一、RT-PCR方法半定量在基因表达水平检测中的应用（论文文献综述）
韩丽娜[1]（2020）在《元帅系苹果突变体的基因组变异检测及MdWD40和Md4CL的功能验证》文中研究指明苹果是世界上主要的鲜食水果之一,而果皮颜色是决定苹果品质和商品价值的重要品质指标之一。果树芽变是果树育种的重要来源,具有选种周期短、育种进程快的特点,是种质资源创新的重要途径,而元帅系是最容易发生芽变的苹果品种,因此,对元帅系苹果突变体的基因组变异检测将为苹果芽变机理的研究提供理论基础。本试验以‘元帅’（G0）及突变体‘红星’（G1）、‘新红星’（G2）、‘康拜尔首红’（G3）和‘瓦里短枝’（G4）为材料,通过全基因组重测序（WGS）,将‘元帅’及其突变体的基因组序列进行分析,筛选出突变相关位点及基因。另外,以‘瓦里短枝’果皮为材料克隆得到花青素合成相关的基因,以期探究‘元帅’系苹果果皮的着色机理,为苹果果皮色泽的遗传改良提供理论依据。本试验的主要研究结果如下:1.G0到G4的生长特性为节间长度从G0到G4逐渐变短,除G1外,G0同G2、G3和G4间的节间长度存在显着差异;G0到G4的叶面积存在显着差异,G2到G4的叶面积显着小于G1和G0;单果重从G0到G4呈增高的趋势,G1到G4的单果重显着高于G0;果皮颜色G0和G1为条红,G2到G4为全红色,其中以G4的颜色最深为浓红色。2.‘元帅’及其四代突变体的WGS共获得189.38 Gb的有效数据,G0到G4的样本GC含量为38.19%～38.30%,大于等于20%和30%的碱基数所占百分比分别为96.77%～97.23%和92.28%～93.19%;从G0到G4中鉴定的结构变异（SVs）为56,484～66,431个,拷贝数变异（CNVs）为27,620～28,985个。对G0到G4的CNVs和SVs进行鉴定和评估,SVs的数据集中以缺失（DEL）比例最高,染色体间的转移（CTX）次之;G0、G1、G3和G4的SVs变异数最高分布在200-300bp,其次是1200bp,而G2的SVs变异数在300-400bp间分布最高。G0到G4中SVs变异数在2、3、9和15号染色体上分布最多,在16号染色体上分布最少,其中在2、3、9和15号染色体上超过4300个SVs,在16号染色体上低于2100个SVs;G0到G4中CNVs在15号染色体上的数量最多,而在16号染色体上的数量最少。3.对‘元帅’及其四代突变体的单核苷酸多态性位点（SNPs）和插入/缺失位点（InDels）进行检测和注释,从G0到G4中鉴定的SNPs为1,973,621～2,058,335个,InDels为377,275～392,815个;对G0到G4的SNPs和InDels变异位点进行分析,得到SNPs和InDels在基因间区分布最多,内含子次之,上游/下游和外显子分布最少;在G0到G4的SNPs变异中非同义变异约占外显子的54%。G0到G4中主要以C:G型转变为T:A型和T:A型转变为C:G型为主。在G0到G4的InDels变异中移码突变约占外显子的65%。G0、G1、G3和G4的SNPs变异数在11号染色体上分布最多,其次是9、2和15号染色体,而G2在15号染色体中分布最多,其次是2、11和9;G0到G4中的InDels变异数在15号染色体上有最大数量,而在G0到G4的4号染色体中检测到的SNPs和InDels变异数最少。与G0相比,从G1到G4中的移码突变InDels检测到短枝相关基因42个和花青素合成相关基因18个,其中短枝相关基因在G1中检测到4个,G2中34个,G3中10个,G4中12个,花青素合成的相关基因在G1中检测到8个,G2中14个,G3中4个,G4中6个。4.以‘瓦里短枝’果皮中提取的RNA反转录合成的cDNA为模板,PCR克隆得到MdWD40和Md4CL基因,构建了pCAMBIA1300-super::MdWD40-GFP和pCAMBIA1300-super::Md4CL-GFP的过表达载体。MdWD40和Md4CL分别编码532和458个氨基酸。生物信息学分析表明,MdWD40和Md4CL的分子量分别为31.76和51.44kDa,理论等电点分别为9.49和5.58。洋葱亚细胞定位表明,MdWD40和Md4CL定位在细胞核,属于核蛋白,与生物信息学的预测结果一致。农杆菌介导的苹果果皮瞬时表达结果表明,与空载pCAMBIA1300-super::GFP（GFP）相比,注射过表达载体的苹果果皮变红,花青素含量升高,Md WD40和Md4CL的表达量显着上调;注射孔周围果皮花青素合成相关基因F3’H、CHS、MYB1和PAL的相对表达量在MdWD40-GFP过表达载体中显着上调,而MYB1、UFGT和C4H的相对表达量在Md4CL-GFP过表达载体中显着上调。
唐亚琴[2]（2020）在《功能化探针/载体在基因检测和治疗中的应用研究》文中研究说明随着人们对精准医疗的迫切需求和对功能基因组的深入研究,基因检测和治疗被寄予了很高的期望,科学家们希望能从基因角度为人类多个领域的复杂疾病带来持久改善和治疗。非编码小RNA中miRNA和siRNA的发现给基因检测和治疗增添了具有潜力的靶标和治疗工具。然而,由于其自身不稳定和生理环境的干扰阻碍了它们的临床应用。目前,开发具有可行性的探针和载体致力于非编码小RNA在基因检测和治疗中的应用,是一种非常有前景的解决方法。本论文主要围绕miRNA和siRNA致力于功能化探针和载体的开发和应用研究,其中包括三种基于张力介导的高特异性识别探针的制备及其用于miRNA的检测研究和响应性共价交联纳米载体的制备及其用于siRNA的运输研究。（1）闭合环形探针用于细胞内miRNA检测与成像研究采用高效的无铜点击化学方法连接制备了具有较大张力的闭合环形探针。将环形探针和线性探针进行对比分析,结果表明正是由于环状结构触发的较大张力,促使探针具有高特异性识别能力,且在没有任何酶辅助和室温的条件下即可区分单碱基错配序列。更重要的是,将环形探针转入不同细胞系活细胞中,其信号强度与细胞中miRNA表达水平一致,表明环形探针可应用于活细胞中的内源性miRNA检测和成像。该研究利用环张力来提高探针的特异性识别能力,为miRNA检测和细胞内成像提供了一种新的思路。（2）双重信号放大的环形探针用于miRNA高灵敏度定量检测设计制备了一种具有高灵敏度和高选择性的miRNA检测探针,该探针通过集成闭合环形探针和两种信号放大系统（自催化DNAzyme和具有光捕获能力的阳离子共轭聚合物）制备而成。正是由于靶标miRNA激活了DNAzyme的自催化循环裂解以及共轭聚合物与小分子染料之间的荧光共振能量转移（FRET）进而引发了高信号扩增效率,使探针的灵敏度得到有效提高,可灵敏地检测出低至1.5 f M的let-7a。此外,基于环张力和粘性末端介导的链置换作用使探针具有高选择性,可以轻松地区分miRNA家族成员之间的单碱基错配差异。更重要的是,该探针可用于定量检测三种细胞系中let-7a的含量,其结果与q RT-PCR一致。因此,该双重信号放大的探针在高选择性和敏感的miRNA检测分析中具有重要意义,可成为miRNA相关疾病早期诊断的潜在候选者。（3）基于逻辑门和双重信号放大的探针用于miRNA多元灵敏检测设计并制备了灵敏的多元miRNA检测探针,该探针延续了双重信号扩增的环形探针的高特异性和高灵敏度。在Y形DNA和链霉亲和素磁珠的引入下,通过共轭聚合物与不同染料标记的底物链之间高效的荧光共振能量转移（FRET）,实现单次荧光激发的条件下多种信号同时输出。此外,通过观察以miRNA为输入的相应标记染料的发射强度来操作不同类型的逻辑门,大大简化了数据的复杂性,从而为以逻辑信号为基础特异性检测多元miRNAs提供了新的途径。更重要的是,我们成功地将探针应用于细胞裂解物中的多种miRNAs检测,结果与q RT-PCR吻合。因此,我们相信该平台具有在生物样品中同时检测多元miRNAs的巨大潜力。（4）pH响应的siRNA共价交联纳米颗粒用于小鼠急性肝损伤的治疗研究该研究提出了一种新的siRNA运输载体（PNSDS）,是一种无电荷的纳米载体,主要由多臂聚乙二醇（PEG）为骨架、带有酸敏感基团和叠氮基团的疏水链以及环辛炔修饰的siRNA和甘露糖,采用共价交联的方式制备而成。正是由于PNSDS独特的siRNA交联结构使其具有最小的细胞毒性、高的siRNA负载率以及刺激响应等特性,使载体能在细胞内特定pH条件下选择性地释放siRNA。结果表明PNSDS可以将肿瘤坏死因子α（TNF-α）siRNA运输进入巨噬细胞中,有效地诱导靶基因下调。此外,具有甘露糖靶向配体修饰的M-PNSDS可以选择性地在小鼠肝脏中累积,特异性地抑制体内TNF-α的表达,从而保护小鼠免受炎症引起的肝损害。因此,这项工作为模块化和功能化siRNA载体系统提供了新的途径,有效的提高基于RNAi疗法的治疗潜力。
苏婷[3]（2020）在《PRKAG2-AS1调控心肌细胞及内皮细胞凋亡的机制》文中提出研究背景与目的LncRNA是长度大于200个碱基的非编码RNA,它们作用广泛,主要以顺式及反式作用调控基因表达,在多种生理和病理过程中发挥重要作用。在心血管领域,LncRNA作为重要的转录调节因子,参与调节动脉粥样硬化、心力衰竭等多种心血管疾病的发生发展。人类基因中约有100,000种LncRNA,然而绝大多数LncRNA的生物学功能尚不清楚。既往研究表明LncRNA主要调控其转录位点附近基因的表达来发挥功能。我课题组于2007年报道了一个PRKAG2综合征的家系,随后对PRKAG2综合征及PRKAG2基因进行了一系列研究。前期研究发现PRKAG2基因突变将导致AMPK活性异常,进而引起心脏代谢的紊乱。PRKAG2基因启动子区存在一个LncRNA,即PRKAG2-AS1。同时,根据选择性转录起始位点不同,PRKAG2可以形成五种不同亚型。鉴于PRKAG2基因参与调控AMPK活性,而后者活性异常将导致多种心血管疾病表型,加之LncRNA可以调控邻近基因的表达,由此我们提出科学问题,PRKAG2-AS1是否可作为调控元件参与PRKAG2基因剪接水平的基因调控,从而调节细胞生物学功能,并参与调控心肌及内皮细胞凋亡。我们推测PRKAG2-AS1可能作为脚手架来募集转录因子,在PRKAG2多种亚型选择性转录起始过程发挥重要功能,实现选择性转录起始。不同的PRKAG2亚型功能可能发挥不同生物学功能,从而导致心血管疾病。本课题选择PRKAG2-AS1作为研究对象,观察在心肌缺氧模型及内皮细胞凋亡模型中PRKAG2-AS1、PRKAG2b、d亚型表达水平改变,并进一步对PRKAG2-AS1、PRKAG2b、d亚型的生物学功能及其相互作用关系进行了探索研究。这将有助于我们深入理解PRKAG2-AS1及PRKAG2多种亚型对心血管疾病的影响,从而为精准医学治疗提供更精确的作用靶点。第一部分PRKAG2-AS1参与调控心肌细胞凋亡研究方法:1.通过NCBI网站检索,对PRKAG2基因进行生物信息学在线分析。2.选用人心肌细胞系AC16为主要研究对象,使用RNA核质分提,q RT-PCR的方法检测PRKAG2-AS1在心肌细胞中的表达模式。3.琼脂糖凝胶电泳的方法检测PRKAG2五种亚型在AC16、HUVEC、HCAEC、293T四种细胞系中的表达模式。4.PRKAG2-AS1参与调控心肌细胞凋亡的可能机制:（1）AC16置于1%O2孵箱中培养12h,构建心肌缺氧损伤模型。使用Annexin V-FITC/PI流式细胞学检测模型中细胞凋亡,q RT-PCR检测模型中SOD以及PRKAG2-AS1、PRKAG2b、d亚型的表达水平。（2）分别使用si RNA、反义寡核苷酸技术,敲低细胞中PRKAG2-AS1的表达,q RT-PCR验证敲减效率,并检测心肌细胞中PRKAG2b、d亚型、SOD以及心衰标志物m RNA表达水平,使用Annexin V-FITC/PI流式细胞学检测细胞凋亡,Western blot检测AMPKγ2蛋白表达水平。（3）特异性si RNA分别敲低细胞中PRKAG2b、d表达,q RT-PCR的方法验证敲减效率,并检测SOD及心衰标志物的表达水平,使用Annexin V-FITC/PI流式细胞学检测心肌细胞凋亡情况。结果:1.PRKAG2基因启动子处存在一个LncRNA,即PRKAG2-AS1,根据不同的转录起始位点,PRKAG2可产生a、b、c、d、e五种不同亚型。2.PRKAG2-AS1在心肌细胞胞质及胞核中均有表达,且主要在胞核中表达。3.PRKAG2五种亚型中以PRKAG2b、PRKAG2d表达水平相对最高。4.相对于常氧对照组,缺氧12h心肌细胞Annexin V+/PI+及Annexin V+/PI-染色细胞增多（p<0.05）,SOD1、SOD3、ANP及MYH6表达水平降低（p<0.05）,PRKAG2-AS1及PRKAG2b、PRKAG2d两种亚型的表达水平均明显降低（p<0.05）。相对于NC对照组,使用特异性si RNA及反义寡核苷酸的方法能够有效降低心肌细胞中PRKAG2-AS1表达水平（p<0.05）。si RNA敲低胞质PRKAG2-AS1组较NC对照组,Annexin V+/PI-染色细胞增多（p<0.05）,下调SOD1表达水平并上调SOD2及SOD3表达水平（p<0.05）,同时能够降低AMPKγ2蛋白表达水平,但对ANP、BNP、MYH7、MYH6以及PRKAG2b、d亚型基因表达水平无明显影响。而oligo敲低胞核PRKAG2-AS1后,相对于NC对照组,Annexin V+/PI-及Annexin V+/PI+染色细胞增多（p<0.05）,SOD1、SOD3表达水平降低（p<0.05）,并能够显着降低MYH6表达水平,升高BNP表达水平（p<0.05）,降低AMPKγ2蛋白表达水平。此外,还能够降低PRKAG2d表达水平（p<0.01）,但对PRKAG2b表达水平无明显改变。通过引入PRKAG2b、d特异性si RNA,较NC对照组,能够分别有效降低心肌细胞中PRKAG2b、d亚型的表达水平（p<0.05）。敲低PRKAG2b及PRKAG2d相对于NC对照组,均可导致MYH6、MYH7表达水平降低,但对ANP、BNP及SOD的表达水平无明显改变,同时未见明显心肌细胞凋亡。结论:1.PRKAG2-AS1在心肌细胞质胞核中均有表达,且胞核居多。胞核和胞质中的PRKAG2-AS1可能具有不同的功能,能够通过不同的机制影响心肌SOD、心衰标志物的表达水平。2.胞核内的PRKAG2-AS1可能在心肌细胞凋亡中直接调控PRKAG2d的表达,参与细胞凋亡过程。3.PRKAG2存在五种亚型,其中PRKAG2b及d两种亚型表达相对较多。4.胞核中PRKAG2-AS1可能参与了PRKAG2d的选择性转录起始。5.除了PRKAG2b、d亚型,PRKAG2-AS1可能在心肌缺氧诱发的细胞凋亡中,还通过调控其它基因的表达来发挥生物学功能。第二部分PRKAG2-AS1参与调控内皮细胞凋亡研究方法:1.选用人脐静脉内皮细胞系HUVEC为主要研究对象,使用RNA核质分提进一步q RT-PCR的方法及RNA原位杂交技术检测PRKAG2-AS1在内皮细胞中的表达模式。2.使用ox-LDL处理内皮细胞24小时以构建内皮细胞凋亡模型,q RT-PCR检测内皮细胞凋亡模型中炎性因子IL-6、IL-10 m RNA表达水平3.PRKAG2-AS1的生物学功能研究:（1）使用q RT-PCR检测内皮细胞凋亡模型中PRKAG2-AS1及PRKAG2b、d亚型表达水平;（2）使用si RNA及反义寡核苷酸,敲低细胞PRKAG2-AS1的表达,并使用RNA核质分提的方法分别验证敲减效果;（3）利用CCK-8法检测细胞增殖、细胞划痕检测细胞迁移能力、小管形成实验检测细胞成管能力、TUNEL以及Annexin V-FITC/PI流式细胞学检测细胞凋亡,以检测PRKAG2-AS1对内皮细胞功能的影响;（4）通过q RT-PCR方法检测敲低胞核内PRKAG2-AS1及PRKAG2b、d亚型表达后内皮细胞中炎性因子及凋亡相关因子的表达水平,蛋白免疫印迹法检测进一步验证敲低胞核内PRKAG2-AS1增殖及凋亡相关蛋白的表达;（5）腺病毒过表达PRKAG2-AS1后,细胞RNA核质分提及q RT-PCR法验证过表达效率,并检测细胞PRKAG2b和PRKAG2d基因的表达水平;4.PRKAG2b、d亚型的生物学功能研究:特异性si RNA分别敲低PRKAG2b、PRKAG2d,通过q RT-PCR方式验证敲减效率,并检测炎症相关因子IL-6及IL-10m RNA表达水平;5.选用CHIRP方法,进一步验证PRKAG2-AS1与b、d亚型的关系。结果:1.PRKAG2-AS1在内皮细胞胞质胞核中均有分布,且核内居多。2.相对于对照组,内皮细胞凋亡模型中IL-6及IL-10表达水平均升高（p<0.05）,PRKAG2-AS1表达水平降低（p<0.05）,PRKAG2d基因表达水平升高（p<0.05）,而PRKAG2b基因表达无明显变化。3.特异性si RNA主要降低了胞质中PRKAG2-AS1的表达水平,而oligo主要降低了其在胞核中的表达。4.CCK8法检测细胞增殖能力,结果提示相对于NC对照组,随观察时间的延长,敲低胞核内PRKAG2-AS1组细胞OD值增长明显缓慢。划痕实验通过镜下观察及Imaje J软件统计分析,发现敲低核内PRKAG2-AS1组划痕12h及24h后,划痕间距显着高于NC对照组（p<0.01）。小管形成实验,通过观察光学显微镜下发现NC对照组广泛连接成小管,而敲低细胞核内PRKAG2-AS1组细胞散在分布,未见管腔形成。进一步通过Imaje J软件分析,发现敲低核内PRKAG2-AS1组节点数、交叉点数、网眼数均显着低于NC对照组（p<0.01）。TUNEL试剂盒检测细胞凋亡,结果表明相对于NC对照组,敲低细胞核内PRKAG2-AS1组细胞凋亡明显增加,Annexin V-FITC/PI染色流式细胞学检测细胞凋亡,结果显示oligo敲低PRKAG2-AS1组较NC对照组,Annexin V+/PI-、Annexin V+/PI+染色细胞明显增多,（p<0.01）。这些结果提示敲低核内PRKAG2-AS1显着抑制内皮细胞的增殖、迁移及小管形成能力,并促进内皮细胞凋亡,尤其是早期及晚期细胞凋亡。5.敲低胞质中PRKAG2-AS1相对于对照组,细胞中IL-6表达水平升高,IL-10表达水平降低（p<0.05）,而CRP、MCP1表达水平无明显变化。凋亡相关因子BCL2、Caspase3 m RNA表达水平无明显改变;而敲低胞核中的PRKAG2-AS1相对于对照组,IL-6、IL-10、CRP及MCP1表达水平均显着升高（p<0.05）相对于对照组,凋亡相关因子BCL2 m RNA表达水平升高（p<0.05）,同时,BAL2及Cleaved-Caspase3蛋白表达水平均升高,PCNA的蛋白表达水平降低。此外,敲低胞质及细胞核内PRKAG2-AS1均可导致PRKAG2d亚型表达降低（p<0.05）,而PRKAG2b亚型表达改变无统计学意义。6.相对于GFP对照组,转染特异性腺病毒后,细胞内PRKAG2-AS1表达明显升高（p<0.05）,且主要使得胞核中PRKAG2-AS1表达水平升高。相对于对照组,腺病毒过表达PRKAG2-AS1后PRKAG2d表达水平升高。7.敲低PRKAG2d后,相对于NC组,IL-6表达水平降低,而IL-10表达上调（p<0.05）。而敲低PRKAG2b相对于NC组,IL-6及IL-10基因表达水平无明显改变。8.CHIRP结果提示,加入了特异性生物素标记的probe组PRKAG2d基因表达量明显多于较未加入探针的ctl组,这一趋势与PRKAG2-AS1的表达模式相同。而PRKAG2-b表达模式与之相反。提示PRKAG2-AS1与PRKAG2d相互作用。结论:1.PRKAG2-AS1在内皮细胞胞质胞核中均有表达,且胞核居多。胞核和胞质中的PRKAG2-AS1可能具有不同的功能,能够通过不同的机制影响内皮细胞中炎性因子的表达。2.胞核内的PRKAG2-AS1能够促进内皮细胞增殖、迁移及成管能力,抑制内皮细胞凋亡。3.PRKAG2-AS1可能在内皮细胞凋亡中直接调控PRKAG2d的表达,参与细胞凋亡过程。4.胞核中PRKAG2-AS1可能参与了PRKAG2d的选择性转录起始。全文总结1、PRKAG2-AS1在心肌及内皮细胞胞质胞核中均有表达,且胞核居多。胞核和胞质中的PRKAG2-AS1可能具有不同的功能,能够通过不同的机制影响心肌SOD、心衰标志物的表达以及内皮细胞中炎性因子的表达。2、胞核内的PRKAG2-AS1可能在缺氧诱发的心肌细胞凋亡及ox-LDL诱发的内皮细胞凋亡中直接调控PRKAG2d的表达,参与细胞凋亡过程。3、PRKAG2存在5种亚型,其中PRKAG2b及d两种亚型表达相对较多。4、胞核中PRKAG2-AS1可能参与了PRKAG2d的选择性转录起始。5、除了PRKAG2 d亚型,PRKAG2-AS1可能在心肌细胞凋亡及内皮细胞凋亡中,可能还通过调控其它基因的表达来发挥生物学功能。
田萍[4]（2020）在《CBX7通过ITGβ3/TGFβ1/AKT信号通路在宫颈癌进展中的作用机制研究》文中研究说明目的:探讨色素框同源物7（CBX7）在宫颈癌中的作用,对化疗药物敏感性的影响,论证CBX7通过整合素β3（ITGβ3）/转化生长因子β1（TGFβ1）/蛋白激酶B（AKT）信号通路干扰宫颈癌上皮间质转化（EMT）的发生、宫颈癌的进展和化疗药物治疗的敏感性。方法:免疫组织化学法（IHC）检测人宫颈癌组织中CBX7及肿瘤相关基因ITGβ3、TGFβ1、磷酸化磷酯酰肌醇-3激酶（PI3K）、AKT、上皮细胞钙粘蛋白（E-cad）和波形蛋白（VIM）,回顾性收集患者临床病理信息。分析CBX7和肿瘤相关基因在癌组织与癌旁非瘤组织中表达的差异;分析CBX7与临床病理参数、肿瘤相关基因的关系;采用生存分析,评价CBX7表达对宫颈癌患者生存的影响。利用Lentivirus载体系统转染He La、Si Ha细胞,构建CBX7过表达和下调的稳定转染细胞系。将稳定转染Si Ha细胞暴露于顺铂,应用敲低CBX7 Si Ha（si CBX7 Si Ha）细胞建立移植瘤模型。采用MTT、克隆形成实验方法检测细胞生长情况;伤口愈合实验、Transwell侵袭实验检测细胞的迁移和侵袭情况;流式细胞仪技术检测细胞凋亡情况;检测转染不同水平CBX7细胞的成瘤率、移植瘤体积及重量;IHC、实时定量聚合酶链反应（q RT-PCR）检测移植瘤模型中CBX7及肿瘤相关基因的表达水平。利用RNAi的方法下调稳定转染细胞株中TGFβ1表达,抑制ITGβ3/TGFβ1轴;将稳定转染Si Ha细胞暴露顺铂,检测上述细胞生长、侵袭能力和凋亡情况;检测转染与未转染sh RNA TGFβ1细胞中,暴露与未暴露顺铂中CBX7及肿瘤相关基因的m RNA和蛋白的表达变化。结果:（1）CBX7的表达水平与临床分期、淋巴结转移,脉管浸润显着负相关,并随着组织分化的消除而表达下降;（2）CBX7与宫颈癌生存率呈正相关;（3）IHC检测CBX7在宫颈癌组织中阳性表达率低于癌旁非瘤组织并与ITGβ3、TGFβ1、PI3K、AKT、p-AKT和VIM负相关,与E-cad正相关;（4）稳定转染细胞的生物学行为检测,敲低CBX7促进了宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭能力,凋亡能力明显减弱;上调CBX7提高了顺铂对Si Ha细胞的增殖抑制和凋亡作用;敲低CBX7提高了裸鼠成瘤率,增加了移植瘤模型的体积和体重;（5）IHC分析移植瘤组织结果显示,CBX7、E-cad在si CBX7组阳性表达率低于对照组;VIM高于对照组;ITGβ3、TGFβ1在si CBX7组阳性表达水平高于对照组;（6）移植瘤中ITGβ3、TGFβ1、PI3K和AKT m RNA高于对照组;（7）沉默TGFβ1的细胞生物学行为检测,沉默TGFβ1消弱了si CBX7对细胞增殖的促进作用和对凋亡的抑制作用;（8）敲低CBX7升高了ITGβ3、TGFβ1、PI3K、AKT、VIM m RNA和蛋白等表达,降低了E-cad表达;采用sh RNA TGFβ1转染逆转了si CBX7对ITGβ3、TGFβ1、PI3K、AKT、VIM m RNA和蛋白的升高,抑制了对E-cad的降低;（9）Si Ha细胞暴露于顺铂,过表达CBX7调低了ITGβ3/TGFβ1信号通路及VIM的m RNA和蛋白表达,升高了E-cad的表达。结论:CBX7在人宫颈癌组织中表达降低,CBX7是宫颈癌预后的预测因子之一;CBX7的低表达可促进宫颈癌细胞生长、迁移和侵袭,抑制凋亡,CBX7过表达提高了宫颈癌细胞对化疗药物顺铂的敏感性;si CBX7调控ITGβ3/TGFβ1轴调节宫颈癌EMT的发生,沉默TGFβ1,可以部分逆转宫颈癌细胞EMT表征;CBX7通过ITGβ3/TGFβ1轴调节PI3K/AKT信号通路影响EMT的发生和化疗药物敏感性;证明CBX7在宫颈癌中是抑癌基因,可能是治疗宫颈癌的一个潜在因子,通过CBX7抑制ITGβ3/TGFβ1信号通路可能成为提高宫颈癌疗效的一种新的治疗途径。
陈丽园[5]（2019）在《红花玉兰APETATAL1和AGAMOUS-LIKE 6同源基因克隆和功能研究》文中认为红花玉兰（Magnolia wufengensis）属木兰科（Magnoliaceae）木兰属（Magnolia）,其种内具有丰富的花色、花型及花被片数目等自然变异,使其成为研究被子植物花器官形态建成和发育演变的理想材料。经典花发育ABCDE模型中AP1是决定外侧花器官特征的MADS-box基因,但已有对基部被子植物和基部双子叶植物中AGL6同源基因表达模式研究推测AGL6同源基因可能具有A类基因功能。为此本文对红花玉兰中APETATAL1-like和AGAMOUS-LIKE 6-like 基因及AP1/SEP/AGL6亚族成员进行同源克隆,分析其表达模式和验证其功能,并研究其蛋白相互作用,以揭示红花玉兰AP1和AGL6同源基因在花被片发育中的作用。主要研究结果如下:1、红花玉兰AP1同源基因的克隆与功能分析红花玉兰仅有一个AP1-like基因,具有FUL motif和paleoAP1 motif结构域,在系统进化树上与木兰类植物FUL同源基因聚类在一起。半定量分析表明MawuAP1在叶片和各轮花器官中均有表达;实时定量结果表明MawuAP1在苞片中表达水平较高,花器官中除心皮外,由外向内表达水平逐渐降低;对转基因拟南芥的表型分析表明MawuAP1能够促进开花和心皮发育,但没有拟南芥AP1决定外侧花器官的功能。2、红花玉兰AGL6同源基因克隆与功能分析（1）红花玉兰AGL6同源基因克隆与系统进化分析从红花玉兰花芽中克隆得到MawuAGL61和MawuAGL62,其编码区碱基相似度81.0%,氨基酸序列相似度81.1%,C区具有AGL6 motif Ⅰ和AGL6 motifⅡ结构域。构建种子植物AGL6-like基因系统进化树并结合其组织表达特异性发现,MawuAGL61/2是最近一次木兰类植物中基因重复事件的产物。（2）MawuAGL61/2表达模式分析半定量结果表明MawuAGL61在花器官中均有表达,MawuAGL62在雄蕊中不表达;实时定量分析表明MawuAGL61/2在花器官发生和花芽快速生长期的花被片中均高水平表达,MawuAGL62在花被片中自外而内表达水平逐渐降低。这一结果表明MawuAGL62参与决定花被片形态发生发育。（3）MawuAGL61/2 功能分析转基因MawuAGL61/2野生型拟南芥出现早花,MawuAGL61使顶生花早现,并在其第一、二轮花器官之间产生外侧花器官残缺的次生花,表明其具有促进开花和决定花原基的功能,MawuAGL62增加花瓣数,表明其参与决定花瓣特征;转基因MawuAGL61/2的ap1-10突变体也早花,MawuAGL61使顶生花早现并出现同样的次生花、花瓣状雄蕊、增加叶状器官,表明其具有决定花瓣和萼片的功能,MawuAGL62恢复ap1-10突变体的花瓣和萼片,表明其参与决定花瓣和萼片发育。二者均有A类基因功能。3、MawuAGL61/2与红花玉兰B、C、E类基因相互作用分析（1）红花玉兰MADS-box基因表达模式分析实时定量分析MawuAGL61/2与B、C、E类基因在红花玉兰及其多瓣红花玉兰花器官中表达模式表明,苞片中仅MawuAP1高水平表达;M MawuAP31/2和MawuPI在花被中自外而内表达水平逐渐降低;雄蕊中MawuAGL61/2表达水平极低。为此推测MawuAGL61/2、MawuAP31/2和MawuPI1共同决定花被片发育。（2）红花玉兰MADS-box蛋白相互作用酵母双杂结果表明MawuAP1与红花玉兰AGL6-like、AP1-like和SEP-like有相互作用;MawuAGL61/2与红花玉兰和拟南芥AGL6-like、SEP-like及自身均有相互作用,而MawuAGL62还与AP1-like有相互作用;它们与B类基因均没表现相互作用;酵母三杂结果表明MawuAGL62与AtSEP3、AtAP3有相互作用,通过形成四聚体以决定花瓣特征。
段学清[6]（2019）在《玉米Ac/Ds转座体系的构建及二穗短柄草BdSOC1-like基因功能的初步分析》文中进行了进一步梳理玉米（Zea mays L.）作为世界上分布最广泛的作物之一,其用途广泛,不仅可以作为人类口粮,还可以作为牲畜饲料及工业生产原料。由于居民饮食结构中肉类的比例逐渐上升,极大地促进了养殖业的发展。随着养殖业的快速发展,对饲料的需求逐年攀升。玉米还可用于工业原料,生产淀粉,氨基酸和乙醇等,这带动了玉米种植面积和总产量的稳步上升。然而在世界范围内玉米需求仍在持续增长,但供给情况并不乐观。因此积极展开玉米的分子遗传学研究,为玉米遗传育种工作提供材料和基因资源,就显得十分必要和迫切。然而玉米的分子遗传学研究离不开转基因和大量的突变体材料。另外玉米的株型较大不适合大规模温室生长,生长周期较长等特点限制了玉米基因功能研究的发展。二穗短柄草（Brachypodium distachyon L.）与大麦,小麦,玉米等禾本科作物亲缘关系较近,它们都是单子叶植物,另外二穗短柄草的基因组小,生长周期短,生长条件也简单及自花授粉等特点使其成为了研究禾本科单子叶植物的模式材料。为了更好地开展玉米功能基因组学研究,本文致力于建立高效,可重复的玉米遗传转化体系和Ac/Ds标签突变体库,创造大量突变体材料,为玉米基因的发掘,功能注释及其分子机理研究奠定基础和提供材料;同时我们也对相关突变体及其相关基因在二穗短柄草中的功能做初步分析,为各物种间基因功能的分子及进化关系研究提供思路。玉米遗传转化体系的建立（1）基因枪介导的玉米遗传转化在玉米遗传转化研究工作中,人们通常使用未成熟胚或其胚性愈伤组织作为转化受体,抗生素或除草剂筛选产生抗性愈伤组织和抗性芽。玉米的抗性愈伤组织和抗性芽中往往会存在比例不等的假阳性现象,显着地增加了组织培养和后期分子鉴定的工作量。利用GFP（Green Fluorescence Protein）绿色荧光蛋白基因作为辅助性筛选标记基因,基因枪法轰击了玉米自交系A188和Qi319未成熟胚的胚性愈伤组织。瞬时表达实验结果表明,轰击后GFP表达可持续近3w,轰击后10d左右表达量仍保持在较高的水平。采用潮霉素筛选,GFP荧光法鉴定,获得了一批玉米转基因植株,转化频率0.3-0.5%。分子鉴定和后代分析的结果表明,外源基因已经整合到了玉米基因组中并能够稳定地表达和遗传。这一工作揭示了GFP作为辅助性筛选标记基因可以直观、快速和有效地消除玉米遗传转化工作中的假阳性现象。（2）农杆菌介导的玉米遗传转化在以未成熟胚为受体,农杆菌介导的玉米遗传转化研究中,MS或N6共培养基（MC）常常被用来培养侵染后的玉米未成熟胚。在这里,我们描述了一种新的共培养方法—干滤纸共培养法（农杆菌侵染后的玉米未成熟胚放置于垫有两张干滤纸的培养皿中培养,DC）,同时我们以来源于Qi319玉米自交系的未成熟胚为受体,通过农杆菌介导玉米的遗传转化。为了检测这两种共培养法（MC和DC）对玉米转化效率的影响,我们设计了三组实验:（1）使用AGL1菌株分别携带两种独立的质粒（pXQD12和pXQD70）侵染玉米9-15d的未成熟胚;（2）使用两个不同菌株（AGL1和EHA105）携带同一载体（pXQD12）分别侵染玉米9-15d的未成熟胚;（3）用携带（pXQD12或pXQD70）质粒的（AGL1或EH105）菌株分别侵染玉米9-15d的未成熟胚,侵染不同时间（5min,10min,15min,20min和25min）。然后,侵染过的未成熟胚分别放置于仅垫有两张滤纸的培养皿或MS共培养基上进行培养,余下转化过程同普通的转化过程一样。结果显示,和MC相比,侵染后8d（3d共培养,5d天恢复培养）对愈伤组织在体视镜下进行GFP观察,%GFP+愈伤组织（GFP+愈伤组织占所侵染的未成熟胚的百分率）增加约2-3倍。另外,与MC相比,DC的平均再生效率（%GFP+再生的愈伤组织占所侵染的未成熟胚的百分率）和稳定转化效率（%GFP+植株占所侵染的未成熟胚的百分率）也显着提高。总之,DC共培养法也许能用于发展一种更为有效的农杆菌介导的玉米遗传转化。玉米Ac/Ds标签突变体库的构建与分析玉米是一个对C4植物进行分子和农艺研究的模式材料。本项研究利用转座子标签载体—激活（Ac）/解离（Ds）-ATagubiGFP在玉米Qi319中产生插入标签和敲除型突变体。该载体携带新霉素磷酸转移酶基因（NPTII）,绿色荧光蛋白（GFP）基因和由35S启动子启动的玉米转座酶（TPase）基因。利用该载体转化玉米产生了4个外源Ds（foreign Ds,fDs）发生转座的T0转基因系。在T0和T1代时,将转基因与野生型杂交,共获得12,514个单株。使用绿色荧光蛋白（GFP）和多重聚合酶链反应（PCR）筛选该群体。通过热不对称交错PCR（TAIL-PCR）或反向PCR（iPCR）鉴定fDs-ATag元件转座位置的边界,并将得到的产物序列与最近报导的玉米基因组进行比对。到目前为止,我们已经获得在10条玉米染色体都有分布的154个独立的仅fDs转座群体。这些群体已经以种子的形式在种子库中保存下来,这样人们可以通过对在线数据库进行访问,为商业玉米品种背景下的基因功能分析和育种提供了独特的资源。二穗短柄草BdSOC1-like基因功能的初步研究在上述Ac/Ds突变体库中,我们发现了一个可能由于fD插入造成的晚花突变体。经过分子及生物信息学分析,该突变体中fDs插入到基因号为NP001105152的玉米基因的第一个外显子上且该基因与二穗短柄草BdSOC1-like基因同源。由于玉米生长周期较长,株型较大不适合温室大规模生长等特点,为了能快速的研究上述基因号为NP001105152的玉米基因的功能,同时也想看看温带禾本科植物中该同源基因的功能,我们使用与小麦和水稻亲缘关系较近且生长周期较短的模式植物二穗短柄草Bd21为研究材料,对BdSOC1-like的功能进行初步分析。生物信息学分析显示该BdSOC1-like具有SOC1家族所特有的MADS-box和kerati（k）结构域。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果暗示了,BdSOC1-like基因在植物根、茎、幼叶、老叶、顶端分生组织和花中都有表达,在长日照（LD,18h light/6h dark）或短日照（SD,10h light/14h dark）条件下,BdSOC1-like的mRNA积累并没有昼夜节律性以及BdSOC1-like的表达也对持续的冷处理没有记忆性。另外在二穗短柄草中超表达BdSOC1-like不但引起了植物提前开花,也导致了较弱的种子表型。总的来说,以上结果暗示了,在二穗短柄草中,BdSOC1-like在植物的成花转变中也许扮演着重要的角色。总之,本研究改进了玉米遗传转化方法,建立了Ac/Ds转座体系,并对玉米在短柄草中的一个与花期相关的同源基因进行了功能分析,获得了3方面的创新性结果:（1）在基因枪转化中建立了一种GFP标签鉴定方法,使转基因后代鉴定更快速便捷。在农杆菌转化中建立了干滤纸共培养法,使转化效率大幅度提高;（2）建立了玉米Ac/Ds转座系统,获得了转座位点分布在10条染色体上的154个fDs转座系;（3）发现一个晚花突变体,分析了突变基因,进而在短柄草基因组中找到了同源基因BdSOC1-like,并利用转基因方法进行了功能验证。
邬旭龙[7]（2019）在《猪病毒性疫病高通量检测方法的建立和应用及NADC30-like PRRSV与ASFV的监测研究》文中认为我国养猪业正在向规模化和智能化的养殖模式蓬勃发展,养殖规模与管理水平的不对称,使得猪病种类越来越多,病程复杂程度不断加剧,多种疫病的混合感染越来越严重,给临床诊断和治疗带来了困难,严重制约了我国养猪业的发展。许多散户和微型养猪场,尤其是以生活产生的餐厨垃圾作饲料饲喂的猪场,因其饲养管理和疫病防控能力差,导致各种疾病的发生,使猪场对疾病的预防和控制越来越困难。加之我国养猪现状中生猪调运,生物安全防控不到位等因素,加剧了各种病原体在猪场间的传播。多种疾病的感染严重影响猪群健康水平和生物安全体系,而加大了新发动物疫病和重大外来疫病对猪场的威胁。本研究通过建立两种高效、灵敏、自动化的高通量检测方法,对不同养殖场进行病毒性病原分子流行病学调查,并分析了不同养猪场对疾病的有效防控能力,以及新发和外来动物疫病的感染风险,进一步对新发和外来动物疫病猪繁殖与呼吸综合征NADC30-like毒株（NADC30-like PRRSV）和非洲猪瘟（ASF）进行检测和病毒实时监控,主要结果如下:（1）建立了一种毛细管电泳的猪病毒性疫病高通量检测方法,能有效同时对9种猪病原体进行检测,包括PRV、CSFV、FMDV、JEV、PCV2、PRRSV、PEDV、TGEV和PPV,该方法同时检测到9种病毒的最低检测限度为104 copies/μL,具有较高的检测灵敏度,同时具有较好的特异性和重复性。通过对2015-2017年间采集的178份临床样品进行检测,发现病原体感染情况较为严重,特别是多重混合感染情况较为复杂,样品阳性检出率为49.44%,在检出的病毒性疾病中,PRV、PRRSV、PCV2、PEDV所占比例较高,以PCV2和PRRSV混合感染极为严重。因此提高猪场饲养管理水平,建立有效的疾病防治措施显得尤为重要。（2）基于靶序列富集多重PCR（TEM-PCR）技术和液相芯片系统,建立一种同时检测上述9种猪病毒性疫病的高通量检测方法,通过对该方法检测性能的优化和验证,以及临床样品应用及比较,该方法较毛细管电泳检测方法具有更高的灵敏度,能同时检测到9种病毒的最低检测限度为103 copies/μL,特异性和重复性较好。临床样品检测结果与毛细管电泳检测结果高度一致,为猪病高通量的临床鉴别诊断提供一种有力的技术支撑,同时为先进的检测技术应用于兽医临床诊断提供参考。（3）利用建立的两种高通量检测方法,对三种不同类型养猪场采集的341份临床样品进行检测和病原分子流行病学调查研究。根据病原检测结果,初步分析了不同猪场对疾病的有效防控能力,进而推测猪场对新发和外来动物疫病的防控能力及感染易感性。结果显示四川地区养猪场病原阳性检出率均较高,普遍存在多病原混合感染的情况,且较为严重,特别是微型养猪场,其病原感染情况最为严重。进一步通过鉴别诊断方法对近年来国内的新发动物疫病NADC30-like PRRSV进行临床的监测研究,结果可知341份临床样品ADC30-like PRRSV阳性检出率为21.41%,其中微型养猪场的阳性检出率最高,为45.90%,其次为中小型养猪场,阳性检出率为22.03%,最低为规模化养猪场,阳性检出率为11.73%。猪场应进一步完善生物安全措施,做好猪群的饲养管理,结合现有疫苗控制,降低猪场感染的可能。（4）原核表达ASFV pK205R重组蛋白,并进行蛋白纯化和验证。以pK205R为包被抗原,建立一种快速的ASFV间接ELISA抗体检测方法,同时建立了高检测灵敏度的ASFV ddPCR核酸检测方法。分别对2015-2017年间采集的474份样品进行检测,该方法在我国边境及口岸入境动物检验检疫中开展临床示范,同时对四川地区不同养猪场ASFV进行实时监控,检测结果均为阴性,表明在本研究中并未发现ASFV的感染。本研究为国内ASFV的实时监控提供数据参考,同时也为ASFV的检验检疫提供可靠的技术储备。
贾杨彦圣[8]（2019）在《探究Slc5a8在小鼠眼角膜上皮表达的时空分布》文中研究表明角膜缘干细胞（Limbal stem cells,LSCs）存在于角膜缘区域。在个体发育过程中,LSCs向心移行并分化为成熟角膜上皮细胞。据此,可以作为LSCs和成熟角膜上皮细胞的鉴定和定位的理论基础。小鼠是重要的模式动物之一,但关于小鼠角膜缘细胞基因差异性表达的研究尚未见相关报道。本课题结合分子生物学技术和高通量组学技术探究小鼠眼角膜不同区域的差异表达,加深人们对于小鼠眼角膜细胞基因差异性表达的认知。SLC5A8是钠偶联的单羧酸转运蛋白（也称为SMCT1）参与乳酸和短链脂肪酸的运载,这一运载体不仅可以在卵细胞中表达,在其他体细胞中也同样表达。我们推测在小鼠角膜也会表达。本研究利用HE染色、免疫组化染色进行小鼠眼角膜形态学观察,界定角膜缘区域。在此基础上,通过获取角膜缘组织并将角膜缘区域根据冠状面象限分为上（Superior,S）、下（Inferior,I）、鼻（Nasal,N）、颞（Temporal,T）四个组,以中央角膜区域和结膜区域作为对照组进行转录组测序（RNA-seq）。然后对测序结果进行差异分析、GO注释和KEGG通路分析。通过差异分析获得细胞基因差异性表达的概况,筛选出有研究意义的差异基因并探究其在小鼠眼角膜中不同水平的差异性表达。我们成功地对小鼠角膜缘区域进行了准确界定。18个样品的RNA-seq测序质量均符合公认的要求（Q20≥95%、Q30≥85%）,其中,Q20最小值为95.79%,Q30最小值88.71%,clean reads ratio最小值为94.89%。差异分析结果显示Slc5a8在各实验组中差异表达,因此,进一步通过qRT-PCR和Western Blotting对其进行定量和半定量检测,并利用单分子RNA原位检测和免疫组化分别探究其在转录水平和蛋白水平的空间分布情况。qRT-PCR和单分子RNA原位检测结果显示Slc5a8在转录水平主要高表达于角膜缘上皮区域,Western Blotting和免疫组化结果显示SLC5A8在蛋白水平却主要高表达于中央角膜上皮区域。这种表达反差提示Slc5a8基因在转录水平可作为LSCs候选标志物,在蛋白水平可作为角膜上皮细胞候选标志物。
杨俊[9]（2018）在《OsCaM1-1和OsCML16调控水稻耐逆性机制的研究》文中进行了进一步梳理Ca2+是植物生长发育所必需的一种矿质元素,也是植物细胞中最重要的第二信使之一。研究表明,植物遭受非生物逆境胁迫时,细胞内Ca2+浓度瞬间增加,在时空、振幅以及频率上发生特异变化,产生Ca2+指纹信号（calcium signature）。Ca2+信号被细胞内Ca2+感受器蛋白（CaMs/CMLs、CDPKs、CBLs/CIPKs）识别、解码,并将其传递,从而诱导下响应基因的表达,引起植物体内一系列的生理生化变化。最后,使植物适应外界逆境。目前,已发现CaMs/CMLs蛋白家族参与了植物生长发育和耐非生物逆境（冷害、热害、干旱与盐害）中的调控功能。因此,有必要阐明这些蛋白在植物非生物逆境信号转导中的调控机制,为增强植物耐逆性提供理论依据。水稻是我国三大粮食作物之一,也是一种起源于热带亚热带、对盐害中度敏感和冷胁迫敏感的喜温型禾本科作物。盐害和低温是影响水稻生长发育、产量和品质的主要非生生物逆境因子。开展水稻耐盐性和耐冷性信号传导途径相关基因的挖掘与功能鉴定,探讨水稻耐盐性和抗冷性的分子生理和遗传机制,对从生理、栽培和分子育种途径提高水稻的耐盐性和耐冷害具有重要的理论和应用意义。本论文主要分为以下两部分:第一部分,研究了水稻钙调素OsCaM1（rice calmodulin 1）在水稻耐盐性中的功能和调控机制,提出了一条参与水稻盐胁迫信号转导OsCaM1-OsCCaMK-OsMKK1/6途径。通过真核生物中的CaM氨基酸序列比对,发现了4个保守的磷酸化位点T80、S82、S102和T118。EMSA和蛋白互作实验证明,S102和T118影响了OsCaM1在体外与Ca2+的结合,但不影响OsCaM1与靶蛋白OsCCaMK在体内外条件下的互作;酵母双杂交和BiFC均证实,OsCCaMK分别与OsMKK1和OsMKK6特异性互作;体外磷酸化实验证明,OsMKK1可以磷酸化OsCCaMK,而OsCCaMK可以磷酸化OsMKK6。因此,水稻可能存在一条OsCaM1-OsCCaMK-OsMKK1/6途径。qRT-PCR分析表明,Ca2+信号和MAPK信号途径在响应ABA信号中存在“交谈”,Ca2+/CaM介导了ABA对OsCCaMK、OsMKK1、OsMKK6及其下游靶基因OsMPK3、OsMPK4和OsMPK6的转录调控。OsCaM1-1超表达和反义抑制表达转基因水稻植株在盐胁迫下表型鉴定表明,OsCaM1-1超表达转基因株系比反义抑制表达转基因株系表现更强的耐盐性;同时,施用外源Ca2+促进水稻幼芽侧根的生长,增强了水稻耐盐性,诱导侧根发育相关基因表达水平差异明显。第二部分,利用遗传学和生物化学的方法,鉴定了水稻类钙调蛋白OsCML16（Calmodulin-like protein 16）的互作蛋白及其冷胁迫诱导表达。结果表明,OsCML16基因受4℃和12℃胁迫诱导表达明显;体外蛋白实验证明,OsCML16蛋白具有体外Ca2+与Mg2+结合特性。但是,Ca2+和Mg2+诱导OsCML16构象变化的程度不同;GUS组织染色表明,OsCML16主要在幼苗的叶和根系、孕穗期的颖壳、成熟期的茎节中表达。同时,创建了OsCML16过表达和RNAi抑制表达转基因植株并获得了纯合株系。水稻原生质体亚细胞定位结果表明,OsCML16主要位于细胞质和细胞核中;以OsCML16为诱饵蛋白,大规模筛选了水稻幼苗低温的酵母双杂交cDNA文库,获得了9个与其互作的候选蛋白,包含2个激酶蛋白（Y2、Y12）、2个转录因子（Y26、Y336）及5个功能蛋白（Y1、Y14、Y64、Y304、Y419）,点对点酵母双杂交和BiFC鉴定这些候选蛋白与OsCML16的真实性互作。qRT-PCR分析表明,6个互作候选基因均受4℃和12℃的诱导表达。
肖前林[10]（2017）在《转录因子ZmMYB14、ZmNAC126参与玉米淀粉合成调控机制研究》文中提出玉米是世界主要粮食作物之一,其籽粒中的储藏淀粉是玉米的主要利用产物。基于玉米淀粉的产量和品质,其被广泛用作畜禽饲料和工业原料,同时在能源、化工等领域也具有重要的应用前景。在土地资源匮乏和能源危机的当下,玉米淀粉对于解决世界粮食危机和能源危机具有一定的作用。玉米籽粒中的淀粉生物合成主利用运输至造粉体中的光合作用直接产物蔗糖,其合成的过程主要包括:ADPG的生物合成与转运、多聚糖链的延伸、多聚糖链的分支与去分支以及淀粉粒的形成等;其合成过程中主要功能蛋白有腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、淀粉合酶（Starch synthase）、淀粉分支酶（Branching enzyme）、淀粉去分支酶（Debranching enzyme）、淀粉磷酸化酶（Starch phosphorylase）以及ADPG转运蛋白（Transporter BT1）。基于不同物种的研究表明,转录调控是淀粉生物合成过程中重要的调控方式,它主要依赖于顺式作用元件（cis-element）和反式作用因子（trans-acting factor）,共同调节基因的转录水平,影响淀粉的生物合成。目前在玉米籽粒储藏淀粉的生物合成过程中,基因的转录调控机制研究较少。因此,鉴定参与玉米籽粒淀粉合成调控的顺式作用元件和反式作用因子,不仅有利于完善玉米籽粒淀粉生物合成的调控途径,同时也能为玉米分子育种中提高产量、改善品质提供新的基因资源。本研究以玉米自交系18-599（红）为试验材料,测定淀粉在胚乳发育中的动态积累,分析淀粉合成相关基因的表达模式;结合基因组序列,预测不同物种中淀粉合成相关酶基因启动子的顺式作用元件;利用胚乳瞬时转化体系鉴定ZmBT1基因启动子活性位点;结合ZmBT1基因启动子活性位点、基因表达模式以及共表达分析等方式筛选得到候选基因ZmMYB14与ZmNAC126。通过RT-PCR等技术分析基因的表达模式。利用不同的受体系统研究ZmMYB14与ZmNAC126的功能特性以及二者参与玉米淀粉合成的转录调控机制。主要结论如下:1.对玉米自交系18-599的淀粉测定与基因表达模式分析结果表明,授粉10d以后,淀粉在胚乳中开始大量积累,淀粉积累的趋势与胚乳中的淀粉合成相关酶基因表达模式相联系。不同物种的淀粉合成相关酶基因启动子的顺式作用元件预测表明,淀粉合成相关酶基因启动子中存在响应植物激素、光信号、逆境信号以及调控基因表达的顺式作用元件。2.通过利用胚乳瞬时转化体系以及β-glucuronidase和Luciferase报告基因系统对玉米自交系18-599（红）中克隆得到的ZmBT1基因1644bp的启动子片段进行片段缺失、突变位点的活性分析。首次鉴定得到ZmBT1基因启动子中-280bp到-151bp片段以及-151bp到+14bp片段能极显着影响启动子活性;首次发现-280bp到-151bp片段中的MBSI位点是影响ZmBT1基因启动子活性的重要顺式作用元件。3.基于基因表达模式、MBSI位点以及对启动活性的影响筛选得到ZmMYB14。结合分子生物实验技术分析发现,ZmMYB14是一个定位细胞核中,具有转录激活活性且转录激活位点位于C端的2R-MYB转录因子;ZmMYB14在玉米胚乳中高表达且受外源ABA和蔗糖处理的诱导;通过胚乳瞬时转化体系以及酵母单杂交分析表明,ZmMYB14能与-280bp到-151bp发生结合作用,且通过MBSI位点极显着的促进pZmBT1启动子活性,但结合作用不直接受到MBSI的突变和缺失的影响。由此表明,ZmMYB14参与ZmBT1基因的转录调控。4.通过基因枪瞬时转化、酵母单杂交以及水稻中花11外源表达ZmMYB14基因对ZmMYB14参与玉米淀粉合成过程的转录调控机制进行研究。结果发现ZmMYB14能通过直接与淀粉合成相关酶基因启动子pZmGBSSI、pZmSSI以及pZmSBE1相结合,并促进启动子的活性;对于pZmSh2、pZmBt2启动子的活性影响则是依赖于间接作用。同时ZmMYB14能直接结合pZmSSIIa、pZmISA1和pZmISA2启动子,但对启动子活性没有明显作用。在对外源表达ZmMYB14基因的T1代水稻的外源表达株系、阴性株系以及野生型的淀粉合成相关酶基因的转录水平检测发现,外源表达ZmMYB14能提高水稻ADPG转运蛋白编码基因OsBT1、淀粉合成相关酶基因OsAGPL2、OsSBEI、OsGBSSI、OsISA1、OsSSIIa、OsSBE2b以及OsPul基因的转录水平。由此表明ZmMYB14能参与玉米淀粉生物合成过程中基因的转录调控,且能同时调控多个基因的转录。5.通过共表达以及对pZmBT1启动子活性作用的分析筛选得到ZmNAC126基因,结合分子生物实验技术研究其在玉米淀粉生物合成过程中的调控机制。结果发现,克隆得到的ZmNAC126基因编码一个含有NAM保守结构域,定位在细胞核中,转录激活结构域位于C端的NAC家族转录因子;ZmNAC126在玉米籽粒与胚乳中高表达,与玉米淀粉合成相关酶基因存在共表达现象;且能与CACG核心基序的重复序列相结合。基于酵母单杂交与胚乳瞬时转化实验分析表明,ZmNAC126能通过与pZmGBSSI以及pZmBT1启动子直接作用促进启动子活性,通过与pZmISA1以及pZmISA2启动子直接结合抑制启动子活性,通过间接作用促进启动子pZmSh2、pZmBt2以及pZmSSIIIa活性,对于淀粉合酶ZmSSI基因启动子pZmSSI以及淀粉分支酶ZmSBEI基因启动子pZmSBE1的活性没有明显的影响。由此表明,ZmNAC126参与玉米淀粉合成相关酶基因的转录调控,且能以不同的方式作用于多个基因的调控过程。
二、RT-PCR方法半定量在基因表达水平检测中的应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、RT-PCR方法半定量在基因表达水平检测中的应用（论文提纲范文）
（1）元帅系苹果突变体的基因组变异检测及MdWD40和Md4CL的功能验证（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 苹果芽变育种的研究进展 |
| 1.1.1 苹果芽变育种现状 |
| 1.1.2 苹果芽变机理和鉴定的研究进展 |
| 1.2 短枝型苹果品种的特点 |
| 1.3 着色芽变苹果品种的特点 |
| 1.4 全基因组重测序的研究 |
| 1.4.1 全基因组重测序概念 |
| 1.4.2 全基因组重测序在果树中的研究进展 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 1.6 技术路线 |
| 第二章 ‘元帅’及其四代突变体的形态学遗传变异分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验地概况 |
| 2.1.2 试验材料 |
| 2.1.3 试验方法 |
| 2.2 数据分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 ‘元帅’及其四代突变体节间长度的变化 |
| 2.3.2 ‘元帅’及其四代突变体叶片性状的描述 |
| 2.3.3 ‘元帅’及其四代突变体单果重的变化 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 ‘元帅’及其四代突变体的全基因组重测序 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 试验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 ‘元帅’及其四代突变体的测序结果统计 |
| 3.2.2 ‘元帅’及其四代突变体与参考基因组的比对分析 |
| 3.2.3 CNVs和 SVs的鉴定与评估 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 基于重测序的‘元帅’及其四代突变体SNPs和 InDels的检测 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 试验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 SNPs检测及注释 |
| 4.2.2 InDels检测及注释 |
| 4.2.3 SNPs和 InDels在染色体上的数量和分布 |
| 4.2.4 花青素合成相关基因和短枝型相关基因的筛选 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 花青素合成相关基因MdWD40和Md4CL的亚细胞定位和瞬时表达 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 菌株与连接载体 |
| 5.2 试验试剂与仪器 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.3 试验方法 |
| 5.3.1 引物设计 |
| 5.3.2 总RNA的提取 |
| 5.3.3 MdWD40和Md4CL基因的克隆 |
| 5.3.4 PCR产物的回收与纯化 |
| 5.3.5 克隆载体的连接及转化 |
| 5.3.6 实时荧光定量PCR |
| 5.3.7 生物信息学的分析 |
| 5.3.8 菌液质粒DNA的提取 |
| 5.3.9 双酶切反应 |
| 5.3.10 过表达载体的构建 |
| 5.3.11 农杆菌感受态细胞的转化 |
| 5.3.12 洋葱表皮中的亚细胞定位 |
| 5.3.13 瞬时转化苹果 |
| 5.3.14 花青素含量的测定 |
| 5.3.15 花青素合成相关基因的实时荧光定量 PCR和半定量 PCR |
| 5.3.16 数据处理 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 MdWD40和Md4CL基因的克隆 |
| 5.4.2 同源序列比对及系统进化树分析 |
| 5.4.3 MdWD40和Md4CL基因的理化性质分析 |
| 5.4.4 预测分析蛋白质的二级结构与三级结构 |
| 5.4.5 预测分析MdWD40和Md4CL基因的保守功能域 |
| 5.4.6 MdWD40和Md4CL基因的相对表达量 |
| 5.4.7 MdWD40和Md4CL过表达载体的构建和农杆菌的转化 |
| 5.4.8 MdWD40-GFP和 Md4CL-GFP融合蛋白在洋葱内表皮的亚细胞定位 |
| 5.4.9 MdWD40-GFP和 Md4CL-GFP在苹果果皮上的瞬时表达 |
| 5.4.10 MdWD40和Md4CL基因在瞬时转化苹果中的表达 |
| 5.4.11 花青素合成相关基因的表达受MdWD40和Md4CL基因的调控 |
| 5.5 讨论 |
| 第六章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（2）功能化探针/载体在基因检测和治疗中的应用研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 microRNA |
| 1.2.1 miRNA的生物合成和作用机制 |
| 1.2.2 miRNA与疾病 |
| 1.2.3 miRNA检测 |
| 1.2.4 传统的miRNA检测方法 |
| 1.2.5 miRNA检测的信号扩增技术 |
| 1.2.6 新型的miRNA检测系统 |
| 1.3 基因治疗 |
| 1.3.1 基因治疗的现状及意义 |
| 1.3.2 siRNA作用机制及其运输障碍 |
| 1.3.3 病毒载体 |
| 1.3.4 功能化载体在基因运输中的应用 |
| 1.3.5 siRNA的临床发展 |
| 1.4 本论文的研究意义和创新之处 |
| 1.4.1 本论文的研究目的和意义 |
| 1.4.2 本论文的主要创新点 |
| 2 闭合环形探针用于细胞内miRNA检测和成像研究 |
| 2.1 本章引言 |
| 2.2 实验部分 |
| 2.2.1 实验试剂和仪器 |
| 2.2.2 实验中相关溶液的配制 |
| 2.2.3 CD的环化 |
| 2.2.4 CP探针的制备 |
| 2.2.5 环形探针检测的特异性和灵敏度实验 |
| 2.2.6 细胞培养 |
| 2.2.7 细胞内miRNA-21 成像检测 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 CMD和CD表征 |
| 2.3.2 探针的可行性实验分析 |
| 2.3.3 CP探针和LP探针对比分析 |
| 2.3.4 CP探针用于miRNA检测 |
| 2.3.5 细胞内miRNA的成像检测 |
| 2.4 本章小结 |
| 3 双重信号放大的环形探针用于miRNA高灵敏度定量检测 |
| 3.1 本章引言 |
| 3.2 实验部分 |
| 3.2.1 实验试剂和仪器 |
| 3.2.2 CD2和CD-17ES的制备 |
| 3.2.3 细胞总RNA提取 |
| 3.2.4 凝胶电泳实验 |
| 3.2.5 荧光测试实验 |
| 3.3 结果与讨论 |
| 3.3.1 let-7a诱导DNAzyme特异性自断裂 |
| 3.3.2 PFP与 F-SS高效的荧光共振能量转移 |
| 3.3.3 CD-17ES探针可行性分析 |
| 3.3.4 CD-17ES探针用于let-7 家族中let-7a特异性检测 |
| 3.3.5 CD-17ES探针的灵敏度实验 |
| 3.3.6 细胞总RNA提取物中let-7a定量分析 |
| 3.4 本章小结 |
| 4 基于逻辑门和双重信号放大的探针用于miRNA多元灵敏检测 |
| 4.1 本章引言 |
| 4.2 实验部分 |
| 4.2.1 实验试剂和仪器 |
| 4.2.2 CRP和 CRP/17ES制备 |
| 4.2.3 Y-DNA制备和链霉亲和素磁珠优化 |
| 4.2.4 miRNA-155 检测实验 |
| 4.2.5 多元miRNAs检测实验 |
| 4.2.6 细胞总RNA中目标miRNAs检测 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 Y-DNA表征 |
| 4.3.2 多元检测探针的可行性分析 |
| 4.3.3 多元检测探针的选择性和灵敏度 |
| 4.3.4 两种靶标miRNA的检测 |
| 4.3.5 三种靶标miRNAs的检测 |
| 4.3.6 细胞总RNA中 miRNAs检测 |
| 4.4 本章小结 |
| 5 pH响应的siRNA 共价交联纳米颗粒用于小鼠急性肝损伤的治疗研究 |
| 5.1 本章引言 |
| 5.2 实验部分 |
| 5.2.1 实验试剂和仪器 |
| 5.2.2 化合物AAPEG的合成 |
| 5.2.3 甘露糖靶向配体的合成 |
| 5.2.4 环辛炔修饰的siRNA、PNSDS和 M-PNSDS制备 |
| 5.2.5 PNSDS和 M-PNSDS物理化学性质表征 |
| 5.2.6 PNSDS纳米颗粒的细胞实验 |
| 5.2.7 M-PNSDS在小鼠急性肝损伤模型中的相关实验 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 环辛炔修饰siRNA表征 |
| 5.3.2 AAPEG体外pH刺激响应 |
| 5.3.3 PNSDS物理性质表征 |
| 5.3.4 siRNA共价交联纳米颗粒的细胞实验 |
| 5.3.5 siRNA共价交联纳米颗粒在治疗急性肝损伤小鼠模型的体内实验 |
| 5.4 本章小结 |
| 6 总结与展望 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| A 作者简介 |
| B 作者在攻读学位期间发表的论文目录 |
| C 作者在攻读学位期间申的请专利目录 |
| D 部分重要化合物图谱 |
| E 学位论文数据集 |
| 致谢 |
（3）PRKAG2-AS1调控心肌细胞及内皮细胞凋亡的机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 PRKAG2-AS1参与调控心肌细胞凋亡 |
| 引言 |
| 一、材料和仪器 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计方法 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 六、小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PRKAG2-AS1 参与调控内皮细胞凋亡 |
| 引言 |
| 一、材料和仪器 |
| 二、实验方法 |
| 三、实验结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 附录 |
| 文献综述 长链非编码RNA与心血管疾病 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文情况说明 |
| 致谢 |
（4）CBX7通过ITGβ3/TGFβ1/AKT信号通路在宫颈癌进展中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 CBX7及ITGβ3/TGFβ1 信号通路相关基因在宫颈癌中的表达及其临床意义 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 标本来源 |
| 1.2 主要试剂与耗材 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 CBX7 在宫颈癌生物学行为中的作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞系的选取 |
| 1.2 主要试剂和耗材 |
| 1.3 主要仪器 |
| 1.4 主要试剂的配制 |
| 1.5 裸鼠来源和饲养 |
| 1.6 实验方法 |
| 1.7 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 CBX7 调控宫颈癌生物学行为的机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 细胞系的选取 |
| 1.2 主要实验试剂及耗材 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 创新点与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 CBX在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
（5）红花玉兰APETATAL1和AGAMOUS-LIKE 6同源基因克隆和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 植物花被片的起源假说 |
| 1.3 MADS-Box转录因子调控植物花发育的研究 |
| 1.3.1 花发育调控模型与MADS-Box家族基因起源 |
| 1.3.2 MADS-box基因调控花被片发育的研究 |
| 1.3.3 AP1亚族基因的研究进展 |
| 1.3.4 AGL6亚族基因的研究进展 |
| 1.3.5 AP1/SEP/AGL6进化系同源基因的研究进展 |
| 1.4 红花玉兰及其相关研究 |
| 1.4.1 发现红花玉兰 |
| 1.4.2 红花玉兰MADS-box基因研究 |
| 1.5 研究目的和意义 |
| 1.6 研究技术路线 |
| 2 红花玉兰AP1同源基因克隆及功能分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 主要试剂和仪器 |
| 2.1.3 试验方法 |
| 2.1.3.1 红花玉兰总RNA提取 |
| 2.1.3.2 红花玉兰总RNA样品中的DNA消化 |
| 2.1.3.3 红花玉兰总RNA逆转录 |
| 2.1.3.4 3'RACE基因克隆技术 |
| 2.1.3.5 PCR产物的电泳检测与胶回收 |
| 2.1.3.6 5'RACE基因克隆技术 |
| 2.1.3.7 构建克隆载体 |
| 2.1.3.8 构建双元表达载体 |
| 2.1.3.9 转化大肠杆菌 |
| 2.1.3.10 质粒提取 |
| 2.1.3.11 转化农杆菌 |
| 2.1.3.12 转染拟南芥 |
| 2.1.3.13 转基因拟南芥快速鉴定技术 |
| 2.1.3.14 半定量PCR分析 |
| 2.1.3.15 实时定量分析 |
| 2.1.4 AP1同源基因特征结构域分析 |
| 2.1.5 种子植物AP1同源基因系统进化树构建 |
| 2.1.6 MawuAP1在红花玉兰中表达的组织特异性 |
| 2.1.7 MawuAP1在花器官发育不同阶段的表达模式 |
| 2.1.8 本章所用引物 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 MawuAP1基因克隆及结构域分析 |
| 2.2.2 AP1同源基因系统进化树 |
| 2.2.3 MawuAP1组织表达特异性及表达模式分析 |
| 2.2.4 MawuAP1转基因拟南芥功能分析 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 MawuAP1不具有决定花被片性状的功能 |
| 2.3.2 AP1/FUL基因亚族功能分化 |
| 2.4 小结 |
| 3 红花玉兰AGL6同源基因克隆及功能分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器 |
| 3.1.3 基因克隆及载体构建方法 |
| 3.1.4 木兰属AGL6同源基因克隆及特征结构域分析 |
| 3.1.5 种子植物AGL6同源基因系统进化树构建 |
| 3.1.6 种子植物AGL6同源基因组织表达特异性及表达模式分析 |
| 3.1.7 MawuAGL6_1/2在红花玉兰中表达的组织特异性 |
| 3.1.8 MawuAGL6_1/2在花器官发育不同阶段的表达模式 |
| 3.1.9 MawuAGL6_1/2在不同花被片数花芽中的表达模式分析 |
| 3.1.10 MawuAGL6_1/2转基因拟南芥功能分析 |
| 3.1.11 体视显微镜和扫描电子显微镜 |
| 3.1.12 本章所用引物 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 红花玉兰AGL6同源基因克隆 |
| 3.2.2 MawuAGL6_1/2结构域分析 |
| 3.2.3 种子植物AGL6同源丛因系统进化研究 |
| 3.2.4 种子植物AGL6亚族基因表达模式分析 |
| 3.2.5 MawuAGL6_1/2在红花玉兰花发育中的表达模式 |
| 3.2.5.1 MawuAGL6_1/2在不同发育阶段的表达模式 |
| 3.2.5.2 MawuAGL6_1/2在不同花被片数红花玉兰表达模式 |
| 3.2.6 MawuAGL6_1/2转基因拟南芥功能分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 MawuAGL6_1/2在花被片发育中的功能 |
| 3.3.2 基因重复事件导致AGL6同源基因功能分化 |
| 3.4 小结 |
| 4 红花玉兰MADS-BOX基因表达模式分析 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 植物材料 |
| 4.1.2 主要试剂和仪器 |
| 4.1.3 试验方法 |
| 4.1.3.1 红花玉兰SEP同源基因克隆 |
| 4.1.3.2 红花玉兰SEP同源基因特征结构域分析 |
| 4.1.3.3 被子植物SEP同源基因系统进化分析 |
| 4.1.3.4 红花玉兰花发育MADS-box同源基因表达模式分析 |
| 4.1.3.5 种子植物AP1/SEP/AGL6同源基因系统进化树构建 |
| 4.1.4 本章所用引物 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 红花玉兰SEP同源基因特征结构域分析 |
| 4.2.2 被子植物SEP同源基因系统进化分析 |
| 4.2.3 红花玉兰花发育MADS-box基因表达模式分析 |
| 4.2.4 种子植物AP1/SEP/AGL6亚族基因系统进化研究 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 5 MawuAGL6_1/2、MawuAP1蛋白质结构预测与蛋白相互作用分析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 主要试剂与仪器 |
| 5.1.2 试验方法 |
| 5.1.2.1 氨基酸序列分析 |
| 5.1.2.2 蛋白质三级结构预测 |
| 5.1.2.3 In-fusion同源克隆法构建酵母表达载体 |
| 5.1.2.4 配制酵母双/三杂培养基 |
| 5.1.2.5 酵母感受态制备及转化 |
| 5.1.2.6 MawuAGL6_1/2与红花玉兰MADS-box基因蛋白相互作用 |
| 5.1.2.7 MawuAGL6_1/2M、I、K、C结构域与红花玉兰MADS-box转录因子相互作用 |
| 5.1.2.8 MawuAGL6_1/2与拟南芥MADS-box转录因子蛋白相互作用 |
| 5.1.2.8.1 酵母双杂实验 |
| 5.1.2.8.2 酵母三杂实验 |
| 5.1.2.9 MawuAP1与红花玉兰MADS-box转录因子相互作用 |
| 5.1.3 本章所用引物列表 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 MawuAGL6_1/2、MawuAP1氨基酸序列分析 |
| 5.2.2 MawuAGL6_1/2三级结构预测 |
| 5.2.3 MawuAGL6_1/2与红花玉兰MADS-box转录因子相互作用 |
| 5.2.4 MawuAGL6_1/2与拟南芥MADS-box转录因子相互作用 |
| 5.2.5 MawuAGL6_1/2与AtAP3、AtSEP3转录因子相互作用 |
| 5.2.6 MawuAP1与红花玉兰MADS-box转录因子蛋白相互作用 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 MawuAGL6_1/2、MawuAP1蛋白相互作用模式 |
| 5.3.2 MawuAGL6_1/2、MawuAP1在花被片发育中的作用模型 |
| 5.4 小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 红花玉兰MawuAGL6_1/2具有A类基因功能 |
| 6.2 基因重复与基因表达模式、功能分化及系统进化 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录A AP1/SEP/AGL6亚族基因编码区序列 |
| 附录B AP1/SEP/AGL6亚族系统进化树基因氨基酸序列 |
| 附录C 花芽采集时间与大小 |
| 个人简介 |
| 导师简介 |
| 获得成果目录清单 |
| 致谢 |
（6）玉米Ac/Ds转座体系的构建及二穗短柄草BdSOC1-like基因功能的初步分析（论文提纲范文）
| 符号说明 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 玉米简介 |
| 1.2 玉米遗传转化技术的发展 |
| 1.2.1 原生体法 |
| 1.2.2 基因枪法 |
| 1.2.3 电击法、碳化硅晶体法和气溶胶注射法 |
| 1.2.4 农杆菌法 |
| 1.3 玉米转座子 |
| 1.3.1 玉米转座子的发现 |
| 1.3.2 转座子的类型 |
| 1.3.2.1 Ac/Ds转座子系统 |
| 1.3.2.2 Mu转座子系统 |
| 1.3.2.3 En/Spm转座子系统 |
| 1.4 玉米突变体的发展现状 |
| 1.4.1 理化诱变技术 |
| 1.4.2 CRISPR/Cas9 基因编辑法 |
| 1.4.3 插入诱变 |
| 1.4.3.1 T-DNA插入法 |
| 1.4.3.2 转座子标签法 |
| 1.5 SOC1 基因调控植物开花的研究现状 |
| 1.6 本课题的目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 植物材料及其生长条件 |
| 2.1.2 质粒与菌株 |
| 2.1.3 酶及生化试剂 |
| 2.1.4 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 玉米遗传转化相关表达载体的构建 |
| 2.2.1.1 感受态的制备 |
| 2.2.1.2 植物总RNA的提取 |
| 2.2.1.3 cDNA反转录 |
| 2.2.1.4 Pfu高保真酶PCR扩增 |
| 2.2.1.5 胶回收 |
| 2.2.1.6 TA克隆 |
| 2.2.1.7 转化大肠杆菌 |
| 2.2.1.8 提取质粒 |
| 2.2.1.9 将克隆的DNA目的片段连接到植物表达载体 |
| 2.2.1.10 转化大肠杆菌 |
| 2.2.1.11 提取质粒(试剂盒法) |
| 2.2.1.12 农杆菌AGL1或EHA105 的转化 |
| 2.2.2 基因枪法转化玉米 |
| 2.2.2.1 诱导愈伤 |
| 2.2.2.2 基因枪质粒制备 |
| 2.2.2.3 基因枪微弹的制备 |
| 2.2.2.4 基因枪设备 |
| 2.2.2.5 基因枪轰击玉米愈伤组织 |
| 2.2.2.6 GFP阳性幼苗的再生 |
| 2.2.2.7 GFP阳性植株的分子分析 |
| 2.2.2.8 GFP阳性植株的F1 代分析 |
| 2.2.3 农杆菌介导的玉米遗传转化 |
| 2.2.3.1 农杆菌侵染液的准备 |
| 2.2.3.2 幼胚的处理 |
| 2.2.3.3 侵染与共培养处理 |
| 2.2.3.4 恢复培养 |
| 2.2.3.5 GFP阳性幼苗的再生 |
| 2.2.3.6 GFP阳性植株的PCR和 RT-PCR分析 |
| 2.2.3.7 Southern杂交 |
| 2.2.3.8 GFP阳性植株的F1 代分析 |
| 2.2.4 玉米Ac/Ds突变体库的构建与分析 |
| 2.2.4.1 转基因系T0代Ac转座酶基因的表达分析 |
| 2.2.4.2 玉米DNA的提取(试剂盒法) |
| 2.2.4.3 T-DNA定位 |
| 2.2.4.4 转基因系T0代fDs的体细胞转座分析 |
| 2.2.4.5 fDs插入突变植株的鉴定与富集 |
| 2.2.4.6 fDs新插入位置的定位分析 |
| 2.2.5 二穗短柄草SOC1-like(BdSOC1-like)功能的初步分析 |
| 2.2.5.1 序列比对及进化分析 |
| 2.2.5.2 qRT-PCR分析 |
| 2.2.5.3 BdSOC1-like超表达载体(BdSOC1-like-ox)的构建 |
| 2.2.5.4 二穗短柄草的遗传转化 |
| 2.2.5.5 PCR |
| 2.2.5.6 pXQD17 阳性后代的遗传分析 |
| 2.2.5.7 开花时间分析 |
| 2.2.5.8 种子特点分析 |
| 2.2.6 统计分析 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 本研究相关表达载体的构建 |
| 3.2 玉米遗传转化 |
| 3.2.1 基因枪法转化玉米 |
| 3.2.1.1 GFP辅助筛选抗性愈伤和抗性芽及植株 |
| 3.2.1.2 基因枪法介导的玉米转化频率 |
| 3.2.1.3 GFP阳性植株的分子鉴定 |
| 3.2.1.4 GFP阳性植株中GFP的拷贝数分析 |
| 3.2.1.5 GFP阳性植株的F1 代分析 |
| 3.2.2 农杆菌介导的玉米转化 |
| 3.2.2.1 两种共培养法(DC和 MC)对玉米瞬时转化效率的影响对比 |
| 3.2.2.2 T0 GFP阳性幼苗的再生及初步分析 |
| 3.2.2.3 两种共培养法(DC和 MC)对玉米再生和稳定转化效率的影响 |
| 3.2.2.4 GFP阳性植株的F1 分析 |
| 3.3 玉米Ac/Ds突变体库的构建与分析 |
| 3.3.1 pXQD70 阳性植株的T0 分析 |
| 3.3.1.1 Ac转座酶基因的表达分析 |
| 3.3.1.2 T0 体细胞fDs转座分析 |
| 3.3.2 pXQD70 阳性株系后代的筛选 |
| 3.3.3 F1 fDs转座印迹分析 |
| 3.3.4 非连锁转座的大规模富集 |
| 3.3.5 fDs插入位置在染色体上的分布 |
| 3.3.6 突变体表型分析 |
| 3.4 BdSOC1-like基因功能的初步分析 |
| 3.4.1 BdSOC1-like基因的生物信息学分析及分子克隆 |
| 3.4.2 BdSOC1-like的空间表达分析 |
| 3.4.3 BdSOC1-like的表达并没有昼夜节律性 |
| 3.4.4 冷处理对BdSOC1-like mRNA水平的影响 |
| 3.4.5 BdSOC1-like超表达(BdSOC1-like-ox)阳性株系T0 的分子分析 |
| 3.4.6 BdSOC1-like-ox阳性株系T1 后代的分离分析 |
| 3.4.7 BdSOC1-like超表达能促进植物的成花转变 |
| 3.4.8 超表达BdSOC1-like产生了多效性表型 |
| 4 讨论 |
| 4.1 在玉米的遗传转化中,GFP荧光是一种可靠的可视化标签 |
| 4.2 干滤纸共培养法能显着提高玉米的转化效率 |
| 4.3 有效的玉米遗传转化系统仍然需要改善 |
| 4.4 Ac/Ds系统的工作情况 |
| 4.5 BdSOC1-like基因功能的初步研究 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（7）猪病毒性疫病高通量检测方法的建立和应用及NADC30-like PRRSV与ASFV的监测研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 高通量检测技术 |
| 1.2 毛细管电泳研究进展 |
| 1.2.1 毛细管电泳发展历史 |
| 1.2.2 特点 |
| 1.2.3 毛细管电泳的应用 |
| 1.3 液相芯片研究进展 |
| 1.3.1 液相芯片简介 |
| 1.3.2 液相芯片原理 |
| 1.3.3 液相芯片优势 |
| 1.3.4 应用及展望 |
| 1.4 NADC30-like PRRSV研究进展 |
| 1.4.1 基因序列分析 |
| 1.4.2 流行现状 |
| 1.4.3 致病性及临床表现 |
| 1.4.4 防控措施 |
| 1.5 非洲猪瘟研究进展 |
| 1.5.1 病原学 |
| 1.5.2 流行病学 |
| 1.5.3 临床症状和病理变化 |
| 1.5.4 实验室诊断 |
| 1.5.5 防控措施 |
| 1.6 数字PCR研究进展 |
| 1.6.1 发展历史 |
| 1.6.2 ddPCR原理 |
| 1.6.3 ddPCR应用 |
| 1.7 本研究的目的和意义 |
| 第二章 猪病毒性疫病毛细管电泳全自动核酸检测方法的建立及应用研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 样品来源 |
| 2.1.2 毒株 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要仪器 |
| 2.1.5 引物设计 |
| 2.1.6 RNA的提取 |
| 2.1.7 RNA的反转录 |
| 2.1.8 DNA的提取 |
| 2.1.9 重组质粒的制备 |
| 2.1.10 毛细管电泳的预备 |
| 2.1.11 PCR引物验证 |
| 2.1.12 多重PCR反应条件的优化 |
| 2.1.13 毛细管电泳全自动核酸分析 |
| 2.1.14 特异性试验 |
| 2.1.15 灵敏度试验 |
| 2.1.16 重复性试验 |
| 2.1.17 临床样品检测 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 引物验证 |
| 2.2.2 多重PCR反应条件的确定 |
| 2.2.3 毛细管电泳分析结果 |
| 2.2.4 灵敏性试验结果 |
| 2.2.5 特异性试验结果 |
| 2.2.6 重复性试验结果 |
| 2.2.7 临床样品检测结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 靶序列富集多重PCR和液相芯片技术在猪病毒性疫病核酸检测中的应用研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 样品来源 |
| 3.1.2 毒株 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.1.5 引物和探针设计 |
| 3.1.6 核酸提取及重组质粒制备 |
| 3.1.7 Bio-Plex200TM的校正和验证 |
| 3.1.8 微球与探针偶联 |
| 3.1.9 偶联探针质控验证 |
| 3.1.10 TEM-PCR体系的建立及优化 |
| 3.1.11 杂交反应的优化 |
| 3.1.12 杂交结果的判定标准 |
| 3.1.13 特异性试验 |
| 3.1.14 灵敏度试验 |
| 3.1.15 重复性试验 |
| 3.1.16 临床样品检测 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 引物验证 |
| 3.2.2 微球偶联探针验证 |
| 3.2.3 微球计数 |
| 3.2.4 反应体系的确定 |
| 3.2.5 杂交温度的优化 |
| 3.2.6 杂交时间优化 |
| 3.2.7 特异性试验 |
| 3.2.8 灵敏性试验 |
| 3.2.9 重复性试验 |
| 3.2.10 临床样品检测 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 高通量核酸检测方法对不同养殖场猪病毒性疫病分子流行病学调查及NADC30-like监测研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 毒株 |
| 4.1.2 临床样品 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.1.4 主要仪器 |
| 4.1.5 核酸提取和制备 |
| 4.1.6 病原检测方法 |
| 4.1.7 猪场疾病有效防控能力分析 |
| 4.1.8 NADC30-like PRRSV检测方法 |
| 4.1.9 NADC30-like PRRSV病毒监测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 不同猪场病原检测结果 |
| 4.2.2 猪场疾病有效防控能力分析 |
| 4.2.3 NADC30-like检测方法验证 |
| 4.2.4 NADC30-like PRRSV临床检测结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 非洲猪瘟病毒检测方法的建立以及病毒的实时监控 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 样品信息 |
| 5.1.2 毒株 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.1.4 主要仪器 |
| 5.1.5 引物设计 |
| 5.1.6 ASFV K205R原核表达系统构建 |
| 5.1.7 间接ELISA检测方法的建立 |
| 5.1.8 非洲猪瘟病毒微滴数字PCR方法的建立 |
| 5.1.9 临床样品检测 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 ASFV K205R基因原核表达 |
| 5.2.2 ASFV K205R ELISA建立 |
| 5.2.3 ASFV ddPCR核酸检测方法的建立 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 结论与创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）探究Slc5a8在小鼠眼角膜上皮表达的时空分布（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第1章 引言 |
| 1.1 角膜与角膜缘 |
| 1.2 角膜缘干细胞(LSCs) |
| 1.2.1 LSCs的功能 |
| 1.2.2 LSCs的增殖与分化 |
| 1.2.3 LSCs标志物研究进展 |
| 1.2.4 LSCs的空间分布 |
| 1.3 转录组测序技术在LSCs上的应用 |
| 1.4 单分子RNA原位检测在LSCs上的应用 |
| 1.5 Slc5a8 的研究进展 |
| 1.6 本课题的来源和意义 |
| 第2章 小鼠角膜缘区域的界定 |
| 2.1 实验材料、设备与试剂配方 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 实验材料 |
| 2.1.3 实验仪器 |
| 2.1.4 试剂配方 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 显微镜下观察角膜组织形态 |
| 2.2.2 石蜡切片的制作 |
| 2.2.3 HE染色 |
| 2.2.4 免疫组化 |
| 2.3 实验结果及分析 |
| 2.3.1 小鼠角膜的组织形态学观察 |
| 2.3.2 小鼠角膜的HE染色 |
| 2.3.3 小鼠眼球石蜡切片的免疫组化结果 |
| 2.4 讨论与小结 |
| 第3章 小鼠角膜缘组织转录组测序及差异表达分析 |
| 3.1 实验材料、设备与试剂配方 |
| 3.1.1 实验动物 |
| 3.1.2 实验材料 |
| 3.1.3 实验仪器 |
| 3.1.4 试剂配方 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 RNA样本的制备 |
| 3.2.2 文库构建及上机测序 |
| 3.2.3 数据处理及生物信息学分析 |
| 3.2.4 qRT-PCR验证 |
| 3.3 实验结果与分析 |
| 3.3.1 原始测序数据的质量控制 |
| 3.3.2 样本重复相关性分析结果 |
| 3.3.3 差异基因表达分析和聚类分析结果 |
| 3.3.4 富集分析结果 |
| 3.3.5 qRT-PCR验证结果 |
| 3.3.6 筛选差异表达基因 |
| 3.4 讨论与小结 |
| 第4章 差异基因Slc5a8 在小鼠眼角膜的时空分布探究 |
| 4.1 实验材料、设备与试剂配方 |
| 4.1.1 实验动物 |
| 4.1.2 实验材料 |
| 4.1.3 实验仪器 |
| 4.1.4 试剂配方 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 qRT-PCR |
| 4.2.2 单分子RNA原位检测 |
| 4.2.3 Western Blotting |
| 4.2.4 免疫组化 |
| 4.3 实验结果与分析 |
| 4.3.1 Slc5a8 在转录水平的定量与定位检测 |
| 4.3.2 SLC5A8 在蛋白水平的半定量与定位检测 |
| 4.4 讨论与小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（9）OsCaM1-1和OsCML16调控水稻耐逆性机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表Abbreviations |
| 第1章 前言 |
| 1.1 Ca~(2+)对植物的重要性 |
| 1.1.1 植物对Ca~(2+)的吸收 |
| 1.1.2 Ca~(2+)在植物生长发育过程中的作用 |
| 1.1.3 植物体内钙信号的产生 |
| 1.1.4 植物体内钙信号的解码机制 |
| 1.2 植物体内的钙信号系统 |
| 1.2.1 CaM/CML信号系统 |
| 1.2.2 CDPK蛋白家族 |
| 1.2.3 CBL/CIPK蛋白家族 |
| 1.3 CaM/CML基因家族的起源和进化 |
| 1.4 CaM/CML在植物生长发育和响应非生物胁迫中的研究进展 |
| 1.5 Ca~(2+)信号在植物耐盐性中的功能研究 |
| 1.5.1 盐胁迫信号转导途径 |
| 1.5.2 Ca~(2+)/CaM介导的信号与MAPK信号交谈 |
| 1.6 钙信号响应冷害的研究进展 |
| 1.6.1 植物抗冷性的生理基础 |
| 1.6.2 植物对低温信号的感应 |
| 1.6.3 植物在低温胁迫下细胞质中“钙指纹”信号形成的机制 |
| 1.6.4 植物CaMs/CMLs及其靶蛋白在冷胁迫中的功能研究 |
| 1.7 研究的目的和意义 |
| 第2章 OsCaM1-1特异性调控OsCCaMK-OsMKK1/OsMKK6途径与耐盐性鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料和试剂 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 OsCaM亚家族蛋白的磷酸化位点分析 |
| 2.2.2 OsCaM1磷酸化位点对体外Ca~(2+)结合的影响 |
| 2.2.3 OsCaM1磷酸化位点对OsCaM1与OsCCaMK互作的影响 |
| 2.2.4 OsCCaMK在体外和体内与OsMKK1和OsMKK6特异性互作的鉴定 |
| 2.2.5 CaM和H_2O_2介导ABA诱导的OsCCaMK-OsMKK1/6途径基因转录分析 |
| 2.2.6 OsCaM1-1调控水稻幼芽的耐盐性 |
| 2.2.7 OsCaM1-1促进水稻发芽侧根的生长 |
| 2.3 小结 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 OsCaM1的磷酸化修饰对Ca~(2+)和靶蛋白结合能力的影响 |
| 2.4.2 OsCCaMK与OsMKKs的互作依赖于Ca~(2+)和CaM |
| 2.4.3 OsCaM1-OsCCaMK-OsMKK1/6途径调控水稻的耐盐性和侧根生长 |
| 第3章 类钙调蛋白OsCML16互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料和试剂 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 类钙调蛋白基因OsCML16在水稻幼苗中冷诱导表达 |
| 3.2.2 OsCML16蛋白的生物信息学分析 |
| 3.2.3 OsCML16在体外与Ca~(2+)/Mg~(2+)结合的检测 |
| 3.2.4 OsCML16在水稻组织中的GUS表达和亚细胞定位 |
| 3.2.5 OsCML16转基因株系表达水平的检测 |
| 3.2.6 OsCML16互作蛋白的筛选与鉴定 |
| 3.2.7 候选基因的冷胁迫诱导分析 |
| 3.3 小结 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 OsCML16在低温逆境下的功能分析 |
| 3.4.2 OsCML16的生化特征分析 |
| 3.4.3 OsCML16及其互作蛋白在冷响应中的信号转导机制 |
| 第4章 全文总结与展望 |
| 4.1 全文总结 |
| 4.2 主要创新点 |
| 4.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 常用试剂的配方 |
| 附录Ⅱ 引物信息 |
| 附录Ⅲ 磷酸化位点修饰液相质谱部分原始数据 |
| 附录Ⅳ 个人简介 |
| 附录Ⅴ 博士在读期间的研究成果 |
| 致谢 |
（10）转录因子ZmMYB14、ZmNAC126参与玉米淀粉合成调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 淀粉的基本性质与分类 |
| 2 淀粉的生物合成 |
| 2.1 腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase) |
| 2.2 淀粉合酶(Starchsynthase) |
| 2.3 淀粉分支酶(StarchBranchingenzyme) |
| 2.4 淀粉去分支酶(StarchDebranchingenzyme) |
| 2.5 淀粉磷酸化酶(Starchphosphorylase) |
| 2.6 转运子(TransporterBT1) |
| 3 基因表达调控的研究进展 |
| 3.1 顺式作用元件研究进展 |
| 3.2 转录因子的研究进展 |
| 4 淀粉合成的调控机制研究进展 |
| 4.1 淀粉合成过程中的调控机制 |
| 4.2 淀粉合成过程中的转录调控 |
| 5 研究目的与意义 |
| 6 技术路线 |
| 第二章 基础数据积累与分析 |
| 1 前言 |
| 2 试验材料 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 淀粉的定性、定量测定 |
| 3.2 基因表达模式分析 |
| 3.3 淀粉合成相关酶基因启动子中顺式作用元件预测与分析 |
| 4 试验结果 |
| 4.1 自交系18-599中淀粉含量的定性分析与定量测定 |
| 4.2 淀粉合成相关酶基因的表达模式分析 |
| 4.3 淀粉合酶相关基因启动子中顺式作用元件预测与分析 |
| 5 讨论 |
| 第三章 ZmBT1启动子克隆与关键活性位点的鉴定 |
| 1 前言 |
| 2 试验材料 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 玉米基因组DNA提取 |
| 3.2 淀粉合成过程中转运子BT1的进化分析 |
| 3.3 淀粉合成过程中转运子BT1基因启动子分析 |
| 3.4 玉米转运子BT1基因表达模式分析 |
| 3.5 ZmBT1基因启动子克隆、片段缺失与点突变系列载体构建 |
| 3.6 ZmBT1基因启动子及系列载体活性检测 |
| 4 试验结果 |
| 4.1 植物中BT1基因进化分析 |
| 4.2 作物中BT1基因启动子序列分析 |
| 4.3 ZmBT1基因表达模式分析 |
| 4.4 ZmBT1启动子克隆与活性分析 |
| 4.5 ZmBT1启动子活性位点的鉴定 |
| 5 讨论 |
| 5.1 ZmBT1基因的功能 |
| 5.2 顺式作用元件与淀粉生物合成 |
| 第四章 转录因子ZmMYB14参与淀粉合成的调控机制 |
| 1 前言 |
| 2 试验材料 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.2 试验载体、菌株与试剂 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 玉米MYB转录因子表达模式分析 |
| 3.2 玉米胚乳RNA提取 |
| 3.3 ZmMYB14转录因子克隆 |
| 3.4 ZmMYB14基因表达模式分析 |
| 3.5 ZmMYB14载体构建与自身特性研究 |
| 3.6 ZmMYB14与pZmBT1启动子片段间的作用模式分析 |
| 3.7 水稻的ZmMYB14基因外源表达材料构建与分析 |
| 4 试验结果 |
| 4.1 MYB候选转录因筛选 |
| 4.2 ZmMYB14克隆以及鉴定 |
| 4.3 ZmMYB14基因自身特性分析 |
| 4.4 ZmMYB14与ZmBT1启动子作用模式分析 |
| 4.5 淀粉合成相关酶基因启动子中MYB转录因子结合位点分析 |
| 4.6 ZmMYB14与淀粉合成相关酶基因启动子相互作用 |
| 4.7 水稻的ZmMYB14基因外源表达材料构建与分析 |
| 5 讨论 |
| 5.1 MYB转录因子的功能 |
| 5.2 MYB14参与玉米的淀粉合成调控 |
| 第五章 转录因子ZmNAC126调控玉米淀粉合成机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 试验材料 |
| 3 试验方法 |
| 3.1 基因共表达分析 |
| 3.2 RNA提取与候选基因表达分析 |
| 3.3 ZmNAC126基因克隆 |
| 3.4 ZmNAC126基因表达模式分析 |
| 3.5 ZmNAC16亚细胞定位分析 |
| 3.6 ZmNAC16激活特性的研究与激活结构域的分析 |
| 3.7 EMSA分析ZmNAC126与CACG重复基序作用 |
| 3.8 酵母单杂交研究转录因子与启动子间的直接相互作用 |
| 3.9 基因枪共转化玉米胚乳分析转录因子与启动子间的活性影响 |
| 4 试验结果 |
| 4.1 基因表达模式与共相关分析 |
| 4.2 筛选转录因子的表达分析 |
| 4.3 ZmNAC126基因克隆与序列分析 |
| 4.4 ZmNAC126基因的初步筛选 |
| 4.5 ZmNAC126基因的表达模式分析 |
| 4.6 ZmNAC126转录激活活性分析与激活活性片段研究 |
| 4.7 ZmNAC126定位在细胞核中 |
| 4.8 ZmNAC126蛋白诱导、纯化以及WB分析 |
| 4.9 ZmNAC126与CACG重复基序的结合 |
| 4.10 ZmNAC126能与淀粉合成相关酶基因启动子结合 |
| 4.11 玉米胚乳中过表达ZmNAC126基因能影响淀粉合成相关酶基因启动子的活性 |
| 5 讨论 |
| 5.1 NAC基因家族功能研究 |
| 5.2 基因表达模式分析可以基因功能研究提供导向 |
| 5.3 ZmNAC126与不同作用因子间的联系分析 |
| 第六章 总结与展望 |
| 1 全文总结 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 创新点 |
| 附录 |
| 作者简历 |
| 一、个人基本情况 |
| 二、教育经历 |
| 三、获奖情况 |
| 四、参加项目 |
| 五、攻读博士学位期间发表的学术论文 |
| 发表以及未发表文章中的主要研究内容 |
| 致谢 |
四、RT-PCR方法半定量在基因表达水平检测中的应用（论文参考文献）
- [1]元帅系苹果突变体的基因组变异检测及MdWD40和Md4CL的功能验证[D]. 韩丽娜. 甘肃农业大学, 2020(09)
- [2]功能化探针/载体在基因检测和治疗中的应用研究[D]. 唐亚琴. 重庆大学, 2020(02)
- [3]PRKAG2-AS1调控心肌细胞及内皮细胞凋亡的机制[D]. 苏婷. 中国人民解放军海军军医大学, 2020(02)
- [4]CBX7通过ITGβ3/TGFβ1/AKT信号通路在宫颈癌进展中的作用机制研究[D]. 田萍. 新疆医科大学, 2020
- [5]红花玉兰APETATAL1和AGAMOUS-LIKE 6同源基因克隆和功能研究[D]. 陈丽园. 北京林业大学, 2019
- [6]玉米Ac/Ds转座体系的构建及二穗短柄草BdSOC1-like基因功能的初步分析[D]. 段学清. 山东农业大学, 2019(01)
- [7]猪病毒性疫病高通量检测方法的建立和应用及NADC30-like PRRSV与ASFV的监测研究[D]. 邬旭龙. 四川农业大学, 2019(07)
- [8]探究Slc5a8在小鼠眼角膜上皮表达的时空分布[D]. 贾杨彦圣. 华侨大学, 2019(01)
- [9]OsCaM1-1和OsCML16调控水稻耐逆性机制的研究[D]. 杨俊. 华中农业大学, 2018(01)
- [10]转录因子ZmMYB14、ZmNAC126参与玉米淀粉合成调控机制研究[D]. 肖前林. 四川农业大学, 2017(03)