一、转化生长因子β_1基因修饰的小鼠树突状细胞在移植体内的迁移与生存(摘要)（论文文献综述）
李昕宇[1]（2021）在《小鼠Kupffer细胞的转分化研究》文中指出研究背景及目的:KCs是肝脏长期驻留的巨噬细胞,在慢性肝损伤期间KCs被激活并分泌促炎症和促纤维化细胞因子,作用于HSCs转分化形成肌成纤维细胞,最终产生胶原沉积,学术界广泛认可,HSCs是肝脏中胶原沉积的主要来源,也是肝纤维化病理过程的核心环节,而KCs除了能辅助HSCs参与纤维化以外,是否有其他途径产生胶原沉积尚未阐明。HSCs转分化成为肌成纤维细胞是肝纤维化的关键步骤,除了HSCs转分化以外,肝脏中还存在大量其他细胞转分化的现象,例如有实验研究证明了动物模型中肝细胞和胆管细胞相互转化。在肝外组织中的巨噬细胞,例如皮肤、心肌、肾脏等组织中巨噬细胞可更进一步转分化为纤维细胞并分泌胶原蛋白,和伤口损伤愈合修复密切相关。通过上述类比,提出KCs可以发生转分化的猜想,KCs转分化为类成纤维细胞后可能产生胶原沉积,甚至有可能参与肝组织损伤修复乃至肝纤维化形成。KCs的转分化理论提供了不同于传统纤维化理论着眼于HSCs的不同视角,把肝硬化的过程视为河流,HSCs的转分化可视作主干道,而KCs则可作为支流,提供了未来肝纤维化治疗的新思路和新靶点,同时给成纤维细胞提供了新的来源,完善了对肝纤维化的认识。材料和方法:首先本研究在两个不同的体外实验模型中进行平行实验:体外肝脏非实质细胞培养和精密肝切片培养。具体步骤如下:（1）构建特异性追踪KCs谱系的动物模型Emr1Cre+/-::Ribo Tag+/-的小鼠追踪KCs谱系。（2）分离KCs后进行体外培养。（3）使用精密肝切片培养技术进行精密肝片培养。（4）使用免疫荧光成像分析培养后的KCs表达的蛋白。（5）利用多聚体免疫共沉淀富集KCs,提取RNA,合成c DNA。（6）实时定量PCR（Fludigm）。其次在小鼠肝切片中进行胶原沉积研究,使用氯膦酸盐脂质体耗竭KCs,进行精密肝切片培养,对肝切片进行Masson三色染色和RT-PCR基因表达分析。最后使用IL1r敲除小鼠和Nlrp3基因敲除小鼠,使用精密肝切片培养技,实时定量PCR分析基因表达,使用LDH检测套盒定量分析肝片中细胞死亡情况。结果:（1）随着体外培养时间的推移,体外非实质细胞培养和精密肝切片培养两种模型中均发生:KCs的特征基因以及调控其表达的转录因子表达下调。（2）随着体外培养时间的推移,体外非实质细胞培养和精密肝切片培养两种模型中均发生:KCs中纤维化相关的基因以及调控其表达的转录因子表达上调。上述效应在非实质细胞培养和肝组织切片培养之间是高度一致的。（3）清除KCs后肝切片中胶原沉积减少。（4）Il-1r敲除小鼠的肝片中细胞死亡相关基因表达与对照组没有显着差异。（5）Nlrp3敲除小鼠肝片中细胞死亡相关基因表达与对照组没有显着差异。结论:KCs转分化在体外非实质细胞培养和精密肝切片培养两种模型中均有发生。KCs的转分化在体外培养中相对保守反应,转分化为类似成纤维细胞样的细胞,可以分泌胶原沉积相关蛋白。
毛鑫[2]（2021）在《人羊膜间充质干细胞抑制同种异体小鼠心脏移植免疫排斥损伤作用microRNA表达初步探究》文中研究说明目的:本研究旨在探讨人羊膜间充质干细胞（human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs）有减轻小鼠心脏移植免疫排斥损伤作用的基础上,采用RNA-seq技术对其进行micro RNA转录组研究。初步挖掘hAMSCs在减轻排斥损伤方面的潜在机制。为hAMSCs的应用提供理论基础,也为其在减轻心脏移植免疫损伤方面的应用提供新的认识。方法:1.运用显微外科技术进行模型构建。分为同系移植组（A组）,异系移植组（B组）,异系移植干细胞干预组（C组）,干细胞（2.5×105个细胞/次/0.4毫升）于术后第1天、第4天经尾静脉注入。2.观察小鼠存活时间及状态,通过取B、C组供体心脏做HE染色观察心肌病理改变。3.评估模型成功后,于术后第7天取小鼠供心组织,收集RNA样本测序。通过RNA-seq、生物信息技术分析得到差异表达显着的micro RNA。4.应用mi Randa行靶基因预测后,用R的cluster Profiler进行富集分析。5.通过阅读相关文献,测序数据富集结果分析以及在GEO数据库相关测序分析结果中通过韦恩（venn）取得交集的方式,筛选出差异显着的micro RNA进行q RT-PCR验证。结果:1.造模及干预后观察小鼠状态良好,干细胞干预组小鼠存活时间较单纯异系移植组延长（P<0.05）;2.通过HE染色发现单纯异系移植组心肌组织中单核细胞、中性粒细胞侵入肌细胞的周界,肌细胞被浸润细胞包围。心肌纤维扭曲断裂。心肌纤维形态不规则,肌纤维水肿,且连续性消失。干细胞干预组心肌间单核细胞、中性粒细胞浸润明显减少,亦可见心肌纤维损伤断裂和结构变形,但程度较轻。3.通过测序分析得出AB组间、AC组间、BC组间差异性表达micro RNA分别为:1324、1323和1340个,其中显着差异的分别有:213、211、82个。4.通过靶基因预测发现的重要micro RNA包括:mi R-1247-5P、mi R-106b-3p、mi R-127-5p。GO富集分析结果显示,靶基因主要富集包括:蛋白结合、激酶活性、转录调控、磷酸化等方面。KEGG通路富集在多个通路中,主要涉及:Rap1信号通路、MAPK信号通路、Wnt信号通路、c AMP信号通路等。5.筛选出差异表达显着的micro RNA为:（1）.同、异系移植组间（AB组间）差异表达micro RNA:mi R-199a-3p;mi R-34b-3p;mi R-434-3p;（2）.三组间差异表达micro RNA:mi R-451a;mi R-494-3p;mi R-136-3p。通过q RT-PCR验证发现这些micro RNA与转录组测序得到的结果趋势基本相同。结论:1.初步表明了hAMSCs具有减轻同种异体小鼠心脏移植免疫排斥损伤作用。2.通过RNA-seq、生物信息技术分析及q RT-PCR验证,初步确认mi R-451a、mi R-494-3p、mi R-136-3p的表达可能与hAMSCs减轻同种异体小鼠心脏移植免疫排斥损伤的作用存在密切关系。
谢俊豪[3]（2021）在《人乳牙牙髓干细胞治疗STZ诱导糖尿病大鼠的疗效观察及机制研究》文中研究指明糖尿病（Diabetes Mellitus,DM）是一种全球性慢性代谢性疾病。据国际糖尿病联盟（International Diabetes Federation,IDF）报告显示,到2040年,糖尿病人口预计将从2015年的4.15亿增加到6.42亿。1型糖尿病（Type 1 Diabetes Mellitus,T1DM）的病例以每年3%-5%速度稳步增加,全世界患有T1DM的青年人数（<20岁）超过100万人,按照目前的趋势发展,预计每年将增加10万人。胰岛素终生替代疗法是目前临床T1DM的主要治疗方法,但其不能遏制胰岛功能进行性衰竭,也无法有效阻止T1DM相关并发症的发生和进展。近年来,干细胞疗法有望通过胰岛β细胞替代或再生,保护甚至重建内源性胰岛素分泌系统,从而改善疾病进程与预后,是T1DM治疗领域备受关注的研究方向。而人乳牙牙髓干细胞（stem cells from pulps of human exfoliated deciduous teeth,SHED）的应用逐步显示其潜在优势。SHED较其他间充质干细胞来源丰富、获取简单、增殖能力强、低免疫原性、低致瘤风险,且不存在伦理问题,有更好的免疫调节作用,较好的生物学稳定性和良性特征,较低的凋亡性和衰老性。已证明SHED可诱导为胰岛β细胞,显示其运用于未来T1DM治疗的巨大潜力。目前,其应用于DM的研究正逐步开展,尚未见其治疗T1DM恢复β细胞功能相关基础及临床研究的报道,其发挥作用的机制也有待阐明。一、研究目的（一）通过尾静脉和胰背动脉两种途径移植SHED,探究不同移植途径对SHED治疗STZ诱导DM大鼠疗效的影响。（二）皮下注射胰岛素,维持DM大鼠血糖于不同水平,通过尾静脉多次移植SHED,探究不同血糖水平DM大鼠多次输注SHED疗效差异。（三）通过动物和细胞实验,探究SHED治疗DM的可能机制。二、研究方法180-200g雄性SD大鼠,适应性喂养后,予60mg/kg STZ腹腔注射构建糖尿病模型。（一）SHED经不同输注途径治疗DM大鼠随机选取48只STZ诱导DM大鼠,分为DM对照组（DM组,diabetes mellitus group,n=14）,尾静脉输注组（CV组,Caudal vein infusion SHED group,n=16）,胰背动脉输注组（DPA组,Dorsal pancreatic artery infusion SHED group,n=18）。对照大鼠12只为正常对照组（NC组,Normal control group,n=12）。成模后,CV组和DPA组皮下注射胰岛素降糖治疗,一周左右至目标血糖后开始干细胞治疗,胰岛素降糖治疗持续至治疗结束。每周监测大鼠食量、体重、空腹血糖,每天监测CV组和DPA组大鼠随机血糖,记录胰岛素注射剂量。治疗前及SHED治疗2周后,行口服葡萄糖耐量试验（Oral glucose tolerance test,OGTT）评价糖代谢情况,并留取血清标本检测C肽、糖化血清蛋白（glycated serum protein,GSP）等。干细胞治疗2周后,处死大鼠留取器官进行后续研究。（二）SHED治疗不同血糖水平DM大鼠36只STZ诱导DM大鼠分为DM对照组（diabetes mellitus group,DM组,n=6）,胰岛素治疗组（n=12）和干细胞治疗组（n=18）,其中胰岛素治疗组又分为中糖组（Middle glycemic group,MG组）和低糖组（Low glycemic group,LG组）;干细胞治疗组又分为高糖干细胞组（High glycemic SHED group,HGSHED组）、中糖干细胞组（Middle glycemic SHED group,MGSHED组）和低糖干细胞组（Low glycemic SHED group,LGSHED组）,每组各6只。未造模大鼠为正常对照组（normal control group,NC组,n=6只）。MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠均给予胰岛素治疗,2周内达到目标血糖后开始干细胞治疗,胰岛素降糖治疗持续至治疗结束。每周监测食量、体重、空腹血糖,每天监测MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠随机血糖,记录胰岛素注射量。治疗前和第3次输注干细胞2周后,分别对所有大鼠行OGTT试验,评价糖代谢情况,并留取血清检测C肽、GSP等。干细胞治疗5周后,处死大鼠留取器官进行后续研究。（三）SHED治疗DM大鼠机制研究苏木精-伊红染色（hematoxylin and eosin staining,HE染色）观察胰腺病理变化,透射电镜观察胰岛β细胞内部结构变化,免疫组织化学和免疫荧光双标染色探究β/α胰岛细胞比例、胰岛素和胰高血糖素分泌情况。冰冻切片活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）染色及氧化应激相关指标检测评价各组大鼠胰腺氧化应激情况,蛋白质印迹法（Western-Blot,WB）分析胰腺Keap1/Nrf2抗氧化信号通路、p-Erk激活情况和抗凋亡相关蛋白Bcl-2表达情况。（四）SHED改善STZ诱导胰岛RIN-m5F细胞损伤的效应观察及机制探究1、细胞模型的构建予不同浓度STZ（50mM、20 mM、10 mM、7.5 mM、5 mM、2.5 mM、1.25 mM、1 mM）刺激胰岛RIN-m5F细胞不同时间（2h、6h、12h、24h）,行Cell-Counting Kit-8检测,选择抑制率为50%的浓度和时间为后续细胞实验造模条件,在该浓度和时间检测ROS,确定DM氧化应激细胞模型构建成功。2、SHED培养上清液刺激实验按照不同处理分为正常对照组（normal control group,NC组）、SHED培养上清液处理组（culture medium treatment group,CM组）、STZ组、STZ+SHED培养上清液处理组（STZ+CM组）。各组进行ROS荧光染色及流式细胞检测,氧化应激相关指标检测,凋亡流式细胞检测,Ed U-594细胞增殖荧光染色及流式细胞检测,荧光定量PCR确定Keap1、Nrf2、抗凋亡蛋白Bcl-2、凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3、增殖细胞核抗原（Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA）m RNA表达量变化。3、关键作用细胞因子确定及siRNA干扰查阅文献确定HGF为本研究细胞因子,SHED改善STZ诱导的DM胰岛β细胞功能可能与其分泌较高量的HGF密切相关,并对SHED的HGF基因进行siRNA干扰。4、SHED培养上清液与siRNA-HGF SHED培养上清液刺激对比实验按照不同处理分为STZ组、STZ+SHED培养上清液处理组（STZ+CM组）、STZ+siRNA干扰SHED培养上清液处理组（STZ+siRNACM组）及STZ+重组肝细胞生长因子处理组（STZ+HGF组）。各组进行相关检测,包括ROS荧光染色及流式细胞检测,氧化应激相关指标检测,凋亡流式细胞检测,Ed U-594细胞增殖荧光染色及流式细胞检测,荧光定量PCR检测Keap1、Nrf2、抗凋亡蛋白Bcl-2、凋亡相关蛋白Bax和Caspase-3、PCNA m RNA表达量变化。并进一步通过Western Blot探索HGF在细胞模型中对Keap1、Nrf2、p-Erk、p-Akt及凋亡相关蛋白的影响。三、研究结果（一）SHED经不同输注途径治疗DM大鼠干细胞治疗后,CV组和DPA组大鼠每周日均食量明显少于DM组（均P<0.01）,且CV组小于DPA组（P<0.01）。CV组和DPA组大鼠体重明显大于DM组（P<0.01）（P<0.05）,CV组大鼠体重也明显大于DPA组大鼠（P<0.01）。治疗后1周,两组空腹血糖均值相同（15.68mmol/L）,且治疗后2周,两组空腹血糖均明显低于DM组（均P<0.01）。CV组和DPA组日均胰岛素注射量较治疗前（第5周）均明显减少（P=0.001,P=0.001）。治疗后,CV组和DPA组血糖AUC0-120min均明显低于DM组（均P<0.01）。CV组和DPA组大鼠C肽AUC0-120min水平较治疗前明显升高（P=0.004）（P=0.001）,且CV组明显高于DM组和DPA组（均P<0.01）。DM组大鼠GSP水平明显高于NC组、CV组和DPA组（均P<0.01）,但三组之间无明显差异（P>0.05）。CV组大鼠GSP治疗前后无明显变化（P=0.309）,DPA组大鼠GSP较治疗前降低（P=0.001）。（二）SHED治疗不同血糖水平DM大鼠干细胞治疗后,MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠日均食量均明显小于DM组、HGSHED组和MG组（P<0.05）（P<0.01）。MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠体重均明显大于同期DM组和HGSHED组（均P<0.01）。MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠空腹血糖均明显低于同期DM组和HGSHED组,且MG组、MGSHED组和LGSHED组空腹血糖与NC组无明显差异（P>0.05）。MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠日均胰岛素使用量较干细胞治疗前均明显减少（P<0.05）（P<0.01）。治疗后,MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组血糖AUC0-120min较治疗前逐渐降低（均P<0.01）,且均明显低于DM组和HGSHED组（均P<0.01）。DM组C肽AUC0-120min较治疗前明显降低（P<0.01）,而HGSHED组治疗前后无明显变化。DM组、HGSHED组和MG组大鼠C肽AUC0-120min水平均明显低于NC组（P<0.05）（P<0.01）;MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组大鼠C肽AUC0-120min水平明显高于DM组和HGSHED组（P<0.01）。治疗后,MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组GSP水平均明显低于DM组和HGSHED组（均P<0.01）。（三）SHED治疗DM大鼠机制研究1、HE染色,MG组、MGSHED组、LG组和LGSHED组胰岛体积较DM组和HGSHED组明显增大,胰岛细胞明显增多,细胞核染色清晰度明显增加,空泡细胞和玻璃样变减少,炎性细胞浸润明显减少。MGSHED组较MG组、LGSHED组较LG组体积增大,改善更明显。其中,MGSHED组胰岛体积最大,但小于NC组。2、胰腺电镜结果显示,各治疗组胰岛β细胞状态不同程度改善,MGSHED组改善最为明显。胰岛免疫组织化学和荧光双标染色均显示,各治疗组β/α细胞比例增大,胰岛素分泌增多,而胰高血糖素分泌不同程度减少。3、ROS染色,DM组平均荧光强度最大,各治疗组大鼠较DM组平均荧光强度一定程度降低。其中,MGSHED组平均荧光强度最小。4、各治疗组大鼠胰腺总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）不同程度升高,而丙二醛（MDA）、一氧化氮合成酶（NOS）分型尤其是i NOS一定程度降低。5、Western Blot蛋白分析,DM组大鼠胰腺Nrf2蛋白表达较NC组明显减少,各治疗组均有不同程度增加,其中MGSHED组Nrf2蛋白表达增加最多。而DM组大鼠胰腺Keap1蛋白表达较NC组明显增加,各治疗组一定程度减少,MGSHED组Keap1蛋白表达最少。DM组p-Erk、抗凋亡蛋白Bcl-2明显减少,各治疗组一定程度增加,MGSHED组明显大于MG组,LGSHED组明显大于LG组。（四）SHED改善STZ诱导胰岛RIN-m5F细胞损伤的效应观察及机制探究1、STZ浓度为5mM、时间为12h,作为后续细胞实验造模条件。ROS荧光强度明显增强表明氧化应激细胞模型构建成功。2、SHED培养上清液刺激实验STZ+CM组较STZ组ROS平均荧光强度减小,抗氧化相关指标T-AOC、SOD、GSH升高,脂质过氧化产物MDA减少,细胞凋亡率明显降低,增殖率明显升高（p<0.01）。STZ+CM组Nrf2m RNA表达量明显高于STZ组（p<0.01）,而STZ+CM组Keap1表达量明显低于STZ组（p<0.01）。STZ+CM组Bcl-2和PCNA m RNA表达量明显大于STZ组（p<0.01）,而Bax和Caspase-3明显小于STZ组（p<0.01）。3、关键作用细胞因子确定及siRNA干扰siRNA-HGF干扰SHED,HOMO-HGF-2能明显抑制SHED细胞中HGF基因m RNA（抑制率约71.78%）（p<0.01）和蛋白表达。Elisa法检测SHED培养上清液中HGF浓度,siRNA-HGF2组明显低于NC组和siRNA-NC组（p<0.05）（P<0.01）。4、SHED培养上清液与siRNA-HGF SHED培养上清液刺激对比实验STZ+CM组ROS平均荧光强度明显小于STZ+siRNACM组（p<0.01）,STZ+siRNACM组T-AOC明显小于STZ+CM组（p<0.01）,细胞增殖率（p<0.05）、Nrf2（p<0.01）,Bcl-2、PCNA m RNA表达量明显低于STZ+CM组（p<0.01）,而Caspase-3m RNA表达量明显高于STZ+CM组（p<0.01）。5、Western Blot检测确定HGF作用相关蛋白发现,重组HGF能激活Nrf2、p-Erk、p-Akt,下调Keap1,增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达,减少凋亡相关蛋白Caspase-3表达。四、研究结论1、不同输注途径及不同血糖水平SHED治疗对DM大鼠症状、糖代谢相关指标及胰岛分泌功能均有不同程度的改善作用。2、不同输注途径移植SHED,输注相同次数,在相同糖代谢水平,观察相同时间,对血糖改善作用类似。3、多次尾静脉移植SHED,对不同血糖水平DM大鼠疗效不同。MGSHED组DM大鼠症状、糖代谢及胰岛功能整体改善效果较好,表明维持血糖平稳控制于合适的水平,更利于SHED体内存活迁移及相关细胞因子分泌,达到更好的治疗效果。4、控制血糖水平后,多次静脉移植SHED,可明显改善糖尿病症状,降低空腹血糖水平、改善胰岛储备与分泌功能、减少胰岛素使用剂量,且三次移植效果优于一次。5、SHED移植治疗DM大鼠,可能启动胰腺内源性氧化应激系统,增强其抗氧化能力,调节氧化应激可能是其发挥作用重要机制之一。最重要的抗氧化信号通路Keap1/Nrf2与调控密切相关。且与p-Erk激活相关的细胞增殖及Bcl-2家族蛋白的活化减轻细胞凋亡相关。6、体外研究发现,SHED减少STZ诱导胰腺RIN-m5F细胞氧化应激、促进其存活与其分泌大量HGF密切相关。可能通过HGF激活p-Erk、p-Akt及Keap1/Nrf2抗氧化信号通路,启动内源性抗氧化途径,从而影响氧化应激相关指标,并减少凋亡蛋白,促进抗凋亡及增殖相关蛋白表达,保护β细胞,从而在抗糖尿病中发挥重要作用。
尹良伟[4]（2021）在《黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究》文中进行了进一步梳理自20世纪70年代末,全球乳腺癌（Breast Cancer）发病率一直呈上升趋势,在我国乳腺癌已经成为女性发病首位的恶性肿瘤,而且呈现年轻化趋势;年轻女性乳腺癌的发病,往往侵袭性更高,病理分级及预后更差。手术、化疗、放疗和内分泌治疗是乳腺癌传统的四大治疗手段,生物治疗为进入本世纪以来乳腺癌的第五大治疗手段,免疫治疗从属于生物治疗的范畴。然而,乳腺癌免疫治疗的发展一直较为缓慢。因此,如何合理选择人群和合理的治疗模式,让更多的乳腺癌患者从免疫治疗中获益,是未来该领域的重点发展方向。树突状细胞（Dendritic Cells,DC）作为抗原提呈功能细胞的主要效应细胞之一,将固有免疫和适应性免疫紧密连接在一起,尤其是在特异性免疫反应中发挥独特的免疫学效应。根据不同阶段DC生物学特性的不同,有些学者设想利用改善DC功能的手段来增强其抗肿瘤效应。黏蛋白1（Mucins1,MUC1）是I型跨膜糖蛋白,正常情况下可表达于多种组织、器官的上皮细胞近管腔或腺腔面,亦可见于腺癌上皮细胞的表面,而且呈高表达态势。相关研究显示,MUC1表达程度越高,往往预示着肿瘤侵袭性越强,预后越差,而且更容易出现局部浸润、淋巴结转移和血行转移。结合近年来MUC1在肿瘤生物治疗中的新发现以及基因修饰技术的成熟和推广,我们以MUC1作为出发点,以基因修饰DC作为主要技术路线,分以下3部分系统探讨MUC1基因转染后的DC对乳腺癌的免疫作用,旨在探索乳腺癌新的肿瘤免疫治疗途径与方法。一、黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备目的:验证MUC1在人乳腺癌中高表达,并构建和包装MUC1重组慢病毒,感染DC,制备过表达MUC1的DC疫苗。材料和方法:（1）应用免疫组织化学技术检测90例乳腺癌组织和30例癌旁正常组织以及三种细胞（神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y与两种乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231）中MUC1蛋白的表达,q PCR检测26例新鲜乳腺癌组织和癌旁正常组织以及三种细胞MUC1 m RNA水平,验证MUC1在乳腺癌组织及细胞系中的表达;（2）应用GV657载体,经目的基因扩增、PCR产物与载体交换、测序、质粒提取及纯化、病毒包装,获取重组MUC1慢病毒;（3）通过密度梯度离心法,体外分离获得人外周血单个核细胞;采用无血清培养基,经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rh GM-CSF）、重组人白介素-4（rh IL-4）和肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF）-α诱导产生成熟DC;流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平;（4）MUC1慢病毒感染DC,分为MUC1基因感染DC组（MUC1-DC组）、空载体感染DC组（GFP-DC组）以及对照组（DC组）;（5）RT-PCR检测感染后DC的MUC1 m RNA水平;（6）Western blotting检测感染后DC的MUC1蛋白表达。结果:（1）90例乳腺癌组织中,MUC1表达明显高于癌旁正常组织,92.2%（83/90）乳腺癌组织中显示MUC1高表达,30例癌旁组织中5例为高表达（16.7%）,其余25例者（83.3%）为阴性或细胞质内弱表达。在26例乳腺癌组织中有92.3%（24/26）的MUC1 m RNA水平明显高于配对的癌旁对照组织（P<0.01）,仅2例乳腺癌中MUC1 m RNA表达水平与癌旁组织相当;与神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y比较,两种乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的MUC1 m RNA水平和蛋白表达均显着增高（均为P<0.01）;（2）MUC1重组质粒测序结果与目的基因一致,经包装获得病毒滴度为1×109TU/m L的重组MUC1慢病毒;（3）相差显微镜观察体外培养的外周血来源DC形态变化过程,培养至5～7d大部分细胞脱壁悬浮,体积明显增大且大小不等,形态不规则,表面可见很多粗细不一、参差不齐、形态各异的毛刺状突起,呈现典型的树突状细胞形态;培养7d的DC流式检测结果显示,CD1a、CD80、CD83及CD86分子表达率分别为（21.6±2.4）%、（22.7±1.6）%、（24.9±2.1）%及（95.4±4.3）%,表明获得成熟DC;（4）采用MUC1重组慢病毒感染DC后,于24 h时可见特异性GFP表达,24h、48 h、72 h的转染效率分别为（11.7±1.0）%、（12.9±0.9）%和（36.8±1.6）%;（5）与空载体组和对照组相比,MUC1-DC组RT-PCR检测到346 bp扩增带;（6）同时Western blotting检测MUC1-DC组可见明显的MUC1蛋白条带。结论:（1）验证了MUC1在人乳腺癌组织以及两种人乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231中呈高表达;（2）成功构建MUC1重组质粒,并包装获得携带MUC1基因重组慢病毒;（3）以MUC1重组慢病毒感染DC,成功获得过表达MUC1的DC,即MUC1-DC疫苗。二、MUC1-DC免疫功能的体外研究目的:探究前一部分实验获得的MUC1-DC疫苗在体外诱导CTL的免疫作用及对人乳腺癌细胞MCF7的杀伤活性。材料和方法:（1）诱导培养特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,免疫荧光技术检测不同转染时间后MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-α情况;（2）ELISA法检测比较MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL和DC-CTL IL-12、TNF-α含量;（3）以人乳腺癌细胞MCF7为靶细胞,以MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL、DC-CTL为效应细胞,采用LDH释放法检测CTL的杀伤活性,CTL特异性杀伤率（%）=（试验孔值-效应细胞对照值）/（最大杀伤对照值-最小杀伤对照值）×100%。结果:（1）经免疫荧光检测,转染的MCU1-DC培养2d后诱导CTL开始表达IL-12和TNF-α,但荧光强度较弱;与MCU1-DC培养3d相比,培养4d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的量均明显升高,荧光强度增强,差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.05）;MCU1-DC培养5d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α荧光强度最强;MCU1-DC培养6d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的荧光强度逐渐下降;（2）ELISA结果显示:GFP-DC诱导CTL分泌细胞因子IL-12、TNF-α能力较低,分别为（101.83±5.79）ng/m L、（119.26±11.52）ng/m L,与DC组比较差异无统计学意义（P>0.05）;而MUC1-DC诱导CTL分泌这两种因子的能力明显增强,分别为（202.52±17.10）ng/m L和（349.07±79.42）ng/m L,与DC组和GFP-DC组比较,差异均有明显统计学意义（均为P<0.01）;（3）LDH释放法检测结果显示,三组杀伤活性均随效靶比的升高而增强;相同效靶比时,与DC-CTL组或GFP-DC-CTL组比较,MUC1-DC-CTL组对靶细胞MCF7具有更明显的杀伤活性,差异具有明显统计学意义（均为P<0.01）。结论:（1）MUC1基因转染的DC诱导CTL即MUC1-DC-CTL在5 d时分泌IL-12和TNF-α的能力最强,用于本研究后续实验;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC诱导CTL具有更强的产生IL-12、TNF-ɑ细胞因子的免疫活性;（3）MUC1-DC-CTL对人乳腺癌MCF-7细胞比单纯DC-CTL具有更明显的杀伤活性,而且随着效靶比的升高,CTL的杀伤活性逐渐增强。三、光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用目的:通过活体监测MCF7荷瘤裸鼠的成瘤生长情况,评价MUC1基因转染的DC疫苗对乳腺癌免疫作用的效果及其可能的机制。材料和方法:（1）GFP慢病毒转染MCF7细胞（GFP-MCF7）;（2）BALB/c裸鼠皮下种植GFP-MCF7 1×107个/只,成瘤后随机分为3组,各组裸鼠首先尾静脉注射体外活化的CIK细胞1×108个/只,治疗组于皮下注射MUC1-DC（MUC1-DC组）或DC细胞（DC组）1×107个/只,体积0.2 ml/只,对照组（Ct组）注射等体积生理盐水,每天治疗1次,连续5d;（3）采用小动物活体光学成像系统在开始治疗前及开始治疗后第35d进行成像观察移植瘤荧光成像,分析荧光强度和荧光面积;（4）免疫组化法检测三组裸鼠移植瘤组织中Caspase3的表达情况;（5）TUNELl法检测三组裸鼠移植瘤组织中的细胞凋亡率。结果:（1）裸鼠于GFP-MCF7荷瘤后7d,成瘤率100%。开始治疗前和开始治疗后35d活体光学分子成像结果显示,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号强度无明显差异（F=0.4341,P>0.05）;开始治疗后第35d,MUC1-DC组的荧光信号强度明显低于Ct组（F=7.864,P<0.05）;DC与Ct、MUC1-DC与DC组间均无显着性差异（均为P>0.05）,但MUC1-DC比DC组荧光信号更低。从荧光信号面积上进行统计分析,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号分布面积无显着差异（F=1.084,P>0.05）;开始治疗后第35d,Ct组荧光信号呈多处散在分布,MUC1-DC组和DC组的荧光信号面积均明显低于Ct组（均为P<0.01）,但MUC1-DC组与DC组的荧光信号面积无显着性差异（P>0.05）;（2）Ct组Caspase3表达最少,DC组次之,MUC1-DC组呈高表达Caspase3,三组间比较,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;（3）TUNEL结果显示,三组细胞凋亡率分别为:Ct组（4.11±2.61%）、DC组（9.63±2.27）%、MUC1-DC组（25.30±8.24）%,三组间比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）GFP荧光标记的人乳腺癌细胞在裸鼠内可以持续表达荧光信号,可以通过光学分子成像系统检测光密度值观察肿瘤的部位及生长情况,是一种活体内实时动态观察肿瘤的生长和转移、评价抑瘤作用的有效方法;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC免疫治疗人乳腺癌荷瘤小鼠能够更有效地抑制肿瘤生长和扩散;（3）MUC1-DC发挥了更好的促进肿瘤细胞凋亡的作用。
涂丽裙[5]（2020）在《转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用》文中提出转化生长因子-β2（TGF-β2）对免疫应答有全方位的负调节作用,可调节几乎每一种适应性免疫应答和固有免疫应答的细胞,包括树突状细胞、T细胞、B细胞、粒细胞和固有免疫淋巴样细胞。使用免疫检查点抑制剂治疗肿瘤的成功案例提示我们:抑制免疫抑制性细胞因子TGF-β2可能是一种新的策略去研制新型疫苗佐剂。为了研制出以核酸为基础的TGF-β2的抑制剂,我们设计了三个靶向人鼠的TGF-β2 m RNA3’UTR保守区域的反义寡核苷酸,并将其命名为TIO1,TIO2,TIO3。在小鼠巨噬细胞,人单核细胞及人浆细胞样树突状细胞,TIO1,TIO2及TIO3均明显下调TGF-β2的表达。在小鼠中,TIO3和TIO1,均可显着增强微生物疫苗所诱导的抗体反应。其中TIO3为佐剂的流感疫苗可抵抗流感病毒的攻击并减轻流感病毒引起的急性肺损伤。在小鼠中,TIO3可明显下调淋巴结及脾脏细胞CD4+T细胞及CD19+B细胞上s TGF-β2的表达,上调CD19+B细胞及CD11c+DC表面CD40,CD80,CD86,CD69及MHC II分子的表达,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,促进CD4+T细胞产生IL-4,抑制调节性T细胞（Tregs）的产生,促进CD4+T细胞和CD19+B细胞的增殖与活化,促进流感病毒感染的小鼠的肺脏中CD4+T细胞和CD8+T细胞表面CD69的表达。总的来说,通过干扰TGF-β2的表达,TIO3或TIO1,可作为新型微生物疫苗佐剂增强疫苗诱导的抗体反应;此外,TIO3为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗可显着延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。TIO3可通过抑制人和小鼠的胶质瘤细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞表达TGF-β2,诱生胶质瘤特异性的CD4+T细胞和CD8+T细胞,激活NK细胞,促进CD4+T细胞和CD8+T细胞产生IFN-γ,上调胶质瘤细胞表面MHCI分子的表达进而增强胶质瘤疫苗的抗肿瘤功效。单独应用TIO3可通过抑制胶质瘤细胞表达TGF-β2、促进胶质瘤细胞表达MHC I,IL-17A及IFN-α、抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞表达s TGF-β2、抑制Tregs的产生、促进CD4+T细胞及CD8+T细胞的增殖而明显延长原位接种胶质瘤预防模型小鼠的生存期。单独应用TIO3可通过抑制胃癌细胞表达TGF-β2,促进MHC I,IL-13,IL-15,IL-17及IFN-γ的表达而显着减少肿瘤体积、延长胃癌背部移植瘤小鼠的生存期。TGF-β2的反义寡核苷酸有潜能作为微生物疫苗和肿瘤疫苗的新型佐剂,或单独治疗胶质瘤和胃癌的候选药物。
赵慧[6]（2020）在《免疫与炎症反应在脑卒中动物模型中的影响与机制研究》文中研究指明目的:脑卒中后脑内炎症反应参与损伤级联扩大及神经功能恶化,但其特点与直接作用尚不明确。本研究通过注射百日咳毒素（pertussis toxin,PTx）增强脑缺血或出血后脑内炎症反应,观察脑内炎症特点、病理变化及临床结局,明确脑卒中后脑内炎症的直接作用。在细胞调节水平,具有获得性免疫功能的固有淋巴细胞（innate lymphoid cell,ILC）亚群对脑卒中的免疫调节作用与机制尚不明确。因此我们研究以2型为代表的ILC及其调节因子白介素（interleukin,IL）-33对脑卒中的影响,以明确脑卒中后免疫细胞介导的炎症反应特征与机制,为免疫调节治疗提供实验依据。方法:第一部分:野生型C57BL/6小鼠100只,雄性,予以分为5组,假手术组（Sham组）、脑缺血组（MCAO组）、PTx处理脑缺血组（20μg/kg PTx+MCAO组）、脑出血组（ICH组）、PTx处理脑出血组（20μg/kg PTx+ICH组）（随机数字法）,每组20只。采用线栓法对野生型C57BL/6小鼠建立60分钟大脑中动脉缺血再灌注模型。采用胶原酶微量泵注射法制备野生型C57BL/6小鼠脑出血模型。应用改良的神经功能缺损评分量表、转棒疲劳实验检测第1-3天各组小鼠的神经功能损伤情况;用流式细胞术对第3天各组小鼠的病灶侧脑组织免疫细胞浸润情况进行分析,包括小胶质细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞;小动物活体成像技术对第3天各组小鼠中枢活性氧进行标记示踪;免疫荧光染色的方法对内皮细胞与紧密连接蛋白ZO-1、内皮细胞与紧密连接蛋白Claudin-5共染,观察第3天各组小鼠的血脑屏障通透性。第二部分:野生型C57BL/6小鼠40只,雄性,予以分为2组,假手术组（Sham组）与脑缺血组（MCAO组）（随机数字法）,每组20只。流式细胞分析比较各组小鼠MCAO模型制备后第3天脑、脾、外周血的ILC2计数;免疫荧光染色法分析少突胶质细胞、星形胶质细胞中IL-33表达水平。应用药理学干预和转基因动物,研究删除、转输或活化ILC2细胞对神经功能评分和梗死体积的影响:分组1)野生型C57BL/6小鼠制备MCAO模型后20只,雄性,予以分为2组,PBS处理组（Vehicle组）与删除ILC2组（anti-CD90.2组）（随机数字法）,每组10只。2)应用免疫缺陷的Rag2-/-γc-/-小鼠制备MCAO模型后20只,雄性,予以分为2组,PBS处理组（Vehicle组）与ILC2转输组（ILC2组）（随机数字法）,每组10只。3)野生型C57BL/6小鼠制备MCAO模型后20只,雄性,予以分为2组,PBS处理组（Vehicle组）与IL-33处理组（IL-33组）（随机数字法）,每组10只。应用小动物磁共振成像仪T2成像比较各组小鼠MCAO模型制备后第1、3、7天脑梗死病灶体积;改良的神经功能缺损评分量表、转角实验比较各组小鼠MCAO模型制备后第1、3、7天神经功能损伤情况。结果:第一部分:（1）各组小鼠神经功能损伤情况:与MCAO组相比,第1-3天20μg/kg PTx+MCAO组小鼠改良的神经功能缺损评分明显增高（*P<0.05）,转棒疲劳实验小鼠停留的时间明显减少（*P<0.05）。与ICH组相比,20μg/kg PTx+ICH组小鼠改良的神经功能缺损评分明显增高（*P<0.05）,转棒疲劳实验的时间明显减少（*P<0.05）。（2）各组小鼠中枢免疫细胞浸润分布:与Sham组相比,MCAO组与ICH组小鼠脑内小胶质细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞显着增多（*P<0.05）。分别与MCAO组、ICH组相比,20μg/kg PTx+MCAO组、20μg/kg PTx+ICH组小鼠中枢内B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞明显增多（*P<0.05）。此外,分别与MCAO、20μg/kg PTx+MCAO组相比,ICH、20μg/kg PTx+ICH组小鼠中枢内中性粒细胞、自然杀伤细胞、B细胞、CD8+T细胞明显减少（*P<0.05）。（3）各组小鼠脑氧化应激对比:与Sham组相比,MCAO组、ICH组第3天的活性氧产生显着增多,氧化应激水平显着增高（*P<0.05）。20μg/kg PTx+MCAO组、20μg/kg PTx+ICH组的氧化应激水平较未处理组明显增高（*P<0.05）。（4）各组小鼠血脑屏障染色:与Sham组相比,MCAO组、ICH组第3天的紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5表达显着减少。分别与MCAO组、ICH组相比,20μg/kgPTx+MCAO组、20μg/kg PTx+ICH组的紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5表达进一步减少。第二部分:（1）与Sham组相比,MCAO组野生型C57BL/6小鼠脑内ILC2计数明显增多（**P<0.01）,脾与外周血中ILC2计数明显减少（*P<0.05）,提示脑缺血后ILC2向中枢浸润增多。（2）为研究ILC2是否影响脑卒中病理进程,我们利用抗CD90.2单抗删除ILC2及将ILC2转输至Rag2-/-γc-/-小鼠（无T、B、NK细胞）体内,经核磁影像与神经功能评分阐述ILC2对脑卒中预后的影响。实验发现,在脑缺血再灌注后第1-3天,抗CD90.2抗体删除ILC2显着增加小鼠脑梗死体积和神经功能缺失（*P<0.05）。而通过将ILC2转输至Rag2-/-γc-/-小鼠可有效降低脑梗死体积和神经功能缺失（*P<0.05）。上述结果表明ILC2对缺血性脑卒中具有保护作用。（3）继而,我们利用病理切片染色发现,少突胶质细胞是表达IL-33的主要细胞,且在脑缺血再灌注后表达显着上调（*P<0.05）。推测胶质细胞来源的IL-33可能是维持脑部ILC2细胞存活与活化的主要细胞。缺血性脑卒中小鼠体内给予IL-33能够扩增ILC2数量,减小脑梗死体积和神经功能缺失（*P<0.05）。结论:第一部分:PTx引起的系统炎症反应可进一步加重小鼠脑卒中后神经功能损伤程度体现为:中枢内小胶质细胞活化,髓系与淋巴细胞的浸润增多;PTx引起的免疫炎症过程可能与B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞在中枢内浸润增高有关,而与小胶质细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞的中枢浸润关系不密切。相比ICH模型,MCAO模型以中性粒细胞、自然杀伤细胞、B细胞、CD8+T细胞的中枢浸润为主,提示天然免疫可能主要参与了脑缺血急性期损伤加重。PTx对小鼠脑内活性氧的产生及其氧化应激水平有进一步放大作用。PTx诱发的炎症反应下调脑卒中后第3天血脑屏障的紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5的表达,使其破坏加重,进一步扩大脑内免疫炎症反应水平。第二部分:MCAO小鼠脑内有大量的ILC2浸润,而外周ILC2显着减少,提示外周ILC2可能在脑缺血后迁移至脑损伤部位。通过删除或转输ILC2的相关实验提示ILC2可减轻脑缺血再灌注小鼠神经功能损伤和病灶体积,证明ILC2对缺血性脑卒中发挥保护作用。IL-33可在体内扩增ILC2,表明脑内胶质细胞来源的IL-33可能是维持ILC2细胞活化的关键分子。ILC2减小梗死体积、帮助神经功能的修复可能是通过其上游的IL-33调节作用完成,其中少突胶质细胞可能是IL-33的主要来源。
陈剑潇[7]（2020）在《间充质干细胞对旁分泌TGFβ1调控Th17/Treg影响ARDS炎症反应及免疫功能的研究》文中研究指明背景早期失衡的炎症反应是急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome,ARDS）的重要病理生理改变,有效调控促炎细胞及抑炎细胞的分化平衡对ARDS治疗具有关键作用。CD4+T细胞作为适应性免疫的重要效应细胞,其亚群Th17/Treg在ARDS早期失衡炎症反应中扮演重要角色。既往研究证实,间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）能有效控制ARDS炎症反应,同时对Th17及Treg分化有调控作用,但其具体作用机制仍未可知。MSCs可以旁分泌转化生长因子β1（transforming growth factorβ1,TGFβ1）,其为调控Th17/Treg分化的主要细胞因子之一,推测调控MSCs旁分泌TGFβ1表达可影响MSCs治疗ARDS的早期炎症反应,且其机制是影响Th17/Treg失衡。本研究利用基因工程上调小鼠骨髓来源间充质干细胞（murine bone-marrow-derived mesenchymal stem cell,mBM-MSC）中TGFβ1表达,并将构建好的细胞株通过气道及静脉移植至LPS诱导的ARDS小鼠模型中,分别通过病理、流式检测CD4+T细胞亚群及炎症因子表达等检测,探讨MSCs通过旁分泌TGFβ1影响CD4+T细胞分化,从而对ARDS模型肺局部及整体免疫功能的影响。第一部分高表达TGFβ1的慢病毒质粒转染对小鼠骨髓来源间充质干细胞体外增殖、分化及迁移功能的影响目的构建慢病毒介导的稳定高表达TGFβ1蛋白的mBM-MSC,并探讨高表达TGFβ1对mBM-MSC体外增殖、分化和迁移的影响。方法将含有TGFβ1基因的质粒转染mBM-MSC细胞株;荧光镜检及流式细胞法鉴定第20代转染细胞的转染效率,q RT-PCR法、Westernblot及ELISA法分别检测mBM-MSC中TGFβ1 m RNA和蛋白表达水平;采用诱导分化试剂盒鉴定转染后细胞株成骨、成脂及成软骨分化能力;采用Cell counting kit-8（CCK-8）试剂盒鉴定转染后细胞株的增殖能力;采用划痕实验及Transwell迁移实验鉴定转染后细胞株的水平迁移和垂直迁移能力。结果（1）慢病毒质粒长期稳定转染TGFβ1基因。采用慢病毒转染的TGFβ1基因高表达的mBM-MSC,传代培养至20代后,其转染效率为82.3-88.6%。（2）慢病毒质粒转染后,TGFβ1在mBM-MSC中显着高表达。与正常对照组（mBM-MSC-NC组）相比,高表达TGFβ1的mBM-MSC（mBM-MSC-TGFβ1组）的TGFβ1 m RNA表达水平、TGFβ1蛋白的外分泌水平及细胞内TGFβ1蛋白表达水平均显着增加（P<0.0001）。（3）高表达TGFβ1对mBM-MSC的分化功能无显着影响。与mBM-MSC-NC组相比,mBM-MSC-TGFβ1组细胞仍保持良好的成骨、成脂、成软骨能力。（4）高表达TGFβ1对mBM-MSC的增殖功能存在抑制。第5d至第7d,与mBM-MSC-NC组相比,mBM-MSC-TGFβ1组增殖能力明显降低（P<0.05）。（5）高表达TGFβ1对mBM-MSC的迁移功能无显着影响。划痕后及Transwell迁移实验12h后,与mBM-MSC-NC组相比,mBM-MSC-TGFβ1组划痕宽度无明显变化（P>0.05）、细胞迁移亦无明显增加（P>0.05）。结论慢病毒介导的质粒转染成功构建高表达TGFβ1的mBM-MSC,高表达TGFβ1后对mBM-MSC细胞株增殖有一定抑制作用,而对细胞的分化、迁移无明显影响。第二部分高表达TGFβ1的mBM-MSC移植调控Th17/Treg失衡对ARDS小鼠肺部炎症影响及肺损伤修复作用的研究目的明确经气道内移植高表达TGFβ1的mBM-MSC对LPS诱导的ARDS小鼠肺部局部炎症的影响及对肺损伤的修复作用。方法气道内滴入LPS诱导ARDS小鼠动物模型并经气道移植等体积PBS、mBMMSC、mBM-MSC-NC及mBM-MSC-TGFβ1,分为:Control组、ARDS组、LPS+mBM-MSC组、LPS+mBM-MSC-NC组及LPS+mBM-MSC-TGFβ1组,经过不同处理后1d、3d及7d分别采集以下标本:（1）记录每组小鼠每天生存只数直至实验终点,计算7d生存率;（2）使用NIR815标记mBM-MSC并追踪离体肺内mBM-MSC的存留情况;（3）制备肺组织单细胞混悬液,流式细胞法检测小鼠肺组织中Th17及Treg表达比例及数目;（4）Western blot检测肺组织中IL-17A、IL-10及occludin的表达;（5）计算小鼠肺湿重/体重比（LWW/BW）;（6）ELISA法测定小鼠肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中总蛋白（total protein,TP）和白蛋白（albumin,ALB）含量;（7）HE染色评价小鼠肺组织病理并进行肺损伤评分;（8）q RT-PCR法检测小鼠肺组织中Collagen I及α-SMAm RNA表达,Masson染色及Ashcroft评分评价肺纤维化程度。结果（1）高表达TGFβ1的mBM-MSC移植对ARDS小鼠7d生存率无显着影响,但有升高趋势。mBM-MSC移植后7d,ARDS组小鼠生存率为38.9%,LPS+mBM-MSC和LPS+mBM-MSC-NC组小鼠生存率均为50.0%,LPS+mBMMSC-TGFβ1组小鼠生存率为61.1%,较LPS+mBM-MSC-NC组无显着统计学差异（P>0.05）,但有升高趋势。（2）高表达TGFβ1对mBM-MSC在LPS诱导的ARDS小鼠肺组织的存留无明显影响。mBM-MSC移植后1d、3d或7d,对ARDS小鼠离体肺进行近红外成像并分析荧光图像发现,LPS+mBM-MSC组、LPS+mBM-MSC-NC组及LPS+mBMMSC-TGFβ1组小鼠离体肺荧光数量无明显差异（P>0.05）。（3）高表达TGFβ1的mBM-MSC移植后可以调控ARDS小鼠肺Th17、Treg的分化,显着下调肺Th17/Treg。mBM-MSC移植后3d、7d,与Control组相比,ARDS组小鼠肺Th17/Treg比例显着升高（P<0.05）,与ARDS组相比,LPS+mBMMSC组及LPS+mBM-MSC-NC组小鼠肺Th17/Treg比例显着降低（P<0.05）,与LPS+mBM-MSC-NC组相比,LPS+mBM-MSC-TGFβ1组小鼠肺Th17/Treg比例显着降低（P<0.05）。（4）高表达TGFβ1的mBM-MSC移植后可以抑制ARDS小鼠肺促炎因子IL-17A的含量,同时促进抑炎因子IL-10的表达。mBM-MSC移植后3d、7d,与ARDS组相比,LPS+mBM-MSC组和LPS+mBM-MSC-NC组可以显着减少ARDS小鼠肺IL-17A的浓度（P<0.05）、增加IL-10的浓度（P<0.05）;与LPS+mBMMSC-NC组相比,LPS+mBM-MSC-TGFβ1组可以显着降低肺IL-17A的浓度（P<0.05）而增加肺IL-10的表达（P<0.05）。（5）高表达TGFβ1的mBM-MSC可以改善LPS诱导的ARDS小鼠肺泡通透性。mBM-MSC移植后3d、7d,与ARDS组相比,LPS+mBM-MSC组、LPS+mBMMSC-NC组及LPS+mBM-MSC-TGFβ1组LWW/BW显着降低（P<0.05）;与LPS+mBM-MSC-NC组相比,LPS+mBM-MSC-TGFβ1组小鼠LWW/BW、BALF中TP、ALB蛋白水平显着下降（P<0.05）。与LPS+mBM-MSC-NC组相比,LPS+mBM-MSC-TGFβ1组小鼠肺组织中occludin蛋白显着升高（P<0.05）。（6）高表达TGFβ1能促进mBM-MSC减轻ARDS小鼠肺组织病理损伤。mBMMSC移植后3d、7d,与LPS+mBM-MSC-NC组相比,LPS+mBM-MSC-TGFβ1组小鼠肺组织损伤程度显着减轻,病理损伤评分显着降低（P<0.05）。（7）高表达TGFβ1的mBM-MSC不增加ARDS小鼠肺纤维化。mBM-MSC移植后7d,与ARDS组比较,LPS+mBM-MSC组、LPS+mBM-MSC-NC组、LPS+mBM-MSC-TGFβ1组小鼠肺组织纤维化评分均显着降低（P<0.0001）。结论高表达TGFβ1的mBM-MSC可通过调节ARDS小鼠肺部Th17/Treg分化失衡来调控肺部炎症,并促进肺组织损伤修复。第三部分不同方式移植mBM-MSC对ARDS小鼠肺及脾CD4+T细胞分化影响目的探讨不同方式移植mBM-MSC对LPS诱导的ARDS小鼠模型肺及脾CD4+T细胞分化的影响及作用。方法分别经气道（IT）和经尾静脉（IV）移植等体积PBS、mBM-MSC、mBMMSC-NC及mBM-MSC-TGFβ1,分为:Control组、ARDS组、LPS+mBM-MSC组、LPS+mBM-MSC-NC组及LPS+mBM-MSC-TGFβ1组,经不同治疗后3d及7d分别行以下处理:（1）制备小鼠肺及脾单细胞混悬液,流式细胞法检测组织中Th17/Treg、Th1/Th2表达比例及数目;（2）使用细胞计数及瑞氏染色统计各组小鼠BALF中的细胞总数及中性粒细胞计数;（3）记录各组小鼠生存只数评价7d生存率。结果（1）移植mBM-MSC可增加小鼠肺CD4+T细胞总数,两种移植方式对小鼠肺CD4+T细胞总数无影响;静脉移植可以显着增加小鼠脾CD4+T细胞总数,静脉移植高表达TGFβ1的mBM-MSC可以进一步增加小鼠脾脏CD4+T细胞总数。在mBM-MSC移植后3d,与ARDS组相比,移植各组肺CD4+T细胞总数均显着增加（P<0.05）;与IT组相比,IV各组CD4+T细胞总数无显着变化（P>0.05）;在mBM-MSC静脉移植后3d、7d,与ARDS组相比,各组脾CD4+T细胞总数均显着增加（P<0.05）;与LPS+mBM-MSC-NC组相比,LPS+mBM-MSC-TGFβ1组小鼠脾CD4+T细胞总数显着增加（P<0.05）;与IT组相比,IV组可显着增加小鼠脾CD4+T细胞总数（P<0.05）。（2）高表达TGFβ1的mBM-MSC移植后可降低ARDS小鼠BALF内中性粒细胞计数,且经气道内移植可更好地减少BALF内中性粒细胞数量。mBM-MSC经气道或静脉移植后3d,LPS+mBM-MSC组、LPS+mBM-MSC-NC组及LPS+mBMMSC-TGFβ1组小鼠BALF内中性粒细胞计数较ARDS组显着降低（P<0.05）。在mBM-MSC移植后7d,IT组BALF内中性粒细胞计数明显低于IV组（P<0.05）。（3）气道内移植mBM-MSC可显着下调ARDS小鼠肺及脾的Th17/Treg（P<0.05）,而气道内移植高表达TGFβ1的mBM-MSC可以下调小鼠肺Th17/Treg（P<0.05）,对脾作用不显着（P>0.05）。（4）静脉移植mBM-MSC可显着下调ARDS小鼠3d肺及脾的Th17/Treg（P<0.05）,而静脉移植高表达TGFβ1的mBM-MSC可下调小鼠脾3d的Th17/Treg（P<0.05）,其移植的7d效应不显着且对肺调控不显着（P>0.05）。（5）气道内移植正常及高表达TGFβ1的mBM-MSC对ARDS小鼠肺、脾Th1/Th2无显着影响。mBM-MSC移植后3d、7d,各组间肺或脾Th1/Th2比例无明显差异（P>0.05）。（6）静脉移植正常及高表达TGFβ1的mBM-MSC后对ARDS小鼠肺、脾Th1/Th2无显着影响。mBM-MSC移植后3d、7d,各组间肺或脾Th1/Th2比例无明显差异（P>0.05）。（7）气道移植mBM-MSC显着下调ARDS小鼠肺部的Th17/Treg,而静脉移植显着下调脾Th17/Treg。mBM-MSC移植后3d或7d,与IV组相比,经气道内移植mBM-MSC的小鼠肺部Th17/Treg比例显着降低（P<0.05）。mBM-MSC移植后3d,与IT组相比,经静脉移植mBM-MSC可显着下调小鼠脾Th17/Treg比例（P<0.05）。（8）mBM-MSC不同移植方式移植对ARDS小鼠生存率无影响。在经气道或静脉移植mBM-MSC或高表达TGFβ1的mBM-MSC后7d,各组间小鼠生存率无明显统计学差异（P>0.05）。结论气道移植mBM-MSC显着增加ARDS小鼠肺CD4+T总数,降低Th17/Treg;静脉移植mBM-MSC对小鼠脾作用更为显着,高表达TGFβ1可进一步降低Th17/Treg。
马占川[8]（2020）在《MDSC分泌的Arg-1对肠炎小鼠Th17细胞的影响及橡黄素治疗机制的研究》文中研究指明研究背景与目的:在炎症性肠炎（Inflammatory bowel disease,IBD）中,多种免疫细胞和肠道菌群相互影响共同导致肠炎进展。其中,由于Th17细胞在肠炎中的关键作用成为近年来研究的热点。我们先前的研究结果表明髓系来源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSC）通过分泌 Ⅰ 型精氨酸酶（arginase-1,Arg-1）促进Th17细胞的分化,从而加重系统性红斑狼疮的进展。但是在炎症性肠炎中,MDSC与Th17细胞的关系仍不明确,阻碍了肠炎治疗的研究。此外,橡黄素在肠炎治疗中的表现出一定功效,但其作用机制还有待于进一步研究。因此,本研究以髓系细胞Arg-1敲除（ArgmyeKO）小鼠构建肠炎模型,研究MDSC对Th17细胞功能的影响,并探究橡黄素在肠炎治疗中的作用机制,为炎症性肠炎的治疗提供新的思路。研究方法:（1）3.5%葡聚糖硫酸钠喂养ArgmyeKO小鼠或野生型小鼠8～12天得到肠炎小鼠。从喂养之日起每天记录小鼠体重,对粪便硬度,粪便潜血水平进行评分,直至小鼠死亡,测量结直肠长度。以时间为横坐标评分为纵坐标绘制肠炎小鼠疾病得分曲线,以时间为横坐标存活率为纵坐标绘制肠炎小鼠生存曲线,对比两组肠炎小鼠结直肠长度,借此评估肠炎状态下Arg-1对小鼠的影响。（2）流式分选纯化肠炎小鼠脾脏MDSC,与带有CFSE标记的CD3、CD28刺激的小鼠T细胞共培养3天,流式检测评估Arg-1敲除对MDSC功能的影响。（3）在肠炎发病前后收集小鼠外周血,脾脏细胞以及派氏集合淋巴结细胞检测MDSC、Th17细胞、Treg细胞以及γδT细胞的比例。取肠炎小鼠结直肠做HE染色评估免疫细胞浸润状态和肠粘膜屏障受损情况。（4）流式检测肠炎小鼠MDSC Arg-1的分泌,检测Th17细胞IL-17A、IL-17F以及IL-22的分泌;荧光定量PCR检测肠炎小鼠结直肠组织中ACTI、IL-22、IL-23、OCLN、COX-2 的表达。（5）流式分选纯化野生型小鼠脾脏MDSC,转输给ArgmyeKO小鼠,记录小鼠体重,粪便硬度,便血程度,结直肠长度。流式检测转输MDSC后肠炎小鼠派氏集合淋巴结和肠黏膜淋巴结中Th17细胞IL-17A、IL-17F的表达水平。（6）在第0,3,5,7天给肠炎小鼠腹腔注射橡黄素,橡黄素用量按0.5 μM/g体重计算。记录小鼠体重,粪便硬度,便血程度,结直肠长度。流式检测肠炎小鼠外周血,脾脏以及肠道固有层中MDSC 比例以及Arg-1和pSTAT3的水平,分选脾脏MDSC荧光定量PCR检测ESRI、ESR2的水平,检测小鼠脾脏和外周血派氏集合淋巴结和肠黏膜淋巴结中Th17细胞和γδT细胞IL-17A、IL-17F的表达水平。荧光定量PCR检测橡黄素治疗后肠炎小鼠结直肠组织中ACT1、IL-22、IL-23、OCLN、COX-2 的表达。研究结果:（1）肠炎期间Argmye KO小鼠体重下降明显,便血严重,肠组织中大量免疫细胞浸润,死亡率高于WT组小鼠。（2）肠炎期间ArgmyeKO小鼠结直肠组织IL-17A表达水平低于WT组小鼠;IL-17F表达水平高于WT组小鼠。ArgmyeKO小鼠派氏集合淋巴结中Th17细胞IL-17A的分泌量低于WT组小鼠,而IL-17F表达量则高于WT组小鼠。（3）肠炎期间ArgmyeKO小鼠肠组织和外周血中MDSC L比例低于WT组小鼠;其中M-MDSC 比例显着低于WT组,G-MDSC 比例组间无统计学意义。脾脏MDSC 比例在组间无统计学意义。此外,ArgmyeKO小鼠MDSC三个抑制分子Arg-1,iNOS,IDO表达水平低于WT组小鼠。ArgmyeKO小鼠结直肠中ACT1和COX-2表达量高于WT组小鼠;IL-22,IL-23,OCLN表达量在ArgmyeKO小鼠结直肠中更低。（4）转输WT来源的MDSC后,ArgmyeKCO小鼠便血减轻,体重流失程度减轻,结直肠比对照组小鼠更长。流式结果显示转输MDSC后,ArgmyeKO小鼠派氏集合淋巴结和肠黏膜淋巴结中Th17细胞分泌更多的IL-17A;而IL-17F的表达量低于对照组。（5）给予橡黄素治疗后,肠炎小鼠疾病评分降低,体重降低程度减轻,结直肠长度比对照组小鼠更长。流式结果显示治疗组小鼠外周血,脾脏和肠组织中MDSC 比例明显升高。MDSC表面雌激素受体表达量上升,胞内pSTAT3水平提高,MDSC分泌更多Arg-1。（6）给予橡黄素治疗后,肠炎小鼠结直肠组织IL-17A、IL-17F表达量升高。流式结果显示派氏集合淋巴结,肠黏膜淋巴结中Th17细胞和γδ T细胞分泌更多IL-17A;而IL-17F水平也高于对照组小鼠。治疗组小鼠结直肠中ACT1,IL-22,IL-23和OCLN表达量高于对照组小鼠;COX-2表达水平下降。结论:本研究发现在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中,激活MDSC中ESR/STAT3信号通路可以上调MDSC Arg-1的分泌水平。经橡黄素治疗后,肠炎小鼠体内MDSC 比例显着升高并分泌大量Arg-1。Arg-1提高Th17细胞IL-17A的表达同时抑制IL-17F的水平,促进肠粘膜修复相关因子的表达,从而缓解肠炎。我们的数据强调了 MDSC来源的Arg-1在小鼠肠炎中对Th17细胞IL-17A和IL-17F的调节作用,揭示了橡黄素缓解肠炎发病的机制,并为肠炎的治疗提供了新的思路。
杨玉花[9]（2020）在《人皮肤角质形成细胞来源的诱导性多能干细胞的研究》文中认为背景:体细胞重编程可以产生诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）。产生的患者特异性干细胞不仅能模拟人类疾病过程,研究发病机制,还能用于药物开发和筛选,以及为个性化再生细胞疗法提供新的机会。目的:探索一种快速简便、不损伤细胞活性、能高效产生诱导性多能干细胞（Induced pluripotent stem cells,iPSCs）的方法,并评价应用该法获得的iPSCs在体外诱导为皮肤黑素细胞的可能性,为临床治疗色素性疾病提供研究基础。方法:1.分离酶消化修剪后包皮,获得表皮片,一部分做组织培养,另一部分进一步消化成细胞悬液培养。健康个体包皮来源的表皮片平铺在基质胶包被的培养板上培养3周,获得KCs,并进行KSCs标志物K15免疫荧光染色,证实表皮中KSCs的存在。胰酶消化表皮获得表皮KCs悬液,接种在预先IV型胶原包被的六孔培养板,留取15min内贴壁的细胞继续培养。培养24 h后,采用K15抗体、SOX2和OCT4抗体以及干细胞活细胞染料CDy1,进行染色。未染色孔的细胞用胚胎干细胞培养基继续培养1周,观察细胞形态,70%融合后传代培养。15 min未贴附的细胞也同步培养,作为对照研究。拔取的毛囊放入基质胶包被的培养板进行体外培养,分析毛囊KCs的OCT4和NANOG的DNA甲基化水平,与表皮中的KCs相比较。2.用携带OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四种转录因子混合的慢病毒转染富集的表皮KSCs获得iPSCs。观察和记录产生的克隆的形态和时间,采用干细胞标记物的相应抗体、碱性磷酸酶检测试剂盒、干细胞活细胞CDy1染料进行检测。分析OCT4和NANOG启动子区域的DNA甲基化水平,RT-PCR检测多潜能基因表达。采用含有不同因子的诱导培养基,诱导iPSCs分别分化成为肝细胞、脂肪细胞、神经细胞、MCs等。用携带4种转录因子的慢病毒转染毛囊KCs,观察iPSCs的形成。将iPSCs种植到SCID小鼠的后肢皮下,观察畸胎瘤的形成,获取畸胎瘤后,进行组织病理和免疫组化检测。从畸胎瘤中获取细胞,分别在KCs培养基、M254培养基和DMEM培养基中培养,观察细胞形态。3.分离酶消化修剪后包皮获得表皮片,通过不同培养方法分别获得KCs、MCs、成纤维细胞（fibroblasts,FBs）。用携带OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC四种转录因子混合的慢病毒分别转染KCs、MCs并获得相应的iPSCs,FBs通过长时间胰酶消化获得Muse细胞。透射电镜观察人皮肤KCs、MCs及重编程产生的iPSCs和Muse细胞的超微结构。结果:1.表皮片贴附在基质胶包被的培养板底部,产生外向性生长的KCs,中心区域细胞体积小,表皮片外缘的细胞体积逐渐变大,细胞呈多边形。K15抗体染色显示,皮片中心区域阳性细胞密集,周边区阳性数目减少,证实KSCs的存在和大致分布。用胰酶消化未培养的表皮片,获得细胞悬液,这些细胞接种到IV型胶原包被的培养板后,15 min内大约有20～30%的细胞贴壁。快速贴壁的细胞体积较小。24 h后,细胞黏附牢固,部分开始增殖,K15染色和干细胞活细胞染料CDy1染色,明显阳性。而针对干性特异性标志物SOX2和OCT4的染色呈弱阳性。用胚胎干细胞培养基继续培养快速贴壁细胞1周,可见大小不等的克隆形成。相比之下,同步培养的慢贴壁细胞也有克隆形成,但比快速贴壁细胞的克隆小。拔取的毛囊很容易贴附到基质胶上,从毛外根鞘处爬出很多KCs,其中许多呈克隆样生长。传代培养的毛囊KCs和表皮KCs的SOX2和OCT4的甲基化水平相近。2.获得的表皮KSCs传代培养后,进行细胞转染。最早在第7天出现第一个克隆,在10天可见很多典型的iPSCs。干细胞特异性标记物SOX2、OCT4、NANOG和SSEA3染色阳性。干细胞活细胞CDy1染料呈阳性,碱性磷酸酶染色细胞呈紫红色。与亲本KCs相比,获得的iPSCs显示OCT4和NANOG启动子DNA去甲基化。RTPCR检测结果示:iPSCs中SOX2、OCT4、NANOG基因表达水平高于亲本的KCs,而亲本KCs的KLF4基因表达水平高于iPSCs。拟胚体在明胶包被的培养板生长良好,自分化培养可出现外胚层、中胚层和内胚层细胞。用不同分化培养基,诱导iPSCs逐渐分化成为肝细胞、脂肪细胞、神经细胞、MCs,特异性染色相应为AFP（+）、油红O染色（+）、βIII-微管蛋白（+）、神经丝（+）、HMB45（+）和TYR（+）。用四种因子转染毛囊KCs,同样可获得iPSCs。将产生的iPSCs注射到4周龄SCID小鼠后肢皮下,第8周肿瘤长到足够大小,切取畸胎瘤组织进行病理和免疫病理学检查。结果显示:Vimentin（+）、CK（pan）（+）和KI-67（+）阳性,GFAP和AFP染色为阴性。从畸胎瘤组织获得的单细胞,在KCs培养基中生长3周细胞小而圆体,核浆比大,细胞荧光仍然很强,培养6周后细胞排列紧密,细胞活力好,增殖快速。在DMEM培养基中生长3周时细胞主要是圆形,部分有突起,培养6周的细胞,细胞显出扁平形,类似纤维细胞的形态。在M254培养基中生长3周以细小圆形细胞为主,可见部分细胞有少量突触样结构,培养6周的细胞显示出细长的树突,类似MCs的形态。3.透射电镜显示KCs胞体大致呈方形,细胞核大,有一个核仁。MCs呈椭圆形,并且细胞核染色质聚集性差,胞质中可见膜包裹的黑素小体。MCs和KCs重编程产生的iPSCs的超微结构大致相同,细胞呈圆形,具有多个核仁,细胞质稀少,核浆比高,可见发育不良的内质网和高尔基复合体。FBs胞体呈梭型或不规则形,细胞核呈椭圆形或圆形,染色质丰富,细胞器较多。Muse细胞核质比高,细胞核有较多突起,核仁体积较大,细胞质内细胞器较少,相对幼稚。结论:1.KCs混悬液接种在IV型胶原包被的培养板中,15 min内贴壁的细胞富含KSCs。拔取毛发可获得大量的KCs,与表皮来源的KCs类似,包含大量的KSCs。2.用携带四种转录因子的慢病毒转染表皮KSCs,可高效率和较短时间出现iPSCs。这些细胞具有多能性,并可被诱导分化成为不同类型细胞。拔取毛发获的KCs可被重编产生iPSCs。iPSCs接种到SCID小鼠皮下,可产生肿瘤。畸胎瘤细胞在不同培养基中生长呈现不同形态。3.透射电镜显示KCs重编程产生得iPSCs的超微结构与MCs来源的iPSCs超微结构以及Muse细胞的超微结构近似,核浆比高,多个核仁,细胞浆中细胞器较少,且发育不成熟。
赵芸[10]（2020）在《GDF11通过YME1L介导的OPA1动态平衡提高间充质干细胞治疗心肌梗死疗效》文中进行了进一步梳理研究背景:急性心肌梗死是世界范围内死亡率最高、最危及生命的疾病之一。间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是治疗心肌梗死最有前途的细胞类型之一,有临床前试验支持供体细胞越接近心脏表型修复心脏功能的疗效越好。然而,无论MSCs的来源如何,移植到心梗周边区的MSCs因心梗后恶劣环境而存活率很低,限制了MSCs在心梗治疗中的应用。转化生长因子11（growth differentiation factor 11,GDF11）是转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）超家族中的一员,已被证实可以在缺血/再灌注模型中刺激血管祖细胞的增殖和血管生成,可通过调控线粒体生成或线粒体动力学参与骨骼肌细胞线粒体质量控制。而在心肌损伤治疗中GDF11是否可提高心脏来源的MSCs活性及治疗疗效有待进一步研究。线粒体完整性的维持在细胞抵抗凋亡中起着重要的作用,线粒体功能障碍导致分裂激活和融合失活。因此我们推测缺氧条件下GDF11可能通过维持线粒体动态稳定及完整性对MSCs起到抗凋亡保护作用。研究目的:在体内和体外模型中验证缺氧条件下GDF11是否通过改善线粒体形态和功能对MSCs起到保护作用并提高其治疗疗效,并进一步探索作用机制。研究方法及结果:第一部分:本研究通过构建C57BL/6J小鼠心肌梗死（Myocardiac Infarction,MI）模型,明确过表达GDF11的慢病毒感染的MSCs(MSCs LV-GDF11)对心脏保护作用的影响。心脏切片荧光染色GFP及心脏RT-PCR均显示,心梗后3天,与MSCs LV组相比,MSCs LV-GDF11组细胞存活率明显提高。心梗后28天进行心脏超声及天狼星红染色,发现两组均较对照DMEM组小鼠心功能提高和纤维化程度降低,且MSCs LV-GDF11组较MSCs LV组有明显缓解。心梗后28天检测CD31和α-SMA等新生血管指标发现MSCs LV-GDF11组较对照组血管新生明显增加。体外实验使用重组因子r GDF11预处理MSCs 24小时(MSCsr GDF11)或过表达GDF11后暴露于缺氧缺血清环境中48小时构建凋亡模型。TUNEL染色和Western Blot显示GDF11处理后的MSCs可明显降低凋亡率。此外,收集MSCs经r GDF11或过表达GDF11后的上清,处理HUVECs后发现管腔形成增多,H9C2的细胞凋亡减少。第二部分:透射电镜发现缺氧条件下MSCsr GDF11组线粒体呈细长的管状形态,线粒体嵴致密、规则,而对照组线粒体呈短小点状,线粒体嵴消失。而且,MSCsr GDF11组OCR检测的基础氧耗和最大氧耗增加,细胞ATP产能增加,TMRM检测的线粒体膜电位增加。同时发现MSCsr GDF11组中调控线粒体内膜融合与分裂的因子Optic atrophy1（OPA1）蛋白水平明显增加。OPA1分长亚型（L-OPA1）和短亚型（S-OPA1）,两者功能截然相反,L-OPA1调控线粒体内膜融合,而S-OPA1调控线粒体内膜分裂。在我们的研究中,缺氧条件下GDF11处理的MSCs中L-OPA1明显增多,与电镜观察结果一致。通过si-RNA对细胞OPA1进行特异性基因沉默,证实了GDF11对MSCs的抗凋亡保护作用是依赖于OPA1的。第三部分:进一步分析调控OPA1的因子后我们发现,GDF11处理MSCs后,Smad2/3磷酸化激活,YME1L增加,对线粒体形态的维持具有重要作用。而当ALK5或Smad2/3被抑制,或si-RNA下调YME1L后,GDF11的抗凋亡作用被抑制,线粒体形态和功能不能被改善,L-OPA1不再增多。结论:GDF11可通过激活TGF-β-Smad2/3通路,上调YME1L表达后促进L-OPA1的聚集,促使线粒体融合而保护线粒体形态的完整及功能的维持,对MSCs起到抗凋亡保护作用,从而优化移植MSCs治疗心肌梗死的疗效。
二、转化生长因子β_1基因修饰的小鼠树突状细胞在移植体内的迁移与生存(摘要)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、转化生长因子β_1基因修饰的小鼠树突状细胞在移植体内的迁移与生存(摘要)（论文提纲范文）
（1）小鼠Kupffer细胞的转分化研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩写词对照表 |
| 前言 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 肝脏概述 |
| 1.2 肝脏纤维化 |
| 1.2.1 肝细胞的死亡与凋亡 |
| 1.2.2 肝纤维化发展 |
| 1.2.3 肝纤维化中肌成纤维细胞的组成 |
| 1.3 KCs在肝脏学中的研究进展 |
| 1.3.1 KCs的起源 |
| 1.3.2 KCs在肝脏结构中的定位 |
| 1.3.3 KCs的免疫作用 |
| 1.3.4 KCs的异质性 |
| 1.3.5 KCs的可塑性 |
| 1.3.6 KCs与肝脏疾病 |
| 1.4 细胞谱系追踪技术 |
| 1.4.1 细胞谱系追踪技术的基本原理 |
| 1.4.2 细胞谱系追踪的标记方法 |
| 1.4.3 细胞谱系追踪在肝脏研究中的应用 |
| 1.4.4 细胞谱系追踪的未来 |
| 1.6 细胞的转分化 |
| 1.6.1 细胞转分化概述 |
| 1.6.2 自然发生的转分化 |
| 1.6.3 实验性转分化 |
| 1.6.4 肝脏中的转分化 |
| 1.6.5 转分化应用于再生医学的优点和局限性 |
| 第2章 KCs在体外非实质细胞培养过程中的形态和表型变化研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 主要实验耗材与设备 |
| 2.2.4 主要实验试剂配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 非实质细胞分离 |
| 2.3.2 收集培养的非实质细胞 |
| 2.3.3 多聚体免疫共沉淀 |
| 2.3.4 RNA提取 |
| 2.3.5 基因表达分析 |
| 2.3.6 免疫荧光成像 |
| 2.3.7 统计学方法 |
| 2.4 结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 精密肝切片培养实验过程中,KCs特征性基因表达下调 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验试剂 |
| 3.2.3 主要实验耗材与设备 |
| 3.2.4 主要实验试剂配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 在精密肝切片培养和体外非实质细胞培养实验中,KCs中纤维化相关基因表达分析研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 主要实验试剂 |
| 4.2.3 主要实验耗材与设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.4 结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 KCs在培养过程中转录因子基因表达研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.2.1 实验动物 |
| 5.2.2 实验试剂 |
| 5.2.3 主要实验耗材与设备 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.4 结果 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 KCs与肝片中胶原沉积的初步探索研究 |
| 6.1 引言 |
| 6.1.1 实验动物 |
| 6.1.2 实验试剂 |
| 6.1.3 主要实验耗材与设备 |
| 6.1.4 主要实验试剂配制 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 KCs耗竭 |
| 6.2.2 肝片培养、基因分析等方法同前所述 |
| 6.3 结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 结论 |
| 本实验创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（2）人羊膜间充质干细胞抑制同种异体小鼠心脏移植免疫排斥损伤作用microRNA表达初步探究（论文提纲范文）
| 中英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 间充质干细胞在心脏移植免疫耐受诱导中的重要作用 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（3）人乳牙牙髓干细胞治疗STZ诱导糖尿病大鼠的疗效观察及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 人乳牙牙髓干细胞经不同输注途径治疗糖尿病大鼠的疗效观察 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 第二部分 人乳牙牙髓干细胞治疗不同血糖水平糖尿病大鼠的疗效观察 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 第三部分 人乳牙牙髓干细胞治疗糖尿病大鼠机制初探 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 第四部分 SHED改善STZ诱导胰岛RIN-m5F细胞损伤的效应观察及机制探究 |
| 一、实验材料 |
| 二、实验方法 |
| 三、统计学分析 |
| 四、实验结果 |
| 五、讨论 |
| 全文小结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 间充质干细胞治疗1型糖尿病的机制及研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文和参加科研工作情况说明 |
| 致谢 |
（4）黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备 |
| 材料和方法 |
| 1.标本来源 |
| 2.材料及试剂 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1. MUC1在人乳腺癌组织中表达情况 |
| 2.MUC1在乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞中的表达 |
| 3.过表达MUC1慢病毒质粒的构建结果 |
| 4.分离培养DC的形态学特征及表型分子表达 |
| 5.转染效率测定 |
| 6.MUC1-DC中MUC1 mRNA和蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MUC1-DC免疫功能的体外研究 |
| 材料和方法 |
| 1.试剂与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.MCU1-DC诱导CTL条件的优化 |
| 2.MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-ɑ的含量 |
| 3.MUC1-DC对CTL杀伤活性的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用 |
| 材料和方法 |
| 1.动物来源 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.慢病毒转染条件优化 |
| 2.光学分子成像活体检测MUC1-DC对裸鼠乳腺癌移植瘤的抑制作用 |
| 3. MUC1-DC对裸鼠移植瘤体积和重量的影响 |
| 4.MUC1-DC对裸鼠移植瘤Caspase3表达的影响 |
| 5.TUNEL法检测裸鼠移植瘤中的细胞凋亡率 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基因修饰的树突状细胞在抗肿瘤免疫中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 博士在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（5）转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用（论文提纲范文）
| 提要 |
| 中文摘要 |
| abstract |
| 文章缩略词表 |
| 引言 |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 TGF-β的概述 |
| 1.1.1 TGF-β的来源 |
| 1.1.2 TGF-β的表达 |
| 1.1.3 TGF-β的结构 |
| 1.1.4 TGF-β的信号通路 |
| 1.2 TGF-β的生物学活性 |
| 1.2.1 TGF-β对胚胎发育的调节 |
| 1.2.2 TGF-β对免疫应答的负向调节 |
| 1.2.3 TGF-β2对肿瘤的生长,侵袭及迁移的促进作用 |
| 1.2.4 TGF-β对组织损伤修复、创面愈合、瘢痕增生的促进作用及炎症反应的抑制作用 |
| 1.2.5 TGF-β2对纤维化的调节作用 |
| 1.2.6 TGF-β对肿瘤的抑制作用 |
| 1.3 靶向TGF-β2的药物 |
| 1.3.1 TGF-β2的反义寡核苷酸 |
| 1.3.2 TGF-β2的micro RNA |
| 1.3.3 TGF-β2的sh RNA |
| 1.3.4 TGF-β2的抗体 |
| 1.3.5 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
| 1.3.6 TGF-β2的反义基因修饰的同种异体肿瘤疫苗 |
| 1.3.7 TGF-β2的抑制剂 |
| 1.4 疫苗佐剂的概述及其研究进展 |
| 1.4.1 增强第一信号的佐剂 |
| 1.4.2 增强第二信号的佐剂 |
| 1.4.3 增强第三信号的佐剂 |
| 1.4.4 抑制T细胞抑制信号的佐剂 |
| 1.4.5 改善肿瘤免疫抑制微环境的佐剂 |
| 1.4.6 病毒载体佐剂 |
| 1.4.7 其他佐剂 |
| 1.4.8 多佐剂肿瘤疫苗 |
| 1.4.9 佐剂的接种途径 |
| 1.4.10 佐剂发挥作用的机制 |
| 1.5 RNA靶向性寡核苷酸的研究进展 |
| 1.5.1 反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide) |
| 1.5.2 siRNA |
| 1.5.3 micro RNA |
| 1.5.4 反义寡核苷酸的化学修饰方法 |
| 第2章 材料方法 |
| 2.1 ODN及引物 |
| 2.2 实验试剂,仪器与耗材 |
| 2.3 细胞与细胞系 |
| 2.4 实验动物 |
| 2.5 IAV的扩增 |
| 2.6 IAV TCID50 的测定 |
| 2.7 IAV血凝效价的测定 |
| 2.8 聚合酶链式反应(RT-PCR) |
| 2.9 小鼠PBMC、脾脏及淋巴结单细胞悬液的制备 |
| 2.10 TIO对 TGF-β2 m RNA表达的抑制实验 |
| 2.11 流式细胞术(Flow cytometry) |
| 2.12 蛋白免疫印迹实验(Western Blotting analysis) |
| 2.13 免疫荧光技术 |
| 2.14 TIO在小鼠器官和组织中的分布检测 |
| 2.15 小鼠的免疫 |
| 2.15.1 疫苗的制备 |
| 2.15.2 小鼠的免疫和血清的收集 |
| 2.16 酶联免疫吸附试验(ELISA) |
| 2.17 流感病毒攻毒实验 |
| 2.18 小鼠肺组织的病理学观察 |
| 2.19 脑胶质瘤细胞裂解物(TCL)的制备 |
| 2.20 GL261脑胶质瘤原位模型的建立 |
| 2.21 脑胶质瘤预防模型的建立 |
| 2.22 脑胶质瘤治疗模型的建立 |
| 2.23 肿瘤周围浸润的炎性细胞的检测 |
| 2.24 肿瘤组织病理分析 |
| 2.25 胃癌背部移植瘤模型的建立 |
| 2.26 统计学分析 |
| 第3章 研究结果 |
| 3.1 靶向TGF-β2的反义寡核苷酸的设计与筛选 |
| 3.2 TIOs对 RAW264.7 细胞,U-937 细胞及CAL-1 细胞表达TGF-β2的影响 |
| 3.2.1 TIOs对 IL-4 诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 m RNA表达的影响 |
| 3.2.2 TIOs对 IL-4诱导的RAW264.7细胞Arg1及TNF-αmRNA表达的影响 |
| 3.2.3 TIOs对 LPS诱导的RAW264.7 细胞TGF-β2 mRNA表达的影响 |
| 3.2.4 TIOs对 LPS诱导的U-937 细胞表达TGF-β2 mRNA的影响 |
| 3.2.5 TIOs对甲型流感病毒(IAV)诱导的CAL-1 细胞TGF-β2mRNA表达的影响 |
| 3.2.6 TIOs对 IL-4/LPS诱导的RAW264.7/U-937细胞表达TGF-β2蛋白的影响 |
| 3.3 TIO3在细胞和组织中的分布 |
| 3.4 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
| 3.4.1 TIOs对微生物疫苗诱导的抗体产生水平的影响 |
| 3.4.2 TIO3对流感病毒疫苗诱导的抗流感病毒效率的增强作用 |
| 3.4.3 TIO1和TIO3 的微生物疫苗佐剂效应的可能机制 |
| 3.4.4 TIOs的微生物疫苗佐剂的安全性评价 |
| 3.5 TIO的胶质瘤疫苗的佐剂作用 |
| 3.5.1 TIOs为佐剂的胶质瘤细胞裂解物疫苗对原位接种脑胶质瘤预防模型小鼠的影响 |
| 3.5.2 TIOs为佐剂的胶质瘤疫苗对原位接种胶质瘤治疗模型小鼠生存期的影响 |
| 3.6 单独应用TIO3的抗胶质瘤及抗胃癌作用 |
| 3.6.1 单独应用TIO3对脑胶质瘤原位移植瘤模型小鼠生存期的影响 |
| 3.6.2 单独应用TIO3对胃癌背部移植瘤模型小鼠体重、肿瘤大小及生存期的影响 |
| 3.6.3 单独应用TIO3对胃癌细胞腹腔种植模型小鼠生存期的影响 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 TIOs的微生物疫苗佐剂效应 |
| 4.1.1 TIO3对CD4~+T细胞表面s TGF-β2 表达的抑制作用 |
| 4.1.2 TIO3 对 CD19~+ B 细胞表面 sTGF-β2 表达的抑制作用 |
| 4.1.3 TIO3的药效动力学分析 |
| 4.1.4 TIO1,TIO2及TIO3 的不同功效的机理分析 |
| 4.1.5 TIO3用于微生物疫苗佐剂的副作用分析 |
| 4.1.6 TIO3用于微生物疫苗佐剂的可行性分析 |
| 4.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应 |
| 4.2.1 TIO3 对胶质瘤细胞MHC I分子表达的上调作用 |
| 4.2.2 TIO3的胶质瘤疫苗佐剂效应的机理分析 |
| 4.3 单独应用TIO3的抗胶质瘤和抗胃癌作用 |
| 4.4 总结和展望 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 附录1 |
| 附录2 The College of Basic Medical Sciences of Jilin University Ethics Committee Approval Form |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）免疫与炎症反应在脑卒中动物模型中的影响与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstracts |
| 缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 第一部分 PTx引发的炎性反应对脑卒中动物模型的影响与机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 各组小鼠神经功能损伤情况 |
| 2.2 各组小鼠中枢免疫细胞浸润分布 |
| 2.3 各组小鼠脑氧化应激对比 |
| 2.4 各组小鼠血脑屏障染色 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 第二部分 2型固有淋巴细胞对缺血性脑卒中动物模型的影响与机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 缺血性脑卒中后小鼠脑与外周ILC2数量变化 |
| 2.2 ILC2对缺血性脑卒中小鼠神经功能与脑梗死体积的影响 |
| 2.3 缺血性脑卒中后第3天小鼠少突胶质细胞是IL-33的主要来源 |
| 2.4 IL-33能够扩增ILC2细胞数量,减少缺血性脑卒中小鼠神经功能缺损与脑梗死体积 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 脑血管病的发病机制、诊断与治疗方面的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）间充质干细胞对旁分泌TGFβ1调控Th17/Treg影响ARDS炎症反应及免疫功能的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 文献综述 间充质干细胞对 CD4~+T 细胞调控作用在 ARDS 中的研究进展 |
| References |
| 主要实验仪器与试剂 |
| 一、实验动物 |
| 二、实验细胞 |
| 三、主要仪器 |
| 四、主要试剂 |
| 五、主要试剂配制 |
| 第一部分 高表达 TGFβ1 的慢病毒质粒转染对小鼠骨髓来源的间充质干细胞体外增殖、分化及迁移功能的影响 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 高表达TGFβ1 的mBM-MSC移植调控Th17/Treg失衡对ARDS小鼠肺部炎症影响及肺损伤修复作用 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第三部分不同方式移植mBM-MSC对ARDS小鼠肺及脾CD4+T细胞分化影响 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 已发表论文 |
| 基金资助 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（8）MDSC分泌的Arg-1对肠炎小鼠Th17细胞的影响及橡黄素治疗机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 炎症性肠炎 |
| 1.2.1 炎症性肠炎概述 |
| 1.2.2 炎症性肠炎的机制 |
| 1.2 Th17细胞 |
| 1.2.1 Th17细胞概述 |
| 1.2.2 Th17细胞的起源和发育 |
| 1.2.3 Th17细胞的可塑性 |
| 1.2.4 Th17细胞在IBD中的功能 |
| 1.3 调节性免疫细胞概述 |
| 1.3.1 调节性T细胞 |
| 1.3.2 调节性B细胞 |
| 1.3.3 调节性红细胞 |
| 1.3.4 调节性的髓系细胞 |
| 1.4 MDSC与自身免疫病 |
| 1.4.1 MDSC的起源 |
| 1.4.2 MDSC的功能 |
| 1.4.3 MDSC扩增的调控机制 |
| 1.4.4 MDSC功能的调控机制 |
| 1.4.5 MDSC与自身免疫病 |
| 1.4.6 MDSC在炎症性肠炎中的作用 |
| 1.5 自身免疫病中MDSC与Th17细胞的关系 |
| 1.6 炎症性肠病中MDSC和Th17细胞的展望 |
| 第2章 肠炎小鼠中MDSC影响Th17细胞IL-17A和IL-17F的表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验材料和试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Arg~(myeKO)小鼠的构建 |
| 2.3.2 炎症性肠炎小鼠模型的构建 |
| 2.3.3 肠炎分级评分标准 |
| 2.3.4 外周血单个核细胞的分离 |
| 2.3.5 脾脏单细胞悬液制备 |
| 2.3.6 小肠派氏集合淋巴结细胞分离 |
| 2.3.7 肠系膜淋巴结细胞分离 |
| 2.3.8 结直肠固有层淋巴结细胞分离 |
| 2.3.9 体外刺激PBMC实验 |
| 2.3.10 细胞表面染色 |
| 2.3.11 细胞内染色 |
| 2.3.12 抑制实验 |
| 2.3.13 抑制实验检测 |
| 2.3.14 荧光定量PCR |
| 2.3.15 转输实验 |
| 2.3.16 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 肠炎条件下Arg~(myeKO)小鼠Th17细胞IL-17A表达降低,IL-17F表达升高 |
| 2.4.2 肠炎条件下Arg~(myKO)小鼠MDSC比例下降 |
| 2.4.3 肠炎条件下Arg~(myeKO)小鼠肠组织中保护性因子表达下调 |
| 2.4.4 转输WT小鼠来源的MDSC缓解Arg~(myeKO)小鼠肠炎 |
| 2.5 实验讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 橡黄素通过ESR/STAT3通路促进MDSC存活 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 数据库 |
| 3.2.2 软件 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.2.4 试剂耗材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 Arg~(myeKO)小鼠的构建 |
| 3.3.2 体外实验橡黄素处理髓系细胞 |
| 3.3.3 橡黄素治疗肠炎小鼠 |
| 3.3.4 肠炎分级评分标准 |
| 3.3.5 橡黄素互作基因的预测 |
| 3.3.6 基因富集和通路分析 |
| 3.3.7 小鼠骨髓细胞的分离 |
| 3.3.8 荷瘤小鼠脾脏细胞的分离 |
| 3.3.9 人脐带血单个核细胞的分离 |
| 3.3.10 细胞表面染色 |
| 3.3.11 细胞内染色 |
| 3.3.12 荧光定量PCR |
| 3.3.13 数据分析及统计方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 MDSC雌激素受体的激活通过STAT3通路上调Arg-1的分泌 |
| 3.4.2 扩增的MDSC减轻DSS诱导的小鼠肠炎 |
| 3.5 实验讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 在肠炎小鼠中橡黄素通过MDSC产生的Arg-1调节Th17细胞因子分泌 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验材料和试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Arg~(myeKO)小鼠的构建 |
| 4.3.2 橡黄素治疗实验 |
| 4.3.3 外周血单个核细胞的分离 |
| 4.3.4 脾脏单细胞悬液制备 |
| 4.3.5 小肠派氏集合淋巴结细胞分离 |
| 4.3.6 肠系膜淋巴结细胞分离 |
| 4.3.7 结直肠固有层淋巴结细胞分离 |
| 4.3.8 体外刺激PBMC实验 |
| 4.3.9 细胞表面染色 |
| 4.3.10 细胞内染色 |
| 4.3.11 荧光定量PCR |
| 4.3.12 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 橡黄素通过上调ESR/pSTAT3促进MDSC促进Arg-1分泌 |
| 4.4.2 MDSC分泌的Arg-1促进Th17细胞IL-17A的表达,抑制IL-17F的水平 |
| 4.4.3 MDSC来源的Arg-1促进小鼠肠组织中保护性因子表达下调 |
| 4.5 实验讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（9）人皮肤角质形成细胞来源的诱导性多能干细胞的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 研究背景 |
| 参考文献 |
| 第一章 富含干细胞的人皮肤角质形成细胞的获取 |
| 一、试剂和材料 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 第二章 人皮肤角质形成细胞重编程产生诱导性多能干细胞 |
| 一、试剂、材料和使用设备 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 诱导性多能干细胞超微结构的对比研究 |
| 一、试剂材料和仪器 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 五、小结 |
| 参考文献 |
| 总结和展望 |
| 第四章 综述 |
| 综述 1 表皮干细胞增殖和分化机制研究 |
| 参考文献 |
| 综述 2 皮肤干细胞在皮肤再生及创伤修复中的作用 |
| 参考文献 |
| 综述 3 人皮肤源性多潜能干细胞的研究现状和应用前景 |
| 参考文献 |
| 负责科研项目 |
| 参与科研项目 |
| 读博期间发表的论文 |
| 缩写词表 |
| 致谢 |
（10）GDF11通过YME1L介导的OPA1动态平衡提高间充质干细胞治疗心肌梗死疗效（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 中英文缩略词 |
| 1 引言 |
| 2 实验材料 |
| 2.1 实验动物 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验试剂 |
| 3 实验方法 |
| 3.1 细胞分离和培养 |
| 3.2 GDF11慢病毒的构建和转染 |
| 3.3 siRNA干扰实验 |
| 3.4 C57BL/6J小鼠心肌梗死模型建立 |
| 3.5 小鼠心脏超声 |
| 3.6 组织学分析 |
| 3.7 细胞学检测 |
| 3.8 实时荧光定量PCR |
| 3.9 免疫印迹实验-Western Blot |
| 3.10 透射电镜样本处理 |
| 3.11 细胞呼吸功能检测 |
| 3.12 线粒体膜电位的测定 |
| 3.13 细胞线粒体的分离 |
| 3.14 细胞ATP测定 |
| 3.15 染色质免疫共沉淀(CHIP)及荧光定量PCR |
| 3.16 统计学方法 |
| 4 结果 |
| 第一部分 在体内和体外模型中验证GDF11对MSCs活性的影响 |
| 第二部分 GDF11对MSCs的线粒体形态及功能的影响 |
| 第三部分 GDF11对MSCs抗凋亡保护作用的机制研究 |
| 5 讨论 |
| 6 论文的创新点和不足 |
| 6.1 本论文的创新点 |
| 6.2 本论文的不足 |
| 参考文献 |
| 综述 间充质干细胞治疗心肌梗死及改善治疗疗效的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 作者简历及在学期间所取得的科研成果 |
四、转化生长因子β_1基因修饰的小鼠树突状细胞在移植体内的迁移与生存(摘要)（论文参考文献）
- [1]小鼠Kupffer细胞的转分化研究[D]. 李昕宇. 吉林大学, 2021(01)
- [2]人羊膜间充质干细胞抑制同种异体小鼠心脏移植免疫排斥损伤作用microRNA表达初步探究[D]. 毛鑫. 遵义医科大学, 2021(01)
- [3]人乳牙牙髓干细胞治疗STZ诱导糖尿病大鼠的疗效观察及机制研究[D]. 谢俊豪. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [4]黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究[D]. 尹良伟. 大连医科大学, 2021(01)
- [5]转化生长因子-β2反义寡核苷酸的微生物疫苗及肿瘤疫苗的佐剂作用[D]. 涂丽裙. 吉林大学, 2020(03)
- [6]免疫与炎症反应在脑卒中动物模型中的影响与机制研究[D]. 赵慧. 山西医科大学, 2020(01)
- [7]间充质干细胞对旁分泌TGFβ1调控Th17/Treg影响ARDS炎症反应及免疫功能的研究[D]. 陈剑潇. 东南大学, 2020
- [8]MDSC分泌的Arg-1对肠炎小鼠Th17细胞的影响及橡黄素治疗机制的研究[D]. 马占川. 吉林大学, 2020(08)
- [9]人皮肤角质形成细胞来源的诱导性多能干细胞的研究[D]. 杨玉花. 苏州大学, 2020(06)
- [10]GDF11通过YME1L介导的OPA1动态平衡提高间充质干细胞治疗心肌梗死疗效[D]. 赵芸. 浙江大学, 2020(01)
标签：树突状细胞论文; 转化生长因子-β论文; 细胞分化论文; 细胞生长因子论文; 分泌蛋白论文;