一、金雀异黄素对缺氧诱导的人ARPE-19细胞内碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达的影响(英文)（论文文献综述）
田静岩[1]（2021）在《多功能纳米脂质体运载塞来昔布和金雀异黄素联合抑制前列腺癌细胞增殖的实验研究》文中研究说明研究背景:在全球范围内,前列腺癌是对男性具有挑战性的健康问题,传统的前列腺癌治疗方法包括前列腺根治性切除术、前列腺癌放射治疗、内分泌治疗及化疗等。前列腺癌化疗包括新辅助化疗及术后挽救性化疗,临床上常用的化疗药物包括吉西他滨、多西他赛及紫杉醇,但这些药物存在靶向性弱且毒副作用较强的问题。此外,由于前列腺癌为多基因异常,癌细胞的存活受多种信号传导途径的调节,因此,前列腺癌的化疗迫切需要一种含有多种药物（靶向多种途径）的制剂,以提高药物的靶向性,减少毒副作用,有效杀伤癌细胞。COX-2和GLUT-1可通过调节相关信号传导途径促进肿瘤的发生与发展。塞来昔布可通过抑制COX-2蛋白的表达,导致细胞内前列腺素E2减少,从而抑制肿瘤的增殖和侵袭作用。但是单独大剂量使用塞来昔布,可对患者产生严重的不良反应。因此,实现药物的肿瘤组织靶向运送是利用塞来昔布治疗肿瘤的有效策略。金雀异黄素是众所周知的GLUT-1蛋白抑制剂,可以诱导ROS的形成并与AMPK信号通路激活相关,是新型肿瘤化学治疗制剂,但是,由于该药的水溶性较低,因此难以实现静脉给药,而口服给药的生物利用度不佳。因此,实现该药物在体液中溶解及向肿瘤组织转运是急待解决的问题。纳米脂质体是以天然或合成脂质载体为基础,具有高生物相容性、优良靶向性、多药荷载性的新型纳米递药系统,可以克服原药物体内半衰期短、药物溶解性差、不良反应大、靶向性弱以及注射剂辅料毒性等缺陷。纳米脂质体可包封多种抗肿瘤药物并将其输送至特定的肿瘤部位,在联合抗肿瘤方面具有优异的效果。药物纳米脂质体可以按所设计比例缓释,并在血液中具有长循环周期,进一步提高了药物的功效。由于约100 nm直径的纳米材料表现出了“增强渗透性和保留”效应,故药物递送纳米载体可提供更好的治疗功效。与正常健康血管不同,肿瘤组织中的渗漏脉管系统在相邻内皮细胞之间具有约600～800 nm宽的间隙,促进了纳米材料药物的被动靶向。这种有缺陷的血管系统具有较差的淋巴回流,能够使纳米材料药物渗入血管外空间并在肿瘤组织中积聚。研究目的:本研究通过生物信息学方法和免疫组化检测,明确COX-2和GLUT-1在前列腺癌组织中的转录与表达,探究其与常见肿瘤突变基因的相关性;通过制备包封塞来昔布和金雀异黄素的多功能纳米脂质体,实现精准递送药物至肿瘤细胞并减少药物的不良反应;通过细胞实验,明确塞来昔布和金雀异黄素纳米脂质体对前列腺癌细胞增殖的抑制作用,并探讨其作用机制。为应用包封塞来昔布和金雀异黄素的多功能纳米脂质体治疗前列腺癌,尤其是去势抵抗性前列腺癌提供新型制剂和实验依据。研究方法:1.COX-2和GLUT-1在前列腺癌组织中的转录与表达应用Oncomine数据库分析COX-2和GLUT-1 m RNA在前列腺癌组织及正常前列腺组织中的转录;应用STRING数据库分析COX-2和GLUT-1基因与其它肿瘤基因的相关性;应用免疫组织化学染色的方法检测COX-2和GLUT-1蛋白在前列腺癌组织及良性病变前列腺组织中的表达,并分析二者表达的相关性。2.包封塞来昔布和金雀异黄素的多功能纳米脂质体的制备及理化分析制备目标药物包括空纳米脂质体、包封塞来昔布的纳米脂质体、包封金雀异黄素的纳米脂质体、包封塞来昔布和金雀异黄素的纳米脂质体。空纳米脂质体的合成:（1）L-α-磷脂酰胆碱（egg PC）和1,2-二棕榈酰基-锡-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-2000]铵盐（DPPE-PEG-2000）以95:5mol%比例溶解在氯仿中,制备成25mg/ml浓度的总脂质;（2）通过吹入N2气去除脂质混合物中的氯仿;（3）将获得的脂质悬浮在无菌盐溶液或水中,在60℃下间歇涡旋,持续30min;（4）30min后超声波处理上述溶液;（5）使用Avanti Mini-Extruder在60℃下通过100nm聚碳酸酯膜挤出。塞来昔布和金雀异黄素纳米脂质体制备:上述25mg/ml浓度的总脂质制备完成后,将塞来昔布（100μM）和金雀异黄素（10μM）单独和以10:1的比例溶解于上述脂质氯仿溶液中。后续步骤同上。塞来昔布和金雀异黄素纳米脂质体理化分析:（1）以扫描电镜观察药物纳米脂质体在TEM下的形态、直径及分布等成像特点;（2）测量分散在PBS和水中纳米脂质体流体动力学直径及zeta电位值;（3）监测255 nm和382 nm处的吸光强度来量化塞来昔布和金雀异黄素在纳米脂质体内的负载量;（4）测量在10 m M谷胱甘肽培养基中的释放动力学模式。3.药物纳米脂质体抗前列腺癌的实验研究体外培养前列腺癌细胞PC-3、LNCa P,以及成纤维细胞。将细胞分为空纳米脂质体组、塞来昔布纳米脂质体组、金雀异黄素纳米脂质体组、塞来昔布和金雀异黄素纳米脂质体组。（1）采用MTT法检测各组药物作用下的细胞活力变化;（2）采用细胞划痕愈合实验检测各组药物对PC-3细胞、LNCa P细胞,以及成纤维细胞转移能力的抑制作用;（3）检测各组药物作用于前列腺癌细胞后的ROS水平变化;（4）检测药物处理后的前列腺癌细胞内GSH水平的变化;（5）使用流式细胞仪检测细胞中2-NBDG来获得细胞中葡萄糖的摄取结果,以检测药物作用下PC-3细胞和LNCa P细胞葡萄糖转运水平变化;（6）采用Western blot检测各组药物作用下PC-3细胞和LNCa P细胞中COX-2、GLUT-1、Trx R、Prx-6、Cleaved caspase-3蛋白表达的变化情况;（7）使用Image-J密度测定分析仪来定量分析蛋白质条带;（8）采用RT-PCR方法检测各组药物作用下PC-3细胞和LNCa P细胞中COX-2、GLUT-1、Trx R、Prx-6、Caspase-3 m RNA的变化情况。实验结果1.COX-2和GLUT-1在前列腺癌组织中的转录与蛋白表达升高生物信息学分析结果显示,与正常前列腺组织相比,COX-2和GLUT-1的m RNA在前列腺癌组织中均表达上调,COX-2与STAT3相关性强,GLUT-1基因与TP53基因相关性强。免疫组织化学染色结果发现,与良性病变前列腺组织相比,COX-2和GLUT-1蛋白在前列腺癌组织中均表达上调,且与Gleason评分呈正相关。2.包封塞来昔布和金雀异黄素的多功能纳米脂质体的理化性质（1）制备获得纳米脂质体的理化分析,通过TEM观察,发现EL、CL、GL和CGL的形态为球形或准球形,平均粒径分布分别为110 nm、90 nm、90 nm和85 nm。（2）分散在PBS和水中的纳米脂质体的流体动力学直径分别为112 nm、108nm、98 nm和92 nm;zeta电位测量分散在PBS中的纳米脂质体的值在-2.0至-0.6m V之间,分散在水中的纳米脂质体显示值为-50至-46 m V。（3）包封定量结果表明,约91.7%塞来昔布包封在CL中,约68.9%的金雀异黄素包封在GL中,塞来昔布和金雀异黄素在CGL中的分别为78.7%和63.5%;（4）药物释放动力学显示,来自CGL的塞来昔布和金雀异黄素在10 m M谷胱甘肽培养液中48 hrs,塞来昔布释放率约82%,金雀异黄素释放率约79%。3.多功能纳米脂质体抑制前列腺癌细胞增殖及侵袭（1）细胞活力检测结果显示,作用24 hrs,CGL作用于PC-3细胞导致细胞活力降低约75%,72 hrs导致细胞活力降低约85%。对LNCa P细胞的影响,CGL作用导致细胞增殖减少约60%。CGL于成纤维细胞显示细胞活力略有下降（<10%）,但作用时间延长（48 hrs和72 hrs）。（2）划痕愈合实验显示:当CGL作用于划痕时,在所有时间点0 hrs,24 hrs和48 hrs均观察到明显抑制PC-3细胞向划痕区域的迁移,在CGL作用48 hrs,可以清楚地看到细胞呈球形形态。（3）药物作用后细胞标志物水平的研究显示:CGL作用后导致PC-3细胞产生显着的（3倍）ROS,CGL作用的LNCa P细胞产生的ROS量约1.6倍,EL,CL,GL和CGL在成纤维细胞中对ROS产生作用不明显;GL和CGL影响PC-3细胞中GSH生成降低约30%和90%,CGL导致LNCa P细胞GSH生成减少约90%。（4）对细胞葡萄糖摄取能力检测显示,GL和CGL对PC-3细胞和LNCa P细胞葡萄糖的转运抑制约60%。（5）Western blot结果显示:CGL作用后使PC-3细胞Cleaved caspase-3蛋白表达增加23倍;CGL作用后诱导PC-3细胞Trx R表达增加约8倍;CGL作用PC-3细胞后,Prx-6的表达水平显着降低;GL和CGL作用则导致GLUT-1蛋白表达显着降低,CGL作用导致GLUT-1蛋白表达降低约90%;CL、CGL作用后PC-3细胞COX-2蛋白表达显着增加。（6）RT-PCR检测结果显示:CGL作用于PC-3细胞后COX-2 m RNA的表达显着降低;GL和CGL作用于PC-3细胞后显着抑制GLUT-1 m RNA合成;CGL作用PC-3细胞后Prx-6、Trx R的m RNA合成明显增加;CGL作用的PC-3细胞Caspase-3 m RNA合成显着增加。实验结论1.与正常前列腺细胞及前列腺良性病变组织相比,COX-2和GLUT-1在前列腺癌组织中的转录与蛋白表达上调,且与Gleason评分呈正相关,COX-2基因与STAT3基因相关性强,GLUT-1基因与TP53基因相关性强,提示COX-2和GLUT-1在前列腺癌发展中起重要作用。2.本实验成功制备了包封塞来昔布和金雀异黄素的纳米脂质体,制备的纳米脂质体直径约100 nm,此为肿瘤细胞容易内化的体积,制备的纳米脂质体具有良好的包封率和稳定的释放率。3.纳米脂质体通过协同作用抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移,其机制为诱导ROS产生,降低细胞GSH浓度,抑制COX-2信号传导途径,减少GLUT-1蛋白抑制葡萄糖摄取,减少Prx-6蛋白和增加Trx R和Cleaved caspase-3蛋白水平,促进癌细胞凋亡。
陈水龄[2]（2020）在《姜黄素抑制实验性脉络膜新生血管的机制研究》文中指出第一章目的采用 532nm倍频激光建立实验性脉络膜新生血管（Choroidal Neovascularization,CNV）动物模型,为CNV的相关基础研究提供模型参考。方法1.应用532nm倍频激光光凝棕色挪威（Brown Norway,BN）大鼠建立实验性CNV模型,分别在光凝后1d、3d、5d、7d、14d、21d采用眼底照、眼底荧光血管造影（Fundus Fluorescein Angiograph,FFA）和吲哚菁绿血管造影（Indocyanine green Angiography,ICGA）观察光凝后不同时间点 CNV 的变化情况。2.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本,采用HE染色法观察光凝后不同时间点CNV中央厚度。3.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本,采用免疫组织化学染色法观察光凝后不同时间点CNV眼组织中CD105因子表达的情况。结果1.光凝后1d光斑处无荧光素渗漏;光凝后3d、5d仅有少量光斑处有荧光素渗漏。光凝后7d CNV生成率为70.18%,荧光素渗漏平均光密度值为128.30±11.21。光凝后14d CNV生成率为78.18%,平均光密度值为182.12±6.59,与光凝后7d组比较差异有统计学意义（P<0.05）。光凝后21d,CNV生成率和荧光素渗漏平均光密度值与光凝后14d组比较差异无统计学意义。2.HE染色结果显示:随着光凝后时间的增加,CNV中央厚度逐渐增加,光凝后7d CNV厚度为48.92±2.81μm,较光凝后1d显着增加（P<0.05）;光凝后14d CNV厚度为61.98±5.06μm,较光凝后7d显着增加（P<0.05）;光凝后21d CNV厚度为61.78±4.03μm,与14d组比较差异无统计学意义。3.CD105免疫组化结果显示:正常组视网膜组织CD105表达呈阴性,光凝后1d、3d、5d组光斑处可见少量棕黄色反应物表达,光凝后7d组光斑处棕黄色反应物逐渐增多（P<0.05）,光凝后14d组较光凝后7d组比较显着增加（P<0.05）,光凝后21d组与光凝后14d组比较差异无统计学意义。结论1.应用532nm激光光凝可以成功建立BN大鼠实验性CNV动物模型。2.CNV在光凝后7d至14d生长迅速,至21d逐渐稳定,此模型具有成模速度快,成模率高、重复性好、成本低的优点,可作为CNV基础研究的动物模型。3.眼底照、FFA、ICGA、HE染色和免疫组化检查可以动态观察CNV的变化。第二章目的观察中药单体姜黄素对BN大鼠实验性CNV的抑制作用,以及对AKT/p-AKT/HIF-1 α/VEGF信号通路活性的影响,为姜黄素治疗CNV提供实验依据。方法1.应用532nm倍频激光光凝诱导BN大鼠建立CNV模型,造模后的大鼠被随机分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低剂量组、姜黄素中剂量组和姜黄素高剂量组,在光凝后14d进行眼底照、FFA与ICGA检查。2.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本,采用HE染色法观察不同组CNV中央厚度。3.制作BN大鼠CNV眼组织病理学标本,采用免疫组织化学法观察不同组CNV眼组织中AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子蛋白的表达情况。4.采用RT-qPCR法检测CNV眼组织中AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子mRNA的相对表达量。5.采用蛋白免疫印迹（Western blot）法检测CNV眼组织中AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路各因子蛋白的相对表达量。结果1.正常组未打激光,模型组,雷珠单抗组,姜黄素低、中、高剂量组CNV生成率分别为78.18%、73.21%、77.19%、75.86%、74.55%,组间比较差异无统计学意义;荧光素渗漏平均光密度值分别为182.12±6.59、119.22±8.03、166.45±8.33、164.34±5.69、149.22±6.45;雷珠单抗组较模型组显着降低（P<0.05）;姜黄素低、中、高剂量组较雷珠单抗组显着升高（P<0.05）,其中姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）。2.HE染色结果显示:正常组BN大鼠视网膜组织各层结构清晰、排列整齐。光凝后14d,雷珠单抗组CNV中央厚度较模型组显着减少（P<0.05）;姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素高剂量组较模型组显着减少（P<0.05）,较雷珠单抗组显着增加（P<0.05）。3.免疫组化结果显示:正常组BN大鼠视网膜组织结构中AKT、p-AKT、HIF-1α、VEGF因子表达呈阴性,未见棕黄色反应物。光凝后14d,模型组光斑处AKT、p-AKT、HIF-1α、VEGF因子的表达高于正常组（P<0.05）;雷珠单抗组低于模型组（P<0.05）;姜黄素低剂量组、中剂量组AKT、p-AKT、HIF-1α、VEGF因子的表达与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素高剂量组的表达较模型组显着降低（P<0.05）;较雷珠单抗组显着增加（P<0.05）。4.mRNA结果显示:光凝后14d,模型组AKT、HIF-1α和VEGF mRNA相对表达量均高于正常组（P<0.05）;雷珠单抗组均低于模型组（P<0.05）;姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）,较雷珠单抗组显着增加（P<0.05）。5.Westernblot结果显示:光凝后14d,AKT蛋白各组间比较差异无统计学意义。p-AKT蛋白相对表达量模型组较正常组显着增加（P<0.05）;雷珠单抗组较模型组显着降低（P<0.05）;姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）。HIF-1α蛋白相对表达量模型组较正常组显着增加（P<0.05）,雷珠单抗组较模型组显着降低（P<0.05）,姜黄素低、中剂量与模型组比较差异无统计学意义,姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）,较雷珠单抗组显着增加（P<0.05）。VEGF蛋白相对表达量模型组较正常组显着增加（P<0.05）,雷珠单抗组较模型组显着降低（P<0.05）,姜黄素低剂量组与模型组比较差异无统计学意义,姜黄素中、高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）。结论1.高剂量姜黄素（400mg/Kg/d）对激光诱导的BN大鼠实验性CNV的形成具有抑制作用。2.姜黄素抑制BN大鼠实验性CNV的机制可能与抑制AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路的激活,降低相关因子的表达有关。第三章目的观察姜黄素对氯化钴（CoCl2）诱导的人视网膜色素上皮细胞株-19（adult retinal pigment epithelial cell line-19,ARPE-19）细胞缺氧模型中 AKT、HIF-1 α 和VEGF因子mRNA及蛋白表达的影响。方法1.采用CoCl2诱导ARPE-19细胞建立化学性缺氧模型,应用CCK-8法筛选造模试剂CoCl2、实验药物姜黄素和阳性对照药雷珠单抗的浓度,同时检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞活性的影响。2.将ARPE-19细胞分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组,应用RT-qPCR法检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞缺氧模型AKT、HIF-1α和VEGF mRNA表达量的影响。3.将ARPE-19细胞分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组,应用Westernblot法检测姜黄素对CoCl2诱导的ARPE-19细胞缺氧模型AKT、p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白表达量的影响。结果1.CCK-8细胞活性检测:随着CoCl2浓度的增加,ARPE-19细胞活性呈现先增长后抑制,当CoCl2终浓度≥200μM时,细胞活性显着降低（P<0.05）。姜黄素终浓度在0-100μM时,ARPE-19细胞活性未见异常;当浓度≥200μM时,细胞活性显着降低（P<0.05）。雷珠单抗在终浓度为20μg/mL时,细胞活性较CoCl2组显着降低（P<0.05）,与正常组比较差异无统计学意义;当浓度为40μg/mL、80μg/mL时,细胞活性较CoCl2组和正常组均显着降低（P<0.05）。因此,我们选择终浓度100μM的CoCl2作为造模浓度;终浓度6.25μM、25μM、100μM的姜黄素作为低、中、高剂量组浓度;终浓度为20μg/mL的雷珠单抗作为阳性对照药物的浓度。2.RT-qPCR结果显示:模型组AKT、HIF-1α和VEGF mRNA相对表达量均高于正常组（P<0.05）;雷珠单抗组均低于模型组（P<0.05）;姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义（P<0.05）;姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）;与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。3.Westernblot结果显示:AKT蛋白相对表达量各组间比较差异无统计学意义。p-AKT和HIF-1α蛋白相对表达量模型组均高于正常组（P<0.05）,雷珠单抗组均低于模型组（P<0.05）,姜黄素低、中剂量组与模型组比较差异无统计学意义（P<0.05）,姜黄素高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）,与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。VEGF蛋白相对表达量模型组高于正常组（P<0.05）,雷珠单抗组低于模型组（P<0.05）,姜黄素低剂量与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素中、高剂量组较模型组显着降低（P<0.05）,与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。结论1.应用CoCl2可成功建立APRE-19细胞化学缺氧模型。2.CoCl2在终浓度为100μM时可增加细胞中AKT、HIF-1α和VEGF mRNA及p-AKT、HIF-1α和VEGF蛋白的表达量。3.高剂量姜黄素（100μM）可降低CoCl2诱导的ARPE-19细胞中AKT、HIF-1α和 VEGF mRNA 及 p-AKT、HIF-1α 和 VEGF 蛋白的表达。4.姜黄素（100μM）对CoCl2诱导ARPE-19细胞缺氧具有保护作用。第四章目的观察ARPE-19细胞的各组条件培养液对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）细胞增殖、迁移、侵袭和管腔形成的影响。方法1.将ARPE-19细胞条件培养液分为正常组、模型组、雷珠单抗组、姜黄素低、中、高剂量组,分别作用于HUVEC细胞;采用CCK-8法观察ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞活性的影响。2.采用细胞划痕实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的水平迁移的影响。3.采用Transwell小室迁移实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的垂直迁移的影响。4.采用Transwell小室侵袭实验观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞的侵袭的影响。5.采用Matrigel基质胶管腔形成实验,观察在非接触情况下ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞管腔形成的影响。结果1.ARPE-19细胞的各组条件培养液对HUVEC细胞活性的影响,组间差异无统计学意义。2.HUVEC细胞水平迁移实验结果显示:与正常组比较模型组HUVEC细胞水平迁移显着增加（P<0.05）;与模型组比较雷珠单抗组水平迁移显着减少（P<0.05）;姜黄素条件培养液低（6.25μM）、中（25μM）、高（100μM）剂量组水平迁移较模型组显着减少（P<0.05）,其中,高剂量组与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。3.HUVEC细胞垂直迁移实验结果显示:与正常组比较模型组HUVEC细胞垂直迁移显着增加（P<0.05）;与模型组比较雷珠单抗组垂直迁移显着减少（P<0.05）;姜黄素条件培养液低（6.25μM）、中（25μM）剂量组垂直迁移与模型组比较差异无统计学意义,姜黄素条件培养液高（100μM）剂量组垂直迁移较模型组显着减少（P<0.05）,与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。4.HUVEC细胞侵袭实验结果显示:与正常组比较模型组HUVEC细胞侵袭显着增加（P<0.05）;与模型组比较雷珠单抗组细胞侵袭显着减少（P<0.05）;姜黄素条件培养液低（6.25μM）、中（25μM）剂量组细胞侵袭与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素条件培养液高（100μM）剂量组较模型组细胞侵袭显着减少（P<0.05）,与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。5.HUVEC细胞管腔形成实验结果显示:模型组管腔形成较正常组显着增加（P<0.05）;雷珠单抗组管腔形成较模型组显着较少（P<0.05）;姜黄素条件培养液低（6.25μM）剂量组管腔形成与模型组比较差异无统计学意义;姜黄素中（25μM）、高（100μM）剂量组管腔形成与模型组比较显着减少（P<0.05）,与雷珠单抗组比较差异无统计学意义。结论1.ARPE-19细胞姜黄素低（6.25μM）、中（25μM）、高剂量组（100μM）条件培养液可显着抑制HUVEC细胞水平迁移;其中高剂量组条件培养液可显着抑制HUVEC细胞垂直迁移。2.ARPE-19细胞姜黄素高剂量组（100μM）条件培养液可抑制HUVEC细胞侵袭。3.ARPE-19细胞姜黄素中（25μM）、高剂量组（100μM）条件培养液可抑制HUVEC细胞管腔形成。4.姜黄素可在细胞水平抑制血管的生成。
张佳良[3]（2020）在《从缺氧-VEGF途径探讨止血化瘀利水方防治视网膜静脉阻塞黄斑水肿的作用机理》文中进行了进一步梳理目的:通过体外细胞实验和体内动物实验从缺氧-VEGF途径探讨止血化瘀利水方治疗视网膜静脉阻塞性黄斑水肿及其新生血管相关性并发症的作用及调控机理,为中医“络病论治”、“理血治水”治疗RVO黄斑水肿等新生血管相关并发症提供初步的理论依据,丰富中医治疗眼底血证理论。方法:1.通过体外细胞实验观察止血化瘀利水方对缺氧诱导ARPE-19细胞VEGF及其相关因子表达的影响,并探讨其作用机理:体外培养ARPE-19细胞,取对数期生长状态良好的细胞,分为正常组、中药空白组、缺氧模型组、阳性对照组与中药组。首先用不同浓度CoCl2进行诱导培养24h、48h、72h后,CCK-8法检测细胞的增殖活性,以筛选出最佳CoCl2浓度用于建立细胞缺氧模型;采用ELISA法检测细胞上清液中VEGF的蛋白浓度;Western Blot法检测细胞中HIF-1α、NF-KB p65、NF-KB p-p65的蛋白表达水平;Realtime-RT-PCR法检测细胞VEGFmRNA和HIF-1αmRNA的表达水平,具体内容见实验一章节。2.通过体内动物实验观察止血化瘀利水方对视网膜静脉阻塞模型兔视网膜组织内VEGF及其相关因子表达的影响,并探讨其作用机理:以光化学法诱导新西兰兔RVO模型,将造模成功后的RVO兔随机分为模型组与中药组,正常对照组为未进行造模的同龄正常新西兰兔。各项指标检测时间节点分别为造模后7d、14d、21d、28d。采用免疫组化法检测兔视网膜中VEGF、HIF-1α、NF-KB p65的蛋白分布;Western Blot法检测兔视网膜中VEGF、HIF-1α NF-KB p65的蛋白表达水平;Realtime-RT-PCR法检测实验兔视网膜中VEGFmRNA和HIF-1αmRNA的表达水平,具体内容见实验二章节。结果:1.体外细胞实验（1）细胞缺氧模型的建立:实验中通过CCK-8法检测ARPE-19细胞增殖活性,证实CoCl2可诱导出细胞缺氧状态,并筛选出建模CoCl2最佳浓度为200μmol/L和含药血清最佳浓度为20%以应用于以下实验研究。（2）细胞ELISA检测结果:各组细胞的VEGF蛋白浓度在24h、48h、72h3个时间点均随时间延长呈递增趋势,与正常组相比,缺氧模型组升高,差异有统计学意义（t24h=9.794,t48h=7.447,t72h=10.466,P24,48,72h<0.001）。与缺氧模型组相比,空白对照组差异无统计学意义（P>0.05）,阳性对照组显着降低（t24h=2.897,P24h<0.01;t48h=2.308,P48h<0.05;t72h=4.748,P72h<0.001）,中药组显着降低（t24h=4.242,t48h=3.430,P24.48h<0.001;t72h=2.501,P72h<0.01）;中药组与阳性对照组比较,两组在48h和72h有显着性差异（t48h=2.429,t72h=1.933,P48,72h<0.05）。（3）细胞Western blot检测结果:①HIF-1α蛋白在各组细胞中的相对表达结果显示,与正常组相比,中药空白组差异无统计学意义（P>0.05）,缺氧模型组各时间点均升高,在72h差异有统计学意义（t=4.593,P<0.01）;与缺氧模型组相比,中药组各时间点均降低,在72h差异有统计学意义（t=2.873,P<0.05）。②NF-KB p65和NF-KB p-p65蛋白在缺氧模型组中未表达,中药组中少量表达。（4）细胞Realtime-RT-PCR检测结果:①VEGFmRNA的表达结果显示,与正常组相比,缺氧模型组各时间点均增加,差异有统计学意义（t24h=4.946,t48h=12.863,P24,48h<0.001;t72h=5.561,P72h<0.05）;与缺氧模型组相比,阳性对照组与中药组在24h和48h减少,72h增加,在3时相,阳性对照组差异有统计学意义（t24h=3.437,P24h<0.01;t48h=13.554,P48h<0.001;t72h=2.219,P72h<0.05）;中药组差异有统计学意义（t24h=3.084,t72h=6.115,P24h,72h<0.01;t48h=14.837,P48h<0.001）,而这两组间比较,差异无统计学意义（P>0.05）。②HIF-1αmRNA的表达结果显示,与正常组相比,缺氧模型组各时间点均显着增加（t24h=2.658,P24h<0.05,t48h=6.150,P48h<0.001,t72h=3.203,P72h<0.01）;与缺氧模型组相比,阳性对照组与中药组在各时间点均减少,在48h时两组差异有统计学意义（t阳性对照组=14.918,t中药组=15.358,P阳性对照,中药组<0.001）;这两组间的两两比较差异无统计学意义（P>0.05）。2.体内动物实验（1）RVO兔模型的建立:实验中眼底镜下观察及FFA和眼底彩照结果显示,造模后实验兔均出现光凝静脉阻塞表现,动物死亡率较低,证实了该方法建立的RVO动物模型的安全可靠。（2）兔视网膜免疫组化结果:①VEGF:正常组兔视网膜血管内皮细胞、神经节细胞层、内外核层、RPE细胞及脉络膜血管内皮细胞中均有少量VEGF表达,模型组和中药组VEGF 阳性表达主要见于造模区域的视网膜血管内皮细胞胞浆、神经节细胞核、RPE细胞胞浆及脉络膜血管内皮细胞胞浆。AOD结果显示,自造模后7d-28d VEGF 阳性表达,与正常组相比,模型组均增强,差异有统计学意义（t7d=10.232,t14d=9.895,t21d=10.952,t28d=12.772,P7-28d<0.001）;与模型组相比,中药组中药干预后均显着减弱（t7d=2.233,P7d<0.05;Z14d=2.873,P14d<0.01;t21d=6.648,t28d=7.710,P21d,28d<0.001）;AG 结果显示,自造模后 7d-28d VEGF 阳性表达,模型组均强于正常组,差异有统计学意义（t7d=6.847,t14d=8.751,t21d=9.637,t28d=8.417,P7-8d<0.001）;21d 和 28d 中药组均显着低于模型组（t21d=3.967,P21d<0.001;t28d=3.532,P28d<0.01）。AOD 与 AG 结果总体一致,模型组的表达水平较稳定,中药组随时间延长阳性表达逐渐减弱。②HIF-1α:正常组兔视网膜血管内皮细胞、神经节细胞层、内外核层、RPE细胞及脉络膜血管内皮细胞中均有少量HIF-1α表达,模型组和中药组HIF-1α阳性表达主要见于视网膜血管内皮细胞胞浆、神经节细胞核、内外核层、RPE细胞胞浆及脉络膜血管内皮细胞胞浆。AOD结果显示,自造模后7d-28d HIF-1α阳性表达,与正常组相比,模型组均增强,差异有统计学意义（Z7-28d=3.780,P7-28d<0.001）;与模型组相比,中药组均显着减弱（t7d=5.041,t14d=10.218,t28=4.766,P7d14d,28d<O.001;t21d=3.451,P21d<0.01）;AG结果显示,自造模后7d-28d HIF-1α阳性表达,与正常组相比,模型组均增强,差异有统计学意义（t7d=11.795,t14d=8.751,P7d.14d<0.001 t21d=2.674,Z28d=2.419,P21d,28d<0.05）;与模型组相比,中药组在 7d、14d、28d 均减弱,但在14d差异有统计学意义（t=4.358,P<0.001）。AOD与AG结果显示模型组表达趋势基本一致,在14d表达最强;中药组阳性表达总体上低于模型组,并且随时间延长表达逐渐减弱。③NF-KB p65:正常组兔视网膜在神经节细胞核和内外核层有棕黄色阳性染色,较分散。模型组和中药组NF-KB p65阳性表达主要见于视网膜血管内皮细胞胞浆、神经节细胞核、内核层及外核层细胞核。AOD结果显示,自造模后7d-28d NF-KB p65阳性表达,与正常组相比,模型组均增强,差异有统计学意义（t7d=4.264,t14d=15.027,t21d=1 1.026,t28d=8.073,P7-28d<0.001）;与模型组相比,中药组均减弱,在14d、21d、28d差异有统计学意义（t14d=4.579,t28d=5.232,P14d,28d<0.001;t21d=3.266,P21d<0.01）;AG 结果显示,自造模后7d-28d NF-KB p65阳性表达,与正常组相比,模型组均增强,差异有统计学意义（t7d=8.026,t14d=8.426,t21d=8.013,t28d=4.478,P7-28d<0.001）;与模型组相比,中药组均显着减弱（t7d=4.579,t14d=3.769,P7d,14d<0.001;t21d=3.176,P21d<0.01;t28d=2.531,P28d<0.05）。AOD 与 AG 结果基本一致,模型组在 14d 时表达最高,中药组随时间延长表达逐渐减弱。（3）兔视网膜Western blot结果:①VEGF蛋白的表达结果显示,在视网膜细胞胞浆中的表达:与正常组相比,模型组在各时间点均降低;与模型组相比,中药组在7d、14d、21d均降低,并随时间延长而逐渐降低。而在视网膜细胞胞核中的表达:与正常组相比,模型组在14d、21d、28d增加;与模型组相比,中药组在14d、21d、28d降低,并随时间延长而逐渐降低,但以上组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。②HIF-1α蛋白的表达结果显示,在视网膜细胞胞浆中的表达:与正常组相比,模型组在7d和21d增加;与模型组相比,中药组在21d降低。而在视网膜细胞胞核中的表达:与正常组相比,模型组在14d增加,中药组在7d、14d、21d降低,但以上组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。③NF-KB p65蛋白的表达结果显示,在视网膜细胞胞浆中的表达:与正常组相比,模型组在7d、21d和28d增加;与模型组相比,中药组在7d、21d降低。而在视网膜细胞胞核中的表达:与正常组相比,模型组在各时间点均增加;与模型组相比,中药组在各时间点均降低,但以上组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。（4）兔视网膜Realtime-RT-PCR结果:①VEGFmRNA的相对表达量:与正常组相比,模型组在7d、14d、21d表达水平升高,7d和14d时差异有统计学意义（t7d=2.935,t14d=3.149,P7,14d<0.05）,而且在14d时表达水平最高;与模型组相比,中药组在各时间点表达水平均降低,但差异均无统计学意义（P>0.05）。②HIF-1αmRNA的相对表达量:与正常组相比,模型组各时间点表达水平均升高,在14d差异有统计学意义（Z=-2.087,P<0.05）,而且在14d时表达水平最高;与模型组相比,中药组在7d、14d、21d表达水平降低,但差异均无统计学意义（P>0.05）。结论:1.CoCl2可成功诱导ARPE-19细胞缺氧模型,以更好的模拟体内缺氧环境。2.体外细胞实验:缺氧诱导ARPE-19细胞中VEGF、HIF-1α表达升高,提示缺氧环境下细胞趋化两因子的高表达。3.止血化瘀利水方与复方血栓通含药血清对缺氧损伤后ARPE-19细胞的增殖和VEGF、HIF-1α表达均起抑制作用,因此推测改善缺氧环境及抑制VEGF是中药在治疗RVO中发挥作用的关键机制。4.光化学法可成功诱导RVO兔模型,具备动物死亡率低及成功率高的优点。5.体内动物实验:RVO兔模型视网膜中VEGF、HIF-1α、NF-KB p65表达升高,在14d时尤为明显,提示以上三因子参与了 RVO及其并发症的病理过程,14d为相关因子维持的时间转折点。6.止血化瘀利水方对RVO兔模型视网膜中VEGF、HIF-1α和NF-KB p65起到较好的抑制调节作用,表明该中药可能是通过改善视网膜缺血缺氧途径,减少VEGF等新生血管生长相关因子产生,从而达到防治RVO引起的ME及新生血管性并发症的目的。7.结合体外实验与体内实验的结果表明,止血化瘀利水方可能通过缺氧-VEGF途径对RVO及ME、新生血管性并发症具有较好的防治作用。
向雪萍[4]（2020）在《DFMG调节TLR4/VEGF-A抗宫颈癌血管新生的机制研究》文中认为目的:宫颈癌患者死亡的主要原因是肿瘤的复发、未控和转移,且约有35%的患者会发生复发/未控。复发/未控的治疗难点在于:受之前治疗手段的影响（手术、放疗或化疗）,后续治疗方法常常受到限制,预后很差。血管新生是宫颈癌发生发展中的重要步骤,目前抗血管新生药物联合化疗已成为复发/未控性宫颈癌的首选治疗方案。但现有的抗血管新生药物仍存在很多局限,在降低副反应、降低费用、提高疗效等方面仍有很大的提升空间。临床上迫切需要寻找经济有效、低毒安全的新型抗血管新生药物,从植物提取物中研发抗血管新生药物是一个极富吸引力的方向。7-二氟亚甲基-5,4’-二甲烷氧基异黄酮（7-difluoromethoxy-5,4’-dimethoxygenistein,DFMG）是本课题组前期从植物中提取的新化学实体,已证实能通过调控Toll样受体4（Tolllike receptor 4,TLR4）抑制动脉粥样硬化过程中的血管新生。有研究表明宫颈癌细胞中TLR4呈高表达状态,且与VEGF-A之间存在明显正相关性,研究猜想DFMG是否可通过调控TLR4/VEGF-A路径抑制宫颈癌血管新生。本课题以宫颈癌Siha细胞和静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell-12,HUVE-12）为研究对象,探讨DFMG对宫颈癌血管新生的影响及其可能作用机制,为宫颈癌药物治疗的研发提供理论基础。方法:1.CCK-8试剂盒方法检测不同浓度（0,25,50,100μmol/L）DFMG分别孵育Siha细胞和HUVE-12细胞24 h后的细胞活性,选择合适浓度;2.基质胶小管形成、细胞划痕、CAM膜血管形成实验观察DFMG、金雀异黄素、贝伐单抗分别对Siha细胞和HUVE-12细胞血管新生的影响;3.ELISA检测DFMG、金雀异黄素、贝伐单抗分别孵育Siha细胞和HUVE-12细胞24 h后上清液中的VEGF-A蛋白浓度;Western Blot检测细胞中VEGF-A表达量;4.TLR4基因过表达慢病毒转染Siha细胞,并建立稳定过表达TLR4的Siha细胞系;TLR4基因小干扰RNA瞬时转染Siha细胞,倒置荧光显微镜下观察荧光效率,Western Blot和q RT-PCR检测转染是否成功;5.基质胶小管形成、细胞划痕、CAM膜血管形成实验观察Siha细胞培养上清中加入VEGF-A或VEGF-A抗体贝伐单抗后对血管新生的影响,同时观察TLR4过表达的Siha细胞培养上清中加入VEGFA抗体贝伐单抗及TLR4沉默表达的Siha细胞培养上清中加入VEGFA细胞因子后对血管新生的影响;6.基质胶小管形成、细胞划痕、CAM膜血管形成实验观察DFMG对过表达或沉默表达TLR4的Siha细胞血管新生的影响;7.ELISA检测DFMG孵育过表达或沉默表达TLR4的Siha细胞后上清液中的VEGF-A蛋白浓度;Western Blot和q RT-PCR检测细胞中VEGF-A、TLR4的表达量。结果:1.50μmol/L DFMG能抑制Siha细胞活性作用,而不影响HUVE-12细胞,故选择50μmol/L DFMG研究其对宫颈癌血管新生的影响;2.DFMG可抑制宫颈癌血管新生,且作用强于金雀异黄素,弱于贝伐单抗;同时贝伐单抗可抑制HUVE-12细胞血管新生,而DFMG、金雀异黄素对其无影响;3.DFMG抑制Siha细胞VEGF-A蛋白的表达和分泌,且作用强于金雀异黄素,弱于贝伐单抗;同时贝伐单抗抑制HUVE-12细胞VEGF-A蛋白的表达和分泌,而DFMG、金雀异黄素对其无影响;4.荧光显微镜下观察荧光效率已达到90%以上,Western Blot和q RT-PCR验证TLR4基因过表达慢病毒和小干扰RNA转染Siha细胞均成功;5.Siha细胞培养上清中加入VEGF-A可促进血管新生,加入贝伐单抗则抑制血管新生;而上清液中加入贝伐单抗可拮抗Siha细胞中TLR4过表达的促血管新生作用,上清液中加入VEGF-A可拮抗Siha细胞中TLR4沉默表达的抑制血管新生作用;6.Siha细胞过表达TLR4后,DFMG抑制血管新生的能力减弱;Siha细胞沉默表达TLR4后,DFMG抑制血管新生的能力增强;7.Siha细胞中TLR4的过表达可拮抗DFMG抑制TLR4的表达及VEGF-A的分泌与表达的作用,而Siha细胞中TLR4的沉默表达可协同DFMG抑制TLR4的表达及VEGF-A的分泌与表达。结论:1.DFMG可抑制宫颈癌血管新生。2.TLR4/VEGF-A路径可调控宫颈癌血管新生。3.DFMG抑制宫颈癌血管新生,其机制可能与调控TLR4/VEGFA路径相关。
韩昊特[5]（2021）在《PI3Kδ在PVR中的作用机制及视网膜病变治疗新途径研究》文中认为增殖性玻璃体视网膜病变（PVR）是与视网膜牵拉和脱离相关的临床综合征。视网膜和玻璃体腔表面具有增殖潜能的细胞增殖和收缩是其形成的主要原因。目前多数情况下,可以实现与PVR相关的视网膜的外科手术复位,但视觉恢复效果仍较差。在多达10%的视网膜脱离患者中发现,一定程度的PVR尽管进行了复杂的手术,但大多数病人仍会视力低下。糖尿病性视网膜病变,特别是其增生阶段（增殖性糖尿病性视网膜病变,proliferative diabetic retinopathy,PDR）,与病理性血管生成有关,是导致失明的第二大原因。当前,PDR治疗方法通常使用VEGF抗体（兰尼单抗或贝伐单抗）或由融合至VEGF受体胞外域的抗体Fc片段组成的重组蛋白来中和玻璃体中的血管内皮生长因子。但在许多PDR患者中都观察到了耐药性,迫切需要新的治疗方法。本论文基于CRISPR-Cas9基因编辑技术研究PI3Kδ在PVR形成中的作用机制,探索PVR基因治疗新途径;并从天然单体化合物中筛选潜在的治疗视网膜病变（如PVR和PDR）的先导化合物或药物,为视网膜疾病的治疗提供新的治疗方法。本论文的主要研究内容和结果如下:（1）应用CRISPR-Cas9基因编辑技术研究磷酸肌醇3激酶δ（PI3Kδ）在玻璃体诱导的Akt/Mdm2/p53激活和视网膜色素上皮细胞迁移中的作用磷酸肌醇3激酶（PI3K）是脂质家族蛋白激酶,其在信号传递方面起关键作用。PI3Ks包括PI3Kα,PI3Kβ,P13Kγ和PI3Kδ。PI3K在实验性增殖性玻璃体视网膜病变中起重要作用,但是,PVR涉及何种PI3K亚型尚不清楚。本章研究表明,p110δ在视网膜色素上皮RPEs细胞中特异性高表达,为了阐明PI3K亚型在PVR形成中的分子机制,利用CRISPR-Cas9基因编辑技术构建p110δ敲减细胞系,并采用p110δ特异抑制剂Idelalisib用分子和药理学方法灭活p110δ,证明p110δ灭活可阻止玻璃体诱导的Akt/Mdm2/p53通路的激活以及在PVR形成中细胞固有的细胞应答,进而阐明了PI3K亚型在PVR形成中的分子机制。这些研究为RPE（如PVR）相关疾病的治疗提供了新的技术手段。（2）TGF-β2诱导的PI3Kδ信号转导环在PVR疾病中的作用在PVR的发展过程中,上皮间质转化（EMT）是细胞主要的应答反应,而转化生长因子（TGF）-β2是诱导EMT的关键因素。PI3K/Akt信号通路是实验性PVR的重要调节通路,而在玻璃体诱导的Akt激活中,PI3Kδ亚型起主要作用。本章研究表明,通过CRISPR/Cas9或药理学（Idelalisib抑制剂）方式使PI3Kδ失活,可有效阻断TGF-β2诱导的Akt激活以及EMT。Idelalisib对PI3Kδ的抑制作用还可以防止在小鼠中实验性诱导的PVR形成。进一步研究发现TGF-β2诱导PI3Kδ/Akt/Mdm2/NF-κB途径控制PI3K的催化亚基p110δ的表达,并产生正反馈回路,这一通路的发现为阐明PVR的发病机理奠定了基础。（3）Chalcomoracin预防玻璃体诱导的Akt活化和视网膜色素上皮细胞迁移为了寻找治疗视网膜病变新的药物或先导化合物,本章选用实验室从真菌感染的桑叶分离得到的天然单体化合物Chalcomoracin（CMR）,研究其抑制玻璃体诱导的信号转导通路和PVR固有的细胞反应。研究表明,CMR对ARPE-19细胞IC50在72小时为35.5μM,而5μM的CMR则可显着抑制玻璃体诱导的Akt激活和p53抑制。此外,还发现CMR能有效地阻断玻璃体刺激的ARPE-19细胞的增殖,迁移和收缩,表明CMR是一种潜在的PVR预防剂。（4）Capilliposide B在人原代视网膜微血管内皮细胞中阻断VEGF诱导的体外血管生成异常的血管生成与PDR的形成有关。本章探讨天然产物对PDR的治疗的可行性。Capilliposide B（CPS-B）是一种来源于细梗香草（Lysimachia capillipes Hemsl）的齐墩果三萜皂苷,可以抑制血管内皮生长因子诱导的血管生成信号通路和人视网膜微血管内皮细胞（HREC）在PDR中的细胞响应。研究表明,CPS-B对HREC细胞IC50在72小时为8.5μM,而1μM CPS-B则可特异性抑制VEGF诱导的VEGFR2及其下游信号转导酶Akt和Erk的活化。发现CPS-B有效地阻断了VEGF刺激的HREC增殖,迁移和管形成,表明CPS-B是一种潜在的血管新生相关疾病（如增殖性糖尿病性视网膜病）的预防剂。
陈冬悦[6]（2017）在《TWEAK与增殖性糖尿病视网膜病变相关性及促细胞增殖作用的研究》文中研究指明目的:为了证实TWEAK和Fn14在增殖性糖尿病视网膜病变中上调,并有促使ARPE-19细胞增殖和胶原合成的作用。研究背景:糖尿病视网膜病变严重危害了糖尿病患者的视力,是其视力丧失的主要原因,是糖尿病危害性最大的并发症之一。持续的高血糖引起视网膜微血管的慢性病变,促进糖尿病视网膜病变病理过程的进展。临床上根据糖尿病视网膜病变（DR）的分级标准,出现视网膜新生血管或玻璃体出血和（或）视网膜前出血即发展为增殖性糖尿病视网膜病变（PDR）。PDR引起反复玻璃体出血,视网膜和玻璃体纤维化,视神经萎缩以及视网膜脱离,最终可导致患者视力严重受损。PDR最显着的特征就是视网膜新生血管的形成,各种血管因子、细胞因子和炎症因子均参与这一过程。以往的重点在于各类血管内皮生长因子和其它具有促血管生成作用的因子的研究。近年来,免疫系统的紊乱和功能失衡以及血管增殖的激活也被认为参与了PDR的病理过程。另外有研究表明,在PDR增殖过程中有多种细胞参与,如成纤维细胞、RPE细胞、胶原细胞等,因RPE细胞参与血-视网膜外屏障的构成,所以RPE细胞的变化在PDR进展中尤为重要。最近肿瘤坏死因子超家族中的新成员被发现具有调节炎症和细胞增殖、促新生血管形成的作用。特别是肿瘤坏死因子样的凋亡弱诱导剂（TWEAK）具有活跃的生物学特性,它通过结合纤维母细胞生长因子诱导分子14（Fn14）激活NF-κB信号通路,调节细胞的存活和增殖,诱导释放Cathepsin B引起细胞死亡,提高前炎症分子MMP9、ICAM1和IL6的表达,而这些细胞因子均已被证实参与了PDR的病理过程。有报道称,在PDR病人玻璃体中有TWEAK和Fn14的基因表达。大量证据表明TWEAK有可能通过TWEAK/Fn14信号通路参与调控PDR的发展。本研究通过检测PDR病人玻璃体中TWEAK和Fn14的表达情况,了解TWEAK和Fn14与PDR的相关性。为确认TWEAK表达与PDR临床病理特征之间的关系,我们进一步研究了视网膜细胞过表达TWEAK后,能够提高该细胞增殖和胶原合成的能力。方法:玻璃体样本的采集通过玻璃体手术分别获得16个PDR病人和21个非PDR的2型糖尿病病人的玻璃体样本。ELISA法检测玻璃体液中TWEAK和Fn14含量通过ELISA法检测两组病人玻璃体液中TWEAK和Fn14的含量。Westernblot法分析玻璃体液中TWEAK和Fn14蛋白的表达量两组病人玻璃体液中TWEAK和Fn14蛋白的表达水平通过与GAPDH带的灰度百分比表示。目的基因的获取从293T细胞获取人的总DNA,通过PCR技术获得TWEAK扩展片段。ARPE-19细胞培养和TWEAK过表达将ARPE-19细胞进行贴壁培养。细胞融合大于90%时,以1:3的比例分代。在ARPE-19细胞中过表达TWEAK。将TWEAK编码序列克隆入pc DNA3.1（+）载体。将TWEAK-pc DNA3.1（+）和对照质粒分别转染入ARPE-19细胞。在G418液体中筛选并保存。RNA提取和定量RT-PCRRT-PCR操作按照试剂盒说明书进行,GAPDH作为内对照。TWEAK和GAPDH引物由Sangon公司合成。Westernblot法分析细胞中TWEAK蛋白的表达量检测过表达ARPE-19细胞在传代不同阶段,细胞中TWEAK蛋白的表达量。细胞计数检测,MTT检测和群落形成检测细胞计数检测获得细胞生长曲线,MTT法检测细胞活力,集落形成实验检测细胞增殖能力。Westernblot法分析细胞中α-SMA,collagen I和collagen IV蛋白的表达量检测过表达ARPE-19细胞在传代不同阶段,细胞中α-SMA,collagen I和collagen IV蛋白的表达量。统计和分析用Graph Pad Prism软件进行统计分析。数据结果表示为平均值加减标准差。两组间对比采用t-test,多组均数对比采用单因素方差分析。P小于0.05视为有统计学意义。结果:PDR病人玻璃体液中TWEAK和Fn14水平升高21个非PDR的T2DM病人和16个PDR病人的玻璃体样本被收录本研究中。为确定TWEAK和Fn14与PDR的相关性,通过ELISA法检测了两组病人玻璃体液中TWEAK和Fn14的含量的变化,结果显示,PDR病人玻璃体中TWEAK和Fn14含量显着升高。通过Westernblot法分析了两组病人玻璃体中TWEAK和Fn14的蛋白表达水平。结果显示,TWEAK和Fn14在PDR病人玻璃体中的蛋白表达水平也随之显着升高,因此,我们认为TWEAK/Fn14信号通路在PDR病人的玻璃体液中表达上调。稳定的TWEAK过表达ARPE-19细胞系的建立从293T细胞中获取人总DNA,利用PCR技术得到TWEAK编码序列扩展片段,然后被克隆入pc DNA3.1（+）载体,ARPE-19细胞被克隆的载体转染,可以获得稳定表达TWEAK的ARPE-19细胞系。TWEAK过表达促进了细胞增殖和胶原在ARPE-19中的合成为了研究TWEAK在ARPE-19细胞增殖中的作用,我们将ARPE-19（TWEAK过表达）组和ARPE-19（阴性对照）组的细胞生长曲线进行对比,我们发现,TWEAK过表达组细胞群在培育3天和5天时的生长速度明显加快。在培育24和48小时后,过表达组细胞的活力较对照组更强。无论初始培育的细胞数目是多少,TWEAK过表达组细胞形成的集落数目显着多于对照组。因此我们认为TWEAK过表达可以引起ARPE-19细胞的增殖和活力的增强。我们进一步研究了纤维化相关分子在两组细胞中的表达情况,结果显示,过表达组细胞中α-SMA,collagen I和collagen IV的蛋白表达水平显着高于对照组,并在细胞传代过程中表达稳定,提示TWEAK能提高纤维化相关分子在视网膜细胞中的表达。结论:在增殖性糖尿病视网膜病变病人的玻璃体中,TWEAK/Fn14通路表达上调。TWEAK/Fn14通过其相关机制推动PDR的病理发展过程。TWEAK/Fn14通路在视网膜ARPE-19细胞增殖和胶原合成中的发挥调节作用。
宁映霞[7]（2017）在《金雀异黄素阻断IL-8/STAT3轴抑制TAM诱导卵巢癌干样细胞特性研究》文中研究表明第一部分:SKOV3源性卵巢癌干样细胞和肿瘤相关巨噬细胞的制备与鉴别目的体外培养和扩增SKOV3源性卵巢癌干细胞样细胞（ovarian cancer stem-like cells,OCSLC,简称卵巢癌干样细胞）和THP-1源性肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages,TAM）,以利进行SKOV3源性OCSLC与THP-1源性TAM相互作用以及金雀异黄素干预作用机制的研究。方法用干细胞条件培养基超低粘附板悬浮培养法从建立人卵巢癌SKOV-3细胞系扩增球细胞,并通过比较SKOV-3细胞和SKOV-3细胞系第2代球细胞体外肿瘤球形成和琼脂集落形成能力、肿瘤干细胞标志物（CD133和CD44）蛋白表达以及裸鼠体内致瘤性,鉴别是否为SKOV3源性OCSLC。用佛波酯（PMA,100ng/ml）处理体外培养人单核细胞THP-1细胞48h,制备THP-1巨噬细胞。应用Transwell共培养细胞小室进行SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养,制备TAM细胞模型,并通过比较THP-1巨噬细胞和SKOV3源性OCSLC共培养THP-1巨噬细胞TAM标志物（CD68和CD163）蛋白表达、细胞因子（IL-8、IL-10、IL-12、IL-1β、VEGF、MMP-9）和NO产物浓度水平、鉴别SKOV3源性OCSLC共培养THP-1巨噬细胞是否为THP-1源性TAM。结果1.分散的原代SKOV3细胞系球细胞能够形成第2代球细胞,随后形成第3代和第4代球细胞;以SKOV3细胞系第2代球细胞在第3次球培养中得到的球形成效率最高（P<0.05）。2.与SKOV3细胞比较,SKOV3细胞系第2代球细胞具有更高肿瘤球形成率、琼脂集落形成率、肿瘤干细胞标志物CD133和CD44蛋白表达水平（P<0.05）。3.与SKOV3细胞比较,SKOV3源性OCSLC具有更强裸鼠体内致瘤性（P<0.05）。4.与THP-1巨噬细胞比较,SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养THP-1巨噬细胞CD163、p-STAT3和NF-κBp65蛋白高表达（P<0.05）;然而,两者的CD68蛋白表达差异无统计学意义。5.与SKOV3源性OCSLC条件培养基（OCSLC-CM）和THP-1巨噬细胞条件培养基（THP-1-CM）相比,SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养条件培养基（Co-CM）的IL-8、IL-10、VEGF、MMP-9更高,IL-12浓度和NO产物浓度水平降低（P<0.05）;然而,THP-1-CM和Co-CM的IL-1β浓度水平的差异无统计学意义。6.与THP-1-CM处理SKOV3细胞比较,Co-CM处理诱导SKOV3细胞肿瘤球形成、琼脂集落形成、CD133和CD44蛋白表达（P<0.05）。7.SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共注射促进SKOV3源性OCSLC裸鼠移植瘤生长（P<0.05）。小结1.SKOV3细胞系第2代球细胞具有OCSLC性质。2.SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养THP-1巨噬细胞具有TAM性质,并且SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共注射促进SKOV3源性OCSLC裸鼠移植瘤生长。第二部分:IL-8/STAT3参与TAM诱导SKOV3细胞OCSLC特性的作用目的研究SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养IL-8高分泌是否参与和促成SKOV3源性OCSLC与THP-1源性TAM相互作用诱导SKOV3细胞OCSLC特性的获得。方法采用蛋白质印迹、ELISA测定、肿瘤球形成和琼脂集落形成试验,分别检测在THP-1巨噬细胞条件培养基或干细胞条件培养基添加IL-8以及在SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养条件培养基免疫耗竭IL-8情况下THP-1巨噬细胞的TAM标志物（CD163）蛋白表达、细胞因子（IL-10和IL-12）和NO产物浓度水平以及SKOV3细胞肿瘤球形成率、琼脂集落形成率、肿瘤干细胞标志物CD133和CD44蛋白表达水平;以确定SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导THP-1巨噬细胞M2极化和SKOV3细胞OCSLC特性获得作用是否依赖IL-8高分泌。结果1.添加IL-8的THP-1巨噬细胞条件培养基增高THP-1巨噬细胞CD163蛋白表达水平和IL-10浓度水平（P<0.05）;同时,抑制THP-1巨噬细胞IL-12分泌和NO产物生成（P<0.05）。2.添加IL-8的干细胞条件培养基诱导SKOV3细胞肿瘤球形成、琼脂集落形成、CD133和CD44蛋白表达。3.添加IL-8的THP-1巨噬细胞条件培养基上调THP-1巨噬细胞p-STAT3和NF-κBp65蛋白表达。4.免疫耗竭IL-8的SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养条件培养基降低THP-1巨噬细胞CD163蛋白表达水平和IL-10浓度水平（P<0.05）;同时,促进THP-1巨噬细胞IL-12分泌和NO产物生成（P<0.05）。5.免疫耗竭IL-8的SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养条件培养基抑制诱导SKOV3细胞肿瘤球形成、琼脂集落形成、CD133和CD44蛋白表达（P<0.05）。6.免疫耗竭IL-8的SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养条件培养基抑制THP-1巨噬细胞STAT3蛋白磷酸化和下调NF-κBp65蛋白表达（P<0.05）。小结SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导THP-1巨噬细胞M2极化和SKOV3细胞OCSLC特性获得依赖于IL-8高分泌。第三部分:金雀异黄素对SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导SKOV3细胞OCSLC特性的影响目的确定金雀异黄素抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导THP-1巨噬细胞M2极化和SKOV3细胞OCSLC特性获得作用。方法应用蛋白质印迹、ELISA测定、肿瘤球形成率测定和琼脂集落形成试验检测金雀异黄素（10.0、20.0和40.0μM）对SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导TAM M2极化表型和SKOV3细胞OCSLC特性作用以及p-STAT3和NF-κBp65蛋白表达水平的影响。结果1.金雀异黄素（10.0、20.0和40.0μM）以浓度依赖方式降低SKOV3源性OCSLC共培养THP-1巨噬细胞CD163蛋白表达水平和IL-10浓度水平（P<0.05）;同时,促进THP-1巨噬细胞IL-12分泌和NO产物生成（P<0.05）。2.金雀异黄素（10.0、20.0和40.0μM）抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导SKOV3细胞肿瘤球形成、琼脂集落形成、CD133和CD44蛋白表达,呈浓度依赖性（P<0.05）。3.金雀异黄素（10.0、20.0和40.0μM）抑制SKOV3源性OCSLC共培养THP-1巨噬细胞STAT3蛋白磷酸化和NF-κBp65蛋白表达（P<0.05）。小结金雀异黄素具有抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导THP-1巨噬细胞M2极化和SKOV3细胞OCSLC特性获得作用。第四部分:金雀异黄素可能通过阻断IL-8/STAT3轴抑制TAM诱导卵巢癌干样细胞的特性目的阐释金雀异黄素通过阻断IL-8/STAT3信号轴抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导THP-1巨噬细胞M2极化和SKOV3细胞OCSLC特性获得作用机制。方法金雀异黄素联合IL-8添加或IL-8免疫耗竭探讨其是否通过抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养IL-8分泌抑制THP-1巨噬细胞M2极化表型、p-STAT3和NF-κBp65蛋白表达及抑制SKOV3细胞OCSLC特性。利用腺病毒基因递送系统沉默或过表达THP-1巨噬细胞STAT3基因技术手段研究金雀异黄素通过抑制THP-1巨噬细胞STAT3活性抑制SKOV3源性OCSLC共培养诱导THP-1巨噬细胞M2极化表型和SKOV3细胞OCSLC特性作用。应用裸鼠SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞皮下共注射治疗实验模型,评价金雀异黄素灌胃给药联合表达STAT3 sh RNA腺病毒瘤内注射治疗SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共注射裸鼠移植瘤的体内有效性。结果1.添加10 ng/ml IL-8能有效拮抗金雀异黄素（10μM）抑制SKOV3源性OCSCLCs共培养诱导THP-1巨噬细胞CD163蛋白表达和IL-10分泌（P<0.05）和促进THP-1巨噬细胞IL-12分泌和NO产物生成作用（P<0.05）。2.添加10 ng/ml IL-8能有效拮抗金雀异黄素（10μM）抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导SKOV3细胞肿瘤球形成、琼脂集落形成、CD133和CD44蛋白表达作用（P<0.05）。3.添加10 ng/ml IL-8能有效拮抗金雀异黄素（10μM）抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养的THP-1巨噬细胞STAT3蛋白磷酸化和NF-κBp65蛋白表达（P<0.05）。4.IL-8免疫耗竭协作金雀异黄素（10.0μM）抑制SKOV3源性OCSCLCs共培养诱导THP-1巨噬细胞CD163蛋白表达和IL-10分泌（P<0.05）和促进THP-1巨噬细胞IL-12分泌和NO产物生成作用（P<0.05）。5.IL-8免疫耗竭协作金雀异黄素（10.0μM）抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导SKOV3细胞肿瘤球形成、琼脂集落形成、CD133和CD44蛋白表达作用（P<0.05）。6.IL-8免疫耗竭协作金雀异黄素（10.0μM）抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养的THP-1巨噬细胞STAT3蛋白磷酸化和NF-κBp65蛋白表达（P<0.05）。7.STAT3 sh RNA协作金雀异黄素（10.0μM）抑制SKOV3源性OCSCLCs共培养诱导THP-1巨噬细胞CD163蛋白表达和IL-10分泌（P<0.05）和促进THP-1巨噬细胞IL-12分泌和NO产物生成作用（P<0.05）。8.STAT3 sh RNA协作金雀异黄素（10.0μM）抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导SKOV3细胞肿瘤球形成、琼脂集落形成、CD133和CD44蛋白表达作用（P<0.05）。9.STAT3 sh RNA协作金雀异黄素（10.0μM）抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养的THP-1巨噬细胞STAT3蛋白磷酸化和NF-κBp65蛋白表达（P<0.05）。10.STAT3基因转导拮抗金雀异黄素（10.0μM）抑制SKOV3源性OCSCLC共培养诱导THP-1巨噬细胞CD163蛋白表达和IL-10分泌（P<0.05）和促进THP-1巨噬细胞IL-12分泌和NO产物生成作用（P<0.05）。11.STAT3基因转导拮抗金雀异黄素（10.0μM）抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导SKOV3细胞肿瘤球形成、琼脂集落形成、CD133和CD44蛋白表达作用（P<0.05）。12.STAT3基因转导拮抗金雀异黄素（10.0μM）抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养的THP-1巨噬细胞STAT3蛋白磷酸化和NF-κBp65蛋白表达（P<0.05）。13.STAT3基因转导对抗金雀异黄素（10.0μM）联合STAT3 sh RNA抑制SKOV3源性OCSCLC共培养诱导THP-1巨噬细胞CD163蛋白表达和IL-10分泌（P<0.05）和促进THP-1巨噬细胞IL-12分泌和NO产物生成作用（P<0.05）。14.STAT3基因转导对抗金雀异黄素（10.0μM）联合STAT3 sh RNA抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导SKOV3细胞肿瘤球形成、琼脂集落形成、CD133和CD44蛋白表达作用（P<0.05）。15.STAT3基因转导对抗金雀异黄素（10.0μM）联合STAT3 sh RNA抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养的THP-1巨噬细胞STAT3蛋白磷酸化和NF-κBp65蛋白表达（P<0.05）。16.金雀异黄素和STAT3 sh RNA协作抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共注射裸鼠移植瘤生长（P<0.05）。小结金雀异黄素通过阻断IL-8/STAT3信号轴抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导THP-1巨噬细胞M2极化和SKOV3细胞OCSLC特性获得。结论1.IL-8/STAT3信号轴活化促成SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导THP-1巨噬细胞M2极化和SKOV3细胞OCSLC特性。2.金雀异黄素具有抑制SKOV3源性OCSLC/THP-1巨噬细胞共培养诱导THP-1巨噬细胞M2极化和SKOV3细胞OCSLC特性作用。3.金雀异黄素通过阻断SKOV3源性OCSLC共培养THP-1巨噬细胞IL-8/STAT3信号轴抑制THP-1巨噬细胞M2极化和SKOV3细胞OCSLC特性。
单俊杰,袁志兰,曹国平[8]（2011）在《血清中VEGF和bFGF水平与糖尿病视网膜病变关系的临床研究》文中指出目的:探讨糖尿病视网膜病变患者血清中血管内皮细胞生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）水平与糖尿病视网膜病变的关系。方法:收集患有糖尿病视网膜病变白内障患者的血清样本,并以无糖尿病白内障患者的血清样本作为对照,用ELISA方法测定血清中bFGF,VEGF的含量。结果:对照组12例血清样本bFGF含量为（34.95±9.62）ng/L,VEGF含量为（150±20）μg/L;单纯型DR组中10例bFGF含量为（52.6±7.54）ng/L,VEGF含量为（330±50）μg/L;增生型DR组7例bFGF含量为（64.929±11.917）ng/L,VEGF含量为（580±50）μg/L。和对照组相比糖尿病患者血清中bFGF,VEGF的含量均显着增加（P<0.01）,并且随着DR病情的进展而增高（P<0.05）;血清中VEGF与bFGF之间呈正相关（r=0.419,P<0.01）。结论:VEGF,bFGF参与了DR的发生发展,并与DR后期新生血管形成关系密切。
王济[9]（2009）在《羟基红花黄色素A对异常增殖人脐静脉内皮细胞的抑制作用及其信号转导机制研究》文中认为肿瘤的生长是血管依赖性的。研究表明,至少有30种生长因子与肿瘤的血管生成有关,其中最直接的促血管生成因子是血管内皮细胞生长因子（VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。如何阻断肿瘤血管的生成已成为目前肿瘤研究领域的一个重要课题。在新血管的发生过程中,血管内皮细胞增殖是最基本和最重要的环节。由于肿瘤细胞和血管内皮细胞互相依赖介导了肿瘤血管新生。因此,血管内皮细胞与肿瘤细胞的共培养模型是研究体外肿瘤血管新生的重要方法。中医理论认为“血瘀证”为肿瘤的基本证型,活血化瘀法在抗肿瘤的研究中占有重要地位。红花是传统的活血化瘀类中药,临床上用于治疗多种恶性肿瘤,但其作用机制鲜见相关报道。经基红花黄色素A（HSYA）是红花的主要有效成分,目前对于HSYA抑制肿瘤新生血管形成的作用,国内外尚未见报道。本研究通过前期实验,首次从十余味活血化瘀中药或中药有效组分中,筛选出HSYA,能显着抑制鸡胚尿囊膜（CAM）新生血管的生成。为进一步探讨HSYA对肿瘤上清液培养环境下血管内皮细胞的作用情况及作用机理,本研究建立了肿瘤细胞上清液刺激下异常增殖人脐静脉内皮细胞（HUVEC）模型,目的是探讨活血化瘀中药红花的有效成分羟基红花黄色素A（HSYA）对肿瘤上清液诱导的人脐静脉内皮细胞增殖、凋亡及血管生成相关因子及受体表达的影响,以及对癌基因、抑癌基因表达的影响并探讨其信号转导机制。实验共分为五个部分:1、原代培养人脐静脉内皮细胞,传代至3—5代进行实验。以MTT法检测不同浓度肿瘤上清液在不同时间点刺激后内皮细胞的增殖情况。选择最佳最佳浓度、最佳时间点进一步实验。然后以不同浓度羟基红花黄色素A作用于肿瘤上清液刺激后的HUVEC,MTT法检测HSYA对肿瘤上清液刺激后内皮细胞增殖的抑制作用,并从中选择最佳浓度的羟基红花黄色素A。2、设立三个实验组:正常组、肿瘤上清刺激组和加HSYA组。流式细胞术检测各组细胞周期和凋亡情况,并分别以real-time PCR和ELISA法检测凋亡相关细胞因子TNF-α的mRNA和蛋白表达情况。3、以real-time PCR和ELISA法检测与血管生成有关的细胞因子VEGF及其受体KDR,bFGF及其受体bFGFR的mRNA和蛋白表达情况。4、以western blotting法检测HUVEC MAPK通路信号转导分子ras、c-Raf、ERK、p38 MAPK、Akt等的表达。5、以real-time PCR和ELISA法检测癌基因N-ras、c-myc和转录因子NFκB表达情况。实验结果如下:1、人脐静脉内皮细胞生长状态良好,以3-5代状态最佳。50%以上的HepG2肿瘤上清液对HUVEC增殖具有较好的刺激效果,且在加药培养24小时后达到最佳效果。终浓度为0.0037g/L的羟基红花黄色素A是抑制肿瘤上清液刺激后HUVEC增殖的最佳浓度。2、HUVEC经肿瘤上清液刺激后G0/G1期细胞比例明显减少（P＜0.05）,S期细胞的比例明显增加（P＜0.01）,凋亡细胞比例明显减少（P＜0.05）;经HSYA作用后,G0/G1期细胞比例增加,S期细胞比例减少,差异不显着。凋亡细胞明显增多（P＜0.05）。同时,凋亡相关细胞因子TNF-α的mRNA和蛋白表达在肿瘤上清液刺激组明显增加（P＜0.05）,HSYA组明显减少（P＜0.05）。3、血管生成相关因子表达情况:HUVEC的VEGF及其受体KDR表达经肿瘤上清液刺激后可以明显增加（P＜0.01）,经HSYA作用后VEGF表达明显降低（P＜0.05）,KDR蛋白表达明显减少（P＜0.01）,mRNA表达有减少趋势,差异不显着;bFGF及其受体bFGFR表达经肿瘤上清液刺激后明显增加（P＜0.05）,经HSYA作用后有所降低,但差异不显着（P＞0.05）。4、信号转导通路相关因子表达情况:肿瘤上清液刺激组与对照组相比较,Ras、p-raf、p-ERK、p-p38MAPK表达增加;HSYA作用后,以上信号转导分子表达减少。而总raf、总ERK、总p38MAPK和Akt在三组之间变化不明显。4、癌基因和转录因子表达情况:HUVEC经肿瘤上清液刺激后癌基因c-myc、N-ras和转录因子NFκB表达明显增加（P＜0.05）;HSYA作用后,c-myc、N-ras、NFκB表达明显减少（P＜0.05）。分析实验结果,得出如下结论:1、HSYA可以有效抑制肿瘤上清液刺激后的人脐静脉内皮细胞增殖,促进其凋亡。2、HSYA可以明显抑制血管生成相关因子VEGF及其受体KDR的表达,并在一定程度上抑制bFGF及其受体的表达。3、HSYA可以明显抑制异常增殖HUVEC MAPK家族的Ras、Raf、磷酸化ERK、磷酸化p38MAPK表达,对其总蛋白以及Akt表达影响不明显。4、HSYA可以明显抑制异常增殖HUVEC癌基因c-myc、N-ras和转录因子NFκB的表达。综上所述,羟基红花黄色素A可以有效抑制肿瘤上清液刺激后的人脐静脉内皮细胞增殖,促进其凋亡。可以明显抑制血管生成相关因子VEGF及其受体KDR的表达,并在一定程度上抑制bFGF及其受体的表达,通过受体酪氨酸激酶信号转导通路,经MAPK家族的Ras→Raf→MEK→ERK途径进行胞内信号转导,最终通过抑制癌基因和转录因子表达实现抑制肿瘤上清液诱导的血管内皮细胞异常增殖的作用,从而抑制肿瘤新生血管的形成。本研究的结果对于进一步阐明红花活血化瘀作用机制,开发HSYA新的药理作用提供了一定的理论和实验依据。
游江,姜德咏[10]（2008）在《金雀异黄素对外伤性增生性玻璃体视网膜病变中bFGF和PCNA表达的抑制》文中研究指明目的探讨金雀异黄素对兔外伤性增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy,PVR）视网膜组织碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）mRNA和增殖细胞核抗原（proliferating cell nu-clear antigen,PCNA）表达的影响。方法建立外伤性PVR兔模型,分为模型对照组及金雀异黄素治疗组。每组于制模后7、14、21、28d分别将2只模型兔眼球取出制作标本,采用原位杂交法检测视网膜组织bFGF mRNA表达,采用免疫组织化学法检测PCNA表达。结果①外伤性PVR视网膜组织bFGF mRNA和PCNA表达呈现先升高后降低的动态变化,14d时达到峰值;②金雀异黄素治疗组在7、14、21、28d时视网膜组织bFGFmRNA和PCNA表达均明显低于模型对照组,差异均有显着性意义（均P<0.05）。结论金雀异黄素能抑制外伤性PVR视网膜组织bFGF mRNA和PCNA表达,具有防治外伤性PVR的潜能。
二、金雀异黄素对缺氧诱导的人ARPE-19细胞内碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达的影响(英文)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、金雀异黄素对缺氧诱导的人ARPE-19细胞内碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达的影响(英文)（论文提纲范文）
（1）多功能纳米脂质体运载塞来昔布和金雀异黄素联合抑制前列腺癌细胞增殖的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 前列腺癌的流行病学及治疗现状 |
| 1.1.1 前列腺癌的流行病学 |
| 1.1.2 前列腺癌的治疗现状 |
| 1.1.3 去势抵抗性前列腺癌的定义 |
| 1.1.4 CRPC治疗方法和缺陷 |
| 1.2 针对CRPC的筛选药物和给药方案 |
| 1.2.1 塞来昔布 |
| 1.2.2 金雀异黄素 |
| 1.2.3 葡萄糖转运蛋白-1 |
| 1.2.4 金雀异黄素对葡萄糖转运蛋白-1 的作用 |
| 1.3 给药方案——纳米脂质体 |
| 1.3.1 纳米脂质体概述 |
| 1.3.2 纳米递药系统分类 |
| 1.3.3 纳米脂质体的功能分类 |
| 1.3.4 纳米脂质体的制备方法 |
| 1.3.5 纳米脂质体制备方法的选择原则 |
| 1.3.6 纳米脂质体特征参数 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 COX2与GLUT1 在前列腺癌中的表达 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.1.1 实验试剂 |
| 2.1.1.2 实验仪器 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.1.3 统计方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 COX2和GLUT1 m RNA在前列腺癌组织中的转录 |
| 2.2.2 COX2和GLUT1 蛋白在前列腺癌组织中的表达 |
| 2.3 讨论 |
| 第3章 塞来昔布和金雀异黄素纳米脂质体的制备 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 试剂与耗材 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 含有塞来昔布和金雀异黄素及空白脂质体的制备 |
| 3.2.2 脂质体的理化特性 |
| 3.2.3 药物包封和释放动力学 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 包封塞来昔布和金雀异黄素的纳米脂质体的形态与大小 |
| 3.3.2 纳米脂质体在溶质中的液体动力学直径和电位 |
| 3.3.3 纳米脂质体的释放动力学 |
| 3.3.4 纳米脂质体的包封率 |
| 3.4 讨论 |
| 第4章 塞来昔布和金雀异黄素纳米脂质体抑制前列腺癌细胞增殖的实验研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 试剂与耗材 |
| 4.1.2 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 前列腺癌细胞活力的测定 |
| 4.2.2 细胞迁移能力测定 |
| 4.2.3 ROS产生测定 |
| 4.2.4 谷胱甘肽测定 |
| 4.2.5 葡萄糖摄取测定 |
| 4.2.6 Western blotting |
| 4.2.7 实时聚合酶链反应(RT-PCR) |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 药物脂质体对COX2和GLUT1 基因转录的影响 |
| 4.3.2 药物脂质体对COX2和GLUT1 蛋白表达的影响 |
| 4.3.3 药物脂质体对前列腺癌细胞及成纤维细胞活力的抑制作用 |
| 4.3.4 药物脂质体对前列腺癌细胞迁移能力的抑制作用 |
| 4.3.5 药物脂质体对细胞中ROS水平的影响 |
| 4.3.6 药物脂质体对细胞中GSH的影响 |
| 4.3.7 药物脂质体对PC-3及LNCaP细胞葡萄糖摄取量的影响 |
| 4.3.8 药物脂质体对前列腺癌细胞氧化应激反应相关蛋白基因转录的影响 |
| 4.3.9 药物脂质体对前列腺癌细胞氧化应激反应相关蛋白表达的影响 |
| 4.3.10 药物脂质体对前列腺癌细胞凋亡相关蛋白基因转录的影响 |
| 4.3.11 药物脂质体对前列腺癌细胞凋亡相关蛋白表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 包封塞来昔布和金雀异黄素的纳米脂质体对前列腺癌细胞及成纤维细胞的毒性分析 |
| 4.4.2 包封塞来昔布和金雀异黄素的纳米脂质体对前列腺癌细胞转移能力的抑制作用 |
| 4.4.3 包封塞来昔布和金雀异黄素的纳米脂质体对前列腺癌细胞氧化应激反应的研究 |
| 4.4.4 监测包封塞来昔布和金雀异黄素的纳米脂质体抑制前列腺癌细胞生长的关键信号传导途径的表达 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（2）姜黄素抑制实验性脉络膜新生血管的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 引言 |
| 第一章 532nm倍频激光诱导BN大鼠脉络膜新生血管模型的建立 |
| 1. 实验动物、仪器、耗材与试剂 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器及耗材 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 实验分组 |
| 2.2 532nm倍频激光建立CNV模型 |
| 2.3 眼底照相、FFA及ICGA观察CNV变化 |
| 2.4 制备病理学标本 |
| 2.5 HE染色 |
| 2.6 免疫组织化学检测 |
| 3. 图像分析与统计学方法 |
| 3.1 眼底照、FFA及ICGA图像 |
| 3.2 HE染色图像 |
| 3.3 免疫组化图像 |
| 3.4 统计学方法 |
| 4. 结果 |
| 4.1 眼底照、FFA与ICGA结果 |
| 4.2 HE染色结果 |
| 4.3 CD105免疫组化结果 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 CNV模型建立的方法 |
| 5.2 532nm倍频激光诱导BN大鼠建立实验性CNV模型的机制 |
| 5.3 532nm倍频激光诱导BN大鼠CNV模型的评价 |
| 6. 结论 |
| 第二章 姜黄素通过AKT/p-AKT/HIF-1α/VEGF信号通路抑制BN大鼠CNV的实验研究 |
| 1. 实验动物、仪器、耗材与试剂 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 实验仪器与耗材 |
| 1.3 实验试剂 |
| 2. 实验方法 |
| 2.0 实验药物配制 |
| 2.1 实验分组及给药 |
| 2.2 532nm倍频激光建立实验性CNV模型 |
| 2.3 眼底照相、FFA及ICGA观察CNV变化 |
| 2.4 病理学标本制备 |
| 2.5 HE染色 |
| 2.6 免疫组织化学检测 |
| 2.7 RT-qPCR检测mRNA表达 |
| 2.8 Westernblot检测蛋白表达 |
| 3. 图像分析与统计学方法 |
| 3.1 眼底照、FFA与ICGA图像 |
| 3.2 HE染色图像 |
| 3.3 免疫组化图像 |
| 3.4 RT-qPCR结果分析 |
| 3.5 Westernblot结果分析 |
| 3.6 统计学方法 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 眼底照、FFA与ICGA结果 |
| 4.2 HE染色结果 |
| 4.3 免疫组化结果 |
| 4.4 RT-qPCR结果 |
| 4.5 Westernblot结果 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 新生血管与中药单体 |
| 5.2 姜黄与姜黄素 |
| 5.3 姜黄素与眼部新生血管 |
| 5.4 CNV的中医认识 |
| 5.5 姜黄素抑制CNV的机制 |
| 6. 结论 |
| 第三章 姜黄素对CoCl_2诱导的ARPE-19细胞缺氧模型中AKT、HIF-1α和VEGF因子的影响 |
| 1. 实验细胞、试剂、药物及仪器 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验药物及溶液的配制 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 ARPE-19细胞复苏、传代与冻存 |
| 2.2 造模试剂CoCl_2、实验药物姜黄素及阳性对照药雷珠单抗浓度的筛选 |
| 2.3 实验分组与干预 |
| 2.4 CCK-8法检测实验各组ARPE-19细胞的活性 |
| 2.5 RT-qPCR检测 |
| 2.6 Westernblot检测 |
| 3. 结果分析与统计学方法 |
| 3.1 CCK-8检测细胞活性结果分析 |
| 3.2 RT-qPCR结果分析 |
| 3.3 Westernblot结果分析 |
| 3.4 统计学方法 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 正常ARPE-19细胞形态 |
| 4.2 CoCl_2对ARPE-19细胞活性的影响 |
| 4.3 姜黄素对ARPE-19细胞活性的影响 |
| 4.4 雷珠单抗对CoCl_2诱导的ARPE-19细胞活性的影响 |
| 4.5 RT-qPCR结果 |
| 4.6 Westernblot结果 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 细胞缺氧模型的建立 |
| 5.2 CoCl_2诱导ARPE-19细胞缺氧模型的机制 |
| 5.3 姜黄素对CoCl_2诱导ARPE-19细胞缺氧的保护作用 |
| 6. 结论 |
| 第四章 非接触共培养体系观察ARPE-19细胞姜黄素的条件培养液对HUVEC细胞形态学的影响 |
| 1. 实验细胞、药物、试剂及仪器 |
| 1.1 实验细胞 |
| 1.2 实验试剂 |
| 1.3 实验试剂的配制 |
| 1.4 实验仪器 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 HUVEC细胞株复苏培养、传代与冻存 |
| 2.2 CCK-8检测 |
| 2.3 划痕实验检测细胞水平迁移 |
| 2.4 Transwell小室法检测细胞垂直迁移 |
| 2.5 Transwell小室法检测细胞侵袭 |
| 2.6 Matrigel基质胶法检测细胞管腔形成 |
| 3. 统计学方法 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 正常HUVEC细胞形态 |
| 4.2 CCK-8结果 |
| 4.3 划痕实验细胞水平迁移结果 |
| 4.4 Transwell小室实验细胞垂直迁移结果 |
| 4.5 Transwell小室实验细胞侵袭结果 |
| 4.6 Matrigel基质胶实验细胞管腔形成结果 |
| 5. 讨论 |
| 5.1 细胞迁移 |
| 5.2 细胞侵袭 |
| 5.3 细胞管腔形成 |
| 6. 结论 |
| 参考文献 |
| 创新性 |
| 不足与展望 |
| 综述一 脉络膜新生血管的发病机制及中西医治疗的研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 姜黄素在眼科疾病的研究进展 |
| 参考文献 |
| 研究生期间学术表现 |
| 致谢 |
| 附: 查新报告 |
（3）从缺氧-VEGF途径探讨止血化瘀利水方防治视网膜静脉阻塞黄斑水肿的作用机理（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 视网膜静脉阻塞中VEGF及其缺氧相关因子调节机制的研究进展 |
| 浅谈止血化瘀利水方防治视网膜静脉阻塞 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 实验一 体外细胞实验:止血化瘀利水方对缺氧诱导ARPE-19细胞VEGF及其相关因子表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物与细胞 |
| 1.2 药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 CoCl_2诱导ARPE-19细胞缺氧模型及细胞分组 |
| 2.2 ELISA法检测细胞上清液中VEGF的蛋白浓度 |
| 2.3 Western-blot法检测HIF-1α、NF-KB p65的蛋白表达 |
| 2.4 Realtime-RT-PCR检测VEGFmRNA、HIF-1αmRNA的表达 |
| 3 统计分析方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 模型建立情况-CCK-8法检测细胞增殖活性 |
| 4.2 ELISA检测结果 |
| 4.3 Western-blot检测结果 |
| 4.4 Realtime-RT-PCR检测结果 |
| 5 讨论与小结 |
| 实验二 体内动物实验: 止血化瘀利水方对兔视网膜静脉阻塞VEGF及其相关因子表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 药物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 主要仪器 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 光化学法诱导RVO兔模型及动物分组 |
| 2.2 免疫组化检测VEGF、HIF-1α、NF-KB p65的蛋白分布 |
| 2.3 Western-blot检测VEGF、HIF-Iα、NF-KB p65的蛋白表达 |
| 2.4 Realtime-RT-PCR检测VEGFmRNA、HIF-1αmRNA的表达 |
| 3 统计分析方法 |
| 4 实验结果 |
| 4.1 模型建立情况-眼底彩照与FFA检查结果 |
| 4.2 免疫组化检测结果 |
| 4.3 Western-blot检测结果 |
| 4.4 Realtime-RT-PCR检测VEGFmRNA、HIF-1αmRNA的表达 |
| 5 讨论与小结 |
| 论文总结 |
| 1.研究小结 |
| 2.课题意义及创新点 |
| 3.问题与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）DFMG调节TLR4/VEGF-A抗宫颈癌血管新生的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 第一部分 DFMG对宫颈癌血管新生的影响 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.1.1 细胞系 |
| 1.1.2 药品和试剂 |
| 1.1.3 仪器和设备 |
| 1.1.4 试剂的配制 |
| 1.1.5 抗体 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 细胞培养 |
| 1.2.2 CCK-8试剂盒检测细胞活力 |
| 1.2.3 Matrigel基质胶小管形成实验 |
| 1.2.4 细胞划痕实验 |
| 1.2.5 鸡胚绒毛尿囊膜(Chick embryo chorioallantoic membrane,CAM)血管形成实验 |
| 1.2.6 酶联免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay,ELISA) |
| 1.2.7 蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB) |
| 1.2.8 统计学分析 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.3.1 不同浓度的DFMG对细胞活力的影响 |
| 1.3.2 宫颈癌Siha细胞上清液对Matrigel基质胶小管形成的影响 |
| 1.3.3 宫颈癌Siha细胞上清液对HUVE-12 细胞迁移能力的影响 |
| 1.3.4 宫颈癌Siha细胞上清液对CAM膜血管形成的影响 |
| 1.3.5 DFMG对宫颈癌Siha细胞VEGF-A蛋白分泌的影响 |
| 1.3.6 DFMG对宫颈癌Siha细胞VEGF-A蛋白表达的影响 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二部分 TLR4/VEGF-A路径对宫颈癌血管新生的影响 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 药品和试剂 |
| 2.1.3 仪器设备 |
| 2.1.4 试剂的配置 |
| 2.1.5 慢病毒载体与小干扰RNA靶序列 |
| 2.1.6 引物 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 TLR4 基因过表达慢病毒稳定转染宫颈癌Siha细胞 |
| 2.2.3 TLR4 基因小干扰RNA(Si RNA)瞬时转染宫颈癌Siha细胞 |
| 2.2.4 蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB) |
| 2.2.5 实时定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR) |
| 2.2.6 实验分组 |
| 2.2.7 Matrigel基质胶小管形成实验 |
| 2.2.8 细胞划痕实验 |
| 2.2.9 鸡胚绒毛尿囊膜(Chick embryo chorioallantoic membrane,CAM)血管形成实验 |
| 2.2.10 统计学方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 TLR4 基因过表达慢病毒和小干扰RNA(Si RNA)分别转染宫颈癌Siha细胞的验证 |
| 2.3.2 干预TLR4/VEGF-A后宫颈癌Siha细胞上清液对Matrigel基质胶小管形成的影响 |
| 2.3.3 干预TLR4/VEGF-A后宫颈癌Siha细胞上清液对HUVE-12细胞迁移的影响 |
| 2.3.4 干预TLR4/VEGF-A后宫颈癌Siha细胞上清液对CAM膜血管形成的影响 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三部分 DFMG干预TLRE/VEGF-A对宫颈癌血管新生的影响 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 细胞系 |
| 3.1.2 药品和试剂 |
| 3.1.3 仪器和设备 |
| 3.1.4 试剂的配置 |
| 3.1.5 抗体 |
| 3.1.6 引物 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 细胞培养 |
| 3.2.2 实验分组 |
| 3.2.3 Matrigel基质胶小管形成实验 |
| 3.2.4 细胞划痕实验 |
| 3.2.5 鸡胚绒毛尿囊膜(Chick embryo chorioallantoic membrane,CAM)血管形成实验 |
| 3.2.6 酶联免疫吸附剂测定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay,ELISA) |
| 3.2.7 蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB) |
| 3.2.8 实时定量聚合酶链反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR) |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 DFMG干预TLR4/VEGF-A后宫颈癌Siha细胞上清液对Matrigel基质胶小管形成的影响 |
| 3.3.2 DFMG干预TLR4/VEGF-A后宫颈癌Siha细胞上清液对HUEV-12细胞迁移的影响 |
| 3.3.3 DFMG干预TLR4/VEGF-A后宫颈癌Siha细胞上清液对CAM膜血管形成的影响 |
| 3.3.4 DFMG干预TLR4/VEGF-A对宫颈癌Siha细胞VEGF-A蛋白分泌的影响 |
| 3.3.5 DFMG干预TLR4/VEGF-A对宫颈癌Siha细胞TLR4、VEGF-A蛋白表达的影响 |
| 3.3.6 DFMG干预TLR4/VEGF-A对宫颈癌Siha细胞TLR4、VEGF-A m RNA表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间主要成果 |
| 致谢 |
（5）PI3Kδ在PVR中的作用机制及视网膜病变治疗新途径研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩写表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 PVR和 PDR简介 |
| 1.1.1 增殖性玻璃体视网膜病变(PVR) |
| 1.1.2 增殖性糖尿病型视网膜病变(PDR) |
| 1.1.3 PVR和 PDR临床治疗策略 |
| 1.2 CRISPR-Cas9 基因编辑技术 |
| 1.2.1 CRISPR-Cas9 作用原理 |
| 1.2.2 CRISPR-Cas9 在基因治疗中的应用 |
| 1.3 上皮间充质转化(EMT) |
| 1.3.1 EMT发生过程 |
| 1.3.2 EMT调控网络 |
| 1.3.3 EMT在眼科疾病中的信号调控 |
| 1.4 Capilliposide B和 Chalcomoracin天然化合物简介 |
| 1.5 本文的研究内容与意义 |
| 2 磷酸肌醇3 激酶δ在PVR模型中调控视网膜色素上皮细胞增殖迁移的作用机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 材料和实验试剂 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 细胞培养 |
| 2.2.4 SgRNA设计与目标基因载体克隆 |
| 2.2.5 慢病毒的包装 |
| 2.2.6 p110δ的重新表达 |
| 2.2.7 Western Blotting |
| 2.2.8 免疫荧光 |
| 2.2.9 MTT法 |
| 2.2.10 细胞增殖试验 |
| 2.2.11 细胞迁移试验 |
| 2.2.12 胶原收缩试验 |
| 2.2.13 统计分析 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 PI3Kδ在 RPE中高度表达 |
| 2.3.2 CRIS PR/Cas9 建立p110δ敲减细胞系 |
| 2.3.3 P110δ敲减可减轻玻璃体诱导的AKT和 MDM2 的激活以及p53 的抑制 |
| 2.3.4 P110δ的再表达恢复了玻璃体诱导的AKT和 MDM2 的激活和p53 的减少 |
| 2.3.5 PI3Kδ的化学抑制有效地阻止了玻璃体诱导的Akt和 Mdm2 的激活和 p53 的减少 |
| 2.3.6 PI3Kδ失活可防止玻璃体刺激的RPEs增殖 |
| 2.3.7 PI3Kδ的失活阻碍了玻璃体诱导的RPEs的迁移 |
| 2.3.8 PI3Kδ失活可消除玻璃体引起的RPE收缩 |
| 2.4 小结与讨论 |
| 3 基于CRISPR-Cas9基因编辑技术研究PI3Kδ信号转导环在PVR疾病中的关键作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 材料和实验试剂 |
| 3.2.2 实验仪器 |
| 3.2.3 细胞培养 |
| 3.2.4 DNA的构建 |
| 3.2.5 慢病毒包装 |
| 3.2.6 Western blotting |
| 3.2.7 免疫荧光检测 |
| 3.2.8 细胞迁移实验 |
| 3.2.9 荧光素酶测定-PI3Kδ报告基因 |
| 3.2.10 实验性PVR模型建立 |
| 3.2.11 统计分析 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 PI3Kδ失活阻止TGF-β2 诱导的Akt激活和 Mdm2和NF-κB/p65 的蛋白表达 |
| 3.3.2 PI3Kδ失活可防止TGF-β2诱导的EMT |
| 3.3.3 阻断Mdm2 可抑制TGF-β2 诱导的Akt激活,p110δ和NF-κB/p65 的表达和细胞EMT |
| 3.3.4 NF-κB/p65 的消耗减弱了TGF-β2 诱导的Akt激活,p110δ和 Mdm2 的表达以及抑制EMT |
| 3.3.5 PI3Kδ的失活阻止了TGF-β2 诱导的ARPE-19 细胞迁移 |
| 3.3.6 抑制PI3Kδ可防止实验性PVR |
| 3.4 小结与讨论 |
| 4 Chalcomoracin在预防治疗PVR疾病中的作用 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与方法 |
| 4.2.1 材料与实验试剂 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.2.3 细胞培养 |
| 4.2.4 Western blotting |
| 4.2.5 细胞活力测定 |
| 4.2.6 形态学观察 |
| 4.2.7 细胞增殖测定 |
| 4.2.8 细胞迁移测定 |
| 4.2.9 胶原蛋白收缩测定 |
| 4.2.10 统计分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 玻璃体诱导ARPE-19 细胞中AKT的活化并抑制p53 的表达 |
| 4.3.2 CMR可阻止玻璃体诱导的AKT激活和p53 的降低 |
| 4.3.3 CMR预防玻璃体引起的ARPE-19 增殖 |
| 4.3.4 CMR阻断玻璃体诱导的ARPE-19 迁移 |
| 4.3.5 CMR阻滞玻璃体引起的ARPE-19 收缩 |
| 4.4 小结与讨论 |
| 5 Capilliposide B在预防治疗PDR疾病中的作用 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 材料与实验试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 细胞培养 |
| 5.2.4 免疫荧光 |
| 5.2.5 Western blot |
| 5.2.6 细胞活力测定 |
| 5.2.7 形态学观察 |
| 5.2.8 细胞迁移测定 |
| 5.2.9 Tube formation实验 |
| 5.2.10 统计分析 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 CPS-B阻止VEGF诱导的VEGFR2 信号转导 |
| 5.3.2 CPS-B可阻止VEGF诱导的HREC增殖 |
| 5.3.3 CPS-B阻断VEGF诱导的HREC迁移 |
| 5.3.4 CPS-B阻断VEGF诱导的HRECs管形成 |
| 5.4 小结与讨论 |
| 6 全文总结 |
| 6.1 总结 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 不足之处与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（6）TWEAK与增殖性糖尿病视网膜病变相关性及促细胞增殖作用的研究（论文提纲范文）
| 序 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词 |
| 第1章 引言 |
| 第2章 综述 |
| 2.1 增殖性糖尿病视网膜病变的研究 |
| 2.1.1 患病率 |
| 2.1.2 危险因素 |
| 2.1.3 病理改变 |
| 2.1.4 发病机制 |
| 2.2 TWEAK及其受体Fn14的研究 |
| 2.2.1 结构特点 |
| 2.2.2 TWEAK及其受体Fnl4的生物学活性 |
| 2.2.3 TWEAK／Fn14和各组织器官之间的关系 |
| 第3章 实验部分 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 玻璃体样本 |
| 3.1.2 ARPE-19 细胞 |
| 3.1.3 293T细胞 |
| 3.1.4 主要试剂和试剂盒 |
| 3.1.5 其他试剂盒 |
| 3.1.6 其他试剂 |
| 3.1.7 相关仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 玻璃体样本的获取 |
| 3.2.2 ELISA法检测玻璃体液中TWEAK和Fn14含量 |
| 3.2.3 Westernblot法分析玻璃体液中TWEAK和Fn14的表达 |
| 3.2.4 ARPE-19 细胞的复苏、培养和传代 |
| 3.2.5 TWEAK在ARPE-19 细胞过表达 |
| 3.2.6 Westernblot法分析过表达ARPE-19 细胞TWEAK的蛋白表达量 |
| 3.2.7 细胞计数检测，MTT检测和群落形成检测 |
| 3.2.8 Westernblot分析过表达ARPE-19 细胞 α-SMA, collagen I, 和collagen IV的蛋白量 |
| 3.3 统计和分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 玻璃体样本病人的临床特征 |
| 3.4.2 PDR病人玻璃体液中TWEAK和Fn14含量的变化 |
| 3.4.3 PDR病人玻璃体液中TWEAK和Fn14的蛋白表达水平的变化 |
| 3.4.4 构建一个TWEAK过表达的ARPE-19 细胞系 |
| 3.4.5 TWEAK过表达促进了细胞增殖和胶原在视网膜细胞中的合成 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 玻璃体样本的采集 |
| 4.2 TWEAK在PDR病人玻璃体液中的表达变化 |
| 4.3 Fn14在PDR病人玻璃体液中的表达变化 |
| 4.4 TWEAK在ARPE-19 细胞系中的过表达 |
| 4.5 TWEAK过表达促进了ARPE-19 细胞增殖 |
| 4.6 TWEAK过表达促进了ARPE -19 细胞中胶原的合成 |
| 4.7 问题与展望 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（7）金雀异黄素阻断IL-8/STAT3轴抑制TAM诱导卵巢癌干样细胞特性研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 引言 |
| 1.1 卵巢上皮癌的特征 |
| 1.2 关于卵巢癌干样细胞 |
| 1.3 关于TAM促进肿瘤演进的认识 |
| 1.4 关于IL-8/STAT3信号轴 |
| 1.5 关于金雀异黄素 |
| 1.6 实验研究的主要目标 |
| 1.7 参考文献 |
| 2 第一部分 SKOV3源性卵巢癌干样细胞和肿瘤相关巨噬细胞的制备与鉴别 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 2.6 参考文献 |
| 3 第二部分 IL-8/STAT3参与TAM诱导SKOV3细胞OCSLC特性的作用 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.3 结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 3.6 参考文献 |
| 4 第三部分 金雀异黄素对SKOV3源性OCSLC/THP-1 巨噬细胞共培养诱导SKOV3细胞OCSLC特性的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.3 结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 4.6 参考文献 |
| 5 第四部分 金雀异黄素可能通过阻断IL-8/STAT3轴抑制TAM诱导卵巢癌干样细胞的特性 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 5.6 参考文献 |
| 全文小结 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 附录（Ⅰ）缩略词（A-Z） |
| 附录（Ⅱ）综述 STAT3 转录因子在肿瘤干细胞龛中的作用 |
| 参考文献 |
| 在学期间发表论文清单 |
| 致谢 |
（8）血清中VEGF和bFGF水平与糖尿病视网膜病变关系的临床研究（论文提纲范文）
| 0 引言 |
| 1 对象和方法 |
| 1.1 对象 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 标本采集 |
| 1.2.2 ELISA法测定前房液中b FGF含量 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
（9）羟基红花黄色素A对异常增殖人脐静脉内皮细胞的抑制作用及其信号转导机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 上篇 文献综述 |
| 综述一 红花及其有效成分的研究进展 |
| 1.红花有效成分的提取 |
| 2.红花的传统应用 |
| 3.羟基红花黄色素A的现代药理研究 |
| 参考文献 |
| 综述二 中医药抗肿瘤血管生成研究进展 |
| 1.中医对肿瘤血管生成的认识及其现代研究 |
| 2.中药单体及有效成分抗肿瘤血管生成作用研究进展 |
| 3.中药复方抗肿瘤血管生成作用研究进展 |
| 4.中药抗肿瘤血管生成的研究方法 |
| 参考文献 |
| 综述三 肿瘤血管生成过程及其调控机制研究进展 |
| 1.肿瘤血管生成基本过程 |
| 2.肿瘤血管生成调控的分子机制 |
| 参考文献 |
| 下篇 实验研究 |
| 引言 |
| 实验一 羟基红花黄色素A对肿瘤培养上清液诱导的HUVEC增殖的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验二 羟基红花黄色素A对肿瘤培养液诱导的HUVEC细胞周期及凋亡的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验三 HSYA对肿瘤培养液诱导的HUVEC VEGF、KDR、BFGF及BFGFR等血管生成相关因子及受体表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验四 HSYA对肿瘤培养液诱导的HUVEC MAPK通路信号转导分子表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 实验五 HSYA对肿瘤培养液诱导的HUVEC癌基因C-MYC、N-RAS和转录因子NFKB表达的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 附图 |
（10）金雀异黄素对外伤性增生性玻璃体视网膜病变中bFGF和PCNA表达的抑制（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物及分组 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 外伤性PVR模型的建立 |
| 1.2.2 眼球标本制作 |
| 1.2.3 原位杂交法检测bFGF mRNA表达 |
| 1.2.4 免疫组化法检测PCNA表达 |
| 1.3 图像分析 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 病理表现 |
| 2.2 bFGF mRNA表达变化 |
| 2.3 PCNA表达变化 |
| 3 讨论 |
四、金雀异黄素对缺氧诱导的人ARPE-19细胞内碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达的影响(英文)（论文参考文献）
- [1]多功能纳米脂质体运载塞来昔布和金雀异黄素联合抑制前列腺癌细胞增殖的实验研究[D]. 田静岩. 吉林大学, 2021(01)
- [2]姜黄素抑制实验性脉络膜新生血管的机制研究[D]. 陈水龄. 中国中医科学院, 2020(01)
- [3]从缺氧-VEGF途径探讨止血化瘀利水方防治视网膜静脉阻塞黄斑水肿的作用机理[D]. 张佳良. 中国中医科学院, 2020(01)
- [4]DFMG调节TLR4/VEGF-A抗宫颈癌血管新生的机制研究[D]. 向雪萍. 湖南师范大学, 2020(01)
- [5]PI3Kδ在PVR中的作用机制及视网膜病变治疗新途径研究[D]. 韩昊特. 浙江大学, 2021(01)
- [6]TWEAK与增殖性糖尿病视网膜病变相关性及促细胞增殖作用的研究[D]. 陈冬悦. 吉林大学, 2017(11)
- [7]金雀异黄素阻断IL-8/STAT3轴抑制TAM诱导卵巢癌干样细胞特性研究[D]. 宁映霞. 暨南大学, 2017(01)
- [8]血清中VEGF和bFGF水平与糖尿病视网膜病变关系的临床研究[J]. 单俊杰,袁志兰,曹国平. 国际眼科杂志, 2011(12)
- [9]羟基红花黄色素A对异常增殖人脐静脉内皮细胞的抑制作用及其信号转导机制研究[D]. 王济. 北京中医药大学, 2009(10)
- [10]金雀异黄素对外伤性增生性玻璃体视网膜病变中bFGF和PCNA表达的抑制[J]. 游江,姜德咏. 华中科技大学学报(医学版), 2008(04)