一、大鼠成肌细胞体外培养及其自发收缩特性（论文文献综述）
王亚奇[1]（2020）在《成肌细胞G0期模型构建及应力诱导下p38与JNK交互对话调控细胞周期》文中进行了进一步梳理目的:本实验首先建立L6成肌细胞静止期（G0期）模型,细胞在G0期仍可被激活并重新进入细胞循环周期,以确保后续实验中细胞基本处于均衡一致状态,且活力尚可。在此基础,模拟成肌细胞应力加载模型,在宏观层面观察应力刺激成肌细胞体外生长时,细胞周期变化。从微观层面探讨丝裂原活化蛋白激酶（MAPK Mitogen--Activated Proton Kinase）信号通路中p38 MAPK与JNK如何交互作用调节下游相关蛋白最终参与到周期调节中,为阐明颌面部肌肉适应性改建的机制提供依据,为功能矫形治疗提供理论支持。方法:实验对象为大鼠成肌细胞L6,传代培养后诱导细胞进入暂不分裂的休眠期,运用流式细胞术和蛋白免疫印迹法分别检测细胞周期改变和Ki67表达变化,确认基本所有细胞进入G0期。使用含10%胎牛血清的促增殖培养液激活细胞,使重新进入G1期。分别于6 h、12 h、18 h、24 h观察细胞数目及活力,提取样本,检测细胞周期的变化、增殖标志性蛋白Ki67及其他周期相关蛋白变化。将重新激活12 h的细胞分为对照组及加力组,加力组细胞施以周期性应力,时间分别为1 h、3 h、6 h、12 h,加载频率为10 cycles/min,张力幅度为15%细胞形变,对照组不加力。观察应力作用下细胞形态及排列方向的变化,检测两组细胞周期分布、p38 MAPK（p-p38 MAPK）与JNK（p-JNK）通路是否被激活（或抑制）,同时检测其下游周期调控相关蛋白CyclinD1、p21、p57。最后,应用p38特异性抑制剂（SB203580）进一步明确p38与JNK交互作用及其对细胞周期的影响。结果:1.成功建立L6-G0期模型,流式结果示S期细胞数量低于2%,Western Blot结果显示细胞增殖标志性蛋白Ki67表达几乎完全抑制。2.转入含10%胎牛血清培养条件中分别孵育6 h、12 h、18 h、24 h,镜下可见细胞逐渐激活、密度增加,同时流式及Western Blot结果均显示细胞重新进入S期,并在12h呈现出增殖高峰。3.将激活12 h组细胞,按照上述参数加载应力,观察到细胞的排列会随应力刺激出现形状及排列方向变化。4.流式结果显示,与对照组相比,加力组中S期细胞比例下降,其中加力时间为3 h、6 h时差异有统计学意义。5.Western Blot中,p-p38 MAPK在受力细胞中表达显着升高,相反p-JNK在实验组表达适当降低。同时,实验组细胞CyclinD1表达低于对照组,p21及p57则表达升高。6.p38特异性抑制剂（SB203580）使用后,相对单纯加力组,抑制剂处理后的受力细胞增殖率无明显变化,p-p38表达骤减,相反JNK表达升高,同时伴随CyclinD1表达升高,而p21在抑制剂组表达量无明显下降。结论:特定的周期性应力通过激活p38MAPK通路,抑制下游CyclinD1表达,从而阻止细胞无限增殖;且p38MAPK与JNK存在交互对话,当p38MAPK活性抑制,JNK则明显被激活。有趣的是p38MAPK通路失活并未引起S期细胞比例剧增,推测在此过程中存在其他通路及蛋白参与到调节细胞周期中来。
Budsuren Undarmaa[2]（2020）在《蒙古马肌肉卫星细胞中MSTN调控网络的研究》文中研究表明肌生长抑制素（Myostatin,MSTN）是TGF-β超家族的成员,它是几种哺乳动物物种中骨骼肌生长和分化相关核心的负调节基因。此外,MSTN也称为“速度”基因,是被公认的在多个物种中影响不同个体速跑能力的主要遗传因素。迄今为止,已经确定了 MSTN基因上游和下游区域的许多序列和结构变异,都与纯种马的赛马表现有关。由此,在多种商品化速度马（Equinome Speed）遗传测试中MSTN基因被用于预测马匹适合的赛跑距离类型,从而帮助育马人提升选择,繁殖或训练中的决策能力。然而目前,MSTN基因的研究在其他马品种中开展的很少,关于这些品种马中MSTN基因的调控网络也知之甚少。据我们所知,这是第一个研究MSTN基因敲除对马模型中肌肉卫星细胞和功能以及全身代谢的影响的研究。在这项研究中,我们提供了在基因组,转录本水平上马中肌生长抑制素基因的表征。当前,其他研究尚未探索MSTN敲低效应的转录组概况,并且马骨骼肌再生中的相关信号传导途径仍然有限。因此,这项研究的基本目的是第一次分析转录组分析揭示的下游基因网络,因为这种机制通过敲除MSTN限制对肌肉卫星细胞的过度调节作用在蒙古本地马中尚不清楚。这项研究的目的是按照主要程序,调查MSTN knock down和对照摸索之间基因表达的差异:①培养和表征马肌肉卫星细胞;②建立基于质粒的MSTN in vitro调控系统;③分析马肌肉卫星细胞中MSTN的下游调控网络。主要结果如下:（1）我们探索了体外分离培养蒙古马卫星细胞的体系,并通过细胞形态观察、细胞增殖实验和PAX7、MyoD、Desmin等标志物的Q-PCR和免疫荧光实验证明了本研究中我们通过利用酶消化和预铺板联合使用的方法,最终在体外成功分离获得了较纯的体外蒙古马卫星细胞系。（2）成功构建了针对马MSTN基因的真核过表达质粒载体pEGFP-eMSTN和miRNA介导的真核表达干扰质粒载体pTd Tomato-miRNAs-eMSTN。（3）通过RNA-seq方法探究MSTN干扰对蒙古马卫星细胞转录组的影响发现MSTN可通成影响肌细胞因子（PAX家族和成肌调控因子家族）、细胞周期因子、Notch、MAPK、WNT等多种关键信号途径在蒙古马卫星细胞中在增殖和细胞周期等复杂的多种细胞过程中发挥调控功能。（4）体外细胞增殖实验证明,MSTN干扰可显着加快蒙古马卫星细胞的增殖速度。
陈笑笑[3]（2020）在《基于GelMA微纤维的骨骼肌单轴拉伸诱导生成及致动特性研究》文中研究说明生物混合致动器具有固有的安全性、高能效、低能耗、高敏感度以及自修复能力,为仿生机器人设计提供了新的思路。生物混合致动器的主要动力来源是可收缩的细胞或组织,在此之中,组织工程化骨骼肌具有细胞来源广、组织工程化难度低、可控性高、功率重量比高且可自修复等特性,使其成为最有潜力的生物混合致动器的动力来源。骨骼肌是常见的纤维状组织,其结构对其功能完整性及基于骨骼肌的致动器的应用场景具有重要影响,因此有必要在体外复制出其微纤维状结构。然而,现有的微纤维加工方法或由于其极端的加工条件不适宜于纤维状细胞衍生物的构建,或由于多步固化、离子型凝结剂暴露容易造成细胞损伤。天然骨骼肌长期处于机械场中,这对于骨骼肌的发育具有重要意义。然而,机械刺激诱导骨骼肌体外生成的系统性研究,受到设备复杂控制系统、较大占用空间或细胞高污染风险等限制,很难在培养系统中进行。另外,组织工程化骨骼肌有限的致动能力及寿命,为其在生物混合致动方面的应用带来了重重挑战。本论文从用于生物混合致动的组织工程化骨骼肌的需求出发,制备了致密排列、长寿命且高性能的基于明胶-甲基丙烯酰基（GelMA）微纤维的骨骼肌。主要研究内容和结果如下:1.仿骨骼肌胞外基质GelMA微纤维的制备。提出了基于有机硅管的无凝固浴法进行GelMA微纤维的加工,通过一次UV曝光获得数十厘米长的均质多孔微纤维。该方法易于操作、材料限制小且成本低,适用性广。通过改变曝光时间得到了结构和刚度类似于天然骨骼肌的微纤维。温和的加工条件和GelMA优异的物理特性避免了由于剪切应力、极端环境和离子凝结剂暴露引起的细胞损伤,有利于培养过程中营养物质的扩散和高细胞活性的维持,使其在骨骼肌组织工程中具有较大的应用潜力。2.单轴拉伸诱导微纤维状骨骼肌生成的研究。我们设计了基于柱-孔阵列的拉伸装置,将单轴拉伸用于GelMA微纤维中C2C12成肌细胞的行为调控。这种独立的小型化拉伸装置可重复使用、成本低、损耗低、灵活度高。通过将其与培养系统集成,为细胞机械响应的系统性分析提供了研究平台。单轴拉伸的施加有效改善了细胞的扩散、伸长和取向,显着增加了肌管的尺寸及成熟度,并在应变≥35%时达到饱和水平。以上结果表明单轴拉伸能够有效地促进微纤维状骨骼肌的生成和成熟。微纤维状骨骼肌的致动性能具有优异的可控性,且随着应变的增加,其致动能力明显提高,而致动模式则从扭转模式（应变<25%）转变为线性收缩（应变≥25%）。对机械刺激诱导微纤维中成肌细胞定向生长及骨骼肌生成的系统性分析,使我们对机械刺激在骨骼肌生成的各个阶段所起的作用有了更深入的了解。而单轴拉伸对微纤维状骨骼肌致动能力及致动模式的影响,使得生物混合致动器的定制更加便利,可拓宽其应用领域。3.微纤维状骨骼致动性能优化研究。为了提高微纤维状骨骼肌的细胞密度,本文引入了单轴拉伸与类胰岛素样生长因子-I（IGF-I）。它们共同作用,对微纤维状骨骼肌生成进行调控,明显促进了肌管密度和尺寸的增大,并延缓了肌管收缩能力随培养时间的衰减,有利于延长其使用寿命。为了改善微纤维状骨骼肌的致动性能,我们引入了电刺激训练。单轴拉伸、IGF-I与电刺激训练相结合,极大地促进成肌细胞的增殖和肌管的生成以及成熟,使肌管的收缩位移增大为原来的～3.2倍。这种具有高密度肌管序列、致动能力改善的微纤维状骨骼肌在生物混合致动方面具有巨大的应用潜力。基于以上内容,本论文的创新点如下:提出了一种基于有机硅管的无凝固浴的方法来制造微纤维状的仿骨骼肌胞外基质。设计了基于柱-孔阵列的小型化、低能耗的拉伸装置,用于细胞行为、骨骼肌生成及致动性能的调控。并且引入了单轴拉伸、IGF-I与电刺激训练的综合作用,使得微纤维状骨骼肌的致动性能得到大幅度提高,同时延缓了其功能的衰退,使其能够满足在生物混合驱动等方面的应用需求。
卢群文[4]（2019）在《模拟推拿机械力刺激干预大鼠骨骼肌细胞生物力学效应研究》文中研究表明推拿手法作为传统中医外治疗法,其本质为机械力学刺激,能产生如压力、张力、摩擦力和剪应力等多种形式的“推拿力”（机械力）,在机械力作用下人体组织细胞对机械刺激的反应可能是推拿细胞生物力学原理之一,如何将力学信号转变为各种生化信号是推拿手法机制研究的关键。目前,对手法生物力学原理的研究已由宏观向微观深入,但体内复杂的力学环境因素使体内研究难以区别单一效应或特定的联合效应,基于细胞分析的体外细胞培养技术给这一难题的解决带来转机;机体内的各种力学敏感细胞是手法机械力作用的主要部位和效应靶点;通过文献检索我们发现,目前,已有研究者构建了一些推拿手法相关的骨骼肌细胞体外培养-力学刺激模型,发现不同参数（频率、时间、力）作用下组织细胞的部分力学响应特征,但他们之间的关系未能得到很好的阐述;我们前期工作发现相同手法的不同生物力学参数及其所引发的力学效应存在差异,但是因为何种因素导致这种不同生物力学参数机械力刺激下力学效应的差异?不同生物力学参数机械力刺激下细胞的生物力学效应有何异同?我们仍然认识较浅。目的:构建骨骼肌细胞体外培养-力学刺激模型,模拟推拿机械力刺激,观察恒定压力作用下不同刺激时间以及固定时间不同应力模式、不同强度刺激下大鼠骨骼肌细胞（RSkMCs）生物学力响应特征,探讨推拿手法效应机制。方法:体外培养RSkMCs,采用四点弯曲细胞力学加载系统（FPBS）施加类推拿机械力刺激,观察恒定压力作用下不同时间;及固定时间,不同应力模式、不同强度机械力作用下RSkMCs生物力学效应的变化,采用倒置生物显微镜观察细胞形态及排列变化,流式细胞仪（FCM）分析细胞周期、凋亡及细胞内Ca2+浓度变化,计算细胞S期细胞比例（SPF）及增殖指数（PI）的变化;免疫组织化学（IHC）检测MyOD、Myf5蛋白表达水平的变化;酶联免疫吸附实验（ELIS A）和硝酸还原酶法（NRM）分别检测培养上清液中白介素6（IL-6）、前列腺素E2（PGE2）和一氧化氮（NO）浓度的变化;分析各指标之间相关性。结果:1.细胞形态及排列改变与机械力刺激时间、强度及应力模式有关,刺激时间越长、强度越大细胞形态及排列改变越明显;压缩性应力细胞形态趋于类圆形改变,牵张性应力细胞形态趋于梭形改变,交互应力细胞形态及排列改变不明显。2.不同时间、应力模式及强度的机械力对细胞凋亡的影响存在差异,持续压力作用下,细胞凋亡成一定的时间依赖性,时间越长细胞凋亡越明显;固定刺激时间30min,不同模式的应力刺激均可以促进细胞凋亡,持续压力促进细胞凋亡作用强于周期性作用力;轻、中强度的刺激可以抑制细胞凋亡,而重强度的刺激对细胞的凋亡作用与力学性质有关,单一性质压力刺激抑制凋亡,组合交互性质（压缩-牵张/牵张-压缩）刺激促进细胞凋亡。3.机械力可以通过影响SPF而影响细胞增殖,持续压力刺激对肌细胞的SPF及PI呈双向调节作用,短时间（<90min）抑制,长时间（120min）促进;刺激时间30min,周期性牵张应力可以显着增加SPF及PI;轻、中、强三种强度刺激均可增加SPF及PI,以轻、重刺激作用明显。4.机械力刺激可以影响肌细胞的分泌,短时间（<30min）、轻、中刺激显着提升肌细胞培养上清液中PGE2和NO浓度及胞内Ca2+浓度,重刺激胞内Ca2+浓度与力学模式有关,组合交互性质（压缩-牵张/牵张-压缩）机械力提升胞内C a2+浓度,单一性质压力无显着影响;力的性质而言,周期性牵张应力可以显着提升肌细胞培养上清液中PGE2和NO浓度及胞内Ca2+浓度;持续压力、重刺激肌细胞培养上清液中IL-6浓度有降低趋势。5.MyoD、Myf5蛋白的表达与机械力刺激时间、强度、性质有关,持续压力作用,短时间（<30min）促进MyoD、Myf5蛋白的表达,但随着时间延长促进作用减弱;刺激时间30min,MyoD、Myf5对周期性作用力敏感;不同强度单一性质压力刺激对MyoD、Myf5蛋白的表达无影响,组合交互性质（压缩-牵张/牵张-压缩）轻、中、强度刺激可以促进MyoD、Myf5蛋白的表达。结论:1.不同时间、应力模式及强度的机械力引发的细胞生物力学效应存在差异,细胞可以通过改变形态、周期、增殖与凋亡、分泌及蛋白的合成等力学组学形式来响应机械力刺激,通过多层次的力学-化学-生物学耦合作用产生生物学效应。2.细胞直接感受机械力刺激并调控生物信号的转导可能是推拿手法发挥局部治疗作用的效应机制之一。3.合理的用力模式及时间、强度是推拿手法发挥治疗效应的关键因素。
陈玉佩[5]（2019）在《电针“委中”对大鼠腰多裂肌细胞外基质重塑和卫星细胞增殖的影响》文中提出腰痛是全球范围内高发且复发率极高的一种公共健康问题,严重影响人们的工作效率和生活质量。由此带来的高额医疗费用,给个人和社会带来了巨大的经济负担。寻求一种安全有效且花费较少的腰痛治疗方法是目前医疗相关部门正在解决的问题。针刺作为一种安全、有效、无创的物理治疗方式被广泛推荐为腰痛的临床治疗方法。位于竖脊肌深层的腰部多裂肌在维持腰椎稳定性方面发挥重要作用。多裂肌形态的改变和功能的紊乱都会诱发或加重腰痛。因此,维持多裂肌正常的形态和功能是预防腰痛发生的关键。肌卫星细胞是骨骼肌损伤后再生修复的干细胞,肌卫星细胞的增殖是受损骨骼肌实现再生修复的关键。课题组前期对电针“委中”穴治疗多裂肌损伤所致腰痛模型的机制做了大量研究,发现电针“委中”穴可能通过调节血清中白细胞介素-17（IL-17）、血清肌酸激酶（CK）等,促进损伤多裂肌早期的再生修复,且以第4天的疗效最为明显。因此,本研究结合动物实验和细胞实验观察电针“委中”穴对损伤多裂肌再生修复的影响,以及再生修复过程中Integrinβ 1/ERK途径对肌卫星细胞增殖相关分子和细胞外基质（Extracell ular matrix,ECM）中胶原蛋白I（Collagen I）、基质金属蛋白酶2（Matrix Metalloproteinases,MMP2）表达的影响,揭示电针“委中”穴促进腰多裂肌损伤后再生修复的部分作用机制。实验一电针“委中”穴对大鼠腰多裂肌损伤后Collagen I、MMP2表达的影响目的:观察电针“委中”穴对大鼠腰多裂肌损伤后与骨骼肌增殖相关的成肌分化抗原（MyoD）、配对核转录因子7（Pax7）和ECM中Collagen I、MMP2表达的影响,揭示电针“委中”穴促进腰多裂肌损伤修复的部分作用机制。方法:SPF级雄性SD大鼠24只,随机分为正常组、模型组、电针组,每组8只,双侧腰4、5节段多裂肌局部注射0.5%的布比卡因建立多裂肌损伤的腰痛模型,电针组选取双侧“委中”穴进行电针治疗,频率2/100Hz,电流强度1-2mA,20min/次,1次/天,共针刺3次,正常组与模型组不给予针刺干预。第4天各组大鼠腹主动脉取血,制备针刺血清;收集损伤部位多裂肌,观察HE染色后多裂肌的形态学变化和Masson染色后胶原纤维的变化;WB检测MyoD、Pax7、Collagen I、MMP2的蛋白表达情况。结果:（1）肌肉注射0.5%的布比卡因导致多裂肌形态发生明显改变。（2）布比卡因注射后,多裂肌中胶原纤维数量增加;电针干预后胶原纤维数量减少。（3）Collagen Ⅰ、MMP2蛋白表达:与正常组比较,模型组CollagenⅠ、MMP2蛋白表达升高（P<0.01,P<0.05）;与模型组比较,电针组Collagen Ⅰ蛋白表达降低（P<0.01）、MMP2蛋白表达升高（P<0.01）。（4）MyoD、Pax7蛋白表达:与正常组比较,模型组MyoD蛋白表达升高（P<0.01）、Pax7蛋白降低（P<0.01）;与模型组比较,电针组MyoD、Pax7蛋白表达升高（P<0.05,P<0.01）。结论:电针“委中”穴可能通过良性调节ECM中Collagen Ⅰ、MMP2的蛋白表达,促进多裂肌增殖,实现损伤多裂肌早期的再生修复。实验二大鼠腰多裂肌卫星细胞的分离培养与鉴定目的:通过酶消化法建立一种多裂肌MSCs分离、纯化、培养及鉴定的有效方法。方法:SPF级雄性SD大鼠1只,分离获取腰4、5节段多裂肌,用I型胶原酶消化,使用差速贴壁法对腰多裂肌MSCs进行纯化处理,采用免疫荧光细胞化学染色检测Pax7、MyoD、MyHC的表达进行鉴定。结果:（1）形态学观察可见,分离、纯化得到的腰多裂肌MSCs形态为圆形,折光性强,培养一段时间后,细胞呈梭型。分离所得到的细胞具有一致的生长方式和形态特点。（2）免疫荧光细胞化学染色结果显示,分离得到的腰多裂肌MSCs在静止期表达Pax7、增殖期表达MyoD、分化早期表达MyHC。结论:应用酶消化法可以成功分离获得多裂肌MSCs,其相关特异性标志物表达为阳性,说明该方法是一种简单、高效的分离、培养、鉴定多裂肌MSCs的方法。实验三电针血清促进大鼠腰多裂肌细胞外基质重塑和肌卫星细胞增殖与ERK关系的研究目的:观察ERK在电针血清促进多裂肌MSCs增殖和ECM重塑过程中Collagen Ⅰ、MMP2表达的影响,探讨电针血清促进ECM重塑和MSCs增殖作用与ERK之间存在的关系。方法:以实验一中所制备的正常血清、模型血清、电针血清,另加设ERK抑制剂血清（电针血清+PD98059）为干预手段,培养实验二中分离鉴定所得的MSCs。共培养24h后,CCK-8检测各组MSCs的增殖能力;WB检测各组Collagen Ⅰ、MMP2、MyoD、Pax7、ERK的蛋白表达;RT-PCR检测 Collagen Ⅰ、MMP2 的 mRNA 表达。结果:（1）WB结果显示,与正常血清组比较,模型血清组ERK蛋白表达显着下降（P<0.01）;与模型血清组比较,电针血清组ERK蛋白表达显着增加（P<0.01）。（2）MSCs增殖能力检测:①CCK-8:与正常血清组比较,模型血清组MSCs的增殖能力显着下降（P<0.01）;与模型血清组比较,电针血清组MSCs的增殖能力显着上升（P<0.01）,抑制剂血清组MSCs的增殖能力显着下降（P<0.01）;与电针血清组比较,抑制剂组MSCs的增殖能力显着下降（P<0.01）。②WB检测MyoD、Pax7:与正常血清组比较,模型血清组蛋白表达显着下降（P<0.01）;与模型血清组比较,电针血清组的蛋白表达显着增加（P<0.01）,抑制剂血清组与模型血清组比较无差异（P>0.05）;与电针血清组比较,抑制剂血清组蛋白表达显着下降（P<0.01）。（3）WB和RT-PCR检测ECM重塑:与正常血清组比较,模型血清组Collagen I蛋白、mRNA表达显着增加（P<0.01）,MMP2 mRNA表达下降（P<0.01）;与模型血清组比较,电针血清组Collagen I蛋白、mRNA表达显着降低（P<0.01）、MMP2蛋白表达增加（P<0.01）;与电针血清组比较,抑制剂血清组Collagen Ⅰ蛋白、mRNA表达显着增加（P<0.01）、MMP2蛋白表达显着降低（P<0.01）。结论:电针血清通过促进ECM的重塑——增加MMP2的表达降解过多的Collagen Ⅰ,促进多裂肌MSCs的增殖,实现损伤多裂肌的再生修复;ERK参与了电针血清促进ECM重塑和MSCs增殖的过程。实验四电针血清促进大鼠腰多裂肌细胞外基质重塑和肌卫星细胞增殖与Integrinβ 1关系的研究目的:观察Integrinβ 1/ERK途径在电针血清促进多裂肌MSCs增殖和ECM重塑过程中Collagen Ⅰ、MMP2表达的影响,探讨电针血清促进ECM重塑和MSCs增殖作用与Integrinβ 1/ERK途径之间存在的关系。方法:同实验三,另设Integrinβ 1抑制剂血清组（电针血清+GRGDS）。干预24h后,采取 CCK-8 法检测 MSCs 的增殖能力;WB 检测 MyoD、Pax7、Collagen Ⅰ、MMP2、ERK、Integrinβ1 蛋白表达;RT-PCR 检测 Collagen Ⅰ和MMP2 mRNA 表达。结果:（1）WB结果显示,与正常血清组比较,模型血清组Integrinβ 1蛋白表达显着下降（P<0.01）;与模型血清组比较,电针血清组Integrinβ 1蛋白表达显着增加（P<0.01）。（2）MSCs增殖能力检测:①CCK-8结果:与正常血清组比较,模型血清组MSCs增殖能力显着下降（P<0.01）;与模型血清组比较,电针血清组MSCs增殖能力显着上升（P<0.01）,抑制剂血清组MSCs增殖能力显着下降（P<0.01）;与电针血清组比较,抑制剂组MSCs的增殖能力显着下降（P<0.01）。②WB检测MyoD、Pax7:与正常血清组比较,模型血清组蛋白表达显着下降（P<0.01）;与模型血清组比较,电针血清组蛋白表达显着增加（P<0.01）,抑制剂血清组与模型血清组比较无差异（P>0.05）;与电针血清组比较,抑制剂血清组蛋白表达显着下降（P<0.01）。（3）WB和RT-PCR检测ECM的重塑:与正常血清组比较,模型血清组Collagen Ⅰ蛋白、mRNA表达上升（P<0.01）,MMP2蛋白表达上升（P<0.01）、mRNA表达下降（P<0.01）;与模型血清组比较,电针血清组Collagen I蛋白、mRNA表达显着下降（P<0.01）,MMP2蛋白、MMP2 mRNA表达增加（P<0.01）;抑制剂血清组Collagen Ⅰ蛋白、mRNA表达显着下降（P<0.01）,MMP2蛋白表达无差异（P>0.05）、mRNA表达上升（P<0.01）;与电针血清组比较,抑制剂血清组Collagen Ⅰ、MMP2 mRNA表达无差异,Collagen Ⅰ蛋白表达上升（P<0.01）,MMP2蛋白表达下降（P<0.01）。（4）WB检测ERK:与正常血清组比较,模型血清组ERK蛋白表达显着下降（P<0.01）;与模型血清组比较,电针血清组ERK蛋白表达显着升高（P<0.01）,抑制剂血清组ERK蛋白表达显着下降（P<0.01）;与电针血清组比较,抑制剂血清组ERK蛋白表达显着下降（P<0.01）。结论:电针血清通过促进ECM的重塑——增加MMP2的表达降解过多的Collagen Ⅰ,促进多裂肌MSCs的增殖,实现损伤多裂肌的再生修复;Integrinβ1/ERK途径参与了电针血清促进ECM重塑和MSCs增殖的过程。
赵昱[6]（2019）在《有氧运动对小鼠肌肉干细胞衰减和相关表型的影响及细胞周期调控研究》文中研究表明肌肉干细胞（muscle stem cells,MuSCs）是肌肉组织中的成体干细胞,对修复肌纤维损伤,减缓骨骼肌衰老有着重要作用。积极的体育锻炼是维持骨骼肌功能的主要方式,这是否是因为运动维持了肌肉干细胞的正常状态,而肌肉干细胞的增加对骨骼肌的功能是否亦有帮助,这些问题目前仍不是十分清楚。随着当代人口寿命的延长,运动功能障碍已成为影响老年人群生活质量的重要原因,如何合理的利用运动锻炼长期维护骨骼肌健康直到老年,并掌握肌肉干细胞的增殖（细胞周期）特性来为其潜在的医疗应用价值提供依据,是本课题的研究初衷。目的:研究中等强度有氧运动对不同生命阶段小鼠肌肉干细胞数量和增殖能力的影响,分析肌肉干细胞数量、肌核数量与肌肉质量、肌力、肌纤维横截面积等表型指标之间的关系,探讨运动通过影响肌肉干细胞而减缓骨骼肌衰老的细胞周期调控机制,为深入研究运动抵抗机体运动功能衰老的作用提供新的思路。同时,建立单肌纤维培养、分析技术与小动物骨骼肌功能测试方法,为以应用动物模型的运动科学基础研究提供相应技术支持。方法:研究采用BALB/c品系雄性小鼠,分为5个组别系列,安静对照组（C组）、6-12周龄运动组（Q组）、20-26周龄运动组（M组）、50-56周龄运动组（L组）、6周龄起终生运动组（Z组）,按照相应的运动周期,采用中等强度跑台运动干预后,在各组别系列的6、12、26、56周龄四个不同生命阶段分别取样。小鼠的一侧腓肠肌用作分离及培养单根肌纤维,利用免疫荧光染色观察肌肉干细胞分子标志Pax7的定位,同时统计单根肌纤维上总细胞核数与肌肉干细胞数。另一侧腓肠肌石蜡包埋后横切,做HE染色,测量腓肠肌及肌纤维横截面积。大腿股四头肌用于细胞周期调控相关蛋白的免疫印迹（Western blotting）检测。在取样前,还需测试小鼠抓力峰值,抓力耐力、体重等表型指标。结果:1)小鼠腓肠肌中肌肉干细胞数量随周龄的增加逐渐减少,通过长期有氧运动干预可以减缓肌肉干细胞减少的趋势,而6周有氧运动干预可以逆转已经减少的肌肉干细胞数量。2)小鼠腓肠肌中肌纤维细胞核的数量虽然随周龄的增加而下降,但下降幅度较小,通过有氧运动干预可以增加肌核数量,但同样增加幅度也较小。3)在衰老之前,随着周龄增加,小鼠的体重、腓肠肌质量无论运动与否均呈增加趋势,进入老年后,对照组体重、腓肠肌质量均出现明显下降,而有过有氧运动干预的组别,体重、腓肠肌质量下降较少。但腓肠肌质量分数从12周龄之后,各组均呈现下降趋势。4)小鼠抓力的高峰出现在12周龄,随后逐渐下降,而在不同组别中有氧运动可以维持或小幅增加小鼠的抓力。5)在衰老之前,随周龄的增加,小鼠腓肠肌横截面积也增加,进入老年后腓肠肌横截面积下降较快,而肌纤维的横截面积在12周龄最大,随周龄的增加逐渐下降。年轻时,有氧运动对增加肌纤维的横截面积作用明显,而老年时这种作用减弱。6)肌肉干细胞数量与肌核数量呈现明显的正相关性。同时,肌核数量与肌纤维横截面积、肌力及腓肠肌质量分数也呈现正相关性,但与体重、肌肉质量没有明显相关性。7)长期有氧运动显着下调小鼠骨骼肌中Visfatin、Sirt1、CDK6、Cyclin A2、Cyclin B1、Cyclin D3、Cyclin E2、p16、p21的蛋白水平。结论:1)有氧运动可以增加成年小鼠肌肉干细胞的数量与肌核的数量。2)肌肉干细胞的数量与肌核的数量高度正相关,而肌核的增加有助于提高肌纤维的横截面积和骨骼肌的力量水平。3)有氧运动在任何生命阶段干预小鼠,都对其老年时的体重和肌肉质量维持有帮助,但对改变身体成分中骨骼肌比例下降的趋势作用较小。4)促进细胞周期上调并不是有氧运动维持肌肉干细胞在一定数量的主要调控通路,反而持续一段时间的有氧运动可以促进肌纤维的稳态,使肌肉干细胞维持静止状态,细胞周期蛋白表达下调。5)骨骼肌中p16基因的表达随衰老而增加,p16蛋白的积累与骨骼肌和肌肉干细胞的衰减有关,而有氧运动可以降低p16的表达,减缓骨骼肌的衰减。6)骨骼肌中Sirt1表达水平的下调有利于肌纤维的蛋白质合成,同时会抑制肌肉干细胞的增殖活动。
董贵荣[7]（2018）在《带仿生血管网复合肌组织支架与体外组织工程化方法研究》文中提出肌肉移植是有效修复大面积肌肉缺损的手段,但由于可利用的肌肉来源有限,供区损伤较大,以及异体移植供体来源和免疫排斥等问题,使其应用受到限制。随着组织工程的发展,尤其是骨骼肌组织工程在肌肉组织再生和功能重建方面的进展,为解决骨骼肌组织缺损和功能丧失等问题带来了希望。本文构建了一种带血管网酶交联水凝胶与EVOH电纺基底膜叠加组装的复合肌组织工程支架,通过体外灌流-拉伸动态培养,实现了肌细胞定向排列和向肌小管体外分化的过程,为仿生血管网的参数优化提供理论参考和实验依据。本文主要工作及成果如下:首先,以仿生设计思路为指导,通过分形模型的理论计算,提出了一种多级多尺寸的仿生血管网结构。通过分布函数计算出该血管网的分形维数为2.99,证明设计模型符合体内微小血管的功能要求,形成结构与功能相适应的生物学概念。通过CFD流体分析,将血管网模型与DAVID体外模型灌流的压力-流速曲线进行对比,结果表明流速误差小于5%,证实流体分析方法的有效性。其次,研究仿生血管网的微制造工艺,通过SLA光固化成型法和翻模制造方法,制备TG酶交联水凝胶作为基质材料的仿生血管网。研究制造仿生血管网的成型精度、降解速度和生物相容性等性能,结果证明基质材料成型精度高,可以长时间维持微流道结构,在流体和重力等因素作用下,微流道截面形状逐渐由矩形转变成更接近体内实际结构的圆形,且细胞毒性低,生物相容性好。通过CFD流体分析,确定1ml/min的流速作为体外培养的灌流参数。第三,通过多细胞共培养技术,研究了酶交联水凝胶材料的生物相容性,证实肌细胞,内皮细胞和成纤维细胞共培养时,可以在基质材料内呈现良好的增殖趋势。在仿生血管网内种植HUVEC-GFP细胞,灌流培养后,通过对细胞进行细胞形态学和增值动力学检测,研究了血管网参数对内皮化的影响。结果证明,500μm内的仿生血管网中,血管直径越小对形成内皮化越为有利,而分叉角则对细胞的生长和代谢影响不大。第四,根据体内肌肉结构,设计了血管网-基质-筋膜层的叠加式复合肌组织工程支架。通过电纺技术制备EVOH纳米纤维膜,模拟体内筋膜层,并与带血管网水凝胶组装构建复合支架。研究了纳米纤维筋膜层的制备工艺参数和支架组装工艺,叠加式支架的灌流和力学性能,为体外动态培养提供了可拉伸的肌组织工程支架模型。同时还研究了筋膜层基底膜的生物相容性和抑菌作用等生物性能,证实该支架具有良好的生物相容性,同时具有广谱抗菌作用,为多因素体外动态培养提供了有利条件。第五,设计带密封腔室的生物反应器,搭建了体外灌流-拉伸动态培养平台。该平台提供了一种密封腔室的力学拉伸试验系统,并且准确控制软组织的拉伸量。此外,该系统能够实现分别对腔室和血管网进行灌流,模拟体内血液的流动和营养供给,为细胞的增殖,延长和分化提供研究基础。第六,在体外灌流-拉伸动态培养系统上,对带血管网的肌组织工程支架进行体外动态培养。提出了一种肌组织工程体外动态培养评价方法,研究了血管网结构参数对肌细胞定向排列和分化的影响。结果证明仿生血管网能有效促进肌细胞实现定向排列和分化,并且证实了本文仿生血管网内培养液的渗透距离大约为300μm。
廖肇福[8]（2019）在《心脏Telocytes协同心脏干细胞治疗缺血性心肌梗死及其机理的研究》文中研究表明目的:（1）对心脏Telocytes（CTs）、心脏干细胞（CSCs）和骨髓间充质干细胞（MSCs）移植治疗缺血性心肌梗死的疗效进行比较;（2）对CTs与CSCs不同的协同方式移植治疗缺血性心肌梗死的疗效进行比较;（3）对CTs分泌外泌体治疗缺血性心肌梗死的疗效及其机制进行研究;（4）对CTs外泌体所含的miRNA-21-5p治疗缺血性心肌梗死的疗效及其机理进行研究;（5）对不同细胞、CTs外泌体治疗和miR-21-5p治疗心肌梗死的疗效进行比较;（6）对CTs外泌体的蛋白组可能参与梗死心肌修复再生的可能机理进行生物信息学预测;（7）对年青与年老CTs表达基因的差异组学及随增龄相应通路改变进行研究。方法:（1）通过贴壁法分离得到MSCs,磁珠分选法分离得到CTs和CSCs,然后分别将总细胞量为5×105的CTs、CSCs、MSCs、4种不同的CTs协同CSCs的方式[（1）CTs与CSCs在Transwell系统中共培养48小时后,移植共培养后的CSCs（5×105个细胞）（CSCs-co）;（2）移植正常培养的CTs（2.5×105个细胞）和低氧（5%O2）培养48 h的CSCs（2.5×105个细胞）（CTs+CSCs-hyp）;（3）移植正常培养的CTs（2.5×105个细胞）和在Transwell中与CTs共培养48 h后的CSCs（2.5×105个细胞）（CTs-nor+CSCs-co）;（4）移植CTs（2.5×105个细胞）和CSCs（2.5×105个细胞）混合培养48 h后的混合细胞（CTs+CSCs-co）]及PBS移植到利用左冠状动脉前降支（LAD）结扎术构建的心肌梗死大鼠的心肌层中。细胞心肌内移植4周后,使用超声心动图评价心功能;使用Masson’s trichrome染色,对各组心肌梗死面积、心脏纤维化程度、左心室室壁厚度进行半定量比较分析;使用抗v WF免疫组化染色对各组梗死区和梗死边缘区的血管密度进行半定量分析比较;使用抗PH3和α-SA,抗Ki67和Cardiac troponin I的免疫荧光双标染色对各组梗死区和梗死边缘区的增殖心肌数进行半定量分析;使用抗c-Kit和CD34,及抗c-Kit和Sca-1的免疫荧光双标染色分别对各组梗死区存活的CTs和CSCs密度进行半定量分析;（2）使用透射电镜观察大鼠心肌层的CTs及CTs分泌的外泌体。通过心肌内注射移植CTs外泌体到LAD结扎的大鼠梗死心肌层中,4周后使用超声心动图对CTs分泌外泌体治疗组和PBS对照组的心功能进行评价分析;使用Masson’s trichrome染色,对心肌梗死面积、心脏纤维化程度、左心室室壁厚度进行半定量分析;使用抗α-SMA和抗MMP2的免疫荧光染色分别对各组梗死区成肌成纤维细胞密度和MMP2的表达量进行半定量分析;使用抗v WF的免疫组化染色和抗Ki67与Cardiac troponin I的免疫荧光双标染色分别对各组梗死区与梗死边缘区的血管密度和增殖心肌数进行半定量分析;使用抗c-Kit和Sca-1的免疫荧光双标染色分别对各组梗死区存活的CSCs密度进行半定量分析;把经Di I染色的CTs分泌外泌体与CSCs进行共孵育,以观察CTs分泌外泌体是否能进入CSCs;使用流式细胞技术、死活细胞染色和CCK8分别对CTs分泌外泌体对缺血缺氧环境中的CSCs可能的保护作用进行分析;（3）使用qPCR对与CTs共培养48小时的CSCs中的miR-21-5p表达水平进行定量分析。通过心肌内注射miR-21-5p agomir和无关序列对照至LAD结扎致心梗的大鼠缺血心肌层中,7天后利用超声心动图对心功能进行评价;使用Masson’s trichrome染色对心肌梗死面积进行半定量分析比较;使用抗Ki67和Cardiac troponin I的免疫荧光双标染色对各组梗死区和梗死边缘区的增殖心肌数进行半定量分析;使用抗c-Kit和Sca-1的免疫荧光双标染色对各组梗死区存活的CSCs进行半定量分析。使用生物信息学预测miR-21-5p潜在靶基因,并利用qPCR和双荧光素酶报告系统确认miR-21-5p的靶基因,并使用针对靶基因的siRNA对miR-21-5p靶基因及功能进行研究。（4）通过单因素方差分析比较不同细胞、CTs外泌体和miR-21-5p治疗心肌梗死的射血分数、缩短分数、左心室收缩和舒张末期直径和梗死面积,以比较相应的疗效。（5）使用蛋白质非标记定量质谱技术和Ingenuity Systems Pathway Analysis（IPA）生物信息学系统对常氧和低氧环境下,CTs分泌外泌体参与心肌修复与再生的功能因子进行分析。（6）通过基因芯片和IPA生物信息学系统对年老和年青CTs差异表达的基因可能参与调控心血管生理与病理与通路进行分析。结果:（1）CTs,MSCs和CSCs分别对心梗治疗的疗效比较:心功能指标,CTs治疗组的射血分数、缩短分数、左心室收缩和舒张末期直径相比MSCs组和CSCs组差异均无显着性统计学意义（P>0.05）;梗死面积,CTs治疗组的梗死面积显着小于MSCs组（P<0.05）,与CSCs组的差异没有显着性统计学意义（P>0.05）;心脏纤维化指标,CTs治疗组的梗死区胶原面积和梗死对侧区的血管周边胶原面积均分别显着小于MSCs组和CSCs组（P<0.05）;左心室重构指标,CTs治疗组的梗死区边缘厚度和最小厚度与MSCs组和CSCs组差异均无显着性统计学意义（P>0.05）;血管新生,CTs治疗组的梗死区血管密度分别显着性大于MSCs组和CSCs组（P<0.05）,CTs治疗组的梗死边缘区血管密度显着性大于MSCs组（P<0.05）,而和CSCs组的差异没有显着性统计学意义（P>0.05）;梗死区和边缘区的心肌增殖,CTs治疗组的PH3阳性心肌或Ki67阳性的心肌数与MSCs组和CSCs组的差异无显着性统计学意义（P>0.05）;梗死区CSCs和CTs的密度,CTs治疗组的梗死区CTs密度和CSCs密度分别与MSCs组和CSCs组相比,差异无显着性统计学意义（P>0.05）。（2）4种不同协同方式的CTs和CSCs治疗对心梗治疗的疗效比较:心功能指标,4种不同协同方式的CTs和CSCs治疗组中只有CTs+CSCs-co治疗组的射血分数和缩短分数分别显着大于单独移植CTs组、CSCs组和MSCs组（P<0.01）,左心室收缩末期直径分别显着小于单独移植CTs组、CSCs组和MSCs组（P<0.05）,左心室收舒张期直径分别显着小于单独移植CTs组和MSCs组（P<0.05）,但与CSCs组的差异没有显着性统计学意义（P>0.05）;梗死面积,4种不同协同方式的CTs组和CSCs治疗组中只有CTs+CSCs-co治疗组的梗死面积分别显着小于单独移植CTs、CSCs和MSCs组（P<0.05）;心脏纤维化指标,CTs+CSCs-co治疗组的梗死区胶原面积分别显着小于单独移植CTs组、CSCs组和MSCs组（P<0.05）,梗死对侧区血管周边胶原面积分别显着小于单独移植CSCs组和MSCs组（P<0.01）,但与CTs组的差异没有显着性统计学意义（P>0.05）;左心室重构指标,CTs+CSCs-co治疗组的梗死边缘厚度与CTs组、CSCs组和MSCs组差异均无显着性统计学意义（P>0.05）,而梗死区最小厚度分别显着大于CSCs组和MSCs组（P<0.05）,但与CTs组差异没有显着性统计学意义（P>0.05）;血管新生,CTs+CSCs-co治疗组的梗死区和梗死边缘区的血管密度均分别显着大于单独移植CTs组、CSCs组和MSCs组（P<0.01）;梗死区和边缘区心肌增殖,CTs+CSCs-co治疗组的PH3阳性心肌或Ki67阳性的心肌数均分别显着大于单独移植CTs组、CSCs组和MSCs组（P<0.05）;梗死区CSCs和CTs的存活,CTs+CSCs-co治疗组的梗死区CTs密度和CSCs密度均分别显着大于单独移植CTs组、CSCs组和MSCs组（P<0.05）。（3）通过透射电镜在大鼠心肌层观察到典型形态的CTs及其分泌的外泌体;心肌注射CTs外泌体对心梗治疗的疗效:心功能指标,CTs外泌体治疗组的射血分数和缩短分数分别显着大于PBS对照组（P<0.05）,左心室收缩末期直径显着小于PBS组（P<0.01）,左心室舒张末期直径与PBS组的差异没有显着性统计学意义（P>0.05）;梗死面积,CTs外泌体治疗组的梗死面积显着小于PBS组（P<0.05）;心脏纤维化指标,CTs外泌体治疗组的梗死区胶原面积、梗死对侧区的血管周边胶原面积以及梗死区成肌成纤维细胞密度均显着小于PBS组（P<0.01）;左心室重构指标,CTs外泌体治疗组的梗死边缘厚度显着大于PBS对照组（P<0.05）,但最小厚度与PBS组的差异没有统计学意义（P>0.05）,梗死区的MMP2的表达量显着低于PBS对照组（P<0.01）;血管新生,CTs外泌体治疗组的梗死区血管密度显着大于PBS对照组（P<0.05）,但梗死边缘区血管密度与PBS对照组相比差异没有显着性统计学意义（P>0.05）;梗死区和边缘区心肌增殖,CTs外泌体治疗组的Ki67阳性的心肌数显着大于PBS组（P<0.01）;梗死区CSCs的存活,CTs外泌体治疗组的CSCs密度显着大于PBS组（P<0.01）;经Di I染色的CTs外泌体能被CSCs摄取,并且发现CSCs经CTs外泌体预处理2 h后相比PBS对照组能显着减少缺血缺氧环境中CSCs的凋亡率和显着提高CSCs的存活率（P<0.05）。（4）与CTs共培养48 h后CSCs的miR-21-5p的表达量显着升高（P<0.01）;心肌注射miR-21-5p对心梗治疗的疗效:心功能指标,miR-21-5p治疗组的射血分数和缩短分数均显着大于无关序列对照组（P<0.05）,左心室收缩和舒张末期直径均显着小于无关序列对照组（P<0.05）;梗死面积,miR-21-5p治疗组的梗死面积显着小于无关序列对照组（P<0.05）;梗死区和边缘区的心肌增殖,miR-21-5p治疗组的Ki67阳性的心肌数显着大于无关序列对照组（P<0.05）;梗死区CSCs存活,miR-21-5p治疗组的CSCs密度均显着大于无关序列对照组（P<0.05）;CSCs过表达miR-21-5p后能显着减小在缺血缺氧环境中的凋亡率（P<0.05）。通过生物信息学预测、q-PCR和双荧光素酶报告细胞验证Cdip1是miR-21-5p的靶基因,通过Cdip1的siRNA沉默CSCs中Cdip1的表达能显着减少CSCs在缺血缺氧环境中的凋亡（P<0.05）。（5）通过比较不同细胞治疗、CT外泌体治疗和miR-21-5p治疗三种疗法对心梗大鼠的心功能和梗死面积,发现所有的细胞治疗组与注射CTs外泌体及注射miR-21-5p治疗组的射血分数、缩短分数相比PBS对照组均显着增加（P<0.05）,而梗死面积显着减小（P<0.05）。而三种治疗心肌梗死的疗法中CTs+CSCs-co组的射血分数和缩短分数最大,梗死面积最小。（6）蛋白质非标记定量质谱技术在常氧和低氧CTs分泌的外泌体中检测到450种和454个蛋白,通过IPA分析揭示这些蛋白可能参与血管新生、心脏纤维化、细胞增殖和细胞死亡与存活等去影响心肌梗死进程。（7）通过比较分析老年CTs与年青CTs的表达芯片,发现老年CTs相比年青CTs表达量上调有注释的基因有1948个,表达量下调有注释的基因有1407个,IPA分析揭示老年CTs相比年青CTs表达有显着性差异的基因和显着性差异在5倍以上的基因都与Cardiovascular system development and function和Cardiovascular disease高度相关。结论:（1）移植CTs治疗心肌梗死,在减少梗死面积和心脏纤维化与促进血管新生方面略优于单独移植CSCs和MSCs;（2）4种CTs与CSCs协同治疗方式中CTs+CSCs-co对心肌梗死的疗效最佳,并且在改善心功能,减小梗死面积和心脏纤维化,促进血管新生、心肌增殖、CTs网络重构及CSCs的存活方面优于单独移植CTs、CSCs和MSCs治疗;（3）使用CTs分泌的外泌体对心梗进行治疗能显着改善心梗心脏的心功能,减小梗死面积和心脏纤维化,改善左心室重构,促进血管新生、心肌增殖以及CSCs的存活;（4）心肌内注射miR-21-5p对心梗进行治疗能显着减小梗死面积,促进心肌增殖和CSCs存活,miR-21-5p保护CSCs的机制之于是通过下调靶基因Cdip1的表达减少缺血缺氧环境中CSCs的凋亡;（5）三种治法（细胞、CTs外泌体和miR-21-5p）对心梗的治疗中,CTs+CSCs-co组治疗的疗效相对最佳;（6）CTs分泌外泌体所含的蛋白因子可能参与梗死心肌的再生;（7）老年CTs相比年青CTs表达差异的基因可能参与心脏衰老和心血管疾病的发生。
孙仙蕊[9]（2013）在《线粒体通路在应力介导的成肌细胞凋亡中的作用及其调控机制》文中认为目的：面颌部肌肉组织尤其是翼外肌在牙、颌、面部畸形的发生、发展、治疗和疗效维持中发挥着重要作用。功能矫形前伸下颌后,翼外肌的功能和结构可以发生适应性改建,这正是矫形治疗得以成功并保持稳定的关键,成肌细胞是适应性改建的主要体现者。翼外肌的改建主要包括细胞的增殖、分化和凋亡,以往研究多局限于细胞的增殖与分化,而凋亡方面的研究少见。本研究拟通过构建成肌细胞体外培养-力学刺激模型,探讨周期性张应力对成肌细胞凋亡的影响,明确线粒体通路在应力介导的成肌细胞凋亡中的作用及作用机制,从而阐明机械应力下面颌肌细胞适应性改建可能存在的内在分子调控机制,将为口腔临床医生应用不同方法诱导或调控面颌肌肉改建提供理论指导。方法：以大鼠L6成肌细胞为研究对象,在成功构建成肌细胞体外培养-力学刺激模型的基础上,通过多通道细胞牵张应力加载系统,分别对待测细胞持续施加1h、6h、12h、24h的周期性张应力,加载力值为15%的细胞形变,频率为10cycles/min,每一循环包括3s-stretch/3s-relaxation,不加力组为对照组；采用Hoechst33258荧光染料对凋亡细胞进行形态学观察；应用流式细胞术分析成肌细胞的凋亡率；运用RT-PCR和Western blotting检测周期性张应力作用下各组之间Caspase-9和AIF的mRNA含量和蛋白含量；应用Caspase-9特异性抑制齐（?）Z-LEHD-FMK明确Caspase-9在应力介导的成肌细胞凋亡中的作用,进一步明确线粒体途径与应力介导的成肌细胞凋亡的关系。采用统计软件SPSS17.0对所得数据进行统计学分析。结果：1.大鼠L6成肌细胞在受到15%,10cycles/min的周期性张应力刺激后,可以保持良好的生长状态,生物学特性良好,长时间的张力刺激后,细胞呈现顺应力场方向排列趋势；2. Hoechst33258荧光染色,流式细胞术检测结果均显示大鼠L6成肌细胞在15%,10cycles/min的周期性张应力诱导下发生凋亡,并且凋亡率随加力时间延长而升高,24h达到峰值。3. RT-PCR和Western blotting检测结果显示,随着加力时间的延长,Caspase-9、AIF的mRNA含量和蛋白含量均增加,24h达到最高,差异具有显着统计学意义（P<0.01）;4.加入Caspase-9特异性抑制剂Z-LEHD-FMK后,成肌细胞的凋亡率以及Cleaved Caspase-9的mRNA含量和蛋白表达量均有所下降,而Procaspase-9的mRNA含量和蛋白表达量有所升高,差异具有显着统计学意义（P<0.01）。结论：1.线粒体通路参与了应力介导的成肌细胞凋亡；2.Caspase-9和AIF发挥了重要作用。
张力[10]（2012）在《骨碎补总黄酮促进转基因成肌细胞成骨分化及引导性骨再生的研究》文中进行了进一步梳理目的：本实验拟以成肌细胞和骨碎补总黄酮（assemble flavone of rhizome drynaria，AFDR）为研究对象，探讨AFDR对体外培养转睫状神经营养因子（Ciliary neurotrophicfactor, CNTF）基因的成肌细胞增殖、成骨细胞分化的影响及AFDR促进其向成骨细胞诱导分化的作用机制；并将AFDR含药血清预处理的转CNTF成肌细胞微囊化处理达到免疫隔离效果，与负载骨形态发生蛋白（Bone morpnogenetic protein,BMP）的透明质酸（Hyaluronicacid,HA）钠凝胶载体、引导性骨再生（guided bone regeneration,GBR）膜——硅胶管联合构建新型组织工程化人工骨，通过动物在体实验观察引导性骨再生（GBR）促进骨缺损修复的效果；评价成肌细胞作为新型种子细胞、AFDR作为新型成骨诱导因素应用于骨组织工程学研究的可行性。材料与方法：第一部分转染CNTF基因促进大鼠成肌细胞去分化的实验研究取新生5d清洁级Wistar大鼠4只，采用改良法体外分离、培养、纯化成肌细胞，并进行鉴定备用。应用质粒快速提取盒提取CNTF质粒DNA，通过阳离子脂质体法介导转染大鼠成肌细胞影响其分化过程，促使其保持去分化的干细胞状态，并对转染细胞的细胞活性、表达情况和细胞分化率等进行相关检测，结果进行统计学处理；第二部分骨碎补总黄酮促进转CNTF成肌细胞向成骨分化的实验研究及机制探讨取健康12月龄雌性Wistar大鼠20只，随机分为高、中、低剂量给药组及空白血清对照组，每组5只，根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”给予AFDR灌胃，无菌条件下由腹主动脉取血、离心、取上清、灭活补体、抽滤除菌制备不同浓度AFDR含药血清；将转CNTF成肌细胞按实验设计分为A、B、C、D、E5组分别加入相应培养液进行预处理，其中A组（高浓度AFDR组）：培养液为高浓度AFDR含药血清+成骨诱导剂；B组（中浓度AFDR组）：培养液为中浓度AFDR含药血清+成骨诱导剂；C组（低浓度AFDR组）：培养液为低浓度AFDR含药血清+成骨诱导剂；D组（空白血清组）：培养液为空白血清+成骨诱导剂；E组（标准培养液组）：培养液为完全培养液。连续培养21天，观察预处理后转CNTF成肌细胞的增殖、成骨分化情况，进行MTT测定，碱性磷酸酶、茜素红、I型胶原染色观察，骨钙素、钙沉积量、ALP比活性等成骨标志物检测及成骨、成脂相关基因测定，并进行统计学分析。第三部分微囊化骨碎补总黄酮预处理转CNTF成肌细胞促进引导性骨再生的实验研究取第二部分中C组培养液（低浓度AFDR含药血清+成骨诱导剂）对转CNTF成肌细胞进行成骨诱导分化，行相关检测后继续培养备用。对上述转CNTF成肌细胞及AFDR预处理的转CNTF成肌细胞进行微囊化处理，测定细胞存活率。取清洁新西兰大白兔24只行桡骨缺损造模，根据处置条件随机分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组，每组6只动物，以硅胶管为GBR膜，分别植入不同的移植物，其中Ⅰ组为AFDR预处理转CNTF成肌细胞微囊与负载BMP的HA凝胶组，Ⅱ组为转CNTF基因成肌细胞微囊与负载BMP的HA凝胶组，Ⅲ组为仅负载BMP的HA凝胶组，Ⅳ组为仅注入HA凝胶组，术后进行大体观察、X线测定及组织学染色的检测，并进行统计学分析。结果：1.采用改良方法可获得生长状态良好的成肌细胞，通过扫描电镜及结蛋白抗体染色鉴定呈阳性；通过实验可成功提取CNTF质粒并转染大鼠成肌细胞，转染CNTF的成肌细胞能分泌表达CNTF mRNA，其细胞分化率下降而处于去分化状态。2.实验成功获取高、中、低浓度AFDR含药血清及空白血清；采用不同浓度AFDR含药血清（包括空白血清）对转CNTF成肌细胞进行预处理，并与标准培养液培养的转CNTF成肌细胞进行观察比较。（1）倒置相差显微镜下观察：培养过程中AFDR预处理的转CNTF成肌细胞大多向梭形、多角形转化，有的带有数个突起，在继续培养过程中逐渐形成多个散在的岛状致密细胞群结构，细胞密集成旋涡状，中间细胞排列紧密模糊，逐渐被含有高折射的空泡和深色颗粒的基质包埋形成白色钙化结节，其中以低浓度AFDR含药血清组最为明显；（2）MTT结果显示：不同处理组中转CNTF成肌细胞随着时间迁移均呈现不同程度的增殖，在第5-6天时达到增殖高峰，第7天开始呈现下降趋势。在同一时间点上，在低浓度AFDR组、中浓度AFDR组、空白血清组OD值高于标准培养液组（p＜0.05），其中低浓度AFDR含药血清组的作用最强；（3）碱性磷酸酶染色、茜素红染色、Ⅰ型胶原的免疫组化染色结果显示：除标准培养液组染色呈阴性外，其余各组转CNTF成肌细胞的胞质中均分别出现紫黑色颗粒或块状沉淀、橘红色的沉淀、棕黄色颗粒沉淀，呈相应染色阳性，而且以低浓度AFDR组反应最强，高浓度AFDR组最弱，中浓度AFDR组与空白血清组相当；（4）成骨细胞标志物检测显示：①OCN含量在细胞培养第7d时，五组间差异没有统计学意义（p＞0.05），在培养第14d和第21d时，低浓度AFDR组、中浓度AFDR组、空白血清组中OCN分泌量均高于标准培养液组，低浓度AFDR组OCN分泌量明显高于中浓度AFDR组、空白血清组，差异有统计学意义（p＜0.05）；在不同时间点同组之间进行比较发现，除高浓度AFDR组和标准培养液组外，其余三组中第21dOCN分泌量均明显高于第14d、第7dOCN分泌量，且第14d OCN分泌量亦高于第7dOCN分泌量；②钙沉积量测定在培养第3d、6d、9d时，五组间差异没有统计学意义（p＞0.05）；在第12d时，低浓度AFDR组、中浓度AFDR组、高浓度AFDR组中钙沉积量均高于空白血清组、标准培养液组，而低浓度AFDR组、中浓度AFDR组、高浓度AFDR组3组间中钙沉积量及空白血清组、标准培养液组2组间中钙沉积量均没有统计学差异；在培养第15d、18d和第21d时，五组间差异均有显着性意义（p＜0.01），进一步两两比较，培养第15d、18d和第21d时，低浓度AFDR组、中浓度AFDR组、高浓度AFDR组中钙沉积量均高于标准培养液组，而且空白血清组亦钙沉积量均高于标准培养液组；③ALP比活性测定在不同时间点进行不同处理组间方差分析结果显示，在培养第1d、3d时，五组间差异没有统计学意义（p＞0.05）；在第7d、11d、14d时，低浓度AFDR组、中浓度AFDR组、空白血清组中ALP比活性均明显高于高浓度AFDR组、标准培养液组，且低浓度AFDR组ALP比活性明显高于中浓度AFDR组、空白血清组，差异有统计学意义（p＜0.05），中浓度AFDR组、空白血清组中ALP比活性差异没有统计学意义（p＞0.05）；高浓度AFDR组与标准培养液组中ALP比活性均极低，且差异没有统计学意义（p＞0.05）。（5）在第14d时检测5组Cbfa1mRNA、ALP mRNA、PPARγ mRNA表达，结果显示各组间差异均有显着性意义（P＜0.05或P＜0.01），以低浓度AFDR组对转CNTF成肌细胞向成骨细胞分化过程中Cbfa1mRNA、ALP mRNA、PPARγ mRNA表达的影响最为显着。即低浓度AFDR（按AFDR67.5mg/kg.d给药）组成骨相关因子Cbfa1mRNA、ALP mRNA表达最高，成脂相关因子PPARγ mRNA表达最低。3.微囊化细胞体外存活良好，微囊外形完整无粘连，大小较均一，囊内细胞清晰可见；动物在体实验中Ⅰ组微囊化AFDR预处理转CNTF成肌细胞与BMP因子组引导性再生促进骨缺损修复的各项指标均优于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组3组，组间差异均有显着性，p<0.05。结论：1.应用CNTF基因转染成肌细胞能够抑制成肌细胞体外成肌分化，保持成肌细胞去分化状态，为成肌细胞被用作组织工程研究的种子细胞提供理论基础。2.转CNTF成肌细胞在体外经成骨诱导剂诱导后能够转化为成骨前体细胞。3.AFDR含药血清可显着促进转CNTF成肌细胞的体外增殖和成骨分化，提示AFDR具有开发为促进骨折愈合、抗骨质疏松新药的潜力。4.AFDR含药血清促进转CNTF成肌细胞体外增殖和成骨分化均以低浓度AFDR含药血清作用最强，而高浓度AFDR含药血清抑制其增殖、分化，说明AFDR对转CNTF成肌细胞体外增殖和成骨分化与其浓度相关。5.AFDR含药血清促进转CNTF成肌细胞体外成骨分化机制与其在成骨分化过程上调Cbfa1mRNA、ALP mRNA表达，下调PPARγ mRNA表达有关。6.AFDR和成肌细胞联合应用可促进骨缺损的修复，两者可应用于骨组织工程学研究。7.创新性的应用引导性骨再生理论将透明质酸钠凝胶和硅胶管的应用于骨缺损的修复可以取得良好的修复效果，且两者已应用于临床，可以作为良好的骨组织工程材料。
二、大鼠成肌细胞体外培养及其自发收缩特性（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、大鼠成肌细胞体外培养及其自发收缩特性（论文提纲范文）
（1）成肌细胞G0期模型构建及应力诱导下p38与JNK交互对话调控细胞周期（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 成肌细胞体外培养-G0期模型的构建 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 一、L6成肌细胞体外培养形态学观察 |
| 二、G0期成肌细胞激活过程形态学观察 |
| 三、G0期及细胞激活过程中细胞周期变化 |
| 四、G0期及细胞激活过程中相关蛋白表达变化 |
| 讨论 |
| 一、L6成肌细胞体外培养最佳条件 |
| 二、G0模型构建意义 |
| 结论 |
| 第二部分 应力作用下p38与JNK交互对话影响L6成肌细胞周期 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 一、细胞形态及分布的观察 |
| 二、流式细胞周期变化及统计分析结果 |
| 三、Western Blot相关蛋白表达 |
| 讨论 |
| 应力刺激激活细胞骨架相关蛋白 |
| 丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）途径 |
| 结论 |
| 第三部分 p38特异性抑制剂对周期及蛋白表达的影响 |
| 材料与方法 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 结果 |
| 一、SB203580可基本抑制p38通路活性 |
| 二、抑制剂对细胞周期的影响 |
| 三、特异性抑制剂对通路及相关蛋白的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 临床病例展示 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 致谢 |
（2）蒙古马肌肉卫星细胞中MSTN调控网络的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 文献综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 马的起源和驯化 |
| 1.2.1 马的起源 |
| 1.2.2 马的驯化 |
| 1.2.3 基因学在现代马选育中的应用 |
| 1.3 骨骼肌的结构与发展 |
| 1.3.1 骨骼肌的结构和纤维类型 |
| 1.3.2 骨骼肌的发育 |
| 1.4 骨骼肌再生和卫星细胞 |
| 1.4.1 骨骼肌再生 |
| 1.4.2 卫星细胞特性 |
| 1.4.3 卫星细胞的静止期 |
| 1.4.4 卫星细胞的激活 |
| 1.5 肌抑制素(MSTN)基因 |
| 1.5.1 MSTN基因特征 |
| 1.5.2 MSTN组织表达与转录调控 |
| 1.5.3 骨骼肌中的MSTN基因相关信号通路 |
| 1.5.4 MSTN在新生肌肉生长和再生中的作用 |
| 1.6 微小RNA(MIRNA) |
| 1.6.1 微小RNA的结构和历史 |
| 1.6.2 骨骼肌中的肌肉特异性microRNA |
| 1.6.3 miRNA和MSTN信号传导 |
| 1.7 研究的目的与意义 |
| 2 蒙古马卫星细胞的分离培养及鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 马骨骼肌采样 |
| 2.2.2 主要试剂和仪器 |
| 2.2.3 常规数据库及分析软件 |
| 2.2.4 马肌肉卫星细胞的酶解法结合差速贴壁法分离及体外培养 |
| 2.2.5 马肌肉卫星细胞免疫荧光法鉴定 |
| 2.2.6 RNA提取 |
| 2.2.7 反转录 |
| 2.2.8 Realtime实验 |
| 2.2.9 统计学分析 |
| 2.3 结果与分新 |
| 2.3.1 蒙古马肌肉卫星细胞体外分离培养 |
| 2.3.2 蒙古马成纤维细胞与肌肉卫星细胞细胞增殖曲线的对比 |
| 2.3.3 蒙古马肌肉卫星细胞内肌肉调控关键因子mRNA表达情况 |
| 2.3.4 蒙古马肌肉卫星细胞的免疫荧光鉴定 |
| 2.4 讨论 |
| 3 蒙古马MSTN基因全长CDS的克隆及马MSTN体外调控分子工具的构建 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 主要试剂和仪器 |
| 3.2.2 主要溶液的配制 |
| 3.2.3 蒙古马MSTN敲低和过表达质粒的构建 |
| 3.2.4 大提细胞转染用质粒 |
| 3.3 结果与分新 |
| 3.3.1 蒙古马MSTN全长CDs区的克隆 |
| 3.3.2 蒙古马MSTN调控质粒的构建 |
| 3.4 讨论 |
| 4 蒙古马卫星细胞内MSTN基因的调控网络及生物功能 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 分离马MSCs |
| 4.2.2 MSTN敲低质粒的构建 |
| 4.2.3 对马卫星细胞进行质粒转染 |
| 4.2.4 测序样品收集 |
| 4.2.5 总RNA提取 |
| 4.2.6 mRNA纯化 |
| 4.2.7 cDNA文库构建和Illumina HiseqTM 2500平台的测序 |
| 4.2.8 差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)筛选 |
| 4.2.9 差异基因GO富集分析 |
| 4.2.10 差异基因Pathway富集分析 |
| 4.2.11 Realtime实验 |
| 4.2.12 统计学分析 |
| 4.3 结果与分新 |
| 4.3.1 蒙古马卫星细胞MSTN敲低质粒的转染 |
| 4.3.2 MSTN敲低对蒙古马卫星细胞转录组的影响 |
| 4.3.3 Q-PCR验证关键差异表达基因 |
| 4.3.4 蒙古马卫星细胞内敲低MSTN基因可促进细胞增殖 |
| 4.4 讨论 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（3）基于GelMA微纤维的骨骼肌单轴拉伸诱导生成及致动特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 生物混合驱动 |
| 1.2 生物混合致动器 |
| 1.2.1 不可扩展的生物混合致动器 |
| 1.2.2 可扩展的生物混合致动器 |
| 1.2.3 现有生物混合致动器的局限性 |
| 1.3 用于生物混合驱动的工程化骨骼肌 |
| 1.3.1 骨骼肌的结构及功能 |
| 1.3.2 体外诱导骨骼肌生成的影响因素 |
| 1.3.3 用于生物混合驱动的工程化骨骼肌构建体 |
| 1.3.4 工程化骨骼肌用于生物混合驱动面临的挑战 |
| 1.4 本课题的研究内容与目标 |
| 1.5 本文的结构安排 |
| 第二章 仿骨骼肌胞外基质GelMA微纤维的加工及表征 |
| 2.1 用于组织工程的微纤维状结构的研究现状 |
| 2.2 明胶-甲基丙烯酰基(GelMA)水凝胶的合成及性能表征 |
| 2.2.1 GelMA水凝胶的合成 |
| 2.2.2 GelMA取代率的表征 |
| 2.2.3 GelMA流变性的确定 |
| 2.2.4 GelMA流变性与温度、单体浓度的关系 |
| 2.3 GelMA微纤维的制备及表征 |
| 2.3.1 GelMA微纤维的制备 |
| 2.3.2 GelMA微纤维的孔径结构及机械性能的表征 |
| 2.3.3 曝光参数对GelMA微纤维的机械性能和孔径的影响 |
| 2.4 GelMA微纤维用于C2C12细胞的三维包裹 |
| 2.4.1 包裹有C2C12成肌细胞的GelMA微纤维的加工 |
| 2.4.2 GelMA微纤维中细胞存活率的确定 |
| 2.4.3 曝光参数对包裹在GelMA微纤维中的细胞存活率的影响 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 单轴拉伸用于GelMA微纤维中成肌细胞的取向调控 |
| 3.1 机械拉伸对细胞取向的调控 |
| 3.1.1 细胞取向在组织工程中的意义 |
| 3.1.2 机械拉伸对细胞取向的调控机理 |
| 3.2 单轴拉伸用于GelMA微纤维中细胞取向调控及表征 |
| 3.2.1 基于柱-孔阵列的拉伸装置用于单轴拉伸的施加 |
| 3.2.2 细胞荧光染色 |
| 3.2.3 数据处理及统计分析 |
| 3.3 单轴拉伸对GelMA微纤维中成肌细胞行为的影响 |
| 3.3.1 参数的定义 |
| 3.3.2 单轴拉伸对成肌细胞伸长及铺展的影响 |
| 3.3.3 单轴拉伸对成肌细胞取向的影响 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 微纤维状骨骼肌的单轴拉伸诱导生成及致动能力表征 |
| 4.1 机械刺激对骨骼肌生成的影响机制 |
| 4.2 GelMA微纤维中骨骼肌生成的表征 |
| 4.2.1 GelMA微纤维中成肌细胞的分化 |
| 4.2.2 GelMA微纤维中骨骼肌的免疫荧光染色 |
| 4.3 单轴拉伸对微纤维状骨骼肌生成的影响 |
| 4.3.1 单轴拉伸对微纤维状骨骼肌的肌管尺寸及取向的影响 |
| 4.3.2 单轴拉伸对微纤维状骨骼肌中肌管成熟度的影响 |
| 4.4 微纤维状骨骼肌的致动性能的研究 |
| 4.4.1 微纤维状骨骼肌的电刺激驱动 |
| 4.4.2 微纤维状骨骼肌收缩响应的记录及数据处理 |
| 4.4.3 微纤维状骨骼肌的可控性研究 |
| 4.4.4 单轴拉伸对微纤维状骨骼肌的致动性能的影响 |
| 4.4.5 单轴拉伸对致动模式的影响 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 多因素诱导微纤维状骨骼肌致动性能的优化 |
| 5.1 生物混合致动器的性能需求 |
| 5.2 机械-生化刺激共同作用对微纤维状骨骼肌致动性能的影响 |
| 5.2.1 类胰岛素样生长因子(IGF-I)的简介 |
| 5.2.2 单轴拉伸-IGF-I共同作用对微纤维状骨骼肌生成的影响 |
| 5.2.3 单轴拉伸-IGF-I共同作用对微纤维状骨骼肌致动性能的影响 |
| 5.3 机械-生化-电多因素作用对微纤维状骨骼肌致动性能的影响 |
| 5.3.1 单轴拉伸-IGF-I-电刺激训练多因素的引入 |
| 5.3.2 单轴拉伸-IGF-I-电刺激训练对微纤维状骨骼肌生成的影响 |
| 5.3.3 单轴拉伸-IGF-I-电刺激训练对微纤维状骨骼肌致动性能的影响 |
| 5.4 微纤维状骨骼肌在生物混合驱动方面的应用前景 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 总结与展望 |
| 6.1 本文工作总结 |
| 6.2 本文的主要创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果 |
| 致谢 |
（4）模拟推拿机械力刺激干预大鼠骨骼肌细胞生物力学效应研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 实验研究 |
| 第一部分 大鼠骨骼肌细胞的制备 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 主要材料与试剂、仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 研究结果 |
| 小结 |
| 第二部分 不同时间对大鼠骨骼肌细胞生物力学效应的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 主要材料与试剂、仪器 |
| 2 实验方法 |
| 3 研究结果 |
| 小结 |
| 第三部分 不同应力模式对大鼠骨骼肌细胞生物力学效应的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.主要材料与试剂、仪器 |
| 2.实验方法 |
| 3 研究结果 |
| 小结 |
| 第四部分 不同刺激强度对大鼠骨骼肌细胞生物学效应的影响 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1.主要材料与试剂、仪器 |
| 2.实验方法 |
| 3 研究结果 |
| 3.1 不同强度压力刺激对大鼠骨骼肌细胞生物学效应的影响 |
| 3.2 不同组合刺激强度对大鼠骨骼肌细胞生物学效应的影响 |
| 4.实验指标相关性分析 |
| 4.1 实验指标正态性检验 |
| 4.2 Spearman秩相性 |
| 4.3 回归分析 |
| 小结 |
| 讨论 |
| 1.体外培养可得到纯度较高的骨骼肌细胞,细胞力学实验以5代以前、培养时间6天以内为宜 |
| 2.现代研究对推拿手法本质-力的认识 |
| 3.现代研究对手法生物力学参数的认识 |
| 4.细胞分子层面手法效应机制的阐述 |
| 5.骨骼肌细胞可以通过形态、周期、增殖、凋亡、分泌及蛋白表达改变的形式响应机械力刺激 |
| 结论 |
| 特色与创新 |
| 问题与展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附件 |
| 附件一:综述 |
| 参考文献 |
| 附件二:在读期间公开发表的学术论文、专着及科研成果 |
（5）电针“委中”对大鼠腰多裂肌细胞外基质重塑和卫星细胞增殖的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 细胞外基质的研究现状 |
| 1 ECM的组成及其降解系统 |
| 1.1 ECM的组成 |
| 1.2 ECM的降解系统 |
| 2 ECM作用的实现途径 |
| 2.1 ECM硬度 |
| 2.2 ECM硬度相关通路 |
| 3 ECM的研究进展 |
| 3.1 ECM与癌症的研究现状 |
| 3.2 ECM与纤维化疾病的研究现状 |
| 参考文献 |
| 综述二 细胞外基质与骨骼肌损伤修复关系的研究进展 |
| 1 骨骼肌损伤的研究现状 |
| 1.1 骨骼肌损伤的原因 |
| 1.2 骨骼肌损伤的病理机制 |
| 2 骨骼肌纤维化研究现状 |
| 2.1 ECM调节骨骼肌纤维化的相关分子机制 |
| 2.2 ECM力学传导通路与骨骼肌细胞之间的关系 |
| 参考文献 |
| 综述三 骨骼肌再生修复过程中相关信号通路的研究进展 |
| 1 MSCs的概况 |
| 2 骨骼肌损伤修复过程中的信号通路 |
| 2.1 MAPK信号通路与骨骼肌损伤 |
| 2.2 PI3K/Akt/mTOR信号通路与骨骼肌损伤 |
| 2.3 Wnt信号通路与骨骼肌损伤 |
| 2.4 Notch信号通路与骨骼肌损伤 |
| 2.5 JAK/STAT信号通路与骨骼肌损伤 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 实验研究 |
| 实验技术路线图 |
| 实验一 电针“委中”穴对大鼠腰多裂肌损伤后胶原蛋白Ⅰ、基质金属蛋白酶2表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 实验二 大鼠腰多裂肌卫星细胞的分离培养与鉴定 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 实验三 电针血清促进大鼠腰多裂肌细胞外基质重塑和肌卫星细胞增殖与ERK关系的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 实验四 电针血清促进大鼠腰多裂肌细胞外基质重塑和肌卫星细胞增殖与Integrinβ1关系的研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 1 各部分实验结果小结 |
| 2 结论 |
| 3 创新点 |
| 4 不足和展望 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 在学期间的主要研究成果 |
（6）有氧运动对小鼠肌肉干细胞衰减和相关表型的影响及细胞周期调控研究（论文提纲范文）
| 论文摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 有氧运动与衰老 |
| 1.2 肌肉干细胞研究进展 |
| 1.2.1 卫星细胞概述 |
| 1.2.2 卫星细胞即肌肉干细胞的验证过程 |
| 1.2.3 肌肉干细胞的异质性及不同分子标记 |
| 1.2.4 与肌肉干细胞数量相关细胞更新、增殖、分化调控的分子机制 |
| 1.2.5 微环境对肌肉干细胞数量相关细胞事件的调控作用 |
| 1.2.6 衰老、运动对肌肉干细胞数量与功能的改变 |
| 1.3 细胞周期调控与肌肉干细胞的增殖、分化、衰老 |
| 1.3.1 细胞周期调控概述 |
| 1.3.2 肌肉干细胞的细胞周期调控研究 |
| 1.3.3 p16INK4a与肌肉干细胞的衰老 |
| 本研究的目的与意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 实验仪器与试剂 |
| 2.2 实验动物 |
| 2.3 试验方法 |
| 2.3.1 小鼠抓力测试方法 |
| 2.3.2 小鼠腓肠肌单肌纤维分离培养方法 |
| 2.3.3 体外培养肌纤维的免疫荧光染色、成像及计数 |
| 2.3.4 组织石蜡包埋切片 |
| 2.3.5 石蜡组织切片的HE染色及成像 |
| 2.3.6 蛋白免疫印迹实验(Western blotting) |
| 2.3.7 统计学方法 |
| 第三章 结果与分析 |
| 3.1 有氧运动对不同生命阶段小鼠腓肠肌中肌肉干细胞及总细胞核数量的影响 |
| 3.1.1 小鼠腓肠肌单根肌纤维分离技术的建立及体外培养肌纤维发育过程的形态学观察 |
| 3.1.2 有氧运动对各组小鼠肌肉干细胞及总细胞核的数量分析 |
| 3.2 有氧运动对不同生命阶段小鼠骨骼肌相关表型指标的影响研究 |
| 3.2.1 有氧运动对各组小鼠体重的影响 |
| 3.2.2 有氧运动对各组小鼠腓肠肌质量的影响 |
| 3.2.3 有氧运动对各组小鼠腓肠肌质量分数的影响 |
| 3.2.4 有氧运动对不同生命阶段小鼠肌力的影响 |
| 3.2.5 有氧运动对不同生命阶段小鼠腓肠肌及肌纤维横截面积的影响 |
| 3.2.6 小鼠肌纤维上肌肉干细胞与总细胞核数量和各表型数据的相关性分析 |
| 3.3 有氧运动对小鼠骨骼肌及肌肉干细胞的细胞周期调控信号影响 |
| 3.3.1 有氧运动与衰老对小鼠骨骼肌Sirt1与Visfatin蛋白表达的影响 |
| 3.3.2 有氧运动与衰老对小鼠骨骼肌CDK6 蛋白表达的影响 |
| 3.3.3 有氧运动与衰老对小鼠骨骼肌各Cyclins蛋白表达的影响 |
| 3.3.4 有氧运动与衰老对小鼠骨骼肌各CKIs蛋白表达的影响 |
| 3.3.5 运动适应后肌纤维上激活态的肌肉干细胞数量观察 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 年龄与运动对肌肉干细胞数量的影响 |
| 4.2 肌核与肌肉干细胞数量的关系 |
| 4.3 从衰老的角度看肌核与肌纤维体积之间的关系及“肌核域”假说 |
| 4.4 衰老对肌力的影响 |
| 4.5 肌肉干细胞与骨骼肌质量的关系 |
| 4.6 长期运动对骨骼肌细胞周期调控的影响 |
| 4.7 运动通过抑制p16INK4a表达以对抗肌肉的衰老 |
| 4.8 Sirt1 对肌纤维及肌肉干细胞的不同影响作用 |
| 第五章 研究总结 |
| 5.1 研究结论 |
| 5.2 创新之处 |
| 5.3 不足之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 作者简历及在学期间所取得的学术成果 |
| 后记 |
（7）带仿生血管网复合肌组织支架与体外组织工程化方法研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 选题背景及研究意义 |
| 1.2 国内外研究现状 |
| 1.2.1 肌组织工程支架制备方法的研究现状 |
| 1.2.2 仿生血管网的设计与制造的研究现状 |
| 1.2.3 肌组织支架体外组织工程化方法的研究现状 |
| 1.3 研究内容 |
| 1.4 研究方法和技术路线 |
| 1.4.1 研究方法 |
| 1.4.2 技术路线 |
| 2 仿生血管网的设计、分维计算与流动性分析 |
| 2.1 仿生血管网设计要求 |
| 2.1.1 莫里法则 |
| 2.1.2 仿生血管网分叉角设计原则 |
| 2.1.3 仿生血管网长度设计原则 |
| 2.1.4 仿生血管网横截面设计原则 |
| 2.1.5 血管网循环结构设计原则 |
| 2.1.6 血管分支数量的确定 |
| 2.2 分形血管模型的建立与分析 |
| 2.2.1 分形血管模型建立及假设条件 |
| 2.2.2 分形血管参数计算与分析 |
| 2.3 仿生血管网结构设计 |
| 2.3.1 仿生血管网模型设计 |
| 2.3.2 仿生血管网参数设计 |
| 2.4 仿生血管网维数计算与分析 |
| 2.4.1 分形血管维数的定义 |
| 2.4.2 分形血管维数的计算 |
| 2.5 仿生血管网流体流动性分析 |
| 2.5.1 血流动力学参数与研究方法 |
| 2.5.2 仿生血管网流体仿真模型建立 |
| 2.5.3 仿生血管网流动性分析结果 |
| 2.6 小结 |
| 3 仿生血管网的制备方法与性能研究 |
| 3.1 仿生血管网制备工艺 |
| 3.1.1 支架模具制造工艺 |
| 3.1.2 基质材料交联性能研究 |
| 3.1.3 带血管网支架制造工艺 |
| 3.2 仿生血管网精度研究 |
| 3.2.1 仿生血管网成型精度研究 |
| 3.2.2 仿生血管网降解精度研究 |
| 3.3 成型后仿生血管网流动性分析 |
| 3.3.1 成型后仿生血管网模型建立 |
| 3.3.2 成型前后仿生血管网流动性对比分析 |
| 3.4 酶交联水凝胶多细胞相容性实验研究 |
| 3.4.1 细胞外基质材料的研究基础 |
| 3.4.2 实验试剂及仪器 |
| 3.4.3 支架和细胞准备 |
| 3.4.4 多细胞培养实验 |
| 3.4.5 生物相容性实验结果分析 |
| 3.5 小结 |
| 4 仿生血管网的内皮化研究 |
| 4.1 血管网外基质材料毒性实验研究 |
| 4.1.1 实验试剂及仪器 |
| 4.1.2 内皮细胞准备 |
| 4.1.3 实验过程及检测方法 |
| 4.1.4 细胞毒性实验结果分析 |
| 4.2 仿生血管网灌流能力研究 |
| 4.2.1 灌流支架设计与制备 |
| 4.2.2 灌流平台搭建 |
| 4.2.3 灌流性能实验结果分析 |
| 4.3 仿生血管网内皮化实验研究 |
| 4.3.1 实验仪器和细胞准备 |
| 4.3.2 血管网内皮化研究方法 |
| 4.3.3 血管网内皮化结果分析 |
| 4.4 小结 |
| 5 复合肌组织工程支架的制备及性能研究 |
| 5.1 复合肌组织工程支架的模型设计 |
| 5.1.1 肌肉解剖结构 |
| 5.1.2 复合肌组织工程支架模型建立 |
| 5.2 基底膜制备工艺过程及样品检测 |
| 5.2.1 电纺制备原理 |
| 5.2.2 电纺纤维材料材料配方及制备工艺 |
| 5.2.3 电纺纤维样品检测 |
| 5.3 基底膜生物相容性实验研究 |
| 5.3.1 实验设备、实验样品和细胞的准备 |
| 5.3.2 实验过程及检测方法 |
| 5.3.3 基底膜生物相容性实验结果分析 |
| 5.4 基底膜抑菌实验研究 |
| 5.4.1 细菌与试剂准备 |
| 5.4.2 实验过程及检测方法 |
| 5.4.3 基底膜抑菌实验结果分析 |
| 5.5 复合肌组织工程支架的制备 |
| 5.5.1 仿生血管网的制备 |
| 5.5.2 复合肌组织工程支架的制备与组装 |
| 5.5.3 复合肌组织工程支架粘附性实验 |
| 5.6 小结 |
| 6 复合肌组织工程支架/细胞的体外动态培养实验研究 |
| 6.1 灌流-拉伸生物反应器平台设计 |
| 6.1.1 动态拉伸原理 |
| 6.1.2 动态灌流原理 |
| 6.2 灌流-拉伸生物反应器平台搭建 |
| 6.2.1 密封腔的设计和制造 |
| 6.2.2 体外动态培养平台搭建 |
| 6.3 体外灌流-拉伸动态培养实验 |
| 6.3.1 实验试剂及仪器 |
| 6.3.2 细胞和样品准备 |
| 6.3.3 体外动态灌流-拉伸实验 |
| 6.4 体外动态培养评价方法 |
| 6.4.1 细胞形态学评价方法 |
| 6.4.2 增殖动力学评价方法 |
| 6.4.3 rt-PCR检测方法 |
| 6.5 体外动态培养实验结果 |
| 6.5.1 细胞形态学评价 |
| 6.5.2 增殖动力学评价 |
| 6.5.3 分化潜能评价 |
| 6.6 小结 |
| 7 结论和展望 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 主要创新点 |
| 7.3 展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的成果 |
（8）心脏Telocytes协同心脏干细胞治疗缺血性心肌梗死及其机理的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词注释表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 心血管疾病的现状 |
| 1.2 心肌梗死 |
| 1.3 心肌梗死的治疗 |
| 1.4 细胞治疗 |
| 1.5 细胞外泌体(exosome)治疗 |
| 1.6 MicroRNA治疗 |
| 1.7 心脏Telocyte与心脏再生 |
| 1.8 本论文的主要研究内容 |
| 1.9 本论文的创新点 |
| 第二章 心脏Telocytes协同心脏干细胞对缺血性心肌梗死的疗效优于单独细胞移植 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.3 方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 第三章 心脏Telocytes分泌外泌体对缺血性心肌梗死的疗效研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.3 方法 |
| 3.4 结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 心脏Telocytes外泌体内所含的miRNA-21-5p对缺血性心肌梗死的疗效研究. |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.3 方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 第五章 细胞、外泌体及miRNA对缺血梗死心肌疗效的相互比较 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 方法 |
| 5.3 结果 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 心脏Telocytes分泌外泌体的蛋白组学研究 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 材料 |
| 6.3 方法 |
| 6.4 结果 |
| 6.5 讨论 |
| 第七章 老年心脏 Telocytes与年青心脏 Telocytes基因表达芯片的比较与分析 |
| 7.1 前言 |
| 7.2 材料 |
| 7.3 方法 |
| 7.4 结果 |
| 7.5 讨论 |
| 第八章 全文总结 |
| 参考文献 |
| 特别鸣谢 |
| 硕博士期间发表论文清单 |
| 致谢 |
（9）线粒体通路在应力介导的成肌细胞凋亡中的作用及其调控机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第1章 成肌细胞的体外培养和力学刺激模型的构建 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第2章 周期性张应力对成肌细胞凋亡的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第3章 线粒体途径在周期性张应力诱导的成肌细胞凋亡中的作用 |
| 1 材料和方法 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第4章 线粒体途径在应力介导的成肌细胞凋亡中的作用 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 附录 |
| 附图 |
| 致谢 |
（10）骨碎补总黄酮促进转基因成肌细胞成骨分化及引导性骨再生的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 文献综述 |
| 一、骨碎补及其黄酮类成分促进骨损伤修复的研究进展 |
| 二、成肌细胞及其在骨科中应用的研究进展 |
| 第一部分：转染 CNTF 基因促进大鼠成肌细胞去分化的实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 分析讨论 |
| 第二部分：骨碎补总黄酮促进转 CNTF 成肌细胞向成骨分化的实验研究及机制 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 分析讨论 |
| 第三部分：微囊化骨碎补总黄酮预处理转 CNTF 成肌细胞促进引导性骨再生的实验研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 分析讨论 |
| 结论 |
| 本研究的创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、大鼠成肌细胞体外培养及其自发收缩特性（论文参考文献）
- [1]成肌细胞G0期模型构建及应力诱导下p38与JNK交互对话调控细胞周期[D]. 王亚奇. 青岛大学, 2020(01)
- [2]蒙古马肌肉卫星细胞中MSTN调控网络的研究[D]. Budsuren Undarmaa. 内蒙古农业大学, 2020(01)
- [3]基于GelMA微纤维的骨骼肌单轴拉伸诱导生成及致动特性研究[D]. 陈笑笑. 中国科学技术大学, 2020(01)
- [4]模拟推拿机械力刺激干预大鼠骨骼肌细胞生物力学效应研究[D]. 卢群文. 成都中医药大学, 2019(04)
- [5]电针“委中”对大鼠腰多裂肌细胞外基质重塑和卫星细胞增殖的影响[D]. 陈玉佩. 北京中医药大学, 2019(04)
- [6]有氧运动对小鼠肌肉干细胞衰减和相关表型的影响及细胞周期调控研究[D]. 赵昱. 华东师范大学, 2019(08)
- [7]带仿生血管网复合肌组织支架与体外组织工程化方法研究[D]. 董贵荣. 西安科技大学, 2018(01)
- [8]心脏Telocytes协同心脏干细胞治疗缺血性心肌梗死及其机理的研究[D]. 廖肇福. 暨南大学, 2019
- [9]线粒体通路在应力介导的成肌细胞凋亡中的作用及其调控机制[D]. 孙仙蕊. 青岛大学, 2013(S1)
- [10]骨碎补总黄酮促进转基因成肌细胞成骨分化及引导性骨再生的研究[D]. 张力. 辽宁中医药大学, 2012(05)