一、急性髓系白血病血管新生因子的表达及临床意义（论文文献综述）
苏龙[1]（2021）在《阻断CXCR4对移植物抗白血病效应与移植物抗宿主病影响的研究》文中研究指明研究背景与目的急性白血病是严重威胁人类健康的恶性血液系统疾病之一,化疗仍是其主要的治疗手段,部分复发难治患者需要接受更强烈的治疗方案,如异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HCT）。然而,复发仍旧是急性白血病治疗失败的主要原因。治疗后骨髓残留白血病细胞是复发的根源所在。与髓外复发相比,骨髓复发患者治疗困难,长期预后差。因此,如何清除骨髓中的残留白血病细胞,对于提高急性白血病患者的治疗效果、改善整体预后,甚至实现治愈白血病的最终目标具有十分重要的意义。趋化因子及其受体在造血与免疫细胞发育、迁移及功能维持中均发挥十分重要的作用。趋化因子CXCL12及其受体CXCR4参与了造血细胞发育、造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSC）向骨髓归巢及其在骨髓微环境中的定居。此外,CXCL12/CXCR4在急性白血病细胞向骨髓迁移及其在骨髓中的定居亦发挥关键性作用。骨髓微环境通过多种机制,如免疫细胞、细胞因子等,维持免疫抑制状态,保护HSC免受损伤从而维持正常造血及机体必要时的应急造血。骨髓微环境同样对白血病细胞具有保护作用,可使白血病细胞对化疗药物、分子靶向治疗药物耐药,同时可抵抗免疫治疗。阻断CXCR4可动员白血病细胞进入外周血,从而可增强化疗药物与分子靶向药物的杀伤效果。然而,阻断CXCR4联合化疗对临床患者治疗的效果改善有限,考虑与化疗不能有效杀伤耐药细胞或白血病干细胞有关。因此,寻找更有效的杀伤耐药细胞或白血病干细胞的联合治疗手段才有可能进一步提高疗效。我们的前期研究已发现,CXCR4拮抗剂可增强异基因淋巴细胞回输（allogeneic lymphocyte infusin,ALI）的移植物抗白血病（graftversus-leukemia,GVL）效应。然而,该研究采用的是人造白血病（人CD34+细胞转染MLL-AF9基因）,可能存在一定的细胞特异性。采用免疫缺陷小鼠构建疾病动物模型,小鼠无完整免疫系统,因此,无法评估在完整免疫系统存在情况下,阻断CXCR4是否能够增强GVL效应。此外,CXCR4阻断对allo-HCT后移植物抗宿主病（graft-versus-host disease,GVHD）与供体细胞植入是否有影响,仍有待研究以明确。本研究的目的旨在确定CXCR4阻断是否可增强ALI与allo-HCT后GVL效应、是否对GVHD及供体造血细胞植入有影响,从而为开展后续临床试验提供直接证据与参考依据。方法采用临床患者标本构建患者来源的异种移植（patient-derived xenotransplants,PDX）模型,待外周血可检测到白血病细胞后,给予ALI。免疫细胞活化后给予CXCR4拮抗剂AMD3100治疗,治疗后检测外周血和/或组织中的白血病细胞水平。采用多种小鼠allo-HCT模型,以小鼠原代T细胞急性淋巴细胞白血病（Tcell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL）与急性髓系白血病（acute myeloid leukemia,AML）细胞作为靶细胞,研究移植后给予AMD3100对GVL效应的影响。建立小鼠急性（BALB/c小鼠→C57BL/6小鼠）与慢性（BALB/c小鼠→CB6F1小鼠）GVHD模型,研究CXCR4阻断对GVHD病程的影响。采用小鼠allo-HCT模型研究CXCR4拮抗剂对供体造血细胞植入的影响。结果1.通过对临床患者B细胞ALL（B-cell ALL,B-ALL）骨髓标本进行检测发现,白血病细胞表面均高表达CXCR4。采用患者标本构建PDX模型发现,CXCR4拮抗剂AMD3100可动员骨髓中的白血病细胞进入外周血,峰值为给药后3小时。2.采用3例患者标本建立PDX模型,给予1次或2次ALI联合AMD3100治疗。结果发现,PDX小鼠骨髓中的B-ALL细胞对ALI抵抗,而AMD3100可明显促进ALI对患者B-ALL细胞的杀伤,且可有效清除骨髓中的残留白血病细胞。3.在PDX模型中,当外周血白血病负荷较高时,可先行化疗预处理,降低白血病负荷,然后再给予ALI联合CXCR4拮抗剂治疗,同样可有效清除白血病细胞,包括骨髓中的白血病细胞。4.小鼠T-ALL与AML细胞亦高表达CXCR4,AMD3100可明显动员上述白血病细胞进入外周血,动员的峰值时间为给药后3小时。采用小鼠allo-HCT模型证明,移植后给予AMD3100可明显增强GVL效应,尤其在低白血病细胞情况下,该治疗方案可取得非常高的无病缓解率,使约85%的受体小鼠长期存活。5.采用小鼠急性与慢性GVHD模型证明,移植后短时间给予AMD3100对小鼠体重变化、生存率、GVHD临床评分及靶器官病理表现均无明显影响。6.采用小鼠非清髓性allo-HCT模型证明,移植后给予AMD3100可促进供体造血干祖细胞在受体小鼠骨髓中的植入。结论临床患者与小鼠白血病细胞均高表达CXCR4,阻断CXCR4可显着动员白血病细胞进入外周血。CXCR4阻断可明显增强ALI与allo-HCT后GVL效应,并可有效清除骨髓中的残留白血病细胞,使受体小鼠获得高的无病缓解率。移植后短时间给予CXCR4拮抗剂对急性与慢性GVHD均无明显影响,且可促进供体来源造血干祖细胞的植入。
辉红蕾[2]（2021）在《急性髓系白血病外泌体蛋白的组学分析和功能研究》文中研究表明[目 的]急性髓系白血病（AML）是一类常见的髓系造血细胞克隆性增殖的恶性血液病。AML复发率和死亡率居高不下的主要原因是化疗过程中耐药和治疗后易复发。目前AML的诊断和病情评估手段单一,不利于早期诊断及精确病情评估,而且AML的发病机制复杂,尚未阐明。有研究表明AML细胞衍生释放外泌体,这些外泌体可以介导细胞之间的通讯,导致靶细胞环境之间相互串扰并影响肿瘤相关过程。本课题从疾病样品出发,收集确诊的AML血清样本及健康对照组样本,提取外泌体,通过定量蛋白质质谱筛选在AML病人血清中特异性、高度富集的外泌体蛋白质,作为研究AML细胞来源的外泌体与疾病发生和转移的分子机制的切入点,验证所筛选获得的蛋白质在临床样本中表达情况,并针对鉴定出的差异蛋白进行功能研究。为AML的早期诊断和预后评估,以及临床耐药、治疗策略的研究提供理论基础。[方 法]1.收集昆明医科大学第二附属医院血液内科门诊或住院部确诊为AML的患者（发病期）血清80mL,同时期健康体检者血清100mL。超速离心法提取血清外泌体,通过透射电镜、western-blot进行鉴定。TMT标记定量质谱分析提取的外泌体的蛋白质组成,对差异表达的蛋白质进行Gene Ontology（GO）分析、KEGG信号通路分析;2.ExoQuick试剂盒提取AML患者及健康体检者血清外泌体,通过扫描电镜、NTA、western-blot进行鉴定,采用western-blot方式检测筛选获取的差异表达蛋白质的表达量,并结合临床资料分析;采用western-blot检测筛选获取的差异表达蛋白质在样本中的定位;3.体外培养OCI-AML3、THP-1、HL60白血病细胞株及HUVEC细胞株,ExoQuick试剂盒提取AML血清外泌体与其共培养,采用CCK8、Annexin V/PI、细胞周期实验、成管实验研究血清外泌体对受体细胞生物学表型的影响;在OCI-AML3细胞株中慢病毒干扰FN,提取下调FN的细胞株衍生的外泌体,通过透射电镜、NAT、western-blot对细胞外泌体进行鉴定,将外泌体与AML细胞株共培养,CCK8、Annexin V/PI探究外泌体FN蛋白对肿瘤细胞的生物功能的影响。[结 果]1.外泌体鉴定:透射电镜下外泌体为类圆形囊泡,Western-blot结果显示外泌体呈现CD63阳性,与经典的外泌体鉴定结果一致。蛋白质定量质谱:共检测出146个差异表达的外泌体蛋白,AML患者血清中有89个蛋白表达上调,57个蛋白表达下调。生物信息学分析提示,差异表达的蛋白与机体的免疫反应密切相关,同时涉及到血细胞的生长、增殖、分化、脱颗粒及整个细胞周期,还涉及机体造血、止凝血等生物学过程。差异表达蛋白在25条生物通路中显着富集,与细胞的增殖、迁移、凋亡相关。2.外泌体鉴定:扫描电镜显示为类圆形囊泡,Western-blot结果显示外泌体呈现CD63、TSG101阳性,NTA显示血清外泌体浓度均值为1.2x107/ml,外泌体直径峰值为145.5nm,与经典的外泌体鉴定结果一致。临床样本验证结果显示:筛选获得的差异表达蛋白Clu、FN、ANG在AML患者血清中表达量高于健康对照组（p<0.001）,ACTN4在AML患者血清外泌体中表达量低于健康对照组（p<0.001）,与质谱结果一致。FN、ANG蛋白在AML不同型（M1-5、M7）患者血清外泌体中差异表达。Clu、FN、ANG在同一 AML患者血清、外泌体中显着表达,但在提取外泌体后的上清液中未检测到,说明Clu、FN、ANG几乎全部包装在外泌体中。3.利用AML患者血清外泌体刺激急性髓系白血病细胞系OCI-AML3、THP-1、HL60和脐静脉内皮细胞系HUVEC,CCK-8实验结果显示:AML血清外泌体可以促进AML细胞的增殖（p<0.05）,且外泌体浓度为200ug/ml时的增殖作用比100ug/ml强,对HUVEC细胞同样具有促进增殖作用（p<0.05）;流式结果显示:血清外泌体刺激的实验组与对照组相比细胞凋亡率明显减少（p<0.05）;周期结果显示:血清外泌体刺激的实验组与对照组相比G2期细胞明显减少,血清外泌体作用于AML细胞株后通过缩短G2期从而促进细胞增殖。4.利用慢病毒在OCI-AML3细胞株中干扰FN后,提取FN下调的细胞株的外泌体,提取的外泌体与OCI-AML3、THP-1、HL60细胞株共培养,CCK-8实验结果显示:干扰组相比对照组细胞增殖受到抑制（p<0.05）,流式结果显示:干扰组相比对照组细胞凋亡率明显增加（p<0.05）。[结 论]1.AML血清外泌体中富含大量蛋白质,且AML患者与健康对照组血清来源的外泌体的蛋白质谱存在显着差异,生物信息学分析提示差异表达蛋白质主要介导免疫反应,与细胞的增殖、迁移、凋亡相关。2.筛选的差异表达外泌体蛋白Clu、FN、ANG在AML患者血清来源外泌体中高表达,ACTN4低表达;差异表达蛋白质FN、ANG在AML不同分型中差异表达,其表达量与AML分型密切相关;提示AML血清外泌体有成为AML体外诊断及分型的生物标志物的潜能。3.Clu、FN、ANG在提取外泌体后的上清液中检测不到,其几乎全部包装在外泌体中;且FN、ANG的表达量与AML疾病进展、细胞遗传学密切相关,提示AML血清外泌体蛋白质是理想的体外活检生物标志物,且其表达量可与细胞遗传学分层一起运用于AML患者的预后评估。4.AML血清外泌体作用于受体细胞,通过促进AML细胞的增殖、抑制凋亡、干扰AML细胞周期参与AML的进展;通过促进内皮细胞增长、内皮细胞成管,参与AML血管的生成。5.外泌体蛋白FN通过促进AML细胞增殖、抑制AML细胞凋亡从而参与AML发生发展的调控。
李美蓉[3]（2020）在《减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究》文中研究指明急性白血病发病迅猛、耐药、易复发、复发后更难治、死亡率高,是白血病死亡最常见的疾病类型。随着近几十年药物研发和风险分类管理的不断改善,儿童急性白血病治疗得到了巨大进步,然而成年尤其是老年急性白血病患者的预后仍然较差,许多患者复发后治疗失败,最终死亡。目前,急性白血病的治疗仍以化疗为主。化疗失败或疾病复发时,才考虑进行骨髓移植或造血干细胞移植。然而,化疗副作用强,耐药易复发,经常导致治疗失败和死亡。骨髓或造血干细胞移植也存在供体难寻、手术费用高昂及手术过程痛苦难耐等问题,且仍存在一定复发风险。因此寻找副作用小、疗效可靠且经济的治疗新药具有重大意义。多例急性白血病患者发生严重细菌感染后获得自发缓解的临床报道,结合目前关注度非常高的肿瘤细菌疗法,提示细菌疗法可能是治疗急性白血病的一个新方向。在多种用于肿瘤治疗研究的细菌中,沙门氏菌因其具有良好的肿瘤靶向性和抗肿瘤效果,被广泛应用于各种实体肿瘤治疗。但是沙门氏菌对血液肿瘤的治疗未见报道。经基因工程改造的减毒沙门氏菌VNP20009产生的内毒素毒力减少了5万倍,且其耐受性和安全性已在一期临床试验中得到证实,是研究细菌治疗急性白血病的理想菌株。本课题首次分别以小鼠急性淋巴细胞白血病细胞（Acute lymphoblastic leukemia,ALL）L1210、人源急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）细胞HL-60皮下移植瘤模型,和人源AML融合蛋白MLL-AF9驱动的系统性AML小鼠模型,评估了VNP20009对急性白血病的治疗效果,并探究了其可能的作用机制,主要研究内容如下:1.体外细菌-细胞共培养实验结果表明,减毒沙门氏菌VNP20009呈剂量效应和时间效应抑制多种急性白血病细胞增殖,并诱导其凋亡。2.裸鼠皮下移植瘤模型治疗实验结果表明,VNP20009能抑制急性白血病皮下移植瘤的生长。肿瘤组织苏木素&伊红染色和脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（Terminal deoxynucleotidyl transferase（Td T）d UTP Nick-End Labeling,TUNEL）免疫荧光结果表明VNP20009能显着诱导肿瘤细胞凋亡,导致肿瘤中心区域细胞核破碎、DNA降解、胞膜解体,肿瘤组织大面积坏死。Western Blot检测肿瘤组织蛋白表明,VNP20009能显着上调促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3及Cleaved-PARP的表达,诱导急性白血病细胞凋亡。3.MLL-AF9驱动的AML模型小鼠治疗实验结果表明,VNP20009显着抑制小鼠体内AML细胞的增殖;降低AML小鼠外周血白细胞计数及其五分类数值,使其恢复至近正常生理水平;延长了AML小鼠的生存期。4.血清细胞因子与趋化因子检测及流式细胞术检测结果表明,VNP20009一方面能上调抗肿瘤因子γ-干扰素（Interferon-γ,IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）的产生,并降低粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF）水平来抑制、杀伤肿瘤细胞;另一方面,显着上调分泌趋化因子C-X-C基序配体-10（C-X-C motif ligand-10,CXCL-10）和CC趋化因子配体-2（C-C motif ligand-2,CCL-2）,招募并激活自然杀伤细胞和以CD4+为主的T淋巴细胞的增殖,杀伤、抑制白血病细胞增殖。VNP20009还能进一步刺激T淋巴细胞向CD4+IFN-γ+和CD8+IFN-γ+效应T淋巴细胞极化,释放IFN-γ,进一步维持、增强机体抗肿瘤免疫力抑制白血病细胞增殖。结论:减毒沙门氏菌VNP20009能显着抑制白血病细胞的增殖,并促进其凋亡,起到治疗和延缓白血病的作用。一方面VNP20009进入机体后,能够诱导多种细胞因子和趋化因子的分泌和多种免疫细胞的增殖,增强机体抗肿瘤免疫力,抑制和杀伤白血病细胞,延长AML小鼠生存期。另一方面移植瘤组织中线粒体促凋亡蛋白Bax、Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP的表达增加,提示VNP20009感染后可能通过线粒体凋亡途径诱导急性白血病细胞凋亡。该研究为急性白血病的治疗提供一种新的策略和理论基础。
杨雪敏[4]（2020）在《过表达CD40L基因对裸鼠白血病模型髓外心、肾浸润的影响》文中研究表明目的:本研究通过检测转染THP-1细胞构建的过表达CD40L基因急性髓系白血病NOD-SCID小鼠模型髓外器官心脏、肾脏中CD13、MMP-2、VEGF的表达情况,探索CD40L过表达对急性髓系白血病髓外心、肾浸润的影响。方法:1)NOD-SCID小鼠经尾静脉注射THP-1细胞、转染空载体的THP-1细胞株及转染CD40L基因的THP-1细胞株各1×107/只,构建急性髓系白血病NOD-SCID小鼠模型,本课题组已成功筛选过表达CD40L的THP-1稳定细胞株;将上述小鼠分为三组:THP-1组、空载体转染THP-1组、CD40L转染THP-1组,每组8只小鼠;2)检测各组小鼠的血常规、外周血涂片及骨髓形态学检查;3)选取各组成瘤小鼠,剥离小鼠心脏、肾脏,用4%甲醛固定后石蜡包埋、切片,行HE染色,显微镜下观察急性髓系白血病小鼠的髓外心、肾浸润情况;4)采用免疫组化检测小鼠心脏、肾脏中CD13、MMP-2、VEGF的表达情况。结果:（1）过表达CD40L的THP-1稳定细胞株:镜下见稳定GFP荧光表达,本课题组前期已用PCR法验证CD40L在THP-1细胞株中过表达;（2）THP-1组、空转组、CD40L组三组小鼠实验前与建模后第4周外周血中均呈现白细胞增多,血红蛋白及血小板减少;各组之间三种血细胞比较无明显趋势变化。（3）THP-1组小鼠在外周血涂片及骨髓涂片中均找见THP-1细胞的有7只,空转组和CD40L组分别有6只。（4）三组小鼠心脏、肾脏组织切片HE染色结果:THP-1组小鼠出现心脏浸润和肾脏浸润均有4只,空转组有2只出现心脏浸润、6只出现肾脏浸润,CD40L组各有3只出现心脏、肾脏浸润。（5）IHC法检测三种小鼠心脏、肾脏中CD13、MMP2、VEGF表达情况:CD13在所有小鼠的心脏、肾脏中均为阳性表达;CD40L组小鼠中心脏的MMP-2表达量低于空转组及THP-1组,差异有统计学意义（p<0.05）;CD40L组小鼠中肾脏的MMP-2表达量低于空转组及THP-1组,CD40L组与THP-1组比较,差异有统计学意义（p<0.05）,CD40L组与空转组比较,差异无统计学意义（p>0.05）;CD40L组小鼠心脏中VEGF的表达量低于空转组及THP-1组,其差异具有统计学意义（p<0.05）,而肾脏中的表达亦低于另两组,但其差异无统计学意义（p>0.05）。结论:（1）小鼠急性髓系白血病模型建模后外周血WBC升高、HB及PLT下降;（2）通过检测急性髓系白血病小鼠髓外心、肾组织的HE染色及CD13表达情况,发现急性髓系白血病易出现髓外心、肾浸润;（3）过表达CD40L基因的白血病小鼠髓外心、肾组织中MMP-2、VEGF的表达量较非过表达CD40L基因的白血病小鼠低,提示过表达CD40L基因可能影响白血病小鼠的髓外心、肾组织浸润程度,其具体机制有待进一步研究。
杨露露[5]（2020）在《初步探讨PDGF家族及其受体基因在急性白血病患者骨髓单个核细胞中的mRNA表达水平及其临床意义》文中研究表明第一部分 采用RT-qPCR方法检测六种PDGF家族及其受体基因在急性白血病中的mRNA表达及其临床意义[目的]通过RT-qPCR方法检测PDGF家族及受体基因PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D及其受体PDGFR-A、PDGFR-B在急性白血病患者骨髓单个核细胞（Bone Marrow mononuclear cells,BMMCs）中的mRNA水平表达及其临床意义。[方法]收集2018年03月至2019年03月就诊于苏州大学附属第一医院的91例初诊急性白血病患者及19例的正常供体的骨髓样本,采用Ficoll梯度离心方法提取骨髓单个核细胞中的总RNA,并行逆转录,实时荧光定量PCR方法检测急性白血病患者骨髓单个核细胞中PDGF家族及受体基因PDGF-A、PDGF-B、PDGF-C、PDGF-D及其受体PDGFR-A、PDGFR-B的mRNA表达水平的差异。结合患者性别、年龄,初诊时血常规、骨髓FAB分型、染色体核型、融合基因、基因突变结果,以及WT1、EVI1定量水平,分析6种PDGF相关基因的表达水平与上述临床特征的相关性。[结果]1、91例初治急性白血病包括急性髓系白血病（AML）63例,急性淋巴细胞白血病（ALL）24例,急性混合细胞白血病（HAL）4例。AML组中M0 1例、M1 6例、M2 34 例、M3 7 例、M4 14 例、M5 1 例;ALL 组中 B-ALL 20 例（Ph+B-ALL 8 例,Ph-B-ALL 10例,Ph-like B-ALL2例）,T淋系ALL4例。56例AML患者染色体核型检测结果示（不包括M3）:单体核型1例,11q23 1例,正常核型33例,del（9）2例,+83例,+21 3例,t（8;21）5例,inv16 1例,其他异常7例。基因突变检测结果示:CEBPα双突变22例,突变率 39.39%;FLT3-ITD+14例,突变率 25.00%;FLT3-TKD+5例,突变率 8.93%;NRAS+11 例,突变率 19.64%;NPM1+10 例,突变率 17.86%;WT1+10 例,突变率 17.86%;DNMT3A+9 例,突变率 16.07%;TET2+6 例,突变率10.71%;其中同时合并NPM1+FLT3-ITD+7例;多重PCR检测结果:AML1-ETO融合基因阳性6例,CBF β-MYH11融合基因阳性4例,MLL相关融合基因阳性5例,其他融合基因阳性2例,融合基因阴性39例,其中WT1融合基因大于150copies 50例,EVI1融合基因大于150copies 6例。按照2017年NCCN急性髓系白血病治疗指南将AML（未纳入M3）分为预后不良组20例,预后中等组19例,预后良好组17例。20例B-ALL患者染色体核型检测结果示:t（9;22）8例,正常核型7例,11q23 2例,del（9）1例,其他异常核型2例;基因突变结果:TP53+3例,ETV6+3例,FLT3-ITD+2 例,FLT3-TKD+1 例,PTPN+2 例,CSMD1+2 例;多重 PCR检测结果:BCR-ABL融合基因阳性8例,E2A-PBX融合基因阳性3例,MLL相关融合基因阳性2例,其中WT1融合基因大于150copies 13例,EVI1融合基因大于150copies 3例。根据2016版中国成人急性淋巴细胞白血病诊断与治疗指南将20例B-ALL患者均列为高危组。2、与健康对照组相比,PDGF-A基因mRNA的表达量在急性白血病组升高（P<0.05）,同时ALL组较AML组表达显着增高（P<0.05）;PDGF-B基因的表达水平在患病组与健康组之间无明显差异（P>0.05）;PDGF-C基因mRNA在ALL组表达明显降低（P<0.001）;PDGF-D基因在AML组表达明显增高（P<0.05）;受体PDGFR-A基因mRNA的表达量在急性白血病组升高（P<0.05）,ALL组与AML组之间表达无差异（P>0.05）;PDGFR-B基因mRNA在ALL组表达升高（P<0.05）。在AML组中,PDGF-A、PDGF-D 和 PDGFR-A 高表达于非 M3 的 AML（P<0.05）。在 ALL 组中,PDGF-A、PDGF-C、受体 PDGFR-A、PDGFR-B等4种基因 mRNA 在 B-ALL 组和 T-ALL组表达无明显差异（P>0.05）。非M3的AML患者中,PDGF-A基因表达水平与PDGFR-A表达水平呈正相关（r=0.707,P<0.0001）;在B-ALL中PDGF-A和PDGF-C基因的表达与受体PDGFR-A和PDGFR-B基因表达没有明显相关性（P>0.05）。3、分析了 56例非M3型AML患者PDGF-A、PDGF-D和PDGFR-A基因表达水平与临床特征的相关性,我们发现PDGF-D基因mRNA高表达于染色体核型正常的AML患者中;而33例染色体核型正常的AML患者中,PDGF-D基因mRNA高表达于NPM1+组（P=0.008）,低表达于 CEBPα+组（P=0.003）。PDGF-A、PDGF-D 和 PDGFR-A 基因的mRNA表达水平与患者不同性别、年龄、FAB分型、低中高危险分层、初诊时血细胞计数水平、骨髓原始细胞计数水平、融合基因类型、WT1定量、EVI1定量水平及其他基因突变类型等临床因素无明显相关（P>0.05）。分析免疫分型表达与PDGFA、PDGF-D和PDGFR-A基因mRNA表达的相关性,在14例M4患者中,CD34阳性组的PDGFR-A基因mRNA表达水平较阴性组明显升高（P=0.009）,PDGF-A、PDGF-D基因mRNA表达情况与免疫表型无明显相关（P>0.05）。4、我们分析了 20 例 B-ALL 患者的 PDGF-A、PDGF-C、PDGFR-A 和 PDGFR-B基因mRNA水平表达与临床特征的相关性,发现PDGFR-B基因mRNA表达量与初诊时外周血白细胞计数呈正相关（r=0.668,P=0.001）;Ph染色体阳性B-ALL患者的PDGF-A和PDGFR-A基因的mRNA表达水平明显高于Ph染色体阴性的B-ALL患者。PDGF-A、PDGF-C、PDGFR-A和PDGFR-B基因的mRNA表达水平与性别、年龄、初诊时外周血红蛋白计数水平,血小板计数水平、骨髓原始细胞计数水平,融合基因类型、WT1定量和EVI1定量水平及基因突变类型等临床因素无明显相关（P>0.05）。在12例Ph染色体阴性B-ALL患者中,PDGF-C低表达于CD7阳性组（P=0.0201）。[结论]:1.急性白血病 BMMCs 中 PDGF-A,PDGF-D 和 PDGFR-A 基因 mRNA 在 AML患者中高表达,而PDGF-A,PDGFR-A和PDGFR-B基因mRNA在B-ALL中高表达,PDGF-C在B-ALL呈现低水平表达。2.在AML中PDGF-D基因mRNA高表达于正常染色体患者,并与NPM1和CEBPα基因突变存在一定的相关性,而在B-ALL中,PDGF-A和PDGFR-A基因的mRNA表达可能与Ph染色体存在一定相关性。第二部分 PDGF家族及其受体基因表达对急性白血病患者预后的影响[目的]分析急性白血病患者BMMCs中PDGF家族及其受体基因mRNA表达对预后的影响。[方法]对76例急性白血病患者进行随访,所有患者均接受1-2疗程诱导化疗和2-4疗程的巩固化疗。结合患者临床基本特征及骨髓形态、免疫分型、染色体核型、融合基因结果、基因突变等临床资料,采用卡方检验（Chi-sqaure test）和曼-惠特尼U检验（Mann-Whitney U test）等统计方法分析相关基因的mRNA表达差异和临床因素对患者化疗敏感率的影响,并用Logistics多因素回归找出影响疗效的独立因素。采用Kaplan-Meier分析影响患者总体生存率（OS）,无病进展生存率（PFS）,累积复发率（CRR）的因素,采用对数秩检验（Log-rank test）比较差异的显着性。采用Cox回归多因素分析找出影响预后的独立危险因素。[结果]1、76例患者随访终点为2019年12月9日,中位随访时间14（1～17）月,持续缓解49例,复发22例,死亡18例（包括复发后死亡13例）,总体生存率（OS）为72.20%,无病进展生存率（PFS）为60.96%,累积复发率（CRR）为39.04%。56例AML患者均接受了 1-2疗程的诱导化疗方案,1疗程诱导化疗后达CR41例,PR10例,NR 5例,接受2疗程诱导化疗获得CR 13例;至随访终点,持续缓解30例,复发15例,死亡13例（包括复发后死亡10例）,中位生存时间14个月,1年OS率为80.34%,1年PFS率为63.46%,1年累积复发率为29.3%。B-ALL组1疗程诱导化疗达CR 15例,NR3例,PR2例,5例NR/PR患者经2疗程诱导化疗达CR4例,PR1例。至随访终点时,持续缓解13例,复发7例,死亡5例（均为复发后死亡）。中位生存时间12个月,1年OS率为75%,1年PFS率为65%,1年累积复发率为35%。2、在AML患者（不包括M3）中,我们分析了 PDGF-A、PDGF-D、PDGFR-A基因表达水平和患者临床特征对化疗敏感率的影响,发现PDGF-A、PDGF-D、PDGFR-A的基因表达量在完全缓解组（CR）与非完全缓解组（PR+NR）组之间无明显差异（P>0.05）,同时临床因素对患者疗效无明显影响（P>0.05）。采用Kaplan-Meier行单因素生存分析,PDGF-A、PDGF-D、PDGFR-A基因mRNA表达水平对患者OS、PFS、CRR无明显影响（P>0.05）,将单因素分析中可能影响患者OS、PFS和CRR的临床因素纳入Cox多因素回归发现免疫表型CD11b+、融合基因WT1阳性可能是影响AML患者OS的独立危险因素（P<0.05）;融合基因WT1阳性可能是影响AML患者PFS独立危险因素（P=0.029）。结合第一部分相关临床因素进行生存分析,PDGF-D基因表达水平对染色体核型正常患者的OS、PFS、CRR无影响（P>0.05）。33例染色体核型正常的患者中,NPM1+AML患者的OS在PDGF-D基因mRNA高表达组显着高于低表达组（P=0.0047）、而PFS和CRR无明显差异（P>0.05）,NPM1-AML患者中PDGF-D基因水平对其OS、PFS、CRR无明显影响（P>0.05）。在CEBPα-AML中,患者OS在PDGF-D基因高表达组显着高于低表达组（P=0.003）、而PFS、CRR无明显差异（P>0.05）,CEBPα+组PDGF-D基因高表达组与低表达组患者的OS、PFS、CRR无明显差异（P>0.05）。3、我们发现 B-ALL 患者的 PDGF-A、PDGF-C、PDGFR-A、PDGFR-B 等基因mRNA表达水平和各临床因素对其首次诱导化疗敏感率无明显影响（P>0.05）。Kaplan-Meier 进行生存分析发现 PDGF-A、PDGF-C、PDGFR-A、PDGFR-B 基因表达水平对患者的OS、PFS、CRR无明显影响（P>0.05）,同时Cox多因素分析发现临床因素对患者总生存、无病进展生存以及复发无明显影响（P>0.05）。结合第一部分的临床因素进行生存分析,PDGF-A、PDGFR-A基因表达水平对Ph+B-ALL患者的OS、PFS、CRR的影响无明显差异（P>0.05）。PDGFR-B基因表达对高白细胞患者的 OS、PFS、CRR 无明显影响（P>0.05）。[结论]染色体核型正常的AML患者的PDGF-D基因表达可能进一步影响NPM1+AML和CEBPα-AML患者的总生存。
聂鼎睿[6]（2020）在《miR-204靶向调控HGF/c-MET通路在急性髓系白血病中的作用和机制的研究》文中认为研究背景急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia）是一种以造血干细胞和髓系祖细胞异常增殖和分化为特点的恶性血液学疾病,可导致造血系统紊乱,抑制红、巨核系正常造血。该病主要表现为感染、出血、贫血并且可浸润皮肤、黏膜、淋巴结、脑脊液、脾脏等重要脏器或组织,起病急骤,病情恶化迅速,自然病程短。近年来,由于对该病的病理生理学过程有了更深刻的认识,使得新药大量涌现,造血干细胞移植技术不断进步及支持疗法的不断完善,显着提高了该病的缓解率及治愈率。但是,该病总生存率仍不足50%,这主要是由于患者原发耐药或者疾病复发最终演变为难治性白血病。MircroRNAs是在进化过程中高度保守的一类非编码RNA,多数起源于内含子,长度约为18-22nt。这些非编码RNA可以结合靶基因的mRNA引起后者降解或者翻译抑制,因此在基因转录后调控发挥着重要作用。在正常生理代谢过程中,这种调控是细胞增殖、分化、凋亡及维持细胞自稳态等细胞生命活动过程中的重要途径之一;与此同时,近几年的报道中发现microRNAs在恶性演变过程不但具有独特的表达模式,而且发挥着癌基因或抑癌基因的效应,因此也是影响肿瘤命运的关键要素之一。miR-204作为其中的一员,位于人类9号染色体q21瞬时受体电位离子通道蛋白 3（Transient receptor potential ion channel proteins-3）基因的第六内含子中。在多数肿瘤的发生中,该microRNA主要发挥抗肿瘤效应。已研究发现低表达miR-204在AML患者往往与较差的预后密切相关。由此,miR-204可作为AML独立的预后因素之一。另外,miR-204还可以靶向作用于BIRC6诱导AML细胞的凋亡且可以增强化疗敏感性。因此,提高miR-204的表达水平可能为AML患者带来新的福音。人类肝细胞因子（hepatocyte growth factor）是一种双链糖蛋白,可调控其靶细胞增殖、生存、移动及形态转变,主要行使细胞更新及组织修复等功能,编码该细胞因子的基因位于7号染色体的长臂（7q2111）,其在细胞恶性演变的过程中发挥重要作用。已有报道在胃癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、非小细胞肺癌等实体瘤发现过度表达的HGF/c-MET通路并且与肿瘤进展及预后密切相关;在AML中,HGF可作用于PI3/AKT、MAPK/ERK信号通路促进AML细胞增殖、侵袭及迁移。因此,miR-204和HGF均与AML存在密切联系。然而,二者在AML中的关系及潜在分子调控机制仍需进一步明确。目的探讨miR-204与HGF在AML中的作用、关系及潜在的分子生物学机制,为AML的靶向治疗提供新的实验室依据。方法应用RT-qPCR技术测定AML患者和正常人骨髓单个核细胞及AML细胞株中miR-204和HGF的表达水平并进行相关性分析。应用western blot技术测定AML细胞株中HGF、c-MET、p-MET、c-myc等与HCF/c-MET通路相关的蛋白水平;Over-expression 及 Knock-dowm 技术调节 miR-204 及 HGF 在 AML细胞株中的表达水平;应用在线生物信息学预测软件对二者关系进行初步预测,构建HGF3’UTR野生型及突变型荧光素酶报告质粒,通过双荧光素酶报告基因实验检测miR-204上调后荧光素酶活性的变化;MMT法测定细胞增殖能力、Annexin V/PI流式细胞技术测定细胞凋亡水平、Transwell法测定细胞的迁移及侵袭的能力。应用GraphPad8、SPSS 23.0、ImageJ将所得数据进行统计学分析。以Student’s t-test及单因素方差分析的方法分析两组与两组以上的差异,应用pearson法进行相关性分析,p值小于0.05认为差异具有统计学意义。结果1.miR-204与HGF在初治AML患者中的表达情况:1.1 miR-204在初治AML患者中的中位相对表达量（1.16643）显着低于正常对照组（2.231967）（p<0.05）。1.2 HGF在初治AML患者中的中位相对表达（1.712266）显着高于正常对照组（1.0285）（p<0.05）。1.3应用Pearson法将初治AML患者骨髓单个核细胞中miR-204与HGF的表达水平进行相关性分析,发现二者的相对表达量成负相关关系（r=-0.3666,p<0.05）。2.miR-204与HGF在AML细胞系中的表达水平2.1相比于人骨髓基质细胞HS-5,miR-204在Kasumi-1及HL-60细胞株中表达量均显着降低（p<0.05）。2.2相比于人骨髓基质细胞HS-5,HGF在Kasumi-1及HL-60细胞株中基因及蛋白水平的表达量均显着增高（p<0.05）。3.miR-204及HGF对AML细胞的生物学效应3.1实时荧光定量PCR结果证明miR-204 mimic可显着上调AML细胞miR-204的相对表达量;sh-HGF干扰载体可抑制HGF在AML细胞的基因及蛋白水平的表达。3.2 MMT法检测结果所示,miR-204上调后可抑制kasumi-1、HL-60的增殖活性,培养72h后抑制率分别为为44.7%和40.8%;下调HGF后可弱化AML细胞的增殖活性影响AML细胞生存,培养72h后生存率分别为53.5%和57.4%。3.3 Annexin V/PI双染法预染细胞并用流式细胞术测定AML细胞的凋亡水平,结果所示上调miR-204或下调HGF均可促进AML细胞的凋亡。3.4 Transwell法测定AML细胞迁移及侵袭能力的结果证实,上调miR-204或下调HGF可削弱Kasumi-1及HL-60细胞迁移和侵袭的能力。4.miR-204与HGF靶向关系的验证4.1 Western blot结果证明:在AML细胞中上调miR-204后,HGF蛋白表达水平显着降低,而应用miR-204 inhibitor下调miR-204可提高HGF蛋白的表达量。4.2应用在线生物信息学预测软件初步预测miR-204与HGF具有靶向关系,成功构建HGF 3’UTR端野生型及突变型荧光素酶报告基因质粒并于人胚肾293T细胞中进行双荧光素酶报告基因试验,结果证实HGF 3’UTR端存在与miR-204结合的预测靶点。5.miR-204靶向HGF对AML细胞生物行为的影响5.1 MMT法检测结果证实,miR-204可靶向作用于HGF抑制AML细胞的增殖活性。5.2 AnnexinV/PI双染法预染细胞并用流式细胞术测定结果说明,miR-204可靶向作用于HGF促进AML细胞凋亡。5.3 Transwell法结果证实,miR-204可靶向作用于HGF抑制AML细胞的迁移和侵袭的能力。6.在AML细胞中,miR-204靶向作用于HGF的分子生物学机制:Western blot结果说明miR-204靶向下调HGF的表达,但并不影响c-MET受体的表达水平,而是抑制c-MET受体的磷酸化水平及下游蛋白CyclinD1、c-myc、Bcl-2、Bax、MMP2和MMP9的表达,并且促进促凋亡蛋白BAX的表达;而在此基础上上调HGF后可恢复上述蛋白的表达水平。结论1.miR-204在AML患者骨髓中低表达,其可能的作用机制为通过抑制AML细胞增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡,发挥抗白血病效应。2.HGF在AML患者骨髓中呈高表达,可能与AML的发生相关。3.HGF为miR-204的靶基因,miR-204可靶向下调HGF影响HGF/c-MET通路及其下游蛋白的表达。4.miR-204靶向抑制HGF的表达,调节HGF/c-MET通路可能是其发挥抗白血病效应的关键要素之一。
周贵珍[7]（2020）在《缺氧对急性髓系白血病KG-1细胞生物学及基因甲基化的影响》文中研究指明目的:由于肿瘤细胞增殖过快普遍存在缺氧,而缺氧诱导的表观遗传改变可能是肿瘤细胞适应缺氧微环境的关键,是目前研究白血病重要发病机制之一。通过建立体外缺氧模型,研究缺氧对急性髓系白血病KG-1细胞增殖代谢影响、HIF-1α表达变化以及对基因组甲基化的影响,将肿瘤细胞缺氧代谢与表观遗传学联系起来,为急性白血病等血液系统恶性肿瘤的诊治研究提供了新的思路与实验依据。方法:1.以不同氧浓度（21%、3%、1%）处理急性髓系白血病细胞系KG-1细胞24、48、72小时,以常氧为对照组。用CCK-8法检测细胞活性,LDH试剂盒测定细胞培养基中LDH,以了解缺氧对KG-1细胞增殖代谢的影响。2.采用荧光实时定量PCR方法来检测HIF-1αmRNA表达,Western blot方法检测HIF-1α蛋白表达以了解缺氧对KG-1细胞中HIF-1α表达的影响。3.采用5-羟甲基化胞嘧啶（5-hmC）及5-甲基化胞嘧啶（5-mC）检测试剂盒检测5-hmC及5-mC含量,以了解缺氧及HIF-1α对KG-1细胞基因甲基化的影响。4.通过慢病毒感染HIF-1α真核表达质粒,使细胞过表达HIF-1α。实验分为慢病毒载体GV358+常氧对照组、过表达GV358-HIF-1α+常氧组、慢病毒载体GV358+缺氧组、过表达GV358-HIF-1α+缺氧组共四组。采用荧光实时定量PCR、Western-blot方法检测HIF-1αmRNA及蛋白的表达水平。采用抗原抗体免疫检测细胞基因组DNA的甲基化态势（5-hmC及5-mC含量）、甲基化特异性PCR（MSP）检测细胞中P15基因启动子区甲基化。以了解HIF-1α过表达对KG-1细胞基因组甲基化及P15基因甲基化的影响。5.采用YC-1抑制HIF-1α的表达。实验分为DMSO+常氧对照组、YC-1+常氧组、DMSO+缺氧组、YC-1+缺氧组共四组。采用荧光实时定量PCR、Western-blot方法检测HIF-1αmRNA及蛋白表达水平。采用抗原抗体免疫检测细胞基因组DNA的甲基化态势（5-hmC及5-mC含量）、MSP检测细胞中P15基因启动子区甲基化,以了解HIF-1α抑制对KG-1细胞基因组甲基化及P15基因甲基化的影响。结果:1.缺氧促进了KG-1细胞增殖及代谢,且随着缺氧程度增加及时间的延长,其增殖活性及代谢逐渐增强（P<0.05）。2.缺氧促进KG-1细胞中HIF-1αmRNA及蛋白的表达,其中1%O248h组表达最高（P<0.05）。3.缺氧组KG-1细胞5-hm C含量均高于常氧组,而5-mC含量均低于常氧组（P<0.05）。4.HIF-1α过表达后结果显示:与正常对照组相比,HIF-1α过表达组HIF-1αmRNA及蛋白表达水平增强、5-hmC含量增加,5-mC含量减少（P<0.05）;HIF-1α过表达+缺氧组细胞HIF-1α表达水平、5-hmC含量较正常对照组明显增强（P<0.05）;与正常细胞缺氧组相比,HIF-1α过表达+缺氧组KG-1细胞HIF-1αmRNA及蛋白表达、5-hmC含量亦增高,5-mC含量亦减少（P<0.05）。常氧情况下,KG-1细胞表现出P15基因启动子区部分甲基化,缺氧处理或/和HIF-1α过表达后P15基因启动子区呈现去甲基化。5.HIF-1α抑制后结果显示:与DMSO+常氧对照组相比,YC-1组KG-1细胞HIF-1αmRNA及蛋白表达水平减少,5-hmC含量减少,而5-mC含量增多（P<0.05）;与正常细胞缺氧组相比,YC-1+缺氧组KG-1细胞HIF-1αmRNA及蛋白表达减少,5-hmC含量减少,5-mC含量增多（P<0.05）;YC-1抑制HIF-1α表达后,P15基因启动子区甲基化增强。结论:1.缺氧可促进KG-1细胞的增殖、代谢,缺氧越严重及缺氧时间越长,KG-1细胞增殖活性及代谢越强。2.缺氧促进KG-1细胞中HIF-1αmRNA及蛋白的表达。3.缺氧或HIF-1α过表达可促进KG-1细胞基因组及P15基因去甲基化,HIF-1α表达抑制可使KG-1细胞基因组及P15基因甲基化增强。
赵衍东[8]（2020）在《升麻鳖甲汤加减方联合节拍式化疗维持治疗“正虚毒瘀型”老年AML的临床研究》文中研究表明目的:1.观察升麻鳖甲汤加减方联合节拍式化疗维持治疗“正虚毒瘀型”老年AML的临床疗效2.进行升麻鳖甲汤加减方联合节拍式化疗维持治疗“正虚毒瘀型”老年AML的安全性评价3.改善老年AML患者的生活质量及体力状况（ECOG）,改善患者的中医证候评分及老年综合评估（CGA）。方法:本研究选择符合纳入标准的老年AML患者,根据患者意愿分为治疗组和对照组,每组各15例患者。治疗组采用升麻鳖甲汤联合节拍式化疗。根据成人急性髓系白血病（非急性早幼粒细胞白血病）中国诊疗指南（2017年版）,对照组接受标准剂量阿糖胞苷（Ara-C）为基础的维持化疗方案,阿糖胞苷用量75-100mg/m2/d,可联合蒽环类药物（米托蒽醌、柔红霉素、去甲氧柔红霉素）,共4-6疗程。治疗前及4疗程后根据血常规、MRD、先令式分类、外周血流式细胞学及《Zubrod-ECOG-WHO评分》、《中医证候评分表》、老年综合评估量表（CGA）进行评分,通过对量表进行评分比较各组的临床疗效差异。结果:1.经过治疗后,两组患者均未出现复发,治疗组有1例患者经过治疗从CRi转变为CR,两组组间临床疗效对比未显示出统计学差异,两组治疗后MRD水平未见统计学差异。2.两组治疗后《Zubrod-ECOG-WHO评分》、《中医证候评分表》、老年综合评估量表（CGA）与治疗前比较均有改变,差异有统计学意义（P<0.05）,治疗组治疗后《中医证候评分表》、老年综合评估量表（CGA）等均优于对照组,具有统计学意义（P<0.05）。结论:升麻鳖甲汤联合节拍式化疗在老年AML患者的维持治疗中的疗效不劣于常规化疗,具有较好的安全性,与常规化疗相比能改善老年人的体能及生存状态,提高CGA评分,从而改善部分老年AML患者的预后。
王梦亚[9]（2020）在《升麻鳖甲汤加减方通过PI3K/AKT通路抑制急性髓系白血病血管新生的机制研究》文中研究说明研究背景及目的急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是起源于多能造血干细胞的恶性克隆性血液系统疾病,表现为白血病干细胞的恶性增殖而导致的造血细胞增殖分化能力受抑,从而引起一系列全身多脏器功能受累。具有较高的异质性,死亡率高,预后不良。目前的主要治疗多以标准化的化疗方案、造血干细胞为主,后者是潜在性治愈白血病的有效方案,近年来免疫疗法的研究也在进一步开展。研究表明,血管新生在白血病的发病机制中发挥着重要的作用。骨内膜存在的广泛血管网供给造血干细胞的增殖以及进一步分化,病理状态下,白血病细胞和血管内皮细胞相互作用,刺激生长因子的失衡进而导致病理性血管的形成,影响疾病的化疗敏感性及预后,增加耐药几率,同时会提高并发症的发病几率。升麻鳖甲汤原方来源于《金匮要略·狐惑阴阳毒病证治》,目前临床已用于皮肤病、免疫组织疾病等疾病治疗中,临床数据显示其具有调节免疫、抗炎等作用。根据中医辨证论治的理论基础,并结合临床实践经验,我们通过对升麻鳖甲汤原方进行加减后应用于血液系统疾病中,在一定程度上减少了化疗后不良事件（如造血受抑、免疫缺陷、胃肠道反应等）的发生率,提高化疗有效率,改善患者中医证候积分。本课题组在前期的实验研究中表明升麻鳖甲汤加减方（ShengMa BieJia Decoction,SMBJD）在荷瘤鼠体内具有抑制移植瘤生长的作用,体外研究显示其对急性髓系白血病细胞株具有细胞毒性作用,且通过MAPK通路诱导AML细胞的凋亡。鉴于白血病发病机制与血管新生之间的联系,本研究拟探讨SMBJD的抗白血病作用是否与其在AML中的抗血管新生作用有关,以及其中可能存在的分子作用机制。研究方法1.体内实验研究通过鸡胚尿囊膜实验观察不同浓度的SMBJD对体内微血管密度的影响;通过构建HL60荷瘤鼠模型研究不同浓度SMBJD对小鼠移植瘤瘤体组织的影响,采用免疫组织化学、蛋白免疫印迹技术（Western Blot,WB）和聚合酶链反应法（Polymerase Chain Reaction,PCR）检测SMBJD介导抗血管新生的相关因素表达。2.体外实验研究高压液相质谱（high performance liquid chromatography,HPLC）检测升麻鳖甲汤加减方中的主要有效成分。利用MTT实验分别检测SMBJD对HUVECs和AML细胞株的细胞活性影响,根据结果提取经SMBJD干预AML细胞后无细胞毒性的药物浓度培养AML细胞提取上清液即为条件培养基（conditional medium,CM）,MTT法检测CM对HUVECs的细胞活性影响;采用划痕实验、Transwell小室实验和体外管腔形成实验分别观察经SMBJD和条件培养基干预后的HUVECs的趋化、迁移及体外成管能力的变化;酶联免疫吸附实验检测AML细胞的VEGF分泌表达情况;利用WB和PCR技术检测相关蛋白和mRNA的变化。研究结果1.体内实验结果荷瘤鼠实验观察结果显示,不同浓度的SMBJD（20,40,80 g/kg）对荷瘤小鼠体重的影响组间无明显差异,瘤体体积随时间推移逐渐增大,给药组与对照组（生理盐水组）之间无明显差异;免疫组化标记结果中CD31和VEGFR2表达的受抑制,且抑制程度与给药浓度成正相关。鸡胚尿囊膜试验中证实,SMBJD对于体内微血管密度（microvessel density,MVD）具有削弱作用,且随着浓度增加而削弱作用逐渐增强。2.体外实验结果升麻鳖甲汤加减方HPLC结果显示,其中的有效成分分别为甘草苷（liquiritin）,阿魏酸（ferulic acid）,升麻素（cimifugin）,异阿魏酸（Isoferulic acid）和甘草酸（glycyrrhizic acid）。细胞增殖活性检测结果显示,SMBJD在所给药剂量范围内（2,4,8 mg/mL）对HUVECs和AML细胞系均无明显细胞毒性。因此均选取2,4,8 mg/mL三个浓度作为后续实验的给药浓度。在非细胞毒性药物浓度的作用下,SMBJD干预后的HUVECs的迁移、趋化和体外成管能力均受到不同程度的抑制,且该抑制作用在8 mg/mL最为显着。无细胞毒性的SMBJD干预后的AML细胞培养上清即CM,对HUVECs亦无明显细胞毒性,但是削弱了 HUVECs的迁移、趋化和成管能力;ELISA结果显示,非毒性浓度的SMBJD抑制了 AML细胞系中血管内皮生长因子（Vascuoar endothelial growth factor,VEGF）的分泌。经内皮细胞刺激因子—VEGF165刺激后的HUVECs在SMBJD干预后,呈现出与给药浓度正相关的活性抑制,且这种抑制作用与不经VEGF165刺激相比有所下降;划痕、Transwell实验、体外管腔形成实验也受到抑制;WB和PCR结果均显示出,无论是SMBJD干预、VEGF165刺激还是条件培养基培养的HUVECs,VEGF、血管内皮生长因子受体-2（Vascuoar endothelial growth factor receptor-2,VEGFR2）及 mRNA 的表达均受到负向调节作用,且具有统计学差异;另外,信号通路相关的PI3K、AKT及其磷酸化蛋白的表达和mRNA的调控也受到负导向作用,其中8 mg/mL的作用更显着。研究结论1.SMBJD体内具有减少鸡胚尿囊膜微血管密度的作用,下调荷瘤鼠模型瘤体组织中VEGF、VEGFR2和mRNA,以及免疫标记CD31、VEGFR2的表达;2.SMBJD体外抑制HUVECs的生理功能,抑制AML细胞中VEGF的分泌;3.条件培养基干预后的HUVECs,随条件培养基中SMBJD浓度的提升,VEGF、VEGFR2、P13K和AKT磷酸化蛋白以及mRNA的表达下降;4.SMBJD的抗血管新生作用的潜在机制可能与负调控AML细胞中VEGF的水平和PI3K/AKT通路有关。
曲艺[10]（2020）在《长链非编码RNA HOXA-AS2对急性髓系白血病的作用及机制研究》文中研究指明目的:急性髓系白血病（Acute myeloid leukemia,AML）的发生发展是多因素共同介导的多步骤过程,涉及多种调控分子改变。其中,遗传学畸变,包括染色体数目和/或结构异常、重现性基因突变或缺失等,相互作用、协同驱动AML的产生,同时也是影响患者临床预后的重要因素。目前AML中这些已知的遗传分子改变被广泛应用于区分疾病分型、指导个性化治疗以及评估预后风险,使得患者的五年生存率有了显着提升。但是,仍然有部分患者预后不良;特别的是,相同遗传亚型患者的治疗效果和临床结局也并非一致,提示这些病例可能伴有至今还未被发现的分子水平异常。因此,更进一步探究疾病发生发展的机制,挖掘新的关键调控分子对提高AML的疗效与长期生存率至关重要。90%的人类基因组DNA转录为非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）,其中转录本长度超出200个核苷酸者被归类为长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）,因其开放阅读框架长度不足而不能编码蛋白或编码能力极低。lncRNA的表达存在组织特异性与时间空间特异性,在细胞核和细胞浆中均有分布,可与DNA分子、RNA分子和蛋白质相互结合互相作用,从表观遗传学水平、转录水平和转录后水平等层面调节靶基因表达,在物种进化、生物体发育和衰老、细胞稳态维系、物质代谢和疾病发生发展等众多生理病理进程中扮演重要角色。在造血系统中,lncRNA能够维持干细胞的自我更新,促进造血细胞的定向分化与成熟,参与造血免疫系统的发育和激活。近年来,越来越多的研究发现AML中存在特定lncRNA表达异常。这些lncRNA在AML中发挥近似原癌基因或抑癌基因的作用,与疾病的启动、维持、发展及复发密切相关,更有文献报道lncRNA还参与AML细胞对化疗敏感或耐药的发生。深入研究lncRNA,为理解AML的本质提供全新视野,有利于理清AML发病和治疗的分子调控机制,为疾病诊断、靶向治疗和预后评估提供新的思路。同源盒基因（homeobox gene,HOX）是造血干/祖细胞分化成熟的主控基因,在正常造血过程中不可或缺,其表达异常可导致白血病的发生与发展。研究发现大量lncRNA位于HOX基因簇中或与之相关,包括HOTAIR、HOTAIRM1和HOTTIP等。HOX基因簇lncRNA在AML的恶性进程中起至关重要的调控作用,影响细胞增殖、分化、周期和凋亡等生物学行为。临床上,HOX基因簇lnc RNA被证实与AML患者诊断分型和生存结局有明确的关联性,可作为有效的生物学标志指导治疗和评估预后。HOXA-AS2是长度为1048个核苷酸,定位于7号染色体长臂1区5带7q15.1,处于HOXA3和HOXA4基因间的反义lncRNA。研究显示HOXA-AS2在多种恶性实体肿瘤中异常高表达,与肿瘤的发病、侵袭、转移及预后关系密切。在实体种瘤中,HOXA-AS2可通过调节组蛋白修饰、作为分子海绵吸附抑制mi RNA表达等方式发挥促癌功能。但是在AML中,HOXA-AS2的表达、临床意义、生物学功能及分子作用机制尚不清楚。鉴于此,本研究旨在检测HOXA-AS2在急性髓系白血病中的表达情况,分析其表达水平与患者临床资料的相关性及意义,研究HOXA-AS2对人髓系白血病细胞株生物学行为的影响,探索HOXA-AS2在AML中作用的下游目的基因及调控分子机制,为AML的诊疗提供全新的的生物学标志物及相应的实验理论基础。研究方法:1.收集初治成人AML患者108例、非恶性血液病对照者36例的骨髓标本,免疫磁珠分选法分离6例健康产妇脐血CD34阳性细胞标本,qRT-PCR实验检测HOXA-AS2的表达差异,分析研究HOXA-AS2表达水平与AML患者临床分型、实验室指标、疗效和长期生存等参数的相关性。2.HOXA-AS2的体外功能研究:培养人髓系白血病细胞株,qRT-PCR实验检测各细胞株内源性HOXA-AS2的表达,选用相对高水平表达HOXA-AS2的细胞株,感染慢病毒介导的靶向HOXA-AS2的shRNA以下调其表达水平,应用CCK-8、流式细胞术、EdU染色、Hoechst染色、Western-blot等实验观察敲减HOXA-AS2对人髓系白血病细胞增殖、分化、周期及凋亡等生物学行为的影响。3.HOXA-AS2调控的分子机制研究:核质分离结合qRT-PCR实验明确HOXAAS2在人髓系白血病细胞中的亚细胞定位;qRT-PCR和Western Blot实验检测敲减HOXA-AS2后邻近基因HOXA3、HOXA4表达的改变;通过文献检索推测HOXAAS2可能通过PI3K/AKT信号通路发挥作用,SOX4是HOXA-AS2潜在靶基因之一,Western Blot实验检测敲减HOXA-AS2后PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的改变;qRT-PCR和Western Blot实验检测敲减HOXA-AS2后SOX4表达的变化;qRTPCR实验检测AML患者中SOX4和HOXA-AS2的表达关系;分别共转染shRNA control+vector、shRNA control+SOX4 OE、HOXA-AS2 shRNA+vector、HOXA-AS2shRNA+SOX4 OE质粒,应用CCK-8、流式细胞术、Western blot实验探索HOXA-AS2是否通过SOX4发挥作用;生物信息学预测能与HOXA-AS2和SOX4 3’UTR区共同结合的miR-124-3p,使用qRT-PCR实验检测敲减HOXA-AS2后miR-124-3p表达的改变;转染miR-NC及miR-124-3p mimic质粒,qRT-PCR和Western blot实验检测上调miR-124-3p表达后HOXA-AS2和SOX4表达的变化;qRT-PCR实验检测AML患者中miR-124-3p与HOXA-AS2、SOX4的表达关系;双荧光素酶报告基因实验明确miR-124-3p是否分别与HOXA-AS2和SOX4 3’UTR在相同的位点靶向结合;在已感染shRNA control和HOXA-AS2 shRNA的细胞株中再分别转染miRNC及miR-124-3p inhibitor质粒,qRT-PCR和Western Blot实验检测共转染各组中SOX4表达的变化;应用CCK-8实验、流式细胞术探索miR-124-3p在AML中的生物学作用;应用CCK-8、流式细胞术、Western blot实验研究HOXA-AS2和miR-124-3p、miR-124-3p和SOX4双重作用下髓系白血病细胞生物学行为的变化。4.细胞实验每组重复3次。所得实验数据应用GraphPad Prism 6.0和SPSS 22.0软件进行统计学分析,其中分类变量以率或构成比表示,差异分析使用卡方检验;连续变量使用Kolmogorov-Smirnov法检验数据分布正态性,正态分布的连续变量以均数±标准差表示,差异分析使?独?样本t检验,非正态分布的连续变量以中位数、四分位数间距表示,差异分析使用非参数秩和检验;生存分析使用KaplanMeier法,差异分析应用log-rank检验,多因素分析应用Cox回归模型;所有检验均为双侧检验,P值<0.05表示差异有统计学意义。结果:1.HOXA-AS2在AML中的表达及临床意义1.1与非恶性血液病对照组和CD34阳性细胞组比较,初治AML患者中HOXAAS2的表达水平显着上调。1.2 HOXA-AS2的表达水平在FAB亚型、染色体核型分型与特征性基因突变类型中有所差异;AML患者中,高HOXA-AS2表达与高外周血白细胞计数、高骨髓原始细胞比例、微小残留病阳性、染色体预后危险分层高危以及早期死亡成正相关;AML患者获得完全缓解后HOXA-AS2的表达水平较初诊时明显下调;生存分析显示,高HOXA-AS2表达的AML患者总生存时间及无复发生存时间相对更短于HOXA-AS2低表达者,其中在染色体核型正常患者中,这种差异有统计学意义,进一步进行单因素和多因素分析发现高HOXA-AS2表达是染色体核型正常患者预后不佳的独立危险因素。2.HOXA-AS2对人髓系白血病细胞株生物学行为的影响2.1 HOXA-AS2在不同人髓系白血病细胞株中的表达水平较对照组均显着上调。2.2 HL-60和K562细胞株中内源性HOXA-AS2的表达水平相对更高,在这2株细胞系中感染3条不同的HOXA-AS2 shRNAs,其中HOXA-AS2 shRNA1和HOXA-AS2 shRNA2的敲减效率相对更高（敲减效率超过70%）,在后续实验中应用此2条shRNAs。2.3 CCK-8实验结果显示HOXA-AS2敲减组的细胞增殖能力较阴性对照组和空白组显着减弱;Western Blot实验结果显示HOXA-AS2敲减组中增殖相关蛋白PCNA的表达水平较阴性对照组和空白组显着下调。2.4流式及EdU染色实验结果显示HOXA-AS2敲减组中细胞被阻滞于G0/G1期,进入S期的细胞比例较阴性对照组和空白组明显下调;Western Blot实验结果显示HOXA-AS2敲减组中周期调控相关蛋白cyclin D1及CDK4的表达较阴性对照组和空白组明显受抑制。2.5流式及Hoechst染色实验结果显示HOXA-AS2敲减组细胞凋亡比例较阴性对照组和空白组明显增加;Western Blot实验结果显示HOXA-AS2敲减组凋亡相关蛋白cleaved PARP、cleaved Caspase 3、cleaved Caspase 9和BAX蛋白表达水平较阴性对照组和空白组均显着上调,抗凋亡蛋白BCL2表达明显受抑制。2.6流式检测结果显示HOXA-AS2敲减组CD11b阳性细胞比例与阴性对照组和空白组比较未见明显差异。3.HOXA-AS2作用AML的分子机制研究3.1 HOXA-AS2在人髓系白血病细胞质和细胞核中均有表达,但主要表达于细胞质。3.2 HL-60和K562细胞敲减HOXA-AS2后其邻近基因HOXA3和HOXA4的表达均无显着变化。3.3 HL-60和K562细胞敲减HOXA-AS2后磷酸化PI3K、磷酸化AKT蛋白表达水平显着下调,P21和P27蛋白表达水平明显上调。HL-60和K562细胞敲减HOXA-AS2后SOX4 mRNA和蛋白表达水平均明显下调;AML患者中SOX4显着高表达、且与HOXA-AS2的表达成正相关;过表达SOX4部分恢复敲减HOXA-AS2对HL-60和K562细胞增殖抑制、阻滞细胞周期于G0/G1期及诱导凋亡的作用。3.4 HL-60和K562细胞敲减HOXA-AS2后miR-124-3p的表达显着上调;HL-60和K562细胞上调miR-124-3p的表达后显着降低HOXA-AS2的表达水平,SOX4的表达也受明显抑制;AML患者中miR-124-3p显着低表达且与HOXA-AS2和SOX4的表达成负相关;双荧光素酶报告基因实验证实miR-124-3p可分别与HOX-AS2和SOX4 3’UTR在相同位点靶向结合;同时敲减HOXA-AS2并下调miR-124-3p表达的髓系白血病细胞中SOX4 mRNA和蛋白的表达水平较单纯敲减HOXA-AS2细胞组显着降低,但明显高于单纯下调miR-124-3p表达细胞组。3.5 miR-124-3p在AML中起抑癌作用,上调miR-124-3p表达能够抑制HL-60和K562细胞增殖,阻滞细胞周期于G0/G1期及诱导细胞凋亡,其生物学功能与敲减HOXA-AS2的趋势一致。3.6下调mi R-124-3p表达能够部分挽救敲减HOXA-AS2引起的HL-60和K562细胞增殖抑制、G0/G1期细胞阻滞及细胞凋亡增加,下调miR-124-3p表达所导致的促进髓系细胞白血病生长的作用也被HOXA-AS2 shRNA部分逆转。3.7过表达SOX4能够部分逆转上调miR-124-3p表达所引起的HL-60和K562细胞增殖抑制、周期阻滞于G0/G1期及诱导细胞凋亡的作用。结论:1.HOXA-AS2在急性髓系白血病患者中高表达,与反映病情严重的临床参数成正相关;高HOXA-AS2表达患者预后趋势不佳,在染色体核型正常患者中,HOXA-AS2高表达是预后不良的独立危险因素。2.HOXA-AS2在髓系白血病细胞系中高表达,起促癌作用,促进髓系白血病细胞增殖、抑制细胞凋亡,对细胞分化无显着影响。3.HOX-AS2靶向结合miR-124-3p,减弱其对SOX4的负性调控作用,从而促进髓系白血病细胞的生长。
二、急性髓系白血病血管新生因子的表达及临床意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、急性髓系白血病血管新生因子的表达及临床意义（论文提纲范文）
（1）阻断CXCR4对移植物抗白血病效应与移植物抗宿主病影响的研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 趋化因子及其受体 |
| 1.2 趋化因子CXCL12及其受体CXCR4 |
| 1.2.1 CXCL12/CXCR4概述 |
| 1.2.2 CXCL12/CXCR4在生理过程与病理状态中的作用 |
| 1.3 CXCR4在急性髓系白血病中的研究进展 |
| 1.3.1 CXCR4在AML细胞向骨髓归巢及定居中的作用 |
| 1.3.2 AML细胞CXCR4的表达与调控 |
| 1.3.3 CXCR4表达与AML患者临床特征及预后的关系 |
| 1.3.4 CXCR4作为AML治疗靶点的研究进展 |
| 1.4 CXCR4在急性淋巴细胞白血病中的研究进展 |
| 1.4.1 CXCR4在ALL病理机制中的作用 |
| 1.4.2 ALL细胞CXCR4的表达与调控 |
| 1.4.3 CXCR4与ALL细胞髓外浸润 |
| 1.4.4 CXCR4在ALL中的预后意义 |
| 1.4.5 CXCR4作为ALL治疗靶点的研究进展 |
| 1.5 CXCL12/CXCR4在造血干细胞移植中的研究进展 |
| 1.5.1 阻断CXCR4在造血干细胞动员中的应用 |
| 1.5.1.1 阻断CXCR4与自体造血干细胞动员 |
| 1.5.1.2 阻断 CXCR4 与 allo-HCT 供者造血干细胞动员 |
| 1.5.1.3 其他阻断 CXCR4 的动员剂 |
| 1.5.2 阻断CXCR4在allo-HCT预处理中的应用 |
| 1.5.3 阻断CXCR4在allo-HCT后的应用 |
| 1.6 总结与展望 |
| 第2章 阻断CXCR4增强异基因淋巴细胞回输后移植物抗白血病效应 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 患者白血病样本与异基因淋巴细胞样本采集 |
| 2.2.2 实验动物 |
| 2.2.3 主要实验试剂、耗材与仪器 |
| 2.2.4 主要溶液配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 临床患者白血病细胞分离 |
| 2.3.2 患者来源异种移植模型(PDX)构建 |
| 2.3.3 异基因淋巴细胞分离与回输 |
| 2.3.4 AMD3100皮下注射 |
| 2.3.5 小鼠外周血细胞流式细胞仪检测 |
| 2.3.6 牺牲小鼠检测各脏器白血病细胞 |
| 2.3.7 统计学方法 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 本研究3例B-ALL患者临床特征 |
| 2.4.2 患者B-ALL细胞CXCR4表达及其体内动员反应 |
| 2.4.3 ALI来源的正常B细胞在PDX小鼠体内快速消失 |
| 2.4.4 ALI联合AMD3100可有效清除PDX小鼠骨髓白血病细胞 |
| 2.4.5 化疗预处理桥接ALI联合AMD3100可有效清除高白血病负荷PDX模型小鼠骨髓白血病细胞 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 阻断CXCR4增强异基因造血干细胞移植后移植物抗白血病效应 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验细胞 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 主要实验试剂、耗材与仪器 |
| 3.2.4 主要溶液配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 原代白血病小鼠的构建 |
| 3.3.2 小鼠allo-HCT |
| 3.3.3 AMD3100皮下注射 |
| 3.3.4 小鼠外周血白血病细胞的检测 |
| 3.3.5 受体小鼠各脏器流式检测 |
| 3.3.6 统计学方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 Notch1-T-ALL与MLL-AF9-AML细胞CXCR4表达与体内动员反应 |
| 3.4.2 AMD3100增强allo-HCT后GVL效应 |
| 3.4.3 AMD3100与allo-HCT后受体小鼠外周血供体T细胞扩增有关 |
| 3.4.4 AMD3100与allo-HCT后受体小鼠外周血供体CD8+记忆T细胞扩增有关 |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 阻断CXCR4对移植物抗宿主病与供体造血细胞植入的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验细胞 |
| 4.2.2 实验动物 |
| 4.2.3 主要实验试剂、耗材与仪器 |
| 4.2.4 主要溶液配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 原代T-ALL种子小鼠的构建 |
| 4.3.2 流式染色检测调节性T细胞 |
| 4.3.3 小鼠异基因造血干细胞移植 |
| 4.3.4 AMD3100皮下注射 |
| 4.3.5 小鼠急性与慢性GVHD模型的评估 |
| 4.3.6 小鼠活体骨髓穿刺 |
| 4.3.7 组织病理检测 |
| 4.3.8 小鼠外周血白血病细胞的检测 |
| 4.3.9 受体小鼠各脏器流式检测 |
| 4.3.10 统计学方法 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 小鼠骨髓免疫细胞CXCR4的表达及其对AMD3100的动员反应 |
| 4.4.2 AMD3100对allo-HCT后急性GVHD的影响 |
| 4.4.3 AMD3100对allo-HCT后慢性GVHD的影响 |
| 4.4.4 AMD3100对allo-HCT后供体细胞植入的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在校期间的学术业绩 |
| 致谢 |
（2）急性髓系白血病外泌体蛋白的组学分析和功能研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 第一部分 蛋白质定量质谱探究急性髓系白血病外泌体蛋白质表达 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 差异表达外泌体蛋白质在急性髓系白血病中的表达及临床意义 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 外泌体对受体细胞的功能及机制 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 外泌体在急性髓系白血病中的作用及临床意义 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 白血病概述 |
| 1.1.1 白血病的定义及常见症状 |
| 1.1.2 白血病的发现及分类 |
| 1.1.3 白血病发病机制研究进展 |
| 1.1.4 白血病流行病学 |
| 1.1.5 白血病的治疗 |
| 1.2 白血病自发性缓解与细菌感染 |
| 1.3 细菌抗肿瘤研究 |
| 1.3.1 细菌抗肿瘤研究历程 |
| 1.3.2 细菌抗肿瘤的优势 |
| 1.3.3 细菌抗肿瘤的应用前景 |
| 1.4 沙门氏菌抗肿瘤研究 |
| 1.4.1 沙门氏菌有效靶向肿瘤 |
| 1.4.2 沙门氏菌介导肿瘤细胞自我死亡 |
| 1.4.3 沙门氏菌减少肿瘤转移 |
| 1.4.4 沙门氏菌诱发宿主抗肿瘤免疫反应 |
| 1.4.5 沙门氏菌增强肿瘤化疗敏感性 |
| 1.4.6 沙门氏菌联合治疗进一步促进了肿瘤的消退 |
| 1.4.7 沙门氏菌的遗传学改造 |
| 1.4.8 沙门氏菌可作为递呈肿瘤治疗分子载体 |
| 1.5 减毒沙门氏菌VNP20009的研究 |
| 1.5.1 减毒沙门氏菌VNP20009的构建及遗传特点 |
| 1.5.2 减毒沙门氏菌VNP20009的生物分布特性 |
| 1.5.3 减毒沙门氏菌VNP20009的毒理学评价 |
| 1.5.4 减毒沙门氏菌VNP20009的抗肿瘤研究 |
| 1.6 课题研究思路、目的、意义及内容 |
| 1.6.1 研究思路 |
| 1.6.2 研究目的和意义 |
| 1.6.3 研究内容 |
| 第二章 VNP20009对急性淋巴细胞白血病细胞的体内外生长抑制作用及机制研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 菌株及细胞株 |
| 2.2.2 实验动物及饲养 |
| 2.2.3 试剂与耗材 |
| 2.2.4 主要试剂的配制 |
| 2.2.5 仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 2.3.2 细胞培养 |
| 2.3.3 细菌-细胞体外共培养实验 |
| 2.3.4 Annexin V-PE/7-ADD双染流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.3.5 L1210皮下瘤模型建立 |
| 2.3.6 动物分组与给药治疗 |
| 2.3.7 石蜡切片的制备 |
| 2.3.8 石蜡切片苏木素&伊红(H&E)染色分析 |
| 2.3.9 石蜡切片缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光分析 |
| 2.3.10 总蛋白的提取 |
| 2.3.11 蛋白浓度测定 |
| 2.3.12 Western Blot检测目标蛋白 |
| 2.3.13 统计学分析 |
| 2.4 研究结果 |
| 2.4.1 VNP20009 体外抑制L1210/Jurkat细胞增殖 |
| 2.4.2 VNP20009 体外诱导L1210/Jurkat细胞凋亡 |
| 2.4.3 VNP20009治疗L1210细胞荷瘤小鼠体重和活动未见异常 |
| 2.4.4 VNP20009抑制L1210皮下移植瘤生长 |
| 2.4.5 VNP20009引起L1210皮下移植瘤组织坏死 |
| 2.4.6 VNP20009诱导L1210皮下移植瘤细胞凋亡 |
| 2.4.7 VNP20009治疗L1210皮下移植瘤凋亡蛋白表达量升高 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 VNP20009对急性髓系白血病细胞的体内外生长抑制作用及机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 菌株及细胞株 |
| 3.2.2 实验动物 |
| 3.2.3 主要试剂与耗材 |
| 3.2.4 主要试剂的配制 |
| 3.2.5 主要仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 3.3.2 细胞培养 |
| 3.3.3 细菌-细胞体外共培养实验 |
| 3.3.4 Annexin V-PE/7-ADD双染流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 3.3.5 HL-60皮下瘤模型建立 |
| 3.3.6 动物分组与给药治疗 |
| 3.3.7 石蜡切片的制备 |
| 3.3.8 石蜡切片苏木素&伊红(H&E)染色分析 |
| 3.3.9 石蜡切片缺口末端标记(TUNEL)免疫荧光分析 |
| 3.3.10 总蛋白的提取 |
| 3.3.11 蛋白浓度测定 |
| 3.3.12 Western Blot检测目标蛋白 |
| 3.3.13 统计学分析 |
| 3.4 研究结果 |
| 3.4.1 VNP20009体外抑制HL-60细胞增殖 |
| 3.4.2 VNP20009体外诱导HL-60细胞凋亡 |
| 3.4.3 VNP20009治疗HL-60细胞荷瘤小鼠体重和活动情况无异常 |
| 3.4.4 VNP20009抑制HL-60皮下移植瘤生长 |
| 3.4.5 VNP20009引起HL-60皮下移植瘤组织坏死 |
| 3.4.6 VNP20009诱导HL-60皮下移植瘤细胞凋亡 |
| 3.4.7 VNP20009治疗HL-60皮下移植瘤组织凋亡蛋白表达量增加 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 VNP20009 对系统性MLL-AF9 驱动型AML小鼠的治疗作用及免疫激活研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 菌株及细胞 |
| 4.2.2 实验动物 |
| 4.2.3 主要试剂与耗材 |
| 4.2.4 主要试剂的配制 |
| 4.2.5 主要仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 沙门氏菌VNP20009的制备 |
| 4.3.2 沙门氏菌VNP20009的组织分布 |
| 4.3.3 MLL-AF9 驱动型AML白血病细胞的复苏 |
| 4.3.4 MLL-AF9 驱动型AML白血病细胞小鼠尾静脉注射造模 |
| 4.3.5 抗凝全血样本的采集 |
| 4.3.6 血清样本的采集 |
| 4.3.7 MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血中白血病细胞(GFP+)检测 |
| 4.3.8 血涂片瑞氏-吉姆萨染色 |
| 4.3.9 小鼠外周血细胞分类计数 |
| 4.3.10 原代脾脏单细胞悬液的制备 |
| 4.3.11 原代骨髓单细胞悬液的制备 |
| 4.3.12 原代白血病细胞红细胞裂解处理 |
| 4.3.13 原代白血病细胞的冻存 |
| 4.3.14 MLL-AF9 驱动型AML小鼠分组与给药治疗 |
| 4.3.15 细胞因子与趋化因子的测定 |
| 4.3.16 流式细胞术检测细胞表面分子 |
| 4.3.17 流式细胞术检测胞内细胞因子的表达 |
| 4.3.18 统计学分析 |
| 4.4 研究结果 |
| 4.4.1 VNP20009小鼠组织分布情况 |
| 4.4.2 MLL-AF9 驱动型AML小鼠模型的构建 |
| 4.4.3 VNP20009 治疗MLL-AF9 驱动型AML小鼠体重未见明显异常 |
| 4.4.4 VNP20009 抑制MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血中白血病细胞的增殖 |
| 4.4.5 VNP20009 抑制MLL-AF9 驱动型AML小鼠脾脏中白血病细胞的增殖 |
| 4.4.6 VNP20009 影响MLL-AF9 驱动型AML小鼠外周血细胞的分布 |
| 4.4.7 NP20009对MLL-AF9驱动型AML主要器官重量的影响 |
| 4.4.8 VNVNP20009 延长MLL-AF9驱动型 AML小鼠生存期 |
| 4.4.9 VNP20009调节MLL-AF9驱动型 AML小鼠血清细胞因子&趋化因子的分泌 |
| 4.4.10 VNP20009调节MLL-AF9驱动型 AML小鼠血清细胞因子&趋化因子的分泌 |
| 4.4.11 VNP20009 激活 MLL-AF9驱动型 AML 小鼠外周血中T淋巴细胞的增殖 |
| 4.4.12 VNP20009 促进 MLL-AF9 驱动型 AML 小鼠脾脏中 IFN-γ+效应T淋巴细胞的极化 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（4）过表达CD40L基因对裸鼠白血病模型髓外心、肾浸润的影响（论文提纲范文）
| 中英缩略词对照表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（5）初步探讨PDGF家族及其受体基因在急性白血病患者骨髓单个核细胞中的mRNA表达水平及其临床意义（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 采用RT-qPCR方法检测六种PDGF家族及其受体基因在急性白血病中的mRNA表达及其临床意义 |
| 1. 引言 |
| 2. 病例和方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 PDGF家族及其受体基因表达对急性白血病患者预后的影响 |
| 1. 引言 |
| 2. 病例和方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 PDGF家族及受体的作用和与疾病的关系 |
| 参考文献 |
| 中英文缩略词汇表 |
| 攻读硕士学位期间发表的文章 |
| 致谢 |
（6）miR-204靶向调控HGF/c-MET通路在急性髓系白血病中的作用和机制的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 MICRORNA在急性髓系白血病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历和在校期间发表论文情况 |
| 致谢 |
（7）缺氧对急性髓系白血病KG-1细胞生物学及基因甲基化的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 缺氧微环境与白血病 |
| 1.2 表观遗传学异常是白血病发病的重要机制 |
| 1.3 缺氧在表观遗传改变中起着关键作用 |
| 第二章 材料和方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要引物 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 细胞培养 |
| 2.2.2 CCK-8法检测细胞活性 |
| 2.2.3 细胞培养基中LDH的测定 |
| 2.2.4 细胞总RNA提取 |
| 2.2.5 逆转录cDNA的合成 |
| 2.2.6 实时荧光定量PCR |
| 2.2.7 免疫印迹法(Western blot) |
| 2.2.8 慢病毒感染HIF-1α过表达 |
| 2.2.9 化合物YC-1 抑制HIF-1α表达 |
| 2.2.10 5-hmC含量测定 |
| 2.2.11 基因组DNA中5-mC含量测定 |
| 2.2.12 甲基化特异性PCR法(MSP) |
| 2.2.13 统计学方法 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 缺氧对急性髓系白血病KG-1细胞增殖及代谢的影响 |
| 3.1.1 CCK-8方法检测细胞增殖活性结果 |
| 3.1.2 细胞培养基中LDH测定结果 |
| 3.2 缺氧对KG-1 细胞中HIF-1α表达的影响 |
| 3.2.1 HIF-1α mRNA表达水平 |
| 3.2.2 HIF-1α蛋白表达水平 |
| 3.3 缺氧及HIF-1α对KG-1 细胞基因甲基化态势的影响 |
| 3.3.1 缺氧对KG-1细胞基因组甲基化的影响 |
| 3.3.2 HIF-1α过表达对KG-1 细胞基因组甲基化及P15 基因甲基化的影响 |
| 3.3.3 HIF-1α抑制对KG-1 细胞基因组甲基化及P15 基因甲基化的影响 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 缺氧对KG-1细胞增殖及代谢的影响 |
| 4.2 缺氧对KG-1 细胞HIF-1α表达的影响 |
| 4.3 缺氧对KG-1细胞甲基化的影响 |
| 第五章 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录一 |
| 附录二 |
| 致谢 |
（8）升麻鳖甲汤加减方联合节拍式化疗维持治疗“正虚毒瘀型”老年AML的临床研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 理论部分 |
| 1. 祖国医学对AML的诊治现状 |
| 1.1 中医学对AML的认识 |
| 1.2 中医药对于AML的治疗现状 |
| 2. AML的西医治疗进展 |
| 第二章 临床研究 |
| 1. 研究对象 |
| 1.1 病例来源 |
| 1.2 纳入标准 |
| 1.3 排除标准 |
| 1.4 病例脱落和剔除标准 |
| 2. 研究方法 |
| 2.1 分组方法 |
| 2.2 治疗方案 |
| 2.3 观察指标及疗效评价 |
| 2.4 统计分析 |
| 3. 实验结果 |
| 3.1 基线比较 |
| 3.2 疗效比较 |
| 第三章 讨论 |
| 1. 本研究选用升麻鳖甲汤的理论依据 |
| 2. 本研究选用节拍式化疗的理论依据 |
| 3. 本研究选取老年人综合评估的理论基础来评估患者的生存状态 |
| 4. 结果讨论 |
| 4.1 疗效比较 |
| 4.2 安全性评价 |
| 5. 不足与展望 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读硕士学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（9）升麻鳖甲汤加减方通过PI3K/AKT通路抑制急性髓系白血病血管新生的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 理论研究 |
| 一、西医研究进展 |
| (一) 急性髓系白血病的概况 |
| (二) 病因学 |
| (三) 分类标准 |
| (四) 基因突变及预后 |
| (五) 血管新生与血液系统肿瘤的关系 |
| (六) 治疗方法 |
| 二、中医研究进展 |
| (一) 中药复方治疗AML |
| (二) 中药化合物治疗AML |
| 第二章 实验研究 |
| 第一部分 升麻鳖甲汤加减方影响荷瘤小鼠血管新生能力 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 第二部分 升麻鳖甲汤加减方抑制HUVECs的功能 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 第三部分 升麻鳖甲汤加减方干预的AML细胞上清影响HUVECs功能 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 第四部分 升麻鳖甲汤加减方抑制VEGF165刺激的HUVECs功能 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 第五部分 升麻鳖甲汤加减方抑制血管新生的机制研究 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 3. 实验结果 |
| 讨论 |
| 结论与展望 |
| 结论 |
| 创新性 |
| 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 中英文缩略词 |
| 攻读博士学位期间取得的学术研究成果 |
| 致谢 |
（10）长链非编码RNA HOXA-AS2对急性髓系白血病的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 长链非编码RNA HOXA-AS2 在急性髓系白血病中的表达及临床意义 |
| 1前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂及仪器 |
| 2.1.1 主要试剂及耗材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验对象和分组 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 骨髓单个核细胞提取 |
| 2.3.2 免疫磁珠分选脐血CD34阳性细胞 |
| 2.3.3 细胞总RNA提取 |
| 2.3.4 cDNA逆转录反应 |
| 2.3.5 实时定量荧光 PCR 反应(q RT-PCR) |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 108例AML患者的基本情况 |
| 3.2 HOXA-AS2在AML患者中高表达 |
| 3.3 AML不同亚型中HOXA-AS2 的表达情况 |
| 3.3.1 FAB分型 |
| 3.3.2 染色体核型比较 |
| 3.3.3 特征性基因突变类型 |
| 3.4 HOXA-AS2 的表达水平与AML患者临床特征之间的关系 |
| 3.5 HOXA-AS2 的表达水平与AML患者疗效的关系 |
| 3.6 HOXA-AS2 的表达水平与AML患者预后的相关性 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 HOXA-AS2 对人髓系白血病细胞株细胞生物学行为的影响 |
| 1前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂、耗材及仪器 |
| 2.1.1 主要试剂、耗材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验对象 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞复苏、培养、传代及冻存 |
| 2.3.2 细胞总RNA的提取 |
| 2.3.3 逆转录及实时荧光定量反应检测HOXA-AS2 的表达 |
| 2.3.4 细胞感染 |
| 2.3.5 CCK-8实验 |
| 2.3.6 流式细胞术检测细胞分化、周期和凋亡 |
| 2.3.7 EdU染色实验 |
| 2.3.8 Hoechst染色实验 |
| 2.3.9 Western Blot实验 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 HOXA-AS2 在人髓系白血病细胞株中高表达 |
| 3.2 髓系白血病细胞株感染慢病毒介导HOXA-AS2 sh RNA效率的检测 |
| 3.3 敲减HOXA-AS2 抑制髓系白血病细胞增殖 |
| 3.3.1 CCK-8实验检测细胞增殖变化 |
| 3.3.2 Western Blot实验检测增殖相关蛋白PNCA表达的变化 |
| 3.4 敲减HOXA-AS2 阻滞髓系白血病细胞周期于G0/G1期 |
| 3.4.1 流式细胞术检测细胞周期变化 |
| 3.4.2 EdU染色实验检测细胞周期变化 |
| 3.4.3 Western Blot实验检测周期相关蛋白cyclin D1、CDK4 表达的变化 |
| 3.5 敲减HOXA-AS2 诱导髓系白血病细胞凋亡 |
| 3.5.1 流式细胞术检测细胞凋亡变化 |
| 3.5.2 Hoechst染色实验检测细胞凋亡变化 |
| 3.5.3 Western Blot实验检测细胞凋亡相关蛋白的表达 |
| 3.6 敲减HOXA-AS2 对髓系白血病细胞分化无显着影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 长链非编码RNA HOXA-AS2 作用AML的分子机制研究 |
| 1前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 主要试剂、耗材及仪器 |
| 2.1.1 主要试剂、耗材 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.2 实验对象 |
| 2.2.1 细胞系 |
| 2.2.2 患者标本 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞复苏、培养、传代及冻存 |
| 2.3.2 核质分离实验及核、质RNA提取 |
| 2.3.3 细胞总RNA提取 |
| 2.3.4 lnc RNA及 m RNA的逆转录及实时荧光定量反应 |
| 2.3.5 miRNA逆转录及实时荧光定量反应 |
| 2.3.6 细胞转染 |
| 2.3.7 CCK-8实验 |
| 2.3.8 流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡 |
| 2.3.9 Western Blot实验 |
| 2.3.10 双荧光素酶报告基因实验 |
| 2.4 统计学方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 HOXA-AS2 在髓系白血病细胞中的亚细胞定位 |
| 3.2 敲减HOXA-AS2 对邻近基因的表达无显着影响 |
| 3.3 HOXA-AS2 通过调控SOX4 的表达促进髓系白血病细胞生长 |
| 3.3.1 敲减HOXA-AS2 抑制PI3K/AKT信号通路 |
| 3.3.2 敲减HOXA-AS2 下调SOX4 表达 |
| 3.3.3 髓系白血病细胞株和AML患者中SOX4 的表达及其与HOXA-AS2 表达的相关性 |
| 3.3.4 髓系白血病细胞株转染SOX4过表达质粒效率的检测 |
| 3.3.5 HOXA-AS2和SOX4 双重作用对髓系白血病细胞生物学行为的影响 |
| 3.4 HOXA-AS2 靶向结合mi R-124-3p调控SOX4 表达 |
| 3.4.1 敲减HOXA-AS2 上调mi R-124-3p表达 |
| 3.4.2 上调mi R-124-3p表达抑制HOXA-AS2 的表达 |
| 3.4.3 上调mi R-124-3p表达抑制SOX4 的表达 |
| 3.4.4 髓系白血病细胞株和AML患者中mi R-124-3p的表达及其与HOXA-AS2、SOX4表达的相关性 |
| 3.4.5 双荧光素酶报告基因实验验证mi R-124-3p分别与HOXA-AS2、SOX43,UTR靶向结合 |
| 3.4.6 共转染 HOXA-AS2 sh RNA 病毒和 mi R-124-3p inhibitor 质粒对 SOX4 表达的影响 |
| 3.5 上调miR-124-3p表达抑制髓系白血病细胞生长 |
| 3.6 HOXA-AS2和mi R-124-3p双重作用对髓系白血病细胞生物学行为的影响 |
| 3.7 mi R-124-3p和 SOX4 双重作用对髓系白血病细胞生物学行为的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
四、急性髓系白血病血管新生因子的表达及临床意义（论文参考文献）
- [1]阻断CXCR4对移植物抗白血病效应与移植物抗宿主病影响的研究[D]. 苏龙. 吉林大学, 2021(01)
- [2]急性髓系白血病外泌体蛋白的组学分析和功能研究[D]. 辉红蕾. 昆明医科大学, 2021(01)
- [3]减毒沙门氏菌VNP20009对急性白血病的治疗作用及机制研究[D]. 李美蓉. 华南理工大学, 2020
- [4]过表达CD40L基因对裸鼠白血病模型髓外心、肾浸润的影响[D]. 杨雪敏. 遵义医科大学, 2020
- [5]初步探讨PDGF家族及其受体基因在急性白血病患者骨髓单个核细胞中的mRNA表达水平及其临床意义[D]. 杨露露. 苏州大学, 2020(02)
- [6]miR-204靶向调控HGF/c-MET通路在急性髓系白血病中的作用和机制的研究[D]. 聂鼎睿. 郑州大学, 2020(02)
- [7]缺氧对急性髓系白血病KG-1细胞生物学及基因甲基化的影响[D]. 周贵珍. 湖南师范大学, 2020(01)
- [8]升麻鳖甲汤加减方联合节拍式化疗维持治疗“正虚毒瘀型”老年AML的临床研究[D]. 赵衍东. 南京中医药大学, 2020(08)
- [9]升麻鳖甲汤加减方通过PI3K/AKT通路抑制急性髓系白血病血管新生的机制研究[D]. 王梦亚. 南京中医药大学, 2020(08)
- [10]长链非编码RNA HOXA-AS2对急性髓系白血病的作用及机制研究[D]. 曲艺. 中国医科大学, 2020(01)
标签：白血病论文; 急性淋巴细胞白血病论文; 急性髓性白血病论文; 慢性粒细胞白血病论文; 化疗药物论文;