一、肝细胞生长因子原核表达载体PUC18-HGF的构建及鉴定（论文文献综述）
李小雨[1]（2019）在《刚地弓形虫IF-3与CSI基因部分生物学功能研究》文中研究指明刚地弓形虫（Toxoplasma gondii,T.gondii）是一种专性胞内寄生性原虫,可以在大部分温血动物之间传播,其引发的弓形虫病对畜牧业和人类健康具有严重的危害性。在急性感染阶段,宿主细胞内的速殖子以无性繁殖的方式实现快速增殖。原癌基因是细胞内参与生长与分化过程的一类正常基因,当其表达水平出现异常时,机体细胞就会发生恶性转化,促进癌症的发生。速殖子在不受宿主免疫应答抑制时的无限繁殖与癌细胞的恶性增殖相类似。热休克蛋白（Heat shock protein,HSP）是一种广泛存在于真核生物体内的应激蛋白质,具有分子伴侣、抗热应激、调节免疫反应等作用,其对小鼠巨噬细胞功能的影响尚不明确。本研究将弓形虫基因组序列与重要原癌基因序列进行比对分析,选取与原癌基因hst具有高度同源性的翻译起始因子（Translation Initiation Factor,IF-3）,研究其对虫体繁殖能力及毒力的影响。此外,在体外环境下,本文还研究了 HSP70与HSP90对小鼠巨噬细胞功能的影响。本文研究结果为探究弓形虫繁殖机制提供了依据,也对弓形虫与宿主间的免疫作用研究具有重要意义。1刚地弓形虫IF-3对虫体繁殖能力及毒力的影响本章研究中,构建针对IF-3基因和对照基因柠檬酸合成酶Ⅰ（citrate synthase Ⅰ,CSI）的特异性CRISPR/Cas9载体与乙胺嘧啶（Pyrimethamine）抗性的DHFR同源重组载体。将构建成功的CRISPR/Cas9载体与同源重组抗性片段共同电转染弓形虫虫体,经过乙胺嘧啶药筛培养后,提取转染后速殖子的基因组并进行PCR验证。五次重复独立实验结果均显示对照组CSI基因被成功敲除,而实验组未获得IF-3基因缺失虫体。因此表明,IF-3是弓形虫生长的必需基因。之后通过RNA干扰技术分析IF-3基因的相关功能,细胞粘附与侵入实验表明IF-3基因被抑制将降低弓形虫粘附细胞的能力,减弱其侵入宿主细胞的能力。体外细胞内噬斑与繁殖实验结果显示干扰IF-3基因后,弓形虫速殖子的繁殖速度随之下降。最后小鼠攻虫实验发现,IF-3基因被抑制能够延长感染小鼠的存活时间,表明虫体的毒力被减弱。综上所述,弓形虫IF-3基因是虫体生长的必需基因,下调其表达会减弱弓形虫的粘附、侵入、繁殖能力及虫体毒力。2刚地弓形虫CSI对虫体繁殖能力及毒力的影响本章研究利用前期构建成功的CSI基因缺失株探究弓形虫CSI对虫体繁殖能力及毒力的影响。通过PCR与免疫荧光实验进一步验证获取的基因缺失株,分析结果表明已成功构建弓形虫CSI基因缺失株,进而开展后续体内与体外实验。细胞粘附与侵入实验表明敲除CSI基因对弓形虫粘附细胞的能力影响较弱,也未能减弱其侵入宿主细胞的能力。体外细胞内噬斑与繁殖实验结果显示缺失CSI基因后,降低弓形虫虫体的繁殖能力。进一步本章还在体内条件下进行了小鼠攻虫实验,结果发现缺失CSI基因能够延长感染小鼠的存活时间。综上所述,弓形虫CSI基因对虫体的粘附与侵入能力无影响,但能减缓弓形虫的繁殖速度,降低虫体的毒力。3刚地弓形虫热休克蛋白70对小鼠巨噬细胞功能的影响在本章研究中,将弓形虫HSP70（TgHSP70）与小鼠巨噬细胞（Ana-1）共同培养,分析TgHSP70对巨噬细胞功能的调节作用。成功克隆并表达重组TgHSP70蛋白（rTgHSP70）,将rTgHSP70与小鼠巨噬细胞共孵育,利用激光共聚焦显微镜观察重组蛋白与Ana-1细胞的结合情况。通过流式细胞检测仪分析rTgHSP70对巨噬细胞吞噬、凋亡能力以及表面Toll样受体4（TLR4）分子表达量的影响。利用试剂盒检测重组蛋白对巨噬细胞增殖与分泌水平的调节作用。免疫荧光实验结果显示,在体外环境下,rTgHSP70能够紧密结合在Ana-1细胞表面。流式细胞术分析结果表明,rTgHSP70能显着促进巨噬细胞的吞噬、凋亡与TLR4分子的表达。检测结果发现,在20和40μg/mL浓度下,rTgHSP70能提高细胞的增殖活性;在不同浓度下,重组蛋白均能显着促进Ana-1细胞分泌IL-6和TNF-α的能力;高浓度的rTgHSP70蛋白与细胞共孵育后,能提升Ana-1细胞分泌NO与IL-10的水平。综上所述,TgHSP70在体外条件下能够调节小鼠巨噬细胞的增殖、吞噬、凋亡及分泌功能。4刚地弓形虫热休克蛋白90对小鼠巨噬细胞功能的影响本章研究主要是将弓形虫HSP90（TgHSP90）作用于小鼠巨噬细胞,目的是探究其对巨噬细胞功能的影响。首先成功构建原核表达质粒pET-32a（+）-TgHSP90,诱导表达并纯化获得重组TgHSP90蛋白（rTgHSP90）。将制备的重组蛋白与巨噬细胞共同培养,结果显示,rTgHSP90能够结合在巨噬细胞表面,进而开展后续细胞功能研究。与rTgHSP90共同孵育后,结果显示,巨噬细胞的增殖与吞噬活性被提升,也显着提高细胞的凋亡比例。此外,巨噬细胞的分泌水平被增强,提升了 TNF-α、NO、IL-6与IL-10的分泌量,同时,巨噬细胞表面TLR4分子表达水平也被提升。由此可见,TgHSP90在体外条件下可以调节小鼠巨噬细胞的增殖、吞噬、凋亡及分泌功能。
赵晨红[2]（2019）在《重组人胰岛素的原核表达与活性探究》文中进行了进一步梳理目的:作为首个被美国食品药品监督管理局（FDA）批准的基因工程蛋白药物,重组人胰岛素在糖尿病治疗中发挥着重要作用。目前,临床上引入外源性胰岛素的唯一途经是皮下注射。然而注射外源性的胰岛素,除了针刺和疼痛引起患者抵触心理之外,还会引起肌肉萎缩,低血糖等一系列副作用。口服是最优的给药方式,但由于胃肠道酶的降解以及肠道的低吸收率,使得口服胰岛素的生物有效性极低。本研究尝试在基因水平对胰岛素原进行改造,得到一种能被迅速分离纯化、并在肠道中主动吸收的胰岛素类似物,从而为口服胰岛素的生产奠定基础。方法:利用分子克隆技术,将带有HAIYPRH短肽的人胰岛素原（proinsulin,ProINS）与类弹性蛋白（Elastin-Like Polypeptide,ELP）融合,构建原核表达质粒载体pET-ProINS（7pep）-LE-Elp。将重组质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）进行诱导表达;借助类弹性蛋白可逆相变循环的特性进行纯化;并分别在动物水平与细胞水平检测蛋白的生物学活性。结果:成功在大肠杆菌中表达出分子量为45 kDa左右的ProINS（7pep）-LE-Elp融合蛋白。该融合蛋白主要以不溶的包涵体形式存在于宿主细胞中。经变复性工艺以及可逆相变循环后得到的可溶ProINS（7pep）-LE-Elp融合蛋白,腹腔注射给糖尿病鼠后能显着降低其血糖水平,并能刺激HepG2细胞胰岛素信号通路Akt的活化,降低PEPCK mRNA的表达水平。然而,结肠注射进入小鼠体内的ProINS（7pep）-LE-Elp融合蛋白并无降糖的效果,说明ProINS（7pep）-LE-Elp融合蛋白不能被小鼠肠上皮细胞主动吸收。结论:成功表达出具有生物学活性的ProINS（7pep）-LE-Elp融合蛋白,为新型长效胰岛素类似物的开发奠定基础。
李雅[3]（2017）在《PGRN与ECM1相互作用介导乳腺癌增殖及转移分子机制的研究》文中提出颗粒蛋白前体（Progranulin,PGRN）是一种具有多功能的分泌性细胞生长因子,参与多种生理过程,如细胞增殖、损伤修复、神经系统发育、血管生成等,同时也参与一些病理过程,如肿瘤发生发展、炎症反应与神经退行性疾病等。PGRN在恶性程度较高的肿瘤组织中呈现高表达,例如乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌等。然而PGRN作为肿瘤发生的重要相关分子,其具体作用机制尚不明确。本课题通过酵母双杂交系统（Yeast two-hybrid system,Y2H）筛选可能与PGRN相互作用的分子时,发现细胞外基质蛋白-1（Extracellular matrix protein 1,ECM1）分子与PGRN存在相互作用。ECM1是一种相对分子质量为85 kDa的分泌性糖蛋白,与肿瘤发生、软骨形成、血管生成和表皮分化等密切相关。ECM1在多种恶性上皮肿瘤组织中高表达,包括浸润性乳腺导管癌、食管鳞状细胞癌、肝癌、胃和结直肠癌等,并与肿瘤的恶性程度及淋巴结转移呈正相关。由于ECM1与PGRN在肿瘤发生过程中均发挥着重要的作用,因此本课题对ECM1与PGRN间相互作用参与肿瘤发生发展过程进行了探索,从而,为阐明ECM1介导PGRN生物学功能的分子机制奠定基础。本课题通过以下5方面内容的研究,并取得了相应的结果:1.ECM1单克隆抗体的制备、鉴定及功能研究:通过单克隆抗体制备技术,获得了六株针对人ECM1-6His的单克隆抗体（1C4、1G4、2E3、2G3、2A3和4C2）;六株抗体对原核及真核ECM1具有较高的亲和力与特异性,均适用于Western blot检测;除4C2外,其余五株抗体均能用于检测具有天然构象的ECM1,适用于免疫荧光染色检测;通过Western blot检测,发现1C4与1G4识别ECM1 N-termianl、2E3 识别 Repeat Ⅰ、2G3 识别 Repeat Ⅱ、2A3 和 4C2 识别 C-termianl;尽管1C4与1G4识别相同的N-termianl结构域,2A3与4C2抗体识别相同的C-termianl结构域,但竞争ELISA结果表明它们所针对的表位不同;因此,我们获得了针对ECM1蛋白不同表位的六株单克隆抗体;通过IP及IF检测,发现1C4、2E3、2G3和2A3抗体均适用,并且1C4可以用于IHC;通过对抗体生物学功能检测,发现1C4、2E3和2A3对于MDA-MB-231增殖、迁移与侵袭均有一定的抑制功能;综上,ECM1单克隆抗体为研究ECM1的功能提供了有利的工具。2.针对人ECM1双夹心ELISA试剂盒构建:基于获得的针对ECM1四个结构域的单克隆抗体,我们获得了能够用于ECM1检测的双夹心试剂盒,试剂盒的标准曲线为 y=0.17397x+0.06148（R=0.998）,其检测范围为 575.0 pg/mL～9.2 ng/mL;将该试剂盒应用于肿瘤病人血清ECM1检测,发现肿瘤病人血清中ECM1显着高于正常人,其中乳腺癌病人最高,卵巢癌次之;在此基础上引入Luciferase-luciferin系统,获得试剂盒的标准曲线为y=458.54x+194.25（R=0.992）,其检测范围为287.5 pg/mL～9.2 ng/mL,成功提高了夹心试剂盒灵敏度。3.PGRN与ECM1蛋白相互作用验证及两者之间各自结合部位确定:通过Y2H、Co-IP和GST pull-down技术证明PGRN与ECM1在体内外均存在相互作用;通过IHC技术,发现PGRN与ECM1在恶性乳腺癌中存在共定位,是PGRN与ECM1发生相互作用的基础;通过Y2H技术,进一步研究确认PGRN通过B 结构域与 ECM1 相互作用,ECM1 Repeat Ⅰ、Repeat Ⅱ及 C-terminal结构域均能与PGRN结合,这可能与ECM1 Repeat Ⅰ、Repeat Ⅱ和C-termianl结构域均具有典型的CC-（X7-10）C结构,能够形成双环结构有关。4.PGRN与ECM1相互作用参与肿瘤转移的分子机制研究:利用CRJSPR/Cas9技术,成功获得ECM1或PGRN基因敲除的MDA-MB-231细胞;研究结果表明,PGRN基因敲除的细胞增殖速度极慢,而ECM1基因敲除的细胞增殖速度稍慢于野生型细胞;Transwell结果表明ECM1促进肿瘤细胞侵袭与迁移,而PGRN抑制肿瘤细胞侵袭与迁移;ECM1基因敲除后,促进上皮细胞-间充质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）进程的分子 N-cadherin、SNAIL与促进转移的分子MMP9、MMP14及ICAM1 mRNA表达水平降低;β-catenin、ICAM1蛋白水平与ERKI/2磷酸化水平均降低,表明ECM1能够促进EMT与ERK1/2信号通路的激活;PGRN基因敲除后,N-cadherin、SNAIL、MMP9、MMP14、ICAM1 及 β-cateninmRNA 表达水平升高,β-catenin、ICAM1 蛋白水平与ERK1/2磷酸化水平升高,表明PGRN能够抑制β-catenin与ERK1/2信号通路;裸鼠体内试验结果表明PGRN基因敲除的细胞在裸鼠体内生长速度最慢,ECM1基因敲除的细胞系稍慢于野生型;小鼠生存期与肿瘤生长速度呈负相关。上述研究结果表明PGRN与ECM1相互作用,且二者为拮抗关系,共同调控了转移过程中的重要分子的表达。5.PGRN与ECM1或EGFR相互作用在调节肿瘤增殖及转移之间平衡的机制研究:通过Co-IP与固相结合技术,发现PGRN与EGFR在体内外均存在相互作用;通过固相竞争技术,发现ECM1能够与EGFR发生竞争,使PGRN与EGFR结合物发生解离;而EGFR也能促使PGRN与ECMI结合物发生解离,说明EGFR与ECM1在结合PGRN方面为竞争关系;Y2H技术结果表明EGFR与PGRN相互作用不是直接结合,需要其它分子介导;利用CRISPR/Cas9技术获得了低表达EGFR的MDA-MB-231细胞系;研究结果表明,低表达EGFR的细胞增殖速度显着慢于野生型细胞与PGRN敲除的细胞系;Transwell结果表明低表达EGFR的细胞侵袭与迁移能力增强;低表达EGFR的细胞中,N-cadherin、SNAIL、ICAM1 及 β-catenin mRNA 表达水平升高,β-catenin、ICAM1蛋白水平与ERK1/2磷酸化水平升高,表明EGFR能够抑制β-catenin与ERK1/2信号通路。上述研究结果表明PGRN与EGFR基因功能均为促进增殖、抑制侵袭与迁移。上述研究表明,PGRN通过与ECM1或EGFR相互作用,对肿瘤增殖及转移之间平衡进行调节。综上所述,本课题首先通过酵母双杂交技术筛选发现了与PGRN存在相互作用新的分子ECM1。并制备了六株针对ECM1的单克隆抗体,为研究ECM1的功能提供了有利的工具。基于ECM1四个结构域的单克隆抗体,获得了能够用于ECM1检测的双夹心试剂盒,并引入luciferase-luciferin系统,进一步提高了夹心试剂盒的灵敏度。通过酵母双杂交技术、Co-IP、GST pull-down和IHC技术证明了 PGRN与ECM1在体内外均存在相互作用,并对PGRN相互作用介导的信号通路进行了深入研究,详细阐述了 PGRN与ECM1相互作用参与乳腺癌转移过程的生物学功能。本课题首次发现PGRN与受体EGFR相互作用,PGRN通过与EGFR或ECM1结合,从而调节乳腺癌细胞增殖与转移间平衡。上述研究结果为进一步阐明PGRN生物学功能的分子机制及其在肿瘤发生发展中的作用机制奠定了重要基础,同时为肿瘤治疗新靶标的发现提供了新思路。
王鹏[4]（2016）在《KGH-R1-ScFv单链抗体与p21Ras蛋白免疫反应性研究》文中研究指明ras基因作为经典癌基因之一,从其被发现以来一直备受关注,即使到现在对它的研究热潮也未曾削减。其中主要原因是因为p21Ras蛋白在许多信号通路中处于中枢地位,调控着细胞的增殖、分化和存活,约33%的人类癌细胞中存在ras基因突变。因此,对ras基因或p21Ras蛋白进行干预在治疗癌症领域具有非常广阔的应用前景。目前以ras基因为靶点的治疗策略主要有反义寡核苷酸和RNA干扰技术,而以p21Ras蛋白为靶点的治疗主要基于免疫治疗。免疫治疗因具有高效的靶向性和安全性,在杀伤癌细胞时基本上不损伤正常组织,被认为是未来癌症治疗中最具前景的治疗技术。选择抗p21Ras蛋白抗体可以中和p21Ras蛋白,阻断ras信号通路,达到治疗与ras基因或蛋白异常相关癌症的目的。本实验室以野生Hp21Ras蛋白作为抗原构建出了广谱抗p21Ras单克隆抗体,并在单克隆抗体基础上构建出广谱抗p21Ras的KGH-R1-ScFv单链抗体。实验室前期工作证明KGH-R1-ScFv单链抗体对多种高表达p21Ras蛋白肿瘤具有很好抑制作用,但对于肿瘤中高表达的p21Ras蛋白是突变型还是野生型尚不清楚。为了最大限度地发挥该单链抗体在治疗Ras相关肿瘤中的作用,必须阐明其免疫反应谱。本实验目的是从蛋白和细胞两个水平上研究KGH-R1-ScFv单链抗体与各种p21Ras蛋白各亚型的免疫反应活性:1、与三种野生型p21Ras蛋白各亚型的免疫反应性;2、与七种突变型p21Ras蛋白的免疫反应性;3、与四种已知p21Ras类型的肿瘤细胞的免疫反应性。第一步,原核表达野生H、N和K-p21Ras蛋白及突变型Kp21RasG12S、Kp21RasG12V、Kp21RasG13D、Np21RasQ61K、Np21RasG12C、Np21RasQ61R、Hp21RasG12V蛋白;第二步,原核表达KGH-R1-ScFv单链抗体;第三步,酶联免疫吸附法（ELISA）检测KGH-R1-ScFv单链抗体与野生型p21Ras蛋白和突变型p21 Ras蛋白之间的免疫反应性;第四步,细胞免疫荧光实验检测KGH-R1-ScFv与已知p21Ras类型的肿瘤细胞（MD-MB-231人乳腺癌细胞、A549人肺癌细胞、SW480人结肠癌细胞、HuH7人肝癌细胞）的免疫反应性;第五步,Western Blotting实验检测进一步验证KGH-R1-ScFv单链抗体与肿瘤细胞p21Ras蛋白免疫反应性。ELISA法结果表明KGH-R1-ScFv单链抗体与野生型的H、N、K-p21Ras蛋白和突变型 p21Ras 蛋白（Kp21RasG12S、Kp21RasG12V、Kp21RasG13D、Np21RasQ61K、Np21RasG12C、Np21RasQ61R 蛋白）都结合,但实验发现与突变的Hp21RasG12V蛋白免疫反应结果为阴性。根据酶标仪读取的蛋白浓度和吸光度值绘制ELISA四参数拟合曲线,结果显示KGH-R1-ScFv单链抗体与突变型Kp21Ras蛋白的免疫结合力高于突变型Np21Ras蛋白,与野生型Hp21Ras、Kp21Ras和Np21Ras蛋白都具有较高的免疫结合力。对实验室已知p21Ras类型的肿瘤细胞进行细胞免疫荧光实验,根据荧光定位结果表明KGH-R1-ScFv单链抗体与Kp21RasG13D的MD-MB-231人乳腺癌细胞、Kp21RasG12S的A549人肺癌细胞、Kp21RasG12V的SW480人结肠癌细胞和NRas突变的HuH7人肝癌细胞都免疫结合。裂解以上4种肿瘤细胞并收集肿瘤细胞蛋白,随后进行Western Blotting实验,结果再次验证KGH-R1-ScFv单链抗体与肿瘤细胞的p21Ras蛋白都结合。本实验完善了 KGH-R1-ScFv单链抗体与p21Ras蛋白免疫反应谱,对后续该单链抗体与其他药物联合治疗肿瘤提供了理论依据,另外实验结果对以KGH-R1-ScFv单链抗体治疗特定突变类型的肿瘤提供了强有力的证据。
曹凯[5]（2015）在《靶向uPAR的胰腺癌双模态分子探针构建及体内MR/光学成像研究》文中研究说明第一部分：胰腺癌靶向uPAR的双模态分子探针的构建研究背景：根治性手术切除对于早期胰腺癌患者而言,是非常重要的预后因素。如果能在术中确定原发肿瘤的浸润边界及局部侵犯的范围,将会显着降低肿瘤的复发及转移,提高病人的生存期。基于上转换纳米颗粒（upconversion nanoparticles, UCNP）的分子影像探针为胰腺癌边界的检测带了巨大希望。这些上转换纳米材料与传统的染料非常不同,它们能够吸收和结合多个低能光子,通过反斯托克过程释放单一的高能光子即近红外（near-infrared, NIR）发射光,有效地提高了光穿透组织的能力。并且,由于生物体内没有荧光体具有相似的性质,自身荧光干扰可以在其成像中完全避免,从而增强了图像的信噪比（signal-to-noise ratio, SNR）。此外,上述纳米颗粒基质中含有顺磁性稀土元素钆（Gd）,颗粒本身具有本征的磁共振和上转换特性,为双模态分子探针的构建提供了理想载体。酶的活性是肿瘤侵袭的关键因素,以酶直接作为成像靶点将有助于我们明确肿瘤浸润的边界。尿激酶型纤溶酶原激活物受体（urokinase plasmin-ogen activator receptor, uPAR）属于丝氨酸蛋白酶,它与其配体尿激酶型纤溶酶原激活物（urokinase plasminogen, uPA）结合后,调节多条信号通路,这些信号通路关系到细胞外基质的降解,细胞的迁移,肿瘤的转移扩散以及肿瘤血管生成等方面,促进了肿瘤的浸润。这种在胰腺癌边界及肿瘤间质细胞中高度表达的膜外受体,为肿瘤边界成像提供了非常有价值的靶点。重组的氨基末端片段（amino termino fragment, ATF）是uPA与受体结合的结构域,它可以作为靶向探针与上转换纳米颗粒载体连接,构建主动靶向探针UCNP-ATF。该探针改变了传统荧光造影剂单一的、下转换发光的成像模式,增强了图像的信噪比及光穿透深度,整合了目前先进的纳米技术、分子靶向和多模态成像,有望实现对胰腺癌边界的判定。目的：制备以顺磁性稀土纳米颗粒为基质的高发光强度上转换纳米颗粒,并对其表面生物相容性及功能化修饰；探讨制备方法和聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）修饰等因素对uPAR靶向的磁共振/上转换发光纳米颗粒的晶体表征、光学性质及弛豫时间的影响;合成重组的多肽ATF；研究UCNP-ATF的磁共振/上转换发光纳米颗粒在体外对人胰腺癌细胞（SW1990）的靶向结合能力。方法：通过高温法合成了NaGdF4:Yb,Er纳米颗粒。为进一步增强发光强度,通过种子生长法,用NaGdF4:Yb,Er制备了具有壳核结构的新型纳米颗粒NaGdF4:Yb,Er @NaGdF4.通过透射电子显微镜（transmission electron microscope, TEM）扫描,检测NaGdF4:Yb,Er及NaGdF4:Yb,Er@NaGdF4纳米颗粒的粒径、形态等本征特性,并采用光谱扫描进行光学性质的研究。通过配体交换法将PEG的磷酸盐和马来酰亚胺基团置换到核壳纳米颗粒上,使其具有水溶性及生物相容性,并利用发光光谱,表征修饰前后上转换发光的稳定性。同时,我们采用了临床使用的3.0 T MRI （Siemens MAGNETOM Skyra）,对修饰后的纳米颗粒的弛豫率进行了表征。通过PCR扩增的方法,获取uPAR 1-135的氨基末端片段的cDNA。重组多肽ATF的特异性扩增片段经载体pET300α的转化,在大肠杆菌DH5α株中表达,并用Ni2+-NTA柱进行纯化。将提纯产物分别用Bradford法以及SDS-PAGE、Western-Blot检测,从而确定产物的纯度和浓度。随后,通过上转换纳米颗粒表面上的马来酰亚胺残基与多肽ATF发生反应,完成UCNP-ATF探针构建。最后,通过动态光散射（Dynamic light scattering, DLS）表征UCNP-ATF探针在PBS中的水合尺寸,并使用相同方法,偶联相同分子量的不相关鼠蛋白,构建非靶向性探针UCNP-mIgG作为体外细胞实验的对照。在与靶向和非靶向探针共同孵育以后,人胰腺癌细胞系SW1990经流式MarkⅡ及MRI扫描后,分别在磁共振及近共聚焦显微镜下成像,检测探针体外与细胞的结合能力。结果：标准化Er3+粒子浓度以后,光谱结果显示包壳后纳米颗粒的整体发光强度是包壳前强度的70倍,表明核壳结构显着增强了纳米颗粒的发光强度。并且,TEM图像显示,包壳后纳米颗粒的尺寸、形态几乎没有发生改变,平均粒径为18.6±0.9nm。PEG修饰后的水溶性非核壳结构和核壳纳米颗粒,在PBS中的光谱结果显示,两种颗粒的发光强度明显下降,这可能是由于水分子的高能振动模式增加了激发态的非辐射弛豫所致。尽管包壳过程对PEG配体置换过程所造成的发光淬灭并没有明显改善,但是核壳纳米颗粒仍较非核壳结构的纳米颗粒高57倍。细胞体外实验MRI成像结果显示,包壳后的纳米颗粒其摩尔弛豫率r,较包壳前稍有下降,考虑与纳米粒径稍有增加相对减小了颗粒比表面积,导致表面Gd3+离子比例相对减少有关。通过Ni柱提纯的重组ATF,以BSA为标准,用Bradford方法测定其浓度为0.4mg/ml,经考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE及Western-Blot分析其纯度约90%。探针UCNP-ATF构建前后的DLS结果显示,探针构建后水合尺寸明显增大,说明纳米颗粒与多肽连接成功,并且DLS上没有出现其它明显的峰位,表明在连接过程中没有形成沉淀或较大的聚集体。对人胰腺癌细胞系SW1990孵育靶向探针的ImageStream流式MarkⅡ显示图像,UCNP-ATF探针能够与细胞膜表面识别结合。MRI结果同样证实,靶向探针比起非靶向探针对细胞有明显的T1信号增强作用及特异性。结论：1.制备了强上转换发光效率的小粒径（<30nm）生物相容性纳米颗粒。2.合成了多肽ATF,并与上述生物相容性纳米颗粒连接,构建了uPAR靶向的双模态探针。3.细胞体外实验证明了该探针具备靶向人胰腺癌的主动识别能力。第二部分：胰腺癌靶向uPAR的双模态分子探针体内MR/光学成像研究研究背景：对于探针的成像研究,除了敏感特异的成像手段,建立能更好表现出肿瘤血管生成,肿瘤病理生理过程以及肿瘤微环境的动物模型,同样也是非常关键的。由于稀土纳米颗粒有着先进的生物相容性及多功能化修饰的特性,NaGdF4:Yb,Er纳米颗粒通过主动靶向的方式能够成功实现皮下小于2mm的肿瘤探测。比起皮下肿瘤模型,动物原位模型对于模拟人体肿瘤真实的微环境及较高的肿瘤转移率都有着很高的优越性。然而,由于建模过程复杂及目前纳米材料糟糕的生物学表现,在动物原位肿瘤模型中,开展的分子探针体内成像的研究并不多见。据最近的文献称,靶向uPAR的多肽荧光探针被报道用于原位胰腺癌的成像研究中,然而,肿瘤信号却受到周围组织严重的自发荧光干扰,很难分辨。因此,无论是原位肿瘤模型的建立,还是开发适合体内成像的新型光学探针,目前都面临着诸多挑战。目的：通过胰腺癌原位动物模型开展双模态成像及病理学评估,探索uPAR靶向的磁共振/上转换发光肿瘤纳米探针在判定胰腺癌边界的成像应用,为下一步术中导航奠定基础。方法：通过外科手术建立裸鼠原位胰腺癌种植模型。为了在体监测肿瘤生长情况,稳定转染绿色荧光蛋白（GFP）及萤火虫荧光素酶（Luciferase）基因的SW1990细胞系（GFP-Luc-SW1990）被用于监测肿瘤的发展。我们将慢病毒载体（PRRL-EFla-GFPluc-WPRE）转染到SW1990细胞中。通过细胞流式仪分析细胞GFPluc表达情况。之后,将40uL含有5×106个GFP-Luc-SW1990细胞的悬液注入裸鼠胰腺后,通过生物自发光活体成像仪（bioluminescence imaging, BLI）验证肿瘤模型是否构建成功。在原位模型构建成功的基础上,通过对肿瘤感兴趣区的信号测量,筛选发光强度相近的裸鼠模型作为实验组和对照组。随后,通过鼠尾静脉注射3 mg/mL （15 mg Gd/Kg体重）靶向探针UCNP-ATF,分别于注射前、注射后第2、4、6小时行MRI成像及上转换发光成像。随后,通过MRI T1 Mapping序列对肿瘤区域的T1绝对值进行两个时间点比较,测算出探针MRI T1时间缩短。同样,在注射后第2、4、6小时,实验动物模型胰腺区域行上转换成像。实验结束后,荷瘤小鼠断颈处死,胰腺组织随即石蜡切片,行苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色。实验模型其余正常组织,经电感耦合等离子体发射光谱仪ICP检测,观察探针组织分布情况。结果：细胞流式结果显示GFP及Luciferace双报告基因转染SW1990细胞的效率高达99.99%。原位种植裸鼠肿瘤模型建立10天后,BLI成像显示建模成功率达90%。MRI成像研究显示,探针于肿瘤T1增强的峰值时间出现在注射后第4个小时,在第4个小时肿瘤区域T1信号下降达21%。上转换成像结果表明,上转换发光最大强度时间也出现在第4个小时,之后随时间持续下降。探针组织分布情况显示,大部分探针集中在正常肺脏部位,但摄取量非常低,还不及注射总量的10%,表现出很好的安全性。结论：基于上转换发光纳米颗粒的UCNP-ATF探针,在体内能够实现微小胰腺癌的检测,在分子及组织水平上明确肿瘤的边界,展现出了在早期胰腺癌诊断及术中导航的临床应用转化价值。
王华[6]（2012）在《定点突变β-环糊精葡萄糖基转移酶及其突变菌株发酵条件优化》文中指出β-环糊精葡萄糖基转移酶（p-CGTase）属于α-淀粉酶家族,可以作用于淀粉的葡萄糖基,从而发生环化、耦合、歧化、水解等反应,其中环化作用生成的β-环糊精（β-CD）具有非极性空穴和外亲水的特点,有稳定、增溶、缓释以及掩蔽异味的作用,作为分子胶囊和乳化剂在食品、医药、化妆品、农药、化学工业等领域具有广泛、重要的应用。β-环糊精葡萄糖基转移酶（β-CGTase）是催化淀粉发生环化反应生成β-CD的关键酶,近年来,由于酶活性的影响使得酶法生产β-CD的产率非常低,因此,借助基因工程技术手段对β-CGTase进行体外定点改造已成为目前研究的热点。本论文以实验室前期构建保藏的一株产β-CGTase的重组工程菌pUC-18::CGTase为基础,以高产酶为目标,对β-CGTase基因进行体外定点突变,并对突变菌株的发酵工艺优化以及突变酶酶学特性进行了系统的研究,为满足工业化发酵生产的需要,还进一步使用5L发酵罐放大试验,为酶法工业化生产β-CD提供理论基础和技术支撑。主要研究内容如下：1、以pUC-18::CGTase为基础,参照NCBI公布的β-环糊精葡萄糖基转移酶的晶体结构,对其进行生物信息学分析,对其基因序列中保守区域的四个氨基酸位点Y127,H167,R254和D355进行体外基因定点突变,同时通过设计引物在基因的5’端引入His6-Tag,得到4个突变体p-T::CGTaseY127F、p-T::CGTaseH167C、p-T::CGTaseR254F、p-T::CGTaseD355R,分别将4段带有His6·Tag突变基因整合到原核表达载体pUC-18中,构成重组表达载体pUY127F, pUH167C,pUR254F和pUD355R,并转化入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,鉴定筛选阳性克隆,得到的突变菌株分别命名为p-YF、p-HC、p-RF和p-DR。经SDS-PAGE及Western blotting检测表明四个突变菌株都可以表达分子量约为70KDa的带有His6·Tag的融合蛋白,与β-CGTase的理论分子量一致。采用蓝值法测定各突变菌株的酶活力,突变菌株p-YF、p-HC、p-RF和p-DR的β-CGTase活力分别为1224U/mg,1228U/mg,1147U/mg,976U/mg,较出发菌株pUC-18::CGTase的活力621U/mg均有显着提高。2、通过对突变酶反应的最适温度、最适pH、温度和pH稳定范围等基本酶学性质测定,发现突变酶与原酶性质基本一致。酶作用的最适温度60℃、最适pH6.0、且酶在60℃下保温1h,pH5.0～8.0范围内均非常稳定。通过对突变酶动力学参数分析,发现突变菌株p-HC、p-YF的突变酶Km值最小,达到0015mg/mL;而突变菌株p-RF、p-DR的突变酶Km值为0.017mg/mL,均低于出发菌株（0.019mg/mL）,说明突变没有影响到酶的催化反应特征,β-CGTase环化活力的提高是由于突变酶与底物玉米淀粉的亲和力的增强。3、通过单因素摇瓶试验,确定了突变菌株产β-CGTase的最佳碳源是玉米淀粉,产酶最佳氮源是蛋白胨和玉米浆组成的复合氮源,添加金属离子镁和磷酸盐可以显着地促进突变菌株产酶和细胞生长。发酵过程中的初始pH值,温度、接种量以及摇床转速都会直接或间接影响到菌体生长及产酶量。采用Box-Benhnken中心组合试验设计和响应面分析,对突变菌株产β-CGTase的发酵培养基及发酵条件进行多项式回归模型建立和最优化。通过回归模型可以得到培养基组成对突变菌株产(3-CGTase活力影响的大小为玉米淀粉（X1）>玉米浆+蛋白胨（X2）>MgSO4·7H2O （X3）>K2HPO4·3H2O （X4）;发酵条件对突变菌株产β-CGTase活力影响的大小为发酵温度（X2）>初始pH（X1）>转速（X4）>接种量（X3）。在此基础上确定了各突变菌株的最优的培养基组成及最优发酵条件。经优化,当突变菌株p-YF的发酵培养基为（%,W/V）：玉米淀粉1.1,玉米浆4.6,蛋白胨1.1,MgSO4·7H2O0.02, K2HPO4·3H2O0.12；在初始pH=8.7,发酵温度37℃,接种量5.3%,转速201r/min下进行摇瓶发酵培养,测得突变菌株p-YF酶活为4235U/mL,是初始酶活的1.99倍；当突变菌株p-HC的发酵培养基为（%,W/V）：玉米淀粉1.1,玉米浆4.4,蛋白胨1.1,MgSO4·7H2O0.02, K2HPO4·3H2O0.10；在初始pH=8.4,发酵温度37.4℃,接种量5.0%,转速202r/min下进行摇瓶发酵培养,测得酶活为4355U/mL,是初始酶活的1.93倍；当突变菌株p-RF的发酵培养基为（%,W/V）：玉米淀粉1.0,玉米浆4.3,蛋白胨1.1,MgSO4·7H2O0.02, K2HPO4·3H2O0.10;在初始pH=8.6,发酵温度37.3℃,接种量5.3%,转速202r/min下进行摇瓶发酵培养酶活为3935U/mL,是初始酶活的1.98倍；当突变菌株p-DR的发酵培养基为（%,W/V）：玉米淀粉1.2,玉米浆4.4,蛋白胨1.1,MgSO4·7H2O0.02, K2HPO4·3H2O0.1;在初始pH=8.4,发酵温度37.6℃,接种量5.0%,转速201r/min下进行摇瓶发酵培养,测得酶活为3640U/mL,是初始酶活的2.19倍。4、在5L发酵罐放大实验中研究了不同搅拌转速及不同相对溶氧条件、不同温度恒定pH下突变菌株YF发酵产β-CGTase活力的影响。研究结果表明,当以1.0mol/L的NaOH或0.2mol/LHCl流加调节发酵罐的pH使其保持在8.7不变条件下,搅拌速度提高至300r/min,溶氧控制在20%,温度控制在37℃时,同时以50g/L流加玉米淀粉,20g/L流加玉米浆,50g/L流加乳糖,此时菌体浓度及β-CGTase活力均有所提高,相对酶活2536U/mg,较出发菌株pUC-18::CGTase活力621U/mg提高了4.08倍。将发酵产β-CGTase作用于底物淀粉,采用HPLC-MS对β-CGTase其产物进行分析,从HPLC-MS图谱可看出,产物分子量为1134.4,与β-CD标准物质的分子量相符,说明β-CGTase对底物淀粉具有环化作用生成β-CD。
刘栋[7]（2010）在《畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究》文中研究说明在生产实践中,传统的疫苗（弱毒苗、灭活苗）对防治动物疫病发挥了重要作用,但近年来该类疫苗暴露出来的免疫效果不佳等缺陷,使研制更安全、高效、廉价的新型疫苗显得非常迫切和必要。基因疫苗主要由真核表达载体和保护性抗原基因构成,此种疫苗与传统疫苗相比,具有设计灵活、安全性高、性质稳定、成本低、同时诱导体液免疫和细胞免疫等优点。然而核酸疫苗存在的问题是产生抗体慢且水平低,需要加入有效的佐剂才能克服这些缺陷;核酸疫苗的佐剂需用分子佐剂,分子佐剂主要有干扰素分子佐剂、白细胞介素分子佐剂、胸腺肽分子佐剂及C3d分子佐剂等,其中C3d分子作为一种新型分子佐剂日益引起人们的关注。补体C3是机体补体激活的经典途径、替代途径以及甘露聚糖结合凝集素（MBL）途径的交汇点的中心成分,是宿主防御机能的一个分子。C3d片段是补体C3的裂解片段之一,是C3分子α链不能被蛋白酶再裂解并仍保持与抗原共价连接的最小片段,具有广泛的免疫学功能。其可以直接与抗原递呈细胞（APC）上的CR2受体结合,从而降低淋巴细胞的活化阈,提高抗原分子的免疫原性。因此,C3d被认为是一种具有研究、开发应用价值的核酸疫苗分子佐剂。鉴于上述研究背景,本研究在对不同动物补体C3d基因克隆及序列测定比较分析的基础上,探讨了补体C3d在不同畜禽间基因水平上的相关性和差异性;验证了鸡补体C3d原核表达重组蛋白（rChC3d）对大肠杆菌疫苗和新城疫灭活油乳苗的免疫增强作用;然后采用新城疫病毒F基因为试验材料、以鸡补体C3d的受体结合功能区P29作为分子佐剂,构建了C3d-P29.n（n=2、4、6）多聚体分子佐剂新城疫F基因疫苗,并经过检测证明了其具有较好的免疫保护效果。本研究成果为以后研制禽类的其他有效细菌及病毒性疫苗提供了理论基础和技术支撑。本研究主要内容如下:1、不同畜禽补体C3d基因的克隆及序列分析:从不同畜禽的肝细胞提取总RNA,通过RT-PCR扩增出C3d基因的cDNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定后直接克隆到pMD18-T载体,构建pMD18-T-C3d重组质粒,转化大肠杆菌,酶切鉴定后进行序列测定,然后进行C3d序列比较、CR2结合区同源性分析比较。结果表明,畜禽补体C3d基因同源性相差较大,进化树反映出C3d基因具有种的多样性,亲缘关系越近,进化关系也越近。对CR2结合区分析发现,禽类的该区为29个氨基酸,而哺乳动物的为28个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为40%,而哺乳动物之间的同源性高达80%,证明补体C3d及CR2结合区具有种属的特异性。另外,用生物学软件对补体C3d基因编码的氨基酸序列以及蛋白结构进行了分析、用ESyPred 3D同源建模等软件对补体C3d的三级结构进行了三维结构预测和分子特征分析,分析结果显示,C3d 3D模型是一种由核心和外层构成的桶状分子结构。本研究为进一步研究动物C3d分子佐剂基因疫苗奠定了基础。2、鸡补体C3d原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化:补体C3d是补体系统（Complement system,CS）中补体C3的最终裂解产物。为研究其免疫增强的生物学功能,利用RT-PCR技术从罗曼蛋鸡肝脏总RNA中扩增出C3d cDNA,经克隆测序证实所得基因为C3d。然后,将其连接至表达载体pET-32a（+）,转化E. coli BL21（DE3）,通过IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析结果表明,目的基因在大肠杆菌中以包涵体的形式进行了高效表达,Western-blotting证实目的蛋白为C3d。包涵体蛋白通过尿素溶解液洗涤并溶解后,经硫酸铵盐析、透析、浓缩和Sephadex G-200凝胶过滤层析,重组C3d蛋白得到纯化。最后,SDS-PAGE及Western-blotting检测验证该C3d表达蛋白得到很好的纯化,并且纯化后的表达蛋白仍具有良好的反应原性。本研究为进一步研究、利用鸡补体C3d蛋白提供了保证。3、鸡补体C3d重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究:从SDS-PAGE凝胶中分离纯化原核表达的重组C3d蛋白,用戊二醛将其与大肠杆菌抗原连接,免疫注射SPF鸡;对照组鸡免疫注射完全弗氏佐剂大肠杆菌疫苗。分别在免疫后的第2、3、4、5、6、7、8、9周采血,用ELISA方法测定血清中的抗体含量,同时测定血清中总补体活性。结果表明,免疫后3周,弗氏佐剂大肠杆菌疫苗诱导鸡体产生的抗体效价高于C3d佐剂疫苗组,但至第4周,弗氏佐剂疫苗组的抗体水平达到高峰（OD值=0.273±0.044）,然后迅速下降,到第9周降至0.200±0.055,而C3d疫苗组鸡免疫后的抗体水平持续上升,从免疫后第2周的0.099±0.030上升到第9周的0.275±0.020。证明原核表达的C3d能够促进免疫记忆细胞的产生,并能够使细菌抗原给予免疫细胞持续稳定的刺激,从而使鸡体维持高水平抗体的时间延长。研究结果为研制有效的家禽细菌性疫苗提供了理论依据。4、鸡补体C3d重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究:为进一步探讨重组鸡补体C3d蛋白的佐剂作用,本试验观察了原核表达纯化后的重组鸡补体C3d蛋白和新城疫灭活油乳苗共同免疫鸡群之后,重组鸡补体C3d蛋白对新城疫灭活油乳苗的免疫协同作用。将7日龄雏鸡分为三组进行免疫注射,作用结果显示联合免疫灭活油乳苗和重组鸡补体C3d蛋白的鸡群,在免疫后1～7周（即14～57日龄）整个观察期内,不但其胸腺T淋巴细胞对ConA、法氏囊B淋巴细胞对PMA的反应均明显强于单纯油乳苗免疫组（其中除在接种后第1周时两组鸡的B淋巴细胞增殖OD值差异不显着外,其余各检测时间两组间均表现为差异显着（P<0.05）或极显着（P<0.01）,特别是T淋巴细胞增殖情况在接种第2周后均表现为差异极显着（P<0.01））;而且联合免疫组的HI抗体效价水平也持续性高于单纯油乳苗免疫鸡群,并在免疫接种后5～7周时差异显着（P<0.05）。在免疫接种后第7周时进行的攻毒保护试验中,联合免疫组的保护率为100%,而单纯油乳苗免疫组鸡在观察期内则有3只发病,保护率为83.3%,且有1只死亡。总之,本试验所用重组鸡补体C3d蛋白和灭活油乳苗联合免疫可显着提高机体的体液免疫和细胞免疫水平,产生了较好的免疫协同作用,使机体对新城疫病毒的综合免疫保护能力得到进一步的增强,从而初步验证了重组C3d蛋白的免疫佐剂作用。5、新城疫病毒C3d-P29分子佐剂F基因疫苗的构建及其表达:C3d是补体C3的裂解产物之一,与抗原相连时可以明显提高抗原分子的免疫原性。CR2/CD21在其功能发挥过程中起到重要作用,P29为编码C3d与CR2结合区域的基因。在克隆出C3d cDNA基础上,设计引物克隆P29至pUC19载体,利用同裂酶BamH I和Bgl II构建pUC-P29.n。酶切获得P29.n,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+）。最后RT-PCR扩增新城疫F基因,定向克隆至真核表达载体pcDNA-P29.n中P29.n的上游,构建完成新城疫F基因疫苗,用IFA法检测pcDNA-F-C3d-P29.n可在CEF中大量表达。本研究为进一步研究补体C3d的分子佐剂效应以及开发和利用鸡C3d奠定了基础。6、鸡C3d-P29重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3含量的初步研究:为验证鸡补体C3d-P29分子佐剂作用,本试验比较研究了免疫注射含有鸡C3d-P29基因重组表达质粒之后的鸡血清中补体水平及其补体C3含量与含有异种动物（如小鼠）CR2结合区基因序列重组质粒或空白对照之间的差异,以探讨鸡补体C3d基因重组质粒能否特异性的增强鸡补体总活性与补体C3含量。根据构建的真核表达重组质粒不同分为五组对鸡进行免疫注射,具体为空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组;含有新城疫F基因的pcDNA3.1-F组;含有新城疫F基因以及鸡CR2结合区（P29）基因序列C3d-P29六聚体的pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组;含有新城疫F基因以及小鼠CR2结合区（P28）基因序列C3d-P28六聚体的pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组。分别采取各组经二免后成年鸡的新鲜血清,测定其补体总活性;利用生化合成的C3α链N端21肽,经免疫家兔后制备的抗鸡C3抗体,具有能够与鸡血清中的补体C3发生特异性反应的特性,用来测定注射过不同真核表达质粒后鸡血清中C3含量差异。结果表明,空白对照（PBS）组;pcDNA3.1空质粒组; pcDNA3.1-F组; pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组和pcDNA3.1-F-MC3d-P28.6组五个试验组鸡血清中的补体C3含量分别为0.34±0.005mg/mL、1.47±0.008mg/mL、1.70±0.005mg/mL、1.78±0.007mg/mL和4.18±0.008mg/mL。免疫鸡补体C3d（pcDNA3.1-F-ChC3d-P29.6组）的鸡血清中补体总活性和C3含量都远远高于其他组,差异极显着（P<0.01）;并且鸡C3d重组质粒能特异性增强鸡补体总活性与C3含量,差异极显着（P<0.01）。7、新城疫补体C3d分子佐剂疫苗免疫效果的研究:在克隆了鸡C3d cDNA和新城疫F48E9株F基因cDNA的基础上,构建编码CR2结合区P29基因的多聚体,以此多聚体为分子佐剂构建了新城疫F基因疫苗pcDNA3.1-F-C3d-P29.2、pcDNA3.1-F-C3d-P29.4、pcDNA3.1-F-C3d-P29.6及pcDNA3.1-F,通过了实验室安全检验和效力检验。将含有不同个数P29基因的多聚体作为分子佐剂的新城疫F基因疫苗、新城疫油乳剂灭活苗以及质粒载体作为对照分别免疫SPF鸡,利用MTT法、血凝抑制法（HI）和ELISA等分别检测不同疫苗免疫后的细胞免疫和体液免疫水平,并在免疫后第五周进行了攻毒试验。最后,还进行了重组鸡补体C3d质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d蛋白（rChC3d）对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验。结果表明,以补体C3d-P29为分子佐剂的新城疫F基因重组疫苗安全性好;虽然免疫后抗体水平和保护率不如新城疫油乳剂灭活苗,但是能够抵抗致死量病毒的攻击,具有较好的保护作用,其中以pcDNA3.1-F-C3d-P29.6效果更好;MTT法测定T淋巴细胞转化结果表明,补体C3d-P29.6佐剂能显着促进淋巴细胞转化,多数时间点与油佐剂的效果相当,部分时间点显着强于油佐剂。MTT法检测pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果显示pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6免疫组峰值较rChC3d协同免疫组出现时间稍晚,但随后质粒免疫组可维持在更高的水平值。这表明pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6在体内持续的时间更长。本研究中C3d分子佐剂疫苗免疫效果的验证,为进一步开发和利用鸡C3d奠定了基础。
刘大斌[8]（2010）在《抗-αvβ3scFv-sTF双功能融合蛋白的可溶性表达及其特性研究》文中认为肿瘤血管靶向治疗的策略由来已久,它通过抑制肿瘤的新生血管生成来阻断肿瘤组织养分的供给,达到抑制肿瘤的生长的目的。这种治疗方案具有毒副作用小、不会产生抗药性、广谱性等优点。整合素家族是一类细胞粘附分子,整合素αvβ3在肿瘤血管发生和肿瘤的迁移中发挥重要的作用。整合素的单克隆抗体可以通过竞争性占据受体和配体结合的部位,阻碍整合素和配体的结合,抑制整合素发挥促肿瘤血管生成和肿瘤扩散的作用。组织因子是体内活性最强的凝血因子之一,其胞外区又称为可溶性组织因子（sTF）,是凝血活性的关键部位,可溶性组织因子可以引起肿瘤组织内的凝血反应,造成血栓,造成肿瘤的坏死。本研究利用本室“十五”863课题的研究成果——抗-αvβ3人源化抗体,研究其单链抗体（scFv）结合肿瘤血管的能力,同时将抗-αvβ3与可溶性组织因子基因融合,并在大肠杆菌中以可溶性形式表达,制备双功能的融合分子（既能阻断αvβ3的促血管生成活性,又能诱导肿瘤血管内凝血）,为后续可能的动物实验和最终开发出具有自主知识产权的抗肿瘤血管生成药物打下基础。首先,利用网站http://mail.ncifcrf.go v/dnaworks/进行在线引物设计,输入可溶性组织因子（sTF）氨基酸序列,选择大肠杆菌偏好的密码子,设置引物的长度为40mer,选择所需的引物复性温度为64°C,设计了34条重叠引物。采用组装PCR的方法人工合成sTF基因。PCR产物纯化回收后克隆到pMD18载体上进行测序,采用DREAM技术纠正突变,最终获得了同设计的目标序列完全一致的克隆。同时,采用融合PCR技术,根据已经测序的人整合素αvβ3的人源化Fab抗体B12克隆的序列,通过计算机软件设计了3对特异性引物分别扩增抗体的轻链和重链基因。扩增的PCR产物纯化和回收后克隆到pMD18载体上进行测序。序列分析表明,融合PCR技术扩增的抗人αvβ3的人源化scFv抗体产物与设计的目标基因序列完全一致。采用酶切连接的方法,分别将上述scfv和sTF基因克隆到pUC18载体中,构建质粒pUC18-scfv-sTF。以pUC18-scfv-sTF为模板,设计了2条引物,通过PCR的方法扩增scfv-sTF。PCR产物测序正确后克隆到pQE80L载体,经转化和酶切鉴定后获得scfv-sTF融合表达质粒pQE80L-scfv-sTF。同时设计了互补的两条引物,混合变性后退火获得两侧带有粘性末端的双链寡DNA接头,通过酶切方式以该DNA接头替换pQE80L-scfv-sTF中的sTF序列获得了抗-αvβ3 scfv单独表达的质粒pQE80L-scfv。将表达质粒pQE80L-scfv-sTF和pQE80L-scfv分别转化M15感受态,挑取单菌落于新鲜氨苄LB培养基中培养,37°C培养至对数生长期,加入终浓度为0.1mmol/L的IPTG继续37°C培养6h后收集菌体,超声裂解菌体后,SDS-PAGE分析上清和沉淀。结果表明重组蛋白主要以包涵体形式表达,但是仍有少量可溶性蛋白表达。通过逐步减低诱导温度和IPTG浓度来提高可溶性蛋白的表达量,在培养温度为26°C、IPTG终浓度为0.04mmol/L的条件下获得了较高的可溶性蛋白表达。由于重组蛋白带有6His标签,因此采用镍柱回收的方式回收目的蛋白。按照镍柱纯化的说明书操作,超声后的上清经过0.45um微孔滤膜过滤后上样过柱,然后用15倍体积的结合缓冲液（20mM Tris-HCl PH8.0, 10mM咪唑, 0.5M NaCl）洗柱并收集过柱液;最后用洗脱缓冲液（20mM Tris-HCl PH8.0, 300mM咪唑,0.5M NaCl）过柱并收集洗脱液。SDS-PAGE分析回收的结果。采用超滤的方式将重组蛋白的缓冲液置换为PBS缓冲液,最后用Bradford蛋白定量试剂盒测量回收的目的蛋白浓度。采用酶联免疫吸附法（ELISA）和Western blotting的方法来验证重组蛋白和人整合素αvβ3抗原的结合能力。人整合素αvβ3抗原包被ELISA板,4°C过夜后用10%脱脂奶粉封闭。梯度稀释的重组蛋白scfv-stf和scfv作为待检一抗,人整合素αvβ3单克隆抗体为阳性对照,同样带有6His标签的HCV NS3C蛋白作为阴性对照。分别加入辣根过氧化氢酶标记标记的anti-His单克隆抗体和辣根过氧化氢酶标记的羊抗鼠IgG后DAB显色,最后在酶联仪上读取450nm吸光值。结果显示重组蛋白scfv-stf和scfv可以和人整合素αvβ3抗原特异性结合。人整合素αvβ3抗原上样10%蛋白胶,SDS-PAGE电泳分离后4℃条件下100mA恒流转膜至PVDF膜上。10%脱脂奶粉37°C封闭2h,然后TBST洗膜液（20mM Tris-HCl PH8.0, 150mM NaCl, 0.05% Tween 20）洗膜4次。加入重组蛋白scfv和scfv-stf（1:5稀释）,阳性抗体标准品（1:1000稀释）,同时以带HIS标签的HCV NS3C蛋白作为阴性对照（1:5稀释）。TBST洗膜后加入分别加入辣根过氧化氢酶标记标记的anti-His单克隆抗体和辣根过氧化氢酶标记的羊抗鼠IgG 37°C反应2h;TBST洗膜后采用ECL发光液发光显影至X光片。结果显示重组蛋白可以和人整合素αvβ3抗原特异性结合。采用Far-western blotting技术分析人整合素αvβ3抗原和重组蛋白的结合能力。28℃条件下诱导重组蛋白表达,收集的菌体经超声破碎后,取上清上样进行SDS-PAGE电泳。4℃条件下100mA恒流转膜将蛋白转移至PVDF膜上,采取膜上复性的方法将PVDF膜放置复性液中4℃过夜。TBST洗膜液洗膜后10%脱脂奶粉37°C封闭2h,然后依次加入一抗（人整合素αvβ3抗原）、二抗（抗人整合素αvβ3单克隆抗体）和辣根过氧化氢酶标记的羊抗鼠IgG。TBST洗膜后采用ECL发光液发光显影至X光片。结果显示重组蛋白可以和人整合素αvβ3抗原特异性结合,同时也证实重组蛋白可以以可溶性形式表达。采用细胞免疫组化方法来验证重组蛋白和人整合素αvβ3抗原特异性结合。在盖玻片上培养人乳腺癌细胞系435s做成细胞涂片,室温条件下以丙酮固定细胞。PBS缓冲液复苏和洗涤后,10%脱脂奶粉37°C封闭1h,以重组蛋白和人整合素αvβ3单克隆抗体作为一抗4℃条件下过夜。PBS洗涤后加入二抗和显色液并在荧光显微镜下观察结果。结果显示重组蛋白和人整合素αvβ3抗原特异性结合。在钙和磷脂存在的条件下,TF具有引起血浆凝固的功能,因此采用蛋白磷脂化的方法来验证scfv-sTF蛋白是否具有凝血活性。scfv-stf蛋白经磷脂化后,加入参比血浆和氯化钙溶液,观察并记录凝血时间。结果显示磷脂化后的蛋白较未磷脂化的蛋白和阴性对照凝血时间明显降低,表明重组scFv-sTF具有良好的凝血活性。通过上述实验,我们成功地在原核细胞中高效表达了可溶性抗人αvβ3人源化单链抗体及其与人凝血因子的融合蛋白,并且以多种免疫学实验证明这些可溶性蛋白具有和人整合素抗原特异性结合的能力;利用体外凝血模型证明抗-αvβ3 scFv-sTF融合蛋白同时还具有凝血功能,这些研究为下一步动物模型研究打下了基础。
陈斌[9]（2008）在《鸭α干扰素原（真）核表达及其生物学活性研究》文中研究说明本文对四川省内地方品种四川麻鸭的干扰素进行如下系列研究:对四川麻鸭Ⅰ型干扰素基因IFN-αORF进行克隆、鉴定和序列分析;构建IFN-αORF基因原核表达载体和真核表达载体;IFN-α原核表达及其生物学活性研究;利用雏鸭为模型,应用免疫组织化学方法研究pcDNA-SDIFN-α真核表达质粒在鸭体内的动态表达分布规律;同时对作为免疫佐剂的pcDNA-SDIFN-α真核表达质粒免疫调节活性进行研究,获得以下结果:1.四川麻鸭IFN-αORF基因克隆、序列比对分析和蛋白结构预测应用Oligo6.0软件设计了两对加入EcoRI和BamHI两个酶切位点的特异性引物对,采用PCR和nest-PCR的方法,从鸭肝脏组织基因组DNA扩增得到大小两个完全包含麻鸭α干扰素ORF基因的DNA片段。其中小片段更适合用于表达,并将其进行pGEM-T载体克隆与测序,对测序结果采用ClustalX软件进行序列分析以及与北京鸭、鸡、鹅等NCBI上序列进行了比较。结果显示四川麻鸭与北京鸭ORF基因序列十分相似,其核苷酸同源性达到99.13%,氨基酸同源性为98.96%。与鸡的核苷酸及氨基酸同源性分别为71.8%、49.97-50.47%,与鹅的核苷酸同源性为96%。同时用BioEdit、NetNGlyc、TreeView软件对该基因所推测的蛋白进行了分析,结果表明四川麻鸭有2个潜在糖基化位点,1个蛋白激酶C磷酸化位点（Protein kinase C phosphorylation）和1个酪蛋白激酶Ⅲ磷酸化位点（Casein kinaseⅢphosphorylation site）,信号肽切割位点28-29位ANA和FS氨基酸之间,成熟的鸭α干扰素有5个疏水区,无跨膜区。2.SDIFN-αORF基因原核表达载体pBV220-SDIFN-α的构建及表达产物的抗病毒活性采用BamHI和EcoRI酶切,通过定向粘末段连接法,构建了原核表达载体pBV220-SDIFN-α质粒。并将质粒转化到原核表达菌株DH5α中进行表达,采用温度诱导的方式,对诱导后的菌液进行SDS-PAGE检测。结果显示工程菌进行了表达,产生的包涵体蛋白分子量为40KD左右。对纯化后的包涵体采用稀释复性的方法复性,采用VSV/DEF系统初步检测抗病毒活性,干扰素的抗病毒活性约为150U/ml,比活力为440U/mg。应用FQ-PCR检测方法,动态监测体内抑制DHBV和体外抑制DPV病毒核酸。结果发现,表达的干扰素具有强烈的病毒复制抑制作用,具有明显的生物学活性。3.SDIFN-αORF基因真核表达载体pcDNA-SDIFN-α的构建及鉴定利用合成在引物两端的EcoRI、BamHI酶切位点,将目的基因成功地从pGEM-T载体克隆重组体中切下,并通过粘端连接的方法,连接到pUC18定向位置上,然后用EcoRI和XbaI双酶切真核表达载体pcDNA3.1（+）和pUC18-SDIFN-α,实现了SDIFN-α定向克隆到pcDNA3.1（+）载体上。四川麻鸭IFN-α真核表达重组质粒pcDNA-SDIFN-α经BamHI、EcoRI和XbaI三种酶切验证,并测序证明四川麻鸭IFN-α的真核表达质粒pcDNA-SDIFN-α构建正确。4.免疫组织化学检测真核表达质粒pcDNA-SDIFN-α在鸭体内表达方法的建立及动态表达规律的研究以pcDNA-SDIFN-α真核质粒免疫鸭,分时间段采集鸭16种不同组织,建立了免疫组织化学检测方法,并应用该方法检测干扰素在体内的动态表达规律。pcDNA-SDIFN-α免疫鸭后,持续表达时间长达9周。能在肺脏细胞、心肌细胞、肝细胞、脾细胞、肠腺和肠绒毛细胞、肌肉细胞、皮肤内检测到表达产物,在14d-35d进行了高峰表达。胸腺、胰腺、法氏囊和哈德氏腺未检测到阳性黄色颗粒,肺脏、免疫部位最早出现阳性颗粒,脑组织细胞中阳性颗粒数量随时间变化较小。其中基因枪免疫鸭后,各组织中的含量和表达量呈现的总体规律为6μg组＞3μg组＞1μg组。肌肉注射免疫鸭后,各组织中的含量和表达量呈现的总体规律为200μg组＞100μg组＞50μg组,都具有一定的剂量相关性。基因枪轰击法较肌肉注射法IFN-α基因表达出现的时间早,3h就可以检测到表达产物。同时,相对于肌肉注射法免疫,基因枪轰击法所用的表达质粒用量更少。5.真核表达质粒pcDNA-SDIFN-α在鸭体内免疫调节剂活性的初步研究以pcDNA-SDIFN-α真核表达质粒为免疫调节剂,研究对DPV/DVH弱毒苗免疫活性调节作用。分不同时间段采血,采用MTT法测定鸭外周血T淋巴细胞转化效果、CD3+T淋巴细胞数量变化和特异性DPV中和抗体IgG水平。结果表明,一定剂量的pcDNA-SDIFN-α真核表达质粒作为免疫调节剂在一定时间内能促进和提高细胞免疫和体液免疫应答,发挥着有效的正向免疫调节作用。
赵海生[10]（2007）在《LEDGFp52对大鼠视网膜神经节细胞作用研究》文中进行了进一步梳理【背景】提高损伤后视网膜神经节细胞（RGCs）存活和再生能力的研究是眼科和神经生物学科共同关注的热点和焦点。具有神经保护性效能的神经营养因子是实现视觉系统中枢神经修复基因治疗和移植的前提和物质基础。然而,既往的研究多集中在某种生长和营养因子的单一研究,迄今为止,还未能找到一种因子能对RGC提供持续的营养支持作用足以克服其周围的再生抑制环境而促进损伤的轴突再生。如果能寻找到某种在转录水平或转录前作用的因子,则该因子有可能启动RGC生长的极链式反应,轴突再生的难题也就迎刃而解了。晶状体来源的上皮生长因子（lens epithelium derived growth factor, LEDGF）是2000年新发现的一种新的生长、粘附、分化、抗凋亡和存活因子,它能提高多数细胞生长粘附能力、促进其分化、延长其存活。LEDGF基因位于人类染色体9p21,该基因选择性的剪切而产生两种蛋白,即LEDGFp75和LEDGFp52蛋白。相比LEDGFp52而言,LEDGFp75只是一个弱的转录辅活化子。最近的研究表明LEDGFp75能促进多种细胞的生长与存活,譬如对晶状体上皮细胞、视网膜光感受器细胞、视网膜色素上皮细胞所发挥的生长刺激和促进存活效应。进一步的研究发现LEDGF在脑内的发育及区域表达,提示其参与神经上皮干细胞分化及神经发生。因此,有专家提议将LEDGF作为视网膜疾病的治疗性蛋白和神经营养因子转染的候选分子。基于LEDGFp75具有一定的眼部保护作用的研究前提、联系LEDGFp52可能比LEDGp75生物学作用更强的生物信息学预测、结合国际上对LEDGFp52这一转录活化子研究很少的事实和视神经再生研究中积极寻找具有神经保护和生长促进效能神经营养因子的要求,我们选择LEDGFp52作为研究的目标。那么,LEDGFp52作为一个新发现的因子,它是否能对RGC起到神经保护和生长促进作用呢?它对RGC神经元生长相关基因和蛋白又有什么影响呢?这有待于我们通过实验研究来明确。【目的】在原代大鼠RGCs培养的基础上进行LEDGFp52基因和蛋白两个水平正负双向调控实验,观察它们对大鼠RGCs突起数目及轴突长度、RGC神经元特异性相关基因和蛋白的调控,全面了解LEDGFp52基因和蛋白对大鼠RGCs生长的影响,为研发更有效的RGC生长和营养因子奠定基础,为探索视神经损伤修复的新途径提供实验依据。【方法】NEUROBASALTM Media无血清体系培养RGCs,采用RT-PCR和细胞免疫荧光化学检测LEDGFp52基因和蛋白在RGCs表达;构建rhLEDGFp52基因原核表达载体、诱导表达及纯化蛋白;细菌内同源重组法构建LEDGFp52基因腺病毒载体、体外表达及制备病毒;构建siRNA-LEDGFp52真核表达载体、鉴定该载体并检测其对LEDGFp52蛋白的抑制率。1、LEDGFp52基因和蛋白对大鼠RGCs的突起数目及轴突长度调控作用的观察:分为实验组和对照组,实验组在大鼠RGCs培养36h后分别将LEDGFp52（2×10-4g/L）和Ab-LEDGF（2.5×10-4g/L）加入RGCs的无血清培养基中,在LipofectamineTM2000介导下将Ad-LEDGFp52（2.5×10-4g/L）（3×10-4pfu/L）和siRNA-LEDGFp52（6×10-4g/L）转染进RGC,分别在处理后12h、24h、36h、48h、72h和96h在相差显微镜下观察。设阳性对照组（CNTF10-4g/L）和空白对照组（不加处理因素）,观察时相点同上。对照组及实验组的每组观察孔数为12孔,重复3次。检测指标:RGCs轴突长度和单个细胞的突起数目。分析软件:IPP图像分析系统。2、LEDGFp52基因和蛋白对RGC神经元生长相关基因和蛋白调控效应的研究:处理因素及分组同上。检测指标:主要采用RT-PCR和细胞免疫荧光化学检测技术进一步研究LEDGFp52对RGC神经元生长相关的GAP-43、NF-L和MAP-2基因与蛋白的调控。分析软件:Quantity One程序半定量分析各个目的基因在mRNA水平的相对含量,以待测基因与相应内参照光密度比值计算相对系数;LSM510-Meta-Expert程序半定量分析各个目的蛋白的平均荧光强度相对数值。【结果】1、无血清的NEUROBASALTM Media培养基是一种较好的RGCs培养体系;LEDGFp52基因及其蛋白在RGCs均有表达。2、利用基因重组技术将rhLEDGFp52基因构建于原核表达载体pET30a（+）中,经酶切、测序鉴定证实构建完全正确,通过IPTG诱导其在大肠杆菌BL21（DE3）中获得可溶性形式表达,rhLEDGFp52蛋白表达量占菌体蛋白总量的34.63%。Western Blot结果显示rhLEDGF2蛋白能够特异性与LEDGF-ab结合。Ni-NTA His.Bind.Resin方法进行纯化后的rhLEDGFp52,终浓度达520μg.mL-1,分析其纯度达87.93%。3、成功将LEDGFp52基因片段亚克隆到腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上构建腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-LEDGFp52,并将腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-LEDGFp52与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共转染BJ5183细菌,经细菌内同源重组产生携带LEDGFp52基因重组腺病毒载体pAd-LEDGFp52,将pAd-LEDGFp52经脂质体法转化293细胞包装产生重组腺病毒Ad-LEDGFp52,滴度可达5×1012 pfu.L-1。将Ad-LEDGFp52体外转染293细胞,在该细胞中有效表达目的基因LEDGFp52,CPE法及Westernblot均证实了该目的基因表达。4、成功构建LEDGFp52基因RNA干扰（RNAi）的真核细胞表达载体,重组质粒转染HeLa细胞48小时,Westernblotting检测到LEDGFp52蛋白表达的改变,Quantity One程序半定量分析LEDGFp52蛋白明显下调了70%。5、LEDGFp52在基因水平和蛋白水平均可调控RGCs生长,表现为正向调节RGCs轴突显着增长,负向调节RGCs轴突显着缩短,而且正向调控时有高峰效应。6、LEDGFp52是RGC树突化因子,同时也是RGC轴突延伸因子。7、LEDGFp52在基因和蛋白两个水平对RGC神经元生长相关的基因/蛋白GAP-43、NF-L和MAP-2的表达均有显着的调控作用,表现为正向调节RGCs神经元生长相关基因/蛋白表达升高,负向调节RGCs神经元生长相关基因/蛋白表达降低。【结论】1.首次确立了LEDGFp52基因及其蛋白在RGCs的表达。2.利用基因重组技术成功获得rhLEDGFp52蛋白,终浓度达520μg.mL-1,纯度达87.93%;经细菌内同源重组成功制备LEDGFp52的重组腺病毒,滴度可达5×1012 pfu.L-1,并能够在真核细胞中获得高效稳定的表达;利用RNAi技术可成功构建抑制LEDGFp52表达的小干扰RNA重组体,该重组体使LEDGFp52蛋白明显下调70%。3. LEDGFp52基因和蛋白能显着调控大鼠RGCs单个细胞突起数目及轴突平均长度,其作用强于CNTF。4. LEDGFp52是RGC树突化因子,也是RGC轴突延伸因子。5. LEDGFp52基因和蛋白通过调控RGC神经元生长相关的基因/蛋白GAP-43、NF-L和MAP-2的表达促进RGC生长。6. LEDGFp52基因在调控RGC树突化时有其它树突化因子的参与。
二、肝细胞生长因子原核表达载体PUC18-HGF的构建及鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、肝细胞生长因子原核表达载体PUC18-HGF的构建及鉴定（论文提纲范文）
（1）刚地弓形虫IF-3与CSI基因部分生物学功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略语 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 弓形虫及弓形虫病 |
| 1 弓形虫 |
| 1.1 弓形虫简述 |
| 1.2 弓形虫生活史 |
| 1.3 宿主抗弓形虫免疫应答 |
| 1.4 弓形虫逃避机制 |
| 2 弓形虫病 |
| 2.1 人的弓形虫病 |
| 2.2 动物的弓形虫病 |
| 2.3 弓形虫病的诊断 |
| 2.4 弓形虫病的治疗 |
| 2.5 弓形虫病的预防 |
| 参考文献 |
| 第二章 原癌基因 |
| 1 原癌基因分类 |
| 1.1 生长因子类 |
| 1.2 生长因子受体类 |
| 1.3 酪氨酸蛋白激酶类 |
| 1.4 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类 |
| 1.5 G蛋白类 |
| 1.6 胞浆调节因子类 |
| 1.7 核转录因子蛋白类 |
| 2 抑癌基因 |
| 2.1 重要的抑癌基因 |
| 2.2 抑癌基因的抗癌机理 |
| 3 弓形虫相关原癌基因 |
| 参考文献 |
| 第三章 弓形虫热休克蛋白研究进展 |
| 1 热休克蛋白 |
| 1.1 热休克蛋白的分类 |
| 1.2 热休克蛋白的生物学功能 |
| 2 弓形虫热休克蛋白 |
| 参考文献 |
| 第二篇 试验研究 |
| 第四章 刚地弓形虫IF-3对虫体繁殖能力及毒力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 CRISPR载体的构建 |
| 2.2 同源重组质粒的构建 |
| 2.3 缺失株的筛选 |
| 2.4 生物信息学分析 |
| 2.5 IF-3的克隆表达 |
| 2.6 TgIF-3 western blot分析 |
| 2.7 IF-3的RNA干扰 |
| 2.8 粘附实验 |
| 2.9 侵入实验 |
| 2.10 噬斑实验 |
| 2.11 细胞内增殖实验 |
| 2.12 小鼠攻虫实验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 刚地弓形虫CSI对虫体繁殖能力及毒力的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 CSI缺失株的构建 |
| 2.2 粘附实验 |
| 2.3 侵入实验 |
| 2.4 噬斑实验 |
| 2.5 细胞内增殖实验 |
| 2.6 小鼠攻虫实验 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 刚地弓形虫热休克蛋白70对小鼠巨噬细胞功能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 生物信息学分析 |
| 2.2 HSP70的克隆表达 |
| 2.3 TgHSP70 western blot分析 |
| 2.4 TgHSP70对小鼠巨噬细胞功能的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第七章 刚地弓形虫热休克蛋白90对小鼠巨噬细胞功能的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 生物信息学分析 |
| 2.2 HSP90的克隆表达 |
| 2.3 TgHSP90 western blot分析 |
| 2.4 TgHSP90对小鼠巨噬细胞功能的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
（2）重组人胰岛素的原核表达与活性探究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 ProINS(7pep)-LE-Elp的原核表达与纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 实验结果和分析 |
| 2.1 pET-ProINS(7pep)-LE-Elp重组载体的构建 |
| 2.2 ProINS(7pep)-LE-Elp重组蛋白的诱导表达 |
| 2.3 不同诱导温度下ProINS(7pep)-LE-Elp重组蛋白的可溶性分析 |
| 2.4 诱导时间及IPTG浓度对ProINS(7pep)-LE-Elp重组蛋白表达量的影响 |
| 2.5 包涵体的变复性 |
| 2.6 ProINS(7pep)-LE-Elp重组蛋白的分离纯化 |
| 3 小结 |
| 第二章 ProINS(7pep)-LE-Elp重组蛋白的活性检测 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 糖尿病小鼠的构建 |
| 2.2 腹腔注射重组胰岛素蛋白的降糖效果 |
| 2.3 结肠注射重组胰岛素蛋白的降糖效果 |
| 2.4 ProINS(7pep)-LE-Elp重组蛋白激活P13K-Akt信号通路 |
| 2.5 mRNA表达水平的检测 |
| 3 小结 |
| 第三章 重组人胰岛素载体的优化与活性探究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 实验结果与分析 |
| 2.1 重组载体的构建 |
| 2.2 重组蛋白的诱导表达与可溶性分析 |
| 2.3 包涵体的变复性 |
| 2.4 重组蛋白的分离纯化 |
| 2.5 腹腔注射重组胰岛素蛋白的降糖效果 |
| 2.6 与ProINS(7pep)-LE-Elp融合蛋白的活性比较检测 |
| 3 小结 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 硕士研究生期间完成的论文 |
| 附录: 中英文缩略表 |
| 致谢 |
（3）PGRN与ECM1相互作用介导乳腺癌增殖及转移分子机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 第一章 引言 |
| 1 PGRN基因及研究现状 |
| 1.1 Pgrn基因定位、蛋白结构及其表达的组织分布 |
| 1.2 PGRN的生物学功能 |
| 2 ECM1基因及研究现状 |
| 2.1 Ecm1基因定位、蛋白结构及其表达的组织分布 |
| 2.2 ECM1的生物学功能 |
| 3 课题研究意义 |
| 4 课题技术路线 |
| 4.1 ECM1单克隆抗体的制备 |
| 4.2 用于检测ECM1的双夹心ELISA试剂盒建立 |
| 4.3 PGRN与ECM1蛋白相互作用验证及结合部位确定 |
| 4.4 PGRN与ECM1相互作用参与肿瘤增殖及转移的机制研究 |
| 4.5 PGRN通过与ECM1或EGFR相互作用调节肿瘤的增殖及转移之间的平衡 |
| 第二章 ECM1单克隆抗体的制备、鉴定及功能研究 |
| 1 实验材料和试剂配制 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 主要试剂配制 |
| 1.3 所用仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 人Ecm1全长基因的克隆 |
| 2.2 pGEMT/Ecm1 sp及pGEMT/Ecm1 no sp阳性克隆质粒的鉴定 |
| 2.3 Ecm1结构域的克隆 |
| 2.4 Ecm1、 Ecm1 N-terminal、 RepeatⅠ、Repeat Ⅱ及C-terminal原核表达载体构建 |
| 2.5 ECM1-6His原核蛋白的表达及纯化 |
| 2.6 ECM1 N-terminal、Repeat Ⅰ、Repeat Ⅱ及C-terminal原核蛋白表达 |
| 2.7 ECM1-Flag真核表达载体构建 |
| 2.8 ECM1单克隆抗体的制备 |
| 2.9 ECM1单克隆抗体腹水的纯化 |
| 2.10 SDS-PAGE及Western blot检测 |
| 2.11 辣根过氧化物酶标记ECM1单克隆抗体 |
| 2.12 竞争ELISA检测ECM1单克隆抗体 |
| 2.13 免疫沉淀技术检测ECM1单克隆抗体 |
| 2.14 免疫组织化学技术检测ECM1单克隆抗体 |
| 2.15 ECM1单克隆抗体生物学功能研究 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 Ecm1基因的克隆 |
| 3.2 ECM1-6His原核表达载体及ECM1-Flag真核表达载体的构建 |
| 3.3 ECM1 N-terminal、Repeat ⅠI、RepeatⅡ及C-terminal原核表达载体构建 |
| 3.4 ECM1-6His原核表达蛋白表达与纯化 |
| 3.5 ECM1 N-terminal、RepeatⅠ、Repeat Ⅱ及C-terminal原核蛋白表达 |
| 3.6 ECM1单克隆抗体重链亚型鉴定及抗体纯化 |
| 3.7 Western blot检测ECM1单克隆抗体 |
| 3.8 免疫荧光细胞染色鉴定ECM1单克隆抗体 |
| 3.9 单克隆抗体针对ECM1结构域的鉴定 |
| 3.10 免疫沉淀检测ECM1单克隆抗体 |
| 3.11 ECM1单克隆抗体检测肿瘤细胞及组织内源性ECM1的表达 |
| 3.12 ECM1单克隆抗体对细胞增殖、侵袭及迁移的影响 |
| 4 讨论 |
| 第三章 针对人ECM1双夹心ELISA试剂盒的建立 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 ECM1-6His真核蛋白的表达及纯化 |
| 2.2 Avidin-6His、 Luciferase-6His及Luciferase-(GGGGS)3-Avdin原核蛋白的表达与纯化 |
| 2.3 ECM1单克隆抗体效价检测 |
| 2.4 HRP或Biotin标记ECM1单克隆抗体 |
| 2.5 ECM1双夹心ELISA试剂盒的建立 |
| 2.6 Avidin与Luciferase蛋白交联 |
| 3. 结果 |
| 3.1 ECM1-6His真核蛋白的表达及纯化 |
| 3.2 ECM1单克隆抗体效价检测 |
| 3.3 ECM1双夹心ELISA试剂盒的建立 |
| 3.4 ECM1双夹心ELISA试剂盒的优化 |
| 4. 讨论 |
| 第四章 PGRN与ECM1蛋白相互作用验证及结合部位确定 |
| 1. 实验材料 |
| 1.1 质粒与细胞 |
| 1.2 主要试剂的配制 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 酵母双杂交筛选与PGRN相互作用的分子 |
| 2.2 酵母表达载体pGADT7/Ecm1 no sp、pGADT7/Ecm1 N-terminal、pGADT7/Ecm1 Repeat Ⅰ、pGADT7/Ecm1 Repeat Ⅱ及pGADT7/Ecm1 C-terminal的构建 |
| 2.3 PGRN与ECM1在酵母细胞内的相互作用及结合结构域研究 |
| 2.4 PGRN和ECM1蛋白在体外的相互作用研究 |
| 2.5 PGRN和ECM1在哺乳动物细胞内的相互作用研究 |
| 2.6 肿瘤病人血清ECM1表达水平研究 |
| 2.7 不同肿瘤细胞系中PGRN与ECM1表达水平研究 |
| 2.8 PGRN和ECM1在肿瘤组织中共定位研究 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 酵母双杂交验证ECM1与PGRN的相互作用 |
| 3.2 PGRN与ECM1相互作用的结合位点研究 |
| 3.3 PGRN和ECM1蛋白在体外的相互作用研究 |
| 3.4 PGRN与ECM1在哺乳动物细胞内的相互作用研究 |
| 3.5 肿瘤病人血清ECM1表达水平研究 |
| 3.6 不同肿瘤细胞系中PGRN与ECM1表达水平研究 |
| 3.7 PGRN和ECM1在乳腺癌组织切片中共定位研究 |
| 4. 讨论 |
| 第五章 PGRN与ECM1相互作用参与乳腺癌转移的机制研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 Ecm1与Pgrn基因敲除sgRNA引物设计 |
| 2.2 Ecm1基因敲除细胞系建立 |
| 2.3 Pgrn基因敲除细胞系建立 |
| 2.4 Real time PCR检测基因敲除细胞系中ECM1与PGRN的mRNA表达水平 |
| 2.5 Western blot检测基因敲除细胞系中ECM1与PGRN的蛋白表达水平 |
| 2.6 MDA-MB-231 WT、ECM1~(-/-)和PGRN~(-/-)细胞增殖、侵袭与迁移能力体外研究 |
| 2.7 ECM1与PGRN相互作用参与乳腺癌转移过程中所涉及的信号通路研究 |
| 2.8 ECM1与PGRN相互作用在MDA-MB-231细胞增殖与转移过程的体内功能研究 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 MDA-MB-231 ECM1~(-/-)细胞系的建立及鉴定 |
| 3.2 MDA-MB-231 PGRN~(-/-)细胞系的建立及鉴定 |
| 3.3 ECM1与PGRN对MDA-MB-231细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响 |
| 3.4 ECM1与PGRN相互作用对乳腺癌转移过程中所涉及的信号通路的影响 |
| 3.5 ECM1与PGRN相互作用在MDA-MB-231细胞增殖与转移过程的体内功能研究 |
| 4. 讨论 |
| 第六章 PGRN通过与ECM1或EGFR相互作用调节乳腺癌增殖及转移之间的平衡 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 Egfr extracellular domain表达载体构建 |
| 2.2 EGFR、PGRN与ECM1间相互作用关系研究 |
| 2.3 免疫共沉淀研究EGFR与PGRN相互作用关系 |
| 2.4 固相竞争试验研究EGFR、PGRN与ECM1间相互作用关系 |
| 2.5 MDA-MB-231 EGFR KD细胞系建立 |
| 2.6 MDA-MB-231 EGFR KD细胞增殖能力研究 |
| 2.7 MDA-MB-231 EGFR KD细胞侵袭与迁移能力体外研究 |
| 2.8 EGFR与PGRN参与乳腺癌转移相关信号通路的研究 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 EGFR、PGRN及ECM1三种分子间相互作用的研究 |
| 3.2 EGFR、PGRN与ECM1间相互作用关系研究 |
| 3.3 MDA-MB-231 EGFR KD细胞增殖研究 |
| 3.4 MDA-MB-231 EGFR KD细胞的侵袭与迁移功能研究 |
| 3.5 EGFR对乳腺癌侵袭与迁移相关信号通路的研究 |
| 4. 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间科研成果 |
（4）KGH-R1-ScFv单链抗体与p21Ras蛋白免疫反应性研究（论文提纲范文）
| 摘要 Abstract 第一章 前言 |
| 1.1 癌症发生率及死亡率 |
| 1.2 ras基因与癌症 |
| 1.3 以ras为靶点治疗肿瘤 |
| 1.4 课题前期工作 |
| 1.5 本课题研究意义 第二章 实验材料 |
| 2.1 实验菌株、质粒及细胞株 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 主要试剂及耗材 |
| 技术路线 第三章 实验方法 |
| 3.1 重组质粒构建 |
| 3.1.1 全基因合成突变ras基因序列及KGH-R1-ScFv基因序列 |
| 3.1.2 细菌培养及质粒提取 |
| 3.1.3 BamH Ⅰ与Hind Ⅲ双酶切获得目的片段与载体 |
| 3.1.4 T4 DNA Ligase连接目的片段与载体并转化大肠杆菌感受态 |
| 3.1.5 菌落PCR和双酶切鉴定 |
| 3.2 重组蛋白的获取 |
| 3.2.1 菌液过夜扩增培养并提取菌液内重组质粒 |
| 3.2.2 重组质粒转化到BL21大肠杆菌感受态内 |
| 3.2.3 诱导BL21大肠杆菌感受态表达重组蛋白 |
| 3.2.4 重组蛋白纯化及复性 |
| 3.2.5 SDS-PAGE鉴定重组蛋白 |
| 3.3 酶联免疫吸附法检测单链抗体与p21Ras蛋白免疫反应性 |
| 3.4 肿瘤细胞培养及细胞爬片制作 |
| 3.5 细胞免疫荧光实验 |
| 3.6 蛋白印迹实验 第四章 结果 |
| 4.1 菌落PCR及双酶切鉴定 |
| 4.2 蛋白纯化及复性结果 |
| 4.3 SDS-PAGE电泳 |
| 4.4 酶联免疫法(ELISA)结果 |
| 4.5 细胞免疫荧光实验 |
| 4.6 Westen Blotting结果 第五章 讨论 |
| 5.1 原核中表达重组蛋白 |
| 5.2 KGH-R1-ScFv单链抗体与p21Ras蛋白的免疫反应谱 |
| 5.3 本课题的不足 第六章 结论 第七章 展望 致谢 参考文献 附录A 攻读学位期间发表论文目录 |
（5）靶向uPAR的胰腺癌双模态分子探针构建及体内MR/光学成像研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第一部分：靶向uPAR的胰腺癌双模态分子探针的构建 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、本章小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分：靶向uPAR的胰腺癌双模态分子探针体内MR/光学成像研究 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、本章小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（6）定点突变β-环糊精葡萄糖基转移酶及其突变菌株发酵条件优化（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号与缩略语说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 环糊精的介绍 |
| 1.1 环糊精的结构 |
| 1.2 环糊精的性质 |
| 1.3 环糊精的应用 |
| 1.4 环糊精的生产 |
| 2 酶的体外进化及定点突变技术 |
| 2.1 酶的体外进化理论依据 |
| 2.2 定点突变 |
| 3 环糊精葡萄糖基转移酶研究进展 |
| 3.1 环糊精葡萄糖基转移酶简介 |
| 3.2 环糊精葡萄糖基转移酶的来源 |
| 3.3 环糊精葡萄糖基转移酶的结构特征 |
| 3.4 环糊精葡萄糖基转移酶酶学性质 |
| 3.5 环糊精葡萄糖基转移酶的发酵生产方式 |
| 3.6 环糊精葡萄糖基转移酶体外定点突变研究进展 |
| 4 本论文主要研究内容 |
| 第二章 β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-CGTase)基因的定点突变 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 酶与试剂 |
| 2.3 质粒与菌株 |
| 2.4 培养基及抗生素 |
| 2.5 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 突变基因的获得 |
| 3.2 重组质粒的双酶切鉴定 |
| 3.3 重组质粒的PCR鉴定 |
| 3.4 突变体测序结果分析 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三章 β-环糊精葡萄糖基转移酶(β-CGTase)突变基因的表达及其酶学性质分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 酶与试剂 |
| 2.3 质粒与菌株 |
| 2.4 培养基及抗生素 |
| 2.5 溶液配制 |
| 2.6 方法 |
| 3 结果与讨论 |
| 3.1 β-CGTase重组突变表达载体的构建 |
| 3.2 突变基因测序分析结果 |
| 3.3 突变蛋白的诱导表达及Western blotting鉴定 |
| 3.4 突变酶的酶活分析 |
| 3.5 突变酶的性质 |
| 3.6 β-环糊精葡萄糖基转移酶及突变酶的动力学参数 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第四章 产β-CGTase重组大肠杆菌发酵工艺优化 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 主要仪器 |
| 2.2 主要试剂 |
| 2.3 菌株 |
| 2.4 培养基及抗生素 |
| 2.5 溶液配制 |
| 2.6 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 不同碳源对β-CGTase活力的影响 |
| 3.2 不同氮源对β-CGTase活力的影响 |
| 3.3 不同金属离子对β-CGTase活力的影响 |
| 3.4 不同磷酸盐对β-CGTase活力的影响 |
| 3.5 初始pH值的确定 |
| 3.6 最适发酵温度的确定 |
| 3.7 最适接种量的确定 |
| 3.8 最适摇床转速的确定 |
| 3.9 响应面法优化突变菌株发酵工艺参数 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第五章 5.0L自动发酵罐扩大培养的初步研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 溶氧对β-CGTase发酵过程的影响 |
| 3.2 温度对β-CGTase发酵过程的影响 |
| 3.4 HPLC-MS检测结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 附件 |
（7）畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 DNA 疫苗及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 综述一 DNA 疫苗的研究进展及其免疫应答增强策略 |
| （一） DNA 疫苗的研究进展 |
| 1、核酸疫苗的研究历史 |
| 2、核酸疫苗的组成和分类 |
| 2.1 核酸疫苗的组成 |
| 2.2 核酸疫苗的分类 |
| 3、DNA 疫苗的免疫机制 |
| 4、核酸疫苗的优点及其不足 |
| 4.1 核酸疫苗的优点 |
| 4.2 核酸疫苗的不足 |
| 5、影响DNA 免疫效果的主要因素 |
| 5.1 目的基因的选择 |
| 5.2 载体及启动子的选择 |
| 5.3 增强剂和佐剂的应用 |
| 5.4 接种途径和剂量 |
| 5.5 接种前动物组织的预处理 |
| （二） DNA 疫苗免疫应答增强策略 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 1.1 细胞因子基因佐剂 |
| 1.2 共刺激分子 |
| 1.3 补体佐剂 |
| 1.4 免疫刺激序列（immunostimulation sequence，ISS） |
| 1.5 霍乱毒素（choleratoxin，CT）和大肠杆菌不耐热肠毒素（heat-labile enterotoxin，LT） |
| 1.6 蛋白转换域（protein transduction domains，PTD） |
| 1.7 模拟或增强MHC 作用 |
| 1.8 提高APC 存活时间和捕捉处理抗原的能力 |
| 1.9 提高抗原处理能力 |
| 1.10 双作用子的应用 |
| 2、通过基因修饰改变抗原特性以提高其免疫原性 |
| 3、载体的优化及选择 |
| 3.1 质粒载体 |
| 3.2 细菌载体 |
| 3.3 病毒载体 |
| 4、免疫方案的优化 |
| 4.1 免疫途径 |
| 4.2 免疫工具的选择 |
| 4.3 免疫程序及组合免疫 |
| 5、展望 |
| 综述二 补体系统概述及C3d 分子佐剂的研究进展 |
| （三） 补体系统概述 |
| 1、补体成分的分类 |
| 1.1 补体系统的固有成分 |
| 1.2 补体系统的调节因子 |
| 1.3 补体受体 |
| 1.4 补体活性片段 |
| 2、补体系统的激活 |
| 2.1 经典激活途径 |
| 2.2 替代途径 |
| 2.3 凝集素途径 |
| （四） CR2-C3d 的结构特征及生物学功能 |
| 1、分子特征 |
| 1.1 C3d 分子 |
| 1.2 CR2(CD21 分子) |
| 1.3 CR2-C3d 结合的结构特征 |
| 2、C3d-CR2 结合介导的生物学效应及作用机理 |
| 2.1 C3d-CR2 结合介导、增强B 细胞Ag 的内化、提呈 |
| 2.2 C3d-CR2 结合促进B 细胞活化及分化 |
| 2.3 C3d-CR2 结合促进记忆性B 细胞的产生 |
| （五） C3d 分子佐剂的研究进展 |
| 1、分子佐剂的应用 |
| 2、C3d 的分子结构 |
| 3、C3d 分子的佐剂作用 |
| 3.1 C3d 可提高抗流感病毒、抗麻疹病毒HA 抗体的水平 |
| 3.2 C3d 可以增强基因免疫效果 |
| 3.3 C3d 可促进抗HIV-1 衣壳蛋白抗体的生成 |
| 3.4 C3d-P28 可在提高体液免疫应答的同时增强基因免疫诱导的HBV 特异性细胞免疫应答 |
| 3.5 C3d 可增强PPS514 的免疫原性、促进Ig 类别转换 |
| 3.6 C3d 负调控HER-2/neu 基因免疫诱导的免疫应答 |
| 3.7 C3d 增强hCGβ的免疫原性、转变免疫应答 |
| 3.8 C3d 与靶抗原共表达的免疫抑制效应 |
| 4、C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 4.1 C3d 偶联抗原可增强CR~(2+)细胞（B 细胞，FDC 等）对抗原的摄取 |
| 4.2 C3d/C3dg 包裹的抗原被 BCR 特异性识别产生抗原刺激信号,同时又与 B 细胞表面的CR2 结合形成交联桥，提供共刺激活化信号，促进B 细胞活化，降低B细胞的活化阈 |
| 4.3 C3d 通过结合CR2、上调IL-4 和转录因子的表达、促进抗体亲合力成熟来增强基因免疫诱导的HBV 特异性免疫应答 |
| 4.4 分子佐剂C3d 上调Raji 细胞协同刺激分子B7-1 和B7-2 的表达 |
| 4.5 C3d 的佐剂作用依赖B 细胞CR2 受体，且相应的抗原必须与C3d 偶联在一起才能发挥作用 |
| （六） 本研究的目的及意义 |
| 第二部分 试验研究部分 |
| 一 不同畜禽补体C3d 基因的克隆及序列分析 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 载体 |
| 1.1.3 试剂及试剂盒 |
| 1.1.4 试验动物 |
| 1.1.5 主要仪器 |
| 1.1.6 试验所用溶液及其配制 |
| 1.1.7 RT-PCR 相关物品的处理 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 引物设计 |
| 1.2.3 RT- PCR 扩增C3d cDNA |
| 1.2.4 制作感受态细胞 |
| 1.2.5 PCR 产物与pMD18-T 的连接 |
| 1.2.6 连接物的转化 |
| 1.2.7 重组质粒的鉴定 |
| 1.2.8 测序 |
| 1.2.9 补体C3d 基因序列分析 |
| 1.2.10 补体C3d 基因蛋白质结构分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR 扩增C3d cDNA |
| 2.2 pMD18-T-C3d 的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 补体C3d cDNA 的测序及序列分析 |
| 2.3.1 测序结果递交GenBank |
| 2.3.2 利用DNASTAR 软件进行C3d 基因序列比较分析 |
| 2.3.3 DNAMAN 及Vector NTI 软件进行CR2 结合区氨基酸同源性比较 |
| 2.4 蛋白序列结构及功能特征预测 |
| 2.4.1 ProtParam tool 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行理化性质分析 |
| 2.4.2 ProtFun 2.2 程序对C3d 基因编码的蛋白质进行蛋白功能推测分析 |
| 2.4.3 补体C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测分析 |
| 2.4.4 补体C3d 基因编码的蛋白质三级结构预测分析 |
| 3 讨论 |
| 二 鸡补体C3d 原核表达载体的构建及其重组蛋白的纯化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 载体与受体菌 |
| 1.1.2 试验动物 |
| 1.1.3 试剂 |
| 1.1.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）试剂 |
| 1.1.5 包涵体纯化的有关试剂 |
| 1.1.6 免疫转印有关试剂和材料 |
| 1.1.7 仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 鸡肝脏总RNA 的提取 |
| 1.2.2 RT-PCR 及C3d cDNA 的克隆、测序 |
| 1.2.3 C3d 原核表达载体的构建 |
| 1.2.4 重组质粒的提取与初步筛选 |
| 1.2.5 pET-C3d 重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达 |
| 1.2.6 重组菌表达条件的优化 |
| 1.2.7 聚丙烯酰胺凝胶电泳 |
| 1.2.8 表达产物的Western-blotting 检测 |
| 1.2.9 重组表达蛋白的纯化 |
| 2 结果 |
| 2.1 C3d cDNA 的克隆及其PCR、酶切鉴定 |
| 2.2 pET-32a-C3d 表达载体的PCR 及酶切鉴定 |
| 2.3 重组蛋白的表达 |
| 2.4 IPTG 诱导表达最佳浓度的确定 |
| 2.5 IPTG 诱导表达最佳作用时间的确定 |
| 2.6 目的蛋白的表达量分析 |
| 2.7 Western-Blotting 结果 |
| 2.8 融合蛋白的纯化 |
| 2.8.1 硫酸铵盐析 |
| 2.8.2 Sephadex G-200 凝胶过滤层析 |
| 2.8.3 蛋白质纯度的鉴定 |
| 2.8.4 蛋白浓度的测定 |
| 3 讨论 |
| 3.1 重组C3d 原核表达系统的选择 |
| 3.2 重组C3d 目的蛋白的表达 |
| 3.3 重组C3d 目的蛋白的复性 |
| 3.4 重组C3d 目的蛋白的检测鉴定 |
| 3.5 重组C3d 目的蛋白的分离提纯 |
| 三 鸡补体C3d 重组蛋白对大肠杆菌疫苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 抗C3d 21 肽抗体 |
| 1.1.2 SPF 鸡血清及SPF 鸡 |
| 1.1.3 菌株 |
| 1.1.4 新西兰白兔 |
| 1.1.5 1%致敏绵羊红细胞 |
| 1.1.6 主要试剂 |
| 1.2 C3d 佐剂大肠杆菌疫苗的制备 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的分离纯化 |
| 1.2.2 大肠杆菌抗原的制备 |
| 1.2.3 C3d 与大肠杆菌抗原的连接 |
| 1.3 C3d 佐剂疫苗的作用效果试验 |
| 1.3.1 动物试验免疫方案 |
| 1.3.2 抗体效价的检测（间接ELISA 方法） |
| 1.3.3 总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 2 结果 |
| 2.1 不同佐剂疫苗的效果比较 |
| 2.2 疫苗注射对补体总活性的影响 |
| 3 讨论 |
| 四 鸡补体C3d 重组蛋白对新城疫病毒灭活油乳苗的免疫增强作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 新城疫油乳剂灭活苗 |
| 1.1.2 重组C3d 佐剂新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.3 血清和抗原 |
| 1.1.4 攻毒用新城疫病毒 |
| 1.1.5 实验用鸡 |
| 1.1.6 主要试剂及其配制 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组C3d 蛋白的纯化制备 |
| 1.2.2 试验动物分组免疫及样品采集 |
| 1.2.3 血清HI 抗体的检测 |
| 1.2.4 淋巴细胞增殖试验（MTT 法） |
| 1.2.5 攻毒保护试验 |
| 1.2.6 数据处理 |
| 2 结果 |
| 2.1 三组试验鸡在免疫接种后不同时期HI 抗体的检测结果 |
| 2.2 三组试验鸡在免疫接种后不同时期法氏囊B 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.3 三组试验鸡在免疫接种后不同时期胸腺T 淋巴细胞增殖情况 |
| 2.4 攻毒保护试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 C3d 分子佐剂与淋巴细胞增值试验（MTT 法） |
| 3.2 重组C3d 蛋白和灭活油乳苗的免疫协同作用 |
| 3.3 重组C3d 分子佐剂研究意义及现状 |
| 五 鸡补体C3d-p29 多聚体与新城疫 F 基因真核表达重组质粒的构建及其表达 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 试验材料及仪器设备 |
| 1.1.1 试验材料 |
| 1.1.2 主要仪器 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 P29 串联体的构建 |
| 1.2.2 pcDNA-P29.n(n=2，4，6)的构建 |
| 1.2.3 RT-PCR 扩增新城疫(F48E9 株)F 基因 |
| 1.2.4 插入抗原基因 |
| 1.2.5 重组真核表达质粒转染鸡胚成纤维细胞(CEF) |
| 2 结果 |
| 2.1 新城疫C3d-P29 分子佐剂F 基因疫苗的构建 |
| 2.2 构建P29 串联体 |
| 2.2.1 单拷贝P29 基因克隆 |
| 2.2.2 P29 串联体的构建 |
| 2.3 RT-PCR 扩增新城疫F48E9 株F 基因 |
| 2.4 抗原基因的插入 |
| 2.5 转染细胞中pcDNA-F-C3d-P29.n F 表达蛋白的检测结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 DNA 疫苗佐剂研究的意义 |
| 3.2 抗原基因的选择及C3d-P29 多聚体的构建 |
| 3.3 脂质体及影响其转染CEF 细胞的因素 |
| 六 鸡C3d-P29 重组质粒特异性增强鸡补体总活性与C3 含量的初步研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 主要仪器设备 |
| 1.1.2 主要试剂 |
| 1.1.3 主要材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 试验动物分组及免疫注射 |
| 1.2.2 不同试验组鸡血清补体总活性的测定 |
| 1.2.3 各试验组鸡血清中总补体活性测定（微量板溶血法） |
| 1.2.4 抗鸡C3 21 肽抗体的制备 |
| 1.2.5 抗鸡C3 21 肽抗体工作浓度的确定 |
| 1.2.6 C3 含量标准曲线的绘制 |
| 1.2.7 各试验组鸡血清补体C3 含量的测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 各试验组鸡血清中补体总活性 |
| 2.1.1 溶血素效价的测定 |
| 2.1.2 各试验组鸡血清中补体总活性的测定 |
| 2.2 兔抗鸡C3 21 肽IgG 抗体工作浓度的确定 |
| 2.3 溶液中C3 含量与OD 值关系的标准曲线 |
| 2.4 各试验组鸡血清中补体C3 的含量、 |
| 3. 讨论 |
| 3.1 微量板溶血法测定动物血清补体的效价 |
| 3.2 影响补体效价测定的因素 |
| 3.3 补体总活性与动物的抗病力 |
| 3.4 C3 21 肽的合成及抗C3 21 肽抗体的制备 |
| 3.5 补体C3 与动物的抗病力 |
| 七 新城疫补体C3d 分子佐剂疫苗免疫效果的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 常用试剂配制 |
| 1.1.2 制备新城疫油乳剂灭活苗用佐剂 |
| 1.1.3 新城疫油乳剂灭活苗的制备 |
| 1.1.4 ELISA 常用试剂 |
| 1.1.5 主要仪器设备 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 重组质粒的大量提取 |
| 1.2.2 质粒的安全性检验 |
| 1.2.3 质粒疫苗的体液免疫效果检测 |
| 1.2.4 攻毒保护试验 |
| 1.2.5 病毒排放的检测 |
| 1.2.6 解剖检查 |
| 1.2.7 重组质粒疫苗的细胞免疫效果检测 |
| 1.2.8 重组鸡补体C3d 质粒（pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6）及原核表达重组C3d 蛋白（rChC3d）对外周血T 淋巴细胞增殖效果对比试验 |
| 2 结果 |
| 2.1 安全性检验结果 |
| 2.2 血凝抑制抗体变化 |
| 2.3 间接ELISA 法检测NDV 抗体最佳工作浓度的确定结果 |
| 2.4 NDV 核酸疫苗在SPF 雏鸡体内诱导抗体的检测结果 |
| 2.5 攻毒保护试验结果 |
| 2.6 免疫鸡攻毒后的病毒分离结果 |
| 2.7 重组质粒疫苗细胞免疫效果的检测结果 |
| 2.8 pcDNA3.1-F-ChC3d-p29.6 与rChC3d对外周血T淋巴细胞增殖效果对比试验结果 |
| 3 讨论 |
| 3.1 新城疫核酸疫苗研究的意义 |
| 3.2 疫苗注射部位、注射方式和免疫剂量的选择 |
| 3.3 采用淋巴细胞转化试验（MTT 法）进行外周血T 淋巴细胞增殖实验效果的讨论 |
| 3.4 本源动物补体C3d 及抗原基因的选择 |
| 3.5 C3d 的CR2 结合域P29 的特殊性 |
| 3.6 C3d 分子佐剂作用的可能机制 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录一 C3d 基因编码的蛋白质二级结构预测 |
| 附录二 使用garnier 软件对C3d 二级结构预测结果 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
（8）抗-αvβ3scFv-sTF双功能融合蛋白的可溶性表达及其特性研究（论文提纲范文）
| 主要缩略语表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一章 整合素单链抗体和可溶性组织因子的克隆和序列分析 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果与讨论 |
| 三、讨论 |
| 第二章 scfv 基因和stf 基因的融合及其原核表达载体的构建 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果与讨论 |
| 三、讨论 |
| 第三章 融合蛋白的表达、纯化和回收 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果与讨论 |
| 三、讨论 |
| 第四章 融合蛋白的活性验证 |
| 摘要 |
| 前言 |
| 一、材料和方法 |
| 二、结果与讨论 |
| 三、讨论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述：整合素αvβ3 与肿瘤研究进展 |
| 参考文献 |
| 论着：抗人整合素αvβ3-组织因子融合蛋白基因的构建和表达 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（9）鸭α干扰素原（真）核表达及其生物学活性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略词表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 干扰素研究进展 |
| 一、干扰素的种类和结构 |
| 二、干扰素生物学特点 |
| 三、禽类干扰素研究进展 |
| 四、兽医领域基因工程干扰素的应用研究 |
| 第二章 佐剂及遗传佐剂研究进展 |
| 一、协同刺激分子(共刺激分子)佐剂 |
| 二、CpG DNA序列和脂质体 |
| 三、细胞因子佐剂 |
| 四、影响遗传佐剂效果的其他因素 |
| 第二部分 实验研究 |
| 第三章 四川麻鸭α干扰素基因的克隆及序列分析 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 麻鸭 |
| 1.2 酶及试剂 |
| 1.3 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 SDIFN-αORF基因的克隆 |
| 2.2 目的基因的序列测定与分析 |
| 3.结果与分析 |
| 3.1 PCR扩增产物 |
| 3.2 nest-PCR扩增产物 |
| 3.3 PCR和nest-PCR产物比较 |
| 3.4 重组质粒酶切鉴定结果 |
| 3.5 重组质粒的PCR鉴定结果 |
| 3.6 IFN-α序列 |
| 3.7 序列分析 |
| 3.8 糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点分析 |
| 3.9 信号肽预测 |
| 3.10 疏水性分析 |
| 3.11 跨膜区和高级结构分析 |
| 3.12 同源性分析和进化比较 |
| 4.讨论 |
| 4.1 引物设计 |
| 4.2 基因扩增 |
| 4.3 T载体克隆 |
| 4.4 生物信息学分析 |
| 5、小结 |
| 第四章 鸭α干扰素基因原核表达载体构建及其表达产物的抗病毒活性 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 四川麻鸭IFN-α原核表达质粒的构建技术路线 |
| 2.2 SDIFN-α原核表达质粒的构建 |
| 2.3 重组质粒的鉴定 |
| 2.4 pBV220-SDIFN-α原核表达菌株的初步表达 |
| 2.5 鸭α-IFN包涵体纯化及复性 |
| 2.6 采用细胞病变抑制法(DEF/VSV系统)初步测定干扰素抗病毒活性 |
| 2.7 FQ-PCR检测干扰素抗病毒活性 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 菌株PCR扩增鉴定结果 |
| 3.2 pBV220-SDIFN-α质粒酶切鉴定结果 |
| 3.3 pBV220-SDIFN-α序列测定 |
| 3.4 pBV220-SDIFN-α的原核表达情况 |
| 3.5 表达产物抗病毒活性 |
| 4 讨论 |
| 4.1 关于表达系统及表达质粒的选择 |
| 4.2 关于感受态细胞的制备与转化 |
| 4.3 关于重组质粒的鉴定 |
| 4.4 关于基因表达 |
| 4.5 关于表达产物抗病毒活性测定 |
| 5 小结 |
| 第五章 四川麻鸭α干扰素基因(SDIFN-α)真核表达载体构建 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 四川麻鸭IFN-α真核表达质粒的构建 |
| 2.2 pcDNA-SDIFN-α真核表达质粒的单双酶切鉴定 |
| 2.3 pcDNA-SDIFN-α真核表达质粒序列测定 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 四川麻鸭IFN-α基因的获取 |
| 3.2 pUC-SDIFN-α酶切鉴定结果 |
| 3.3 pcDNA-SDIFN-α酶切鉴定结果 |
| 3.4 pcDNA-SDIFN-α序列测定 |
| 4 讨论 |
| 4.1 构建SDIFN-α的真核表达重组体的意义 |
| 4.2 四川麻鸭IFN-α的真核表达载体的克隆 |
| 5、小结 |
| 第六章 免疫组织化学检测鸭α干扰素方法的建立及鸭α干扰素真核表达质粒在免疫鸭体内的表达规律研究 |
| 1 实验材料 |
| 2、实验方法 |
| 2.1 真核表达质粒pcDNA-SDIFN-α的大量提取 |
| 2.2 质粒的纯化 |
| 2.3 含pcDNA-SDIFN-α的基因枪子弹的制备 |
| 2.4 实验鸭免疫分组设计 |
| 2.5 采样时间与部位 |
| 2.6 兔抗鸭IFN高免血清的制备及其IgG提取纯化 |
| 2.7 兔抗鸭IFN-IgG的检测及分析 |
| 2.8 免疫组织化学法方法的建立 |
| 2.9 免疫组织化学结果判定 |
| 3、结果与分析 |
| 3.1 表达质粒纯化及检测 |
| 3.2 原核表达产物SDIFN—a抗原的制备 |
| 3.3 SDIFN—a蛋白的纯化 |
| 3.4 琼扩检测及分析 |
| 3.5 ELISA检测及分析 |
| 3.6 Western-Blotting检测及分析 |
| 3.7 免疫组织化学方法检测及真核表达质粒pcDNA-SDIFN-α体内动态表达规律 |
| 4、讨论 |
| 4.1 质粒提取及纯化。 |
| 4.2 抗原抗体反应的检测 |
| 4.3 免疫组织化学检测表达规律。 |
| 5、小结 |
| 第七章 鸭α干扰素真核表达质粒pCDNA-SDIFN-α免疫调节剂研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 质粒的制备及纯化 |
| 2.2 基因枪子弹的制备 |
| 2.3 动物分组和免疫 |
| 2.4 血样的采集和处理 |
| 2.5 淋巴细胞转化试验 |
| 2.6 CD3+T淋巴细胞数量的检测 |
| 2.7 血清IgG的检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 质粒pcDNA-SDIFN-α以不同途径、不同剂量与DPV/DVH弱毒作用后鸭外周血T淋巴细胞转化效果 |
| 3.2 质粒pcDNA-SDIFN-α以不同途径、不同剂量与DVH弱毒作用鸭后激发外周血CD3+T淋巴细胞数量的动态变化 |
| 3.3 质粒pcDNA-SDIFN-α以不同途径、不同剂量与DPV弱毒作用鸭后血清抗体水平的动态变化 |
| 4 讨论 |
| 4.1 质粒pcDNA-SDIFN-α作用鸭后对弱毒苗激发鸭外周血T淋巴细胞转化能力的影响 |
| 4.2 质粒pcDNA-SDIFN-α作用鸭后对疫苗免疫鸭的外周血CD3+T淋巴细胞数量的影响 |
| 4.3 质粒pcDNA-SDIFN-α免疫途径、剂量、时间对疫苗免疫效果的影响 |
| 4.4 a-干扰素抗病毒活性与免疫调节的关系 |
| 5、小结 |
| 第三部分 结论: |
| 参考文献 |
| 附表 免疫组织化学检测结果 |
| 附图 免疫组织化学检测图谱 |
| 致谢 |
| 发表论文及作者简介 |
（10）LEDGFp52对大鼠视网膜神经节细胞作用研究（论文提纲范文）
| 英文缩写一览表 |
| 英文摘要 |
| 中文摘要 |
| 论文正文 LEDGFp52 对大鼠视网膜神经节细胞作用研究 |
| 前言 |
| 第一部分 NEUROBASAL~(TM) Media 无血清体系培养视网膜神经节细胞及LEDGFp52在视网膜神经节细胞表达研究 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第二部分 rhLEDGF p52 基因原核表达载体构建、诱导表达及蛋白纯化 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第三部分 细菌内同源重组法构建LEDGFp52 基因腺病毒载体及其体外表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四部分 siRNA-LEDGFp52 真核表达载体的构建和鉴定 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第五部分 LEDGF p52 调控大鼠视网膜神经节细胞生长状态 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第六部分 LEDGF p52 调控大鼠视网膜神经节细胞中神经元特异性生长相关的基因和蛋白表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 全文结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 文献综述 视觉系统中枢神经修复的基因治疗和移植 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的论着 |
四、肝细胞生长因子原核表达载体PUC18-HGF的构建及鉴定（论文参考文献）
- [1]刚地弓形虫IF-3与CSI基因部分生物学功能研究[D]. 李小雨. 南京农业大学, 2019(08)
- [2]重组人胰岛素的原核表达与活性探究[D]. 赵晨红. 苏州大学, 2019(06)
- [3]PGRN与ECM1相互作用介导乳腺癌增殖及转移分子机制的研究[D]. 李雅. 陕西师范大学, 2017(04)
- [4]KGH-R1-ScFv单链抗体与p21Ras蛋白免疫反应性研究[D]. 王鹏. 昆明理工大学, 2016(07)
- [5]靶向uPAR的胰腺癌双模态分子探针构建及体内MR/光学成像研究[D]. 曹凯. 第二军医大学, 2015(06)
- [6]定点突变β-环糊精葡萄糖基转移酶及其突变菌株发酵条件优化[D]. 王华. 吉林农业大学, 2012(04)
- [7]畜禽补体C3d基因克隆及序列分析和重组鸡C3d免疫佐剂效果研究[D]. 刘栋. 山东农业大学, 2010(05)
- [8]抗-αvβ3scFv-sTF双功能融合蛋白的可溶性表达及其特性研究[D]. 刘大斌. 中国人民解放军军事医学科学院, 2010(05)
- [9]鸭α干扰素原（真）核表达及其生物学活性研究[D]. 陈斌. 四川农业大学, 2008(01)
- [10]LEDGFp52对大鼠视网膜神经节细胞作用研究[D]. 赵海生. 第三军医大学, 2007(03)