一、高毒广谱杀虫Bt工程菌TnY（论文文献综述）
王宇航,束长龙,耿丽丽,刘华梅,张杰[1]（2020）在《苏云金芽胞杆菌G033A产业化现状及应用前景分析》文中指出苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）G033A是国内第一个获得农药登记证的工程菌,也是第一个防治鞘翅目害虫的Bt产品,同时对鳞翅目害虫也具有高毒力。本文总结了G033A产品研发背景、构建过程、安全性评价、产品登记及应用技术与推广示范情况,并对G033A的应用前景做了分析,以期对G033A的大规模应用提供指导。随着高毒化学农药禁用,以及害虫对化学杀虫剂抗性日趋严重,社会对于高质量、绿色安全农产品的需求越来越迫切,相信G033A在未来鳞翅目、鞘翅目的害虫防治中必将发挥重要的作用,应用前景广阔。
张雅昆[2]（2018）在《美国白蛾中肠氨肽酶N的鉴定及其在Cry1Ab35蛋白杀虫机制中功能研究》文中提出美国白蛾Hyphantria cunea（Drury）属鳞翅目（Lepidoptera）灯蛾科（Arctiidae）昆虫,是一种重要的世界性检疫害虫,也是我国重大入侵害虫之一。由于其寄主范围广、繁殖能力强和传播速度快等特点,对我国森林资源、农林业生产和生态建设造成了严重损失。据国家林业局2018年第3、4号公告显示,我国美国白蛾疫区已涉及全国11个省（区、市）的572个县级行政区。苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是目前研究最成熟、应用最广泛的杀虫微生物,具有特异性强、环境友好和使用便捷等诸多优点,已经成功用于多种重要农林业害虫的防治,但用于美国白蛾防治的报道却相对较少。本研究对本实验室保存的15株Bt野生菌株进行生物活性测定,筛选出5株对美国白蛾具有高效杀虫活性的Bt菌株,分别为G31、GS24、GS31、GS36和GS70。该5株Bt菌株对美国白蛾一龄3 d幼虫的LC50（50%Lethal concentration）值为0.0840.268 mg/mL胞晶混合物,其中GS36菌株杀虫活性最高,LC50值为0.084 mg/mL胞晶混合物;表达晶体蛋白形态主要为大菱形、小菱形和圆球形等。5株菌株均含有多种cry基因且都含有cry1A和cry2A类基因,主要表达约130 kDa和60 kDa蛋白。从Bt菌株GS36中克隆了cry1Ab35基因（GenBank登录号KT692985）,开放阅读框（Openreadingframe,ORF）为3495bp,推测编码1181个氨基酸,编码蛋白分子量为133.6 kDa,等电点为4.74。构建了Bt工程菌HD1Ab35表达Cry1Ab35蛋白,分子量为140 kDa,晶体形态为小菱形。Cry1Ab35蛋白经胰蛋白酶消化,获得60 kDa的活化片段。Cry1Ab35蛋白对美国白蛾一龄3 d幼虫具有高效杀虫活性,LC50值为4.34μg/mL;对棉铃虫及甜菜夜蛾初孵幼虫杀虫活性较高,LC50值分别为24.31μg/mL和41.87μg/mL。克隆表达了Bt菌株GS36中enhancin-like基因（GenBank登录号MG012232）,开放阅读框为2202 bp,推测编码733个氨基酸,编码蛋白分子量为84 kDa,等电点为6.35,在重组大肠杆菌E.coliBL21（DE3）中表达84 kDa蛋白。提取并纯化了粉纹夜蛾颗粒体病毒（Trichoplusia nigranulovirus,TnGV）中约90 kDa的Enhancin蛋白。生物活性测定显示,分别加入20μg/mLEnhancin蛋白和100μg/mL Enhancin-like蛋白可使Cry1Ab35蛋白对美国白蛾一龄3 d幼虫的杀虫活性分别提高4.93倍及4.21倍;加入1.0×105 PIBs/mL美国白蛾核型多角体病毒（Hyphantria cuneanuclearpolyhedrosisvirus,HcNPV）可使Cry1Ab35蛋白对美国白蛾三龄2 d幼虫的杀虫活性提高11.16倍,单独Enhancin蛋白、Enhancin-like蛋白和1.0×105 PIBs/mL HcNPV对美国白蛾一龄3 d幼虫和三龄2 d幼虫均无杀虫活性。因此,TnGV中Enhancin蛋白、GS36菌株编码Enhancin-like蛋白、HcNPV三种增效因子可显着增加Cry1Ab35蛋白对美国白蛾的杀虫活性。通过配体杂交（Ligandblot）及质谱（Mass spectrometry,LC-MS/MS）分析技术,分离鉴定了美国白蛾幼虫中肠BBMV（Brush border membrane vesicle）上Cry1Ab35蛋白主要结合蛋白氨肽酶N（Aminopeptidase N,APNs）。结合美国白蛾中肠转录组数据,克隆鉴定了5个hcapn基因,分别为hcapn2（KY949254）、hcapn3（KY949256）、hcapn5（KY949257）、hcapn6（KY949258）和hcapn8（KY949259）。5个hcapn基因的开放阅读框分别为2811、3072、2817、2877和2796 bp,分别编码936、999、938、958和930个氨基酸,预测蛋白分子量分别为105、114、106、110和106 kDa。HcAPNs蛋白与已公布的HcAPN1（KP053647）和HcAPN4（KJ013598）蛋白具有相似的结构特征,即N端信号肽序列,谷氨酸锌化氨肽酶GAMEN基序及锌指结合基序HEXXH（X）18E,除HcAPN1和HcAPN6蛋白外,HcAPNs蛋白均具有C端糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidyl inositol,GPI）锚定位点,均含有多个O-糖基化位点及N-糖基化位点。7个hcapns基因均在美国白蛾幼虫中肠和后肠组织表达量高,美国白蛾幼虫饲喂Cry1Ab35蛋白后,hcapns基因均表现为1224 h表达水平显着上升。利用Bac-to-Bac昆虫细胞杆状病毒表达系统表达了重组HcAPN1、HcAPN2、HcAPN3、HcAPN4、HcAPN5、HcAPN6和HcAPN8蛋白,分子量分别为130、110、120、115、120、130和120kDa。配体杂交显示HcAPNs蛋白均能与Cry1Ab35蛋白活化片段结合。利用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术探索了HcAPNs蛋白在Cry1Ab35蛋白在美国白蛾杀虫机制中的功能。分别用dsRNA-hcapn1/-hcapn2/-hcapn3/-hcapn4/-hcapn5/-hcapn6/-hcapn8注射美国白蛾三龄2d幼虫,3 d后靶标hcapns基因表达水平分别下降了91.9%、72.0%、87.2%、64.0%、68.3%、64.0%和67.1%。将注射ddH2O和dsRNA-egfp/-hcapns的幼虫用含有Cry1Ab35蛋白的饲料饲养5 d后,幼虫校正死亡率分别为70.8%、74.5%、51.4%、41.7%、49.6%、61.1%、50.3%、62.5%和63.9%。注射dsRNA-hcapn1/-hcapn2/-hcapn3/-hcapn5的幼虫校正死亡率显着低于注射ddH2O及dsRNA-egfp/-hcapn4/-hcapn6/-hcapn8的幼虫校正死亡率。因此,推测美国白蛾中肠HcAPN1、HcAPN2、HcAPN3和HcAPN5蛋白为Cry1Ab35蛋白潜在的功能受体。
张晨[3]（2015）在《苏云金芽胞杆菌新菌株杀虫晶体蛋白基因的克隆与功能研究》文中进行了进一步梳理随着Bt杀虫剂的长期使用,害虫对Bt杀虫产生的抗性受到人们的广泛关注和深入研究。在多种抗性管理策略中,筛选新的Bt杀虫菌株,挖掘杀虫新毒素是延缓害虫抗性的有效方法。本研究从全国不同地区不同土壤类型采集了 118份样本,利用温度筛选法分离得到了五株野生型Bt菌株,镜检观察发现均能产生典型的菱形晶体,PCR分析表明菌株均含有cry1类基因。将66号土样筛选到的Bt菌株命名为Bt 6618,并进行形态特征镜检和16S rRNA基因鉴定。采用SDS-PAGE和液质联用质谱仪（LC-MS/MS）分析鉴定到该菌株产生的130kDa蛋白主要由Cry1Ae和Cry1Ac原毒素组成并对得分最高的cry1Ac进行克隆及序列分析,结果表明该菌株所含的cry1Ac基因与已经公布的的cry1Ac1基因序列一致,而cry1Ae基因编码区序列的研究将在后续进行。该菌株的芽胞晶体混合物对棉铃虫初孵幼虫具有显着的杀虫效果,LC5o为55μg/mL。此外,我们对现有已知Bt菌株的杀虫基因进行挖掘。电镜扫描观察本室保藏的一株苏云金芽胞杆菌4U1菌株产生的晶体形态为椭圆形。SDS-PAGE分析表明该菌株主要表达130kDa毒素蛋白,PCR分析结果表明该菌含有cry7类和cry8类基因。质谱鉴定到该菌株原毒素组分主要为Cry7类和Cry8类蛋白。对该菌株中的cry8类基因进行克隆与序列分析,结果显示该基因与ARP110菌株中某毒素基因的CDS序列完全一致,这是该基因在4U1菌株的首次发现。毒力生测表明该菌株芽胞晶体混合物对棉铃虫初孵幼虫毒力较低,对其它害虫的毒力还有待分析。本研究筛选得到的高毒力Bt菌株将丰富我国苏云金芽胞杆菌的储备,为发展新的高效生物杀虫制剂提供资源。
唐裕杰[4]（2013）在《苏云金芽胞杆菌A1菌株的研究和高效工程菌的构建》文中认为苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）是一种能产生伴胞晶体和芽胞的革兰氏阳性细菌,由于其具有毒力高,专一性强,对人畜无害、对环境安全,且不易产生抗性等特点,近年来在农林害虫的防治中得到了广泛的应用,成为世界上研究和使用最广泛的微生物杀虫剂之一。本室从四川生态环境中分离获得了一株对鳞翅目昆虫具有高效杀虫活性的苏云金芽胞杆菌A1菌株,本研究对该菌株进行了生物学特性分析、杀虫晶体蛋白基因的克隆鉴定以及采用基因工程菌株构建的方法对该菌株高效杀虫活性原因进行了研究,具体结果如下：1.A1菌株生物学特性分析。光学显微镜下观察,A1菌株菌体呈杆状直形或者略弯形,两端钝圆；电子显微镜下观察为杆状,能形成芽胞,产生菱形和方形晶体,且具有周身鞭毛。SDS-PAGE结果表明,A1菌株能够产生约130kDa和80kDa左右大小的蛋白；A1菌株生物活性测定结果表明,其对鳞翅目昆虫的棉铃虫（LC50=32μg/mL）和甜菜夜蛾（LCS0=17.2μg/mL）具有高效的杀虫活性。2.利用杀虫晶体蛋白基因通用引物对A1总DNA进行扩增,引物KSun2/K3un2和S5uni/S3uni扩增出了特异性条带。测序分析表明,他们分别与crylal和crylAcl基因序列具有100%同源性。以已公布的cryllal和crylAcl基因序列设计全长引物进行扩增并进行序列分析发现,A1菌株中存在的杀虫晶体蛋白基因是cryllal和crylAcl基因。.3将crylAcl、cryllal基因连接到pET32-a （+）表达载体并转化到大肠杆菌BL21（DE3）pLysS中,诱导表达。SDS-PAGE分析表明这两个基因分别能够表达出分子量大小约为133kDa和81kDa的产物。4.将crylAcl、cryllal基因连接到穿梭载体上得到pSTK-Ac和pSTK-Ia,再将重组质粒pSTK-Ac、pSTK-Ia热击转化到SCS110中去甲基化,并分别将pSTK-Ac、 pSTK-Ia、pSTK-Ac+pSTK-Ia电转化到无晶体突变株HD-73-中得到HD-Ac、HD-Ia和HD-AI。电镜分析表明：HD-Ac能够产生菱形晶体；HD-Ia没有观察到晶体产生；HD-AI能够产生菱形晶体和不规则形状晶体。另外,将cytlDa2基因连接到穿梭载体上得到pSTK-Da,并转入到HD-Ac、HD-Ia得到HD-AD和HD-ID, HD-AD中能够产生菱形和球形晶体,但HD-ID中没有观察到晶体的产生。5.对HD-Ac、HD-Ia、HD-AI、HD-AD和HD-ID5株工程菌株进行生物活性测定,结果表明HD-Ac、HD-AI和HD-AD工程菌对棉铃虫具有较高的杀虫活性,并且这3株工程菌对棉铃虫杀虫活性的LC50与野生菌A1相当,这表明A1菌株对棉铃虫的高效杀虫活性主要来自于crylAcl基因。所有的工程菌株对甜菜夜蛾的杀虫活性都很低,而且都远远低于野生菌A1对甜菜夜蛾的杀虫活性,这说明,A1菌株对甜菜夜蛾的高效杀虫活性可能还有其它杀虫因子的影响.。本研究对苏云金芽胞杆菌A1菌株进行了系统研究,了解了A1菌株生理生化特征,并对A1菌株中杀虫晶体蛋白基因进行了克隆分析,通过构建基因工程菌株的方法,对A1菌株高效杀虫机理进行了揭示,这些结果对于A1菌株的进一步研究利用提供了理论和技术支撑。
关鹏[5]（2013）在《苏云金芽胞杆菌MC28基因组完成图及其杀虫功能基因研究》文中研究说明苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis,Bt)MC28是从四川盆地沐川原始森林土壤中分离得到的,能在芽胞形成期产生大量球形伴胞晶体蛋白,对鳞翅目和双翅目昆虫具有明显的杀虫活性。前期研究采用PCR-RFLP （restricted fragment length polymorphisms, RFLP）鉴定方法从MC28中鉴定并克隆了5个杀虫晶体蛋白基因cry30Fa1、 cry53Ba1、cry54Aa1和cyt2Aa3),其中cry54Aa1编码蛋白对棉铃虫Helicoverpa armigera, Lepidoptera)、甜菜夜蛾（Laphygma exigua, Lepidoptera）和伊蚊（Aedes aegypti, Diptera）具有特异的杀虫活性；cry30Fa1编码蛋白对水稻褐飞虱（Nilaparvata lugens, Homoptera）具有特异的杀虫活性。为了研究MC28的基因组结构和进化特点,我们采用Illumina GA Ⅱ测序技术对MC28菌株进行全基因组测序。全基因组测序获得原始reads并过滤得到18,324,961个双末端reads,其对基因组的覆盖度达到451倍。采用SOAPdenovo组装软件将大约97.13%的reads组装成113个scaffolds。通过PCR、长片段PCR扩增以及构建Fosmid文库等策略对Scaffold内部和scaffold之间的gaps进行补洞,最终获得大小为6.68Mb的基因组完成图。利用Glimmer3.02对Bt MC28全基因组进行基因的预测,然后使用blast软件,将预测得到的蛋白序列与NR库进行比对,选择最好的比对结果作为相对应蛋白的注释,最终,MC28基因组总共注释得到6,555个蛋白。采用perl+SVG工具对Bt MC28和BtCT43及Bt YBT-020分别做共线性分析,结果表明：MC28与CT-43及YBT-020具有非常相似的基因组结构和共线性关系。采用MEGA和SplitsTree软件分别对Bt MC28和其它相关菌株构建系统发育树,两个结果均表明：Bt MC28菌株同其它Bt菌株在进化上距离较远,而是同Be Rock3-28、Bc Rock4-18、Bc Rock1-3和Be Rock3-29处在一个独立的分支上Bt MC28全基因组由8个环状复制子构成（1个染色体DNA和7个内生质粒）,总长为6.68Mb。其中环状染色体DNA长度为5,414,461bp,编码5,279个预测的开放阅读框（ORFs）,染色体DNA的G+C的百分含量为35.41%；7个环状内生质粒分别为pMC8、pMC54、pMC95、pMC183、pMC189、pMC319和pMC429,这些质粒共编码1,278个预测的开放阅读框（ORFs）,其G+C的百分含量在32.11%和34.78%之间。Bt MC28基因组共编码74个tRNA和45个rRNA。通过Bt MC28全基因组测序,我们从中发现了3个编码杀虫晶体蛋白基因的质粒,而且从这些质粒上发现了6个新型的杀虫晶体蛋白基因分别为cry54Ab1、cry68Aa1、cry69Aa1、cry69Aa2、cry70Ba1和cyt1Da1,至此在Bt MC28菌株中共得到11个新型杀虫晶体蛋白基因。其中质粒pMC189上共携带了7个杀虫晶体蛋白基因分别为cry30Fa1、cry53Ab1、cry54Aa1、cry54Ab1、cry68Aa1、, cyt1Da1和cyt2Aa3；而质粒pMC95上共携带有3个杀虫晶体蛋白基因分别cry4Cc1、 cry69Aa1和cry70Ba1;质粒pMC183上仅含有一个与cry69Aa1同源性为96.2%的杀虫晶体蛋白基因cry69Aa2。cry68Aa1、cry70Ba1和cyt1Da1的长度分别为2,511bp、2,427bp和1,527bp。为了研究这三个基因编码蛋白的杀虫活性,我们通过PCR扩增将这三个基因分别插入到原核表达载体pET-28a中,再转入到原核表达感受态细胞BL21（DE3）pLysS中,通过IPTG诱导表达,cry68Aa1, cry70Ba1和cyt1Da1基因分别产生约95kDa、90kDa和60kDa的表达产物,这与其预测表达蛋白的大小一致。生物活性测定结果表明：Cry68Aa1和Cry70Ba1均只对鳞翅目的甜菜夜蛾幼虫具有杀虫活性,其LC50分别为20.16μg/ml（95%的置信区间为16.34-35.72μg/ml）和30.22μg/ml（95%的置信区间为27.15-36.53μg/ml），而两者对鳞翅目的棉铃虫和双翅目的蚊虫无杀虫活性；Cyt1Da1对所测的昆虫均无杀虫活性。cry69Aa1基因全长为3,651bp,编码1,216个氨基酸,其预测编码蛋白大小约为137.1kDa,与已知的Cry4Ba蛋白的同源性最高,但仅为39%。比较结果表明：Cry69Aa1和已知大分子量的Cry蛋白均含有8个保守区域（见图5-1）,因此,Cry69Aa1蛋白属于大分子量Cry蛋白中的一类新型Cry蛋白。为了研究cry69Aa1基因编码蛋白的杀虫活性,我们将扩增得到cry69Aa1全长基因插入到穿梭载体pSTK中,再转入到Bt无晶体突变株HD73-中。重组菌株的扫描电镜（SEM）观察结果表明：cry69Aa1在Bt无晶体突变株HD73-中表达时,能够形成大量的球形伴胞晶体。生测结果表明：重组菌株的芽胞晶体混合物对双翅目的致倦库蚊（Culex quinquefasciatus）幼虫具有明显杀虫活性,其LC5o为23.7μg/ml,95%的置信区间为20.5-26.4μg/ml。cry54Ab1操纵子是由两个相同编码方向的ORFs组成的,第一个ORF是与ory54A类似的cry基因,长度为2,232bp,其编码743个氨基酸,预测编码蛋白分子量84.5kDa,根据编码蛋白的同源性,这个cry基因被命名为cry54Ab1;第二个ORF位于cry54Ab1的下游,两者之间被一个长67bp的非编码区所间隔,这个ORF在本研究中暂命名为orf2基因,该基因长1,524bp,编码503个氨基酸,其预测蛋白分子量为58.2kDa。为了研究cry54Ab1操纵子的杀虫活性,我们将cry54Ab1基因、orf2基因以及完整的cry54Ab1操纵子通过PCR扩增后分别插入到穿梭载体pSTK上,再转入到Bt无晶体突变株HD73-中表达。重组菌株的扫描电镜观察表明：当完整的cryS4Ab1操纵子在Bt无晶体突变株HD73-中表达时,能够形成大量的球形伴胞晶体；当cry54Ab1基因或orf2基因单独在Bt无晶体突变株HD73-中表达时,均不能形成伴胞晶体。SDS-PAGE电泳分析结果表明：完整的cry54Ab1操纵子在Bt无晶体突变株HD73-中表达时,两个ORFs均能够大量表达,然而当cry54Ab1基因和orf2基因单独表达时,两个基因的表达量非常低,尤其是orf2基因几乎不表达。另外生测结果表明：完整的cry54Ab1操纵子和cty54Ab1基因的表达产物均对双翅目的致倦库蚊有杀虫活性,但是完整的cry54Ab1操纵子表达产物的杀虫活性是cry54Ab1基因单独表达时的杀虫活性的10倍之多。由以上结果可知,orf2基因的表达不仅能够使Cry54Ab1蛋白形成球形伴胞晶体,而且能够提高Cry54Ab1蛋白的杀虫活性。
张彦蕊[6]（2012）在《苏云金芽胞杆菌HBF-18菌株毒力相关基因的克隆与活性研究》文中提出蛴螬是金龟子幼虫的总称，是地下害虫中最大类群，也是危害最大、造成损失最严重的种类。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是目前研究最多、应用最广的昆虫病原微生物。由河北农林科学院植保所分离的HBF-18菌株对大黑鳃金龟（Holotrichia oblita）与暗黑鳃金龟（Holotrichia parallela）有较好杀虫活性，本实验室从中克隆了对暗黑鳃金龟与大黑鳃金龟都有活性的cry8Ga1基因。然而，cry8Ga1基因的表达产物杀虫活性与出发菌株（HBF-18）相比，有较大的差别，对大黑鳃金龟、暗鳃金龟的活性比出发菌株分别降低50倍与70倍。在本实验室克隆的其他对蛴螬有活性的cry8类基因则没有这种现象。由此推测HBF-18菌株中除了含有cry8Ga1基因外，还可能含有其他新的杀虫基因。但是通过传统的鉴定方法我们没有鉴定出来新的杀虫基因，本研究在菌株基因组测序的基础上，对HBF-18菌株中可能含有的新的杀虫基因进行发掘，克隆了3个新的基因，并对其表达产物进行了生物活性的测定和增效研究，具体进展如下：本研究在前期基因组测序的基础上，利用生物信息学分析，发现了三种新的杀虫基因。从HBF-18菌株中分别克隆了cry8-like、vip1、vip2基因。其中cry8-like基因长度2214bp，具有完整的阅读框架，编码738个氨基酸，与Cry8Db氨基酸序列相似性最高，达到51%，包含了完整的Cry毒素活性区所必需的三个结构域；在cry8-like基因上游存在SigA、SigD、SigE转录因子的结合位点及RBS序列，在其下游存在两个反向重复序列。该基因是一个完整的、不同于一般3.5kb的Bt cry8类基因。vip1全长基因2634bp，编码878个氨基酸，推导分子量为98.1kD，与Vip1Ba氨基酸序列相似性最高，达到76%，Vip1蛋白N端1-31位氨基酸为信号肽序列。vip2全长基因1386bp，编码462个氨基酸，推导分子量为52.6kD，与Vip2Ac氨基酸序列相似性最高，达到88%，Vip2蛋白N端1-30位氨基酸是其信号肽序列。vip2基因位于vip1基因上游，二者ORF间仅相差7个碱基；在vip2基因上游存在SigB、SigG转录因子结合位点，在vip1下游存在一个反向重复序列。反转录PCR结果显示上述基因在原始菌株HBF-18中能够正常转录。在大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株中成功表达了vip1、vip2、cry8-like基因，SDS-PAGE分析结果显示vip1基因表达约98kDa的蛋白，vip2基因表达约52kDa的蛋白，cry8-like基因表达约75kDa的蛋白。为了在Bt中表达cry8-like基因，本研究利用重叠PCR技术在cry8-like基因末尾加上了一段cry8Ea基因的3′末端序列，使其成为3528bp的杂合基因cry8X。将vip1、vip2、cry8X基因分别转化Bt无晶体突变株HD73-中，成功表达了三种蛋白，Vip1蛋白约80kD，Vip2蛋白约40kD，Cry8X蛋白约133kD。将构建的含有vip1、vip2、cry8X基因的Bt工程菌分别命名为HDVIP1、HDVIP2、HD8X；电镜观察结果表明HD8X可以形成球形晶体。分别测定了HD8X、HD8G、HD8X+HD8G、HDVIP1+HDVIP2、HDVIP1+HDVIP2+HD8G等菌株或菌株组合对暗黑鳃金龟幼虫的杀虫活性。结果表明，HDVIP1+HDVIP2及HD8X菌株对暗黑鳃金龟幼虫有杀虫活性，其LC50分别为3.51×1011和6.66×1011CFU/g土壤，二者杀虫活性都比HD8G及HBF-18低。HDVIP1+HDVIP2+HD8G菌株组合预期LC50与实测LC50的比值为4.15，具有协同增效作用，HD8X+HD8组合预期LC50与实测LC50的比值为1.86，属于相加作用。对不同的菌株和组合进行差异显着性检验，结果显示HDVIP1+HDVIP2+HD8G菌株组合对暗黑鳃金龟幼虫杀虫活性与HBF-18相比差异不显着。因此，HBF-18菌株杀虫活性比HD8G高的原因是该菌株中vip1、vip2、cry8X这些基因表达产物提高了Cry8Ga的杀虫活性。此外，Cry8X蛋白对铜绿丽金龟具有较好的杀虫活性，对小菜蛾没有杀虫活性。综上所述，本研究鉴定和克隆了三个新的杀虫基因vip1、vip2和cry8X，并揭示了只含有cry8Ga基因的表达菌株HD8G和原始菌株HBF-18之间杀虫活性有显着差异的原因。本研究为蛴螬的生物防治提供了新的基因来源。
宋萍[7]（2012）在《苏云金芽胞杆菌分离鉴定及对马铃薯二十八星瓢虫特异活性菌株研究》文中提出苏云金芽胞杆菌（Bt）是世界上研究最多应用范围最广的杀虫微生物,杀虫活性物质包括Cry和Cyt两大类蛋白,在害虫生物防治中发挥了重要作用,但是也暴露了一些弊端,如杀虫谱窄、昆虫易产生抗性等问题,所以进一步分离特异活性或者高活性的野生菌株,鉴定其基因型,为害虫防治提供更多的基因资源。本论文针对含有cry7类基因的苏云金芽胞杆菌野生菌株进行了鉴定和评价,从中筛选出了对马铃薯二十八星瓢虫特异活性的新菌株,针对这一新菌株生物学特性、蛋白型、基因型以及作用机理等方面进行了一系列的研究,主要内容和结果如下。1.利用醋酸钠筛选法并经基因型分析,从河北省土壤中分离筛选出了56株含有cry7基因的Bt菌株。在这些菌株中,10株菌同时含有cry7基因和其他cry基因,46株菌只含有单一cry7基因。大部分Bt菌株表达130kDa蛋白,仅有BQZ-12菌株产生80kDa和70kDa蛋白,BQZ-8菌株产生130kDa和80kDa蛋白。通过生物活性测定得到一株对马铃薯二十八星瓢虫幼虫具有特异杀虫活性野生菌Bt WZ-9。2. WZ-9菌株在胞晶分离期产生菱形伴胞晶体,蛋白分子量为130kDa,对马铃薯二十八星瓢虫2龄幼虫的LC50值为0.209 mg/mL。基因型鉴定结果表明该菌只含有单一的cry7基因,序列分析显示该基因与cry7Ab1同源性达到99%,被Bt命名委员会命名为cry7Ab3（登录号ABX 24522）。3.为了明确Cry7Ab3蛋白的杀虫活性,从Bt WZ-9菌株中克隆了cry7Ab3基因,该基因在大肠杆菌BL21和Bt无晶体突变株HD73 cry-中都能正确表达130kDa蛋白,其表达产物对马铃薯二十八星瓢虫2龄幼虫都具有较高毒力,LC50值分别为0.460 mg/mL和0.205 mg/mL,cry7Ab3基因在转Bt无晶体突变株HD73-Cry7Ab3中形成的晶体（0.86μm×1.23μm）比野生菌产生的晶体（0.73μm×1.00μm）略大一些。这些结果证实了cry7Ab3基因编码蛋白发挥杀虫作用。4.为明确Cry7Ab3蛋白最短活性区序列,利用特异性引物分别克隆表达不同长度的cry7Ab3基因片段,E. coli Cry7Ab3-1（Met1-Phe657）、E. coli Cry7Ab3-2（ Met1-Phe626 ）、E. coli Cry7Ab3-3 （ Asn30-Phe657 ）和E. coli Cry7Ab3-4（Lys87-Phe657）,并测定了表达产物对马铃薯二十八星瓢虫2龄幼虫的毒力。结果表明E. coli Cry7Ab3-1表达的75kDa蛋白毒力最高,LC50值为0.114mg/mL,可以确定Met1-Phe657为Cry7Ab3蛋白的最短活性区。5.分别利用胰蛋白酶和马铃薯二十八星瓢虫中肠蛋白酶液体外酶解130kDa的Cry7Ab3原毒素（质量比为100:1）,均得到75kDa的酶解产物。与相同浓度的原毒素相比,75kDa的酶解产物对马铃薯二十八星瓢虫2龄幼虫具有较高杀虫毒力。对马铃薯二十八星瓢虫幼虫中肠组织病理学研究表明,3龄幼虫取食Cry7Ab3原毒素蛋白3d后,中肠细胞严重破坏,细胞间出现明显孔洞,幼虫表现出活动缓慢,取食量下降的现象。取食5d后,中肠组织完全被破坏,幼虫开始死亡。通过Ligand blotting技术,检测到马铃薯二十八星瓢虫中肠BBMV上存在分子量为220kDa的Cry7Ab3毒素结合受体,经质谱分析鉴定该受体蛋白为钙粘蛋白。本论文创新之处在于发现了对马铃薯二十八星瓢虫幼虫特异活性的Cry7Ab3蛋白,构建了转cry7Ab3基因的Bt工程菌,明确了Cry7Ab3蛋白最短活性区为75kDa的Met1-Phe657蛋白片段以及Cry7Ab3毒素的作用靶标是马铃薯二十八星瓢虫幼虫中肠组织上的BBMV,初步确定了其在中肠BBMV上结合蛋白可能是钙粘蛋白。这些研究结果为更好地应用Cry7Ab3蛋白防治马铃薯二十八星瓢虫提供了理论基础。
李雪,马玉超,李煦,于慧敏,张建[8]（2012）在《苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的研究进展》文中认为伴胞晶体是苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis,简称Bt）在芽孢形成过程中产生的一种蛋白晶体。作为生物杀虫农药之一,伴胞晶体/Bt由于具有高效、广谱、环保及生物安全等优势,在农林业中得到广泛应用。介绍了伴胞晶体的最新分类、命名情况,综述了其结构、杀虫机理及应用方面的研究进展,并对Bt生物农药的发展前景进行了展望。
李雪[9]（2012）在《苏云金芽孢杆菌的筛选与伴孢晶体编码基因的克隆与序列分析》文中研究指明苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，简称Bt），是一种自然界中广泛存在的微生物，其所产的具有杀虫活性的伴孢晶体是目前世界上生物杀虫剂的主要成分，对鳞翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、线虫等200多种昆虫具有杀虫毒力。不同菌株产生编码的蛋白毒素不同，从而杀虫特性也不同，目前伴孢晶体的基因型分类已经达到cry70型。本文围绕对苏云金芽孢杆菌菌株的筛选，16S rRNA的鉴定，基因型的鉴定及全基因的克隆等方面进行一系列的研究。利用在中科院购买的菌株苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种CGMCC1.1752（基因型为cry1Ac）、苏云金芽孢杆菌以色列亚种CGMCC1.1754（基因型为cry4A，cry4B）作为对照菌株建立筛选方法和鉴定方法。利用已建立的方法，从药用植物园采集11种土样和清华大学的1种土样进行筛选，筛选得到一株产伴孢晶体的菌株，经基因型鉴定，结果显示基因型为cry8型基因；通过16S rRNA鉴定，鉴定结果显示为Bt菌株，命名为TS3。对TS3菌株进行生理生化实验，利用苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种CGMCC1.1752（基因型为cry1Ac）、苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种CGMCC1.1755（无质粒）做对照菌株，对上述三株菌进行API20E、API50CH、API ZYM实验，TS3菌株结果与对照菌株的生理生化特性绝大部分一致，可能由于是不同亚种，TS3会有微小差别。对TS3菌株的cry基因型进行克隆，克隆结果表明TS3所产伴孢晶体蛋白的基因型为cry8。基因全长3642bp，由1213个氨基酸组成，分子量为137kDa；并采用ProtScale、HNN方法和swiss-model程序对该蛋白进行模拟分析。对CGMCC1.1752进行发酵实验，主要针对碳源和氮源对伴孢晶体产量的影响，为TS3菌株的后续发酵优化培养奠定基础。
闫贵欣[10]（2009）在《对金龟甲科、叶甲科害虫高毒力苏云金芽胞杆菌杀虫基因及工程菌的研究》文中研究说明苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）是目前世界上应用范围最广的杀虫微生物,其杀虫活性主要来源于杀虫基因编码的晶体蛋白。但是传统的Bt菌株存在杀虫谱窄、杀虫毒力有限等缺点,因此,必须通过生物技术等手段寻找新的基因资源,并且构建高效广谱的Bt工程菌来满足生产的需要。目前,发掘新的杀虫基因,研究其晶体蛋白结构和作用机制都是国内外研究的热点,本论文围绕对鞘翅目害虫高毒力Bt基因的克隆、工程菌的构建、杀虫晶体蛋白杀虫特异性机理等方面进行了一系列的研究,主要结果如下:1、对蛴螬高杀虫活性cry8类基因的克隆:从自行筛选的菌株Bt145中克隆了cry8Ga2新基因,并获得正式命名。转化无晶体突变株HD-73-,构建了新的Bt工程菌株HD8G2,生物活性测定结果表明,工程菌株HD8G2与野生菌株均对鞘翅目害虫暗黑鳃金龟表现出杀虫活性,LC50分别为1.25×108 cfu/g和5.59×108 cfu/g。从自行筛选的菌株BtSU4中克隆了cry8Ha1和cry8Ia1新基因,并获得正式命名。转化无晶体突变株HD-73-,获得了两株新型Bt工程菌株HD8H和HD8I。室内生物活性测定结果表明,HD8H和HD8I都对暗黑鳃金龟幼虫有较高的杀虫活性,LC50分别为2.19×1010cfu/g和8.50×109 cfu/g,对鳞翅目害虫无杀虫活性;从HD8H提取的蛋白经胰凝乳蛋白酶活化后,对叶甲科害虫大猿叶甲表现出较高的杀虫活性,LC50为18.00μg/ml。通过RT-PCR以及Western杂交证实cry8Ha1和cry8Ia1基因在宿主菌株BtSU4中均能正常的表达。两个新基因分别申请了国家发明专利,为其应用奠定了基础。2、对鞘翅目金龟甲科和叶甲科害虫工程菌的构建:将对鞘翅目叶甲科害虫高毒力的cry3Aa7基因,通过电击转化到对蛴螬高毒力的野生菌株BtSU4和HBF-1中,得到工程菌株3A-SU4和3A-HBF。室内生物活性测定结果表明,两株工程菌不仅对蛴螬表现出较高毒力,而且还获得对叶甲科害虫的杀虫活性。工程菌3A-SU4对马铃薯甲虫、大猿叶甲和暗黑鳃金龟幼虫的LC50分别为2.62μg/ml、1.25μg/ml和3.60×108 cfu/g;3A-HBF对马铃薯甲虫、大猿叶甲和铜绿丽金龟幼虫的LC50分别为1.74μg/ml,1.10μg/ml和0.73×108 cfu/g,两株工程菌扩大了对鞘翅目害虫的杀虫谱,具有良好的开发和应用前景。3、Cry8类蛋白杀虫特异性机理的研究:从蛋白的结构、蛋白的活化、蛋白与昆虫体内受体的结合三个方面进行Cry8类蛋白杀虫特异性机理的初步探索。通过结构域互换的方法,得到Cry8Ca2和Cry8Ea1两种蛋白不同结构域组合的8种杂合蛋白,分析8种杂合蛋白对蛴螬的杀虫活性与其结构的对应关系,其中工程菌株HD （3+15（）含由Cry8C的DomainⅠ和DomainⅡ及Cry8E的LoopⅡ和DomainⅢ构成的杂合基因）、HD （7+11） （含由Cry8E的DomainⅠ和DomainⅡ及Cry8C的LoopⅡ和DomainⅢ构成的杂合基因）、HD （6+10）（含由Cry8E的DomainⅠ和LoopⅠ及Cry8C的DomainⅡ和DomainⅢ构成的杂合基因）在浓度为1010 cfu /g时,对铜绿丽金龟幼虫的较正死亡率分别为44%、36%和32%。但所有的杂合蛋白都对暗黑鳃金龟幼虫失去了杀虫活性。通过Cry8Ha1、Cry8Ia1、Cry8Ga1和Cry8Ga2四种蛋白被暗黑鳃金龟中肠液与胰凝乳蛋白酶消化,胰凝乳蛋白酶活化的Cry8Ha1蛋白对大猿叶甲幼虫有较高的杀虫活性,而活化的Cry8Ga1、Cry8Ga2和Cry8Ia1蛋白对大猿叶甲幼虫无杀虫活性。用生物素标记的Cry8Ha1和Cry8Ia1蛋白均能与暗黑鳃金龟和大黑鳃金龟幼虫的BBMV结合,但是这两种蛋白仅对前者具有杀虫活性。
二、高毒广谱杀虫Bt工程菌TnY（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、高毒广谱杀虫Bt工程菌TnY（论文提纲范文）
（1）苏云金芽胞杆菌G033A产业化现状及应用前景分析（论文提纲范文）
| 1 产品研发背景 |
| 2 工程菌构建 |
| 3 转基因工程菌环境安全性评价 |
| 4 产品登记 |
| 5 G033A应用技术 |
| 5.1 马铃薯甲虫防治 |
| 5.2 十字花科蔬菜小菜蛾与甜菜夜蛾防治 |
| 5.3 十字花科蔬菜黄曲条跳甲防治 |
| 5.4 玉米草地贪夜蛾防治 |
| 5.5 番茄棉铃虫和南美番茄潜叶蛾防治 |
| 5.6 花生田鳞翅目害虫防治 |
| 6 产品应用展望 |
（2）美国白蛾中肠氨肽酶N的鉴定及其在Cry1Ab35蛋白杀虫机制中功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 美国白蛾简介 |
| 1.1.1 美国白蛾发生与为害状况 |
| 1.1.2 美国白蛾防治现状 |
| 1.2 苏云金杆菌及杀虫蛋白概述 |
| 1.2.1 苏云金杆菌Bt概况 |
| 1.2.2 Bt杀虫蛋白种类 |
| 1.2.3 Bt杀虫晶体蛋白的进化 |
| 1.2.4 Bt杀虫晶体蛋白的结构与功能 |
| 1.2.5 Bt杀虫晶体蛋白作用机制 |
| 1.2.6 Bt杀虫蛋白增效途径 |
| 1.3 Bt杀虫蛋白在昆虫中肠受体 |
| 1.3.1 氨肽酶N(AminopeptidaseN,APN) |
| 1.3.2 钙粘蛋白(Cadherin,CAD) |
| 1.3.3 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP) |
| 1.3.4 ABC转运体(ATP-binding cassette transporter,ABC) |
| 1.3.5 其它受体蛋白 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 2 对美国白蛾高效活性Bt菌株的筛选 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 供试昆虫 |
| 2.1.2 供试菌株 |
| 2.1.3 培养基 |
| 2.1.4 主要溶液及试剂 |
| 2.1.5 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Bt菌株对美国白蛾杀虫活性测定 |
| 2.2.2 Bt菌株晶体形态观察 |
| 2.2.3 Bt菌株cry基因型鉴定 |
| 2.2.4 Bt菌株晶体蛋白SDS-PAGE分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 Bt菌株对美国白蛾杀虫活性测定 |
| 2.3.2 Bt菌株晶体形态观察 |
| 2.3.3 Bt菌株cry基因型鉴定 |
| 2.3.4 Bt菌株晶体蛋白SDS-PAGE分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 3 对美国白蛾高效Cry1Ab35蛋白的表达及活性分析 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 供试昆虫 |
| 3.1.2 菌株及质粒 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 主要溶液及试剂 |
| 3.1.5 主要仪器设备 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 Bt菌株质粒的提取 |
| 3.2.2 cry1Ab35基因的克隆与原核表达 |
| 3.2.3 Bt工程菌HD1Ab35的构建 |
| 3.2.4 Bt工程菌HD1Ab35晶体蛋白提取 |
| 3.2.5 Cry1Ab35蛋白浓度的测定 |
| 3.2.6 Cry1Ab35蛋白抗体的制备 |
| 3.2.7 Cry1Ab35蛋白杀虫活性测定 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 cry1Ab35基因的克隆与序列分析 |
| 3.3.2 cry1Ab35基因的原核表达 |
| 3.3.3 工程菌HD1Ab35的构建及鉴定 |
| 3.3.4 工程菌HD1Ab35晶体蛋白形态观察 |
| 3.3.5 工程菌HD1Ab35晶体蛋白的表达及定量 |
| 3.3.6 Cry1Ab35蛋白杀虫活性测定 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 4 Cry1Ab35蛋白对美国白蛾杀虫活性增效因子 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 供试昆虫 |
| 4.1.2 菌株及质粒 |
| 4.1.3 昆虫病毒 |
| 4.1.4 主要溶液及试剂 |
| 4.1.5 主要仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 TnGV的增殖、提取与纯化 |
| 4.2.2 TnGV Enhancin蛋白的制备 |
| 4.2.3 Bt GS36菌株enhancin-like基因的克隆 |
| 4.2.4 Enhancin-like蛋白的原核表达 |
| 4.2.5 Enhancin-like蛋白的提取与纯化 |
| 4.2.6 三种增效因子在Cry1Ab35蛋白对美国白蛾杀虫活性中的增效作用分析 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 TnGV Enhancin蛋白的检测 |
| 4.3.2 enhancin-like基因的克隆及序列分析 |
| 4.3.3 enhancin-like基因的原核表达 |
| 4.3.5 三种增效因子在Cry1Ab35蛋白对美国白蛾杀虫活性中的增效作用 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 美国白蛾中肠Cry1Ab35蛋白结合蛋白的鉴定 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 供试昆虫 |
| 5.1.2 菌株及质粒 |
| 5.1.3 主要溶液及试剂 |
| 5.1.4 主要仪器设备 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 Cry1Ab35蛋白的活化 |
| 5.2.2 美国白蛾中肠BBMV蛋白的提取 |
| 5.2.3 Ligandblot检测Cry1Ab35蛋白结合蛋白 |
| 5.2.4 Cry1Ab35蛋白结合蛋白LC-MS/MS分析 |
| 5.2.5 美国白蛾幼虫及组织样本制备 |
| 5.2.6 美国白蛾总RNA的提取及cDNA合成 |
| 5.2.7 hcapns基因的克隆与序列分析 |
| 5.2.8 hcapns基因时空表达分析 |
| 5.2.9 饲喂美国白蛾幼虫Cry1Ab35蛋白后hcapns基因表达分析 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 Cry1Ab35蛋白的活化 |
| 5.3.2 美国白蛾中肠BBMV蛋白的检测 |
| 5.3.3 Cry1Ab35蛋白美国白蛾中肠BBMV结合蛋白的鉴定 |
| 5.3.4 美国白蛾中肠Cry1Ab35蛋白结合蛋白质谱分析 |
| 5.3.5 hcapns基因的克隆 |
| 5.3.6 hcapns基因序列分析 |
| 5.3.7 hcapns基因时空表达分析 |
| 5.3.8 饲喂美国白蛾幼虫Cry1Ab35蛋白后hcapns基因表达水平分析 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 美国白蛾HcAPNs蛋白的表达及功能分析 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 供试昆虫 |
| 6.1.2 菌株及质粒 |
| 6.1.3 培养基及试剂 |
| 6.1.4 主要仪器设备 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 重组HcAPNs蛋白在昆虫细胞系Sf9中的表达 |
| 6.2.2 重组HcAPNs蛋白与Cry1Ab35蛋白结合分析 |
| 6.2.3 hcapns基因RNAi及功能分析 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 重组Bacmid-hcapns的构建 |
| 6.3.2 重组HcAPNs蛋白在昆虫细胞系Sf9中的表达 |
| 6.3.3 重组HcAPNs蛋白与Cry1Ab35蛋白结合分析 |
| 6.3.4 dsRNA的合成及检测 |
| 6.3.5 注射美国白蛾幼虫dsRNA-hcapns后hcapns基因表达水平检测 |
| 6.3.6 注射dsRNA-hcapns美国白蛾幼虫对Cry1Ab35蛋白敏感性测定 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 全文结论 |
| 本研究创新点 |
| 参考文献 |
| 在读期间已发表论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（3）苏云金芽胞杆菌新菌株杀虫晶体蛋白基因的克隆与功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略表（中英文对照） |
| 第一章 绪论 |
| 1 苏云金芽胞杆菌的简介 |
| 2 苏云金芽胞杆菌的分布与分离 |
| 3 苏云金芽胞杆菌杀虫毒素 |
| 3.1 苏云金芽胞杆菌杀虫毒素的种类 |
| 3.2 杀虫晶体蛋白的分子结构与功能 |
| 3.3 杀虫晶体蛋白的作用机制 |
| 3.4 杀虫晶体蛋白的生物活性 |
| 4 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白基因 |
| 4.1 杀虫晶体蛋白基因的分类 |
| 4.2 杀虫晶体蛋白基因的鉴定技术 |
| 5 苏云金芽胞杆菌的应用 |
| 6 立体依据及意义 |
| 第二章 Bt kyushuensis亚种4U1菌株cry新基因的克隆及功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1 4U1菌株的伴胞晶体形态观察 |
| 2.2 4U1菌株芽胞晶体混合物的生物活性测定 |
| 2.3 4U1菌株的SDS-PAGE分析 |
| 2.4 4U1菌株原毒素质谱鉴定 |
| 2.5 4U1菌株通用引物鉴定 |
| 2.6 4U1菌株中毒素基因的克隆与序列分析 |
| 3.讨论 |
| 第三章 Bt新菌株的筛选和毒素基因的克隆及功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 研究方法 |
| 2. 结果与分析 |
| 2.1. 苏云金芽胞杆菌的筛选与形态特征 |
| 2.2 Bt菌株的SDS-PAGE分析 |
| 2.3 Bt菌株的基因型鉴定 |
| 2.4 16S rRNA基因测序 |
| 2.5 系统发育树的构建及分类地位 |
| 2.6 Bt 6618菌株芽胞晶体混合物的生物活性测定 |
| 2.7 Bt 6618杀虫晶体蛋白的质谱鉴定 |
| 2.8 Bt 6618菌株毒素基因的克隆及序列分析 |
| 3. 讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 1. 结论 |
| 2. 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间撰写和发表的论文 |
| 课题受资助的基金项目 |
（4）苏云金芽胞杆菌A1菌株的研究和高效工程菌的构建（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1 苏云金芽胞杆菌的生物学特性及分布 |
| 2 苏云金芽胞杆菌研究历史 |
| 3 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白及其基因 |
| 3.1 伴胞晶体蛋白 |
| 3.1.1 ICPs的结构分析 |
| 3.1.2 杀虫晶体蛋白的作用机理 |
| 3.1.3 杀虫晶体蛋白的协同增效 |
| 3.2 BT杀虫晶体蛋白基因 |
| 3.2.1 杀虫晶体蛋白基因的分类 |
| 3.2.2 杀虫晶体蛋白基因的鉴定 |
| 4 BT工程菌的研究及应用 |
| 4.1 拓宽杀虫谱构建广谱BT工程菌 |
| 4.2 提高毒力构建高效表达的BT工程菌 |
| 4.2.1 改造ICPs基因的启动子 |
| 4.2.2 增加ICPs基因拷贝数 |
| 4.2.3 通过辅助蛋自增效作用 |
| 4.3 提高稳定性 |
| 4.4 延缓抗性的产生 |
| 4.5 延长残效期工程菌 |
| 5 研究目的和意义 |
| 第二章 菌株A1的生物学特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 仪器设备 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.1.4 主要试剂 |
| 1.1.5 酶与生化试剂 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 形态特征和晶体观察 |
| 1.2.2 培养特征分析 |
| 1.2.3 鞭毛观察 |
| 1.2.4 A1牛长曲线测定 |
| 1.2.5 Bt总DNA的提取 |
| 1.2.6 Taq DNA聚合酶反应体系 |
| 1.2.7 琼脂糖凝胶电泳及DNA回收测序 |
| 1.2.8 Bt菌株A1杀虫晶体蛋白SDS-PAGE分析 |
| 1.2.9 室内杀虫活性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 菌株的鉴定 |
| 2.1.1 形态特征与晶体观察 |
| 2.1.2 鞭毛观察 |
| 2.1.3 A1菌株在不同培养基上的生长特征观察 |
| 2.2 生长曲线 |
| 2.3 杀虫晶体蛋白基因的鉴定 |
| 2.4 杀虫晶体蛋白分析 |
| 2.5 A1菌株的生物活性测定 |
| 3 讨论 |
| 第三章 菌株A1杀虫蛋白基因的克隆及工程菌的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 分子生物学操作 |
| 1.2.2 阳性克隆的筛选(α-互补筛选) |
| 1.2.3 质粒提取 |
| 1.2.4 全长基因的克隆 |
| 1.2.5 原核表达载体的构建 |
| 1.2.6 基因的穿梭表达载体的构建 |
| 1.2.7 Bt电击感受态细胞的制备与电击转化 |
| 1.2.8 基因表达 |
| 1.2.9 工程菌株的构建 |
| 1.2.10 工程菌的扫描电镜检测 |
| 1.2.11 工程菌的SDS-PAGE检测 |
| 1.2.12 工程菌中质粒的遗传稳定性 |
| 1.2.13 工程菌株的生物活性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 杀虫晶体蛋白基因全长序列的克隆与分析 |
| 2.2 基因表达载体的构建 |
| 2.2.1 原核表达载体的构建 |
| 2.2.2 穿梭表达载体的构建 |
| 2.3 基因的表达 |
| 2.3.1 基因在大肠杆菌中的表达 |
| 2.3.2 基因在无晶体突变株中表达 |
| 2.4 工程菌的构建 |
| 2.5 工程菌的遗传稳定性 |
| 2.6 工程菌株生物活性测定 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（5）苏云金芽胞杆菌MC28基因组完成图及其杀虫功能基因研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 综述 |
| 1 微生物基因组学 |
| 1.1 微生物基因组学的研究进展 |
| 1.2 微生物基因组学的主要内容 |
| 2 腊状芽胞杆菌群细菌基因组研究进展 |
| 3 Bt研究进展 |
| 3.1 Bt的生物学特性 |
| 3.2 杀虫晶体蛋白基因的分类 |
| 3.3 杀虫晶体蛋白的结构和杀虫机理 |
| 3.4 Bt中其它杀虫蛋白的研究 |
| 3.4.1 营养期杀虫蛋白 |
| 3.4.2 苏云金素 |
| 3.4.3 S-layer蛋白 |
| 3.4.4 双效菌素 |
| 3.4.5 肠毒素 |
| 3.4.6 抗癌蛋白 |
| 3.4.7 蛋白酶类杀虫因子 |
| 3.5 Bt内生质粒的特性 |
| 3.6 Bt菌株及其杀虫晶体蛋白的应用 |
| 3.6.1 Bt工程菌的构建 |
| 3.6.2 杀虫晶体蛋白基因在植物抗虫基因工程中的应用 |
| 4 Bt MC28的特性 |
| 5 本课题的立题依据和意义 |
| 第二章 Bt MC28全基因组组装及分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与试剂 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 Bt MC28总DNA提取 |
| 1.2.2 Bt MC28基因组测序和组装 |
| 1.2.3 Bt MC28基因组完成图组装 |
| 1.2.4 完成图组装结果检验 |
| 1.2.5 基因组和内生质粒的开放阅读框预测及注释 |
| 1.2.6 Bt MC28基因组共线性分析 |
| 1.2.7 Bt MC28基因组进化分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 Bt MC28基因组测序结果 |
| 2.2 Bt MC28基因组基本特性 |
| 2.3 Bt MC28染色体上毒力因子的预测和功能分析 |
| 2.4 Bt MC28基因组共线性分析 |
| 2.5 Bt MC28的系统进化分析 |
| 2.6 Bt MC28内生质粒分析 |
| 2.6.1 质粒pMC429 |
| 2.6.2 质粒pMC319 |
| 2.6.3 质粒pMC189 |
| 2.6.4 质粒pMC183 |
| 2.6.5 质粒pMC95 |
| 2.6.6 质粒pMC54 |
| 2.6.7 质粒pMC8 |
| 3 讨论 |
| 第三章 Bt MC28中cry68Aa1、cry70Ba1和cyt1Da1基因原核表达研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 仪器设备 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 分子生物学操作 |
| 1.2.2 阳性克隆的筛选 |
| 1.2.3 E coli质粒DNA提取 |
| 1.2.4 Bt MC28中杀虫晶体蛋白基因的克隆 |
| 1.2.5 序列分析 |
| 1.2.6 表达载体构建 |
| 1.2.7 基因表达及SDS-PAGE电泳检测 |
| 1.2.8 生物测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 新型杀虫基因全长克隆及序列分析 |
| 2.2 Cry68Aa1、Cry70Ba1和Cyt1Da1蛋白氨基酸组成及序列分析 |
| 2.2.1 Cry68Aa1蛋白氨基酸组成及分析 |
| 2.2.2 Cry70Ba1蛋白氨基酸组成及分析 |
| 2.2.3 Cyt1Da1蛋白氨基酸组成及分析 |
| 2.3 杀虫基因表达载体构建 |
| 2.4 杀虫基因在大肠杆菌中的表达和SDS-PAGE检测 |
| 2.5 表达蛋白的生物活性测定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 cry69Aa1基因在Bt无晶体突变株HD73~-中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 仪器设备 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 分子生物学操作 |
| 1.2.2 Bt MC28中杀虫晶体蛋白基因的克隆 |
| 1.2.3 序列分析 |
| 1.2.4 表达载体构建 |
| 1.2.5 Bt电击转化 |
| 1.2.6 基因表达及SDS-PAGE电泳检测 |
| 1.2.7 显微观察 |
| 1.2.8 生物活性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 新型杀虫基因全长克隆 |
| 2.2 Cry69Aa1蛋白氨基酸序列及分析 |
| 2.3 杀虫基因的穿梭表达载体构建 |
| 2.4 重组质粒在Bt无晶体突变株HD73~-中的表达 |
| 2.5 杀虫晶体蛋白的扫描电镜观察 |
| 2.6 Bt转化菌株的生物活性测定 |
| 3 讨论 |
| 第五章 cry54Ab1操纵子在Bt无晶体突变株HD73~-中的表达 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料与仪器 |
| 1.1.1 菌株与质粒 |
| 1.1.2 培养基 |
| 1.1.3 主要试剂 |
| 1.1.4 仪器设备 |
| 1.2 研究方法 |
| 1.2.1 分子生物学操作 |
| 1.2.2 Bt MC28中杀虫晶体蛋白基因的克隆 |
| 1.2.3 序列分析 |
| 1.2.4 表达载体构建 |
| 1.2.5 Bt电击转化 |
| 1.2.6 基因表达及SDS-PAGE电泳检测 |
| 1.2.7 显微观察 |
| 1.2.8 生物活性测定 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 新型杀虫基因全长克隆 |
| 2.2 Cry54Ab1和Orf2蛋白氨基酸序列及分析 |
| 2.2.1 Cry54Ab1蛋白氨基酸序列 |
| 2.2.2 Orf2蛋白氨基酸序列 |
| 2.3 杀虫基因的穿梭表达载体构建 |
| 2.4 重组质粒在Bt无晶体突变株HD73~-中的表达 |
| 2.5 杀虫晶体蛋白的扫描电镜观察 |
| 2.6 Bt转化菌株的生物活性测定 |
| 3 讨论 |
| 总结及后期实验展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在读期间发表科研论文情况 |
| 专利申请情况 |
| 正式命名的新型杀虫晶体蛋白基因 |
（6）苏云金芽胞杆菌HBF-18菌株毒力相关基因的克隆与活性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌及其作为生防微生物研究历史 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白分类及杀虫活性 |
| 1.3 cry 基因的鉴定 |
| 1.4 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白的结构及功能 |
| 1.4.1 DomainⅠ |
| 1.4.2 DomainⅡ |
| 1.4.3 Domain Ⅲ |
| 1.5 杀虫晶体蛋白的作用机制 |
| 1.5.1 Bravo 模型 |
| 1.5.2 Zhang 模型 |
| 1.5.3 Jurat-Fuentes 模型 |
| 1.6 营养期杀虫蛋白(Vegetative insecticidal proteins ,VIPs) |
| 1.6.1 营养期杀虫蛋白分类及杀虫活性 |
| 1.6.2 Vip 蛋白的结构、功能及作用机理 |
| 1.7 苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白的应用及局限性 |
| 1.7.1 苏云金芽胞杆菌的应用 |
| 1.7.2 苏云金芽胞杆菌应用的局限性 |
| 1.8 苏云金芽胞杆菌的增效途径 |
| 1.9 蛴螬及其危害现状 |
| 1.10 苏云金芽胞杆菌与蛴螬防治 |
| 1.11 本研究的立题依据、研究内容和目的意义 |
| 1.11.1 立题依据 |
| 1.11.2 研究内容 |
| 1.11.3 目的意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验所用菌株和质粒 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 供试昆虫 |
| 2.1.4 所用仪器型号 |
| 2.2 研究方法 |
| 2.2.1 Bt 基因组的提取 |
| 2.2.2 大肠杆菌质粒 DNA 的提取 |
| 2.2.3 获得 HBF-18 基因组 DNA 序列 |
| 2.2.4 获得新杀虫蛋白基因-基因推测 |
| 2.2.5 新基因的序列分析 |
| 2.2.6 RNA 的提取与纯化 |
| 2.2.7 RT-PCR |
| 2.2.8 新基因在大肠杆菌中的克隆 |
| 2.2.9 新基因在大肠杆菌中的表达研究 |
| 2.2.10 新基因在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株中的表达 |
| 2.2.11 Bt 菌株杀虫活性的测定 |
| 2.2.12 生测数据处理与分析 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 获得新的杀虫蛋白基因序列 |
| 3.2 序列分析 |
| 3.2.1 cry8 -like 基因序列分析 |
| 3.2.2 vip1，vip2 基因序列分析 |
| 3.2.3 Vip1，Vip2 蛋白信号肽预测 |
| 3.2.4 新基因在 HBF-18 菌株中的转录分析 |
| 3.3 新基因在大肠杆菌中的克隆及表达 |
| 3.3.1 新基因的 PCR 扩增 |
| 3.3.2 新基因异源表达载体的构建 |
| 3.3.3 新基因在大肠杆菌中的表达 |
| 3.4 新基因在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株中的表达 |
| 3.4.1 新基因在大肠杆菌中的克隆 |
| 3.4.2 工程菌电镜照片 |
| 3.4.3 Cry 蛋白的提取及检测 |
| 3.4.4 硫酸铵沉淀法提取 Vip1、Vip2 分泌蛋白 |
| 3.5 新基因的序列及分析 |
| 3.6 杀虫活性测定结果 |
| 3.6.1 Cry8 对铜绿丽金龟生物活性初筛结果 |
| 3.6.2 Cry8 对小菜蛾生物活性初筛结果 |
| 3.6.3 不同重组菌株及组合对暗黑鳃金龟生物活性测定结果及分析 |
| 3.7 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（7）苏云金芽胞杆菌分离鉴定及对马铃薯二十八星瓢虫特异活性菌株研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 引言 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌生物学特性及Bt 菌株的分离鉴定 |
| 1.1.1 苏云金芽胞杆菌生物学特性 |
| 1.1.2 苏云金芽胞杆菌分离鉴定 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌杀虫毒素 |
| 1.2.1 Cry 杀虫晶体蛋白命名 |
| 1.2.2 编码Cry 杀虫晶体蛋白基因的鉴定方法 |
| 1.2.3 Cry 杀虫晶体蛋白结构与功能 |
| 1.2.4 Cry 杀虫晶体蛋白作用机理 |
| 1.3 对鞘翅目昆虫有活性的Bt 杀虫毒素及其应用 |
| 1.3.1 对叶甲类害虫高毒力的Cry 毒素 |
| 1.3.2 对蛴螬类害虫高毒力的Cry 毒素 |
| 1.3.3 对光肩星天牛的研究进展 |
| 1.4 本研究选题的目的和意义 |
| 第二章 含cry7 类基因的菌株分离筛选及生物学鉴定 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 含cry7 基因的菌株筛选 |
| 2.2.2 培养特性及晶体形状观察 |
| 2.2.3 基因型分析 |
| 2.2.4 蛋白型分析 |
| 2.2.5 生物活性 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 对马铃薯二十八星瓢虫特异杀虫活性的Bt WZ-9 菌株研究 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 研究方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 Bt WZ-9 菌株形态与生长特性 |
| 3.2.2 Bt WZ-9 杀虫活性 |
| 3.2.3 Bt WZ-9 菌晶体蛋白SDS-PAGE 分析 |
| 3.2.4 Bt WZ-9 基因型 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 Bt cry7Ab3 基因的克隆和原核表达 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 材料 |
| 4.1.2 研究方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 cry7Ab3 基因克隆和序列分析 |
| 4.2.2 Cry7Ab3 蛋白氨基酸的序列组成分析 |
| 4.2.3 cry7Ab3 基因原核表达 |
| 4.2.4 Cry7Ab3 原核表达蛋白纯化 |
| 4.2.5 多克隆抗体效价 |
| 4.2.6 原核表达Cry7Ab3 蛋白生物活性 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 结论 |
| 第五章 Bt 工程菌构建 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 材料 |
| 5.1.2 研究方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 穿梭表达载体构建 |
| 5.2.2 工程菌构建 |
| 5.2.3 工程菌Bt HD73-Cry7Ab3 蛋白 SDS-PAGE 检测 |
| 5.2.4 晶体形状观察 |
| 5.2.5 工程菌生长特性 |
| 5.2.6 工程菌遗传稳定性 |
| 5.2.7 工程菌晶体蛋白提取和定量 |
| 5.2.8 工程菌的生物活性测定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 Cry7Ab3 蛋白最短活性区的研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验材料 |
| 6.1.2 研究方法 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 不同长度cry7Ab3 基因片段的克隆和检测 |
| 6.2.2 不同长度cry7Ab3 基因片段的表达 |
| 6.2.3 不同Cry7Ab3 蛋白片段的生物活性测定 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第七章 Cry7Ab3 毒素对马铃薯二十八星瓢虫作用机理的研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 材料 |
| 7.1.2 方法 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 胰蛋白酶酶解Cry7Ab3 原毒素结果 |
| 7.2.2 胃蛋白酶酶解Cry7Ab3 原毒素结果 |
| 7.2.3 马铃薯二十八星瓢虫中肠蛋白酶酶解Cry7Ab3 原毒素结果 |
| 7.2.4 Bt Cry7Ab3 原毒素蛋白体外酶解后活性变化 |
| 7.2.5 Cry7Ab3 原毒素对马铃薯二十八星瓢虫中肠组织影响 |
| 7.2.6 Cry7Ab3 活性毒素蛋白纯化及抗体制备 |
| 7.2.7 Cry7Ab3 活性毒素结合受体检测 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| 问题与展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文 |
| 作者简历 |
| 致谢 |
（8）苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的研究进展（论文提纲范文）
| 1 Bt毒素的分类和基因型的命名 |
| 1.1 Bt毒素的分类 |
| 1.2 Bt伴孢晶体编码基因的命名 |
| 2 伴孢晶体的蛋白结构和杀虫机理 |
| 2.1 伴孢晶体的蛋白结构 |
| 2.2 杀虫晶体蛋白的作用机理 |
| 3 Bt/杀虫蛋白的应用 |
| 3.1 野生菌株直接工业化生产 |
| 3.2 构建基因工程菌株 |
| 3.3 构建Cry毒素蛋白转基因植物 |
| 4 Bt生物农药的发展前景 |
（9）苏云金芽孢杆菌的筛选与伴孢晶体编码基因的克隆与序列分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 苏云金芽孢杆菌毒素的分类和基因型的命名 |
| 1.1.1 苏云金芽孢杆菌毒素的分类 |
| 1.1.2 Bt 伴孢晶体编码基因的命名 |
| 1.1.3 对地下害虫蛴螬有杀虫活性的基因 |
| 1.2 伴孢晶体的蛋白结构和杀虫机理 |
| 1.2.1 伴孢晶体的蛋白结构 |
| 1.2.2 杀虫晶体蛋白的作用机理 |
| 1.3 Bt 杀虫蛋白的应用 |
| 1.3.1 野生菌株直接工业化生产 |
| 1.3.2 构建工程菌株 |
| 1.3.3 用于转基因植物中，抗病虫害 |
| 1.4 本论文的研究目的及意义 |
| 2 产伴孢晶体的苏云金芽孢杆菌的菌株筛选 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 对照菌株 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 仪器设备与试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 产伴孢晶体菌株的显微观察初选方法的建立 |
| 2.2.2 cry 基因型鉴定复筛方法的建立 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 CGMCC 1.1752 和 CGMCC 1.1754 菌株的显微镜观察 |
| 2.3.2 CGMCC 1.1752 和 CGMCC 1.1754 菌株 cry 基因型鉴定 |
| 2.3.3 伴胞晶体产生菌的筛选 |
| 2.3.4 TS3 菌株的 cry 基因型的鉴定 |
| 2.4 小结 |
| 3 伴胞晶体产生菌 TS3 的鉴定 |
| 3.1 材料与试剂 |
| 3.1.1 菌株与培养基 |
| 3.1.2 引物与试剂 |
| 3.2 生理生化实验原理 |
| 3.2.1 API 20E 试剂盒 |
| 3.2.2 API 50CH 试剂盒 |
| 3.2.3 API ZYM 试剂盒 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 菌株 16S rRNA 基因的系统发育分析 |
| 3.3.2 生理生化方法 |
| 3.4 结果与讨论 |
| 3.4.1 16S rRNA 基因的系统发育分析 |
| 3.4.2 生理生化实验结果与分析 |
| 3.5 小结 |
| 4 TS3 菌株的 cry8 型全基因的克隆 |
| 4.1 材料与试剂 |
| 4.1.1 实验菌株 |
| 4.1.2 PCR 扩增引物 |
| 4.1.3 试剂与仪器设备 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 菌株培养 |
| 4.2.2 菌株 cry8 型全基因克隆 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.4 小结 |
| 5 CGMCC 1.17 52 菌种发酵中的碳源和氮源的优化 |
| 5.1 材料与试剂 |
| 5.1.1 菌株 |
| 5.1.2 培养基 |
| 5.1.3 试剂及溶液 |
| 5.2 蛋白含量检测的方法 |
| 5.2.1 标准曲线的制定 |
| 5.2.2 发酵培养及测定方法 |
| 5.3 结果与讨论 |
| 5.3.1 绘制标准曲线 |
| 5.3.2 发酵液中蛋白含量的测定 |
| 5.4 小结 |
| 6 总结 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 |
| 致谢 |
（10）对金龟甲科、叶甲科害虫高毒力苏云金芽胞杆菌杀虫基因及工程菌的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 插图和附表 |
| 英文缩略表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 苏云金芽胞杆菌杀虫毒素 |
| 1.2 苏云金芽胞杆菌Cry 类杀虫晶体蛋白 |
| 1.2.1 Bt 杀虫晶体蛋白及其分类 |
| 1.2.2 对地下害虫蛴螬有杀虫活性的基因 |
| 1.3 Cry 类杀虫晶体蛋白结构与功能之间的关系 |
| 1.3.1 Cry 类杀虫晶体蛋白结构 |
| 1.3.2 Cry 类杀虫晶体蛋白结构与功能的关系 |
| 1.4 Cry 杀虫晶体蛋白的作用方式 |
| 1.4.1 作用模型 |
| 1.4.2 原毒素溶解与活化 |
| 1.4.3 与受体结合 |
| 1.5 苏云金芽胞杆菌的应用 |
| 1.5.1 转基因微生物 |
| 1.5.2 转杀虫cry 基因植物 |
| 1.6 转基因生物的安全性 |
| 1.7 本论文研究的目的与意义 |
| 第二章 Bt145 菌株中cry8 类基因的克隆 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 菌株与质粒 |
| 2.1.2 培养基与抗生素 |
| 2.1.3 酶与生化试剂 |
| 2.1.4 常用溶液与缓冲液 |
| 2.1.5 供试昆虫 |
| 2.1.6 仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 Bt145 菌株形态观察 |
| 2.2.2 Bt145 菌株生长曲线测定及蛋白检测 |
| 2.2.3 Bt145 菌株的大质粒提取 |
| 2.2.4 Bt145 菌株cry 基因的 PCR-RFLP |
| 2.2.5 cry8 类基因的克隆与表达 |
| 2.2.6 大肠杆菌JM110 热击感受态细胞制备与热击转化 |
| 2.2.7 大肠杆菌SCS110 电击感受态细胞制备与电击转化 |
| 2.2.8 大肠杆菌中质粒的提取 |
| 2.2.9 Bt 电击感受态细胞的制备与电击转化 |
| 2.2.10 阳性转化子的筛选 |
| 2.2.11 序列测定及分析 |
| 2.2.12 cry8 类新基因在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株中的表达 |
| 2.2.13 生测菌株粉剂的制备 |
| 2.2.14 Bt 菌株杀虫活性的测定 |
| 2.2.15 数据处理 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 Bt145 菌株生物学特性的研究 |
| 2.3.2 Bt145 的生长曲线与菌株蛋白表达 |
| 2.3.3 Bt145 的大质粒图谱 |
| 2.3.4 Bt145 菌株中杀虫晶体蛋白基因的PCR-RFLP 鉴定 |
| 2.3.5 Bt145 菌株中新型cry8 类基因的克隆与表达 |
| 2.3.6 克隆的cry8 类新基因的序列及分析 |
| 2.3.7 cry8Ga2 基因在苏云金芽胞杆菌无晶体突变株中的表达 |
| 2.3.8 cry8Ga2 基因杀虫活性的研究 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 BtSU4 菌株中cry8 类基因的克隆 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 菌株与质粒 |
| 3.1.2 其它材料 |
| 3.2 研究方法 |
| 3.2.1 cry8 类基因的克隆 |
| 3.2.2 cry8 类基因的Bt 表达载体的构建 |
| 3.2.3 Bt 菌株蛋白的提取 |
| 3.2.4 Bt 蛋白的消化 |
| 3.3 结果和分析 |
| 3.3.1 BtSU4 菌体形态特征观察 |
| 3.3.2 Bt 菌株生长曲线测定 |
| 3.3.3 BtSU4 菌株的大质粒图谱分析 |
| 3.3.4 BtSU4 菌株中杀虫晶体蛋白基因的PCR-RFLP |
| 3.3.5 BtSU4 菌株中新型cry8 类基因的克隆 |
| 3.3.6 cry8 类基因序列测定及分析 |
| 3.3.7 BtSU4 菌株中新型cry8 类基因的表达研究 |
| 3.3.8 Cry8 蛋白的消化 |
| 3.3.9 BtSU4 野生菌株和重组菌株HD8H 和HD81 杀虫活性的研究 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 cry 基因在宿主菌 BtSU4 菌株中的表达分析 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 菌株与引物 |
| 4.1.2 培养基与抗生素 |
| 4.1.3 酶与生化试剂 |
| 4.1.4 常用溶液与缓冲液 |
| 4.1.5 实验仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 RNA 的提取与纯化 |
| 4.2.2 RT-PCR |
| 4.2.3 Cry8Ha1 和Cry8Ia1 蛋白的提取与纯化 |
| 4.2.4 抗体的制备与纯化 |
| 4.2.5 SDS-PAGE 及Western 杂交 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 cry8Ha1 和cry8Ia1 基因在BtSU4 菌株中的转录分析 |
| 4.3.2 Cry8Ia1 蛋白的纯化及抗体的制备 |
| 4.3.3 cry8Ia1 基因在BtSU4 菌株中的表达情况 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 对鞘翅目害虫高毒力工程菌的构建 |
| 5.1 材料与试剂 |
| 5.1.1 菌株和质粒 |
| 5.1.2 供试昆虫 |
| 5.1.3 酶与试剂 |
| 5.1.4 仪器设备 |
| 5.2 试验方法 |
| 5.2.1 工程菌株3A-SU4 和3A-HBF 的构建 |
| 5.2.2 工程菌的扫描电镜检测 |
| 5.2.3 工程菌的SDS-PAGE 和Western blot 检测 |
| 5.2.4 工程菌中质粒的遗传稳定性 |
| 5.2.5 工程菌的生长情况观察 |
| 5.2.6 室内生物活性测定菌株粉剂的制备 |
| 5.2.7 工程菌株的生物活性测定 |
| 5.2.8 生测数据处理 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 工程菌的构建 |
| 5.3.2 晶体形态检测 |
| 5.3.3 工程菌株的SDS-PAGE 检测 |
| 5.3.4 工程菌的遗传稳定性 |
| 5.3.5 工程菌3A-SU4 和3A-HBF 的生长特性 |
| 5.3.6 工程菌株室内生物活性的测定 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 Cry8 类蛋白作用机理的研究 |
| 6.1 材料与试剂 |
| 6.1.1 菌株与质粒 |
| 6.1.2 引物对及扩增的片段 |
| 6.1.3 培养基与抗生素 |
| 6.1.4 酶与生化试剂 |
| 6.1.5 缓冲液 |
| 6.1.6 供试昆虫 |
| 6.1.7 主要仪器 |
| 6.2 研究方法 |
| 6.2.1 重叠PCR 获得杂合基因 |
| 6.2.2 杂合基因的PCR-RFLP 鉴定 |
| 6.2.3 杂合基因的克隆与表达 |
| 6.2.4 中肠液的提取与蛋白的消化实验 |
| 6.2.5 Cry8 类蛋白对胰凝乳蛋白酶稳定性及生物活性 |
| 6.2.6 BBMV 的制备 |
| 6.2.7 Bt 毒素的提取与纯化 |
| 6.2.8 Bt 毒素的生物素标记 |
| 6.2.9 Bt 毒素与昆虫BBMV 的体外结合实验 |
| 6.3 结果与分析 |
| 6.3.1 杂合基因的获取与鉴定 |
| 6.3.2 杂合基因的克隆 |
| 6.3.3 杂合基因在HD-73~-菌株中的表达 |
| 6.3.4 杂合蛋白生物活性的测定 |
| 6.3.5 昆虫中肠液对Cry8 类蛋白的消化作用 |
| 6.3.6 Cry8 类蛋白对胰凝乳蛋白酶的稳定性实验 |
| 6.3.7 Cry 毒素的纯化与生物素标记 |
| 6.3.8 Cry 毒素与蛴螬BBMV 结合分析 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、高毒广谱杀虫Bt工程菌TnY（论文参考文献）
- [1]苏云金芽胞杆菌G033A产业化现状及应用前景分析[J]. 王宇航,束长龙,耿丽丽,刘华梅,张杰. 中国生物防治学报, 2020(06)
- [2]美国白蛾中肠氨肽酶N的鉴定及其在Cry1Ab35蛋白杀虫机制中功能研究[D]. 张雅昆. 河北农业大学, 2018(02)
- [3]苏云金芽胞杆菌新菌株杀虫晶体蛋白基因的克隆与功能研究[D]. 张晨. 湖南师范大学, 2015
- [4]苏云金芽胞杆菌A1菌株的研究和高效工程菌的构建[D]. 唐裕杰. 四川农业大学, 2013(03)
- [5]苏云金芽胞杆菌MC28基因组完成图及其杀虫功能基因研究[D]. 关鹏. 四川农业大学, 2013(03)
- [6]苏云金芽胞杆菌HBF-18菌株毒力相关基因的克隆与活性研究[D]. 张彦蕊. 中国农业科学院, 2012(10)
- [7]苏云金芽胞杆菌分离鉴定及对马铃薯二十八星瓢虫特异活性菌株研究[D]. 宋萍. 河北农业大学, 2012(08)
- [8]苏云金芽孢杆菌伴孢晶体的研究进展[J]. 李雪,马玉超,李煦,于慧敏,张建. 安徽农业科学, 2012(10)
- [9]苏云金芽孢杆菌的筛选与伴孢晶体编码基因的克隆与序列分析[D]. 李雪. 齐齐哈尔大学, 2012(02)
- [10]对金龟甲科、叶甲科害虫高毒力苏云金芽胞杆菌杀虫基因及工程菌的研究[D]. 闫贵欣. 中国农业科学院, 2009(10)