [5]黄芪、莪术配伍对肿瘤细胞迁移能力及黏附作用影响探究[D]. 吴幸冬. 南京中医药大学, 2020(08)
- [6]MIST1在人类黑色素瘤中与失巢凋亡的关系作用及机制研究[D]. 李宜儒. 安徽医科大学, 2020(01)
- [7]miR-32靶向ITGA6抑制肺癌生长和转移的作用及机制研究[D]. 陈艳. 昆明医科大学, 2019
- [8]转录因子SPIB调控非小细胞肺癌细胞失巢凋亡抵抗的机制研究[D]. 张华. 天津医科大学, 2019(06)
- [9]基于AKT信号通路研究蟾酥内酯对黑色素瘤细胞的作用及其分子机制[D]. 曹小仁. 成都中医药大学, 2019(04)
- [10]GFI1在肺癌发生发展中的功能及调控机制的研究[D]. 王豪. 天津医科大学, 2017(02)