一、不同生长阶段软骨细胞构建同种异体软骨的研究（论文文献综述）
吴俊[1]（2021）在《软骨脱细胞细胞外基质3D生物打印支架负载髌下脂肪垫间充质干细胞修复兔软骨病损的相关研究》文中指出研究目的软骨损伤是骨关节炎发生发展过程中极其重要的一个病理过程,临床发病率高,治疗棘手,迄今尚无满意的治疗方法。本研究期望通过组织工程学的手段,将髌下脂肪垫间充质干细胞（infrapatellar fat pad adipose derived mesenchymal stem cell,IPFP-ADSC）作为种子细胞,结合软骨脱细胞细胞外基质（decellularized cartilage extracellular matrix,dCECM）制备复合水凝胶生物墨水,利用3D生物打印的优势,实现IPFP-ADSC在支架内的均匀负载,构建具有体外成软骨分化、体内软骨缺损修复能力的活细胞生物材料,为构建组织工程化软骨修复材料并向临床转化应用提供参考。方法及结果第一部分:髌下脂肪垫间充质干细胞及软骨脱细胞细胞外基质生物学特性研究研究方法:使用Ⅰ型胶原酶消化提取新西兰大白兔IPFP-ADSC和皮下脂肪间充质干细胞（subcutaneous fat adipose derived mesenchymal stem cell,SCF-ADSC）,通过对贴壁生长和三系分化（成骨、成软骨、成脂）能力以及细胞表面标记物的检测进行干性鉴定。使用CCK-8法评估增殖能力,实时荧光定量聚合酶链式反应法（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-PCR）检测软骨分化特异性基因Ⅱ型胶原（collagenⅡ,COL2A1）和性别决定区Y框蛋白9（Sry Related HMG Box-9,Sox-9）的表达水平对二者的成软骨分化能力进行比较。分别使用文献报道的和本课题组改良的方法,联合物理、化学和酶消化法,对猪关节透明软骨进行脱细胞处理,观察dCECM的三维微观结构,通过苏木素伊红（HE）染色比较残留的细胞数量、检测dCECM残留的胶原、糖胺聚糖（glycosaminoglycan,GAG）和双链DNA（double-stranded deoxyribonucleic acid,ds DNA）含量对两种方法的脱细胞效果进行比较。将IPFP-ADSC与dCECM共培养,CCK-8法和钙黄绿素/碘化丙啶染色法（Calcein AM/PI staining）评估细胞增殖能力和活力。分别将不同浓度的dCECM（0,5 mg/mL,10 mg/mL和20mg/mL）作用于IPFP-ADSC,进行体外成软骨诱导分化,使用免疫荧光染色法（immunofluorescent staining,IF）评估Ⅱ型胶原（collagenⅡ,COL-2）,蛋白聚糖（aggrecan,ACAN）的表达情况,RT-PCR检测COL2A1和Sox-9基因表达水平,评价dCECM促IPFP-ADSC成软骨分化的生物学作用。结果:酶消化法能成功提取IPFP-ADSC和SCF-ADSC,二者均符合国际干细胞治疗学会（International Society for Stem Cell Therapy）提出的干细胞标准,具备贴壁生长,成骨、成软骨、成脂三系分化潜能,高表达CD73、CD90和CD105（>99%）,低表达CD34、CD45和HLA-DR（<1%）。相比SCF-ADSC而言,IPFP-ADSC体外增殖能力、成软骨分化能力更强,COL2A1和Sox-9基因表达水平更高（P<0.05）。两种脱细胞方法均能充分地去除软骨细胞,HE染色未见明显细胞核残留,残留ds DNA<5%。改良的脱细胞方法增加了对细胞物理破壁的次数,减少了胰酶的使用,dCECM胶原成分得以更多保留（74%vs 59.5%,P<0.05）。dCECM与IPFP-ADSC共培养,细胞生长状态良好、无脱壁现象,共培养7天时细胞活力大于90%（P>0.05）。体外诱导下,dCECM表现出促进IPFP-ADSC成软骨分化的作用,COL-2、ACAN蛋白表达量和COL2A1、Sox-9基因表达水平随着浓度的增加而提高（P<0.05）。第二部分:负载IPFP-ADSC的dCECM水凝胶支架的3D构建及其生物学特性研究第一节dCECM复合水凝胶生物墨水制备及3D打印水凝胶支架物理特性研究研究方法:制备甲基丙烯酸酐明胶/海藻酸盐（GelMA/ALG）复合水凝胶,按不同浓度添加dCECM（A:3%、B:5%、C:7%,w/v,g/mL）制备3种dCECM/GelMA/ALG复合水凝胶生物墨水,使用旋转流变仪测定黏度、弹性模量,使用Calcein AM/PI染色评估不同时间点复合水凝胶生物墨水中IPFP-ADSC细胞的活力。利用捷诺飞Regenovo3D Bio-Architect?3D生物打印系统进行打印,探索打印条件,构建水凝胶生物支架,并进一步评估水凝胶支架的机械性能、孔隙率、溶胀率、体外降解速度等物理特性。结果:三种dCECM/GelMA/ALG复合水凝胶墨水均呈现出凝胶样外观和可逆的凝胶-溶胶转变温敏特性。随着剪切速率增加黏度逐渐下降,呈现典型的“剪切变稀”现象和。三种水凝胶均有清晰的成胶点温度:A、B墨水在32～33℃,C墨水在27～29℃。72 h时,三组（非固化）生物墨水内细胞活力均>80%,C组细胞活力最差（P<0.05）,A、B组间无显着差别。通过调整打印参数,三种生物墨水均能成功实施3D生物打印。A组（dCECM浓度3%）支架机械性能、孔隙率、溶胀率较高,但体外降解速度最快,C组（dCECM浓度7%）机械性能、孔隙率、溶胀率较差,但体外降解速度最慢。第二节3D生物打印负载IPFP-ADSC组织工程支架体外成软骨分化生物学特性研究研究方法:基于第一节的结果,本节生物墨水中添加5%的dCECM进一步负载IPFP-ADSC构建活细胞3D生物打印支架,实验分为两组:IPFP-ADSC/dCECM（+）/GelMA/ALG组和IPFP-ADSC/dCECM（-）/GelMA/ALG组,IPFP-ADSC细胞密度为107/mL。利用捷诺飞Regenovo 3D Bio-Architect?系统分别构建两种活细胞支架并进行体外成软骨诱导分化。使用Calcein AM/PI染色法评估支架内的细胞活力（第3/7/14/28天）。免疫荧光染色法观察支架内COL-2和Sox-9的生成情况（第7/14/28天）。酶联免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA）测定培养液中游离COL-2、ACAN的表达水平（3/7/10/14/21/28天）。应用蛋白免疫印迹法（Western Blot）和RT-PCR法测定不同时间（第14/28天）、不同培养条件（2D和3D）下两组支架内IPFP-ADSC成软骨分化特异性蛋白（COL-2、Sox-9）和基因（COL2A1、Sox-9）的表达情况,评价dCECM和3D立体培养对IPFP-ADSC成软骨分化的影响。结果:打印后第2周,IPFP-ADSC活力均大于90%,第4周细胞活力均大于85%,各时间点差异无统计学意义（P>0.05）。COL-2和Sox-9荧光染色荧光强度随着时间推移逐渐增强,第4周时dCECM（+）组明显高于dCECM（-）组（P<0.05）。ELISA显示dCECM（-）组在第3周时培养液上清COL-2和ACAN含量与dCECM（+）组第2周水平相当;第4周时,dCECM（+）组明显高于dCECM（-）组（P<0.05）。Western Blot和RT-PCR结果显示,COL-2、Sox-9等软骨相关蛋白及基因表达水平随着诱导时间延长逐步提高:第4周时,无论是dCECM（+）组还是dCECM（-）组,3D培养条件下COL-2、Sox-9表达量均高于2D培养;无论2D还是3D培养,dCECM（+）组COL-2、Sox-9表达量均高于dCECM（-）组（P<0.05）。第三部分:3D生物打印负载IPFP-ADSC组织工程支架修复兔软骨缺损的实验研究研究方法:IPFP-ADSC及3D生物打印负载IPFP-ADSC的组织工程支架的免疫原性评估:选择新西兰大白兔作为实验动物,实验分为四组——PBS、IPFP-ADSC、dCECM/GelMA/ALG支架和IPFP-ADSC/dCECM/GelMA/ALG支架组,分别进行皮下注射或者皮下支架包埋,第2、4周时取材进行大体观察及HE染色以评价细胞和支架的免疫原性。新西兰大白兔股骨滑车软骨缺损的模型建立及修复:实验分为4组,PBS关节腔注射（A组）、IPFP-ADSC关节腔注射（B组）、dCECM/GelMA/ALG支架植入联合IPFP-ADSC关节腔注射（C组）和IPFP-ADSC/dCECM/GelMA/ALG支架植入组（D组）。新西兰大白兔股骨滑车沟制作直径4 mm,深约3 mm的全层软骨缺损,按上述分组分别对软骨缺损进行修复。第6、12周时取材,对修复效果进行大体观察评分（International Cartilage Repair Society Score）和组织学染色评分（The Modified O’Driscoll Histological Score）,评价3D生物打印负载IPFP-ADSC的组织工程支架对兔股骨滑车软骨缺损的修复效果。结果:第2/4周时,PBS及IPFP-ADSC皮下局部注射区未见异常新生组织块及粘连现象。dCECM/GelMA/ALG和IPFP-ADSC/dCECM/GelMA/ALG支架皮下包埋第二周时存在一定程度的异物炎症反应,局部包膜组织充血、粘连,可见较多炎症细胞浸润,高倍镜下中性粒细胞浸润数量比较无组间差异（3.6±0.5 vs 3.4±0.5,P>0.05）;第4周时,细胞浸润现象明显减轻,支架与周围组织无粘连充血,包膜变薄,高倍镜观察细胞浸润数量同样无组间差异（1.4±1.14 vs 1.8±0.8,P>0.05）,随时间推移,炎症反应逐渐减轻（P<0.05）。兔软骨缺损造模成功,缺损修复大体外观及组织学染色评分结果显示:软骨组织几乎没有自我修复能力;IPFP-ADSC/dCECM/GelMA/ALG支架修复效果最好,缺损部位基本完全被新生的软骨组织所覆盖,关节面光滑度高、与周围组织结合紧密,胶原、蛋白多糖沉积更多;dCECM/GelMA/ALG支架联合IPFP-ADSC关节腔注射修复效果次之,新生组织与正常软骨结合略差,关节面欠光滑,胶原、蛋白多糖沉积不均匀;单纯关节腔注射IPFP-ADSC软骨缺损处有一定程度的新生软骨,但组织松脆、结构杂乱,胶原沉积较少。大体观察与组织学染色评分组间差异有统计学意义（P<0.05）。结论胶原酶消化法能够成功获取IPFP-ADSC,具备多向分化潜能,相较于SCF-ADSC,具有更强的体外增殖和成软骨分化能力,获取方便,可作为理想的软骨修复组织工程学种子细胞。改良的软骨脱细胞方法,通过加强物理破壁过程、减少胰酶的使用,同样可以充分地去除软骨细胞,三维微观结构得以保留,更多保留胶原成分。dCECM生物相容性较好,具有促进IPFP-ADSC体外增殖和成软骨分化的生物活性作用。dCECM/GelMA/ALG复合水凝胶生物墨水具备良好的生物相容性和可打印性,利用3D生物打印的优势,可以构建空间有序、均匀负载IPFP-ADSC的仿生支架,在dCECM和3D立体培养协同作用下,能更快更好地向软骨细胞分化。异体IPFP-ADSC和含异种dCECM的IPFP-ADSC/dCECM/GelMA/ALG支架免疫原性低,组织相容性好。相对于单纯的IPFP-ADSC关节腔内注射或dCECM/GelMA/ALG支架联合IPFP-ADSC关节腔注射这种细胞支架无序结合的修复材料,IPFP-ADSC/dCECM/GelMA/ALG 3D生物打印支架对大白兔软骨缺损具有更快更优的修复效果。利用3D生物打印技术的优势,联合IPFP-ADSC和dCECM构建的活细胞组织工程支架实现了将种子细胞、生物活性因子和支架材料均一、有序有机整合的目的,具有良好的体外成软骨分化能力和体内软骨缺损修复效果,是一种极具临床转化应用价值的软骨修复组织工程学治疗手段。
姜双鹏[2]（2021）在《人脐带间充质干细胞外泌体增效脱细胞软骨基质支架促进骨软骨再生》文中研究指明目的和背景:关节软骨是透明软骨,缺乏血管、淋巴管和神经,仅依靠关节滑液的渗透提供营养,其损伤后的自愈能力非常有限。关节软骨损伤若不及时治疗,极易引发骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）。OA不仅严重危害人类的身心健康,还给社会和家庭带来沉重的经济负担。遗憾的是,无论是药物治疗还是传统的外科手术治疗均难以再生透明软骨。随着研究人员对干细胞探索的逐渐深入,间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）治疗已经显示出再生关节软骨的潜力,基于MSCs的组织工程软骨取得了令人鼓舞的结果。MSCs具有强大的自我更新能力和向骨、软骨及脂肪分化的潜能,并且来源广泛,是较为理想的组织工程种子细胞。已有大量研究通过将MSCs与不同形式的组织工程支架相结合或单纯将MSCs注射入关节腔,促进了关节软骨或骨软骨的再生修复。但是,MSCs的致瘤风险、疾病传播风险、细胞储存和运输的较高标准以及相关监管政策对干细胞移植的严格要求限制了基于MSCs的组织工程软骨的进一步发展。所以,目前临床急需一种既能发挥MSCs功能又尽可能避免MSCs局限性的“无细胞”软骨再生方法。近年来,越来越多的研究显示,MSCs促进组织修复与再生的过程可能并非由MSCs直接分化导致,而是由其旁分泌的外泌体（Exosomes,Exos）介导。Exos是细胞间重要的通讯载体,内含多种蛋白质、核酸和脂质,具有与来源细胞相似的生物学功能。已有研究显示,MSC-Exos对关节软骨再生具有有益作用,并且可以抑制OA进展,但其具体机制尚不明确。另外,本课题组前期已成功制备了具有成分和结构双重仿生特性的脱细胞软骨细胞外基质（ACECM）垂直取向支架,动物实验显示该支架复合细胞后可以促进关节软骨再生。本研究的目的是构建基于人脐带华通胶间充质干细胞来源Exos（Human wharton’s jelly mesenchymal stem cell-derived exosomes,hWJMSC-Exos）和ACECM支架的“无细胞”组织工程软骨,探讨hWJMSC-Exos能否增强ACECM支架的修复效果,促进兔骨软骨再生。并且本研究创新性地从关节腔微环境角度初步探讨了hWJMSC-Exos促进骨软骨再生可能的机制,为“无细胞”组织工程软骨的构建和进一步推广提供了理论参考。研究方法:我们使用组织块贴壁法分离原代hWJMSCs,使用流式细胞术鉴定其标志物,通过三系诱导分化培养鉴定其向骨、软骨和脂肪分化的潜能。收集P3-P5代hWJMSCs的培养上清液,以差速超速离心法提取Exos。以透射电子显微镜（Transmission electron microscope,TEM）观察Exos的形态,以纳米粒子跟踪分析（Nanoparticle tracking analysis,NTA）检测Exos的粒径,以蛋白质印迹（Western blot,WB）法鉴定Exos的标志蛋白。以新鲜猪关节软骨制备ACECM支架,表征并验证其细胞相容性。分别通过细胞增殖实验、细胞迁移实验和RTPCR验证hWJMSC-Exos体外对骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchyml stem cells,BMSCs）和软骨细胞增殖、BMSCs迁移和巨噬细胞极化的影响。建立大鼠膝关节骨软骨缺损模型,以PBS关节腔内注射为对照组,hWJMSC-Exos关节腔内注射为实验组。通过对抗炎细胞因子IL-10和促炎细胞因子IL-1及TNF-α进行免疫组织化学染色,探讨hWJMSC-Exos对关节腔微环境炎症反应的影响。然后通过对总巨噬细胞标志物CD68、M1型巨噬细胞标志物CD86和M2型巨噬细胞标志物CD206进行免疫组织荧光染色评估hWJMSC-Exos体内对巨噬细胞极化的影响。通过对MSC标志物CD73和CD105进行免疫荧光染色评估hWJMSC-Exos体内对内源性干细胞迁移的影响。建立兔膝关节骨软骨缺损模型,以PBS关节腔内注射（PBS组）、PBS关节腔内注射联合ACECM支架植入（PBS+S组）、Exos关节腔内注射（Exo组）和不造成骨软骨缺损的假手术（Sham组）作为对照组,以Exos关节腔内注射联合ACECM支架植入（Exo+S组）作为实验组修复兔膝关节骨软骨缺损。术后当天和术后每7天重复进行关节腔注射PBS或hWJMSC-Exos,持续4周。在术后3个月和6个月分别处死一半数量的兔子,收集膝关节标本。通过宏观表现、影像学表现、组织形态学表现、生物力学和生物化学检测评价hWJMSC-Exos在兔膝关节骨软骨缺损模型中能否增强ACECM支架的修复效果,促进骨软骨再生。最后通过miRNA测序和通路富集分析初步探索hWJMSC-Exos在骨软骨再生中可能发挥作用的miRNA及其机制。结果:（1）hWJMSC-Exos具有Exo典型的形态特征并表达Exo的标志蛋白,符合Exo的标准。（2）ACECM支架横截面具有疏松多孔结构,纵截面具有类似天然软骨细胞的垂直取向结构,并具有良好的细胞相容性。（3）hWJMSC-Exos在体外可以促进BMSCs和软骨细胞增殖。（4）hWJMSC-Exos在体外可以促进BMSCs迁移,且这种作用呈剂量依赖性。（5）hWJMSC-Exos在体外可以促进巨噬细胞向M2型极化。（6）hWJMSC-Exos在体内可以促进巨噬细胞向M2型极化,进而促进抗炎细胞因子IL-10的升高,抑制关节腔微环境的炎症反应。（7）hWJMSC-Exos在体内可能在一定程度上促进内源性干细胞迁移,但相对于对照组（PBS）,这种作用并不显着。（8）hWJMSC-Exos可以增强ACECM支架的修复效果,Exo+S组新生软骨具有比较典型的透明软骨特征。（9）hWJMSC-Exos含有多种已被证实了可以促进骨软骨再生的miRNAs,通过筛选确定出20个可能在骨软骨再生中发挥作用的miRNAs。结论:hWJMSC-Exos可以增强ACECM支架修复骨软骨缺损的能力,其机制可能为通过对MSCs、软骨细胞和巨噬细胞生物行为的影响,调节关节腔微环境,促进骨软骨再生。基于hWJMSC-Exos和ACECM支架的“无细胞”组织工程策略有望成为促进骨软骨再生的有效途径。
杨帆[3]（2021）在《bFGF联合琼脂糖凝胶预植入促进异体移植后全层软骨缺损修复的研究》文中提出近年来,同种异体全层软骨移植技术逐渐成为治疗全层软骨损伤这一业内难题的可选方法。该技术可以在为机体提供具有生物学活性的骨与软骨组织的同时,对缺损部位进行大面积甚至是特殊形状单独定制的修复。但是由T细胞介导,多种炎症细胞、炎性因子共同参所引发的免疫排斥反应,导致大量移植手术失败。所以如何避免免疫排斥反应成为同种异体全层软骨移植成功与否的关键问题。针对这一难点,传统方法如对所移植骨与软骨组织进行脱细胞、脱抗原处理等,不仅使移植物失去生物活性,而且无法从根本上避免免疫排斥反应,难以达到全层软骨修复的目标。本研究对大鼠全层软骨缺损区域预植入吸收了碱性成纤维细胞生长因子溶液的琼脂糖凝胶,使机体对其攻击后在局部形成免疫包囊,再二次手术进行同种异体全层软骨移植,在免疫包囊的保护下使所移植全层软骨逃避宿主免疫攻击。并探讨免疫排斥反应的发生机制、病程演变与进行规避。以此为依据,为全层关节软骨缺损的修复提供一种新的方法。本研究主要内容与取得成果如下:第一、体外细胞实验中发现,对大鼠体外培养第三代软骨细胞进行适当浓度的bFGF干预,可以促进软骨细胞的增殖分化,提示其应用的最佳浓度区间为10 ng/mL-100 ng/mL,但当bFGF的浓度达到500 ng/mL时这种促进作用开始降低,并出现抑制,为后续体内实验bFGF溶液的应用浓度提供了理论基础。第二、针对全层软骨移植术后,机体急性免疫反应发生的时间规律进行了动物体内实验研究,得出该反应强度在术后5天达到最高峰,后逐渐回落的结论,机体也通过此过程完成了对同种异体植入物的攻击杀伤。使急性免疫反应在时间上更加具体化,为今后生物工程骨科材料植入以及同种异体/异种骨软骨移植的免疫抑制干预提供了基础。第三、在大鼠全层软骨缺损部位异体移植手术前7天,进行bFGF/琼脂糖凝胶柱复合体的预植入占位,该方法可以有效降低大鼠的炎性反应,保护二期手术移植物,促进全层软骨异体移植修复。为全层软骨修复这一难题,提供了新的方法和思路。综上所述,本研究设计和构建了一系列降低同种异体全层软骨移植术后免疫排斥反应的手术方式和干扰方法,保护所移植的骨与软骨组织,促进了全层软骨缺损的修复。
吴帅[4]（2020）在《同种异体软骨细胞/成骨细胞载β-磷酸三钙生物陶瓷支架修复软骨缺损的实验研究》文中指出[研究背景]软骨作为一种单一细胞成分的结缔组织,由单一的软骨细胞、纤维以及基质构成,在体内主要发挥着连接、支持、分散应力以及减少振荡等生理功能。然而,创伤、炎症以及退化等病理现象的发生容易引起软骨组织出现不同程度的损伤或者缺损,严重者还会导致关节炎的发生,因此对关节正常的功能造成了较大的影响,也给患者的正常生活带来了不便。由于软骨细胞自身的再生能力非常有限,因此当软骨缺损时就需要借助其他方式进行修复,关于软骨损伤的修复治理研究也是目前骨科和临床研究的重中之重。软骨缺损的修复过程极其复杂,而修复过程核相关调控机制尚未揭示。同种异体软骨细胞/成骨细胞载β-磷酸三钙生物陶瓷支架在修复软骨缺损中有着良好的潜在应用前景。同种异体软骨细胞/成骨细胞的研究仍处于探索阶段,对于广泛应用于临床来讲仍有较大的距离,需要多种检测手段的全面配合。关于β-磷酸三钙生物陶瓷支架,材料的选择是治疗软骨缺损的重要内容。因此,在研究过程中,均需要权衡好治疗的风险及获益,才能为未来的临床应用提供更安全的保障。我们相信随着技术的进一步相互结合和深入及推广,将为同种异体软骨细胞成骨细胞载β-磷酸三钙生物陶瓷支架治疗软骨缺损提供切实的临床治疗指导。综合技术的使用能够为软骨缺损患者提供科学的理论指导去制定相应的治疗方案,使患者尽快康复,这为进一步研究软骨缺损奠定了坚实的理论基础。[研究目的]本研究首先探究同种异体软骨细胞/成骨细胞载β-磷酸三钙生物陶瓷支架与软骨的组织相容性。其次,探索3D人工微/纳米支架在关节的组织修复中的应用价值。最后,探寻同种异体软骨细胞/成骨细胞载β-磷酸三钙生物陶瓷支架对软骨细胞能量代谢和增殖的影响。[研究方法]第一部分:提取比格犬骨髓间充质干细胞,分别定向分化为软骨细胞和成骨细胞,将实验细胞分为三组:对照组、软骨细胞组、成骨细胞组。实验犬分为三组:β-TCP组（软骨缺损处放置空白β-TCP支架作为实验对照）,软骨细胞β-TCP组（将培养的软骨细胞同β-TCP支架融合后放入软骨缺损模型犬中）,软骨细胞/成骨细胞β-TCP组（将培养的软骨细胞同β-TCP支架融合及成骨细胞同β-TCP支架融合叠加模仿正常软骨及软骨下骨解剖结构后放入软骨缺损模型犬中）;三组实验比格犬在相同条件下喂养,12周后处死做实验观察。通过MTT检测各组细胞中的增殖。通过流式细胞仪检测各组细胞的凋亡、活力。使用 Alcian蓝结合测定法糖胺聚糖（Glycosaminoglycan,GAG）含量。蛋白印迹分析细胞中ColII、BMP的蛋白表达。第二部分:提取比格犬骨髓间充质干细胞,通过微团干细胞培养和基于生物反应器的细胞负载支架培养分别制备软骨细胞/成骨细胞负载的β-TCP磷酸钙生物陶瓷支架和软骨细胞负载的β-TCP生物陶瓷支架,分别植入比格犬股骨滑车软骨缺损模型,以治疗关节软骨缺损,观察同种异体软骨细胞/成骨细胞负载的β-TCP磷酸钙生物陶瓷支架修复软骨缺损情况,将软骨细胞负载的β-TCP生物陶瓷支架设为阳性对照。第三部分:选择24只年龄为4-10个月、体重为7.5-10.0 kg的健康比格犬,以比格犬股骨滑车作为比格犬关节软骨缺损的研究模型。分别提取比格犬肋软骨的软骨细胞和骨膜的成骨细胞交叉使用以保证同种异体性。实验分为2组:对照组（软骨缺损模型,植入β-TCP生物陶瓷支架,n=12）;复合体组（软骨缺损模型,植入同种异体软骨细胞/成骨细胞载β-TCP生物陶瓷支架,n=12）。通过组织切片和显微镜观察支架上细胞增殖。通过ELIS A试剂盒定量检测软骨细胞中促炎因子IL-1、IL-6、TNF-α水平。通过免疫组化分析不同处理组软骨细胞II型胶原蛋白和骨形态发生蛋白含量。蛋白印迹分析不同处理组软骨细胞转化生长因子β（Transforming growth factor beta,TGF-β）、胰岛素样生长因子 2（Insulin-like growth factor 2,IGF-2）和GLUT蛋白表达。蛋白印迹分析不同处理组软骨细胞能量代谢途径中缺氧诱导因子1α（Hypoxia inducible factor 1α,HIF1α）、AMP 激活激酶（AMP-activated kinase,AMPK）和 ERK mRNA表达。蛋白印迹分析不同处理组软骨细胞糖酵解,氧化磷酸化,PPP以及糖原合成途径关键酶:3-磷酸甘油醛脱氢酶（Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate,NADPH）和糖原合酶激酶 3β（Glycogen synthase kinase 3,GSK3β）蛋白表达。通过酶联免疫检测不同处理组软骨细胞LC3和Beclin-1水平。[研究结果]第一部分:培养4小时后,软骨细胞组较对照组细胞增殖升高（P<0.05）,成骨细胞较对照组细胞增殖升高（P<0.05）。培养第24小时后软骨细胞组较对照组细胞增殖升高（P<0.05）,成骨细胞较对照组细胞增殖升高（P<0.05）。软骨细胞组和成骨细胞组较对照组细胞凋亡降低（P<0.05）,成骨细胞较软骨细胞凋亡率降低（P<0.05）。软骨细胞组和成骨细胞组较对照组细胞活力升高（P<0.05）,成骨细胞较软骨细胞活力升高（P<0.05）。软骨细胞组和成骨细胞组较对照组GAG的含量升高（P<0.05）,软骨细胞组较成骨细胞组GAG的含量比较无差异（P>0.05）。软骨细胞组较对照组ColⅡ的蛋白表达升高（P<0.05）,成骨细胞组较软骨细胞组ColⅡ的蛋白降低（P<0.05）,成骨细胞组较软骨细胞组和对照组BMP蛋白表达升高（P<0.05）,对照组较软骨细胞组BMP蛋白表达无差异（P>0.05）。软骨/成骨β-TCP组较软骨细胞β-TCP组细胞形态评分升高（P<0.05）,软骨细胞β-TCP组较β-TCP组细胞形态评分升高（P<0.05）。软骨/成骨β-TCP组较软骨细胞β-TCP组和β-TCP组表面形态评分升高（P<0.05）。软骨/成骨β-TCP组较软骨细胞β-TCP组和β-TCP组中IL-1β的mRNA表达降低（P<0.05）。β-TCP组较软骨细胞β-TCP组和软骨/成骨β-TCP组TNF-α mRNA表达升高（P<0.05）。软骨/成骨β-TCP组较软骨细胞β-TCP组和β-TCP组IL-6 mRNA 表达降低（P<0.05）。第二部分:使用微团干细胞培养培养可以成功地从骨髓间充质干细胞诱导获得同种异体软骨细胞和成骨细胞。通过应用生物反应器的细胞负载支架培养物成功地制备软骨细胞/成骨细胞的β-TCP生物陶瓷支架组、软骨细胞的β-TCP生物陶瓷的支架组、β-TCP生物陶瓷的支架。将支架用于比格犬关节软骨缺损的治疗。比格犬股骨滑车的相对软骨再生能力如下:软骨细胞/成骨细胞的β-TCP生物陶瓷支架组>软骨细胞的β-TCP生物陶瓷的支架组>β-TCP生物陶瓷的支架。第三部分:对照组和复合体组细胞增殖率均随时间增加而升高,与对照组相比,复合体组1周、3周、5周和8周细胞增殖率升高（P<0.05）。与对照组相比,复合体组IL-1、IL-6、TNF-α水平降低（P<0.05）。与对照组相比,复合体组II型胶原蛋白和骨形态发生蛋白含量升高（P<0.05）。与对照组相比,复合体组TGF-β、IGF-2和GLUT蛋白表达量增加（P<0.05）。与对照组相比,复合体组HIF-1 α、AMPK和ERK蛋白表达量增加（P<0.05）。与对照组相比,复合体组GAPDH、NADPH和GSK3β蛋白表达量降低（P<0.05）。与对照组相比,复合体组LC3和Beclin-1水平降低（P<0.05）,说明复合体抑制自噬。[研究结论]1.探索了 BMSCs来源的同种异体软骨细胞和成骨细胞具有良好的细胞活性。同种异体软骨细胞/成骨细胞负载的β-TCP生物陶瓷支架可以与周围软骨产生良好的生物相容性。2.微团干细胞培养培养和基于生物反应器的细胞加载支架培养可以制备软骨细胞/成骨细胞加载的β-TCP生物陶瓷支架,用于关节软骨缺损的治疗且效果良好。这表明同种异体软骨细胞/成骨细胞负载β-TCP生物陶瓷支架可潜在地用于治疗软骨缺损患者。3.同种异体软骨细胞/成骨细胞载β-TCP生物陶瓷支架增加软骨细胞能量代谢和增殖,减少细胞自噬。
陈昱[5]（2019）在《仿生型组织工程气管支架重建气管缺损的实验研究》文中研究表明气管是人体重要的器官。气管肿瘤、外伤、甲状腺癌、先天性气管狭窄等会导致气管狭窄等问题而威胁生命,因此在临床实践中我们需要切除病变气管和进行气管重建。由于气管特殊的解剖构造,成年人的气管切除长度大于50%或儿童的气管切除长度大于30%时就不能够直接行气管的端对端吻合,因此长段气管缺损的重建需要替代物来实现。但是目前尚无理想的气管移植物,因此气管缺损重建手术对于临床医师是一个非常具有挑战性的工作。组织工程是近些年研究气管重建的研究热点。其主要原理是采用少量的自体细胞,通过体外扩增以后种植于预先构制的三维支架上,最终培养出没有排异性的气管移植物,因此其具有较好的研究前景。研究目的:一、在课题组前期的研究基础上,利用PDO单丝和PHBV/PLA复丝编织出带有横向管道的仿生型组织工程气管支架,并对其进行涂层处理和改性定形,为后期种子细胞提供气管支架;二、利用前期制作出的气管支架在体外与成软骨诱导后的BMSCs进行体外共培养,探索BMSCs与气管支架体外共建的方法,为下一步气管缺损的修复提供材料;三、我们利用仿生型气管支架对动物气管缺损进行实验修复,观察其修复的效果。研究内容与方法:一、仿生型组织工程气管支架的选材、设计与编织与力学评价课题组原先的研究基础上,采用PDO单丝和和PHBV/PLA复丝为主编织出带有横管的仿生型组织工程气管支架,探索一次成型管道结构的编织方法,在横管内塞入PGA细丝,最后对支架内壁利用壳聚糖进行涂层处理,制作出满足后期实验所需的气管支架。二、组织工程气管支架材料的生物学评价依据GB/T16886和标准化组织ISO10993医疗器械生物学评价标准和要求设计一组实验。对五种生物混合材料（PDO、PHBV/PLA、PGA、壳聚糖）进行了生物相容性的实验研究,并且对支架的力学性能进行了测试,为下一步研究的安全进行提供良好的实验基础。三、体外气管支架与种子细胞复合物构建的实验研究在这部分实验中我们在前面实验研究的基础上进行了种子细胞与气管支架体外共培养实验研究。探索种子细胞和三维气管支架共培养条件和方法,为下一步将组织工程气管移植物体内预置和原位移植提供条件。四、仿生型结构气管支架的体内预置与气管缺损的动物模型的建立本部分详细描述了仿生型结构气管支架在动物体内预置的实验方法,并对体内预置后的气管支架进行了组织学检查。利用预置的气管支架对动物气管缺损进行了气管重建,通过对气管重建后动物的转归过程的观察和重建后气管支架的组织学变化,说明了仿生型气管支架修补气管缺损的可行性,并对以后的对组织工程气管的研究提供了思路和参考。研究结果:一、利用PDO单丝和PHBV/PLA复丝一次性制备出了带有横管结构的气管支架,管径包括15mm和10mm两种型号,孔径大小为200μm。之后对仿生型气管支架的内壁利用壳聚糖进行涂层处理,以增加气管支架的气密性和径向支撑力。测定已编织成的两种型号气管支架（φ15mmφ10mm）的径向支撑力为800cN以上,弹性回复率在90%左右。二、对最终组成气管支架的五种生物材料（PDO、PHBV/PLA、PGA、壳聚糖）的混合物进行了细胞毒性试验、全身急性毒性试验、溶血试验、热源试验和迟发型超敏反应试验,通过试验证明了上述混合材料良好的生物相容性,为下一步的实验奠定了良好的基础。三、在气管支架与种子细胞复合物构建的实验研究中,我们对分离培养出的细胞成功的进行了成骨及成软骨诱导,证明了我们通过贴壁法分离纯化的细胞为BMSCs,它为种子细胞与气管支架的共培养提供了细胞数量与质量方面的保证。我们在气管支架的横管中塞入PGA细丝,将经过成软骨诱导的BMSCs种植在PGA细丝形成的三维网状结构中,通过扫描电镜观察到BMSCs在三维结构上的生长情况。四、将气管支架与种子细胞组成的仿生型结构气管移植物在犬的气管与颈部肌群之间的间隙进行了体内预置,通过对预置后的气管支架的组织学分析证明了气管支架优异的组织相容性,在支架内发现有大量的毛细血管,并且在支架内发现了软骨细胞,说明了前期支架设计的有效性。但也发现经过体内预置后的气管支架径向支撑力的损失,因此在之后的气管缺损修复时需要使用气管内支架来保持气道的通畅性。对犬的气管缺损模型进行气管重建,实验中利用气管插管作为气管内支架保持支架三维结构。修补实验后二周将移植物取出进行组织切片研究,发现移植物与气管的吻合口愈合良好。实验结论:1、选取1:2斜纹、1:5斜纹、2:1斜纹作为气管支架三层结构的基础组织,采用分区穿综法,可以一次性制备成功带横管的气管支架。2、研究组选用的混合生物材料具有良好的生物相容性,编织成功的气管支架在体外测试中有一定的力学强度;3、在体外进行了气管支架与经过成软骨诱导的BMSCs进行复合物构建,探索了在体外进行软骨-支架复合物构建的方法;4、通过对预置后的支架进行了组织学评价,进一步明确证实了支架优良的组织相容性并且达到了较好的再血管化能力。并利用支架对犬的气管缺损模型进行了修复。通过对移植物组织学和力学评价为以后对气管修补的研究提供了新思路和新方法。
姜良斌[6]（2019）在《壳聚糖/海藻酸钠膜支架—骨髓间充质干细胞修复软骨缺损的研究》文中研究说明研究一 Beagle犬骨髓间充质干细胞的体外分离、培养及鉴定目的:探讨Beagle犬骨髓间充质干细胞（BMSCs）的体外分离、培养条件以及生物学特性的相关鉴定。方法:Beagle犬使用戊巴比妥钠麻醉（30mg/Kg）成功后,浓度8%的硫化钠液脱毛、温清水擦拭、碘伏液消毒后铺无菌巾单,无菌操作下,选用16号骨髓穿刺针,分别自左右两侧髂嵴抽取Beagle犬骨髓血,注入含肝素和DMEM/F12的离心管内,采用全骨髓血联合贴壁法培养Beagle犬骨髓间充质干细胞:骨髓血以1500转/分,离心5分钟,弃上清,加入DMEM/F12适量。再以1200转/分,离心5分钟,弃上清液,计数,调整细胞密度为5×10-1mL,加入完全培养基中(培养基主要成分包括:DMEMF12培养液（HYCLONE公司,USA）、10%的胎牛血清（HYCLONE公司,USA）、青链霉素混合液（Solarbio公司,pH=7.2）,制成细胞悬液,吹打混匀后接种于25cm2培养瓶内,置于37℃,含5%C02培养箱中常规培养。48小时后首次给予全量换液,以后每48小时至72小时、培养基变黄时换液1次。当细胞融合至80%,采用0.25%胰蛋白酶常规消化,按1:2或1:3传代培养至第三代。形态学观察:倒置显微镜下观察BMSCs贴壁细胞形态、增殖生长速度及群体生长方式等特征。免疫荧光组织化学染色:取第3代BMSCs制备细胞爬片,行苏木精-伊红染色（HE染色）、行CD34,CD44,CD90抗体免疫荧光染色,应用免疫荧光化学染色法进行细胞鉴定,应用流式细胞仪检测干细胞表面标记物的表达,CCK-8检测细胞增殖,检测骨髓间充质干细胞的生长特性。结果:原代Beagle犬骨髓间充质干细胞培养至第4天,通过倒置显微镜观察见视野中有大量成纤维细胞样细胞,它们相互聚集形成细胞单位,在细胞培养瓶底部形成细胞克隆,这些克隆就是所谓的成纤维细胞样克隆。更换新的细胞培养液。从细胞培养的第7天开始,至第10天这段时间,细胞单位的数量在不断变多,面积在不断变大,形成直径为5至9mm的面积较大的克隆单位和<5mm的小克隆单位。免疫荧光染色结果:CD44阳性（+）、CD90阳性（+）,而CD34（）,细胞核周围呈黄褐色;流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面CD34（-）,而CD44与CD90阳性（+）,CCK-8检测细胞增殖,细胞稳定增殖。结论:骨髓间充质干细胞是成纤维样细胞,具有成克隆性、生长活力旺盛、自我更新能力强等主要特征;在体外利用全骨髓联合贴壁法可成功实现Beagle犬骨髓间充质干细胞的扩充、增殖;骨髓间充质干细胞可以作为组织工程技术的种子细胞,为组织工程学方法在修复股骨头软骨缺损的应用中提供了实验基础。研究二 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架-骨髓间充质干细胞复合体的体外实验研究目的:中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料对骨髓间充质干细胞的生物相容性,以及细胞在支架材料上的贴附、生长及增殖情况。方法:体外以中药牡蛎壳和褐藻作为原料,将其提取物壳聚糖及海藻酸钠通过组织工程的方法,合成具有生物降解功能的支架材料,并将体外分离、培养的Beagle犬骨髓间充质干细胞种植在支架材料上。采用扫描电镜观察中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架上骨髓间充质干细胞的附着、生长和增殖情况。其目的在于探讨中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架与Beagle犬骨髓间充质干细胞的生物相容性。结果:通过扫描电镜（SEM）检测,显示中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架为三维多孔材料,孔隙率大约为75%。中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料与骨髓间充质干细胞复合,细胞具有良好的粘附和增殖、分化能力。细胞接种后2小时,观察到骨髓间充质干细胞生长状态良好,附着在壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料上并延伸、生长。接种后1天,观察到细胞呈扁平状,部分细胞生长进入或穿过相连的孔隙。随着培养时间的延长,壳聚糖/海藻酸钠三维孑L隙膜支架材料上的骨髓间充质干细胞数量逐渐增多。结论:中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料具有适合骨髓间充质干细胞增殖分化的三维多孔空间构造。将体外分离、培养的Beagle犬骨髓间充质干细胞种植在中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料上,体现出二者具有良好的生物相容性,可作为一种良好的软骨组织工程支架材料。研究三中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架-骨髓间充质干细胞复合体修复Beagle犬股骨头软骨缺损的动物实验研究目的:探讨中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料与骨髓间充质干细胞复合体植入Beagle犬股骨头软骨缺损区域,观察其在体内修复Beagle犬股骨头软骨缺损的效果,评价中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料与骨髓间充质干细胞复合体在治疗Beagle犬股骨头软骨缺损中的作用及价值。方法:36只6个月龄Beagle犬均采用外科手术方式建立 Beagle犬股骨头软骨缺损模型。根据不同移植物自由组合为3组,实验中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架-骨髓间充质干细胞组（A组）:24只Beagle犬左侧股骨头非负重区软骨缺损区域填放中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料-骨髓间充质干细胞复合体。对照中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架组（B组）:24只Beagle犬右侧股骨头非负重区软骨缺损区域放置空白中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料。空白组（C组）:12只Beagle犬双侧股骨头非负重区软骨缺损处不做任何处理。分别于术后第8周和术后第12周对实验动物的生长状态行一般观察后处死实验动物,收集各组实验动物的股骨头标本,将标本作相应切片处理后行形态学观察、HE染色、甲苯胺蓝染色、免疫组化以及透射电镜检查。结果:术后8周,结果显示,中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架-骨髓间充质干细胞组关节面轻微不光滑,软骨缺损区域局部凹陷,软骨缺陷区域被大量类似于正常软骨组织的半透明组织填充,与周围正常软骨组织相延续;与中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架-骨髓间充质干细胞组相比较而言,中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架组关节面更加不光滑,软骨缺损区域明显凹陷,软骨缺陷区域被少量类似于正常软骨组织的半透明组织填充,与周围正常软骨组织不连续,软骨下骨明显暴露;空白组软骨缺损区域无明显关节软骨组织填充,软骨下骨组织被完全暴露。术后12周,中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架-骨髓间充质干细胞组关节面非常平滑,软骨缺陷区域被大量类似于正常软骨组织的半透明组织填充,与周围正常软骨组织相延续;与4周前相比较而言,中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架组关节面更加平滑,但是仍然存在明显的凹陷,软骨缺陷区域被更多量的类似于正常软骨组织的半透明组织填充,且与周围正常软骨组织相延续,软骨下骨组织被部分覆盖;空白组关节软骨缺损部位仍无关节软骨组织填充,软骨下骨组织仍明显暴露。结论:以中药提取物壳聚糖/海藻酸钠为膜支架,以骨髓间充质干细胞为种子细胞,在体外构建的复合体可有效促进Beagle犬股骨头软骨缺损的软骨组织修复。
卫旭东[7]（2019）在《滑膜间充质干细胞复合同种异体骨修复兔关节软骨的研究》文中认为目的旨在建立新西兰兔膝关节软骨缺损模型,利用深低温技术制备的同种异体骨支架材料复合BMP-4和SMSCs,实现关节软骨损伤的有效修复,从而揭示软骨修复规律,以期为软骨损伤修复提供新思路。方法1.兔SMSCs获得与制备:新西兰兔膝关节腔取材,用Ⅰ型胶原酶消化分离获取SMSCs,采用流式细胞技术检测标记物。设置梯度MOI的病毒（Ad-BMP-4）感染SMSCs,检测转染效率和细胞生长曲线,ELISA检测SMSCs相关蛋白表达。2.同种异体骨移植物的构建和处理:18只成年新西兰兔,使用横穿钉套筒钻取股骨关节面软骨柱36个,软骨柱逐级降温后放入液氮罐中冻存3w。3.软骨缺损动物模型的建立和干预:24只成年新西兰兔随机分成4组,使用横穿钉套筒在股骨髁关节面造成直径4 mm、深度大于4 mm的全厚关节软骨缺损模型。A组为单纯软骨缺损模型,B组使用单纯同种异体骨修复,C组使用SMSCs复合同种异体骨修复,D组使用BMP-4转染的SMSCs复合同种异体骨修复。4.修复效果的评估:术后4、8和16w时间点对4组动物关节取材,每组2只4膝,标本固定切片处理后进行病理学染色,参考Wakitani组织学评分系统从修复组织的细胞种类、基质染色、表面平整、软骨厚度及与周围正常软骨组织的整合情况综合评估缺损修复状况。结果1.经分离纯化获取的SMSCs形态学表现出间充质干细胞应有的结构,流式细胞术检测SMSCs表面标记CD44、CD90高度表达,CD34基本不表达,符合SMSCs的特征。感染效率依赖MOI高低,结合生长曲线选取300MOI为合适的感染滴度。经ELISA检测重组腺病毒感染兔SMSCs细胞,能维持细胞正常增殖水平,且能快速高效地表达BMP-4,并激活其他软骨相关基因Sox9、COLⅡ等表达,促使SMSCs向软骨细胞分化。2.BMP-4基因修饰的SMSCs复合同种异体骨用于兔关节软骨修复,实验组在各个时间点修复组织表面的平整度、与周围软骨整合度均优于其他对照组。病理切片染色,实验组HE和Safranin O染色可见增多的细胞外基质和软骨细胞凹陷,免疫组化染色可见明显的Ⅱ型胶原强阳性表达。结论携带BMP-4基因的腺病毒在成功感染SMSCs后对SMSCs向成软骨分化起重要作用,具有促进SMSCs向软骨分化的能力。经BMP-4基因转染的SMSCs复合同种异体骨可促进损伤的兔膝关节软骨修复,为今后SMSCs复合载体进行软骨组织工程修复的实验研究提供了新的思路。
高峰光,周百岁,牟海波[8]（2016）在《关节腔内骨髓间充质干细胞与同种异体骨的共培养》文中认为背景:构建组织工程软骨的时候,同种异体骨与骨髓间充质干细胞是常用的支架材料和种子细胞,以往大多采用体外培养的方式。膝关节内游离体可以长期存在于关节腔中,并维持一定的软骨组织学特性。因此,关节腔可能为软骨细胞的生长和发育提供良好的环境条件。目的:探讨在关节腔内骨髓间充质干细胞与同种异体骨复合培养的效果。方法:纳入5只新西兰新生白兔进行骨髓间充质干细胞分离与培养,利用1只成年新西兰白兔制备同种异体骨,进行骨髓间充质干细胞与同种异体骨复合。实验分组:腔内培养组将骨髓间充质干细胞与同种异体骨复合物培养于动物关节腔内,正常对照组设为同腔内正常软骨,体外培养组实施常规体外培养。培养4,8,12周进行组织学苏木精-伊红染色观察及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色观察。结果与结论:1培养12周进行苏木精-伊红染色和观察,正常对照组细胞质和软骨基质出现红染,细胞核出现蓝染,软骨细胞按照一定的方向呈紧密状有序排列。腔内培养组细胞质和软骨基质出现红染,细胞核出现蓝染,支架材料基本吸收。软骨细胞长入支架之中,细胞按照一定应力方向排列,且形态变小。体外培养组软骨细胞出现大量增殖,但呈无序状排列;2经免疫组织化学染色和观察,计数可得,随着培养时间的推移,腔内培养组的A值呈现出不断上升的情况,体外培养组和正常对照组均未出现明显的改变。且培养4,8,12周,正常对照组和腔内培养组的A值均显着高于体外培养组（P<0.05）。培养4,8周,腔内培养组的A值均显着低于正常对照组（P<0.05）。但培养12周,腔内培养组与正常对照组A值差异无显着性意义（P>0.05）;3实验结果表明,在体外和关节腔内环境下,均可以利用同种异体骨与骨髓间充质干细胞复合培养获得组织工程软骨,且关节腔内培养可以获得更好的培养效果。
王艳[9]（2013）在《干细胞在软骨组织工程中的应用及其影响因素》文中认为背景:至今各种干细胞作为软骨组织工程种子细胞已被广泛研究。目的:分析不同干细胞的生物学特性及其在软骨组织工程中的研究与应用。方法:通过检索近年来关于软骨组织工程研究中的干细胞来源及其影响因素的相关文献,针对软骨组织工程不同来源干细胞的优化获取、存在的问题、影响细胞分化生长、繁殖及代谢的因素进行了着重论述,为组织工程化软骨修复软骨缺损提供理论基础。结果与结论:通过大量的实验研究证实外源性的干细胞可用于软骨组织工程构建的种子细胞。软骨组织工程种子细胞构建的影响因素包括生长因子、细胞支架、细胞接种密度、氧浓度、应力和微重力等。然而组织工程化软骨仍处于实验室研究阶段,软骨组织工程涉及干细胞的许多问题,如干细胞的改造、干细胞体外培养、如何延长细胞寿命、降低细胞抗原性及增强宿主免疫耐受等尚待解决。
郭振业,卫小春,段王平[10]（2013）在《关节软骨细胞在软骨修复中应用新进展》文中指出关节软骨损伤是人类面临的主要运动性疾病之一,常由创伤、软骨骨炎、骨性关节炎等引起。一直以来,关节软骨缺损的修复是骨科基础研究中的难点。随着中国社会人口老龄化和运动创伤的增加,关节软骨缺损发病率呈日益增加的趋势。关节软骨一旦损伤,则遗留永久性病变,且软骨组织自愈能力非常有限,治疗比较困难,常常影响人们的正常生
二、不同生长阶段软骨细胞构建同种异体软骨的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、不同生长阶段软骨细胞构建同种异体软骨的研究（论文提纲范文）
（1）软骨脱细胞细胞外基质3D生物打印支架负载髌下脂肪垫间充质干细胞修复兔软骨病损的相关研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 一、 骨性关节炎及软骨损伤的治疗现状 |
| 二、 组织工程学在软骨损伤修复领域的应用 |
| 三、 论文工作的提出 |
| 第一部分 髌下脂肪垫间充质干细胞及软骨脱细胞细胞外基质生物学特性的研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二部分 负载IPFP-ADSC的dCECM水凝胶支架的3D构建及其生物学特性的研究 |
| 第一节 dCECM复合水凝胶生物墨水制备及3D打印水凝胶支架的理化特性研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第二节 3D生物打印负载IPFP-ADSC组织工程支架体外成软骨分化生物学特性研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第三部分 3D生物打印负载IPFP-ADSC组织工程支架修复兔软骨缺损的实验研究 |
| 一、材料与方法 |
| 二、结果 |
| 三、讨论 |
| 四、小结 |
| 第四部分 总结与展望 |
| 一、本文工作总结 |
| 二、主要成果及创新点 |
| 三、不足之处及展望 |
| 参考文献 |
| 综述 脱细胞细胞外基质生物材料在组织工程中的应用 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文及科研工作情况 |
| 致谢 |
（2）人脐带间充质干细胞外泌体增效脱细胞软骨基质支架促进骨软骨再生（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:hWJMSC-Exos的提取和鉴定及ACECM支架的制备和表征 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 分离培养原代hWJMSCs |
| 2.2.2 hWJMSCs的冻存和复苏 |
| 2.2.3 三系诱导分化培养鉴定hWJMSCs的分化潜能 |
| 2.2.4 流式细胞术鉴定hWJMSCs的标志物 |
| 2.2.5 hWJMSC培养上清的收集 |
| 2.2.6 差速超速离心法提取hWJMSC-Exos |
| 2.2.7 TEM观察Exos形态 |
| 2.2.8 NTA检测Exos粒径 |
| 2.2.9 WB鉴定Exos的标志蛋白 |
| 2.2.10 ACECM支架的制备和表征 |
| 2.2.11 ACECM支架的细胞相容性检测 |
| 3 结果 |
| 3.1 hWJMSC具有向骨、软骨和脂肪分化的能力 |
| 3.2 hWJMSC阳性表达MSC的标志物且不表达造血干细胞标志物 |
| 3.3 hWJMSC-Exo的形态、粒径和标志物表达情况均符合Exo的标准 |
| 3.4 ACECM支架疏松多孔且具有垂直取向结构 |
| 3.5 ACECM支架具有良好的细胞相容性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:hWJMSC-Exos生物学功能的验证 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞来源与培养方法 |
| 2.2.2 hWJMSC-Exos体外对BMSCs迁移的影响 |
| 2.2.3 hWJMSC-Exos体外对BMSCs和软骨细胞增殖的影响 |
| 2.2.4 hWJMSC-Exos体外对巨噬细胞极化的影响 |
| 2.2.5 大鼠骨软骨缺损模型的建立及干预 |
| 2.2.6 hWJMSC-Exos对关节腔微环境炎症反应的影响 |
| 2.2.7 hWJMSC-Exos对关节腔微环境巨噬细胞极化的影响 |
| 2.2.8 hWJMSC-Exos对内源性干细胞迁移的影响 |
| 2.2.9 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 hWJMSC-Exos在体外促进BMSCs迁移 |
| 3.2 hWJMSC-Exos在体外促进BMSCs和软骨细胞增殖 |
| 3.3 hWJMSC-Exos在体外促进巨噬细胞向M2型极化 |
| 3.4 hWJMSC-Exos在体内促进IL-10 的表达 |
| 3.5 hWJMSC-Exos在体内促进巨噬细胞向M2型极化 |
| 3.6 hWJMSC-Exos诱导内源性干细胞迁移的作用不显着 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分:hWJMSC-Exos增效ACECM支架促进骨软骨再生 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 材料与试剂 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 骨软骨缺损模型的建立 |
| 2.3.2 实验动物分组及取材 |
| 2.3.3 宏观表现评价(ICRS评分) |
| 2.3.4 影像学评价(micro-CT检测) |
| 2.3.5 组织形态学评价 |
| 2.3.5.1 苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin, HE)染色 |
| 2.3.5.2 番红O固绿染色 |
| 2.3.5.3 Ⅱ型胶原蛋白免疫组化染色 |
| 2.3.6 生物化学评价(胶原含量检测) |
| 2.3.7 生物力学评价(杨氏模量检测) |
| 2.3.8 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 Exo+S组新生软骨宏观表现显着优于对照组 |
| 3.2 Exo+S组软骨下骨修复良好 |
| 3.3 Exo+S组组织形态学表现显着优于对照组 |
| 3.4 Exo+S组新生软骨杨氏模量显着高于对照组 |
| 3.5 Exo+S组新生软骨胶原含量显着高于对照组 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四部分:hWJMSC-Exo-miRNA测序及通路富集分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料与试剂 |
| 2.1.1 主要试剂 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 hWJMSC-Exo-RNA的提取和RNA分析 |
| 2.2.2 文库构建和测序 |
| 2.2.3 miRNA分析 |
| 2.2.3.1 miRNA分析和靶基因预测 |
| 2.2.3.2 GO和KEGG通路富集分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 hWJMSC-Exos中总读取计数前50位的高丰度miRNAs |
| 3.2 hWJMSC-Exos中与骨软骨再生和OA相关的miRNAs |
| 3.3 靶向巨噬细胞极化、炎症反应及MSCs迁移相关基因的miRNAs |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 综述 关节软骨再生技术的临床应用现状——组织工程软骨带来新希望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）bFGF联合琼脂糖凝胶预植入促进异体移植后全层软骨缺损修复的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 研究背景与意义 |
| 1.1.1 骨髓刺激技术 |
| 1.1.2 自体全层软骨移植 |
| 1.1.3 同种异体全层软骨移植 |
| 1.1.4 组织工程学修复 |
| 1.2 国内外相关工作研究进展 |
| 1.2.1 炎性因子对骨与软骨修复影响的研究 |
| 1.2.2 生长因子对骨与软骨修复影响的研究 |
| 1.2.3 琼脂糖对骨与软骨修复影响的研究 |
| 1.3 本文研究思路、内容及技术路线 |
| 2 骨髓间充质干细胞联合多孔钽/Bio-Gide胶原膜修复全层软骨缺损的研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与设备 |
| 2.2.1 实验主要设备 |
| 2.2.2 实验主要试剂 |
| 2.2.3 实验对象与分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 兔BMSCs的提取培养 |
| 2.3.2 兔BMSCs免疫荧光染色 |
| 2.3.3 兔BMSCs流式细胞学检测 |
| 2.3.4 BMSCs与Bio-Gide胶原膜、多孔钽共培养 |
| 2.3.5 体内实验手术操作 |
| 2.3.6 兔股骨头组织学染色 |
| 2.3.7 统计学分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 BMSCs细胞生长曲线 |
| 2.4.2 BMSCs细胞免疫荧光染色检测 |
| 2.4.3 BMSCs细胞流式细胞学检测 |
| 2.4.4 BMSC与Bio-Gide胶原膜、多孔钽共培养后形态学检测 |
| 2.4.5 兔股骨头组织学染色及评分 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 3 大鼠软骨细胞体外培养鉴定及不同浓度bFGF对大鼠软骨细胞的促增殖作用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与设备 |
| 3.2.1 实验主要设备 |
| 3.2.2 实验主要试剂 |
| 3.2.3 实验对象与分组 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 鼠膝关节软骨组织提取 |
| 3.3.2 软骨细胞的分离、培养与传代 |
| 3.3.3 软骨细胞增殖检测 |
| 3.3.4 软骨细胞组织学检测 |
| 3.3.5 bFGF对软骨细胞增殖的影响 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 软骨细胞形态观察 |
| 3.4.2 软骨细胞生长曲线 |
| 3.4.3 组织学检测结果 |
| 3.4.4 bFGF对软骨细胞增殖的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 4 鼠全层软骨同种同体/异体移植术后急性免疫反应强度变化的研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与设备 |
| 4.2.1 实验主要设备 |
| 4.2.2 实验主要试剂 |
| 4.2.3 实验对象与分组 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 流式细胞学检测 |
| 4.3.2 组织学检测 |
| 4.3.3 大鼠外周血炎性因子ELISA检测 |
| 4.3.4 统计学分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 炎性细胞变化流式细胞学结果 |
| 4.4.2 免疫反应强度的组织学结果 |
| 4.4.3 外周血炎性因子ELISA检测结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 5 bFGF和琼脂糖凝胶预植入逃避大鼠免疫杀伤促进全层软骨异体移植修复的研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与设备 |
| 5.2.1 实验主要设备 |
| 5.2.2 实验主要试剂 |
| 5.2.3 实验对象与分组 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 琼脂糖支架复合体的制备 |
| 5.3.2 手术与分组操作 |
| 5.3.3 流式细胞术分析 |
| 5.3.4 组织学检测 |
| 5.3.5 统计学分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 移植部位的宏观检查 |
| 5.4.2 炎性细胞的变化 |
| 5.4.3 软骨修复的组织学分析 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 本章小结 |
| 6 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间科研项目及科研成果 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（4）同种异体软骨细胞/成骨细胞载β-磷酸三钙生物陶瓷支架修复软骨缺损的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 主要试剂及仪器 |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导分化来的同种异体软骨细胞和成骨细胞载β-磷酸三钙生物陶瓷支架与软骨的组织相容性研究 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 材料和方法 |
| 1.3 统计学处理 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 应用生物反应器构建BMSCs来源的同种异体软骨细胞/成骨细胞负载β-磷酸三钙生物陶瓷支架修复关节软骨缺损 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.3 统计学处理 |
| 2.4 结果和讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 同种异体软骨细胞/成骨细胞载β-磷酸三钙生物陶瓷支架对软骨细胞能量代谢和增殖的影响 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 外文论文 |
（5）仿生型组织工程气管支架重建气管缺损的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一部分 仿生型组织工程用气管支架的设计与编织 |
| 第一章 仿生型组织工程用气管支架的设计 |
| 第二章 PDO单丝和PHBV/PLA共混丝的热测试和力学测试 |
| 第三章 仿生型组织工程气管支架的编织 |
| 第二部分 组织工程气管再生物支架的生物学及力学性能评价 |
| 第一章 细胞毒性实验 |
| 第二章 急性全身毒性试验 |
| 第三章 溶血试验 |
| 第四章 热源实验 |
| 第五章 迟发型超敏反应试验 |
| 第六章 仿生型组织工程气管支架的力学性能测试 |
| 第三部分 体外气管支架与种子细胞复合物构建的实验研究 |
| 第一章 骨髓间充质干细胞向软骨细胞诱导分化的实验研究 |
| 第三章 诱导分化的软骨细胞与气管支架体外共同培养的实验研究 |
| 第四部分 仿生型结构气管支架修补气管缺损的动物模型的建立 |
| 第一章 仿生型结构气管移植物的体内预置 |
| 第二章 仿生型气管支架重建气管缺损修补的动物模型的建立 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间的学术论文目录 |
（6）壳聚糖/海藻酸钠膜支架—骨髓间充质干细胞修复软骨缺损的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一章 文献研究 |
| 1.1 目前软骨缺损的修复技术 |
| 1.1.1 微骨折技术 |
| 1.1.2 自体软骨细胞移植技术 |
| 1.1.3 膜支架技术 |
| 1.2 未来软骨再生方法的研究 |
| 1.2.1 体外软骨细胞-支架材料复合体 |
| 1.2.2 细胞及组织的替代物 |
| 1.2.2.1 骨髓间充质干细胞 |
| 1.2.2.2 其他来源的干细胞 |
| 1.2.2.3 自体外周血干细胞 |
| 1.2.2.4 诱导多能干细胞 |
| 1.2.2.5 同种异体移植物 |
| 1.2.2.6 创新型无细胞的生物材料 |
| 1.2.2.7 自体诱导软骨形成术 |
| 1.2.3 无支架方式的研究 |
| 1.3 结论 |
| 第二章 种子细胞的研究 Beagle犬骨髓间充质干细胞的体外分离、培养及鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 本部分实验所需培养液、缓冲液及工作液的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Beagle犬骨髓间充质干细胞的体外分离及原代培养 |
| 2.3.2 Beagle犬骨髓间充质干细胞的传代培养 |
| 2.3.3 Beagle犬骨髓间充质干细胞的形态学观察及鉴定 |
| 2.3.3.1 倒置显微镜观察 |
| 2.3.3.2 免疫荧光化学染色 |
| 2.3.3.3 骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶染色 |
| 2.3.3.4 骨髓间充质干细胞钙结节染色 |
| 2.3.3.5 流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标记物的表达 |
| 2.3.4 CCK-8检测细胞增殖 |
| 2.4 实验数据的整理与统计分析 |
| 2.5 结果 |
| 2.5.1 倒置显微镜下骨髓间充质干细胞形态学观察结果 |
| 2.5.2 骨髓间充质干细胞透射电镜观察结果 |
| 2.5.3 骨髓间充质干细胞苏木精-伊红染色鉴定结果 |
| 2.5.4 骨髓间充质干细胞免疫荧光鉴定结果 |
| 2.5.5 骨髓间充质干细胞的碱性磷酸酶染色结果 |
| 2.5.6 骨髓间充质干细胞的钙结节染色结果 |
| 2.5.7 骨髓间充质干细胞表面标记物流式细胞仪检测的结果 |
| 2.5.8 CCK-8检测细胞增殖结果 |
| 2.6 讨论 |
| 第三章 中药支架材料的研究 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架-骨髄间充质干细胞复合体的体外实验研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验器材 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 壳聚糖的制备 |
| 3.3.2 海藻酸钠的制备 |
| 3.3.3 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料的制备 |
| 3.3.4 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架形态观察 |
| 3.3.5 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料与骨髓间充质干细胞共培养 |
| 3.3.6 扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)观察中药提取物支架材料上细胞生长情况 |
| 3.3.6.1 扫描电镜观察实验 |
| 3.3.6.2 透射电镜观察实验 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 壳聚糖、海藻酸钠制备以及制备完成的中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架大体形态观察结果 |
| 3.4.2 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料形貌观察结果 |
| 3.4.3 倒置显微镜、扫描电镜(SEM)观察支架材料上细胞生长情况结果 |
| 3.4.3.1 倒置显微镜观察支架材料上细胞生长情况结果 |
| 3.4.3.2 扫描电镜(SEM)观察中药提取物支架材料上细胞生长情况结果 |
| 3.5 讨论 |
| 第四章 动物实验研究 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架-骨髓间充质干细胞复合体修复Beagle犬股骨头软骨缺损的动物实验研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验器材 |
| 4.2.2 主要试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料的准备及预处理 |
| 4.3.2 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架材料与骨髓间充质干细胞有机复合体的构建 |
| 4.3.3 Beagle犬股骨头软骨缺损模型的建立 |
| 4.3.4 观察指标的选择 |
| 4.3.4.1 实验动物的一般情况 |
| 4.3.4.2 修复软骨缺损的股骨头大体形态检测 |
| 4.3.4.3 标本组织学检查 |
| 4.3.4.3.1 苏木精-伊红染色(HE染色)方法 |
| 4.3.4.3.2 软骨染色液(甲苯胺蓝法)染色方法 |
| 4.3.4.3.3 Ⅱ型胶原免疫组织化学染色(SABC法)方法 |
| 4.3.4.3.4 透射电镜观察实验方法 |
| 4.4 实验数据的整理与统计分析 |
| 4.5 结果 |
| 4.5.1 一般观察结果 |
| 4.5.2 Beagle犬股骨头标本大体形态学观察结果 |
| 4.5.3 Beagle犬股骨头软骨缺损修复标本的组织学、Ⅱ型胶原免疫组化观察结果 |
| 4.5.4 Beagle犬股骨头修复软骨缺损区域标本透射电镜观察结果 |
| 4.6 讨论 |
| 4.6.1 种子细胞 |
| 4.6.2 中药提取物壳聚糖/海藻酸钠膜支架作为细胞支架的优势及其作用. |
| 4.6.3 中药提取物膜支架材料与骨髓间充质干细胞有机复合体修复软骨缺损疗效的分析 |
| 4.6.4 动物模型的建立 |
| 4.6.5 实验的局限性 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
| 统计学审核证明 |
（7）滑膜间充质干细胞复合同种异体骨修复兔关节软骨的研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 1.实验材料 |
| 2.实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录A 攻读硕士期间的成果与奖励 |
| 附录B 综述 |
| 参考文献 |
（8）关节腔内骨髓间充质干细胞与同种异体骨的共培养（论文提纲范文）
| 文章快速阅读: |
| 文题释义: |
| 局部微环境 |
| 同种异体骨 |
| 0引言Introduction |
| 1 材料和方法Materials and methods |
| 1.1 设计 |
| 1.2 材料 |
| 实验动物 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.3.1 种子细胞制备 |
| 1.3.2 支架材料制备 |
| 1.3.3 细胞-载体复合物的构建[9] |
| 1.3.4 细胞-载体复合物体外培养 |
| 1.3.5 细胞-载体复合物关节腔内培养 |
| 1.4 主要观察指标 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果Results |
| 2.1 实验动物数量分析 |
| 2.2 兔骨髓间充质干细胞培养结果 |
| 2.3 兔骨髓间充质干细胞成骨诱导结果 |
| 2.4 同种异体骨形态观察 |
| 2.5 术后动物情况观察 |
| 2.6 苏木精-伊红染色结果 |
| 2.7 免疫组织化学染色结果 |
| 3讨论Discussion |
| 作者贡献 |
| 利益冲突 |
| 伦理问题 |
| 文章查重 |
| 文章外审 |
| 作者声明 |
| 文章版权 |
（9）干细胞在软骨组织工程中的应用及其影响因素（论文提纲范文）
| 文章亮点: |
| 主题词: |
| 0引言Introduction |
| 1资料和方法Data and methods |
| 1.1资料来源 |
| 1.2入选标准 |
| 1.3质量评估 |
| 2干细胞在软骨组织工程中的应用及其影响因素Stem cells in cartilage tissue engineering andinfluential factors |
| 2.1应用间充质干细胞构建组织工程化软骨 |
| 2.2应用脂肪干细胞构建组织工程化软骨 |
| 2.3应用胚胎干细胞构建组织工程化软骨 |
| 2.4软骨组织工程种子细胞的影响因素 |
| 3结论Conclusion |
（10）关节软骨细胞在软骨修复中应用新进展（论文提纲范文）
| 一、关节软骨的结构及功能 |
| 二、关节软骨的损伤与修复 |
| 1. 关节过度活动引起劳损: |
| 2. 关节软骨损伤的自发修复: |
| 3. 关节软骨损伤组织工程修复: |
| 三、关节软骨种子细胞 |
| 1. 软骨细胞: |
| 2. 胚胎干细胞: |
| 3. MSC: |
| 四、软骨细胞体外培养的影响因素 |
| 1. 生长因子对组织工程关节软骨生长的影响: |
| 2. 机械生物力学对组织工程关节软骨生长的影响: |
| 3. 其他影响因素: |
| 五、关节软骨细胞临床应用 |
| 六、总结 |
四、不同生长阶段软骨细胞构建同种异体软骨的研究（论文参考文献）
- [1]软骨脱细胞细胞外基质3D生物打印支架负载髌下脂肪垫间充质干细胞修复兔软骨病损的相关研究[D]. 吴俊. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [2]人脐带间充质干细胞外泌体增效脱细胞软骨基质支架促进骨软骨再生[D]. 姜双鹏. 中国医科大学, 2021(02)
- [3]bFGF联合琼脂糖凝胶预植入促进异体移植后全层软骨缺损修复的研究[D]. 杨帆. 大连理工大学, 2021
- [4]同种异体软骨细胞/成骨细胞载β-磷酸三钙生物陶瓷支架修复软骨缺损的实验研究[D]. 吴帅. 山东大学, 2020(08)
- [5]仿生型组织工程气管支架重建气管缺损的实验研究[D]. 陈昱. 中国人民解放军海军军医大学, 2019(03)
- [6]壳聚糖/海藻酸钠膜支架—骨髓间充质干细胞修复软骨缺损的研究[D]. 姜良斌. 广州中医药大学, 2019(03)
- [7]滑膜间充质干细胞复合同种异体骨修复兔关节软骨的研究[D]. 卫旭东. 蚌埠医学院, 2019(01)
- [8]关节腔内骨髓间充质干细胞与同种异体骨的共培养[J]. 高峰光,周百岁,牟海波. 中国组织工程研究, 2016(19)
- [9]干细胞在软骨组织工程中的应用及其影响因素[J]. 王艳. 中国组织工程研究, 2013(46)
- [10]关节软骨细胞在软骨修复中应用新进展[J]. 郭振业,卫小春,段王平. 中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2013(01)