一、从桑树营养组织中提取高纯度DNA的方法（论文文献综述）
陈丹丹[1]（2018）在《桑树钾离子通道及转运体相关基因的克隆及表达分析》文中研究说明钾是植物得以生存不可缺的营养物质,能够参与植物中一系列重要的生理功能。由于土壤中的钾离子含量不断变化,并且自然界中存在各种形式的胁迫,植物需要灵活进行钾离子的转运。本研究主要是对桑树中钾离子通道及转运体相关基因克隆及相关功能进行验证分析,深入钻研钾在植物中被高效运用的分子机制,为研发钾创新品种创造可信的分子基础,实现改善人类的生存环境、蚕桑业的可持续发展。主要研究内容如下:1.桑树低钾胁迫的生理生化指标测定、转录组测序初步分析及差异基因的表达鉴定。低钾胁迫下,用试剂盒测定其生理生化指标POD、SOD、MDA、叶绿素、BCA和PRO的表达水平都有不同程度的变化趋势。使用正常状态和低钾胁迫的鲁桑嫩叶做转录组测序分析,共获得12.91Gb Clean Data,各样品Clean Data均达到6.44Gb,Q30碱基百分比在87.33%及以上,其比对效率从51.62%到53.31%不等。根据比对结果进行一系列生物信息学分析,依照基因的表达量进行差异表达分析,功能富集和注释等,并且验证分析了12个差异基因的表达状况。2.桑树内向整流型K+通道KAT2基因的克隆、序列及表达分析。从鲁桑育71-1品种克隆获得MaKAT2基因,其序列长度为2528bp,含有开放读码框长为2385bp,可以对794个氨基酸残基进行编码,理论上其蛋白质分子质量和等电点分别为90.073kD,7.11,属于ANK-2超级家族。用生物信息学探究其与不同植物物种的关系以了解其进化状态。定量PCR结果显示,MaKAT2基因在干旱、高盐、低温和低钾四种胁迫条件下,其表达有不同的变化应答。3.桑树弱内向整流型K+通道AKT2基因的克隆、序列表达分析。从鲁桑育71-1品种克隆获得MaAKT2基因,其序列长度为2703bp,含有开放读码框长为2556bp,可以对851个氨基酸残基进行编码,理论上其蛋白质分子质量和等电点分别为96.901kD,6.3,属于ANK-2超级家族。用生物信息学探究其与不同植物物种的关系以了解其进化状态。定量PCR结果显示,MaAKT2基因在干旱、高盐、低温和低钾四种胁迫条件下,其表达有不同的变化应答。4.桑树KCO通道KCO5基因的克隆、序列分析及表达分析。从鲁桑育71-1品种克隆得到MaKCO5基因,其序列长度为1282bp,含有开放读码框长为1137bp,可以对378个氨基酸残基进行编码,理论上其蛋白质分子质量和等电点分别为44.435kD,6.35,属于Ion-trans-2超级家族。用生物信息学探究其与不同植物物种的关系以了解其进化状态。运用基因克隆技术进行原核表达,将目的基因MaKCO5和pET-28a融合构建表达载体并转入大肠杆菌。定量PCR结果显示,MaKCO5基因在干旱、高盐、低温和低钾四种胁迫条件下,其表达有不同的变化应答。5.桑树高亲和钾转运体HAK5基因的克隆、序列分析及表达分析。从鲁桑育71-1品种克隆获得MaHAK5基因,其序列长度为2625bp,含有开放读码框长为2478bp,可以对825个氨基酸残基进行编码,理论上其蛋白质分子质量和等电点分别为92.165kD,8.37,属于K-trans超级家族。用生物信息学探究其与不同植物物种的关系以了解其进化状态。定量PCR结果显示,MaHAK5基因在干旱、高盐、低温和低钾四种胁迫条件下,其表达有不同的变化应答。
李瑞雪[2]（2018）在《桑树耐旱关联microRNA及其靶基因鉴定与功能分析》文中研究表明MicroRNAs（miRNAs）是生物体内一类非编码小RNA分子,长度约为21-24个碱基,主要通过对靶基因mRNA的翻译抑制、降解等负调控的方式在转录后水平精确有效地调控基因的表达。植物miRNA能响应干旱、高盐、低温等非生物胁迫,在植物抗逆过程中发挥重要作用。各种逆境条件会对桑树的生长造成重大影响,研究桑树（Morus alba L.）一些重要的miRNA及其靶基因的功能和它们在胁迫条件下的生理生化、分子适应机制,对提高桑树的抗逆性、保存桑树种质资源和提高桑树产量有重要作用,同时为利用桑树作为生态林树种各方面的作用提供科学支撑。本研究通过高通量深度降解组测序技术系统全面的鉴定了桑树耐旱关联miRNA及其靶基因,通过瞬时转化及VIGS等方法对筛选出的关键miRNA及靶基因的抗旱功能进行了分析,探究了桑树耐旱的分子机制,主要的研究结果如下:一、利用高通量深度降解组测序技术鉴定桑树耐旱关联miRNA及其靶基因通过桑树深度高通量降解组测序,在对照文库（CL）中,分别鉴定出30个保守miRNA家族的409个靶基因和199个新miRNA的990个靶基因,在干旱文库（DL）中,分别鉴定出30个保守miRNA家族的373个靶基因和195个新miRNA的950个靶基因。DL保守miRNA家族中,miR156、miR172和miR396家族靶向最多数量的靶基因,推测这3个保守miRNA家族在桑树响应干旱胁迫中可能起到重要作用。通过分析miRNA-target分子网络图,我们发现在DL特有网络图中,有838个miRNA-mRNA pairs,占DL中总miRNA-mRNA pairs的63.34%。利用荧光定量PCR检测了11个靶基因和12个miRNA在干旱胁迫下的表达模式。通过RLM-5’RACE验证了6个靶基因的剪切位点,证明降解组测序得出的结果是非常准确的。GO注释和KEGG通路分析表明这些靶基因参加广泛的生物过程和各种代谢途径。二、桑树miR166f瞬时转化过表达鉴定其抗旱功能获得了桑树miR166f的前体序列,发现成熟体miR166f在前体的3’臂上,miR166f前体序列最小折叠自由能（MEFs）为-51.70 kcal/mol,具有典型的植物miRNA前体二级结构特征;miR166f 5’端上游除了包含典型的具有转录起始功能的TATA-box和CAAT-box外,还含有多个胁迫响应顺式作用元件和一些激素响应元件;建立了桑树miR166f瞬时转化体系,当转化液浓度OD600为0.7、瞬时转化4 d时,叶片GUS组织化学染色效果最好,同时该处理条件下,叶片中GUS基因和miR166f的表达量与对照叶片中的表达量相比积累最显着,说明适宜浓度的转化液对瞬时转化效率有较大影响和农杆菌介导的瞬时转化有一定的时效性;在桑树中用不同浓度的转化液瞬时转化过表达miR166f后,与对照处理相比,miR166f的2个HD-Zip靶基因和1个JMJD6靶基因的表达水平均出现显着下降;同时叶片相对含水量（RWC）、可溶性蛋白含量、SOD活性、POD活性和Pro含量含量均出现不同程度的增加,而MDA含量显着降低。结果表明miR166f在桑树的抗逆境胁迫响应中发挥积极作用。三、桑树shabby-related蛋白激酶（MmSK）基因的克隆、表达分析及原核表达克隆获得包括完整ORF的MmSK基因（GenBank No:KY348867）,其cDNA序列长为1705 bp,编码411个氨基酸残基,蛋白质分子质量为46.55 Kd,等电点为8.61。保守域结构分析表明,MmSK蛋白具有明显的蛋白激酶的结构域,属于植物类GSK3/shaggy蛋白激酶家族。通过多重序列比对和进化树分析发现,MmSK基因的氨基酸序列与其他比对间的同源性均在89%以上。实时荧光定量PCR分析表明,在桑树不同组织中MmSK基因的相对表达量有较大差异,暗示着MmSK可能参与了植物器官发育的调控,其中,MmSK在韧皮部中表达量最高。桑MmSK基因在高盐、干旱、低温和ABA处理等不同非生物胁迫处理下均上调表达,表明该基因参与了桑树的抗逆过程,为更好地了解MmSK基因在桑树响应逆境胁迫中发挥的作用及分子机制打下了基础。构建了鲁桑MmSK基因的原核表达载体pET-28a（+）-MmSK,并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达重组蛋白MmSK。四、桑树VIGS体系的建立及MmSK基因抗旱功能鉴定利用八氢番茄红素脱氢酶（phytoene desaturase,PDS）基因作为报告基因,构建桑树VIGS体系,并利用VIGS技术成功将桑树miR172的靶基因--MmSK基因沉默。MmSK基因沉默后,其在pTRV2-MmSK-VIGS植株的表达量仅为空载pTRV2-00阴性对照组植株的34.02%,差异极显着。在桑树中沉默MmSK基因后,叶片中可溶性蛋白含量、SOD活性、POD活性、Pro含量均出现不同程度的降低,而MDA的含量增加显着。在干旱胁迫下,随着干旱胁迫处理时间的延长,叶片中可溶性蛋白含量、Pro含量和MDA含量均逐渐增加,SOD活性和POD活性均呈现先上升后下降的趋势,在第5 d时,达到最大值,与MmSK基因表达量变化趋势一致。表明桑树MmSK基因沉默后,能引起桑树中一些与抗旱相关的酶类活性和代谢物的含量的降低,从而导致其抗旱性能减弱,进一步说明MmSK基因在桑树的干旱胁迫响应中发挥重要作用。本研究通过干旱胁迫桑树降解组高通量测序筛选桑树耐旱关联miRNA和靶基因,分析候选miRNA和靶基因的时空表达特性,通过瞬时转化过表达研究目标miR166f对靶基因表达的调控和对植株抗旱相关生理生化指标的影响;构建了桑树VIGS转化体系,并通过VIGS法鉴定MmSK基因的抗旱功能。研究结果完善了桑树抗旱的分子调控网络,为桑树抗逆机理研究及抗性品种选育提供重要的理论依据和探索途径。
卢全有,张建平,孙鑫,杨磊[3]（2017）在《桑树皱叶病毒外壳蛋白基因的原核表达和抗体制备及应用》文中研究表明桑树皱叶病毒（mulberry crinkle leaf virus,MCLV）是近年从感病桑树中分离鉴定的一种新的桑树病毒,该病毒属于双生病毒科。由于MCLV外壳蛋白基因（cp）序列中含有较多大肠埃希菌（Escherichia mori）BL21（DE3）的稀有密码子而限制了其在大肠埃希菌中的表达。通过人工合成DNA的方法对MCLV cp基因序列进行优化,将其中40个大肠埃希菌稀有密码子变换成同义偏爱密码子,构建优化后的MCLV cp基因的原核表达载体p GEX4T-MCLV CP并转化大肠埃希菌BL21（DE3）菌株,经0.1 mmol/L IPTG诱导及SDS-PAGE电泳鉴定,实现了融合蛋白GST-MCLV CP在大肠埃希菌BL21（DE3）中高效表达。通过SDS-PAGE纯化后切胶回收原核表达的融合蛋白GST-MCLV CP,以其为抗原免疫新西兰大白兔制备MCLV CP的多克隆抗体,经间接ELISA法测定该抗血清的效价为1∶4 096,Western blot检测其能与MCLV发生特异性反应。用制备的抗血清对MCLV感染阳性的桑叶样品进行间接ELISA检测,其检出率仅为25%,但将桑叶样品的粗汁液煮沸处理后能显着提高MCLV的检出率,检出率达83.3%。
王钰婷,李瑞雪,王伟,汪泰初[4]（2016）在《安徽桑树品种全基因组DNA提取方法研究》文中进行了进一步梳理旨在获得一种高效、稳定、廉价的DNA提取方法。以安徽桑树品种嫩叶为材料,以CTAB法提取其基因组DNA,并用紫外分光光度计、凝胶电泳、PCR扩增等方法进行鉴定。研究结果表明:提取的DNA A260/A280比值在1.801.90之间,DNA得率约为0.1870.275μg/mg,以提取的DNA为模版,PCR能够获得清晰的目的条带。证明CTAB法提取的DNA质量较好,能满足后续分子生物学操作的需要。
况露露[5]（2016）在《桑树LINE反转录转座子的特征及相关基因分析》文中指出转座子（Transposon element,TE）是存在于生物基因组中的一段DNA序列,能够从染色体上的一个位点转移到另一个位点或者从一条染色体转移到另一条染色体上。转座子广泛存在于原核和真核生物基因组中,是基因组的重要组成部分,在进化中起着重要的作用。长散在核元件（Long interspersed nuclear element,LINE）,属于RNA介导的Class I类反转录转座子,两端不含有长末端重复序列,其对基因组的大小、结构、功能和进化等方面具有重要的作用。桑树是一种落叶性多年生木本植物,除被广泛用于饲养家蚕外,还具有重要的经济、药用和生态价值。随着桑树全基因组测序的完成以及桑树转座子数据库的建成,为研究桑树LINE反转录转座子提供了平台。目前,有关桑树LINE的研究只停留在鉴定分类方面,具体的深入研究则无报道。本研究通过简并引物扩增桑树LINE反转录转座子的反转录酶（Reverse transcriptase,RT）序列,对其特征进行分析,并从全基因组层面对桑树LINE的结构、插入基因区间偏好性和相关基因功能等方面进行分析。最后筛选到由LINE的插入导致选择性剪接发生的基因,对这些基因进行验证,为进一步研究桑树LINE对基因表达调控的影响提供候选基因。研究取得如下主要结果:一、桑树LINE反转录转座子RT片段的特征分析1、使用简并引物从桑树中分离、鉴定得到43条LINE RT序列,对这些序列进行分析,结果显示LINE RT序列核苷酸长度范围在557-595 bp之间,富含AT碱基,AT/GC比例范围为1.26-1.98,其序列间相似度范围为31.8%-99.4%。这些结果表明桑树LINE RT序列具有较高的异质性。进一步对其氨基酸序列进行分析,发现除Mno L10之外,都存在终止密码子,并且有93%（40/43）的序列发生了移码突变,说明终止密码子突变和移码突变是导致桑树LINE RT序列异质性的主要原因。2、43个桑树linert序列通过聚类可分为8个组,这个结果与通过相似度分组是一致的,其中仅groupiii和groupviii两组就占克隆总数的72%（31/43）,推测这两组为桑树lines的主要家族。终止密码子分布及多序列比对结果显示,同组中序列终止密码子的分布模式相似,这表明同组lines经历了相似的进化模式,在相同或相近的时期经扩增而来。3、43个桑树linert序列与13个植物物种同源的序列的系统进化分析,显示桑树中的某些rt序列与外源植物的聚在一起,暗示line反转录转座子除发生垂直转移外,在不同物种间还存在着水平转移。4、荧光原位杂交结果显示,桑树lines在染色体上呈散在分布模式,并不是随机分布的,信号主要集中在近端粒区,少部分信号分布在近着丝粒区。二、桑树line的特征分析1、从桑树转座子数据库下载line两个超家族l1和rte的36个全长序列,分析发现其结构中除包含一般line结构中的en、rt、rnaseh元件外,有些家族还包含cchc锌指结构和duf4238,以及嵌套有ltr类型的gag、rt和rnaseh等。2、桑树与其他植物物种同源的linert和en序列的多序列比对结果显示,桑树的linert和en序列与其他物种的同源性较高,都能够找到相应的保守结构域。进一步的系统进化分析显示,无论是基于rt还是en构建的系统进化树,都是l1聚为一支,rte聚为一支,这说明植物lines超家族中的l1和rte在分化后,便朝着不同的方向进行进化。3、通过对桑树中lines插入基因不同区间的偏好性进行分析,发现line主要偏向于插入到基因内部。对这些有line插入的基因进行功能注释和pathway分析,结果显示这些基因主要参与到细胞组分中的cell（37.41%）、organelle（25.37%）和membrane（20.37%）;分子功能中的catalyticactivity（48.35%）和binding（38.07%）;生物功能中的metabolicprocess（23.36%）、cellularprocess（19.97%）和single-organismprocess（17.07%）。pathway分析表明这些基因至少参与到81个生物途径中,这些结果暗示着line反转录转座子可能对参与到多个生物途径中的这些基因具有潜在的调节功能。三、桑树line反转录转座子选择性剪接相关基因的分析1、基于川桑基因位置信息和line反转录转座子位置信息,从桑树基因组中筛选到560个有line插入的基因（称为line相关基因）。进一步结合选择性剪接基因的位置信息,筛选出57个有line插入且发生选择性剪接的基因,保留line插入到内含子-外显子,外显子-内含子,内含子保留或跳过外显子剪接区域的基因。这些由LINE的插入而形成的选择性剪接基因被称为LINE选择性剪接相关基因,共鉴定到10个。2、对10个LINE选择性剪接相关基因的蛋白进行预测,发现Morus009604、Morus023788和Morus026596在桑树全基因组测序结果中因没预测到蛋白类型,被定为假定蛋白。NCBI比对结果显示它们分别与其他物种的多药和毒性化合物外排转运蛋白（MATE）家族ALF5（与白梨的相似度为74%）、节律钟输出基因（GIGANTEA）（与扁桃的相似度为84%）和酰基转移酶（与梅的部分序列相似度为75%）具有较高的相似度。剩余的7个基因在桑树中预测的和其他物种中比对到的结果是一致的,且都具有较高的相似度。3、根据10个LINE选择性剪接相关基因序列设计引物,扩增包含LINE反转录转座子及剪接区域的片段,通过实验对这10个LINE相关基因进行验证。结果表明基因Morus008188、Morus012782、Morus013014、Morus006083和Morus014786的选择性剪接确实是由LINE的插入导致。这五个基因可以作为研究桑树LINE反转录转座子对基因表达调控功能的影响的候选基因。
苏秀[6]（2015）在《小RNA深度测序在几种木本植物病毒鉴定中的应用》文中提出植物病毒是一类极为重要的病原物,对生产实践造成了很大的危害。林木在社会经济及生态环境中发挥着至关重要的作用,林木病毒有广泛的地理分布和寄主范围,对森林健康、生态环境有很大的潜在威胁。蕴藏在自然界木本植物中的病毒是个极大的未知数；同时,木本植物上的病毒往往很难通过摩擦接种的方式进行人工接种,利用传统方法检测木本植物病毒非常困难。小RNA深度测序技术突破了传统病毒检测方法的局限性,开辟了大规模、快速诊断植物病毒的领域。利用这种技术能同时检测植物样品中已知的和未知的、含量高的及含量低的所有的RNA病毒、DNA病毒以及类病毒。本文探讨了小RNA深度测序及其组装技术在检测木本植物病毒中的应用,以期全面地了解木本植物病毒的种类多样性。我们的研究为发掘新的植物病毒资源以及预防林业生产上的病毒病害提供了指导。利用高通量测序技术对采自浙江杭州表现花叶症状的紫藤（W7isteria sinensis）采自浙江临安表现花叶症状的南天竹（Nandina domestica）和浙江桐乡表现花叶卷叶症状的桑树（Morus alba L.）的病原进行了分子鉴定。利用小RNA深度测序技术,通过contigs拼接和比对,3种植物上的病毒分别为紫藤花叶病毒（Wisteria vein mosaic virus, WVMV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CM IV）和桑花叶卷叶病相关病毒（Mulberry mosaic leaf roll-associated virus, MMLRaV）,其中CMV侵染我国南天竹为国内的首次报道。对采自浙江临安表现花叶症状的美国山核桃（Carya illinoinensis （Wangenh.） K. Koch）样品进行了基于小RNA深度测序技术的高通量鉴定,该病毒为1种新的RNA病毒,暂命名为美国山核桃花叶相关病毒（Pecan mosaic-associated virus, PMaV）。PMaV基因组全长9310 nt,序列中A、T、C、G 4种碱基的含量分别为35.35%、25.49%、18.49%和20.66%,5’非编码区（5’UTR）包含57个核苷酸,3’非编码区（3’UTR）包含175个核苷酸。PMaV的基因组结构具有典型的马铃薯Y病毒属成员的基因组结构特征,包含一个9078 nt的开放阅读框（Open ReadingFrame,ORF）,经推导其编码一个由3026个氨基酸（amino acid, aa）聚合而成的多聚蛋白,推测PMaV编码的多聚蛋白翻译后会被切割成11个成熟的蛋白质：P1、HC-Pro、P3、6K1、C1、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb、CP、PIPO。它的多聚蛋白切割位点分别是LYWRGF/S （P1/HC-Pro）、KLYKVG/G （HC-Pro/P3）. DVITLQ/S （P3/6K1）、CMTFQ/S （6KI/C1）、DAIRFQ/S （C1/6K2）、DTITLQ/G （6K2/NIa-VPg）、DEIQFE/A （NIa-Vpg/NIa-Pro）、DSMKFQ/G （NIa-Pro/NIb）、 AGASAQ/S （NIb/CP）.用PMaV基因组全序列与36种其他马铃薯Y病毒科成员的全序列进行同源性比较和系统进化树分析。PMaV全序列与莴苣花叶病毒（Lettuce mosaic virus, LMV）的相似度最高,为58.9%,并与LMV的进化关系最为紧密,形成一个小进化簇。PMaV多聚蛋白氨基酸全长序列与PVY属其它病毒的同源性在52%-53%之间。PMaV的CP蛋白序列在核苷酸水平上与LMV的同源性最高,为73%；在CP氨基酸水平上的同源性与芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus, TuMV）最高,为68%。多聚蛋白氨基酸全长序列以及系统进化树均显示PMaV与LMV的进化关系最为紧密。由此可见,无论是按照Adams等人的标准：核苷酸一致性小于76%,且氨基酸一致性小于82%；还是按照ICTV第八次报告中确定的标准：核苷酸一致性小于85%,或CP氨基酸序列一致性小于80%,PMaV显然符合Potyvirus属不同种的定种标准。通过病毒汁液摩擦接种的方法,PMaV无法侵染本氏烟（Nicotiana benthamiana）和普通烟（N. tabacum）两种供试植物。感病美国山核桃的叶片经负染后,在透射电镜下看到许多线状的病毒粒子,呈柔软弯曲或较直的线状,长约750 nm,符合PVY属病毒粒子的特征。对采自云南德宏州的柠檬（Citrus limon）病叶样品进行了基于深度测序技术的分子鉴定。结果表明,该柠檬受到了啤酒花矮化类病毒（Hop stunt viroid, HSVd）的侵染。HSVd全长序列与HSVd CC-D isolate 1(（ GenBank登录号：FJ716188.1）的同源性为100%。在C. limon中,HSVd来源的小RNA（siRNAs）长度以21 nt为主,来源于HSVd正义链和负义链的siRNAs数量几乎相等。HSVd-siRNAs序列的5’起始核苷酸碱基偏好于鸟嘌呤(（Guanine, G）.此外,热点区分析显示,大量的HSVd-siRNAs来源于HSVd基因组的C区和V区。植物类病毒的侵染和产生症状与类病毒来源的小RNA有关,位于HSVd多变区（V区）的5-6个核苷酸碱基构成的木质陷孔病表达序列“cachexia expression motif"决定了寄主症状的发生。利用生物信息学手段,我们从HSVd来源的小RNA中,提取到了67条5’端前10个碱基包含“cachexia expression motif"序列的HSVd-siRNA,然后通过预测软件psRNA Target对 HSVd-siRNAs进行靶基因预测,对其中五个数值最高的靶基因与症状发生的关系进行了分析。同时,用miRNA靶基因预测软件RNA22验证了这五个靶基因是由HSVd-siRNAs所调控的。我们的研究结果表明,HSVd-siRNAs可能参与了寄主的基因表达,并影响寄主病害症状的产生。通过高通量小RNA测序对采自浙江临安的表现花叶症状的大青样品进行了病毒鉴定,该病毒为中国大青金色花叶病毒（Clerodendrum golden mosaic china virus, C1GMCNV）. C1GMCNV的DNA-A组份全序列长2776 bp,与Clerodendrum golden mosaic China virus complete DNA-A genome, isolate YX1 （GenBank登录号：FN396962.1）相似性为99%；DNA-B组份全序列长2729 bp,与Clerodendrum golden mosaic China virus complete DNA-B genome, isolate YX1 （GenBank登录号：FN396963.1）同源性98%。采用了Velvet和Velvet-Oases两种方法,并设定了不同的参数（k-mer分别为15、17、19、21）,对大青样品的深度测序数据进行了分析。研究发现,在对序列进行拼接比对时,不同的拼接软件和不同的参数设置对实验的结果有很大的影响。利用Velvet软件,K-mer为15时,拼接得到的contigs数量及长度最大,可以覆盖C1GMCNV基因组全长70%以上,而K-mer为21时,拼接得到的contigs仅仅能覆盖C1GMCNV基因组全长30%左右。利用Velvet-Oases分析方法,我们将不同K-mer值组装的contigs又进行了拼接组装,发现最终得到的contigs覆盖到基因组的比例显着提高,最高达到88.25%。我们的研究提供了一套利用small RNA深度测序技术结合生物信息学分析鉴定病毒以及组装得到病毒基因组的流程。为了更加清楚地看到深度测序所得到的病毒来源小RNA在病毒基因组上的分布情况,我们用可视化工具SeqMonk对测序得到的小RNA序列进行了全基因组浏览,结果显示C1GMCNV不同组分的基因组全长上,明显存在没有病毒源小RNA覆盖的区域。
马宇欣[7]（2015）在《桑花叶型萎缩病病原的鉴定》文中提出桑花叶型萎缩病（Mulberry mosaic dwarf disease,MMDD）是一种困扰桑树生产长达数十年的重要病害,感病的桑树会表现出植株矮小、叶片花叶、畸形、皱缩、叶缘卷曲等症状,严重影响桑蚕产业的发展。虽然对该病害的研究开展了近一个世纪,但对于其病原却至今未明确。鉴于此,本研究以探究桑花叶型萎缩病的病原为目的,系统的开展研究工作。首先,选取陕西省安康学院蚕桑科研基地进行样品采集,重点采集表现花叶型萎缩病症状的桑树样品92份,无症状样品9份。选取感病和健康样品各1份进行高通量测序技术,从感病样品中检测到2种病毒:双生病毒、线虫传多面体病毒和一种小分子环状RNA,而此健康样品中未检测到病毒病原物。通过RT-PCR/PCR实验验证了这三种病原物确实存在于感病样品中。其次,对所有样品中这三种病原物的发生率进行了调查,发现感病的92份样品中,双生病毒的检出率为92.4%,线虫传多面体病毒的检出率为52.17%,小分子环状RNA的检出率为40.2%。因此,双生病毒与花叶型萎缩病的发生存在正相关关系;而线虫传多面体病毒的检出率也较高,与双生病毒可能存在混合侵染的情况存在;由于从健康的样品中也检测到小分子环状RNA的存在,因此小分子RNA与病害的发生没有相关关系。我们通过实验得出双生病毒与花叶型萎缩病具有极大的相关关系,但仍需根据科赫氏法则来进行致病性验证,最终确定是否为该病病原。最后,鉴于此双生病毒与花叶型萎缩病的相关关系,将其命名为桑花叶型萎缩病相关病毒（Mulberry mosaic dwarf associated virus,MMDa V）,并对其进行了鉴定。采用PCR法和RCA的方法克隆得到了双生病毒的基因组全长序列（2952 nt）,单组份,单链环状DNA。除了具有双生病毒科病毒保守的结构之外,该病毒开放阅读框的个数及位置不同于其他双生病毒,病毒链含有5个,互补链含有2个,具有独特性。软件预测到互补链存在一个内含子（101 nt）,通过RT-PCR实验验证了这一预测,并结合高通量数据中存在139个RNA reads以外显子-外显子序列方式存在,进一步证明了体内剪切掉内含子的互补链转录本的存在,根据序列特征判断,该内含子属于U2型内含子。系统发育分析结果显示,桑树上的双生病毒与柑橘上发现的柑橘褪绿矮缩相关病毒（Citrus chlorotic dwarf associated virus,CCDa V）共同存在于一个单独的分支,且未归到已知的属中,因此,我们建议将这两种病毒共同归于一个新的属。由于传统检测技术的局限性,桑花叶型萎缩病的病原一直未能明确。本研究的创新之处在于,打破传统检测技术的瓶颈,利用高通量测序技术快速筛选到感病样品中所有的病毒,通过病原发生率的调查找到与病害的相关关系,根据科赫氏法则进行生物学实验,最终鉴定出引起该病害的病毒,解决“桑花叶型萎缩病的病原是什么”这一关键科学问题。
韩淑梅[8]（2015）在《桑树MLX56基因家族生物信息学及表达分析》文中研究指明桑树（Morus alba L.）是重要的双子叶木本经济作物之一,广泛分布在热带及温带地区。桑叶作为家蚕最佳的天然饲料,是蚕桑产业的重要物质基础。桑椹,是桑树的果实,味道甘甜可口,营养丰富,既可作为功能食品开发的原料,又可作为我国传统中药,应用前景广阔。桑树乳汁中的次生代谢产物质及防御蛋白,具有抑菌抗虫作用。桑树乳胶蛋白基因在抗虫防御过程中起着重要的作用。2009年,Konno从桑树乳汁中纯化鉴定到一个56 KDa的防御蛋白,命名为MLX56蛋白。从桑树基因组数据库中检索MLX56基因同源序列,并进行基因进化、基因结构及基因的表达分析,为桑树MLX56基因的功能研究及利用奠定基础。本研究利用桑树基因组数据库,采用生物信息学方法,分析桑树MLX56基因家族结构及进化关系,并对MLX56基因家族成员进行鉴定；利用MEGA4.1软件进行系统进化树分析；通过差异表达分析及半定量PCR技术研究MLX56基因在不同桑树种质材料及不同组织中的表达水平；构建原核表达载体pET28a-MLX56-6,并将其转入大肠杆菌BL21 （DE3）表达感受态细胞中,在28℃,0.5 mmol·L-1IPTG条件下诱导融合蛋白表达,SDS-PAGE检测不同诱导时间段融合蛋白的表达情况,并将高效表达时段的菌液进行超声破碎,SDS-PAGE检测目的蛋白的可溶性；使用Western Blot验证目的蛋白的表达;同时研究该基因对大肠杆菌生长速率的影响。主要研究结果如下：1、桑树MLX56基因家族克隆及生物信息学分析利用桑树基因组数据库,鉴定到6个MLX56家族基因,为串联重复序列,6个桑树MLX56基因编码区序列长约2000bp,其中,4个MLX56基因内含子数为1,另外2个MLX56基因含有2个内含子。另外,还克隆了1个新的MLX56基因,命名为MLX56-7 （GenBank登录号为K1496133）。结构域分析显示该家族基因含有2个几丁质结合域,在两个几丁质结合域之间有一段伸展蛋白区域,MLX56基因都含有信号肽,属于分泌蛋白。通过NJ法构建系统进化树,发现桑树MLX56基因家族编码的氨基酸序列与西洋接骨木类橡胶蛋白同源性最高,同源性达66%,与茶树几丁质酶、葡萄几丁质酶同源性较低,同源性分别为49%和48%。2、桑树MLX56基因家族在18份桑树种质材料及广东桑‘桂优62号’不同组织中的表达水平根据MLX56基因家族7个成员伸展区域的不同设计通用引物,以不同桑树种质材料幼叶cDNA为模板进行PCR扩增。核酸PAGE电泳分析表明MLX56基因在18份桑树种质材料中的表达存在差异,组织特异性分析显示MLX56基因在广东桑‘桂优62号’不同组织中的表达也存在差异。半定量PCR分析表明,MLX56-2和MLX56-4在18份桑树种质材料中均有表达,MLX56-3基因在18份桑树种质材料中没有表达,MLX56-1 MLX56-5, MLX56-6, MLX56-7仅在部分桑树种质材料中表达；组织表达特异性分析表明MLX56-2, MLX56-4, MLX56-5,MLX56-6和MLX56-7基因在广东桑‘桂优62号’各个组织中都有表达,MLX56-1基因仅在叶柄及茎中表达,MLX56-3基因在广东桑‘桂优62号’各个组织中都没有检测到表达。3、桑树MLX56-6基因原核表达分析及大肠杆菌生长速率测定原核表达结果表明,MLX56-6蛋白在终浓度为0.5 mmol·L-1 IPTG诱导下成功表达；融合蛋白主要以包涵体形式存在；Western Blot分析证实大肠杆菌BL21 （DE3）中表达了一个分子量为56 kDa的蛋白。但在大肠杆菌诱导表达过程中,其生长速率受到MLX56-6蛋白的抑制。
卢全有[9]（2014）在《桑树中一种新病毒和一种小分子环状RNA的研究》文中进行了进一步梳理近年,我们从桑花叶卷叶病叶组织中发现一种新的球状病毒和一种新的小分子环状RNA,为了阐明该病毒及小分子环状RNA的生物学和分子生物学特征以及与该病发生的关系,本研究将：1.利用锚定随机引物及5’,3’-RACE对新发现病毒的基因组序列进行克隆,分析基因组的分子特征,确立分离出的病毒的分类地位；建立病毒抗血清新的制备方法并建立病毒的血清学检测方法；利用RT-PCR对病毒进行检测并根据检测结果提出病毒与桑花叶卷叶病发生的关系；2.继续对先前分离出的小分子环状RNA（Mulberry small circular RNA, mscRNA）进行研究,克隆mscRNA的全长序列,分析其分子结构特征；通过回接mscRNA以及构建的mscRNA侵染性克隆,确定mscRNA是否具有侵染性,揭示mscRNA与桑花叶卷叶病的关系；建立灵敏、快速、可靠的分子检测方法对不同地区的病桑进行检测,并根据检测结果提出nscRNA与桑花叶卷叶病发生以及症状表现的关系。结果如下：1.通过电子显微镜观察,桑花叶卷叶病叶中的球状病毒粒体直径为28-30nm。其基因组由2条正单链RNA（ssRNA）组成,RNA1和RNA2的全长分别为7183nt和3742nt[都不包括poly（A）尾的长度],2条RNA链都只包含一个开放阅读框,RNA1的开放阅读框编码一个由2102aa组成,相应分子量约为235.1kDa的多聚蛋白P1,RNA2的开放阅读框编码一个由1093aa组成,相应分子量约为120.5kDa的多聚蛋白P2；基于P1的氨基酸序列构建的进化树表明,该病毒属于线虫传多面体病毒属（Nepovirus）病毒；P1的氨基酸序列包含Hel、VPg、RdRp保守性氨基酸基序以及半胱氨酸蛋白酶（Pro）的催化三联体；该病毒外壳蛋白位于P2的C端,运动蛋白位于P2的N端,通过NetPicoRNA1.0Server软件预测以及Western blot分析,推测运动蛋白与外壳蛋白之间的切割位点位于553E/V554,这个切割位点以前未曾报道过,是3CL （pro）一个新的切割位点,切割后产生一个分子量约为59kDa的外壳蛋白。基于外壳蛋白氨基酸序列构建的进化树分析、RNA2的核苷酸序列长度、RNA1和RNA2的3’-UTR和5’-UTR的核苷酸序列特征以及国际病毒分类委员会（International Committee on Taxonomy of Viruses, ICTV）第九次报告提出的Nepovirus新病毒认定标准（与其它Nepovirus病毒比较,外壳蛋白的氨基酸序列的相似性<75%）,该病毒属于Nepovirus属A亚组的一种新病毒。由于该病毒最初是从桑花叶卷叶病的叶组织中分离出来的,其与桑花叶卷叶病的关系还没有通过Koch’s法则确定,我们暂时将该病毒命名为桑花叶卷叶病相关病毒（MulberryMosaic Leaf Roll-associated Virus, MMLRaV）。RT-PCR的检测结果显示,从浙江省湖州市、江苏省海安县和江苏省镇江市的桑园中采集到的61份表现桑花叶卷叶病症状样品中,58份样品检测出含有MMLRaV,病毒的侵染率高达95%,这个结果说明,MMLRaV在浙江和江苏的桑园中普遍存在,绝大多数表现桑花叶卷叶病症状的桑树均受到MMLRaV的侵染,MMLRaV与桑花叶卷叶病的发生有着明显的关联。2. mscRNA浙江分离株mscRNA-zj是由356nt核苷酸组成,G+C含量为51.12%,经过BLAST比对,mscRNA-zj序列与已报道的Mulberry small circular viroid-like RNA1isolate201110151（JQ809700）和Mulberry small circular viroid-like RNA1（EU547491）的序列的相似性高达99%,然而,我们通过实验获得的mscRNA-zj序列与已报道这2个分离株的极性相反。通过（?）fold预测mscRNA的最稳定的二级结构呈支链状,在37℃下,这种结构的最低自由能是-601.6kJ/mol,链内65.7%的碱基能够配对,比以前报道的浙江株和陕西株2个分离株的最低自由能更低,链内碱基配对比例更高,mscRNA-zj支链状二级结构与鳄梨日斑类病毒科（Avsunviroidae）类病毒和一些病毒的环状单链卫星RNA的支链状二级结构相似。mscRNA-zj的正链上含有锤头型核酶,根据锤头型核酶的自我切割特性推测了mscRNA-zj复制过程中自我切割位点的位置。不同地理分布的mscRNA存在序列多样性。LiCl法提取的mscRNA以及构建的侵染性克隆的接种结果显不,]mscRNA-zj单独存在是不能在其自然寄主-桑树体内自我复制,也不能在鉴别寄主-番茄中自我复制,初步认为mscRNA是一种桑树病毒的卫星RNA而不是一种新的类病毒。通过建立的单管一步RT-PCR对田间发生的桑花叶卷叶病的检测,结果显示,mscRNA不仅与桑花叶卷叶病的症状表现没有明显的关系,而且与该病的发生没有明显的关联。结论：MMLRaV是一种新的线虫传多面体病毒,归属于该属的A亚组,与桑花叶卷叶病的发生有着紧密的关联；mscRNA是一种桑树病毒的单链环状卫星RNA,而不是一种类病毒,与桑花叶卷叶病的发生和病害的症状表现没有明显的关联。
马斌[10]（2013）在《桑树枝条韧皮部桑根皮素的制备及其对小鼠H22细胞株移植性肿瘤的抑制作用》文中研究说明本实验主要以桑树栽培种湖桑32号的桑树枝条韧皮部（简称桑枝皮）为试验材料，采用无水乙醇提取、大孔树脂的吸附与分离、葡聚糖凝胶柱洗脱和半制备反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离纯化等方法，经过高效液相色谱二级管陈列检测（HPLC-DAD）和与标准品紫外光谱比对分析与鉴定，分离到的高纯单体为桑根皮素（morusin）。以桑根皮素标准品绘制的线性方程定量分析待测样品中桑根皮素的含量，桑根皮素在0.05-1.00μg范围内与其吸光度值具有很好的线性关系，相关系数为R2=0.9996。同时，应用HPLC-DAD色谱法测定桑枝皮中桑根皮素的重现性和回收率分别为6.02%和100.62%。桑树不同部位中桑根皮素的含量分析结果显示，湖桑32的桑枝皮中桑根皮素含量与根皮中含量相差甚微，而在桑叶中没有发现桑根皮素的存在；桑品种为延边秋雨的桑枝皮中桑根皮素含量约是其根皮中的3倍。100个桑树栽培品种的桑枝皮中桑根皮素含量差异显着，高低可达20倍之多。湖桑32枝条皮中桑根皮素含量为200.22μg/g，湖桑13号品种的桑枝皮中含量最高为585.81μg/g，而引三桑品种的枝条皮中其含量最低仅为29.64μg/g。本试验结果表明，本文应用的RP-HPLC-DAD分析法对鉴定和分析桑树或桑枝皮中桑根皮素的方法快速、可靠。我们可以从大量废弃的桑树枝条皮中大量提取和回收具有抗肿瘤、抗菌、抗艾滋病毒等活性成份—桑根皮素，为农业废弃物桑树枝条的高效利用和高附加值的开发打下良好的基础。为了研究桑根皮素抗肿瘤等方面的作用机制，本实验利用分子生物学的方法，定量检测某些相关抗肿瘤基因的表达情况。通过小鼠肝癌肿瘤细胞株的移植，建立了移植瘤H22肝癌肿瘤小鼠的模型，采用腹腔注射的治疗方式，研究了桑根皮素抑制腋下H22实体瘤荷瘤模型小鼠肿瘤的发育情况和病理组织学的变化。随机将H22移植瘤肝癌小鼠分为5组：注射生理盐水的模型组，注射桑根皮素低（10mg/kg·d）、中（20mg/kg·d）、高（40mg/kg·d）剂量的样品处理组，以及注射抗肿瘤药物的5-氟尿嘧啶为阳性对照组，给药10d，剖去瘤块、脾脏和肝脏，计算抑瘤率及肝脏、脾脏系数增长率和体质量增长率；采用HE染色对肿瘤和肝脏进行病理观察；以肿瘤模型组为对照，桑根皮素低、中、高剂量注射组及5-氟尿嘧啶阳性对照组对肿瘤的生长均有不同程度的抑制作用，抑瘤率分别为13.84%、26.21%、34.43%和47.21%；肝脏和脾脏系数增长率及体质量增长率结果显示，桑根皮素对小鼠肝脏、肾脏和体质量增长无明显影响。以5-氟尿嘧啶注射组为实验对照的荧光定量PCR（QPCR）定量分析研究表明，经桑根皮素处理的H22小鼠与模型组相比，桑根皮素各剂量注射组的P53、Caspase-3、Survivin和CyclinB1基因表达显着上升，具有统计学意义（P＜0.05）。桑根皮素低、中、高剂量治疗组中Caspase-3的基因表达水平均明显高于模型组（P＜0.01）；其低剂量组Caspase-3基因表达水平大大高于模型组达4倍以上，中、高剂量实验组Caspase-3基因表达水平虽低于低剂量组，但也分别高于模型组3.6和3.0倍。随着注射桑根皮素浓度的上升，样品处理组的抑制效果呈现下降趋势，即呈剂量-效应的逆向关系。荷瘤模型组中NF-κB基因表达水平最高，高剂量样品注射组NF-κB基因表达量最低，与模型组表达量相比下调到36.5%。这三个剂量的桑根皮素样品注射组对NF-κB基因表达的下调作用都达到非常显着的水平（p＜0.01）。根据以上荧光定量分析的实验结果，我们可以推测桑根皮素的抗肝癌作用的机制是通过上调Caspase-3基因表达水平并下调NF-κB基因表达水平来促进肿瘤细胞的凋亡，最终使瘤体变性坏死达到抗癌的效果。
二、从桑树营养组织中提取高纯度DNA的方法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、从桑树营养组织中提取高纯度DNA的方法（论文提纲范文）
（1）桑树钾离子通道及转运体相关基因的克隆及表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究的目的和意义 |
| 1.2 研究现状 |
| 1.2.1 转录组测序的研究进展 |
| 1.2.2 钾离子通道的研究进展 |
| 1.2.3 钾转运体HAK5的研究进展 |
| 1.3 研究内容 |
| 1.3.1 桑树低钾胁迫的生理生化指标测定、转录组测序初步分析及差异基因的表达鉴定 |
| 1.3.2 桑树内向整流型K~+通道KAT2基因的克隆、序列及表达分析 |
| 1.3.3 桑树弱内向整流型K~+通道AKT2基因的克隆、序列及表达分析 |
| 1.3.4 桑树KCO通道KCO5基因的克隆、序列及表达分析 |
| 1.3.5 桑树高亲和钾转运体HAK5基因的克隆及分析 |
| 第2章 桑树低钾胁迫的生理生化指标测定、转录组测序初步分析及差异基因的表达鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 植物材料和仪器 |
| 2.1.2 常用缓冲溶液和培养基 |
| 2.1.3 桑树总RNA提取 |
| 2.1.4 反转录PCR |
| 2.1.5 桑树低钾处理后生理生化指标变化的检测分析 |
| 2.1.6 桑树低钾处理后转录组测序初步分析及差异基因的表达鉴定 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 桑树低钾处理后生理生化指标变化的检测分析 |
| 2.2.2 测序数据及其质量控制 |
| 2.2.3 转录组数据与参考基因组序列比对 |
| 2.2.4 新基因分析 |
| 2.2.5 基因表达量分析 |
| 2.2.6 差异表达分析 |
| 2.2.7 功能注释和富集分析 |
| 2.2.8 筛选基因的鉴定分析 |
| 2.3 生理生化指标和转录组的结果与讨论 |
| 第3章 桑树内向整流型K~+通道KAT2基因的克隆、序列及表达分析 |
| 3.1 材料与常规实验(同2.1) |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备 |
| 3.2.2 桑树MaKAT2基因引物的设计 |
| 3.2.3 桑树MaKAT2基因cDNA序列的克隆验证 |
| 3.2.4 桑树MaKAT2基因的生物信息学分析 |
| 3.2.5 桑树MaKAT2基因在胁迫下的表达 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 桑树MaKAT2基因的克隆验证 |
| 3.3.2 桑树MaKAT2基因的cDNA序列分析 |
| 3.3.3 桑树MaKAT2基因同源比对及进化分析 |
| 3.3.4 桑树MaKAT2基因在胁迫下的分析 |
| 3.4 桑树MaKAT2基因的结果与讨论 |
| 第4章 桑树弱内向整流型K~+通道AKT2基因的克隆、序列及表达分析 |
| 4.1 材料与常规实验(同2.1) |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 桑树MaAKT2基因引物的设计 |
| 4.2.2 桑树MaAKT2基因cDNA序列的克隆验证 |
| 4.2.3 桑树MaAKT2基因的生物信息学分析 |
| 4.2.4 桑树MaAKT2基因在胁迫下的表达 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 桑树MaAKT2基因的克隆验证 |
| 4.3.2 桑树MaAKT2基因的cDNA序列分析 |
| 4.3.3 桑树MaAKT2基因同源比对及进化分析 |
| 4.3.4 桑树MaAKT2基因在胁迫下的分析 |
| 4.4 桑树MaAKT2基因的结果与讨论 |
| 第5章 桑树KCO通道KCO5基因的克隆、序列及表达分析 |
| 5.1 材料与常规实验(同2.1) |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 桑树MaKCO5基因引物的设计 |
| 5.2.2 桑树MaKCO5基因cDNA序列的克隆验证 |
| 5.2.3 桑树MaKCO5基因的生物信息学分析 |
| 5.2.4 桑树MaKCO5基因的原核表达SDS-PAGE电泳步骤及试剂配制 |
| 5.2.5 桑树MaKCO5基因在胁迫下的表达 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 桑树MaKCO5基因的克隆验证 |
| 5.3.2 桑树MaKCO5基因的cDNA序列分析 |
| 5.3.3 桑树MaKCO5基因同源比对及进化分析 |
| 5.3.4 桑树MaKCO5基因的原核表达SDS-PAGE电泳分析 |
| 5.3.5 桑树MaKCO5基因在胁迫下的分析 |
| 5.4 桑树MaKCO5基因的结果与讨论 |
| 第6章 桑树高亲和钾转运体HAK5基因的克隆及分析 |
| 6.1 材料与常规实验(同2.1) |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 桑树MaHAK5基因引物的设计 |
| 6.2.2 桑树MaHAK5基因cDNA序列的克隆验证 |
| 6.2.3 桑树MaHAK5基因的生物信息学分析 |
| 6.2.4 桑树MaHAK5基因在胁迫下的表达 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 桑树MaHAK5基因的克隆验证 |
| 6.3.2 桑树MaHAK5基因的cDNA序列分析 |
| 6.3.3 桑树MaHAK5基因同源比对及进化分析 |
| 6.3.4 桑树MaHAK5基因在胁迫下的分析 |
| 6.4 桑树MaHAK5基因的结果与讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
| 致谢 |
（2）桑树耐旱关联microRNA及其靶基因鉴定与功能分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 植物抗旱性 |
| 1.1.1 干旱胁迫及干旱对植物的影响 |
| 1.1.2 植物对干旱适应性反应 |
| 1.1.3 植物抗旱性评价指标 |
| 1.1.4 植物抗旱机制 |
| 1.2 植物miRNA的生成、作用机制、抗逆功能及靶基因鉴定 |
| 1.2.1 植物miRNA的生成 |
| 1.2.2 植物miRNA的作用机制 |
| 1.2.3 植物miRNA的抗逆功能 |
| 1.2.4 miRNA及其靶基因的鉴定 |
| 1.3 病毒诱导基因沉默(VIGS)技术及应用 |
| 1.3.1 VIGS的利用优势 |
| 1.3.2 VIGS的作用机制 |
| 1.3.3 VIGS的发现及应用 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 1.5 本研究的主要内容及方法 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第2章 降解组测序鉴定桑树耐旱关联miRNA及其靶基因 |
| 2.1 试验材料和试剂 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要试剂和缓冲液的配制 |
| 2.1.5 引物序列 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 桑树材料处理 |
| 2.2.2 桑树总RNA的提取 |
| 2.2.3 桑树降解组文库的构建 |
| 2.2.4 靶基因鉴定及生物信息学分析 |
| 2.2.5 qRT-PCR检测干旱胁迫后桑树miRNA及其靶基因的表达变化 |
| 2.2.6 miRNA和靶基因间调控网络的构建 |
| 2.2.7 靶基因降解位点的验证 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 桑树降解组文库的构建和测序分析 |
| 2.3.2 桑树miRNA靶基因的系统鉴定 |
| 2.3.3 桑树干旱胁迫关联miRNA及其靶基因的鉴定 |
| 2.3.4 靶基因GO功能注释、KEGG代谢通路注释及NR分析 |
| 2.3.5 miRNA-target调控网络 |
| 2.3.6 干旱胁迫后桑树miRNA及其靶基因的表达变化 |
| 2.3.7 靶基因降解位点的RLM-5’RACE验证结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第3章 桑树miR166f瞬时转化过表达鉴定其抗旱功能 |
| 3.1 试验材料和试剂 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 主要试剂和缓冲液的配制 |
| 3.1.5 引物序列 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 桑树幼苗的培养 |
| 3.2.2 桑树基因组DNA的提取 |
| 3.2.3 桑树miR166f前体序列分析、克隆和靶基因鉴定 |
| 3.2.4 桑树miR166f过表达重组载体的构建 |
| 3.2.5 农杆菌介导桑树miR166f瞬时转化 |
| 3.2.6 桑树miR166f过表达瞬时转化效率的检测 |
| 3.2.7 桑树miR166f对其靶基因表达水平影响的分析鉴定 |
| 3.2.8 桑树miR166f过表达后抗旱相关生理生化指标的检测分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 桑树miR166f的生物信息分析及克隆 |
| 3.3.2 桑树双元超表达载体的构建 |
| 3.3.3 不同条件下重组农杆菌菌液对桑树叶片的转化效率 |
| 3.3.4 桑树miR166f过表达对其靶基因表达水平的影响 |
| 3.3.5 桑树miR166f过表达对抗旱相关生理生化指标的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 桑树MmSK基因的克隆、表达模式分析及原核表达 |
| 4.1 试验材料和试剂 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.1.4 主要试剂和缓冲液的配制 |
| 4.1.5 引物序列 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 桑树的胁迫处理 |
| 4.2.2 桑树总RNA的提取和cDNA的合成 |
| 4.2.3 桑树MmSK基因cDNA序列的克隆验证 |
| 4.2.4 桑树MmSK基因cDNA序列的生物信息学分析 |
| 4.2.5 桑树MmSK基因表达模式分析 |
| 4.2.6 重组MmSK表达载体的构建 |
| 4.2.7 桑树MmSK基因的原核诱导表达 |
| 4.2.8 重组MmSK蛋白的SDS-PAGE及WesternBlot鉴定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 桑树MmSK基因的克隆验证 |
| 4.3.2 桑树MmSK基因的全长cDNA序列及分析结果 |
| 4.3.3 桑树MmSK基因编码氨基酸的同源性与系统进化树分析结果 |
| 4.3.4 桑树MmSK基因在不同组织中的表达分析 |
| 4.3.5 桑树MmSK基因在不同非生物胁迫下的表达分析 |
| 4.3.6 重组表达载体pET-28a(+)-MmSK的构建 |
| 4.3.7 MmSK诱导表达及检测结果 |
| 4.4 讨论 |
| 第5章 桑树VIGS体系的建立及MmSK基因抗旱功能鉴定 |
| 5.1 试验材料和试剂 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.1.4 主要试剂和缓冲液的配制 |
| 5.1.5 引物序列 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 桑树幼苗的培养 |
| 5.2.2 桑树总RNA的提取和cDNA的合成 |
| 5.2.3 病毒载体pTRV2-PDS的构建 |
| 5.2.4 VIGS沉默体系的建立 |
| 5.2.5 桑树MmSK基因的VIGS体系构建 |
| 5.2.6 桑树MmSK基因沉默后干旱胁迫下MmSK表达水平检测分析 |
| 5.2.7 桑树MmSK基因沉默后干旱胁迫下桑树理化指标的检测分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 重组病毒载体pTRV2-PDS及pTRV2-MmSK的构建 |
| 5.3.2 MmSK基因沉默效率的检测 |
| 5.3.3 MmSK基因沉默后干旱胁迫下MmSK表达水平检测结果 |
| 5.3.4 MmSK基因沉默后干旱胁迫下桑树生理生化指标的检测结果 |
| 5.4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 博士期间学术论文发表情况 |
| 致谢 |
（3）桑树皱叶病毒外壳蛋白基因的原核表达和抗体制备及应用（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料和主要试剂 |
| 1.2 粗提纯MCLV病毒样品的制备及感病桑叶粗汁液提取 |
| 1.3 桑叶组织总DNA提取 |
| 1.4 MCLV外壳蛋白基因 (cp) 的克隆 |
| 1.5 MCLV cp基因原核表达载体的构建 |
| 1.6 MCLV CP融合蛋白的诱导表达及可溶性分析和表达量测定 |
| 1.7 多克隆抗体的制备及效价测定和特异性分析 |
| 1.8 稀有密码子分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 优化的MCLV cp基因和原核表达载体的鉴定及融合蛋白的诱导表达 |
| 2.2 优化条件下MCLV CP融合蛋白的诱导表达 |
| 2.3 MCLV CP抗血清的效价和特异性 |
| 2.4制备的MCLV CP抗血清用于桑树皱叶病毒ELISA检测的效果 |
| 3 讨论 |
（5）桑树LINE反转录转座子的特征及相关基因分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 转座子的概述 |
| 1.2 LINE反转录转座子的结构 |
| 1.3 LINE反转录转座子的分类 |
| 1.4 LINE反转录转座子的转座机制 |
| 1.5 LINE反转录转座子的特征 |
| 1.5.1 广泛存在于植物基因组中 |
| 1.5.2 高异质性 |
| 1.6 LINE反转录转座子的功能 |
| 1.6.1 转座导致基因组扩增 |
| 1.6.2 引起基因组的不稳定 |
| 1.6.3 影响基因的表达 |
| 1.7 桑树LINE反转录转座子研究进展 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景及意义 |
| 2.2 主要研究内容 |
| 2.3 技术路线 |
| 第三章 桑树基因组中LINE反转录转座子逆转座酶片段的克隆及特征分析 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 引物 |
| 3.1.3 试剂及主要溶液配置方法 |
| 3.1.4 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 桑树叶片总DNA的提取及检测 |
| 3.2.2 目的片段的克隆及序列验证 |
| 3.2.3 序列分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 桑树LINE反转录转座子RT序列的克隆 |
| 3.3.2 桑树LINE反转录转座子RT序列的特征分析 |
| 3.3.3 桑树LINE反转录转座子RT序列的进化分析 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 3.4.1 桑树LINE反转录转座子RT序列的克隆 |
| 3.4.2 桑树LINE反转录转座子RT序列的异质性 |
| 3.4.3 LINE反转录转座子在桑树基因组中的进化 |
| 第四章 桑树LINE反转录转座子在染色体的分布 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 试剂及主要溶液配置方法 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 去壁低渗法制备染色体玻片 |
| 4.2.2 探针的制备 |
| 4.2.3 荧光原位杂交 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 探针的制备 |
| 4.3.2 桑树LINE RT序列在染色体上的分布 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 桑树基因组LINE反转录转座子的特征分析 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 数据来源 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 氨基酸序列分析 |
| 5.2.2 桑树LINE反转录转座子插入基因偏好性分析 |
| 5.2.3 LINE相关基因的分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 桑树LI和RTE序列的结构特征 |
| 5.3.2 桑树基因组中的LI和RTE氨基酸序列分析 |
| 5.3.3 桑树基因组中的LI和RTE插入基因区域偏好性分析 |
| 5.3.4 插入基因内部的LINE相关基因的功能注释及pathway分析 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 5.4.1 桑树LINE的结构特征 |
| 5.4.2 桑树LINE的序列分析 |
| 5.4.3 桑树LINE与基因的关系 |
| 第六章 桑树基因组LINE相关基因分析 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 数据来源 |
| 6.1.3 试剂及主要溶液配置方法 |
| 6.1.4 主要仪器 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 桑树有LINE插入的选择性剪切基因的筛选 |
| 6.2.2 预测的由LINE插入形成的选择性剪切基因的基本信息 |
| 6.2.3 预测的由LINE插入形成的选择性剪切基因的验证 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 桑树LINE插入形成的选择性剪切相关基因的筛选 |
| 6.3.2 桑树LINE选择性剪接相关基因的基本信息 |
| 6.3.3 桑树LINE选择性剪切相关基因的验证 |
| 6.4 小结与讨论 |
| 第七章 综合与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在读期间发表论文及参加课题 |
| 致谢 |
（6）小RNA深度测序在几种木本植物病毒鉴定中的应用（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 植物病毒检测技术研究进展 |
| 1.1.1 生物学测定法 |
| 1.1.2 电子显微镜法 |
| 1.1.3 血清学检测 |
| 1.1.4 分子生物学检测 |
| 1.1.5 第二代测序(Next-generation sequencing,NGS)检测法 |
| 1.2 我国木本植物病毒研究概况 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 样品采集 |
| 2.2 植物病毒基因组克隆及基因组序列分析 |
| 2.2.1 试剂盒法提取植物总DNA |
| 2.2.2 植物总RNA的提取 |
| 2.2.3 植物病毒基因的反转录 |
| 2.2.4 超保真DNA聚合酶扩增反应 |
| 2.2.5 RACE-PCR(Rapid Amplification of cDNA Ends-PCR) |
| 2.2.6 PCR产物纯化 |
| 2.2.7 大肠杆菌感受态细胞制备 |
| 2.2.8 连接 |
| 2.2.9 大肠杆菌感受态细胞转化 |
| 2.2.10 菌落PCR检测 |
| 2.2.11 序列测定与比对分析 |
| 2.3 小RNA深度测序 |
| 2.3.1 样品RNA的准备 |
| 2.3.2 小RNA文库构建及库检 |
| 2.3.3 小RNA上机测序 |
| 2.4 生物信息学分析 |
| 2.4.1 小RNA测序原始数据处理与分析 |
| 2.4.2 病毒来源小RNA分析 |
| 2.4.3 病毒基因组二级结构预测 |
| 2.4.4 多聚蛋白切割位点分析 |
| 2.4.5 系统进化树构建 |
| 2.4.6 病毒重组分析 |
| 3 三种木本植物RNA病毒的分子鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料来源 |
| 3.1.2 样品RNA提取及送测 |
| 3.1.3 小RNA文库构建及Illumia测序 |
| 3.1.4 小RNA深度测序数据分析 |
| 3.1.5 病毒汁液摩擦接种 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 紫藤花叶病毒的分子鉴定 |
| 3.2.2 南天竹花叶病毒的分子鉴定 |
| 3.2.3 桑树花叶卷叶病毒的分子鉴定 |
| 3.2.4 木本植物来源的WVMV、CMV及MMLRaV摩擦接种实验结果 |
| 3.3 讨论 |
| 4 美国山核桃花叶病毒的分子鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料来源 |
| 4.1.2 样品RNA提取及送测 |
| 4.1.3 小RNA文库构建及Illumia测序 |
| 4.1.4 小RNA深度测序数据分析 |
| 4.1.5 病毒序列分析 |
| 4.1.6 病毒摩擦接种 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 小RNA深度测序结果 |
| 4.2.2 小RNA的拼接及美国山核桃病毒的筛查 |
| 4.2.3 美国山核桃样品中病毒基因组克隆和序列分析 |
| 4.2.4 美国山核桃花叶相关病毒(PMaV)来源小RNA分析 |
| 4.2.5 美国山核桃花叶相关病毒摩擦接种结果 |
| 4.2.6 美国山核桃花叶相关病毒负染电镜观察结果 |
| 4.3 讨论 |
| 5 柠檬矮化类病毒的分子鉴定 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料来源 |
| 5.1.2 样品RNA提取及送测 |
| 5.1.3 小RNA文库构建及Illumia测序 |
| 5.1.4 小RNA深度测序数据分析 |
| 5.1.5 柠檬啤酒花矮化类病毒小RNA的靶基因预测 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 小RNA深度测序结果 |
| 5.2.2 小RNA的拼接及柠檬病毒的筛查 |
| 5.2.3 啤酒花矮化类病毒HSVd基因组克隆和序列分析 |
| 5.2.4 啤酒花矮化类病毒来源小RNA分析结果 |
| 5.2.5 柠檬啤酒花矮化类病毒小RNA的靶基因预测 |
| 5.3 讨论 |
| 6 中国大青金色花叶病毒的分子鉴定 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 材料来源 |
| 6.1.2 样品RNA提取及送测 |
| 6.1.3 小RNA文库构建及Illumia测序 |
| 6.1.4 小RNA深度测序数据分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 小RNA深度测序结果 |
| 6.2.2 小 RNA的拼接及大青病毒的筛查 |
| 6.2.3 中国大青金色花叶病毒基因组克隆和序列分析 |
| 6.2.4 中国大青金色花叶病毒源小RNA分析结果 |
| 6.2.5 中国大青金色花叶病毒源小RNA Velvet-Oases分析结果 |
| 6.2.6 中国大青金色花叶病毒源小RNA在病毒基因组上的分布 |
| 6.3 讨论 |
| 附录Ⅰ 参考文献 |
| 附录Ⅱ 本论文所用病毒缩写及中英文对照 |
| 附录Ⅲ 本论文所用术语缩写词及中英文对照 |
（7）桑花叶型萎缩病病原的鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略表 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 桑花叶型萎缩病概述及研究进展 |
| 1.1.1 桑树萎缩病 |
| 1.1.2 桑萎缩病病原的研究 |
| 1.1.3 花叶型萎缩病病原研究进展 |
| 1.2 双生病毒的概述及研究进展 |
| 1.2.1 双生病毒的分类及基因组结构 |
| 1.2.2 双生病毒的命名 |
| 1.2.3 双生病毒寄主范围的扩大 |
| 1.3 高通量测序技术 |
| 1.3.1 高通量测序 |
| 1.3.2 高通量测序技术在病毒检测领域的应用 |
| 1.3.3 Small RNA测序 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 1.5 技术路线 |
| 第二章花叶型萎缩病桑树样品中病原物的检测及验证 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 样品采集 |
| 2.1.2 试剂及溶液配制 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 改良的CTAB法提取总DNA |
| 2.2.2 改良TRIzol法提取桑树植物组织总RNA |
| 2.2.3 Small RNA测序 |
| 2.2.4 原始数据处理 |
| 2.2.5 Small RNA比对、拼接和注释 |
| 2.2.6（RT）-PCR检测、克隆及测序 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 提取的总RNA的质量 |
| 2.3.2 Small RNA测序数据 |
| 2.3.3 Contigs的比对结果 |
| 2.3.4 候选病原物的确定及PCR验证 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章候选病原物与花叶型萎缩病发生的相关关系研究 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 样品采集 |
| 3.1.2 试剂及溶液配制 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 小分子环状RNA检测探针的制备 |
| 3.2.2 桑树双生病毒检测探针制备-PCR法 |
| 3.2.3 Northern杂交操作步骤 |
| 3.2.4 Southern杂交操作步骤 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 小分子环状RNA的检出率 |
| 3.3.2 线虫传多面体病毒的检出率 |
| 3.3.3 双生病毒的检出率 |
| 3.3.4 三种病原物与花叶型萎缩病害发生的相关关系 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章双生病毒全长序列克隆及基因组结构分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 样品准备 |
| 4.1.2 试剂及溶液配制 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 桑树植物组织总DNA的提取 |
| 4.2.2 PCR扩增、克隆MMDaV基因组全长序列和测序 |
| 4.2.3 滚环扩增（Rolling circle amplification, RCA）： |
| 4.2.4 Southern blot杂交 |
| 4.2.5 RT-PCR鉴定内含子的序列 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 双生病毒基因组全长的克隆 |
| 4.3.2 基因组结构分析及编码蛋白质的预测 |
| 4.3.3 内含子的预测及RT-PCR验证 |
| 4.3.4 系统发育分析 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章双生病毒致病性的鉴定 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 接种植物 |
| 5.1.2 菌株和载体 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 桑树双生病毒侵染性克隆的构建 |
| 5.2.2 酶切鉴定 |
| 5.2.3 载体的去磷酸化 |
| 5.2.4 农杆菌感受态的制备 |
| 5.2.5 重组质粒电击转化农杆菌 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 两端含有SacI和Hind III酶切位点的全长序列扩增 |
| 5.3.2 一个单位全长（SacI & Hind III）克隆至中间载体 |
| 5.3.3 一个单位全长（SacI & Hind III）克隆至植物表达载体pCAMBIA1305.1 |
| 5.3.4 另一个单位全长（Sac I & Sac I）克隆至植物表达载体 p CAMBIA-1.0 U |
| 5.3.5 农杆菌介导接种 |
| 第六章全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（8）桑树MLX56基因家族生物信息学及表达分析（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 植物乳汁概述 |
| 1.1.1 植物乳汁生物特性 |
| 1.1.2 植物乳汁应用价值 |
| 1.2 植物乳汁中的化学成分 |
| 1.2.1 化学成分 |
| 1.3 植物乳汁中的相关酶类 |
| 1.3.1 蛋白酶类 |
| 1.3.2 蛋白酶抑制剂 |
| 1.3.3 氧化酶类 |
| 1.3.4 凝集素,橡胶类似几丁质结合蛋白,几丁质酶 |
| 1.3.5 其他蛋白 |
| 1.4 桑树乳汁概况 |
| 1.4.1 桑树植物乳汁特性 |
| 1.4.2 桑树乳汁应用价值 |
| 1.5 桑树乳胶蛋白 |
| 1.6 家蚕与桑树的协同进化关系 |
| 第二章 引言 |
| 2.1 研究背景及意义 |
| 2.2 研究目的 |
| 2.3 研究内容 |
| 2.3.1 桑树MLX56基因家族成员克隆及生物信息学分析 |
| 2.3.2 桑树MLX56基因家族差异表达及半定量PCR分析 |
| 2.3.3 桑树MLX56-6基因原核表达分析及大肠杆菌生长速率的测定 |
| 2.4 研究技术路线 |
| 第三章 桑树MLX56基因家族的克隆及生物信息学分析 |
| 3.1 材料和试剂 |
| 3.1.1 实验植物材料 |
| 3.1.2 菌株和质粒 |
| 3.1.3 试剂和药品 |
| 3.1.4 实验仪器与设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 MLX56基因家族成员鉴定 |
| 3.2.2 RNA的提取与检测 |
| 3.2.3 反转录合成cDNA第一链 |
| 3.2.4 桑树叶片基因组DNA提取 |
| 3.2.5 桑树MLX56基因的克隆 |
| 3.2.6 桑树MLX56基因家族生物信息学分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 桑树MLX56基因家族鉴定及结构分析 |
| 3.3.2 桑树MLX56基因蛋白质结构域及三维结构分析 |
| 3.3.3 桑树MLX56家族基因系统进化分析 |
| 3.4 小结与讨论 |
| 第四章 桑树MLX56基因家族差异表达及半定量PCR分析 |
| 4.1 材料和试剂 |
| 4.1.1 实验植物材料 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 实验仪器与设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 桑树mRNA的提取及反转录为cDNA |
| 4.2.2 桑树MLX56基因在不同桑树种质材料及不同组织中的差异表达分析 |
| 4.2.3 桑树MLX56基因在不同桑树种质材料及不同组织中的半定量PCR分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 18份桑树种质材料差异表达分析 |
| 4.3.2 18份桑树种质材料MLX56基因聚类分析 |
| 4.3.3 18份桑树种质材料MLX56基因半定量PCR分析 |
| 4.3.4 广东桑‘桂优62号’MLX56基因的组织特异性表达 |
| 4.3.5 广东桑‘桂优62号’MLX56基因半定量PCR分析 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 第五章 桑树MLX56-6基因原核表达分析及大肠杆菌生长速率的测定 |
| 5.1 材料和试剂 |
| 5.1.1 菌株和质粒 |
| 5.1.2 试剂和药品 |
| 5.1.3主要仪器 |
| 5.1.4 主要培养基 |
| 5.1.5 主要溶液 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 pET28a-MLX56-6原核表达载体的构建 |
| 5.2.3 目的蛋白诱导表达 |
| 5.2.4 诱导表达蛋白的SDS-PAGE分析 |
| 5.2.5 重组表达蛋白形式鉴定 |
| 5.2.6 重组表达蛋白Western Blot验证 |
| 5.2.7 大肠杆菌生长速率的测定 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 pET28a-MLX56-6原核表达载体构建 |
| 5.3.2 MLX56-6蛋白的诱导表达 |
| 5.3.3 诱导表达蛋白可溶性检测 |
| 5.3.4 重组蛋白Western Blot检测 |
| 5.3.5 MLX56-6蛋白对大肠杆菌生长的影响 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 第六章 全文总结 |
| 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 附录一 本文采用的缩写 |
| 附录二 经克隆后MLX56基因序列 |
| 硕士在读期间发表论文及参加课题 |
| 致谢 |
（9）桑树中一种新病毒和一种小分子环状RNA的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 桑花叶卷叶病的历史记载 |
| 1.2 桑花叶卷叶病的症状及发生情况 |
| 1.3 桑花叶卷叶病的病原的研究现状 |
| 1.4 桑树病毒的研究进展 |
| 1.5 线虫传多面体病毒属病毒的研究 |
| 1.5.1 线虫传多面体病毒属病毒的分类地位及分类依据 |
| 1.5.2 线虫传多面体病毒的基因组结构特征与功能 |
| 1.5.3 线虫传多面体病毒的传播途径 |
| 1.5.4 线虫传多面体病毒的检测 |
| 1.6 植物病毒卫星RNA的研究 |
| 1.6.1 植物病毒卫星RNA的分类 |
| 1.6.2 环状单链卫星RNA的二级结构 |
| 1.6.3 环状单链卫星RNA的复制 |
| 1.7 类病毒的研究 |
| 1.7.1 类病毒的分类、结构 |
| 1.7.2 类病毒的复制、移动和传播 |
| 1.7.3 类病毒的检测 |
| 1.8 环状单链卫星RNA与类病毒的区别 |
| 1.9 小分子环状RNA侵染性克隆 |
| 1.10 本研究的目的和意义 |
| 2 桑花叶卷叶病叶中一种新发现的病毒的研究 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 样品的采集 |
| 2.1.2 试剂和菌株 |
| 2.1.3 桑叶总RNA提取 |
| 2.1.4 病毒dsRNA的提取 |
| 2.1.5 粗提纯病毒样品的制备及电子显微镜观察 |
| 2.1.6 病毒RNA的提取 |
| 2.1.7 引物合成 |
| 2.1.8 随机锚定引物RT-PCR扩增病毒基因组 |
| 2.1.9 5',3'-RACE |
| 2.1.10 序列分析 |
| 2.1.11 RT-PCR检测 |
| 2.1.12 琼脂糖凝胶电泳分析 |
| 2.1.13 Western blot |
| 2.1.14 MMLRaV抗血清的制备 |
| 2.1.15 生物接种实验 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 粗提纯病毒样品的电子显微镜观察 |
| 2.2.2 桑叶总RNA的质量检测 |
| 2.2.3 cDNA合成和锚定随机引物的扩增 |
| 2.2.4 5',3'-RACE |
| 2.2.5 病毒基因组序列分析 |
| 2.2.6 运动蛋白和外壳蛋白之间的切割位点 |
| 2.2.7 MMLRaV基因组RNA1和RNA2的3'-UTR核苷酸序列分析 |
| 2.2.8 生物接种实验 |
| 2.2.9 大田中MMLRaV的RT-PCR检测 |
| 2.2.10 MMLRaV抗血清的制备 |
| 2.3 讨论 |
| 3 桑花叶卷叶病叶中一种小分子环状RNA的研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 桑树中小分子RNA的提取 |
| 3.1.4 5%往返聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 3.1.5 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 3.1.6 mscRNA的纯化 |
| 3.1.7 mscRNA的分子量大小评估 |
| 3.1.8 引物的合成 |
| 3.1.9 mscRNA的cDNA合成、克隆和测序 |
| 3.1.10 两步法RT-PCR |
| 3.1.11 单管一步RT-PCR |
| 3.1.12 PCR产物纯化、重组质粒的构建、重组质粒的提取 |
| 3.1.13 DIG标记的RNA探针的制备 |
| 3.1.14 Dot blot和Northern blot杂交 |
| 3.1.15 mscRNA二级结构及锤头型核酶结构预测 |
| 3.1.16 mscRNA侵染性克隆的构建 |
| 3.1.17 mscRNA的接种 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 mscRNA的2D-PAGE分析及纯化 |
| 3.2.2 mscRNA的分子量大小评估 |
| 3.2.3 mscRNA分子的cDNA合成、克隆及测序 |
| 3.2.4 mscRNA链极性的确定以及二级结构预测 |
| 3.2.5 mscRNA正链上的锤头型核酶 |
| 3.2.6 mscRNA序列多样性分析 |
| 3.2.7 mscRNA侵染性克隆的构建 |
| 3.2.8 mscRNA的生物学鉴定 |
| 3.2.9 单管一步RT-PCR检测体系的建立 |
| 3.2.10 单管一步RT-PCR、Dot blot和Northern blot在mscRNA检测中的应用 |
| 3.3 讨论 |
| 全文总结 |
| 1 桑花叶卷叶病叶中一种新病毒的研究 |
| 2 桑小分子环状RNA的研究 |
| 3 今后研究的重点及展望 |
| 参考文献 |
| 附录1 缩略词 |
| 附录2 MMLRaV RNA1和RNA2的序列 |
| 附录3 分子生物学试剂购置及通用试剂的配制 |
| 致谢 |
（10）桑树枝条韧皮部桑根皮素的制备及其对小鼠H22细胞株移植性肿瘤的抑制作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1. 概述 |
| 2. 桑树抗肿瘤活性成份的研究概况 |
| 3 桑根皮素的研究现状 |
| 3.1 桑根皮素的结构及鉴定 |
| 3.2 桑根皮素的检测和提取方法 |
| 3.3 桑根皮素的药理作用 |
| 3.3.1 镇痛、抗炎和免疫调控作用 |
| 3.3.2 抗艾滋病病毒(HIV)作用 |
| 3.3.3 抗菌作用 |
| 3.3.4 抗肿瘤作用 |
| 3.3.5 其他药理作用 |
| 4 肿瘤相关基因的研究 |
| 4.1 P53 与肿瘤的关系 |
| 4.2 Survivin 与肿瘤的关系 |
| 4.3 CyclinB1 与肿瘤的关系 |
| 4.4 Caspase-3 与肿瘤的关系 |
| 4.5 NF-κB 与肿瘤的关系 |
| 5 本论文的研究内容与意义 |
| 5.1 主要研究内容 |
| 5.2 研究意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 1 实验试剂、材料及仪器 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 仪器与设备 |
| 1.3 试剂与材料 |
| 2 实验设计与方法 |
| 2.1 桑枝皮醇提物的制备 |
| 2.2 高效液相色谱法（HPLC）分析 |
| 2.2.1 样品的配制 |
| 2.2.2 色谱条件 |
| 2.2.3 桑根皮素的紫外可见光谱测定 |
| 2.3 桑根皮素含量测定 |
| 2.3.1 桑根皮素标准曲线的绘制 |
| 2.3.2 桑枝皮中桑根皮素乙醇提取的稳定性实验 |
| 2.3.3 桑枝皮中桑根皮素的 HPLC 法测定回收率试验 |
| 2.3.4 桑根皮素 HPLC 梯度洗脱分析法的重现性试验 |
| 2.4 桑根皮素单体的提取、分离与纯化 |
| 2.4.1 D101 大孔树脂的预处理 |
| 2.4.2 D101 大孔树脂吸附与分离 |
| 2.4.3 葡聚糖凝胶的预处理及再生 |
| 2.4.4 E100 在 Sephadex LH20 柱上的分离与收集 |
| 2.4.5 D101-Sephadex LH20 组分的半制备反相 HPLC 收集 |
| 2.5 动物实验 |
| 2.5.1 实验动物 |
| 2.5.2 移植瘤 H22肝癌肿瘤小鼠模型的建立 |
| 2.5.3 实验分组 |
| 2.5.4 病理组织切片与观察 |
| 2.5.5 RNA 提取 |
| 2.5.6 引物设计 |
| 2.5.7 RNA 反转录成 cDNA |
| 2.5.8 荧光定量 PCR 的操作步骤 |
| 参考文献 |
| 第三章 实验结果分析与讨论 |
| 1. 结果与分析 |
| 1.1 桑根皮素的鉴定 |
| 1.2 桑根皮素分离与纯化 |
| 1.2.1 桑枝皮醇提物的大孔树脂吸附与分离 |
| 1.2.2 D101-E100 组分反相 HPLC 结果 |
| 1.2.3 D101-E100 组分在 Sephadex-LH20 上的纯化与分离 |
| 1.2.4 纯化样品桑根皮素在反相 HPLC 色谱柱上的分析 |
| 2 桑树中桑根皮素的水平与分布 |
| 2.1 桑根皮素标准曲线 |
| 2.2 HPLC 法测定桑枝皮中桑根皮素的回收率 |
| 2.3 桑根皮素 HPLC 分析法的重现性 |
| 2.4 无水乙醇提取桑枝皮中桑根皮素的稳定性 |
| 2.5 桑树不同部位中桑根皮素的水平 |
| 2.6 桑枝皮中桑根皮素的品种差异 |
| 3 桑根皮素对肿瘤小鼠的影响 |
| 3.1 桑根皮素对肿瘤小鼠体重和肿瘤的影响 |
| 3.1.1 模型小鼠生活状态及体重的变化 |
| 3.1.2 桑根皮素对 H22 肝癌肿瘤小鼠的肿瘤生长的影响 |
| 3.1.3 桑根皮素对肿瘤小鼠肝脏和脾脏发育的影响 |
| 3.2 病理组织学变化 |
| 3.2.1 桑根皮素对小鼠 H22肝癌细胞移植瘤的细胞形态和数量的影响 |
| 3.2.2 桑根皮素对移植瘤 H22小鼠肝毒性的影响 |
| 3.3 相关基因表达的定量分析 |
| 3.3.1 桑根皮素对 P53 基因表达的影响 |
| 3.3.2 桑根皮素对 Survivin 基因表达的影响 |
| 3.3.3 桑根皮素对 CyclinB1 基因表达的影响 |
| 3.3.4 桑根皮素对 Caspase-3 基因表达的影响 |
| 3.3.5 桑根皮素对 NF-κB 基因的影响 |
| 4. 讨论 |
| 5. 结论 |
| 参考文献 |
| 基金资助 |
| 附录一 英汉双解缩略词表 |
| 附录二 |
| 读研期间发表的文章及成果 |
| 致谢 |
四、从桑树营养组织中提取高纯度DNA的方法（论文参考文献）
- [1]桑树钾离子通道及转运体相关基因的克隆及表达分析[D]. 陈丹丹. 江苏科技大学, 2018(02)
- [2]桑树耐旱关联microRNA及其靶基因鉴定与功能分析[D]. 李瑞雪. 江苏科技大学, 2018(02)
- [3]桑树皱叶病毒外壳蛋白基因的原核表达和抗体制备及应用[J]. 卢全有,张建平,孙鑫,杨磊. 蚕业科学, 2017(03)
- [4]安徽桑树品种全基因组DNA提取方法研究[J]. 王钰婷,李瑞雪,王伟,汪泰初. 农学学报, 2016(11)
- [5]桑树LINE反转录转座子的特征及相关基因分析[D]. 况露露. 西南大学, 2016(02)
- [6]小RNA深度测序在几种木本植物病毒鉴定中的应用[D]. 苏秀. 浙江大学, 2015(08)
- [7]桑花叶型萎缩病病原的鉴定[D]. 马宇欣. 中国农业科学院, 2015(01)
- [8]桑树MLX56基因家族生物信息学及表达分析[D]. 韩淑梅. 西南大学, 2015(02)
- [9]桑树中一种新病毒和一种小分子环状RNA的研究[D]. 卢全有. 福建农林大学, 2014(03)
- [10]桑树枝条韧皮部桑根皮素的制备及其对小鼠H22细胞株移植性肿瘤的抑制作用[D]. 马斌. 苏州大学, 2013(11)