一、松材线虫、拟松材线虫形态变异及其ITS—RFLP的研究（论文文献综述）
王芳[1]（2019）在《松材线虫太赫兹光谱检测及基因识别研究》文中提出森林的可持续发展关系到全球生态环境和全人类的生存。人工林作为全球森林资源的重要组成部分,在气候调节、水源涵养和水土保持等方面发挥着重要作用。但许多生物不稳定因素,如环境抵抗能力差、生物病虫害等,大大降低了人工林的生产力。松属树种作为人工林中种植最为广泛的树种之一,正遭受着病虫害的侵袭。松材线虫病是由松材线虫引起的松属树种毁灭性死亡的一种世界性森林病害。传统的线虫检测方法包括:形态学、免疫学、病理学、遗传学和生理生化学等方法,但往往受到植物线虫发育阶段和检测环境条件等因素的制约,很难达到快速、准确鉴定的目的。太赫兹（THz）光谱技术作为传统检测技术的有力补充,对探测物质结构存在的微小差异和变化非常灵敏,具有反映化合物结构的指纹特征。理论计算表明在THz频段存在大量的DNA分子主链间激发的本征共振（例如,螺旋式扭曲,氢键振动,碱基漂移振动等）。利用THz时域光谱技术进行DNA束缚态的基因识别,无需对DNA片段作荧光标记,实验相对简单、操作方便。本课题以松材线虫、拟松材线虫等七种生物DNA,以及它们的主要组成部分（碱基、碱基对、特征片段）为研究对象。借助傅里叶红外光谱仪、太赫兹时域光谱仪、拉曼光谱仪、X射线晶体衍射仪等设备,获得了它们在太赫兹和中红外波段的振动光谱。应用基于PBC-GEBF（周期性边界条件下能量分块方法）的量子力学方法以及分子动力学方法对它们的振动光谱进行解析,为快速鉴别松材线虫和拟松材线虫奠定了基础。本文的主要研究成果如下:（1）获得并详细解析了DNA/RNA碱基、碱基对和特征片段样品的太赫兹光谱,同时对碱基晶体的中红外和拉曼光谱进行了研究。利用太赫兹时域光谱仪和傅里叶红外光谱仪测试得到五种核酸碱基、碱基对共晶C:G、以及两种DNA特征片段(5’-d（AT）13-3’和5’-d（CG）13-3’,各含26对碱基)的太赫兹（THz）光谱。利用Gaussian09软件,结合密度泛函理论和PBC-GEBF方法,计算了五种核酸碱基晶体、含有取代基的三种碱基对共晶（9MA:1MT/1MC:9EG/1M5BU:9MA）以及DNA/RNA特征片段（5’-d（AT）2-3’,5’-d（CG）2-3’,5’-AUCG-3’）的振动光谱,研究发现,计算光谱和实验光谱一致吻合,说明密度泛函理论和PBC-GEBF方法可以很好地描述晶体分子间和分子内的弱相互作用。在太赫兹频段晶胞内分子的振动模式均来源于所有原子参与的集体振动。A:T和A:U碱基对中的两条氢键很容易断裂,在制备样品的过程中并没有真正地形成共晶,而C:G共晶结构中因为存在三条氢键,在样品干燥的过程中氢键没有断裂,形成了约几微米的共晶（微晶）。甲基和乙基作为取代基对分子光谱中吸收峰的强度和位置影响不大,但卤素原子溴作为取代基对光谱有一定的影响。但不管是何种取代基,都对振动模式影响很大,这是因为太赫兹波段的振动模式主要表现为所有原子或分子参与的集体振动,即使结构有细微变化,对振动模式的影响都很大。对于DNA/RNA特征片段,太赫兹波段的振动模式均主要源于DNA/RNA骨架的振动或转动,与其构成的二级结构无关。研究表明,基于晶体结构的中红外和拉曼计算光谱与实验光谱一致吻合。（2）测试并分析了松材线虫、拟松材线虫等七种生物DNA样品的太赫兹光谱。利用傅里叶红外光谱仪和太赫兹时域光谱仪测试得到了七种DNA样品的太赫兹光谱。研究发现,不管是在太赫兹波段还是在亚太赫兹波段,傅里叶红外光谱仪测得的不同生物DNA的光谱都极为相似,无法通过吸收峰的位置来进行分辨。而利用太赫兹时域光谱仪测得的不同生物DNA的光谱在吸收峰位置上有一定的区别,但是由于吸收峰太多,较难分辨。（3）测试并分析了松材线虫/拟松材线虫rDNA ITS1区特征片段及短序列的太赫兹光谱。利用数据挖掘技术获取了松材线虫/拟松材线虫rDNA ITS1区有差异的特征片段（约280对碱基）。利用限制性核酸内切酶和蒙特卡洛（Monte Carlo）方法获取代表松材线虫/拟松材线虫rDNA ITS1区特征片段的短序列。通过基因合成技术制备样品,利用傅里叶红外光谱仪测试得到了酶切短序列太赫兹光谱。同时利用AMBER软件结合分子动力学理论,模拟了所有DNA短序列的振动光谱。研究发现,酶切短序列的计算光谱与实验光谱一致吻合,虽然不同的DNA短序列在实验和计算光谱上没有表现出明显的差异,但是振动模式却与内部碱基排序有着很大关联,故可通过振动模式差异区分松材线虫和拟松材线虫DNA。研究还发现,在一定程度上,二阶马尔科夫（Markov）链和Monte Carlo方法预测的短序列可以代表完整序列作为计算的初始结构,且预测短序列越长,计算结果越接近实验值。
王倩倩[2]（2019）在《铃兰短体线虫与伞滑刃线虫一新种的形态和分子鉴定》文中研究表明短体线虫（Pratylenchus spp.）又称根腐线虫,可引起根系表皮破损和内部组织的腐烂,短体线虫非中国种被列为我国检疫性有害生物。伞滑刃线虫属（Bursaphelenchus spp.）中的松材线虫（B.xylophilus）、椰子红环腐线虫（B.cocophilus）是我国重要的检疫性有害生物,特别是松材线虫已造成我国林业毁灭性的损失。因此,加强口岸对进境植物材料的线虫检疫和鉴定,对保证我国生态环境安全具有重要的意义。云南口岸从进境的荷兰铃兰苗根际土壤中分离到一种短体线虫群体,宁波口岸从加纳进境的紫檀原木中分离到一种未知伞滑刃线虫群体,本文对截获的这两个线虫群体进行了形态特征鉴定及分子特征分析,主要研究结果如下:通过形态特征观察、形态特征测计值比较,将荷兰群体鉴定为铃兰短体线虫（P.convallariae）,主要形态特征为:唇区略缢缩,唇环3个;口针粗壮,长15～17μm,基部球呈郁金香球状;受精囊近球形至矩形,内部充满精子;后阴子宫囊长20.0～29.0μm;尾端略平截、粗糙,或常有不规则环纹。基于rDNA28S D2-D3区序列构建的贝叶斯（MrBayes）系统进化树揭示该荷兰群体与铃兰短体线虫美国群体、比利时群体和法国群体聚类形成一个独立分支,序列相似性达98.0%～100%。通过形态特征观察、形态特征测计值比较,将加纳群体鉴定为紫檀伞滑刃线虫新种（B.pterocarpi n.sp.）,主要形态特征为:雌虫体长630～946 μm,侧线4条;口针长12.6～14.6μm,基部球略膨大;排泄孔位于神经环之后;生殖管前伸,受精囊内部充满精子,阴门盖发育良好;尾圆锥形,较直,尾末端具尾尖突,长1.9～4.8μm;自然寄主和真菌培养群体中均未发现有雄虫。基于rDNA 18S、ITS和28S D2-D3区序列构建的合一系统进化树揭示该新种与松材线虫组（xylophilus-group）和非洲伞滑刃线虫组（africanus-group）的成员聚类在同一分支上,处于分支的基部并独立于这两个组。本文对铃兰短体线虫（P.convallariae）和紫檀伞滑刃线虫新种（B.pterocarpi n.sp.）进行了详细的形态特征描述和分子特征分析,不仅为我国植物线虫的检疫鉴定提供了参考依据,同时对防止检疫性线虫传入和保障我国农林业的健康发展有重要意义。
陶冶[3]（2018）在《南方果蔬根结线虫鉴定及其基于线粒体基因组系统发育分析》文中提出根结线虫（Meloidogyne spp.）是一种植物固着性内寄生线虫,种类多、寄主范围广、致病性强且在全球分布广泛。了解根结线虫的种类、分布及寄主是制定防治策略的基础。本研究对我国南方7个省市部分地区的果蔬作物上的根结线虫进行了鉴定。在此基础上,对鉴定到的四种根结线虫进行线粒体基因组全长测序,并结合其他线虫的线粒体基因组信息构建了系统发育树,为根结线虫的分类和系统进化研究提供依据。另外,基于线粒体基因组及其他一些序列的信息,构建了奇异根结线虫（M.aberrans）和象耳豆根结线虫（M.enterolobii）的分子快速检测系统。主要研究成果如下:1.结合形态学、同工酶电泳技术和分子生物学的方法,对89个种群的根结线虫进行鉴定,其中62个种群为南方根结线虫（M.incognita）,占总样本数的70.8%;12个种群为象耳豆根结线虫,占总样本数的13.5%;11个种群为爪哇根结线虫（M.javanica）占总样本数的11.2%;4个种群为本研究发现的一个新种——奇异根结线虫（Meloidogyne aberrans n.sp.）,占总样本数的4.5%。研究表明南方根结线虫是我国南方果蔬作物上的优势种。杨桃和葡萄是象耳豆根结线虫的寄主新纪录。2.描述了根结线虫新种——奇异根结线虫,其形态鉴别特征如下:雌虫会阴部凸起,颈部位于身体侧面,会阴花纹很弱、圆,口针中等长度（13.6-15.5μm）;雄虫口针长（18.2-19.6μm）,交合刺长（22.7-36.8μm）,侧线11-15条;二龄幼虫唇区光滑,侧面观凹陷,口针长（15.9-16.8μm）,侧线4条,透明尾极短（2.2-5.5μm）。其与一户町根结线虫（M.ichinohei）形态最相似,但与一户町根结线虫相比,奇异根结线虫的雄虫、雌虫和二龄幼虫口针均更长;雄虫体长更长、尾更短、DGO更小、侧线更多;二龄幼虫侧线更少。奇异根结线虫的酯酶表型为罕见的S2型,其两条带的相对迁移率（Rm）分别是40.5%和44.5%,而苹果酸脱氢酶的表型为常见的N1型。同时,本研究获得了奇异根结线虫的SSU、LSU D2D3、ITS和cox2-16S rRNA的序列并构建了系统发育树。序列比对及系统发育树均表明该线虫与已知的根结线虫分子特征不一致。SSU和LSU的系统发育树显示奇异根结线虫和一户町根结线虫亲缘关系最近,而在ITS和cox2-16S rRNA的系统发育树上,和奇异根结线虫亲缘关系最近的分别是巨大根结线虫（M.megadora）和山茶根结线虫（M.camelliae）。另外,组织病理学研究表明奇异根结线虫诱导取食位点形成4-6个多核的巨细胞。3.利用长片段PCR技术对奇异根结线虫、象耳豆根结线虫、南方根结线虫和爪哇根结线虫的线粒体基因组全长进行测序,四种根结线虫的线粒体全长分别为:17,004bp、17,494 bp、17,543 bp和18,392 bp;四种根结线虫线粒体基因组的22个tRNA均为非典型的三叶草结构,并且都是单拷贝;12个蛋白编码基因的排列方式也均相同,但tRNA的排列方式具有一定的变化;所有基因具有相同的转录方向;此外,非编码区的数量及长度也有一定的变化,其中象耳豆根结线虫具有3个大的非编码区,其余三种根结线虫只有2个大的非编码区;另外,基于12个蛋白编码基因,采用贝叶斯法（Bayesian inference,BI）和最大似然法（Maximum-likehood,ML）构建了线虫系统进化树,结果显示:所有的根结线虫聚在同一支,其中南方根结线虫,爪哇根结线虫,花生根结线虫和象耳豆根结线虫聚在同一分支上,拟禾本科根结线虫和哥伦比亚根结线虫聚在另一分支上,而奇异根结线虫则单独落在基部的分支上,与其他几种根结线虫形成姐妹支的关系;整个根结线虫的分支和伤残短体线虫亲缘关系最接近,而与孢囊线虫的亲缘关系相对较远。4.基于线粒体基因组设计了检测根结线虫的通用引物对Mt-RKN-F/Mt-RKN-R、检测奇异根结线虫的特异引物对Mab-Mt-F/Mab-Mt-R和象耳豆根结线虫的特异引物对Me-Mt-F/Me-Mt-R,基于这些引物构建了检测奇异根结线虫和象耳豆根结线虫的双重PCR体系,该体系检测灵敏度可达到单条线虫。此外,在奇异根结线虫rDNA-ITS区分别设计了实时荧光定量PCR特异引物对Mab-qF/Mab-qR和探针Mab-Probe;在象耳豆根结线虫特异性扩增区（Sequence characterized amplified region,SCAR）分别设计了实时荧光定量PCR特异引物对Me-qF/Me-qR和探针Me-Probe,利用这些引物和探针构建了检测奇异根结线虫和象耳豆根结线虫的的实时荧光定量PCR体系,该体系对单条线虫DNA稀释1000倍后的模板仍可灵敏检测。将两种方法用于不同土壤样本的检测,结果表明:实时荧光定量PCR可以100%检测到靶标线虫,即奇异根结线虫和象耳豆根结线虫,但双重PCR无法检测到某些靶标线虫含量较低的土壤样本。
周立峰[4]（2017）在《拟松材线虫致病性分化与致病相关基因研究》文中研究指明拟松材线虫（Bursaphelenchus mucronatus）是一种松树内寄生线虫,广泛分布于欧亚大陆的天然松林中。它与松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）在形态学与生物学特性等方面都十分相似,是松材线虫的近缘种,它们拥有相同的食物资源与媒介昆虫,占据相同生态位。从拟松材线虫发现至今已有30余年,尚无研究表明其与松树大量死亡有关。近年来,越来越多的研究表明拟松材线虫部分虫株也具有较强的致病性。迄今为止,关于拟松材线虫的研究报道主要集中在其与松材线虫的区别、鉴定上,在其基因和蛋白水平上的研究鲜有报道。本研究通过转录组学和蛋白组学分析不同致病力拟松材线虫虫株在致病条件下差异表达基因的种类、数量和功能,并鉴定出了一些与致病相关的差异表达蛋白。为进一步研究拟松材线虫致病机制及致病相关基因的表达调控奠定基础。初步研究成果如下:1.拟松材线虫致病性研究为探讨拟松材线虫的致病性,将6株不同地理来源的拟松材线虫虫株接种到2年生的马尾松和湿地松上,接种后的松苗置于野外环境下观察,供水充足,温度自然。结果表明,这6株拟松材线虫虫株对两种松苗的致病力不同:马尾松苗的死亡率在22.2-83.3%之间,而湿地松苗的死亡率在0-33.3%之间。为进一步探讨拟松材线虫的致病性,在松苗致病力测定的基础上,挑选3株致病力显着差异的拟松材线虫接种到12年生黑松上,接种后的松树自然抚育。黑松死亡率在22.2-66.7%之间。实验期间,实验地的月均降雨量和月均气温与当地历史月降雨量、月气温相近,无极端天气情况出现。本实验证明了拟松材线虫具有致病性,高温、干旱等环境胁迫非其致病的必要条件。2.拟松材线虫群体遗传结构分析为探讨不同地理来源的拟松材线虫虫株的遗传背景,通过ISSR分子标记对来自国内14个省份及日本、韩国的61株拟松材线虫进行群体遗传结构分析。非加权组平均法聚类分析将拟松材线虫分为2个分枝,进一步通过主成分分析更清楚地将拟松材线虫分为4个以上组分。Mantel检测表明,拟松材线虫各虫株间的地理距离和遗传距离呈显着的弱相关性（p<0.05,r=0.312）。拟松材线虫各虫株间的遗传分化系数为0.341,远大于遗传分化阈值0.25;另外,拟松材线虫各虫株间的基因流为1.091,接近生殖隔离指数1。这些说明,可能是长期的地理隔离,导致拟松材线虫各虫株间的生殖隔离,进而形成不同致病力的拟松材线虫虫株。3.拟松材线虫不同生境和不同发育阶段内参基因的筛选本研究应用geNorm、NormFinder、BestKeeper、deltaCq、RefFinder等5种分析方法评价了8个常见的内参基因在拟松材线虫不同发育阶段和生境条件下的表达稳定性。结果表明:在不同生境中,微管蛋白,18S核糖体RNA和泛素结合酶的表达较为稳定;而在不同发育阶段,微管蛋白,组蛋白和18S核糖体RNA表达较为稳定。4.拟松材线虫转录组与蛋白组分析应用RNA测序和蛋白质同位素标记相对和绝对定量技术采集了两个致力差异显着的拟松材线虫虫株的转录组和蛋白组数据,共获得了约40000个基因和5000个蛋白。拟松材线虫的转录组和蛋白组两个组学水平上的数据相关性较弱（r=0.138）,表明转录后调控发生在致病过程中。功能分析发现5个致病相关蛋白在强致病力虫株中都是高表达的,其中过氧化物酶、脂肪酸与视黄醇结合蛋白、谷胱甘肽过氧化物酶与应对寄主防御反应有关,纤维素酶、扩张蛋白与破坏寄主细胞壁有关。因此,拟松材线虫的致病机制可能与适应寄主体内生活有关。5.拟松材线虫脂肪酸与视黄醇结合蛋白和钙网蛋白基因的克隆与功能验证基于拟松材线虫转录组测序数据,我们应用cDNA末端快速克隆技术克隆了拟松材线虫脂肪酸与视黄醇结合蛋白和钙网蛋白基因的cDNA全长,分别是694和1630 bp。其中脂肪酸与视黄醇结合蛋白基因完整开放阅读框长度为537 bp,编码178个氨基酸,而钙网蛋白基因完整开放阅读框长度为1209 bp,编码402个氨基酸。为确认脂肪酸与视黄醇结合蛋白和钙网蛋白基因与拟松材线虫致病的相关性,构建了这两个基因的RNA干扰体系。应用RT-qPCR检测经dsRNA和M9处理过的靶基因在转录水平上的表达量,其中以M9处理后的靶基因表达量为100%,GFP dsRNA处理后靶基因的表达量没有显着变化,而靶基因dsRNA处理后靶基因的表达量显着下降,其中FAR基因mRNA的表达水平只有对照的26.9%,CRT基因mRNA的表达水平也仅有对照的17.4%。不同处理的拟松材线虫幼虫在灰葡萄孢上培养10 d后,采用贝尔曼漏斗法收集线虫。M9处理后的幼虫平均每20对产生1239个F1代,而FAR dsRNA、CRT dsRNA和外源对照基因GFP dsRNA处理后的幼虫平均每20对产生945、906和1133个F1代。同时将RNAi处理后的线虫接种到2年生的黑松上,评估RNAi对拟松材线虫致病力的影响。接种五周后,M9、GFP dsRNA、FAR dsRNA三个处理出现死亡松苗,CRT dsRNA处理组第六周出现死亡松苗。靶基因dsRNA处理组死亡率（33.3-41.7%）显着低于M9（83.3%）和外源基因（75%）对照组,说明脂肪酸与视黄醇结合蛋白在拟松材线虫致病过程中起着重要作用。
何洁,顾建锋[5]（2016）在《松材线虫组DNA条形码筛选》文中提出本文基于Gen Bank中登录的14种松材线虫组线虫的28S、18S和ITS部分基因DNA序列,利用遗传距离法及分子生物学方法评价其各自作为松材线虫组DNA条形码序列的适用性。结果显示,28S（拟松材线虫不分亚种）、28S（拟松材线虫分亚种）、18S和ITS的基因序列种内成对遗传距离平均值分别为0.0071、0.0030、0.0007、0.0043,种间成对遗传距离平均值分别为0.0476、0.0454、0.0052、0.1556,其中28S、18S基因序列种内及种间距离存在一定程度的重叠,ITS具有一定程度的Barcoding gap。3个基因序列构建的NJ进化树显示,28S、ITS构建的系统进化树具有较高的节点支持率,可以有效将14个松材线虫组线虫分离成独立分支,而且28S可以有效鉴别出拟松材线虫的2个亚种;基于18S基因构建的进化树不能对吉拉尼伞滑刃线虫、日本冷杉伞滑刃线虫、拟松材线虫进行有效区分。因此,28S、ITS区具有一定的遗传距离间隔以及相对较高的物种识别率,可以作为松材线虫组线虫候选条形码基因。
徐红梅,陈京元,王义勋,王瑞文[6]（2015）在《拟松材线虫研究进展》文中提出松材线虫和拟松材线虫共同构成松材线虫复合群体,为松材线虫病的病原物。拟松材线虫危害过去没有引起足够重视,相关研究工作不如松材线虫细致。近年来,随着拟松材线虫致病性增强现象不断被报道,人们逐步加强了拟松材线虫研究。本文从拟松材线虫分类学特征、致病性研究及与松材线虫关系等角度对拟松材线虫研究进展进行综述,并展望未来可能的研究热点。
李恩佳[7]（2015）在《松材线虫与拟松材线虫杂交后代差异性的研究》文中研究说明松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）被认为是“松树癌症”,是一种对松树危害十分严重的病害。松材线虫病具有传播途径多、发病部位隐蔽、发病速度快以及治理难度大等特点。由传播媒介松墨天牛（Monochamus alternatus Hope）的携带下迅速传染给健康的松树。松材线虫和拟松材线虫之间存在致病差异。通过福建部分地区松材线虫和拟松材线虫杂交,探究杂交后的致病性、形态等等的变化,为松材线虫病的防治提供参考依据。本研究通过福建延平区拟松材线虫和建瓯、福州森林公园以及泉州安溪的松材线虫进行正反交,并测量了杂交后代和亲本的各形态数据、检测了其致病大小以及进行了 RAPD聚类分析,且在试验过程中,结合其他人的一些试验方法并改进,研究结果如下:1、对松材线虫和拟松材线虫杂交后代及其亲本进行致病性的分析,发现大体上致病性可分为强弱两类。本试验中拟松材线虫致病性相对为弱,松材线虫和拟松材线虫杂交后代包括亲本对松树皆具有致病性,且有个别杂交后代致病性增强,如C（南平延平区拟松材线虫早×福州森林公园松材线虫♀）。松材线虫和拟松材线虫杂交,会有致病性变强的情况出现,应予以重视,具体是什么原因导致致病性变强有待于后期的进一步研究。而其他杂交后代虽然没有出现致病性变强,但基本具有一定的致病效果。用发病级值和感病指数两种指标均能够描述松材线虫病发病程度,且两种指标检测结果差异不大。2、对松材线虫和拟松材线虫杂交后代及其亲本进行形态聚类分析,可以将10种线虫分为3类,且杂交后的部分线虫口针、中食道球、生殖器等发生畸形。3、选取的14条引物对杂交后代及其亲本的RAPD聚类效果较明显,整体引物的多态性较高,平均为70%,扩增出的条带清晰完整,也可以用此14条引物甄别松材线虫和拟松材线虫两个种。杂交后代RAPD聚类可以分为4类:（1）延平区拟松材线虫单独一类;（2）B（南平延平区拟松材线虫早×建瓯松材线虫♂）、C（南平延平区拟松材线虫早×福州森林公园松材线虫♂）、D（南平延平区拟松材线虫♂ ×福州森林公园松材线虫♀）、E（南平延平区拟松材线虫早×泉州安溪县松材线虫♂）4个样为一类;（3）松材线虫亲本,南平建瓯市、福州森林公园、泉州安溪县三个样为一个类;（4）F（南平延平区拟松材线虫♂×泉州安溪县松材线虫♀）为一类。此外,本研究还得出松材线虫的致病性和形态关系密切,其结果与RAPD聚类分析的结果相似。
谢丽艳[8]（2013）在《拟松材线虫和松材线虫的遗传多样性分析》文中认为松材线虫（Bursaphlenchus xylophilus）是松树萎蔫病的病原物，拟松材线虫（Bursaphelenchus mucronatus）与松材线虫形态极相似，二者形态主要区别在尾部。目前，对于松材线虫与拟松材线虫大量虫株之间的遗传多样，以及拟松材线虫的形态变异、致病性变异等与拟松材线虫的遗传变异之间的关系尚缺乏相关的研究。为此，本文在大量收集不同地理来源的拟松材线虫虫株的基础上，采用ISSR分子标记方法，分析这两种线虫的遗传多样性，从DNA分子水平探讨两种线虫的亲缘关系和遗传变异。揭示松材线虫和拟松材线虫的遗传多样性，以期对拟松材线虫和松材线虫的防控提供理论支撑。主要结果如下：（1）为了对松材线虫和拟松材线虫进行遗传多样性的研究，采用2%CTAB法提取的92株线虫的基因组DNA得率和质量均能达到ISSR扩增反应的要求。（2）从130个引物中筛选出的9条ISSR引物对92个线虫虫株进行扩增，得到393条谱带，其中393条均为多态性谱带，多态位点百分率达100%，其中62个拟松材线虫共扩增出356条谱带，355条为多态性谱带，多态位点百分率为99.72%；30个松材线虫共扩增出240条谱带，其中227条为多态性谱带，多态位点百分率为94.58%。（3）根据ISSR的扩增结果，对92株线虫进行遗传多样性分析，得出遗传聚类图。ISSR分子标记结果表明：筛选出的9条引物能够将松材线虫和拟松材线虫区分开。92个线虫株系的遗传相似系数为0.6183-0.9542。利用POPGENE32软件对两种线虫进行遗传多样性参数分析，拟松材线虫群体的平均等位基因数（Na）为1.8982，有效等位基因数（Ne）为1.2412，期望杂合度（H）为0.1607，Shannon’s多样性指数（I）为0.2685。松材线虫群体的平均等位基因数（Na）为1.5751，有效等位基因数（Ne）为1.1638，期望杂合度（H）为0.1063，Shannon’s多样性指数（I）为0.1761，拟松材线虫的遗传多样性高于松材线虫。（4）ISSR研究结果表明：松材线虫和拟松材线虫在地理距离和遗传距离之间没有必然的联系。福建省和安徽省虽然地理距离相隔较远，但是虫株间的亲缘关系较近。江苏省内的松材线虫相似度较高，湖北省部分松材线虫遗传相似性极高。其他浙江省、山东省、重庆市、江西、湖南省、广东省松材线虫虫株遗传变异较大。收集的拟松材线虫也对各个地理来源的虫株进行了遗传距离的分析，部分中国拟松材线虫和国外的拟松材线虫遗传距离较近。安徽省内、重庆市内的拟松材线虫虫株遗传相似度较高，其他几省省内的拟松材线虫虫株遗传变异较大；部分中国拟松材线虫和国外的拟松材线虫遗传距离较近，美国的拟松材线虫与其他国外拟松材线虫遗传距离较远，日本和韩国的拟松材线虫亲缘关系较近。根据以上研究，对松材线虫和拟松材线虫可能的分布动态进行了初步分析。
王江岭,顾建锋,陈先锋,段维军[9]（2012）在《东亚型和欧洲型拟松材线虫的形态学和ITSPCR-RFLP鉴定》文中进行了进一步梳理对宁波口岸截获的不同来源木质包装中的东亚型和欧洲型拟松材线虫进行形态学和ITSPCR-RFLP研究。选用5种限制性内切酶RsaI,HaeⅢ,MspI,HinfI,AluI对各株系单条线虫ITS区PCR扩增产物进行酶切,发现限制性内切酶RsaI有3种酶切结果,表明ITS区段存在DNA序列异质性。研究再次证明ITSPCR-RFLP不但是伞滑刃线虫鉴定十分可靠的辅助手段,还可有效区分种内不同地理型。对拟松材线虫与松材线虫（包括"M"型和"R"型株系）、豆伞滑刃线虫、伪伞滑刃线虫等近似种的区别进行讨论。
史延梅[10]（2011）在《几种松树寄生线虫种类鉴定与致病性研究》文中研究说明鉴于松树寄生线虫种类多样,对松树致病性、生物学特性、与寄主相互关系等等一系列生产上亟待解决的问题还不明确,本文主要开展了以下几个方面的研究：（1）松树寄生线虫种类鉴定；（2）我国松树寄生线虫分类检索表的编制；（3）几种松树寄生线虫的实时PCR鉴定技术研究；（4）几种松树寄生线虫致病性研究；（5）双尾滑刃线虫胚胎发育的研究。主要取得了如下结果：（1）在甘肃省华山松枯死样木中分离到4种线虫：松柱形垫刃线虫（Cylindrotylenchus pini）,红松滑刃线虫（Aphelenchoides resinosi）星尖滑刃线虫（A. asteromucronatus） Ektaphelenchus prolobos,在来自江苏马尾松林的松墨天牛体内分离到双尾滑刃线虫（A.bicaudatus）。在重庆枯死木中分离到薄荷滑刃线虫（A. menthae）。（2）编制了我国松树寄生线虫分类检索表。（3）采用BioEid软件对松材线虫、拟松材线虫、莱奴尔夫伞滑刃线虫、泰国伞滑刃线虫、李氏长尾线虫、吴氏长尾线虫、霍夫曼尼伞滑刃线虫、大核滑刃线虫、赫列尼库斯伞滑刃线虫等9种松树寄生线虫的Its区序列进行比对,在内部转录区存在较多的碱基差异区域,利用Premier express3.0软件设计了5种线虫的引物与荧光探针。经特异性验证,松材线虫、拟松材线虫、泰国伞滑刃线虫和吴氏长尾线虫等4种线虫的引物与探针具有种的特异性。通过线虫与对应探针进行灵敏度检测,结果表明探针P-bx、P-bm、P-bt、P-sw均能够分别检测出样品中含有1条松材线虫、拟松材线虫、泰国伞滑刃线虫和吴氏长尾线虫。（4）不同株系的拟松材线虫（Bursaphelenchus mucronatus）对2年生黄山松和黑松致病性不同。根据拟松材线虫对2年生黑松苗的感病指数、发病率、死亡率等指标,将供试的23个拟松材线虫株系划分为三个致病等级：Ⅰ级（强致病性）、Ⅱ级（弱致病性）和Ⅲ级（无致病性）。（5）接种11种其它寄生线虫,其中吴氏长尾线虫（Seinura wuae）、霍夫曼尼伞滑刃线虫（B. hofmanni）、莱奴尔夫伞滑刃线虫（B. rainulfi） （GD、ZJ106D、CQ）、大核滑刃线虫（A. macronucleatus）、泰国伞滑刃线虫（B. thailandae）、赫列尼库斯伞滑刃线虫（B.hellenicus）、薄荷滑刃线虫（A. menthae）、双尾滑刃线虫（A. bicaudatus）、星尖滑刃线虫（A. asteromucronatus）、Aphelenchoides. Sp等10种松树寄生线虫对黑松无致病性。接种小角伞滑刃线虫（B. corneolus）,莱奴尔夫伞滑刃线虫（B. rainulfi） （GS）分别有一株黑松苗表现发病症状,并且检测到少量相应活体线虫,表明小角伞滑刃线虫（B. corneolus）、莱奴尔夫伞滑刃线虫（B. rainulfi） （GS）可能是一种弱致病性线虫。（6）双尾滑刃线虫生殖是单性生殖,在25℃条件下胚胎发育大约经历2.5天.线虫卵的一侧出现一个雌性前核,卵细胞沿轴线对称分裂,形成2个等大的细胞,进入2细胞阶段。
二、松材线虫、拟松材线虫形态变异及其ITS—RFLP的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、松材线虫、拟松材线虫形态变异及其ITS—RFLP的研究（论文提纲范文）
（1）松材线虫太赫兹光谱检测及基因识别研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 基因识别的主要方法及存在问题 |
| 1.3 太赫兹光谱技术用于基因识别的可行性 |
| 1.4 国内外研究的不足及借鉴之处 |
| 1.5 论文研究内容及技术路线 |
| 1.6 本章小结 |
| 第二章 太赫兹光谱系统 |
| 2.1 太赫兹波产生 |
| 2.1.1 光学效应的太赫兹辐射源 |
| 2.1.2 电子学技术的太赫兹辐射源 |
| 2.2 太赫兹波探测技术 |
| 2.2.1 脉冲太赫兹信号探测 |
| 2.2.2 连续太赫兹信号探测 |
| 2.3 太赫兹时域光谱技术 |
| 2.4 傅里叶红外光谱技术 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 太赫兹光谱的理论解析 |
| 3.1 量子化学计算原理及过程 |
| 3.1.1 从头算理论 |
| 3.1.2 半经验理论 |
| 3.1.3 密度泛函理论 |
| 3.1.4 周期性边界条件下基于能量的分块方法 |
| 3.2 分子动力学计算原理及过程 |
| 3.3 正则模分析方法 |
| 3.4 本章小结 |
| 第四章 DNA/RNA及其构成单元的太赫兹光谱测试与分析 |
| 4.1 样品制备与测试 |
| 4.2 DNA/RNA碱基晶体的太赫兹特征光谱 |
| 4.2.1 分子结构和理论计算方法 |
| 4.2.2 DNA碱基晶体的太赫兹光谱研究 |
| 4.2.3 RNA碱基晶体的太赫兹光谱研究 |
| 4.3 DNA/RNA碱基晶体的中红外和拉曼光谱 |
| 4.3.1 DNA碱基晶体的中红外和拉曼光谱研究 |
| 4.3.2 RNA碱基晶体的中红外和拉曼光谱研究 |
| 4.4 DNA/RNA碱基对晶体的太赫兹特征光谱 |
| 4.4.1 DNA碱基对共晶的THz和 XRD光谱研究 |
| 4.4.2 RNA碱基对共晶的THz和 XRD光谱研究 |
| 4.4.3 取代基对RNA碱基对晶体太赫兹光谱的影响 |
| 4.5 DNA/RNA短链结构的太赫兹特征光谱 |
| 4.5.1 基于量子力学的DNA短链结构的太赫兹光谱研究 |
| 4.5.2 基于量子力学的RNA短链结构的太赫兹光谱研究 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 松材线虫/拟松材线虫DNA的太赫兹光谱测试与分析 |
| 5.1 松材线虫及部分生物DNA样品太赫兹特征光谱 |
| 5.2 松材线虫/拟松材线虫特征片段的太赫兹光谱 |
| 5.2.1 利用数据挖掘技术提取松材线虫DNA特征片段 |
| 5.2.2 基于蒙特卡洛方法的DNA特征短序列提取 |
| 5.2.3 利用限制性内切酶获取DNA特征短序列 |
| 5.2.4 松材线虫DNA特征短序列的太赫兹光谱研究 |
| 5.2.5 基于分子动力学的光谱分析研究 |
| 5.3 本章小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 主要研究结论 |
| 6.2 主要创新点 |
| 6.3 进一步研究展望 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 参考文献 |
（2）铃兰短体线虫与伞滑刃线虫一新种的形态和分子鉴定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 上篇 文献综述 |
| 第一章 短体线虫属研究概述 |
| 1 短体线虫属的分类概况 |
| 2 短体线虫属种类的形态学鉴定 |
| 3 短体属线虫种类的分子生物学鉴定 |
| 3.1 种特异性引物PCR |
| 3.2 ITS-RFLP |
| 3.3 DNA条形码 |
| 4 短体线虫的危害 |
| 4.1 对农作物和草本植物的危害 |
| 4.2 对果树和木本植物的危害 |
| 4.3 短体线虫与其他病原生物的复合侵染 |
| 4.3.1 与其他植物寄生线虫的复合侵染 |
| 4.3.2 与病原细菌的复合侵染 |
| 4.3.3 与病原真菌的复合侵染 |
| 5 短体线虫的防治 |
| 第二章 伞滑刃线虫属研究概述 |
| 1 伞滑刃线虫属的分类概况 |
| 2 伞滑刃属线虫种类的形态学鉴定 |
| 3 伞滑刃属线虫的分子生物学鉴定 |
| 3.1 ITS-RFLP鉴定 |
| 3.2 实时荧光定量PCR |
| 3.3 DNA测序 |
| 4 伞滑刃属线虫的致病性及危害 |
| 4.1 松材线虫的致病性及危害 |
| 4.2 椰子红环腐线虫的致病性及危害 |
| 4.3 拟松材线虫的致病性及危害 |
| 4.4 十二齿小蠹伞滑刃线虫的致病性及危害 |
| 4.5 其他伞滑刃线虫的致病性及危害 |
| 5 致病性伞滑刃线虫的防治 |
| 5.1 松材线虫病的防治 |
| 5.2 椰子红环腐线虫病的防治 |
| 下篇 研究内容 |
| 第一章 荷兰进境铃兰苗中铃兰短体线虫的鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 样品采集和线虫分离 |
| 1.2 形态学鉴定 |
| 1.2.1 线虫临时玻片的制作 |
| 1.2.2 线虫永久玻片的制作 |
| 1.2.3 线虫形态特征的测计 |
| 1.3 分子生物学鉴定 |
| 1.3.1 线虫DNA的提取 |
| 1.3.2 rDNA 28S D2-D3片段的扩增与测序 |
| 1.3.3 系统进化分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 荷兰线虫群体的测计值 |
| 2.2 荷兰线虫群体的形态描述 |
| 2.3 荷兰线虫群体的鉴定及其与近似种的关系 |
| 2.4 分子生物学分析 |
| 3 讨论 |
| 第二章 加纳进境紫檀原木中紫檀伞滑刃线虫新种的鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 线虫的分离 |
| 1.2 线虫的纯培养和繁殖测定 |
| 1.3 形态学鉴定 |
| 1.4 分子生物学鉴定 |
| 1.4.1 线虫DNA的提取 |
| 1.4.2 rDNA片段的扩增 |
| 1.4.3 rDNA片段的克隆及测序 |
| 1.4.4 系统进化分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 形态特征测计值 |
| 2.2 形态描述 |
| 2.3 模式生境与寄主 |
| 2.4 模式标本 |
| 2.5 形态鉴定及其与近似种的比较 |
| 2.6 分子鉴定特征和系统进化分析 |
| 3 讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士期间发表的文章 |
| 致谢 |
（3）南方果蔬根结线虫鉴定及其基于线粒体基因组系统发育分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 根结线虫的农业危害及经济重要性 |
| 1.2 根结线虫的发生和分布 |
| 1.3 根结线虫的分类及鉴定方法 |
| 1.3.1 根结线虫的形态分类与鉴定 |
| 1.3.2 同工酶电泳技术 |
| 1.3.3 基于分子生物学的鉴定方法 |
| 1.3.3.1 DNA的提取 |
| 1.3.3.2 DNA靶标序列的选择 |
| 1.3.3.3 植物线虫分子生物学鉴定的方法 |
| 1.4 线虫线粒体基因组的研究 |
| 1.4.1 线虫线粒体基因组的测序方法 |
| 1.4.2 线虫线粒体基因组的特点 |
| 1.4.3 线虫线粒体基因组在线虫学中的应用 |
| 1.5 研究目的及意义 |
| 第二章 南方果蔬作物根结线虫的鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 种群来源 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.2.3 主要仪器与设备 |
| 2.2.4 线虫的纯化与扩繁 |
| 2.2.5 线虫标本的制作及形态观察 |
| 2.2.6 形态学观察和数据测量 |
| 2.2.7 同工酶电泳实验 |
| 2.2.8 扫描电镜观察 |
| 2.2.9 组织病理学切片观察 |
| 2.2.10 单条线虫DNA的提取 |
| 2.2.11 PCR扩增、克隆及测序 |
| 2.2.12 序列分析及系统发育树的构建 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 根结线虫新种—奇异根结线虫（Meloidogyne aberrans n. sp.） |
| 2.3.1.1 形态学鉴定结果 |
| 2.3.1.2 同工酶电泳分析 |
| 2.3.1.3 分子生物学鉴定 |
| 2.3.1.4 症状及组织病理学切片观察 |
| 2.3.2 南方根结线虫 [Meloidogyne incognita（Kofoid, 1919）Chitwood，1949] |
| 2.3.2.1 形态学鉴定结果 |
| 2.3.2.2 同工酶电泳分析 |
| 2.3.2.3 分子生物学鉴定 |
| 2.3.3 爪哇根结线虫[Meloidogyne javanica（Treub, 1885）Chitwood, 1949] |
| 2.3.3.1 形态学鉴定结果 |
| 2.3.3.2 同工酶电泳分析 |
| 2.3.3.3 分子生物学鉴定 |
| 2.3.4 象耳豆根结线虫[Meloidgyne enterolobii（Yang, 1983）] |
| 2.3.4.1 形态学鉴定结果 |
| 2.3.4.2 同工酶电泳分析 |
| 2.3.4.3 分子生物学鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 根结线虫线粒体基因组及系统发育 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 主要试剂及配制 |
| 3.2.2 主要实验仪器 |
| 3.2.3 二龄幼虫的分离与收集 |
| 3.2.4 线虫大量DNA的提取 |
| 3.2.5 锚定区cox1-16s RNA的扩增、克隆和测序 |
| 3.2.5.1 锚定区cox1-16s RNA的PCR扩增 |
| 3.2.5.2 锚定区cox1-16s RNA PCR产物的克隆和测序 |
| 3.2.6 锚定区 16s RNA- cox1的扩增，克隆和测序 |
| 3.2.6.1 锚定区 16s RNA- cox1的PCR扩增 |
| 3.2.6.2 锚定区 16s RNA- cox1 PCR产物的克隆和测序 |
| 3.2.7 序列的拼接 |
| 3.2.8 序列的注释和分析 |
| 3.2.9 基于四种根结线虫线粒体基因组的系统发育分析 |
| 3.2.9.1 系统发育树的序列来源 |
| 3.2.9.2 序列的比对，处理和模型建立 |
| 3.2.9.3 系统发育树的构建 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 奇异根结线虫线粒体基因组测序结果及分析 |
| 3.3.1.1 奇异根结线虫线粒体基因组长片段PCR扩增结果 |
| 3.3.1.2 奇异根结线虫线粒体基因组总特征 |
| 3.3.1.3 奇异根结线虫线粒体基因组编码蛋白的特征及密码子使用 |
| 3.3.1.4 奇异根结线虫线粒体基因组的t RNAs和r RNAs |
| 3.3.1.5 奇异根结线虫线粒体基因组非编码区 |
| 3.3.2 象耳豆根结线虫线粒体基因组测序结果及分析 |
| 3.3.2.1 象耳豆根结线虫线粒体基因组长片段PCR扩增结果 |
| 3.3.2.2 象耳豆根结线虫线粒体基因组总特征 |
| 3.3.2.3 象耳豆线粒体基因组编码蛋白的特征及密码子使用 |
| 3.3.2.4 象耳豆根结线虫线粒体基因组t RNAs和r RNAs |
| 3.3.2.5 象耳豆根结线虫线粒体基因组非编码区 |
| 3.3.3 南方根结线虫线粒体基因组测序结果及分析 |
| 3.3.3.1 南方根结线虫线粒体基因组长片段PCR扩增结果 |
| 3.3.3.2 南方根结线虫线粒体基因组总特征 |
| 3.3.3.3 南方线粒体基因组编码蛋白的特征及密码子使用 |
| 3.3.3.4 南方根结线虫线粒体基因组t RNAs和r RNAs |
| 3.3.3.5 南方根结线虫线粒体基因组非编码区 |
| 3.3.4 爪哇根结线虫线粒体基因组测序结果及分析 |
| 3.3.4.1 爪哇根结线虫线粒体基因组长片段PCR扩增结果 |
| 3.3.4.2 爪哇根结线虫线粒体基因组总特征 |
| 3.3.4.3 爪哇根结线虫线粒体基因组编码蛋白的特征及密码子使用 |
| 3.3.4.4 爪哇根结线虫线粒体基因组t RNAs和r RNAs |
| 3.3.4.5 爪哇根结线虫线粒体基因组非编码区 |
| 3.3.5 基于线粒体基因组的系统发育关系 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 奇异根结线虫和象耳豆根结线虫的快速分子检测 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 单条线虫的DNA提取 |
| 4.2.2 双重PCR检测 |
| 4.2.2.1 双重PCR引物的设计 |
| 4.2.2.2 保守引物稳定性检测 |
| 4.2.2.3 特异引物特异性检测 |
| 4.2.2.4 普通双重PCR体系的构建 |
| 4.2.3 实时荧光定量PCR检测 |
| 4.2.3.1 实时荧光定量PCR引物和探针的设计 |
| 4.2.3.2 实时荧光定量PCR特异性检测 |
| 4.2.3.3 实时荧光定量PCR灵敏性检测 |
| 4.2.3.4 标准曲线的建立 |
| 4.2.3.5 土壤样品中根结线虫的快速鉴定 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 普通双重PCR检测象耳豆根结线虫和奇异根结线虫 |
| 4.3.1.1 根结线虫保守引物的扩增 |
| 4.3.1.2 奇异根结线虫特异引物的扩增 |
| 4.3.1.3 象耳豆根结线虫特异引物的扩增 |
| 4.3.1.4 双重PCR检测结果 |
| 4.3.2 实时荧光定量PCR检测象耳豆根结线虫和奇异根结线虫 |
| 4.3.2.1 实时荧光定量PCR特异性分析 |
| 4.3.2.2 实时荧光定量PCR灵敏度分析 |
| 4.3.2.3 标准曲线的建立 |
| 4.3.2.4 实时荧光定量PCR检测土壤中根结线虫 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 全文总结 |
| 5.1 南方果蔬作物上根结线虫的鉴定 |
| 5.2 根结线虫新种 — 奇异根结线虫(Meloidogyne aberrans n. sp.)的鉴定 |
| 5.3 根结线虫线粒体基因组的研究 |
| 5.4 象耳豆根结线虫和奇异根结线虫的检测 |
| 5.4.1 双重PCR检测 |
| 5.4.2 实时荧光定量PCR检测 |
| 5.4.3 土壤样本的检测 |
| 5.5 本研究创新之处 |
| 5.6 本研究进需要进一步解决的问题 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（4）拟松材线虫致病性分化与致病相关基因研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| abstract |
| 前言 |
| 第一章 绪论 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究目的和意义 |
| 3 拟松材线虫研究现状及评述 |
| 3.1 拟松材线虫生物学特性 |
| 3.2 拟松材线虫的分类地位与鉴定 |
| 3.3 拟松材线虫致病性与致病相关基因的研究进展 |
| 3.4 转录组测序与蛋白组分析在病原线虫研究中的应用 |
| 3.4.1 转录组测序及其在植物病原线虫研究中的应用 |
| 3.4.2 蛋白组分析及其在病原线虫研究中的应用 |
| 3.4.3 转录组和蛋白组数据关联分析的应用 |
| 3.5 RNAi在线虫研究中的应用 |
| 3.5.1 RNAi机制 |
| 3.5.2 RNAi在线虫研究中的应用 |
| 4 研究目标和研究内容 |
| 4.1 研究的主要目标 |
| 4.2 研究的主要内容 |
| 5 研究技术路线 |
| 第二章 拟松材线虫致病性的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 供试线虫与寄主 |
| 1.1.2 供试松苗及松树 |
| 1.1.3 主要试剂与仪器 |
| 1.1.4 培养基 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 供试线虫鉴定 |
| 1.2.2 接种试验 |
| 1.3 试验统计 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 拟松材线虫鉴定结果 |
| 2.2 试验期间两地气象统计 |
| 2.3 拟松材线虫对马尾松苗和湿地松苗的致病性测定结果 |
| 2.4 拟松材线虫对12年生黑松的致病性及其在死亡黑松体内的分布规律 |
| 3 结论与讨论 |
| 第三章 不同地理来源的拟松材线虫群体的遗传结构分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 供试虫株及来源 |
| 1.1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 ISSR–PCR |
| 1.2.2 种群遗传距离与聚类分析 |
| 1.2.3 主成分分析 |
| 1.2.4 遗传距离与地理距离之间的相关性分析 |
| 1.2.5 种群间的遗传分化与基因流 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 非加权类平均（UPGMA）聚类分析 |
| 2.2 主成分分析 |
| 2.3 遗传距离与地理距离之间的Mantel检验 |
| 2.4 种群间的遗传分化与基因流 |
| 3 结论与讨论 |
| 第四章 拟松材线虫实时定量PCR内参基因的筛选 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 供试虫株及来源 |
| 1.1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 不同实验条件下拟松材线虫的收集 |
| 1.2.2 不同实验条件下拟松材线虫总RNA的提取 |
| 1.2.3 拟松材线虫总RNA质量检测 |
| 1.2.4 拟松材线虫总RNA的反转录 |
| 1.2.5 拟松材线虫候选内参基因的选择与qPCR引物的设计 |
| 1.2.6 RT-qPCR反应 |
| 1.2.7 拟松材线虫候选内参基因稳定性分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 候选内参基因的鉴定及引物的筛选 |
| 2.1.1 候选内参基因的鉴定 |
| 2.1.2 候选内参基因引物的筛选 |
| 2.2 候选内参基因表达水平分析 |
| 2.3 基于geNorm软件分析的候选内参基因表达情况 |
| 2.4 基于NormFinder软件分析的候选内参基因表达情况 |
| 2.5 基于BestKeeper软件分析的候选内参基因表达情况 |
| 2.6 基于deltaCq分析的候选内参基因表达情况 |
| 2.7 基于RefFinder分析的候选内参基因表达情况 |
| 3 结论与讨论 |
| 第五章 拟松材线虫转录组学的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 供试线虫与寄主 |
| 1.1.2 接种实验及线虫收集 |
| 1.1.3 主要试剂与仪器 |
| 1.1.4 培养基 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 总RNA提取及检测 |
| 1.2.2 cDNA文库构建和RNA-Seq |
| 1.2.3 测序数据处理与与评估 |
| 1.2.4 转录组生物信息学分析 |
| 1.2.5 RT-qPCR验证 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 RNA质量检测 |
| 2.2 测序及组装数据评估 |
| 2.2.1 测序及组装数据评估 |
| 2.2.2 De novo拼接 |
| 2.3 Unigene功能注释 |
| 2.4 COG功能分类 |
| 2.5 Unigene的GO分类 |
| 2.6 KEGG通路分析 |
| 2.7 SSR分析 |
| 2.8 SNP分析 |
| 2.9 RT-qPCR验证 |
| 2.10 差异基因分析 |
| 2.10.1 差异基因GO功能注释 |
| 2.10.2 差异基因KEGG pathway分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 第六章 拟松材线虫蛋白组学的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 供试线虫 |
| 1.1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 蛋白提取 |
| 1.2.2 蛋白浓度测量 |
| 1.2.3 SDS电泳检测蛋白质量 |
| 1.2.4 蛋白酶解 |
| 1.2.5 iTRAQ标记 |
| 1.2.6 SCX分离 |
| 1.2.7 基于Q-Exactive的LC-MS/MS分析 |
| 1.2.8 蛋白组生物信息学分析 |
| 1.2.9 蛋白组与转录组的关联分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 蛋白质样品质量检测 |
| 2.2 蛋白组鉴定信息 |
| 2.2.1 蛋白组鉴定质量评估 |
| 2.2.2 蛋白组鉴定基本信息 |
| 2.2.3 拟松材线虫蛋白组相对分子质量分布 |
| 2.2.4 肽段长度序列分布 |
| 2.2.5 肽段序列覆盖度 |
| 2.2.6 鉴定蛋白的功能注释 |
| 2.2.7 差异蛋白分析 |
| 2.3 拟松材线虫蛋白组与转录组鉴定信息 |
| 2.3.1 蛋白组与转录组关联的数量关系 |
| 2.3.2 蛋白组与转录组关联表达相关性 |
| 2.3.3 表达变化趋势相同的差异基因与蛋白的GO注释 |
| 2.3.4 拟松材线虫致病相关基因的分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 第七章 拟松材线虫致病相关基因FAR和EXP克隆与功能验证 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 供试线虫 |
| 1.1.2 供试松苗 |
| 1.1.3 主要试剂与仪器 |
| 1.1.4 培养基 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 拟松材线虫RNA提取及cDNA合成 |
| 1.2.2 拟松材线虫FAR和CRT基因片段克隆 |
| 1.2.3 拟松材线虫FAR和CRT基因cDNA全长克隆 |
| 1.2.4 拟松材线虫FAR和CRT基因生物信息学分析 |
| 1.2.5 拟松材线虫FAR和CRT基因RNAi功能验证 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 拟松材线虫FAR和CRT基因RNA-Seq测序片段克隆确认 |
| 2.2 拟松材线虫FAR和CRT基因3'-RACE扩增结果 |
| 2.3 拟松材线虫FAR和CRT基因5'-RACE扩增结果 |
| 2.4 拟松材线虫FAR和CRT基因ORF全长分析 |
| 2.4.1 拟松材线虫FAR结构分析与功能预测 |
| 2.4.2 拟松材线虫CRT结构分析与功能预测 |
| 2.5 拟松材线虫FAR和CRT基因RNAi实验 |
| 2.5.1 拟松材线虫FAR和CRT基因RNAi效率 |
| 2.5.2 拟松材线虫FAR和CRT基因RNAi后线虫的繁殖量 |
| 2.5.3 拟松材线虫FAR和CRT基因RNAi效率 |
| 3 结论与讨论 |
| 第八章 全文总结与展望 |
| 1 全文总结 |
| 2 展望 |
| 博士期间发表的文章 |
| 参考文献 |
| 附件1 博士论文相关数据 |
| 附件2 双尾线虫研究 |
（5）松材线虫组DNA条形码筛选（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 数据来源 |
| 1.2 DNA提取、扩增和测序 |
| 1.3 数据分析 |
| 1.4 备选标记序列的物种识别评价标准 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 序列统计和特征分析 |
| 2.2 不同候选条形码序列遗传距离分析 |
| 2.3不同候选条形码序列遗传距离分布频率及Barcoding Gap检验 |
| 2.4 聚类和物种辨识能力的分析 |
| 3 讨论 |
（6）拟松材线虫研究进展（论文提纲范文）
| 1 松材线虫病概述 |
| 2 拟松材线虫分类地位与特征 |
| 3 拟松材线虫致病性研究 |
| 4 拟松材线虫与松材线虫关系 |
| 4.1 形态学差异 |
| 4.2 形态和致病性变异 |
| 4.3 亲缘关系 |
| 4.4 相互作用 |
（7）松材线虫与拟松材线虫杂交后代差异性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1 松材线虫、拟松材线虫与松材线虫病 |
| 1.1 松材线虫病概况 |
| 1.2 松材线虫和拟松材线虫 |
| 2 国内外研究进展 |
| 2.1 线虫的分离及培养方法 |
| 2.2 松材线虫与拟松材线虫杂交的研究 |
| 2.3 致病性及其测定方法 |
| 2.4 松材线虫病与生物分子技术 |
| 3 本研究的目的和意义 |
| 4 技术路线 |
| 第二章 松材线虫和拟松材线虫杂交及培养 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 材料提供 |
| 1.2 仪器设备 |
| 1.3 培养基的制备 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 松材线虫和拟松材线虫的分离 |
| 2.2 线虫的培养 |
| 2.3 线虫的杂交 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 线虫的纯化和培养 |
| 3.2 不同线虫雌雄比对培养的作用 |
| 3.3 线虫培养温度的选择 |
| 3.4 杂交结果分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 第三章 松材线虫与拟松材线虫杂交后代及其亲本的致病性分析 |
| 1 供试材料 |
| 1.1供试虫株及松苗 |
| 1.2 试验仪器 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验虫株的准备 |
| 2.2 线虫的接种 |
| 2.3 数据收集及处理 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 马尾松发病级值分析 |
| 3.2 马尾松感病指数分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 第四章 松材线虫与拟松材线虫杂交后代及其亲本的形态分析 |
| 1 供试材料 |
| 1.1 供试虫株 |
| 1.2 试验仪器及软件 |
| 1.3 试验试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 试验虫株的准备 |
| 2.2 线虫形态的测量 |
| 2.3 数据的收集及处理 |
| 3 结果与分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 第五章 松材线虫与拟松材线虫杂交后代及其亲本的RAPD分析 |
| 1 供试材料 |
| 1.1 供试虫株 |
| 1.2 主要仪器 |
| 1.3 主要试剂 |
| 2 试验方法 |
| 2.1 DNA的提取 |
| 2.2 线虫DNA的检测 |
| 2.3 松材线虫DNA的RAPD-PCR扩增反应 |
| 2.4 RAPD-PCR产物凝胶电泳及成像 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 线虫DNA提取浓度检测结果 |
| 3.2 引物的多态性分析 |
| 3.3 松材线虫与拟松材线虫杂交及其后代亲缘遗传聚类分析 |
| 4 小结与讨论 |
| 第六章 总结 |
| 1 全文总结 |
| 2 展望 |
| 3 试验创新点 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 附图 |
| 致谢 |
（8）拟松材线虫和松材线虫的遗传多样性分析（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 拟松材线虫 |
| 1.1 拟松材线虫分类地位 |
| 1.2 拟松材线虫的危害 |
| 1.3 拟松材线虫致病力的研究 |
| 1.3.1 无致病力 |
| 1.3.2 弱致病力 |
| 1.3.3 强致病力 |
| 2 松材线虫 |
| 2.1 松材线虫分类地位 |
| 2.2 松材线虫病的危害 |
| 2.3 松材线虫的致病性研究 |
| 3 遗传多样性 |
| 3.1 遗传多样性的概念 |
| 3.2 遗传多样性的研究的意义 |
| 3.3 遗传多样性的主要研究方法 |
| 3.3.1 限制性片段长度多态性（RFLP） |
| 3.3.2 随机扩增多态性（RAPD） |
| 3.3.3 随机片段长度多态性（AFLP） |
| 3.3.4 单链构象多态性（SSCP） |
| 3.3.5 微卫星标记技术（SSR） |
| 3.3.6 简单重复序列间扩增（ISSR） |
| 3.3.7 单核苷酸多态性（SNP） |
| 3.3.8 序列特异性扩增区（SCAR） |
| 4 植物线虫分子标记的研究 |
| 4.1 植物线虫分子标记的分子生物学基础 |
| 4.2 植物线虫分析标记的研究进展 |
| 4.2.1 植物线虫核酸杂交方面的研究 |
| 4.2.2 植物线虫 RFLP 方面的研究 |
| 4.2.3 松材线虫 RAPD 方面的研究 |
| 4.2.4 植物线虫 AFLP 方面的研究 |
| 4.2.5 植物线虫其他分子标记的研究 |
| 第二章 线虫基因组 DNA 的提取 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试线虫的来源 |
| 1.2 线虫的分离、纯化和培养 |
| 1.3 实验试剂和仪器 |
| 1.3.1 实验试剂 |
| 1.3.2 实验仪器 |
| 1.4 线虫基因组 DNA 的提取 |
| 1.5 线虫基因组 DNA 的检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 紫外分光光度计检测结果 |
| 2.2 琼脂糖凝胶电泳的检测结果 |
| 3 结论与讨论 |
| 第三章 拟松材线虫和松材线虫的 ISSR-PCR 引物筛选 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 实验试剂和仪器 |
| 1.2.1 实验试剂 |
| 1.2.2 实验仪器 |
| 1.3 ISSR 引物及退火温度的筛选 |
| 1.4 ISSR 反应结果的检测 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 适宜 ISSR 引物的筛选 |
| 3 结论与讨论 |
| 第四章 拟松材线虫和松材线虫的遗传多样性分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料来源 |
| 1.2 实验试剂和仪器 |
| 1.3 松材线虫和拟松材线虫 ISSR-PCR 的反应体系 |
| 1.4 ISSR-PCR 结果检测 |
| 1.5 数据处理和统计分析 |
| 1.5.1 数据统计方法 |
| 1.5.2 数据处理和分析方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 松材线虫和拟松材线虫 ISSR-PCR 的扩增结果 |
| 2.2 种群遗传多样性分析 |
| 2.2.1 扩增结果多态位点分析 |
| 2.2.2 松材线虫和拟松材线虫群体遗传多样性分析 |
| 2.2.3 拟松材线虫的遗传多样性分析 |
| 2.2.4 松材线虫的遗传多样性分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 3.1 松材线虫和拟松材线虫的 ISSR-PCR 扩增 |
| 3.2 松材线虫和拟松材线虫群体的遗传多样性和遗传分化 |
| 3.3 ISSR 分子标记的可行性 |
| 3.4 我国松材线虫分布动态的初步分析 |
| 3.5 我国拟松材线虫分布动态的初步分析 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 1 主要研究与结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（9）东亚型和欧洲型拟松材线虫的形态学和ITSPCR-RFLP鉴定（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 线虫来源 |
| 1.2 形态观察 |
| 1.3 ITS-RFLP分析 |
| 1.3.1 线虫DNA的提取 (王江岭等，2010) |
| 1.3.2 rDNA的ITS区PCR扩增 |
| 1.3.3 RFLP分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 主要形态特征 |
| 2.2 PCR扩增结果 |
| 2.3 PCR-RFLP结果与分析 |
| 3 讨论 |
（10）几种松树寄生线虫种类鉴定与致病性研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 植物线虫分类研究进展 |
| 1.1 滑刃属分类地位和研究进展 |
| 1.2 伞滑刃属分类地位和研究进展 |
| 2 松树寄生线虫种类和分布 |
| 2.1 国外松树寄生线虫种类和分布 |
| 2.2 我国松树寄生线虫种类 |
| 3 线虫分子鉴定研究 |
| 3.1 DNA杂交技术 |
| 3.2 随机扩增多态性技术(RAPD技术) |
| 3.3 单链构象多态性技术(SSCP) |
| 3.4 限制性片段长度多态性(RFLP技术) |
| 3.5 实时定量PCR技术 |
| 3.6 特异引物PCR技术 |
| 4 松树寄生线虫致病性 |
| 第二章 松树寄生线虫种类鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 线虫样本来源 |
| 1.2 线虫的分离 |
| 1.3 线虫的培养和固定 |
| 1.4 线虫永久玻片制备 |
| 1.5 线虫的鉴定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 松柱形垫刃线虫Cylindrotylenchus pini Yang,1985 |
| 2.2 红松滑刃线虫Aphelenchoides resinosi Tafadzwa R,Kaisa et al.,1995 |
| 2.3 星尖滑刃线虫Aphelenchoides asteromucronatus Eroshenko,1967 |
| 2.4 Ektaphelenchus prolobos Massey,1964 |
| 2.5 薄荷滑刃线虫Aphelenchoides menthae Lisetzkaya,1971 |
| 2.6 双尾滑刃线虫Aphelenchoides bicaudatus(Imamura,1931)Filipjev &Schuurmans Stekhoven,1941 |
| 3 结论与讨论 |
| 第三章 我国松树寄生线虫检索表 |
| 1 我国松树寄生线虫分类检索表 |
| 2 我国松树寄生线虫检索表补充说明 |
| 第四章 几种松树寄生线虫实时PCR鉴定技术研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试线虫种类 |
| 1.2 试验试剂 |
| 1.3 试验仪器 |
| 1.4 DNA提取方法 |
| 1.5 ITS区PCR扩增 |
| 1.6 电泳检测PCR目的产物 |
| 1.7 PCR产物纯化回收DNA片段 |
| 1.8 特异ITS区片段与载体连接 |
| 1.9 连接反应物产物的转化 |
| 1.10 挑斑 |
| 1.11 菌液PCR |
| 1.12 测序 |
| 1.13 特异引物与探针设计 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 ITS序列比对 |
| 2.2 引物与探针设计 |
| 2.3 引物与探针特异性验证 |
| 2.4 探针检测灵敏度 |
| 3 结论与讨论 |
| 第五章 拟松材线虫的致病性 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试松苗 |
| 1.2 供试拟松材线虫株系来源 |
| 1.3 线虫的纯化与培养 |
| 1.4 线虫计数 |
| 1.5 接种方法 |
| 1.6 接种后松苗管理 |
| 1.7 数据统计、处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同拟松材线虫株系对黄山松的致病性 |
| 2.2 不同拟松材线虫株系对黑松的致病性 |
| 3 结论与讨论 |
| 第六章 几种松树寄生线虫对黑松的致病性 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试松苗 |
| 1.2 供试线虫 |
| 1.3 线虫的纯化与培养方法 |
| 1.4 线虫计数 |
| 1.5 接种方法 |
| 1.6 接种后松苗管理 |
| 1.7 数据统计、处理 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 接种后黑松苗发病结果分析 |
| 2.2 接种线虫后再分离结果分析 |
| 3 结论与讨论 |
| 第七章 双尾滑刃线虫(Aphelenchoides bicaudatus)胚胎发育研究 |
| 1. 材料和方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 双尾滑刃线虫的卵 |
| 2.2 胚胎发育 |
| 3 讨论 |
| 第八章 全文总结与展望 |
| 1 主要研究结论 |
| 2 展望 |
| 参考文献 |
| 附录一: 供试线虫形态图片 |
| 详细摘要 |
| Abstract |
四、松材线虫、拟松材线虫形态变异及其ITS—RFLP的研究（论文参考文献）
- [1]松材线虫太赫兹光谱检测及基因识别研究[D]. 王芳. 南京林业大学, 2019(05)
- [2]铃兰短体线虫与伞滑刃线虫一新种的形态和分子鉴定[D]. 王倩倩. 南京农业大学, 2019
- [3]南方果蔬根结线虫鉴定及其基于线粒体基因组系统发育分析[D]. 陶冶. 华南农业大学, 2018(08)
- [4]拟松材线虫致病性分化与致病相关基因研究[D]. 周立峰. 南京林业大学, 2017(02)
- [5]松材线虫组DNA条形码筛选[J]. 何洁,顾建锋. 植物检疫, 2016(01)
- [6]拟松材线虫研究进展[J]. 徐红梅,陈京元,王义勋,王瑞文. 湖北林业科技, 2015(06)
- [7]松材线虫与拟松材线虫杂交后代差异性的研究[D]. 李恩佳. 福建农林大学, 2015(01)
- [8]拟松材线虫和松材线虫的遗传多样性分析[D]. 谢丽艳. 南京林业大学, 2013(02)
- [9]东亚型和欧洲型拟松材线虫的形态学和ITSPCR-RFLP鉴定[J]. 王江岭,顾建锋,陈先锋,段维军. 林业科学, 2012(08)
- [10]几种松树寄生线虫种类鉴定与致病性研究[D]. 史延梅. 南京林业大学, 2011(05)