一、单克隆抗体酶标法检测人血清真胰岛素及其应用（论文文献综述）
古锦翠[1]（2019）在《基于蛋白质组学与免疫学方法的丝绸文物分析鉴定研究》文中进行了进一步梳理近些年来,丝绸的起源和传播得到了越来越多的研究学者关注,然而这一直是考古学界的一个未解之谜。蚕丝在种类上可以分为桑蚕丝、柞蚕丝、蓖麻蚕丝和栗蚕丝等,不同种类的蚕丝具有不同的结构和性能,以不同蚕丝为原料经过一系列工艺流程得到的丝绸样品也具有不同的形貌和结构,分析不同蚕丝种属以及不同文物样种属鉴定对研究丝绸的起源和传播具有重要意义。本论文通过采用蛋白质组学的方法分析现代蚕丝样品,获得不同种属蚕丝的标志性蛋白,建立基于蛋白质组学分析蚕丝种属鉴定的方法;通过分析不同蚕丝的氨基酸序列,选取特征肽段作为半抗原,偶联载体蛋白以获得具有免疫原性的完全抗原,通过动物免疫的方法制备抗体,建立基于免疫学原理的蚕丝种属鉴定方法;在此基础上继续分析老化样品,从免疫学的角度研究样品老化机理,为古代丝绸鉴定的研究提供理论基础。首先,采用铜乙二胺溶液提取不同蚕丝中的丝素蛋白,使用溶液内酶切的方法将蛋白酶解,利用超高效液相色谱串联质谱分析酶解之后的蛋白质,获得不同种属蚕丝的标志性蛋白。桑蚕丝标志性蛋白:编码为P05790和P21828的蛋白;柞蚕丝标志性蛋白:编码为O76786的蛋白;蓖麻蚕丝的标志性蛋白:编码为A0A0D5ZY13的蛋白;栗蚕丝的标志性蛋白:编码为B6ZIV6蛋白。将所建立起来的蛋白质组学方法应用到古代丝绸种属的鉴定上,可以有效的找到文物样样品中的标志性蛋白,从而确定文物样的种属。在蛋白质组学的研究基础上,分析不同种属蚕丝的氨基酸序列,获得桑蚕丝和柞蚕丝的特征肽段,制备针对桑蚕丝和柞蚕丝的不同抗体（兔抗桑蚕丝素蛋白序列抗体和兔抗柞蚕丝素蛋白序列抗体）,同时使用桑蚕丝素蛋白粉末作为完全抗原制备兔抗桑蚕丝素蛋白抗体和鼠抗桑蚕丝素蛋白抗体,通过免疫印迹（Western Blot）的方法将桑蚕丝从其它种属蚕丝中区分开来,继续使用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELSIA）的方法鉴别桑蚕丝和柞蚕丝,最终可以有效将桑蚕丝和柞蚕丝区分开来。将两种抗体应用到文物样的种属鉴定上,成功确定文物样种属,且结果与蛋白质组学检测结果相同。采用柞蚕丝素蛋白粉末为完全抗原,通过动物免疫的方法制备针对柞蚕丝的兔抗柞蚕丝素蛋白抗体,采用热老化和碱老化的方法获取老化柞蚕丝,将建立起来的免疫学的方法应用到老化样品的检测中,同时结合常规检测方法,分析柞蚕丝老化机理。发现碱老化比热老化对柞蚕丝的破坏程度高;检测柞蚕丝老化样品时,ELISA比Western Blot的方法更灵敏。综合上述研究,本课题建立了古代丝绸文物样品的蛋白质组学和免疫学鉴定体系。这一体系的建立为古代丝绸样品的鉴定提供了新的分析方法,也为丝绸的起源和传播研究提供了新的探索思路。
游秋实[2]（2018）在《基于免疫技术的纺织品文物种属鉴定研究》文中指出中国是世界上最早生产纺织品的国家之一。早在原始社会,人们就掌握了简单的纺织技术,通过搓、编、织将野生的麻做成衣服,以取代防寒保暖、遮羞蔽体的动物毛皮。随着农业、桑蚕业和畜牧业的发展,形成了以麻、丝、毛的为主要纺织原材料的中国古代纺织品体系。在漫长的历史长河中,纺织品文物见证了我国社会更替、经济发展和文化交融,是研究我国古代社会经济技术文化水平的珍贵史料。目前出土的纺织品中,蛋白类纺织品所占比例较大。该类纺织品易受到墓葬环境中水分、温度、酸碱度及微生物等影响而发生老化分解,从而引起大分子链的断裂,肽段的降解,出土时已成为碎片、微痕迹。因此,针对蛋白类纺织品文物的特点,建立科学有效的方法确定纺织品文物的种属,对追溯纺织品起源和研究人类文明有着十分重要的意义。本论文通过研究纺织品文物的特征蛋白,对比氨基酸序列筛选出特征多肽片段为半抗原,偶联载体蛋白,得到完全抗原;通过动物免疫和纯化鉴定,制备特异性抗体;对所得抗体的效价、灵敏度、特异性等性能进行测试评估,建立基于特异性抗体的酶联免疫检测方法,对蚕丝、羊毛、皮制品进行检测,从而实现对古代纺织品文物的种属鉴定。1)以桑蚕丝素蛋白的特征氨基酸序列为半抗原,制备兔抗桑蚕丝素蛋白抗体。采用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）测定对抗原的检出限达到158.49 ng/mL。进一步对蚕丝和丝织品进行检测,家蚕丝呈阳性结果,野蚕丝均呈阴性结果,可以有效地将家蚕丝从野蚕丝中鉴别出来。通过对文物样进行种属鉴定,确定两种文物样均为家蚕丝织品。2)以山羊毛角蛋白的特征氨基酸序列为半抗原和绵羊毛中提取的角蛋白为完全抗原,制备得到兔抗角蛋白P抗体和K抗体。P抗体和K抗体对抗原的检出限分别为6.81 ng/mL和81.39 ng/m L。采用两种抗体对羊毛和文物样进行检测,均呈阳性结果,证明文物样确实为羊毛织品。对两种羊毛进行蛋白组学测试,得到山羊毛的两种特征角蛋白片段分别为Q6R650、Q6R649。3)以牛皮胶原蛋白的特征氨基酸序列为半抗原,制备兔抗牛皮胶原蛋白抗体。采用ELISA测定对抗原的检出限达到904.74 ng/m L。对皮类样品进行检测,牛皮呈阳性结果,羊皮呈弱阳性结果。综上所述,本论文探索建立了基于免疫技术的蚕丝种属鉴定技术,为追溯丝绸起源提供了新的方法,也为古代蛋白类材料的种属鉴定开拓了新思路。
汪相宏[3]（2017）在《水稻蛋白糖基化类型及植物特异性糖苷的免疫原性研究》文中研究表明植物蛋白的特异性糖苷修饰一直被怀疑具有潜在的免疫原性,进入人体后可能具有安全性风险,因而限制了它的进一步应用。但这些数据均来自于叶片而不是种子,对种子蛋白的糖苷类型的研究非常有限,而关于其免疫原性的报道则基本没有。水稻胚乳是一种经济有效的生物反应器,因此,研究种子和叶片的糖苷类型差异以及植物特异性糖苷的免疫原性,对水稻胚乳细胞生物反应器的应用具有重要意义。在本研究中,为了探讨水稻胚乳细胞蛋白的糖苷修饰与叶片蛋白修饰间的差异以及植物特异性糖苷的免疫原性,我们首先获得了水稻胚乳特异性表达的人α-1,6-岩藻糖转移酶（FUT8）基因和β-1,4-半乳糖转移酶（GalT）基因水稻品系。为了加快育种进程,我们优化了一种利用水稻基因RBE4作为内参的定量PCR法,用于快速准确地筛选纯合子单株和鉴定转基因的拷贝数。通过杂交,把FUT8、GalT和hAAT（人α抗胰蛋白酶）这三个基因聚合起来,获得了部分人源化糖苷修饰的AAT转基因水稻品系,然后比较了不同糖苷修饰的AAT的糖基化结构,并对其免疫原性做出评价。主要研究结果如下:1.通过MALDI-TOF MS分析,我们发现水稻叶片和种子蛋白的糖苷修饰存在很大差异。种子糖蛋白中同时含有α-1,3-岩藻糖和β-1,2-木糖的结构占总糖苷的4.8-14.5%,而叶片中为27.9-44.2%;但是种子中仅含有β-1,2-木糖（不含α-1,3-岩藻糖）的结构有61.1-80.2%,而叶片中只有35.1-50.9%。2.我们将两个引入人类特异性N-连接糖苷修饰的α-1,6-岩藻糖转移酶基因和β-1,4-半乳糖转移酶基因——FUT8和GalT利用胚乳特异性启动子Glb转入水稻基因组中。通过MALDI-TOF MS分析,转基因水稻的储藏蛋白谷蛋白中可检测到6.8%的α-1,6-岩藻糖和1.9%的β-1,4-半乳糖。3.我们发现内源储藏蛋白谷蛋白和重组蛋白OsrAAT的糖苷结构都比较单一。但是谷蛋白中最主要的结构是MMX,而OsrAAT中最主要的结构是MXF,这两种结构几乎都占据了各自全部N-连接糖苷的50%。4.我们将FUT8、GalT和hAAT这三个基因聚合后发现,部分人源化AAT（mgOsrAAT）中含有38.4%的α-1,6-岩藻糖,并且α-1,3-岩藻糖的含量由植物源AAT（OsrAAT）中的 82.5%下降至 mgOsrAAT 中的 22.7%。5.我们在动物体内检验了 OsrAAT、mgOsrAAT和hAAT的免疫原性,结果发现这三者之间IgG、IgM和IgE滴度没有明显区别。6,豚鼠皮肤被动过敏反应（PCA）显示,植物特异性糖苷具有较弱的免疫原性,进一步分析显示其免疫原性主要来自α-1,3-岩藻糖而不是β-1,2-木糖。7.我们通过检测α-1,3-岩藻糖和β-1,2-木糖特异性抗体的抗体浓度,发现这三种蛋白免疫的兔血清间的抗体主要由α-1,3-岩藻糖产生。文献检索发现α-1,3-岩藻糖并不是植物特异性糖苷,因而推断植物蛋白的α-1,3-岩藻糖修饰并不会产生任何安全风险。8.在本研究中,我们优化了一种利用水稻内源基因RBE4作为内参基因,检测效率和准确性都很高的鉴定纯合子和拷贝数的方法。该方法鉴定的纯合子在单插入位点的准确性达到100%,双插入位点的准确性达到92.3%。通过本研究,我们发现植物糖苷的免疫原性较弱,且其免疫原性主要是由α-1,3-岩藻糖产生,而非β-1,2-木糖。鉴于临床应用的AAT中同样含有α-1,3-岩藻糖,我们推测植物糖苷对人体是安全的。
刘路[4]（2016）在《抗胰岛素单克隆抗体和多克隆抗体的制备》文中研究表明胰岛素是生物体内非常重要的降糖激素,它是糖尿病诊断、糖尿病相关研究及糖尿病治疗药物研发等过程中重要的检测指标和研究靶点。因此,检测胰岛素水平是必需的技术要求。目前,用于检测胰岛素含量的方法大都基于抗原抗体特异性反应的原理,因此制备高效、特异的抗胰岛素单克隆抗体和多克隆抗体是建立胰岛素检测方法的重要基础。在本研究中,我们制备了抗胰岛素单克隆抗体和多克隆抗体,并对抗体的特性进行初步研究,得到以下结果。1.检测抗胰岛素抗体水平的间接ELISA方法条件的优化。在进行阳性克隆筛选前我们要对测定抗体水平的间接ELISA方法的条件进行优化。本研究中我们分别从抗原包被浓度、小鼠血清稀释比例、封闭液种类、封闭时间、血清作用时间、酶标抗体稀释比例和孵育时间等反应条件进行了优化。优化结果如下:抗原最佳包被浓度为5μg/mL,小鼠血清最优稀释比例为1:100,最佳封闭液为1%BSA,其最优封闭时间为2 h,血清最佳作用时间为1.5 h,酶标抗体最佳稀释比例为1:6000,其最优作用时间为30 min。2.抗胰岛素单克隆抗体的制备。首先,我们用商品化的猪胰岛素作为抗原,采用背部多点注射和腹腔注射的方式免疫BALB/c小鼠,刺激小鼠产生免疫反应。三次免疫后,通过间接ELISA方法检测小鼠血清效价,优先选择效价高的小鼠进行加强免疫。然后在加强免疫后3天处死小鼠,无菌取脾,获得的脾细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞或者NS-1细胞通过化学试剂聚乙二醇（PEG）诱导融合。本研究中总共进行了4次细胞融合,经筛选和亚克隆,最后获得三株阳性杂交瘤细胞,分别为2D7、4D4和5D12。经Mouse单抗亚型鉴定试剂盒鉴定抗体亚型全为IgM型,轻链为Kappa。通过体内诱生的方法产生大量单克隆抗体,经测定,2D7、4D4、5D12腹水效价分别为1:3200、1:51200和1:12800。利用优球蛋白纯化法得到初纯抗体。最后,我们鉴定了抗体的特异性和交叉反应性。ELISA检测结果显示,三种单克隆抗体均与牛胰岛素发生交叉反应。Western blot实验结果提示,三种抗体可能识别胰岛素的构象性表位,而非线性表位。3.抗胰岛素多克隆抗体的制备。我们用商品化的猪胰岛素和牛胰岛素分别作为抗原,采用背部多点注射和腹腔注射的方式免疫豚鼠。一共免疫4次,最后免疫5天后,采用心脏取血的方法收集大量血清。利用间接ELISA方法测定血清效价,抗原为猪胰岛素的豚鼠血清效价为1:25600,抗原为牛胰岛素的豚鼠血清最高效价为1:51200。经饱和硫酸铵沉淀后,成功获得粗纯的多克隆抗体。随后我们鉴定了抗体的特异性和交叉反应性。ELISA检测结果显示,抗猪胰岛素多克隆抗体能与牛胰岛素发生交叉反应,且抗牛胰岛素多克隆抗体与猪胰岛素也能发生交叉反应。Western blot实验结果显示,两种多克隆抗体均能与猪胰岛素和牛胰岛素特异性结合。综上所述,我们成功地获得了3株分泌抗胰岛素单克隆抗体的杂交瘤细胞及其产生的单克隆抗体,同时也成功地制备出抗胰岛素多克隆抗体,并对抗体特性进行了初步研究,为实验室自行建立胰岛素水平的检测方法提供基础。
姚焱,李国祥,陈键[5]（2012）在《血清胰岛素TRFIA的建立》文中进行了进一步梳理目的建立血清胰岛素（Ins）时间分辨荧光免疫分析法（time-resolved fluoroimmunoassay,TRFIA）。方法采用一株Ins-MAb包被于固相微孔板上,另一株Ins-MAb用DTTA-Eu3+标记作为示踪剂采用Victor 1420荧光仪测定,。并对本法进行评价。结果本法的标准曲线范围为5～160 mU/L。灵敏度为0.35mU/L。检测3个浓度的Ins样品,批内CV为0.90%～4.10%,批间CV为4.55%～4.96%。平均回收率为97.7%～102.9%。用本法与DSL酶免分析方法同时测定80份血清样品,相关系数为0.982。结论本文建立的Ins-TRFIA具有特异性强、灵敏度高及操作简单等优点,适用于临床血清Ins的检测。
吴在荣,王宏锐[6]（2010）在《链霉亲和素-生物素化学发光免疫分析血清胰岛素方法建立及临床应用》文中认为目的:建立链霉亲和素-生物素双抗体夹心一步法测量人胰岛素化学发光免疫分析方法,并进行临床应用检测。方法:以链霉亲和素包被微孔板,生物素化一株单克隆抗体,辣根过氧化物酶标记另一株单克隆抗体。校准品与胰岛素国家标准品进行溯源,建立免疫分析方法,进行性能参数测试。收集40例正常人、12例1型、29例2型糖尿病人血清,统计整理参考值,并与国外同类试剂盒进行对比。结果:该方法回收率94.13%,线性范围（2～200）μIU/ml,灵敏度0.05μIU/ml,批内、批间变异系数（CV）分别为2.87%～7.06%和3.24%～9.14%,与牛胰岛素、猪胰岛素、人前胰岛素原、胰岛素样生长因子Ⅰ交叉反应率分别为27.2%、19.7%、0.16%、0.07%,与C肽、胰高血糖素、生长抑素无交叉反应。本法与国外同类试剂盒同时检测40份正常人葡萄糖耐量试验血清,r为0.9869,本法37℃7d热稳定性良好,建立一组正常人葡萄糖耐量参考值。结论:本法各项指标均满足临床检测要求,达到国外同类产品水平,反应快速,操作简单,便于临床检验应用。
史晓阳[7]（2010）在《真胰岛素测定评价瑞格列奈对初诊2型糖尿病胰岛功能的影响》文中指出研究背景临床上常用口服葡萄糖耐量-胰岛素释放试验（OG-IRT）来评价胰岛β细胞功能。因高糖毒性的抑制,常规OG-IRT不能客观地反映初诊糖尿病患者自身残存胰岛β细胞的储备功能。随着单克隆抗体技术的发展,高特异性的胰岛素检测方法越来越多,其所测定的是真正具有生物活性的胰岛素,称之为真胰岛素（true insulin,TI）或特异性胰岛素（specific insulin）。在2型糖尿病（T2DM）患者中,除了早时相分泌节律缺陷外,还存在着胰岛素分泌质量的下降,即胰岛素原（proinsulin, PI）占放射免疫性胰岛素（immunoreactive insulin, IRI）的比例增加,而TI相对减少。瑞格列奈是非磺脲类胰岛素促泌剂,与胰岛β细胞表面的36KD亚单位相结合,达峰时间快,半衰期短,可与受体快速结合、快速解离,具有使K+通道“快开快关”的特点,能够增加T2DM患者的早时相胰岛素分泌,恢复其生理性分泌节律。目的探讨瑞格列奈联合OG-IRT （RG-OG-IRT）在评价初诊T2DM患者胰岛β细胞功能方面的价值；评价瑞格列奈和格列苯脲对初诊T2DM患者胰岛β细胞功能影响的异同。对象与方法1.研究对象为2008年11月至2009年7月于河南省人民医院内分泌科就诊的初诊T2DM患者66例,随机分为瑞格列奈组36例,格列苯脲组30例。2.瑞格列奈组：入组时行OGTT检查,作为基线；次日于空腹状态下,提前15min服用2.0mg瑞格列奈后行OGTT检查,定义为瑞格列奈联合OGTT （RG-OG-IRT）；给与瑞格列奈2.0mg,每天3次,餐前15min口服：规则应用7d后重复前一步骤。留取三次检查的空腹、服糖后30min、120min静脉血标本。3.格列苯脲组：入组时行OGTT检查,作为基线；给与格列苯脲2.5mg,每天2次,餐前服用；规则应用7d后于空腹状态下,提前服用2.5mg格列苯脲后行OGTT检查。留取两次检查的空腹、服糖后30min、120min静脉血标本。4.各标本采集当时即测血糖,余离心后取血清于-80℃冻存,集中测定TI、IRI。用葡萄糖氧化酶法测定血糖,酶联免疫吸附法测定TI,放射免疫法测定IRI。5.计算TI／IRI及早时相胰岛素分泌指数△Ins30／△G30。结果1.RG-OG-IRT和规则治疗七天后再次行RG-OG-IRT,30min时TI分别为21.19±14.30 mIU／L和23.69±16.39mIU/L,与基线30min时TI水平（17.65±9.10mIU/L）有统计学差异（P<0.05,P<0.01）；基线30min时TI/IRI为0.65±0.06,RG-OG-IRT和治疗七天后分别为0.69±0.02、0.73±0.03,较基线显着增加（P<0.01）；以TI计算,两种情况的早时相分泌指数△Ins30／△G30分别为6.54±5.41、9.02±6.03,均较基线（2.75±4.46）显着升高（P<0.01）。2.格列苯脲组治疗后30minTI为18.88±9.73mIU/L,同基线水平无差异；120min时TI为32.80±18.86mIU/L,比基线120min时TI（27.81±16.83 mIU/L）显着增高（P<0.05）；基线30min时TI/IRI为0.64±0.09,规则治疗七天后为0.66±0.01,二者无统计学差异；以TI计算,治疗前后早时相分泌指数△Ins30／△G30无统计学差异。结论1.瑞格列奈显着改善T2DM患者早时相胰岛素分泌节律的缺陷。2.瑞格列奈显着增加早时相TI的释放量及其所占比例,改善T2DM患者早时相胰岛素分泌的质与量。3.瑞格列奈联合OG-IRT较常规OG-IRT能够更加客观地反映初诊T2DM患者胰岛β细胞的分泌和储备功能。4.对于血糖较高的初诊T2DM患者,瑞格列奈短期强化治疗后再次行瑞格列奈联合OG-IRT可以更加真实地评价其胰岛β细胞的分泌和储备功能。
张静[8]（2010）在《恩诺沙星化学发光酶免疫分析方法研究》文中指出恩诺沙星（Enrofloxacin, ENR）是一种氟喹诺酮类药物,广泛应用于兽医的疾病治疗。但近年来恩诺沙星应用时所产生的不良反应和耐药性报道越来越多,其在动物性食品中的残留直接威胁到人类身体健康。目前常用的兽药残留检测方法有高效液相色谱法（HPLC）,气相色谱法（GC）,薄层色谱法（TLC）等,这些方法存在样品前处理繁琐,仪器昂贵等问题因而不易推广。因此研究出一种简便快速且灵敏的测定ENR残留的方法,对于动物性食品兽药残留的检测具有实际意义。本实验建立了两种不同发光体系的ENR化学发光酶免疫分析方法（chemiluminescence enzyme immunoassay, CLEIA）,并进行了实际样品的检测。1.碱性磷酸酶-金刚烷（ALP-AMPPD）（?）体系CLEIA测定ENR方法的建立。包被缓冲液为0.05 mol/L碳酸盐缓冲液（CB, pH9.6）,包被抗体浓度为2μg/mL,包被方法为热包被,37℃,150分钟,采用碳化二亚胺的偶联方法,透析时间为6天,用0.01mol/L pH 7.2的PBS缓冲液稀释偶联物,最佳化学发光反应时间为8分钟,发光剂用CB缓冲液1：4（V发光剂：VCB）稀释后每孔加入25μL。在最佳检测条件下进行的竞争CLEIA检测,得到的ENR线性回归方程为：,其中Y为发光值的对数,x为相应ENR浓度的对数,相关系数为0.9977,线性范围为350～1000 pg/mL,检测限为239.9 pg/mL,批内RSD为7.33%～9.08%（n=5）,批间RSD为9.52%～13.28%（n=5）,标准回收率为96.3%～103.3%。2.辣根过氧化物酶-鲁米诺-过氧化氢（HRP-Luminol-H2O2）体系CLEIA测定ENR方法的建立。包被缓冲液为0.05 mol/L碳酸盐缓冲液（CB, pH9.6）,包被抗体浓度为3μg/mL,包被方法为热包被,37℃,150分钟,采用碳化二亚胺的偶联方法,透析时间为5天,用0.01 mol/L pH 7.2的PBS缓冲液稀释偶联物,封闭温度为25℃,封闭时间为2小时,封闭量为150μL/孔,最佳免疫反应时间为1小时,免疫反应温度为37℃,最佳化学发光反应时间为3分钟,发光剂用CB缓冲液1：2（V发光剂：VCB）稀释后每孔加入25μL。在最佳检测条件下进行的竞争CLEIA险测,得到的ENR线性回归方程为：其中Y为发光值的对数,x为相应ENR浓度的对数,相关系数为0.9974,线性范围在350～1000pg/mL之间,检测限为30.2pg/mL,批内RSD为7.75%～9.42%（n=5）,批间RSD为9.19%～13.05%（n=5）,标准回收率为99.9%～100.0%。3.实际样品检测中CLEIA法与HPLC法、ELISA法分析结果的比较,三种方法的检测限依次为30.2pg/mL,6.0ng/mL,3.6ng/mL,测定牛奶样品时,三种方法分别测定5次,其平均回收率依次为96.7%,88.6%,94.3%,相对标准偏差依次为8.27%,3.72%,10.28%；测定鸡蛋样品时,三种方法分别测定5次,其平均回收率依次为97.0%,90.8%,94.4%,相对标准偏差依次为7.98%,3.13%,9.40%；测定蜂蜜样品时,三种方法分别测定5次,其平均回收率依次为97.9%,89.2%,93.7%,相对标准偏差依次为8.46%,3.61%,10.07%；测定血浆样品时,三种方法分别测定5次,其平均回收率依次为98.2%,86.6%,92.5%,相对标准偏差依次为8.99%,4.09%,8.53%。
吴海燕[9]（2009）在《胰腺内分泌肿瘤患者血浆活性ghrelin、leptin和胰岛素（原）水平测定以及ghrelin和GHS-R 1A在肿瘤组织中的表达》文中研究表明研究背景胰岛素瘤是最常见的胰腺内分泌肿瘤,肿瘤大量分泌胰岛素（原）造成病人低血糖,多数患者为防止低血糖发作经常加餐导致超重或肥胖。研究表明,肽类激素ghrelin和leptin与肥胖及胰岛素的分泌相关。但是,在胰岛素瘤这一特殊的高胰岛素（原）血症的背景下,ghrelin和leptin的血浆水平与胰岛素（原）水平和肥胖之间的相关性目前尚不明确。Ghrelin和其受体是否在胰岛素瘤表达尚未见文献报道。研究目的1、观察胰岛素瘤和胰腺内分泌肿瘤病人血浆胰岛素（原）水平和ghrelin、leptin激素水平的相互关系;这些激素的变化与肥胖的关系。2、肿瘤病人血浆激素水平的变化以及激素和受体在肿瘤组织的表达是否和临床病理特点相关。实验方法选取2003年9月～2008年7月于我院确诊的40例胰岛素瘤以及11例非胰岛素瘤的PETs患者的术前血标本,以2006年6月～2008年8月收集的30例正常志愿者（与胰岛素瘤患者匹配年龄、性别和体重）的血标本作为对照,采用ELISA法检测血浆ghrelin,leptin、真胰岛素以及胰岛素原水平,并分析激素之间的相关性。在测定了血浆ghrelin水平的胰岛素瘤和PETs患者中,分别收集22个和8个肿瘤标本,同时选取5例正常胰腺组织及19例配对瘤旁胰腺组织作为对照,采用免疫组织化学染色的方法检测肿瘤和对照组织中ghrelin及其功能性受体GHS-R 1A的表达,并与血浆ghrelin水平进行相关性分析。统计患者的临床病理资料,包括以下项目:一般资料包括年龄,性别,BMI,患者是否为散发性胰岛素瘤;肿瘤特点包括原发肿瘤部位,肿瘤大小,良恶性,肿瘤数量。将患者的血浆激素水平以及ghrelin、GHS-R 1A在肿瘤组织中的表达与患者的临床病理资料进行统计分析。偏态分布的样本采用Mann-Whitney U检验、Kruskal-Wallis H检验、Spearman秩相关分析、Fisher’s精确概率检验以及两因素析因方差分析进行统计学检验,P＜0.05为差异有显着性。实验结果40例胰岛素瘤患者中,男17例,女23例,年龄18～74岁,中位数45岁,BMI 19.3～39.6 kg/m2,平均28.3±0.8 kg/m2（中位数27.9 kg/m2）。胰岛素瘤患者术前血浆活性ghrelin水平低于正常志愿者（0.017±0.001 ng/ml vs.0.021±0.002 ng/ml,P=0.044）,leptin、真胰岛素和胰岛素原水平显着高于正常志愿者(leptin:0.47±0.04 ng/ml vs.0.38±0.04 ng/ml,P=0.003;真胰岛素:29.2±9.8mU/L vs.4.0±0.7 mU/L,P=1.29×10-6;胰岛素原:24.7±4.9 pmol/L vs.2.1±0.3pmol/L,P=3.00×10-9)。肿瘤因素可独立影响血浆ghrelin水平（P=0.019）,并与体重因素协同影响血浆ghrelin水平（P=0.017）。肿瘤原发于胰腺头颈部的胰岛素瘤患者的血浆ghrelin水平显着高于肿瘤位于胰腺体尾部者（P=0.039）,血浆ghrelin水平与BMI和其他临床病理资料均不相关。胰岛素瘤患者leptin水平与真胰岛素水平和BMI正相关（P值均为0.028）,并在男性患者中显着低于女性患者（P=0.0001）,体重因素是血浆leptin水平的独立影响因素。胰岛素瘤患者的真胰岛素水平与BMI正相关（P=0.002）。11例非胰岛素瘤的PETs患者中,男4例,女7例,年龄33～66岁,中位数45岁,BMI 15.8～25.9 kg/m2,平均21.2±1.1 kg/m2（中位数20.7 kg/m2）。PETs患者血浆活性ghrelin、leptin、真胰岛素和胰岛素原水平分别为:0.016±0.005 ng/ml、0.34±0.03 ng/ml、5.5±1.4 mU/L和8.8±6.5 pmol/L,其中ghrelin水平显着低于正常志愿者（P=0.047）,leptin、真胰岛素和胰岛素原水平显着低于胰岛素瘤患者（P值分别为0.049,0.007和0.001）。PETs患者的血浆活性ghrelin与leptin正相关（P=0.015）,其他激素之间以及激素和肿瘤的临床病理资料间均不相关。Ghrelin和GHS-R 1A在胰岛素瘤组织中的表达率分别为82%和64%,阳性表达ghrelin的肿瘤组织中GHS-R 1A的阳性表达率显着高于不表达ghrelin者（78%vs.0%,P=0.010）。Ghrelin在肿瘤组织中阳性表达与否与患者的血浆活性ghrelin水平无关。GHS-R 1A阳性表达的胰岛素瘤患者平均年龄49.7±4.1岁（中位数50岁）,显着大于受体阴性表达者（37.1±3.0岁,中位数37.5岁,P=0.035）。Ghrelin和GHS-R 1A的表达与肿瘤的其他临床病理资料均不相关。Ghrelin和GHS-R 1A在非胰岛素瘤的PETs组织中的表达率分别为75%和88%,与其在胰岛素瘤中的表达无差别。二者的表达与PETs患者的血浆ghrelin水平及肿瘤的临床病理资料均不相关。实验结论胰岛素瘤患者和正常对照相比,激素水平有显着的不同,提示了胰岛素瘤患者中与肥胖相关的激素分泌紊乱。Ghrelin及其功能性受体GHS-R 1A同时在胰岛素瘤和PETs组织中较高表达,提示ghrelin可能通过自分泌或旁分泌的形式作用于这些肿瘤。
胡松[10]（2008）在《人类载脂蛋白AⅤ与血脂和炎症因子的关系以及TNF-α下调其表达的机制初探》文中提出背景冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary heart disease,CHD）是导致人类死亡和病残的主要疾病之一,血循环中甘油三酯（triglyceride,TG）水平的升高是其发病的独立危险因素。载脂蛋白（apolipoprotein）是调节血脂代谢的最重要因素,尤其是Apo AⅠ/CⅢ/AⅣ基因簇与血脂代谢联系非常紧密。通过比较人类和小鼠的该基因簇序列,人们发现了一种新的载脂蛋白——载脂蛋白AⅤ（apolipoprotein AⅤ,ApoAⅤ）。目前许多研究表明,Apo AⅤ是调节血循环中TG水平的最重要因素并且还可能影响高密度脂蛋白胆固醇（high densitylipoprotein-cholesterol,HDL-C）的代谢,但这些研究多是以动物为实验对象而且得出的结论互不一致,因此应该在人类自身进行Apo AⅤ的功能研究如与血脂的关系等。机体炎症通常伴有高甘油三酯血症,这与炎症细胞因子（inflammatory cytokine）有关。炎症细胞因子如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）能刺激和调节炎症反应,而且与极低密度脂蛋白胆固醇（very low density lipoprotein,VLDL）中的胆固醇及甘油三酯呈正相关而与HDL-C负相关,其具体机制尚不清楚。炎症因子是否可影响Apo AⅤ的表达从而升高血TG水平则有待进一步研究。目的应用基因工程技术,用质粒作为人类Apo AⅤ基因载体,转化并构建大肠杆菌原核表达系统表达重组人类Apo AⅤ蛋白并进一步将之纯化。免疫小鼠产生抗人类Apo AⅤ的单克隆抗体,建立检测人类Apo AⅤ的双抗体三明治夹心ELISA方法,进而观察健康中国人群中血清npo AⅤ与血脂、炎症因子高敏C反应蛋白（high sensitive Creaction protein,Hs-CRP）及TNF-α的关系。应用TNF-α刺激HepG2细胞株构建体外炎症反应细胞模型,探讨炎症反应对HepG2细胞ApoAⅤ基因表达、蛋白合成的影响,并进一步探讨其机制是否与核转录因子-κB（nuclear transcription factor-kappa B,NF-κB）活化有关。方法1.将人类Apo AⅤcDNA及载体质粒用限制性核酸内切酶切割再酶连以建立重组质粒,转化表达宿主大肠杆菌并以IPTG诱导重组蛋白表达,超声裂菌提取目的蛋白,Ni-NTA亲和层析法纯化,逐步透析法复性。2.将重组人类Apo AⅤ免疫Balb/c小鼠,提取免疫脾细胞,应用杂交瘤技术与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用HAT及HT进行选择培养,有限稀释法筛选阳性克隆以建立分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,注入小鼠腹腔制备腹水,亲和层析法纯化单抗,过碘酸钠法标记单克隆抗体,方阵法确定三明治双抗体夹心ELISA法的最佳实验条件。3.血清甘油三酯、总胆固醇浓度用酶法测定,HDL-C、LDL-C浓度采用化学遮蔽法直接测定;Hs-CRP用免疫透射比浊法测定;TNF-α用ELISA方法测定;应用针对不同抗原位点的抗重组npo AⅤ单克隆抗体配对,形成夹心三明治ELISA方法以检测人血清Apo AⅤ。4.体外培养HepG2细胞株,将培养的细胞分别以不同浓度的TNF-α分别作用或用相同浓度的TNF-α分别作用不同时间,或将NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨甲基甲酸盐（Pytrolidine dithiocarbanate,PDTC 50μmol/L）与TNF-α同时作用,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测npo AⅤmRNA表达,ELISA法检测NF-κB的活化,ELISA法检测细胞培养上清液中Apo AⅤ含量。结果人类npo AⅤcDNA插入pQE30质粒建立了重组质粒,转化到宿主菌诱导表达了目的蛋白,产物蛋白经亲和层析纯化后见蛋白纯度较高。重组蛋白免疫小鼠制备了两株单克隆抗体1E8、2G1,两种单抗有不同的抗原结合位点,均属于IgG1亚类。1E8的亲和常数为7.153×1010M-1,2G1的亲和常数为1.054×1011M-1。两株单克隆抗体只能检测到重组Apo AⅤ蛋白,不与其他相关抗原或无关抗原反应;两株单克隆抗体形成三明治双抗体夹心ELISA法测定健康中国人血清Apo AⅤ浓度为182.7±104.7ng/ml,其浓度与TG呈负相关（r=-0.225,P=0.031）,与HDL-C正相关（r=0.453,P＜0.001）,与体重指数负相关（r=-0.345,P=0.001）,与Hs-CRP及TNF-α在总体上呈负相关（Hs-CRP r=-0.300,P=0.004;TNF-αr=-0.424,P=0.001）。不同浓度的TNF-α作用于HepG2细胞作用不同时间,发现HepG2细胞表达npoAⅤmRNA表达下降,培养上清液中npo AⅤ含量减少,作用呈显着的剂量和时间依赖性（P＜0.01）;Apo AⅤmRNA的表达量与NF-κB的活化成反比,而PDTC可明显抑制这种作用（P＜0.01）。结论利用大肠杆菌成功表达并纯化了目的蛋白,通过免疫小鼠制备了单克隆抗体,建立了检测人类Apo AⅤ的双抗体夹心ELISA方法。人血清中载脂蛋白AⅤ含量极低,并与甘油三酯呈负相关,与高密度脂蛋白胆固醇正相关,与体重指数负相关,与炎症因子Hs-CRP及TNF-α负相关。TNF-α能下调HepG2细胞中Apo AⅤ的基因表达及蛋白合成水平,NF-κB的激活参与了此过程。
二、单克隆抗体酶标法检测人血清真胰岛素及其应用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、单克隆抗体酶标法检测人血清真胰岛素及其应用（论文提纲范文）
（1）基于蛋白质组学与免疫学方法的丝绸文物分析鉴定研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 丝绸文物概况 |
| 1.3 丝绸类文物鉴定方法 |
| 1.4 蛋白质组学技术介绍 |
| 1.4.1 蛋白质组学技术简介 |
| 1.4.2 蛋白质组学技术的应用 |
| 1.5 免疫学检测技术介绍 |
| 1.5.1 免疫学技术简介 |
| 1.5.2 免疫学技术的应用 |
| 1.6 课题的提出和意义 |
| 1.7 研究技术路线、难点与创新点 |
| 1.7.1 研究技术路线 |
| 1.7.2 技术难点 |
| 1.7.3 技术创新点 |
| 第二章 基于蛋白质组学方法的丝绸文物分析鉴定研究 |
| 2.1 实验试剂及仪器 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 文物样品 |
| 2.2.2 溶液的配制 |
| 2.2.3 实验材料的制备 |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.3.1 样品的处理 |
| 2.3.2 LC-MS/MS 质谱分析 |
| 2.3.3 数据库检索分析 |
| 2.4 实验材料表征及测试 |
| 2.4.1 表观形貌的表征 |
| 2.4.2 化学结构的表征 |
| 2.5 结果与讨论 |
| 2.5.1 表观形貌结果分析 |
| 2.5.2 化学结构结果分析 |
| 2.5.3 LC-MS/MS 结果分析 |
| 2.5.4 蚕丝标志性蛋白的选择 |
| 2.5.5 丝绸文物样的种属鉴定 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 基于免疫学方法的丝绸文物分析鉴定研究 |
| 3.1 实验试剂与仪器 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 样品的介绍 |
| 3.2.2 溶液的配制 |
| 3.2.3 实验材料的制备 |
| 3.3 实验步骤 |
| 3.3.1 抗原的制备 |
| 3.3.2 抗体的制备 |
| 3.3.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹测试 |
| 3.3.4 酶联免疫测试 |
| 3.4 实验材料表征及测试 |
| 3.4.1 聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳 |
| 3.4.2 抗体特异性检测 |
| 3.5 结果讨论与分析 |
| 3.5.1 SDS-PAGE 电泳结果 |
| 3.5.2 抗体的特异性检测 |
| 3.5.3 酶联免疫检测结果 |
| 3.5.3.1 间接酶联免疫对抗体最佳稀释倍数的选择 |
| 3.5.3.2 间接酶联免疫对丝素蛋白的交叉鉴定 |
| 3.5.3.3 间接酶联免疫对文物样品的种属鉴定 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 基于免疫学方法的蚕丝老化分析鉴定研究 |
| 4.1 实验试剂及仪器 |
| 4.1.1 实验试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.2 溶液的配制 |
| 4.2.3 实验材料的制备 |
| 4.3 实验步骤 |
| 4.3.1 样品的制备 |
| 4.3.2 抗原的制备 |
| 4.3.3 抗体的制备 |
| 4.3.4 间接酶联免疫测试步骤 |
| 4.3.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹检测步骤 |
| 4.4 实验材料表征及测试 |
| 4.4.1 化学结构表征 |
| 4.4.2 氨基酸分析 |
| 4.4.3 分子量表征 |
| 4.5 结果讨论与分析 |
| 4.5.1 化学结构分析 |
| 4.5.2 氨基酸分析 |
| 4.5.3 分子量变化分析 |
| 4.5.4 间接酶联免疫检测结果分析 |
| 4.5.4.1 抗原抗体最佳结合条件的选择 |
| 4.5.4.2 间接ELISA检测结果 |
| 4.5.5 免疫印迹检测结果分析 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 附：攻读硕士期间取得与学位论文直接相关的成果 |
| 致谢 |
（2）基于免疫技术的纺织品文物种属鉴定研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 蛋白类纺织品文物概述 |
| 1.2.1 丝织品 |
| 1.2.2 羊毛织品 |
| 1.3 皮制品文物概述 |
| 1.4 蛋白类文物的鉴定方法 |
| 1.5 免疫检测技术介绍 |
| 1.5.1 免疫检测技术的发展历史 |
| 1.5.2 酶联免疫技术 |
| 1.6 免疫检测技术在考古学中的应用 |
| 1.7 课题的背景和意义 |
| 1.8 研究技术路线、难点与创新点 |
| 1.8.1 研究技术路线 |
| 1.8.2 难点 |
| 1.8.3 创新点 |
| 第二章 基于免疫技术的蚕丝种属鉴定研究 |
| 2.1 实验试剂与仪器 |
| 2.1.1 实验试剂 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 样品的介绍 |
| 2.2.2 溶液的配制 |
| 2.2.3 实验材料的预处理 |
| 2.3 实验步骤 |
| 2.3.1 包被抗原的制备 |
| 2.3.2 特异性兔抗丝素蛋白抗体的制备 |
| 2.3.3 酶联免疫测试步骤 |
| 2.3.3.1 间接酶联免疫测试 |
| 2.4 实验样品表征及测试 |
| 2.4.1 表观形貌的表征 |
| 2.4.2 二级结构的表征 |
| 2.4.3 氨基酸分析 |
| 2.5 结果与讨论 |
| 2.5.1 表观形貌分析 |
| 2.5.2 二级结构分析 |
| 2.5.3 氨基酸分析 |
| 2.5.4 酶联免疫检测结果分析 |
| 2.5.4.1 抗原抗体最佳结合的确定 |
| 2.5.4.2 一抗的灵敏度和特异性测试 |
| 2.5.4.3 蚕丝的种属鉴定 |
| 2.5.4.4 丝织品文物的种属鉴定 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 基于免疫技术的羊毛种属鉴定研究 |
| 3.1 实验试剂与仪器 |
| 3.1.1 实验试剂 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 样品的介绍 |
| 3.2.2 溶液的配制 |
| 3.2.3 实验材料的预处理 |
| 3.3 实验步骤 |
| 3.3.1 包被抗原的制备 |
| 3.3.2 特异性兔抗角蛋白抗体的制备 |
| 3.3.3 酶联免疫测试步骤 |
| 3.3.3.1 间接酶联免疫测试 |
| 3.3.3.2 标准样的制备 |
| 3.3.4 蛋白组学测试步骤 |
| 3.4 实验样品表征及测试 |
| 3.4.1 表观形貌的表征 |
| 3.4.2 傅里叶红外（FTIR）测试 |
| 3.5 结果与讨论 |
| 3.5.1 表观形貌分析 |
| 3.5.2 傅里叶红外（FTIR）测试分析 |
| 3.5.3 酶联免疫检测结果分析 |
| 3.5.3.1 抗体的表征及效价测试 |
| 3.5.3.2 抗原抗体最佳结合的确定 |
| 3.5.3.3 一抗的灵敏度和特异性测试 |
| 3.5.3.4 ELISA的重复性测试 |
| 3.5.3.5 羊毛的种属鉴定 |
| 3.5.3.6 毛织品文物样的种属鉴定 |
| 3.5.4 蛋白组学测试结果分析 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 基于免疫技术的皮类种属鉴定研究 |
| 4.1 实验试剂与仪器 |
| 4.1.1 实验试剂 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 样品的介绍 |
| 4.2.2 溶液的配制 |
| 4.2.3 实验材料的预处理 |
| 4.3 实验步骤 |
| 4.3.1 抗原的制备 |
| 4.3.2 特异性兔抗胶原蛋白抗体的制备 |
| 4.3.3 酶联免疫测试步骤 |
| 4.3.3.1 直接酶联免疫测试 |
| 4.3.3.2 间接酶联免疫测试 |
| 4.4 结果与讨论 |
| 4.4.1 抗体的效价测试 |
| 4.4.2 抗原抗体最佳结合的确定 |
| 4.4.3 一抗的灵敏度和特异性测试 |
| 4.4.4 皮类的种属鉴定 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间取得与学位论文直接相关的成果 |
| 致谢 |
（3）水稻蛋白糖基化类型及植物特异性糖苷的免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 第一节 生物制药的发展及现状 |
| 第二节 生物制药的种类 |
| 1.2.1 抗体类药物 |
| 1.2.2 重组蛋白类药物 |
| 1.2.3 疫苗 |
| 1.2.4 细胞因子 |
| 1.2.5 其他 |
| 第三节 用于生物制药的各种表达体系 |
| 1.3.1 微生物生物反应器 |
| 1.3.2 动物生物反应器 |
| 1.3.3 植物生物反应器 |
| 1.3.3.1 植物生物反应器的宿主研究进展 |
| 1.3.3.2 不同类型植物生物反应器的研究进展 |
| 第四节 糖蛋白的N-糖基化修饰的研究进展 |
| 1.4.1 N-糖基化修饰的功能及特点 |
| 1.4.1.1 N-糖基化修饰对蛋白结构和功能的影响 |
| 1.4.1.2 N-糖基化修饰的不均一性 |
| 1.4.1.3 N-糖基化修饰对生物蛋白药物功能的重要作用 |
| 1.4.2 不同表达体系中N-糖基化修饰的差异 |
| 1.4.2.1 动物和植物中N-糖基化修饰的不同 |
| 1.4.2.2 不同物种间N-糖基化修饰的差异 |
| 1.4.2.3 不同器官和组织间N-糖基化修饰的差异 |
| 1.4.2.4 不同细胞器中N-糖基化修饰的差异 |
| 1.4.2.5 不同生长周期中N-糖基化修饰的不同 |
| 1.4.3 植物特异性N-糖基化修饰的免疫原性 |
| 第五节 植物细胞人源化N-糖基化修饰的研究进展 |
| 第二章 水稻不同品种及不同组织的糖基化修饰 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 实验材料和方法 |
| 2.2.1 供试材料品种 |
| 2.2.2 总蛋白提取 |
| 2.2.3 糖苷的分离与纯化 |
| 2.2.4 MALDI-TOF MS |
| 第三节 实验结果 |
| 2.3.1 水稻不同品种种子蛋白的N-糖基化修饰分析 |
| 2.3.2 水稻不同品种叶片的N-糖基化修饰研究 |
| 2.3.3 水稻种子和叶片蛋白的N-糖基化修饰类型比较 |
| 2.3.4 水稻种子和叶片中N-连接糖苷定量分析 |
| 第四节 小结和讨论 |
| 第三章 水稻胚乳中人源化糖苷修饰研究 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 实验材料和方法 |
| 3.2.1 载体构建和水稻转化 |
| 3.2.2 水稻种子的总蛋白提取 |
| 3.2.3 水稻种子储藏谷蛋白提取 |
| 3.2.4 Western blotting分析 |
| 3.2.5 转基因单株的纯合子筛选 |
| 3.2.6 水稻胚乳储藏谷蛋白的糖基化结构分析 |
| 3.2.7 α-1,6-岩藻糖含量的定量分析 |
| 3.2.8 转基因的聚合 |
| 第三节 实验结果 |
| 3.3.1 过量表达FUT8和GalT基因的转基因植株的获得 |
| 3.3.2 转基因水稻种子中谷蛋白的N-连接糖苷结构分析 |
| 第四节 小结和讨论 |
| 第四章 不同糖苷修饰背景下人α抗胰蛋白酶的糖基化修饰分析 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 实验材料和方法 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 纯合子筛选 |
| 4.2.3 Western blotting分析 |
| 4.2.4 重组AAT的纯化 |
| 4.2.5 重组AAT糖基结构分析 |
| 第三节 实验结果 |
| 4.3.1 表达人源化糖苷修饰的AAT转基因品系选育 |
| 4.3.2 重组AAT的纯化与分析 |
| 4.3.3 OsrAAT和mgOsrAAT的N-糖基化结构分析 |
| 第四节 小结和讨论 |
| 第五章 OsrAAT和mgOsrAAT免疫原性的比较 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 实验材料和方法 |
| 5.2.1 实验材料 |
| 5.2.2 家兔免疫 |
| 5.2.2.1 样品配置 |
| 5.2.2.2 实验分组 |
| 5.2.2.3 给药方法 |
| 5.2.2.4 样本采集及处理 |
| 5.2.2.5 一般临床观察 |
| 5.2.2.6 血清中抗体效价测定 |
| 5.2.2.7 血清中AAT特异IgG、IgM和IgE的测定 |
| 5.2.3 被动致敏实验 |
| 5.2.3.1 动物分组 |
| 5.2.3.2 致敏 |
| 5.2.3.3 激发 |
| 5.2.3.4 结果判定 |
| 5.2.4 血清中植物特异性糖苷的抗体浓度检测 |
| 第三节 实验结果 |
| 5.3.1 一般临床观察 |
| 5.3.2 不同来源AAT的抗体效价分析 |
| 5.3.3 血清中抗AAT的IgG、IgM和IgE含量分析 |
| 5.3.4 豚鼠皮肤被动过敏 |
| 5.3.5 血清中植物特异性α-1,3-岩藻糖和β-1,2-木糖的抗体浓度 |
| 第四节 小结和讨论 |
| 附 一种快速鉴定转基因纯合子及拷贝数的方法 |
| 第一节 前言 |
| 第二节 实验材料和方法 |
| 2.1 供本实验的转基因品系 |
| 2.2 基因组DNA提取 |
| 2.3 PCR扩增和引物 |
| 2.4 SYBR Green定量PCR |
| 2.5 转基因纯合子的鉴定 |
| 2.6 纯合子植株的PCR验证 |
| 2.7 转基因拷贝数的确定 |
| 2.8 Southern杂交分析 |
| 第三节 实验结果 |
| 3.1 用于纯合子鉴定的内参基因的选择 |
| 3.2 利用Ct值(2~(-△△Ct))鉴定转基因植株的纯合子和杂合子 |
| 3.3 在T2代中验证已检测出的纯合子的准确性 |
| 3.4 用于确定插入位点数及验证 |
| 第四节 小结和讨论 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的文章及专利 |
| 专利及奖励 |
| 致谢 |
（4）抗胰岛素单克隆抗体和多克隆抗体的制备（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 文献综述 |
| 一、胰岛素及其应用 |
| （一）胰岛素的分子结构 |
| （二）胰岛素的生物学功能及应用 |
| 二、胰岛素检测手段 |
| （一）放射免疫分析法 |
| （二）免疫放射分析法 |
| （三）酶联免疫分析法 |
| （四）荧光免疫分析法 |
| （五）化学发光免疫分析法 |
| （六）其他新型的检测技术 |
| 三、抗体的研究进展及其应用 |
| （一）抗体制备技术 |
| （二）抗体研究进展 |
| （三）抗体的应用 |
| 四、本课题研究的目的与意义 |
| 第二部分 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| （一）实验仪器及器材 |
| （二）实验动物及细胞系 |
| （三）实验试剂 |
| （四）主要溶液配制 |
| 二、实验方法 |
| （一）细胞培养相关实验方法 |
| （二）间接ELISA |
| （三）抗胰岛素单克隆抗体制备 |
| （四）抗胰岛素多克隆抗体制备 |
| （五）SDS-PAGE电泳分离和考马斯亮蓝染色 |
| （六）抗体特性鉴定 |
| 第三部分 实验结果 |
| 一、不同物种来源的胰岛素蛋白质序列对比 |
| 二、检测抗体水平的间接ELISA方法条件的优化 |
| （一）检测抗胰岛素单抗的间接ELISA方法最佳工作条件的确立 |
| （二）检测抗胰岛素多抗的间接ELISA方法最佳工作条件的确立 |
| 三、抗胰岛素单克隆抗体制备 |
| （一）小鼠加强免疫前小鼠血清效价测定 |
| （二）细胞融合 |
| （三）阳性克隆检测、筛选及亚克隆 |
| （四）单抗亚型鉴定 |
| （五）单抗腹水制备及效价检测 |
| （六）单抗纯化 |
| （七）单抗交叉反应性分析 |
| 四、抗胰岛素多克隆抗体制备 |
| （一）免疫动物血清效价测定 |
| （二）多抗纯化 |
| （三）多抗纯化后效价测定 |
| （四）多抗交叉反应性分析 |
| 第四部分 讨论 |
| 第五部分 结论 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）链霉亲和素-生物素化学发光免疫分析血清胰岛素方法建立及临床应用（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 仪器: |
| 1.1.2 试剂 |
| 1.1.3 样本 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 链霉亲和素包被板的制备 |
| 1.2.2 生物素化抗体的制备 |
| 1.2.3 酶标记抗体的制备 |
| 1.2.4 校准品的配制 |
| 1.2.5 抗体反应液的配制 |
| 1.2.6 操作步骤 |
| 1.2.7 统计学处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 本方法的主要技术参数 |
| 2.1.1 回收率 |
| 2.1.2 线性范围 |
| 2.1.3 灵敏度 |
| 2.1.4 精密度 |
| 2.1.5 特异性 |
| 2.1.6 健全性 |
| 2.1.7 发光底物最佳测量时间 |
| 2.1.8 稳定性 |
| 2.2 本法血清胰岛素参考值 |
| 2.3 与国外同类试剂盒的比较 |
| 2.4 本法与其他免疫分析方法的比较 |
| 3 讨论 |
（7）真胰岛素测定评价瑞格列奈对初诊2型糖尿病胰岛功能的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 论文正文 |
| 前言 |
| 对象与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（8）恩诺沙星化学发光酶免疫分析方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 食品安全与兽药残留 |
| 1.2 化学发光免疫分析概述 |
| 1.3 课题研究的目的意义及主要内容 |
| 第二章 ALP-AMPPD体系CLEIA测定恩诺沙星方法的建立 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料及步骤 |
| 2.3 ENR包被单克隆抗体的考察 |
| 2.4 ENR酶标记物的制备及优化 |
| 2.5 ENR化学发光反应的考察 |
| 2.6 ALP-AMPPD体系CLEIA方法的建立 |
| 2.7 本章讨论 |
| 2.8 本章小结 |
| 第三章 HRP-Luminol-H_2O_2体系CLEIA测定恩诺沙星方法的建立 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料及步骤 |
| 3.3 ENR包被单克隆抗体的考察 |
| 3.4 ENR酶标记物的制备及优化 |
| 3.5 ENR免疫反应的考察 |
| 3.6 ENR化学发光反应的考察 |
| 3.7 HRP-Luminol-H_2O_2体系CLEIA方法的建立 |
| 3.8 本章讨论 |
| 3.9 本章小结 |
| 第四章 实际样品中CLEIA法与HPLC法、ELISA法分析结果的比较 |
| 4.1 ENR高效液相色谱检测方法的建立 |
| 4.2 ENR酶联免疫吸附检测方法的建立 |
| 4.3 CLEIA法检测样品中ENR的残留 |
| 4.4 HPLC检测方法的分析结果 |
| 4.5 ELISA检测方法的分析结果 |
| 4.6 CLEIA检测实际样品中ENR的含量 |
| 4.7 三种检测方法的分析结果比较 |
| 4.8 本章讨论 |
| 4.9 本章小结 |
| 总结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（9）胰腺内分泌肿瘤患者血浆活性ghrelin、leptin和胰岛素（原）水平测定以及ghrelin和GHS-R 1A在肿瘤组织中的表达（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 实验材料 |
| 第一部分 胰岛素瘤患者血浆活性ghrelin、leptin和胰岛素(原)水平测定以及ghrelin和GHS-R 1A在肿瘤组织中的表达 |
| 方法 |
| 结果 |
| 第二部分 其他胰腺内分泌肿瘤患者血浆活性ghrelin、leptin和胰岛素(原)水平测定以及ghrelin和GHS-R 1A在肿瘤组织中的表达 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 致谢 |
（10）人类载脂蛋白AⅤ与血脂和炎症因子的关系以及TNF-α下调其表达的机制初探（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语 |
| 第一章 重组人类载脂蛋白AV的表达及纯化 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二章 抗人类载脂蛋白AV单克隆抗体的制备及其应用 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 人血清载脂蛋白AV浓度及其与血脂和炎症因子的关系 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 肿瘤坏死因子-α对载脂蛋白AV表达的调节以及核转录因子-κB在其中的作用 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 载脂蛋白AV研究新进展 |
| 致谢 |
| 发表论文情况 |
四、单克隆抗体酶标法检测人血清真胰岛素及其应用（论文参考文献）
- [1]基于蛋白质组学与免疫学方法的丝绸文物分析鉴定研究[D]. 古锦翠. 浙江理工大学, 2019(06)
- [2]基于免疫技术的纺织品文物种属鉴定研究[D]. 游秋实. 浙江理工大学, 2018(07)
- [3]水稻蛋白糖基化类型及植物特异性糖苷的免疫原性研究[D]. 汪相宏. 武汉大学, 2017(06)
- [4]抗胰岛素单克隆抗体和多克隆抗体的制备[D]. 刘路. 东北师范大学, 2016(04)
- [5]血清胰岛素TRFIA的建立[J]. 姚焱,李国祥,陈键. 标记免疫分析与临床, 2012(01)
- [6]链霉亲和素-生物素化学发光免疫分析血清胰岛素方法建立及临床应用[J]. 吴在荣,王宏锐. 放射免疫学杂志, 2010(05)
- [7]真胰岛素测定评价瑞格列奈对初诊2型糖尿病胰岛功能的影响[D]. 史晓阳. 山东大学, 2010(08)
- [8]恩诺沙星化学发光酶免疫分析方法研究[D]. 张静. 郑州大学, 2010(06)
- [9]胰腺内分泌肿瘤患者血浆活性ghrelin、leptin和胰岛素（原）水平测定以及ghrelin和GHS-R 1A在肿瘤组织中的表达[D]. 吴海燕. 中国协和医科大学, 2009(07)
- [10]人类载脂蛋白AⅤ与血脂和炎症因子的关系以及TNF-α下调其表达的机制初探[D]. 胡松. 中南大学, 2008(12)