一、IL-4、IL-12、IL-6/STAT/SOCS途径对Th细胞分化调节机制的研究进展（论文文献综述）
冯婧,李新胜,侯振江[1]（2021）在《Th17细胞分化与调控的研究进展》文中研究说明Th17细胞是一种不同于Th1和Th2细胞的新型第三类效应性CD4+T细胞亚群,以特异性分泌高水平的IL-17为特征,后者作为一种炎症介质,通过与IL-17受体的结合,以及与IL-6、TGF-β等细胞因子和Th17细胞的特异性转录因子维甲酸相关孤儿受体-γt的相互作用,引发包括JAK/STAT等途径在内的一系列信号传递,从而在免疫应答中发挥重要作用,介导机体炎症反应和自身免疫性疾病的发生、发展过程。近年来,人们对Th17细胞的分化及其调控机制开展了深入研究。本文就影响Th17细胞分化的细胞因子、转录因子和信号传导及转录激活因子通路调控的最新研究成果进行综述,以加深对Th17细胞分化和免疫功能调控机制的认识,进一步拓宽研究视野和思路。
韩超[2]（2021）在《Th17细胞中SOX-5介导RORγt基因新的增强子RORCE2与启动子相互作用的机制研究》文中指出Th17细胞是一种CD4+辅助性T细胞（CD4+Th）的亚群,表达细胞因子IL-17A,以及IL-17F、IL-26、IL-22、IL-21和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α,TNF-α）等,这些细胞因子尤其是IL-17A是Th17细胞发挥各种生物学功能的基础。Th17细胞在多种炎症相关的疾病中发挥着非常重要的作用,例如多发性硬化（multiple sclerosis,MS）、实验性自身免疫性脑炎（Experimental autoimmune encephalitis,EAE）、类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）、系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）、肝炎（Hepatitis）、以及结肠炎（colitis）等等。因此,深入研究Th17细胞的内在分子机制对于多种炎症相关疾病的发病原理和相关防治措施的建立都具有非常重大的意义。维甲酸受体相关孤儿受体（Retinoic acid receptor-related orphan receptor-γ,RORγ,又称为RORC）基因可以编码两种不同的异构体,RORγ1和RORγ2（也称为RORγt）。目前众多的研究表明,在CD4+Th免疫细胞亚群中,RORγt仅表达于Th17细胞中,是Th17细胞特异性的关键转录因子（transcription factor,TF）。在体外实验中证实,敲除RORγt基因的CD4+T细胞中的IL-17A的表达量会迅速下降;而通过基因转染的方式过表达RORγt可恢复表达IL-17A。缺失RORγt基因小鼠的Th17细胞会发生缺陷,在构建的EAE疾病模型中,RORγt基因缺失小鼠更难发病,发病时间会延迟,疾病程度会减轻。由此可见,RORγt是Th17细胞分化、发育和发挥功能的关键转录因子。RORγt可以控制许多调控Th17细胞分化的关键基因,因此,对于RORγt基因自身转录调控机制的研究就显得尤为重要。近年来的研究已经明确RORγt基因的启动子是位于转录起始位点（transcriptional start site,TSS）-400～+151 bp的区域,但是关于RORγt基因增强子却报道不多。本课题围绕RORγt基因增强子的发现和鉴定,以及其具体的作用机制进行了深入的研究,并得到了以下三方面的结论:1.增强子RORCE2通过增强RORγt的表达促进Th17细胞的分化。我们首先利用表观遗传学方法通过对增强子相关的组蛋白修饰H3K4me2的Ch IP-seq数据进行分析,发现在小鼠RORC基因上游存在一段Th17细胞特异的1.5kb左右的候选增强子序列RORCE2;并在人的Th17细胞中RORC基因相同的位点发现了还高度表达与增强子活化相关的H3K4me1和H3K27ac表观修饰标志;体外双荧光素酶实验证实了RORCE2对RORγt启动子活性有显着地增强作用;在小鼠体内分选的Th17细胞中,利用染色质免疫共沉淀（Chromatin Immnoprecipitation,Ch IP）-q PCR进一步证实该序列还发生了与增强子活化密切相关的其他组蛋白修饰,例如H3K4me1、H3K27ac和H3ac;基于CRISPR/Cas9技术制备RORCE2敲除的小鼠,利用RT-q PCR和流式细胞技术（Flow cytometry,FCM）证实RORCE2的缺失严重影响RORγt和IL-17A的表达;在体外诱导分化模型中,通过FCM进一步发现RORCE2的缺失影响Th17细胞的分化;利用RORCE-/-和WT小鼠建立EAE疾病模型发现RORCE2的缺失显着降低了EAE疾病的严重程度。这些结果都提示了Th17细胞中RORCE2是RORγt基因的潜在增强子·,可以通过增强RORγt的表达促进Th17细胞的分化。2.SOX-5介导增强子RORCE2与RORγt基因启动子相互作用对Th17细胞的分化至关重要。增强子对于目的基因的调节依赖于染色质环（loop）的形成,其具体机制是:首先是谱系特异性转录因子与增强子结合并开放该染色质区域,然后招募其他的转录因子协同活化该增强子区域,使其发生特定的组蛋白修饰并最终被彻底激活,进而与同源基因的启动子相互作用发挥增强子的功能。为了进一步探究Th17细胞中增强子RORCE2是如何发挥作用的?我们做了如下实验:（1）首先我们发现在RORCE序列中存在8个限制性内切酶Nla III的酶切位点（TS1-8）;（2）通过染色体构象捕获技术结合定量PCR的方法（Chromatin conformation capture-q PCR,3C-q PCR）证实,无论是表达RORγt的小鼠淋巴细胞株EL4,还是FACS分选的Th17细胞,或者是体外诱导分化的Th17中,3号检测位点（TS3）相比于其他位点而言,可以与RORγt启动子存在很强的相互作用;（3）通过对增强子上转录因子结合位点的生物信息学分析以及文献提示,我们推测转录因子SOX-5可能是与增强子RORCE2相互结合进而参与loop形成调节RORγt基因表达的关键转录因子,其结合位点（SOX-5-Binding site,SOX-5-BS）位于TS3上游约50 bp;（4）通过Ch IP-q PCR证实SOX-5确实结合在SOX-5-BS与以及RORγt启动子区域;（5）通过3C-q PCR结合Ch IP的实验方法（Ch IP-loop）证实,无论是EL4还是体外分化的Th17细胞中,SOX-5都介导了TS3和RORγt启动子之间的相互作用;（6）为了进一步了解其中的机制,基于CRISPR/Cas9技术构建了RORCE上转录因子SOX-5结合位点缺失的小鼠(SOX-5-BS-deficient,SOX-5-BS-/-),结果发现SOX-5-BS的缺失导致SOX-5在SOX-5-BS上的结合显着降低,并严重破坏了TS3和RORγt启动子之间的相互作用;（7）小鼠体内实验也表明:SOX-5结合位点的缺失显着影响了RORγt和IL-17的表达,并通过影响Th17细胞的分化显着降低了EAE疾病的严重程度。这些结果都提示了Th17细胞中转录因子SOX-5介导增强子RORCE2与RORγt基因启动子相互作用对Th17细胞的分化至关重要。3.Th17细胞中SOX-5与STAT3协同诱导RORCE2的染色质开放。SOX家族转录因子通过与DNA结合可以引起染色质开放从而进行基因的转录调控,但是有研究表明,SOX家族的转录因子结合DNA后,并不能独自的招募染色质重塑复合物导致染色质结构的改变,必须依赖于结合在邻近位置上的伙伴转录因子（Partner TF）协同合作才能招募重塑复合物引起染色质的开放。基于此,我们首先利用WT和SOX-5-BS-/-小鼠,通过Ch IP-q PCR和染色质可接近性检测实验发现,SOX-5-BS缺失后,增强子RORCE2区域染色质开放程度严重下降;通过生物信息学分析发现在SOX-5-BS下游存在转录因子STAT3（signal transducer and activator of transcription 3）的结合位点（STAT3 binding site,STAT3-BS）,多篇研究证实STAT3在Th17细胞的分化中至关重要,这就提示Th17细胞中我们STAT3是潜在的SOX-5的Partner TF;进一步的实验结果显示STAT3可以结合在RORCE2上,而且当SOX-5与RORCE2结合缺失后,STAT3与RORCE2的结合也几乎消失;双荧光素酶报告实验结果表明STAT3-BS的缺失严重影响了RORCE2对RORγt启动子活性的增强作用;Co-IP的结果也证实STAT3与SOX-5之间存在蛋白-蛋白之间的相互作用;此外,我们在Th17细胞中敲低（Knock down,KD）STAT3表达后发现,增强子RORCE2区域的染色质开放程度明显降低。这些结果提示我们Th17细胞中SOX-5与STAT3协同诱导RORγt基因增强子RORCE2染色质开放。综上所述,我们证实了在Th17细胞中RORCE2是RORγt基因新的增强子,它可以在转录水平上增强RORγt基因的表达从而促进Th17的分化,转录因子SOX-5与STAT3协同诱导了增强子RORCE2染色质的开放,并介导了其与RORγt基因启动子的相互作用。这项开创性的研究证实了顺式作用元件在疾病发病机制中的重要意义,该研究不仅进一步丰富了Th17细胞分化的机制,同时也为Th17细胞相关疾病的干预治疗提供潜在线索。
南福龙[3]（2021）在《新城疫病毒调节树突状细胞IL-12表达及其抑制抗原递呈机制研究》文中研究说明新城疫（Newcastle disease,ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的严重的禽类呼吸道、消化道传染病,给全世界养禽业造成巨大经济损失。NDV属于副粘病毒科,可以通过多种免疫抑制机制逃避宿主的免疫应答。虽然多种副粘病毒都能抑制宿主的抗原递呈,但关于NDV对宿主抗原递呈的影响研究较少。树突状细胞（Dendritic cells,DCs）作为体内功能最强的专职抗原递呈细胞（Antigen presentation cell,APC）,摄取抗原后能刺激T淋巴细胞增殖活化,开启体内适应性免疫应答。已有研究表明多种NDV载体疫苗都能诱导机体产生高效的体液与细胞免疫应答,诱导DCs活化,但NDV强毒会诱导DCs凋亡,阻碍抗原递呈,抑制T细胞增殖活化。因此,探究NDV调控DCs活化与抗原递呈抑制机制可以更好地了解NDV免疫逃避机制,也为提升NDV载体疫苗免疫效力提供依据。本研究以NDV弱毒标准株LaSota和小鼠DCs为研究对象,体内外探究NDV的抗原递呈过程及抑制机制。主要研究内容如下:一.NDV感染能诱导小鼠DCs成熟。为探索NDV弱毒LaSota株能否诱导DCs活化,本研究首先以商品化重组IL-4和GM-CSF在体外联合诱导小鼠骨髓单核细胞分化成DCs。利用表达绿色荧光蛋白（EGFP）的r NDV（r NDV-EGFP）感染,发现LaSota能够感染DCs。随后通过流式检测感染后DCs表面成熟标志发现:NDV感染上调了MHC及共刺激分子CD80/86等表面标志;诱导DCs分泌除IL-12p70外的促炎因子TNF-α、IFN-α/β/γ;此外,感染DCs的吞噬能力下降同时具有很强的迁移能力。本研究表明,DCs能够被NDV诱导活化。二.NDV感染抑制DCs抗原递呈并诱导Th2型免疫应答。为揭示NDV对DCs抗原递呈的影响,本研究以CCK-8对DCs和T细胞共培养中T细胞增殖活性进行检测,结果发现NDV处理后的DCs刺激T细胞增殖能力下降,抗原递呈被抑制。感染后共培养CD4+及CD8+T细胞比例下降,Th2型细胞占比升高;DCs感染上清和共培养上清Th2型免疫抑制因子IL-10分泌上升,说明LaSota株感染后会抑制DCs的抗原递呈,并诱导CD4+Th0细胞向Th2型细胞分化。体外验证后,本文构建并拯救了表达2型萤火虫荧光素酶基因的重组新城疫病毒r L-Luc,接种小鼠后进行活体成像。结果表明感染12 h荧光值最高,随后下降,至72 h荧光已经很弱。给小鼠接种NDV,在不同时间点监测脾脏淋巴细胞变化,发现NDV感染小鼠后脾脏DCs含量先下降再上升后稳定,说明抗原递呈主要发生在感染开始至72 h之间;能有效募集成熟DCs至脾脏;脾脏B细胞占比升高,T细胞下降,Th2型细胞显着升高,说明LaSota感染在体内抗原递呈也会诱导Th2型应答。本研究表明NDV会抑制DCs抗原递呈,并在体内外介导Th2型免疫应答。三.NDV通过抑制小鼠DCs IL-12p70分泌抑制T细胞增殖。为探索NDV的抗原递呈抑制机制,本研究先以NDV感染DCs,12 h后以LPS处理48 h,发现NDV会抑制LPS诱导的IL-12p40亚基转录,降低IL-12p70分泌。对IL-12生成通路p38 MAPK通路关键蛋白进行检测发现,NDV感染并未影响通路蛋白总量,但降低了p38和p65在胞质和胞核中磷酸化水平。另外,本研究发现共培养时感染组IL-12p70刺激T细胞分泌的下游细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-6均下降。本研究说明NDV通过抑制IL-12生成通路关键蛋白磷酸化入核,抑制IL-12p40生成,从而抑制IL-12p70的分泌和T细胞增殖与细胞因子的分泌。四.NDV通过抑制DCs IL-12p70的分泌增强病毒感染效率。为探究NDV抑制IL-12p70对自身感染的影响,先以r NDV-EGFP感染DCs再共培养,发现NDV能够通过DCs感染T细胞。随后以NDV直接感染T细胞,再以PMA刺激T细胞活化,结果表明NDV感染会抑制PMA刺激的IFN-γ、TNF-α生成。随后将DCs和T细胞的不同感染组合进行共培养,结果表明NDV感染DCs造成的IL-12p70降低是共培养中T细胞增殖和细胞因子分泌抑制的主要原因。接下来以外源宿主相关因子预处理DCs和T细胞再以LaSota感染,结果表明几种被抑制的细胞因子均能有效抑制NDV的感染。最后以不同NDV毒株处理DCs,检测发现多种NDV均会抑制宿主相关因子表达并抑制T细胞增殖活性。本研究表明NDV通过降低IL-12的表达,抑制了下游TNF-α、IFN-γ和IL-6的分泌,以此增强自身对DCs和T细胞的感染效率。综上所述,本研究证明了NDV弱毒LaSota株能诱导小鼠DCs活化,但会抑制p-p65磷酸化入核降低IL-12的分泌从而抑制DCs抗原递呈,在体内外诱导Th2型免疫应答,增强自身感染效率,这种对IL-12的抑制是NDV造成免疫抑制的通用机制。
叶壮[4]（2021）在《调节性B细胞亚群与系统性红斑狼疮发病的关系及其机制研究》文中研究指明背景:调节性B细胞（Regulatory B cells,Bregs）是以负性调节功能为特征的B细胞亚群,具有抑制炎症免疫反应、预防自身免疫反应的调节作用,参与多种免疫病理过程。Bregs既可通过分泌大量的抑制性细胞因子以浓度依赖的方式,亦可通过连接负性共刺激因子以接触依赖的方式发挥其功能。Bregs在包括自身免疫性疾病在内的多种疾病发病过程中扮演着重要角色。但Bregs在SLE病程中的分布规律、对于免疫细胞的影响以及免疫调节功能的作用机制目前尚不明确。目的:（1）明确SLE患者外周血Bregs亚群的表达情况及分布特点,比较SLE患者中Bregs的功能变化,分析Bregs亚群与SLE临床指标的相关性。（2）明确治疗前后SLE患者外周血Bregs的转归。（3）探索Bregs及其功能分子对CD4+T细胞分化、增殖以及功能的影响,探讨Bregs参与SLE疾病发生发展的可能机制。方法:（1）选取新发初治的SLE患者（n=72）,同时选取年龄、性别匹配的健康对照,统计SLEDAI-2K、补体、血沉、C反应蛋白、尿蛋白等临床指标。（2）通过流式细胞术对外周血Bregs亚群、B细胞亚群、Th细胞亚群等细胞群的表达和分布进行分析,利用细胞内染色流式对Bregs亚群进行功能分析。应用ELISA技术测定了外周血中IL-10、IL-35、TGF-β1以及BAFF水平,CBA技术测定Th细胞功能分子水平。（3）分析Bregs亚群与SLE临床指标之间的相关性。（4）随访规范治疗的SLE患者,研究治疗前后Bregs亚群细胞水平和IL-10、IL-35、TGF-β1水平的变化。（5）通过在体外模拟SLE患者Bregs与CD4+T细胞的作用环境,建立transwell共培养体系,研究SLE中Bregs对CD4+T细胞的影响及其可能的作用机制。结果:（1）流式细胞术分析发现,SLE患者外周血中IL-10+Bregs以及IL-35+Bregs亚群细胞比例降低,TGF-β1+Bregs比例无明显变化。CD19+CD24hiCD38hi过渡期Bregs和CD19+CD24hiCD27+记忆Bregs细胞比例减低。CD19+CD24hiCD38hiBregs在外周血总CD3-CD19+B细胞中的比例要低于CD19+CD24hiCD27+Bregs。相关性分析发现,SLE患者外周血IL-10+Bregs的比例与CD19+CD24hiCD27+Bregs的比例呈明显正相关,IL-35+Bregs的比例与CD19+CD24hiCD38hiBregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs的比例呈明显正相关。（2）SLE患者血浆中IL-35、TGF-β1水平明显减低,IL-10水平升高。IL-35水平与IL-35+Bregs亚群比例、CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例明显相关。（3）体外细胞培养试验表明,SLE患者CD19+CD24hiCD27+Bregs产IL-10以及IL-35水平均高于CD19+CD24hiCD38hi Bregs。（4）SLE患者外周血中Th17细胞的频率明显升高,血浆中TNF-α、IL-6、IL-17A、BAFF等细胞因子水平升高,IL-2水平降低。SLE患者血浆中IL-17A水平与外周血中Th17细胞的频率呈正相关,BAFF水平与外周血CD19+CD24hiCD27+Bregs的比例呈负相关。（5）SLE患者CD27+CD38-/lo MB、CD27+CD38hi PB和CD27-CD38hi TB的频率增高,CD27-CD38-/lonaive B细胞的频率下降。IL-35+Bregs亚群比例与CD27+CD38-/loMB、CD27-CD38-/lonaive B细胞比例负相关。TGF-β1+Bregs亚群比例与CD27+CD38hiPB细胞比例负相关。CD19+CD24hiCD38hiBregs亚群比例与CD27-CD38-/lonaive B细胞比例正相关。CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例与CD27-CD38hi TB细胞比例负相关。（6）临床指标相关性分析发现,SLE患者外周血的IL-35+Bregs亚群比例与ESR呈负相关,IL-10+Bregs亚群比例与CRP呈负相关。IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD38highBregs亚群比例与血清中C3水平呈正相关。外周血的IL-10+Bregs亚群比例与血清中C4水平呈正相关。外周血的IL-10+Bregs、IL-35+Bregs亚群比例与SLE疾病活动性评分SLEDAI水平呈负相关。（7）与轻中度活动的SLE患者相比,重度疾病活动的SLE患者IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例明显降低。（8）与不伴有肾脏受累的患者相比,伴有狼疮性肾炎SLE患者的IL-10+Bregs、IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例以及IL-35水平明显降低。（9）经激素及免疫抑制治疗后,IL-10+Bregs、IL-35+Bregs以及CD19+CD24hiCD38hi Bregs、CD19+CD24hiCD27+Bregs细胞频率,IL-10、IL-35水平较基线升高。（10）Transwell共培养CD19+B细胞与CD4+T细胞实验发现,健康人Bregs可抑制SLE患者Th1、Th17细胞水平,这种功能的发挥不完全依赖于细胞间的接触,但细胞间的接触可以强化这种抑制作用。健康人Bregs可抑制SLE患者Th1、Th17细胞功能。IL-10m Ab或rIL-35的刺激均可明显增强Bregs对Th细胞及其功能的抑制作用。SLE患者Bregs对健康人Th细胞的抑制作用受损。IL-10m Ab、rIL-35可以协助SLE患者受损的Bregs恢复对Th1、Th17细胞水平及功能的抑制作用。Th细胞IL-2、IFN-γ及IL-6的产生,在一定程度上受到IL-10和IL-35的调控。结论:（1）SLE患者外周血IL-10+Bregs、IL-35+Bregs、CD19+CD24hiCD38hi Bregs以及CD19+CD24hiCD27+Bregs细胞比例减低,产生IL-35、TGF-β1功能减弱。Bregs分泌功能的发挥主要以CD19+CD24hiCD27+Bregs为主。（2）外周血IL-10+Bregs、IL-35+Bregs以及CD19+CD24hiCD27+Bregs亚群比例、IL-35水平的降低可能与SLE患者合并LN有关。（3）SLE患者经有效治疗后,其外周血Bregs和IL-10、IL-35水平可部分恢复。（4）健康人Bregs可抑制SLE患者Th1、Th17细胞水平及细胞功能,IL-10m Ab或rIL-35的刺激均可明显增强Bregs的抑制作用。（5）SLE患者Bregs抑制功能受损。IL-10m Ab、rIL-35可以协助SLE患者受损的Bregs恢复功能。（6）Th细胞IL-2、IFN-γ及IL-6的产生,在一定程度上受到IL-10和IL-35的调控。
王明哲[5]（2021）在《固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究》文中研究说明背景:慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease,COPD）是一种以持续呼吸道症状和气流受限为特征的疾病,通常是由于明显暴露于有毒颗粒或气体引起的气道和/或肺泡异常所致,其发病机制目前尚未完全阐明,临床疗效欠佳。目前对于COPD的治疗主要以对症治疗为主,治疗效果不理想且需要终身控制疾病的发展。中医以整体观念、辨证施治为纲,可以通过“扶正”、“固卫”起到未病先防,已病防变的作用,从而更好的预防和控制COPD的发生与发展。“固本止咳中药”源于国医大师、中医内科呼吸病专家晁恩祥教授多年诊治COPD的临床经验。晁恩祥教授十分重视人体正气在疾病发病和病情进展中的地位和作用,强调“正气存内,邪不可干”,提出“扶正固卫”理论,因而以经典方剂“玉屏风散”为基础,加减化裁创制固本止咳中药。前期临床研究表明,固本止咳中药在改善患者肺功能等方面有较好效果,并可通过调控T细胞亚群发挥调节人体免疫功能的作用。大量的前期动物实验表明,固本止咳中药可改善COPD模型小鼠肺功能情况、呼吸道病理损伤及炎性因子的过度表达、并降低肺组织αβT细胞/γδT细胞比例、增加肺组织中KGF,KGFR蛋白和基因表达含量等。因此,进一步开展固本止咳中药治疗COPD模型小鼠的疗效及作用机制研究具有一定的意义。目的:损伤修复是在各类细胞生长因子共同作用下的协调有序过程,分为炎症反应、细胞增殖、基质沉积及组织重塑四个时期。呼吸道损伤修复是COPD的主要发病机制之一,贯穿了慢阻肺疾病的全程。本研究从呼吸道的黏膜炎症损伤修复、呼吸道结构损伤修复及异常的呼吸道损伤修复这三个方面入手,研究固本止咳中药对于COPD呼吸道损伤修复的调控作用,从而更好的阐释中医“扶正固卫”、“肺主皮毛”的理论。方法:本研究将100只健康ICR小鼠按体重随机分为空白组（n=30）、模型COPD组（n=35）和固本止咳中药组（n=35）。除正常对照组以外,其余各组均被制成COPD模型。本研究采用被动吸烟加鼻腔滴入LPS的方法进行COPD小鼠造模。治疗组于第61天开始予固本止咳中药灌胃,空白对照组和模型对照组使用蒸馏水以同样方法灌胃,共28天。第一部分:体重监测和肺功能检测明确COPD模型小鼠的模型制备情况和固本止咳中药的药效。在固本止咳中药对COPD模型小鼠的呼吸道黏膜炎性损伤修复的调控作用研究方面,本研究首先通过抗体芯片法对小鼠呼吸道40种炎性因子进行系统检测,并采用免疫组化法对抗体芯片结果中COPD组明显变化和固本止咳中药组发挥明显调控作用的炎性因子进行验证。在固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道结构损伤修复的调控以及对异常的损伤修复的作用研究方面,本研究通过病理学评判、免疫组化法和透射电镜进行检测,以判断香烟烟雾暴露+LPS滴鼻对小鼠呼吸道结构、肺泡结构、细胞外基质和Ⅱ型上皮细胞的结构损伤情况以及固本止咳中药对COPD模型对相应结构损伤修复及异常的损伤修复的调控情况。第二部分:基于质谱技术,对固本止咳中药的成分分析研究,从固本止咳中药的化学成分入手,探讨其发挥损伤修复作用机制的原理。此外,本研究对各组小鼠肺组织进行label-free蛋白组学检测,明确固本止咳中药治疗COPD模型小鼠的靶点及通路。阐释其对于COPD模型小鼠呼吸道损伤修复多成分-多靶点-多通路整体调控的机制。第三部分:基于western-blot和RT-qPCR技术,对第一部分和第二部分结果富集出现的JAK-STAT信号通路进行验证研究,对通路中JAK1,p-JAK1,STAT3,p-STAT3和SOCS3的蛋白表达水平以及JAK1 mRNA,JAK2mRNA,JAK3mRNA,STAT1 mRNA,STAT3 mRNA,SOCS3mRNA的表达水平进行测定。结果:1)体重监测:固本止咳中药可改善COPD模型小鼠体重增长缓慢的情况。2)肺功能检测:COPD 组较空白组 FEV 0.05,FEV0.1,FEV0.2,PEF,Crs,Cst均明显下降（P<0.01）;Rrs,Ers,Rn均明显升高（P<0.01）;G,H均无统计学差异（P>0.05）。固本止咳中药组较COPD组FEV0.05,FEV0.1,FEV0.2,Crs均明显升高（P<0.05）;Rrs,Ers,Rn均明显下降（P<0.05）;PEF,G,H,Cst均无统计学差异（P>0.05）。3)病理形态学:HE染色结果表明,COPD组小鼠病理形态符合COPD的特征,固本止咳中药可改善COPD模型小鼠50-100μm直径气道、呼吸性细支气管和肺泡的病理形态。透射电镜结果表明,COPD组小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞板层小体出现空泡化,线粒体肿胀,嵴断裂或消失。固本止咳中药组小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞部分板层小体出现空泡化,线粒体肿胀,但程度与COPD组相比明显减轻。4)抗体芯片检测:在40个炎性因子中,COPD组与空白组相比,共有8个显着升高的炎性因子,分别为 IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-3,IL-17 和 IL-12p70（P<0.05）;固本止咳中药组与COPD组相比,共有7个显着降低的因子,分别为IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,IL-1β,IL-3 和 TCA-3（P<0.05）。5)免疫组化检测:与空白组相比,COPD组IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,α-SMA,MMP-9,TIMP-1,MMP-9/TIMP-1,HIF-1α 在肺组织中的表达均明显升高（P<0.05）。与 COPD 组相比,固本止咳中药组 IL-6,GM-CSF,TNF-α,IFN-γ,α-SMA,MMP-9,TIMP-1,MMP-9/TIMP-1,HIF-1α在肺组织中的表达均明显下降（P<0.05）。空白组和COPD组,固本止咳中药组与COPD组之间Collegen 1均无统计学差异（P>0.05）。6)中药成分分析:共鉴定出固本止咳中药的41个成分,其中的多种成分被证明可通过抗炎、抗氧化、抑制气道重塑等参与呼吸道损伤修复的调控。7)label-free蛋白组学检测:在COPD组和空白组之间共发现287个差异蛋白,固本止咳中药组和COPD组之间共发现184个差异蛋白。通过对差异蛋白的GO富集分析、KEGG富集分析和REACTOME富集分析发现:固本止咳中药可通过中性粒细胞脱颗粒、补体通路、细胞外基质、JAK-STAT信号通路等多个途径以及多个参与COPD进展的生物标志物,从整体上参与COPD呼吸道损伤修复的调控。8)JAK-STAT信号通路的实验:本研究通过RT-PCR法对各组小鼠肺组织JAK1,JAK2,JAK3,STAT1,STAT3和SOCS3进行了测定,结果表明:与空白组相比,COPD模型小鼠肺组织中 JAK1 mRNA,JAK2 mRNA,JAK3 mRNA,STAT3 mRNA 和 SOCS3 mRNA表达均明显升高（P<0.05）,STAT1 mRNA两组间无统计学差异（P>0.05）。与COPD组相比,固本止咳中药组小鼠肺组织中JAK1 mRNA,STAT3 mRNA表达明显下降（P<0.05）,且 SOCS3 mRNA 表达明显升高（P<0.05）,JAK2mRNA,JAK3 mRNA,STAT1 mRNA与COPD组相比均无统计学差异（P>0.05）。本研究采用western-blot法对各组小鼠肺组织JAK1,p-JAK1,STAT3,p-STAT3,SOCS3进行测定。与空白组相比,COPD 模型小鼠肺组织中 p-JAK1,p-STAT3,p-JAK1/JAK1,p-STAT3/STAT3 明显升高（P<0.05）;JAK1,STAT3,SOCS3与空白组相比均无统计学差异（P>0.05）。与COPD组相比,固本止咳中药组小鼠肺组织中p-JAK1,p-STAT3,p-STAT3/STAT3明显降低（P<0.05）,SOCS3 明显升高（P<0.05）;JAK1,STAT3,P-JAK1/JAK1 与 COPD组相比均无统计学差异（P>0.05）。结论:1)固本止咳中药可通过减少COPD模型小鼠肺组织炎性因子的过度表达,发挥调控呼吸道黏膜炎症损伤修复的作用;并通过改善COPD模型小鼠呼吸道结构、肺泡Ⅱ型上皮细胞超微结构以及细胞外基质的损伤,发挥调控呼吸道结构损伤修复和减少异常的呼吸道损伤修复的作用。体现了中医扶正固卫,肺主皮毛的理论。2)固本止咳中药在COPD损伤修复机制的整体调控中具有多成分-多靶点-多通路的特点,体现了中医整体观念的特点。3)固本止咳中药可通过下调JAK1和STAT3的磷酸化水平,上调SOCS3的表达从而抑制JAK-STAT信号通路。是固本止咳中药基于扶正固卫、肺主皮毛理论调控呼吸道损伤修复在机制上的具体体现。
鲁德玕[6]（2020）在《白细胞介素-27在支气管哮喘气道炎症和气道重构中的作用》文中研究说明研究背景:支气管哮喘（哮喘）是以可变和可逆的气流受限以及气道高反应（Airway hyperresponsiveness,AHR）为特征的慢性炎症性疾病。其病理学特征为气道炎症和气道重构。哮喘患者气道重构导致气道高反应,也是肺功能受损、不可逆性气流受限的病理基础。气道重构一般表现为气道壁增厚和细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）沉积发生变化,新生血管形成以及气道平滑肌细胞（Airway smooth muscle,ASM）的增生与肥大。尽管目前的治疗可以有效地控制症状,但是无法防范和控制气道重构。T淋巴细胞（T-lymphocytes）及其细胞因子在哮喘病理过程中起着至关重要的作用。在发病的机制和原因上,哮喘和辅助性T细胞（T helper cells,Th）亚群细胞之间的失衡的免疫应答有关,Th1/Th2失衡是哮喘免疫学发病机制中的一个重要环节。Th1/Th2平衡的精确调节,Th1和Th2细胞涉及的信号下游通路的选择,对于肺脏稳态的维持、气道炎症以及气道重构至关重要。白细胞介素-27（Interleukin-27,IL-27）为新的IL-12家族的细胞因子,是一个来源不同的二聚体,由EB13和p28两条肽链组成,它们之间以二硫键连接。其受体由gp130和IL-27受体α链（IL-27Rα）组成,IL-27与受体结合可激活Janus激酶/信号转导和转录激活因子发挥生物学效应。IL-27可以提高Th1免疫应答的程度、减低Th2免疫应答的水平,防止炎症反应向过度方向发展,还可以减低Th17细胞分化的程度及相关的细胞因子的合成和释放,此外,IL-27对调节性T细胞（Regulatory T cells,Treg）也有不同程度的作用,这些都提示IL-27可能在哮喘的病理过程中扮演着重要角色。因此,IL-27可能是一个候选治疗哮喘的细胞因子。研究发现,急性发作期哮喘患者血清IL-27水平发生变化,且与患者肺功能状态相关。Jirmo AC及其同事发现IL-27可以增加干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-y）的分泌,而降低IL-5和IL-13的分泌,显示IL-27对Th2反应有直接抑制作用。他们的发现提供IL-27在抑制过敏性哮喘中具有重要作用的证据。基于卵清蛋白（Ovalbumin,OVA）诱导的小鼠模型,Yoshimoto等人已经证明经鼻给药IL-27可降低OVA诱发的气道高反应性和气道炎症。然而,Su X和同事发现预防性经鼻IL-27给药可减轻气道炎症并改善病理变化,而治疗性IL-27给药却没有以上效应,其原因是气道中已经存在己分化的Th2细胞,且对IL-27介导的Th2发育具有抵抗作用。此外,IL-27是否对哮喘慢性模型的气道重构有作用尚未有研究。目前有关IL-27和哮喘的研究,均着眼于IL-27对气道炎症的影响,没有关注气道重构这个哮喘的病理核心。治疗性给予IL-27是否能够减轻哮喘模型小鼠的气道炎症和气道高反应等病理过程研究结果尚不一致。此外,IL-27通过什么信号途径发挥上述作用尚有争议,目前也没有给予IL-27对气道重构有无影响的文献。目的:探讨预防性应用IL-27以及治疗性应用IL-27是否可以抑制哮喘模型小鼠的气道炎症、气道高反应以及气道重构等病理过程。进一步探讨其发挥上述作用的信号途径。为IL-27作为可能的干预因素针对哮喘气道重构的预防和治疗提供新的可能的靶点。方法:1.6周龄雌性BALB/c小鼠,利用鸡OVA构建急性和慢性哮喘模型。在预防处理组,小鼠随机分为正常对照组（PBS组）、模型组（OVA）组和IL-27预防处理组（OVA+IL-27）;在治疗处理组,小鼠随机分为正常对照组（PBS组）、模型组（OVA）组和IL-27治疗处理组（OVA+IL-27）,每组各8只小鼠。2.收集小鼠支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）,对BALF进行瑞氏-吉姆萨（Wright-Giemsa）染色以及计数细胞总数,以及对中性粒细胞（Neutrophils,Neu）、单核细胞（Monocytes,Mon）、淋巴细胞（Lymphocytes,Lym）、嗜酸性粒细胞（Eosinophils,Eos）、嗜碱性粒细胞（Basophils,Bas）进行分类计数。3.酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）评估小鼠血清及 BALF 上清中 IL-4、IL-5、IL-13、IL-17 和 IFN-γ 的含量。4.应用有创的肺功能分析系统测定气道阻力和气道顺应性。5.实时聚合酶链反应（Real-time polymerase chain reaction amplification,Real-time PCR）检测小鼠肺脏组织中 ST AT1、STAT3、GAT A-binding protein-3（GATA-3）mRNA 和 T 细胞表达的转录因子 T-box（Transcription factors T-box expressed in T-cells,T-bet）mRNA 表达情况。6.Western blot 检测小鼠肺脏组织中 STAT1、磷酸化 STAT1（Phosphorylated STAT1,p-STAT1）、STAT3、p-STAT3、GATA3 和 T-bet 蛋白表达情况。同时计算p-STAT1和STAT1以及p-STAT3和STAT3的比值。7.采用不同染色方法评估肺组织气道重构情况:（1）采用H&E染色（Hematein eosin staining）方法,图像分析软件测量气道壁的面积（Area of airway wall,Wat）、平滑肌面积（Area of smooth muscle,Warm）、基底膜周长（Perimeter of basement membrane,Pbm）,用 Wat/Pbm（μm2/μm）和 Wam/Pbm（μm2/μm）,评估气道壁增厚、平滑肌增生情况。（2）采用 Masson 染色（Masson’s trichrome staining）方法,图像分析软件测量基底膜下蓝色胶原沉积面积,得到Masson+面积/Pbm,评估胶原沉积程度。（3）采用过碘酸-希夫（Periodic acid-Schiff,PAS）染色方法,图像分析软件测量PAS阳性面积,得到PAS+面积/Pbm（μm2/μm）,评估杯状细胞增生情况。（4）采用免疫组化α-平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin,α-SMA）染色方法,图像分析软件测量α-SMA 阳性面积,得到α-SMA+面积/Pbm（μm2/μm）,评估肌成纤维细胞活化情况。（5）采用免疫组化CD31染色方法,图像分析软件测量CD31阳性面积,得到CD31+新生血管面积/Pbm（μm2/μm）,评估气道壁血管新生情况。结果:1.OVA诱导的哮喘小鼠模型临床表现哮喘模型组（OVA组）小鼠吸入OVA后即时出现明显的哮喘发作症状:烦躁不安,呼吸急促,腹肌抽搐,活动频繁,大、小便失禁,毛发竖起,部分小鼠出现可听到的哮鸣音,反应迟钝,动作迟缓等异常表现。这些表现均提示小鼠哮喘造模成功。2.小鼠BALF中细胞总数和分类2.1小鼠BALF中细胞总数2.1.1 IL-27在预防处理组可降低小鼠BALF中细胞总数三组小鼠BALF中细胞总数（X 104 cells/ml）有显着统计学差异（PBS组:8.38±1.94,OVA 组:190.70±29.77,OVA+IL-27 组:99.94±17.31,F=167.60,P<0.001,one-way ANOVA）。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠BALF中细胞总数明显减少（t=9.11,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）。2.1.2 IL-27在治疗处理组不能减少小鼠BALF中细胞总数三组小鼠BALF中细胞总数（X 104 cells/ml）有明显统计学差异（PBS组:8.59±2.07,OVA 组:193.50±40.35,OVA+IL-27 组:152.50±40.31,F=69.52,P<0.001,one-way ANOVA）。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠BALF中细胞总数无明显变化（t=2.49,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）。2.2小鼠BALF中细胞分类2.2.1 IL-27在预防处理组可降低小鼠BALF中不同炎症细胞数三组小鼠 BALF 中 Mon 数（× 104 cells/ml）（PBS 组 vs OVA 组 vs OVA+IL-27组,下同:4.53±1.77 vs 17.82±5.18 vs 10.40±2.36,F=29.95,P<0.001,one-way ANOVA,下同）、Eos 数（0.47±0.25 vs 61.99±19.77 vs 17.22±4.36,F=59.26,P<0.001）、Neu 数（2.31±1.04 vs 27.79±6.17 vs 15.91±4.34,F=67.20,P<0.001）、Lym数（1.01±0.39 vs 74.97±16.53 vs 49.84±10.64,F=87.81,P<0.001）和 Bas 数（0.37±0.08 vs 6.03±1.76 vs 1.89±0.49,F=61.51,P<0.001）有显着统计学差异。与 OVA 组相比,OVA+IL-27 组小鼠 BALF 中 Mon 数（t=4.31,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、Eos 数（t=7.66,P<0.001）、Neu 数（t=5.40,P<0.001）、Lym数（t=4.43,P<0.001）和 Bas 数（t=7.83,P<0.001）明显减少。2.2.2 IL-27在治疗处理组不能减少小鼠BALF中不同炎症细胞数三组小鼠 BALF 中 Mon 数（×104 cells/ml）（PBS 组 vs OVA 组 vs OVA+IL-27组,下同:4.70±1.59 vs 18.01 ±6.35 vs 13.56±5.14,F=16.01,P<0.001,one-way ANOVA,下同）、Eos数（0.50±0.25 vs 62.32±20.52 vs 52.78±13.33,F=44.38,P<0.001）、Neu 数（2.34±1.06 vs 28.17±5.78 vs 24.15±4.80,F=80.58,P<0.001）、Lym数（0.97±0.35 vs 78.23±15.32 vs 69.44±19.56,F=69.54,P<0.001）和 Bas 数（0.38±0.11 vs 6.23±2.19 vs 4.77±1.59,F=30.18,P<0.001）有显着统计学差异。与 OVA 组相比,OVA+IL-27 组小鼠 BALF 中 Mon 数（t=1.87,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、Eos 数（t=1.35,P>0.05）、Neu 数（t=1.83,P>0.05）、Lym数（t=1.23,P>0.05）和 Bas 数（t=1.87,P>0.05）无明显改变。3.小鼠的AHR测定3.1 IL-27降低预防处理组小鼠气道对乙酰胆碱的反应性三组小鼠气道基线反应无明显差异。当乙酰甲胆碱浓度为20 mg/ml激发时,与PBS组相比,OVA组小鼠气道对乙酰胆碱的反应性明显增强。表现为气道阻力（Airway resistance,R）增加（2.93±0.17 vs 5.10±0.19,F=285.30,P<0.001,one-way ANOVA;t=9.14,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）,肺动态顺应性（Lung dynamic compliance,Cdyn）下降（0.48±0.02 vs 0.29±0.03,F=171.70,P<0.001,one-way ANOVA;t=10.19,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠气道对乙酰胆碱的反应性显着下降。表现为当乙酰胆碱浓度为20 mg/ml激发时,R下降（5.10±0.19 vs 4.26±0.19,F=285.30,P<0.001,one-way ANOVA;t=9.14,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）,Cdyn 上升（0.29±0.03 vs 0.39±0.02,F=171.70,P<0.001,one-way ANOVA;t=10.19,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）。3.2 IL-27不能改善治疗处理组小鼠气道对乙酰胆碱的反应性三组气道基线反应无明显差异。当乙酰甲胆碱浓度为20 mg/ml激发时,与PBS组相比,OVA组小鼠气道对乙酰胆碱的反应性明显增强。表现为R增加（2.94±0.44 vs 5.02±0.20,F=111.10,P<0.001,one-way ANOVA;t=14.00,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）,Cdyn 下降（0.49±0.02 vs 0.29±0.03,F=175.80,P<0.001,one-way ANOVA;t=17.37,P<0.001,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠气道对乙酰胆碱的反应性无显着改变。表现为当乙酰胆碱浓度为20 mg/ml激发时,R无明显变化（5.02±0.20 vs 4.64±0.18,F=111.10,P<0.001,one-way ANOVA;t=2.56,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）,肺 Cdyn 无明显变化（0.29±0.03 vs 0.32±0.02,F=175.80,P<0.001,one-way ANOVA;t=2.56,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test）。4.急性哮喘模型小鼠BALF上清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17和IFN-γ含量4.1 IL-27在预防处理组降低小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17水平,提高IFN-γ水平三组小鼠 BALF 上清中 IL-4 含量（pg/m1）（PBS 组 vs OVA 组 vs OVA+IL-27组,下同:60.03±13.34 vs 134.20±26.59 vs 101.60±21.90,F=24.30,P<0.001,one-way ANOVA,下同）、IL-5含量（39.33±9.75 vs 84.52±14.70 vs 62.68±12.97,F=25.58,P<0.001）、IL-13 含量（122.90±26.79 vs 369.50±100.40 vs 244.60±68.97,F=23.48,P<0.001）、IL-17 含量（67.61±12.13 vs 203.50±38.32 vs 142.20±22.99,F=51.84,P<0.001）和 IFN-γ 含量（80.22±18.45 vs 39.99±9.21 vs 59.87±14.82,F=15.06,P<0.001）有显着统计学差异。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠BALF中IL-4（t=3.06,P<0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、IL-5（t=3.46,P<0.05）、IL-13（t=3.47,P<0.05）、IL-17（t=4.59,P<0.01）水平明显下降,IFN-γ水平明显增加（t=2.71,P<0.05）。4.2 IL-27在治疗处理组不影响小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17和IFN-γ水平三组小鼠 BALF 上清中 IL-4 含量（pg/mI）（PBS 组 vs OVA 组 vs OVA+IL-27组,下同:58.96±15.47 vs 130.00±30.39 vs 104.60±26.14,F=16.84,P<0.001,one-way ANOVA,下同）、IL-5 含量（39.80±11.32 vs 79.61±23.60 vs 63.87±18.53,F=9.38,P<0.001）、IL-13 含量（117.50±34.18 vs 380.00±87.13 vs 285.20±87.69,F=25.77,P<0.001）、IL-17 含量（68.25±17.66 vs 215.80±46.22 vs 177.20±26.43,F=44.66,P<0.001）和 IFN-γ 含量（79.99±20.53 vs 47.60±17.49 vs 56.82±17.34,F=6.50,P<0.05）有显着统计学差异。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠BALF中 IL-4（t=2.05,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、IL-5（t=1.70,P>0.05）、IL-13（t=2.56,P>0.05）、IL-17（t=2.39,P>0.05）水平无明显下降,IFN-γ水平无明显增加（t=0.99,P>0.05）。5.急性哮喘模型小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17和IFN-γ含量5.1 IL-27在预防处理组降低小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17水平,提高IFN-γ水平三组小鼠血清中IL-4含量（pg/ml）（PBS组vs OVA组vs OVA+IL-27组,下同:24.21±8.74 vs 110.60±20.39 vs 66.98±17.00,F=57.36,P<0.001,one-way ANOVA,下同）、IL-5含量（24.23±8.15 vs 82.87±18.42 vs 53.97±12.36,F=36.96,P<0.001）、IL-13 含量（156.80±33.10 vs 416.40±92.41 vs 269.70±77.54,F=25.98,P<0.001）、IL-17 含量（44.45±12.70 vs 154.5±27.24 vs 101.80±21.03,F=53.99,P<0.001）和 IFN-γ 含量（58.81±9.05 vs 32.76±9.55 vs 50.08±10.28,F= 15.13,P<0.001）有显着统计学差异。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠血清中IL-4（t=5.41,P<0.01,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、IL-5（t=4.24,P<0.01）、IL-13（t=4.06,P<0.05）、IL-17（t=4.98,P<0.01）)水平明显下降,IFN-γ 水平明显增加（t=3.59,P<0.01）。5.2 IL-27在治疗处理组不影响小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17和IFN-γ水平三组小鼠血清中IL-4含量（pg/ml）（PBS组vs OVA组vs OVA+IL-27组,下同:26.25±12.01 vs 100.40±28.67 vs 80.58±24.13,F=22.74,P<0.05,one-way ANOVA,下同）、IL-5 含量（26.86±9.26 vs 79.57±19.31 vs 61.55±15.80,F=24.31,P<0.001）、IL-13 含量（149.90±39.42 vs 439.40±101.10 vs 345.40±112.20,F=21.48,P<0.001）、IL-17 含量（46.00±15.44 vs 157.70±37.82 vs 126.50±33.26,F=28.75,P<0.001）和 IFN-γ 含量（59.96±12.06 vs 33.84±12.47 vs 44.84±12.39,F=9.07,P<0.001）有显着统计学差异。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠血清中IL-4（t=1.74,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、IL-5（t=2.35,P>0.05）、IL-13（t=2.09,P>0.05）、IL-17（t=2.05,P>0.05）水平无明显下降,IFN-γ水平无明显增加（t=1.79,P>0.05）。6.小鼠肺组织 STAT1、STAT3、T-bet 和 GATA3 mRNA 的表达6.1 IL-27在预防处理组可提高小鼠肺组织中STAT1 mRNA和T-bet mRNA、降低GATA3 mRNA表达水平三组小鼠肺组织中STAT1 mRNA表达水平有明显统计学差异（PBS组vs OVA 组 vs OVA+IL-27 组,下同:0.94±0.21 vs 0.67±0.19 vs 1.04±0.32,F=4.61,P<0.05,one-way ANOVA,下同）、GAT A3 mRNA 表达水平（1.15±0.39 vs 5.06±0.83 vs 2.93±0.90,F=55.30,P<0.01）和 T-bet mRNA 表达水平（0.97±0.29 vs 0.31±0.11 vs 0.62±0.25,F=16.83,P<0.001）有显着统计学差异。STAT3 mRNA表达水平（0.99±0.25 vs 0.73±0.24 vs 0.88±0.25,F=2.14,P>0.05）无明显统计学差异。与 OVA 组相比,OVA+IL-27 组小鼠肺组织中 STAT1 mRNA（t=2.94,P<0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）和 T-bet mRNA（t=2.72,P<0.05）表达水平提高,GATA3 mRNA表达水平下降（t=5.73,P<0.01）,STAT3m RNA表达水平无明显变化（t=1.21,P>0.05）。6.2 IL-27在治疗处理组对于小鼠肺组织中STAT1 mRNA、STAT3 mRNA、T-bet mRNA和GATA3 mRNA表达水平无影响三组小鼠肺组织中STAT1 mRNA（PBS组vs OVA组vs OVA+IL-27组,下同:1.04±0.23 vs 0.94±0.13 vs 1.03±0.16,F=0.74,P>0.05）和 STAT3 mRNA 表达水平（1.00±0.25 vs 0.79±0.33 vs 0.88±0.23,F=1.26,P>0.05）表达水平无明显统计学差异。GATA3 mRNA 表达水平（0.98±0.34 vs 5.56± 1.42 vs 4.37±1.36,F=34.04,P<0.01）和 T-bet mRNA 表达水平（0.96±0.29 vs 0.45±0.14 vs 0.64±0.22,F=9.85,P<0.01）有显着统计学差异。与OVA组相比,OVA+IL-27组小鼠肺组织中STAT1 mRNA（t=0.98,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、STAT3 mRNA（t=0.67,P>0.05）、GATA3 mRNA（t=2.07,P>0.05）和 T-bet mRNA（t=1.62,P<0.05）表达水平无明显变化。7.小鼠肺组织STAT1、磷酸化STAT1、STAT3、磷酸化STAT3、T-bet和GATA3蛋白的表达7.1 IL-27在预防处理组可提高小鼠肺组织中STAT1、p-STAT1、p-STAT3和T-bet蛋白表达水平,降低GATA3蛋白表达水平以β-actin作为内参,三组小鼠肺组织中STAT1（PBS组vs OVA组vs OVA+IL-27 组,下同:0.42±0.17 vs 0.39±0.13 vs 0.63±0.22,F=4.24,P<0.05,one-way ANOVA,下同）、磷酸化 STAT1（p-STAT1）（0.99±0.21 vs 0.49±0.11 vs 0.76±0.13,F=31.62,P<0.01）、p-STAT3 表达水平（1.15±0.25 vs 0.40±0.17 vs 0.96±0.31,F=19.64,P<0.01）、T-bet 表达水平（0.80±0.12 vs 0.34±0.11 vs 0.50±0.09,F=16.83,P<0.001）和 GATA3 表达水平（1.19±0.24 vs 3.12±0.95 vs 2.03±0.40,F=19.95,P<0.001）以及比值p-STAT1/STAT1（2.61±0.79 vs 1.04±0.30 vs 1.78±0.53,F=15.45,P<0.01）和 p-STAT3/STAT3（1.85±0.53 vs 0.69±0.33 vs 1.36±0.38,F=15.59,P<0.01）均有显着统计学差异。而STAT3表达水平无明显统计学差异（0.65±0.15 vs 0.63±0.19 vs 0.69±0.20,F=0.99,P>0.05）。与 OVA 组相比,OVA+IL-27 组小鼠肺组织中 STAT1（t=2.63,P<0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、p-STAT1（t=4.83,P<0.01）、p-STAT3（t=4.54,P<0.01）和T-bet（t=2.72,P<0.05）蛋白表达水平提高,比值 p-STAT1/STAT1（t=2.69,P<0.05）和 p-STAT3/STAT3（t=3.21,P<0.05）均升高,GATA3 蛋白表达水平下降（t=3.56,P<0.05）,STAT3蛋白表达水平无明显变化（t=0.18,P>0.05）。7.2 IL-27在治疗处理组不改变小鼠肺组织中STAT1、p-STAT1、GATA3和T-bet蛋白表达水平三组小鼠肺组织中STAT1蛋白（PBS组vs OVA组vs OVA+IL-27组,下同:0.45±0.17 vs 0.41±0.12 vs 0.49±0.13,F=0.92,P>0.05,one-way ANOVA,下）和STAT3 蛋白（0.71±0.21 vs 0.68±0.23 vs 0.74±0.18,F=0.13,P>0.05）表达水平以及比值 p-STAT1/STAT1（2.83±1.79 vs 1.50±0.96 vs 1.52±0.80,F=2.92,P>0.05）和p-STAT3/STAT3（1.56±0.51 vs 1.36±0.85 vs 1.42±0.54,F=0.19,P>0.05）无显着统计学差异。p-STAT1 蛋白（1.04±0.26 vs 0.53±0.21 vs 0.70±0.28,F=8.46,P<0.01）、p-STAT3 蛋白（15±0.25 vs 0.76±0.11 vs 0.98±0.20,F=7.87,P<0.01）、T-bet 蛋白（0.79±0.14 vs 0.41±0.12 vs 0.56±0.14,F=17.15,P<0.001）和 GATA3蛋白（1.25±0.32 vs 3.46±0.83 vs 2.69±0.66,F=24.45,P<0.001）表达水平有显着统计学差异。与 OVA组相比,OVA+IL-27 组小鼠肺组织中 p-STAT1 蛋白（t=1.34,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、p-STAT3 蛋白（t=2.23,P>0.01）、T-bet 蛋白（t=2.27,P>0.05）和 GATA3 蛋白（t=2.41,P>0.05）表达水平以及比值 p-STAT1/STAT1（t=0.02,P>0.05）和 p-STAT3/STAT3（t=0.19,P>0.05）无明显变化。8.IL-27对慢性小鼠哮喘模型气道重构的影响8.1 IL-27在预防处理组可以改善预防处理组慢性小鼠哮喘模型气道重构三组小鼠肺组织H&E染色测量Wat/Pbm（μm2/μm）（PBS组vs OVA组vs OVA+IL-27 组,下同:3.59±1.42 vs 8.49±2.86 vs 5.38±2.21,F=9.78,P<0.001,one-way ANOVA,下同）和 Wam/Pbm（μm2/μm）（10.22±4.02 vs 24.87±6.44 vs 17.00±5.77,F=14.20,P<0.001）、马松三原色染色阳性基底膜下胶原纤维面积和Pbm的比值以（μm2/μm）（1.25±0.41 vs 3.79±0.97 vs 2.39±0.92,F=19.84,P<0.001）、PAS 染色阳性染色面积和 Pbm 的比值（μm2/μm）（0.36±0.18 vs 3.06±1.53 vs 1.31±0.92,F=14.05,P<0.001）、α-SMA免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm的比值（μm2/μm）（0.69±0.32 vs 2.74±1.21 vs 1.56±0.75,F=11.92,P<0.001）和 CD31免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm的比值（μm2/μm）（0.002±0.001 vs 0.37±0.15 vs 0.19±0.12,F=22.50,P<0.001）有明显统计学差异。与 OVA 组相比,OVA+IL-27 组模型小鼠 H&E 染色 Wat/Pbm（t=2.77,P<0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、Wam/Pbm（t=2.86,P<0.05）、马松三原色染色阳性基底膜下胶原纤维面积和Pbm 比值（t=3.45,P<0.05）、PAS染色每um的PAS染色阳性染色面积和Pbm 比值（t=3.37,P<0.05）、α-SMA免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm 比值（t=2.79,P<0.05）以及CD31免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm（t=3.32,P<0.05）明显减小。8.2 IL-27在治疗处理组不能改善治疗处理组慢性小鼠哮喘模型气道重构三组小鼠肺组织H&E染色测量Wat/Pbm（μm2/μm）（PBS组vs OVA组vs OVA+IL-27 组,下同:3.91±1.81 vs 9.13±3.49 vs 6.61±2.38,F=7.75,P<0.01,one-way ANOVA,下同）和 Wam/Pbm（μm2/μm）1131±5.19 vs 26.27±10.23 vs 19.72±6.34,F=7.85,P<0.05)、马松三原色染色阳性基底膜下胶原纤维面积和Pbm比值（μm2/μm）（1.21±0.35 vs 3.82±1.24 vs 3.09±0.99,F=16.36,P<0.001）、PAS 染色阳性染色面积和 Pbm 比值（μm2/μm）（0.40±0.20 vs 3.53±1.55 vs 2.80±1.18,F=16.66,P<0.001）、α-SMA免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm 比值（μm2/μm）（0.73±0.34 vs 3.30±1.58 vs 2.37±1.46,F=8.58,P<0.001）和 CD31 免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm 比值（μm2/μm）（0.001±0.001 vs 0.40±0.16 vs 0.29±0.15,F=21.48,P<0.001）有显着统计学差异。与 OVA 组相比,OVA+IL-27组模型小鼠 H&E 染色 Wat/Pbm（t=1.91,P>0.05,Bonferroni’s Multiple Comparison Test,下同）、Wam/Pbm（t=1.73,P>0.05）、马松三原色染色阳性基底膜下胶原纤维面积和Pbm 比值（t=1.57,P>0.05）、PAS染色每um的PAS染色阳性染色面积和Pbm 比值（t=1.28,P>0.05）、α-SMA免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm 比值（t=1.48,P>0.05）以及CD31免疫组织化学染色阳性染色面积和Pbm 比值（t=1.72,P>0.05）无明显改变。结论:1.IL-27可增强哮喘模型小鼠的Th1型免疫应答,抑制其Th2型免疫应答,改善Th1/Th2细胞因子平衡。2.预防性经鼻吸入IL-27通过STAT1和STAT3信号途径抑制哮喘模型小鼠的气道炎症、气道高反应和气道重构等病理过程。3.IL-27有望成为哮喘的预防和治疗的一个靶点。
马占川[7]（2020）在《MDSC分泌的Arg-1对肠炎小鼠Th17细胞的影响及橡黄素治疗机制的研究》文中指出研究背景与目的:在炎症性肠炎（Inflammatory bowel disease,IBD）中,多种免疫细胞和肠道菌群相互影响共同导致肠炎进展。其中,由于Th17细胞在肠炎中的关键作用成为近年来研究的热点。我们先前的研究结果表明髓系来源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSC）通过分泌 Ⅰ 型精氨酸酶（arginase-1,Arg-1）促进Th17细胞的分化,从而加重系统性红斑狼疮的进展。但是在炎症性肠炎中,MDSC与Th17细胞的关系仍不明确,阻碍了肠炎治疗的研究。此外,橡黄素在肠炎治疗中的表现出一定功效,但其作用机制还有待于进一步研究。因此,本研究以髓系细胞Arg-1敲除（ArgmyeKO）小鼠构建肠炎模型,研究MDSC对Th17细胞功能的影响,并探究橡黄素在肠炎治疗中的作用机制,为炎症性肠炎的治疗提供新的思路。研究方法:（1）3.5%葡聚糖硫酸钠喂养ArgmyeKO小鼠或野生型小鼠8～12天得到肠炎小鼠。从喂养之日起每天记录小鼠体重,对粪便硬度,粪便潜血水平进行评分,直至小鼠死亡,测量结直肠长度。以时间为横坐标评分为纵坐标绘制肠炎小鼠疾病得分曲线,以时间为横坐标存活率为纵坐标绘制肠炎小鼠生存曲线,对比两组肠炎小鼠结直肠长度,借此评估肠炎状态下Arg-1对小鼠的影响。（2）流式分选纯化肠炎小鼠脾脏MDSC,与带有CFSE标记的CD3、CD28刺激的小鼠T细胞共培养3天,流式检测评估Arg-1敲除对MDSC功能的影响。（3）在肠炎发病前后收集小鼠外周血,脾脏细胞以及派氏集合淋巴结细胞检测MDSC、Th17细胞、Treg细胞以及γδT细胞的比例。取肠炎小鼠结直肠做HE染色评估免疫细胞浸润状态和肠粘膜屏障受损情况。（4）流式检测肠炎小鼠MDSC Arg-1的分泌,检测Th17细胞IL-17A、IL-17F以及IL-22的分泌;荧光定量PCR检测肠炎小鼠结直肠组织中ACTI、IL-22、IL-23、OCLN、COX-2 的表达。（5）流式分选纯化野生型小鼠脾脏MDSC,转输给ArgmyeKO小鼠,记录小鼠体重,粪便硬度,便血程度,结直肠长度。流式检测转输MDSC后肠炎小鼠派氏集合淋巴结和肠黏膜淋巴结中Th17细胞IL-17A、IL-17F的表达水平。（6）在第0,3,5,7天给肠炎小鼠腹腔注射橡黄素,橡黄素用量按0.5 μM/g体重计算。记录小鼠体重,粪便硬度,便血程度,结直肠长度。流式检测肠炎小鼠外周血,脾脏以及肠道固有层中MDSC 比例以及Arg-1和pSTAT3的水平,分选脾脏MDSC荧光定量PCR检测ESRI、ESR2的水平,检测小鼠脾脏和外周血派氏集合淋巴结和肠黏膜淋巴结中Th17细胞和γδT细胞IL-17A、IL-17F的表达水平。荧光定量PCR检测橡黄素治疗后肠炎小鼠结直肠组织中ACT1、IL-22、IL-23、OCLN、COX-2 的表达。研究结果:（1）肠炎期间Argmye KO小鼠体重下降明显,便血严重,肠组织中大量免疫细胞浸润,死亡率高于WT组小鼠。（2）肠炎期间ArgmyeKO小鼠结直肠组织IL-17A表达水平低于WT组小鼠;IL-17F表达水平高于WT组小鼠。ArgmyeKO小鼠派氏集合淋巴结中Th17细胞IL-17A的分泌量低于WT组小鼠,而IL-17F表达量则高于WT组小鼠。（3）肠炎期间ArgmyeKO小鼠肠组织和外周血中MDSC L比例低于WT组小鼠;其中M-MDSC 比例显着低于WT组,G-MDSC 比例组间无统计学意义。脾脏MDSC 比例在组间无统计学意义。此外,ArgmyeKO小鼠MDSC三个抑制分子Arg-1,iNOS,IDO表达水平低于WT组小鼠。ArgmyeKO小鼠结直肠中ACT1和COX-2表达量高于WT组小鼠;IL-22,IL-23,OCLN表达量在ArgmyeKO小鼠结直肠中更低。（4）转输WT来源的MDSC后,ArgmyeKCO小鼠便血减轻,体重流失程度减轻,结直肠比对照组小鼠更长。流式结果显示转输MDSC后,ArgmyeKO小鼠派氏集合淋巴结和肠黏膜淋巴结中Th17细胞分泌更多的IL-17A;而IL-17F的表达量低于对照组。（5）给予橡黄素治疗后,肠炎小鼠疾病评分降低,体重降低程度减轻,结直肠长度比对照组小鼠更长。流式结果显示治疗组小鼠外周血,脾脏和肠组织中MDSC 比例明显升高。MDSC表面雌激素受体表达量上升,胞内pSTAT3水平提高,MDSC分泌更多Arg-1。（6）给予橡黄素治疗后,肠炎小鼠结直肠组织IL-17A、IL-17F表达量升高。流式结果显示派氏集合淋巴结,肠黏膜淋巴结中Th17细胞和γδ T细胞分泌更多IL-17A;而IL-17F水平也高于对照组小鼠。治疗组小鼠结直肠中ACT1,IL-22,IL-23和OCLN表达量高于对照组小鼠;COX-2表达水平下降。结论:本研究发现在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中,激活MDSC中ESR/STAT3信号通路可以上调MDSC Arg-1的分泌水平。经橡黄素治疗后,肠炎小鼠体内MDSC 比例显着升高并分泌大量Arg-1。Arg-1提高Th17细胞IL-17A的表达同时抑制IL-17F的水平,促进肠粘膜修复相关因子的表达,从而缓解肠炎。我们的数据强调了 MDSC来源的Arg-1在小鼠肠炎中对Th17细胞IL-17A和IL-17F的调节作用,揭示了橡黄素缓解肠炎发病的机制,并为肠炎的治疗提供了新的思路。
陈一方[8]（2020）在《桦褐孔菌多糖对小鼠炎症性肠病模型的治疗作用及其机制研究》文中进行了进一步梳理研究背景:炎症性肠病（Inflammatory bowel disease,IBD）是一种非特异性炎症性肠道疾病,主要包括克罗恩病（Crohn’s disease,CD）和溃疡性炎症性肠病（Ulcerative colitis,UC）两种疾病形式,此病在欧美国家多发,截至2015年,美国IBD患者数量已超过100万,欧洲超过250万,欧美等发达国家IBD发病率高达0.5%。近十年发现,亚洲、中东及南美等地区的新兴工业化国家IBD发病率也持续增加。由于新兴工业化国家发病率及人口总量急剧增长,预测至2025年,IBD患者总量将与西方国家人口总量相持平,IBD将成为新的全球性负担。IBD多发病于青壮年时期,致病因素尚不明确,多认为与易感基因突变、环境的改变、肠道菌群失衡及免疫应答异常等有关,致病因素的不确定性及多样性加剧了 IBD的治疗难度,其中免疫功能紊乱及免疫应答异常,被认为是引起IBD发病的主要因素,也是靶向治疗IBD的主要目标。树突状细胞（Dendritic cells,DC）是功能最强大的专职抗原提呈细胞（Antigen presenting cell,APC）,是连接固有免疫和适应性免疫的“桥梁”,通过自身耐受性及分泌的特异性细胞因子的不同,调控CD4+T细胞分化为不同的辅助T细胞（T helper cells,Th）或调节性 T 细胞（Regulatory cells,Treg）,使免疫系统发挥免疫激活或免疫耐受作用,进而参与包括IBD在内的多种自身免疫性疾病的发生与发展。CD4+T细胞主要由Th细胞亚群和Treg细胞亚群组成,IBD患者结肠组织往往伴随大量CD4+T细胞的浸润,最初认为Th1/Th2细胞分化失衡是介导IBD发病的主要机制,Th1细胞的过度活化使促炎因子IFN-γ大量表达,抑制IL-4依赖性的Th2细胞的分化,使Th1/Th2细胞轴产生严重偏移,加剧炎症反应,进而在IBD中发挥致病作用。随着IL-17分泌性Th17细胞亚群在IBD患者中检出,Th17细胞在IBD中的致病作用被逐步确定,补充了 Th1/Th2细胞失衡致病的理论。Th17细胞通过分泌促炎因子IL-17参与炎症反应,介导剧烈的组织损伤,其分化呈IL-6依赖性。IL-6抑制TGF-β依赖性亚群Treg细胞的分化,Treg细胞数量不足或功能受损也是IBD发病的机制之一,因此Th17/Treg细胞的分化失衡,成为介导IBD的新型机制,并被广泛探究。目前,IBD的治疗方案主要集中在药物治疗,主要包括氨基水杨酸类药物、皮质类固醇类药物、免疫抑制剂、单抗药物,及其他选择性药物如抗生素、益生菌、维生素及罗格列酮等。随着细胞分子医学及免疫学的深入研究,更多的IBD机制及药物靶点被发现,使IBD的治疗药物及治疗方式呈现多元化开发。然而目前IBD仍然难以被根治,复发率极高,且治疗药物价格昂贵、用药周期长、不良反应等因素,促使研究人员不断探索新的安全、高效、平价的IBD治疗药物或治疗手段。研究目的:桦褐孔菌又称白桦茸,是生长于白桦、银桦、榆树、赤杨等树皮下的一种可食用真菌,多分布于北纬40-50°的寒冷地带,如我国黑龙江省、吉林省长白山等地区,欧洲国家早在16世纪便利用其治疗恶性肿瘤、糖尿病、炎症等难治性疾病。桦褐孔菌多糖（Inonotus obliquus polysaccharide,IOP）是由桦褐孔菌提取的最具有药用价值的活性成分之一,具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节、降血糖、降血脂等多种生物活性,但其对葡聚糖硫酸钠（Dextran sulphate sodium,DSS）诱导的实验性结肠炎的治疗作用及相关机制尚不明确。因此本研究采用不同浓度的IOP探索其对DSS诱导的急、慢性结肠炎的治疗作用,并探索其与DC及CD4+T细胞相关的治疗机制,为IOP治疗IBD提供可行性及理论依据,并通过IOP诱导的耐受性骨髓来源树突状细胞（Bone marrow-derived dendritic cells,BMDC）的体内回输,为IBD免疫细胞治疗提供新的可能性。第一部分IOP对DSS诱导的慢性炎症性肠病的治疗作用研究方法:采用热水浸提法提取IOP,并采用高效液相检测IOP的单糖组成。BALB/c雄性6-8周龄小鼠给予3%DSS三次循环共43天造模法建立慢性结肠炎模型,实验组给予三种不同浓度IOP（100,200,300mg/kg）处理,每日检测小鼠体重、粪便性状、便血情况,并进行疾病活动指数（Disease active index,DAI）评分。第44天脱颈法处死小鼠,测量小鼠结肠长度,评估小鼠肠道炎症严重程度。小鼠结肠石蜡切片进行苏木素-伊红染色（Hematoxylin-Eosin staining,HE）染色并进行组织学评分,免疫组化（Immunohistochemistry,IHC）法检测小鼠结肠组织中带状闭合蛋白（Zonula occludens-1 protein,ZO-1）、Occludin这两种紧密连接（Tightjunction,TJ）蛋白的表达,观察小鼠结肠组织完整性及黏膜损伤情况;逆转录-聚合链酶反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）法检测小鼠结肠组织中与Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Treg细胞相关的特异性细胞因子及转录因子的基因水平表达情况。流式细胞术检测小鼠脾脏及肠系膜淋巴结（Mesenteric lymph node,MLN）中 Th1 细胞、Th2 细胞、Th17 细胞、Treg细胞的分化情况。IHC及免疫印迹（Western blot,WB）法检测与CD4+T细胞分化相关的JAK-STAT信号通路相关蛋白STAT1、STAT3、STAT6在结肠组织中的表达情况。研究结果:经高效液相法检测,我们所提取的IOP主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖组成,含量分别为9.2%、4.4%、46.6%、11.5%、11.1%、4.3%。糖度仪检测多糖含量大于90%,适用于后续研究。与模型组相比,IOP（100,200,300 mg/kg）治疗组小鼠体重变化率较小,结肠长度明显恢复,DAI及组织学评分显着降低,肠道炎症情况得到明显改善,结肠组织TJ蛋白ZO-1及Occludin丢失较少,显着保护了结肠组织通透性及完整性。RT-PCR结果显示,IOP（100,200,300 mg/kg）使结肠组织中Th1细胞、Th17细胞相关促炎因子IFN-y、IL-17及特异性转录因子T-bet、ROR-yt表达量下降,使Th2细胞、Treg细胞相关抑炎因子IL-4、IL-10及特异性转录因子GATA-3、Foxp3表达量上升。同时,IHC及WB结果表明,IOP（100,200,300 mg/kg）对CD4+T细胞分化相关的上游通路JAK-STAT信号通路具有调控作用,使STAT1及STAT3的磷酸化水平下调,入核量减少,STAT6的磷酸化水平上调,入核量增多。流式细胞术结果表明,IOP（100,200,300 mg/kg）可以显着抑制脾脏及MLN中Th1细胞及Th17细胞的分化,促进Th2细胞及Treg细胞的分化,使结肠炎小鼠体内Th1/Th2细胞、Th17/Treg细胞轴趋向平衡。研究结论:1.我们所提取的IOP（100,200,300mg/kg）可以显着缓解DSS诱导的慢性结肠炎的炎症情况。2.IOP（100,200,300 mg/kg）对实验性结肠炎的治疗作用与调控Th1/Th2细胞、Th17/Treg细胞的分化平衡有关。3.IOP（100,200,300 mg/kg）CD4十T细胞亚群的分化的作用可能与STAT1、STAT3、STAT6等蛋白的调控有关。第二部分IOP对CD4+T细胞体外分化的影响研究方法:为探索IOP对Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞及Treg细胞分化过程的影响,CD4+免疫磁珠阴性分选法获取C57BL/6雄性小鼠脾脏CD4+T细胞,活细胞荧光染料CFSE（2 μM）进行标记后,将细胞平均分为CD4+T组、对照组、IOP（10,20,40mg/mL）三种剂量组（即 IOP-L、IOP-M、IOP-H）,除 CD4十T 组外,均给予抗鼠CD3ε抗体（5μg/mL）及抗鼠CD28抗体（3μg/mL）刺激活化三天。流式细胞术检测IOP（L,M,H）分别对CD4+T细胞活化标志CD69、CD25的影响,以及对CD4+T细胞增殖率及增殖指数的影响。RT-PCR法检测Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞及Treg细胞相关细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10及特异性转录因子T-bet、GATA-3、ROR-yt、Foxp3基因水平的表达情况。酶联反应吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测 IFN-γ、IL-4、IL-17、IL-10蛋白水平的分泌情况。对Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞三种细胞亚群给予定向分化,同时给予IOP（L,M,H）处理,流式细胞术检测IOP（L,M,H）对Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞分化率的影响。研究结果:结果显示,与对照组相比,IOP（L,M,H）并不影响CD4+T细胞前期及后期的活化指标CD69、CD25的表达量,细胞的增殖率及增殖指数也未产生显着差异,提示IOP（L,M,H）可能并不作用于CD4+T细胞活化及增殖过程。RT-PCR结果显示,IOP（L,M,H）使活化的CD4+T细胞中,Th1细胞及Th17细胞相关的促炎因子IFN-γ、IL-17及特异性转录因子T-bet、ROR-γt的表达量明显降低,Treg相关的抑炎因子IL-10及特异性转录因子Foxp3的表达量明显上调,而对Th2细胞相关细胞因子IL-4及转录因子GATA-3作用较为局限。ELISA结果显示,IFN-γ、IL-17表达量下调,IL-10表达量上调。Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞定向分化实验结果显示,IOP（L,M,H）使Th1细胞、Th17细胞分化率显着下调,使Treg细胞的分化率显着上调,IOP（L,M,H）对CD4+T细胞分化阶段具有直接调控作用。研究结论:1.IOP（L,M,H）并不参与CD4+T细胞的活化及增殖阶段,而是对其分化阶段产生直接调控作用。2.在体外,IOP（L,M,H）可以抑制Th1细胞、Th17细胞的分化,促进Treg细胞的分化,但是对Th2细胞的分化具有局限性。第三部分IOP对BMDC成熟度及功能的影响研究方法:DC是刺激CD4+T细胞分化的最重要的APC,其表面MHC-Ⅱ、共刺激分子的表达以及分泌细胞因子类型对CD4十T细胞的分化方向起绝对作用,DC成熟度的不同是决定其介导免疫耐受或免疫应答的关键,因此,我们在体外实验中探讨IOP对BMDC成熟度的影响,以及对BMDC诱导免疫耐受能力的影响。取C57BL/6雄性6-8周龄小鼠大腿骨骨髓细胞,以2 × 106个/孔铺于六孔板,并给予 rmGM-CSF（20ng/mL）、rmIL-4（20ng/mL）刺激分化 6 天,第 7 天收集板中悬浮及半悬浮细胞即为BMDC。采用100ng/mL脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）刺激BMDC24小时,使BMDC活化并成熟,即为BMDCLPS细胞,部分BMDCLPS细胞分别给予IOP（10,20,40 mg/mL）即IOPL,M,H处理。流式细胞术检测BMDC成熟度相关指标MHC-Ⅱ、CD40、CD86的表达情况,ELISA检测以及与诱导Th1细胞、Th17细胞和Treg细胞分化相关的细胞因子IL-12、IL-6、TGF-β的分泌情况。取不同处理的BMDC与CD4+T细胞以1:5的比例共同培养,总细胞量2 × 106个/孔铺于六孔板中,建立混合淋巴反应（Mixed lymphocyte reaction,MLR）体系,流式细胞术检测Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞分化率,ELISA检测MLR体系中与此三种细胞分化启动相关的细胞因子IL-12、IL-6、TGF-β的分泌情况。研究结果:MHC-Ⅱ及表面共刺激分子CD40、CD86等的表达量是判断DC成熟与否的标志,同时也是激活CD4+T细胞的第一、二信号,流式细胞术结果显示,与未进行活化刺激的BMDC相比,BMDCLPS表面高表达MHC-Ⅱ以及共刺激分子CD40、CD86,成熟度显着升高。ELISA及流式细胞术检测显示,BMDCLPS分泌与Th1细胞、Th17细胞分化相关的细胞因子IL-12、IL-6明显增高,并使CD4+T细胞向Th1细胞、Th17细胞方向分化率显着上调,MLR体系整体呈现免疫激活状态。而 IOPL,M,H-BMDCLPS组与 BMDCLPS相比,MHC-Ⅱ、CD40 及 CD86 的表达量均明显下降,成熟度显着降低,且TGF-β的分泌量明显提升,使CD4+T细胞向Treg细胞方向分化比率显着上调,使MLR体系呈现免疫耐受状态。研究结论:1.IOPL,M,H使BMDCLPS维持低成熟状态。2.IOPL,M,H-BMDCLPS使CD4+T细胞向Treg细胞方向分化,具有维持免疫耐受的功能。第四部分IOPL-BMDC对DSS诱导的急性结肠炎的治疗作用研究方法:各种功能稳定的免疫耐受性DC被应用到结肠炎模型的治疗中,并验证具有显着的治疗效果,耐受性DC是IBD细胞治疗的重要细胞来源,因此我们探索IOP诱导的耐受性BMDC是否可以通过调控CD4+T细胞的分化,诱导机体免疫耐受,从而达到治疗结肠炎的作用。C57BL/6雄性6-8周龄小鼠采用3%DSS 6天造模法建立急性小鼠结肠炎模型,分为对照（Control）组、模型（DSS）组、BMDC组及IOPL-BMDC组,其中BMDC组及IOPL-BMDC组在给予3%DSS饮用水的前3天及第3天分别给予2 × 106个/只BMDC或IOPL-BMDC腹腔注射,并每日检测各组小鼠生存率、体重、是否便血及腹泻情况,并进行DAI评分。第7天断颈处死小鼠,测量小鼠结肠长度并拍照,评估小鼠肠道受损情况。结肠组织石蜡切片进行HE染色观察结肠组织完整性相关指标并进行组织学评分。IHC法检测小鼠结肠组织TJ蛋白ZO-1和Occludin的表达量,观察小鼠结肠组织完整性及黏膜损伤情况。取小鼠脾脏及MLN,流式细胞术检测Th1细胞、Th17细胞及Treg细胞的分化情况。ELISA法检测小鼠结肠组织匀浆上清液中与CD4+T细胞分化相关的细胞因子IL-12、IL-6、TGF-β、IFN-γ、IL-17、IL-10的分泌情况。研究结果:BMDC及IOPL-BMDC的体内回输,使结肠炎小鼠体重变化率及DAI评分明显降低,恢复因炎症造成的结肠短缩,生存率得到明显改善,小鼠炎症程度得到显着控制。HE及IHC结果显示,与模型组相比,BMDC及IOPL-BMDC组小鼠结肠组织杯状数量增多,隐窝完整,组织完整性得到改善,TJ蛋白ZO-1、Occludin的流失减少,黏膜损伤程度明显降低,且以IOPL-BMDC抗炎效果更为显着。ELISA结果显示,IOPL-BMDC显着抑制与Th1细胞及Th17细胞分化相关的促炎因子IL-12、IFN-γ、IL-6、IL-17的分泌,提高Treg分化相关的抗炎因子TGF-β、IL-10的分泌。流式细胞术结果显示,Th17细胞亚群在正常组小鼠及结肠炎小鼠脾脏及MLN中的分化均不明显,模型组高表达促炎性T细胞亚群Th1细胞,低表达抗炎性T细胞亚群Treg细胞,给予BMDC及IOPL-BMDC回输治疗后,结肠炎小鼠脾脏及MLN中Th1细胞亚群分化率明显降低,而Treg细胞亚群分化率显着提升,其中以IOPL-BMDC组对CD4+T细胞亚群调控能力最为显着。研究结论:1.IOPL-BMDC可以通过调控结肠炎小鼠CD4+T细胞的分化缓解DSS诱导的小鼠急性炎症性肠病。2.IOPL-BMDC为炎症性肠病的细胞治疗提供新的可能性,为耐受性DC的制备提供新的思路。结论:不同剂量IOP（100,200,300 mg/kg）均可显着改善DSS诱导的慢性结肠炎小鼠疾病进程,调控结肠炎小鼠脾脏、MLN及结肠组织中Th1/Th2、Th17/Treg细胞亚群平衡,这种调控作用可能与JAK-STAT信号通路有关。不同浓度IOP（10,20,40 mg/mL）均不影响体外的脾脏来源的CD4+T细胞增殖及活化,对分化具有直接调控作用,抑制Th1细胞、Th17细胞分化,促进Treg细胞分化,对Th2细胞的分化调控具有局限性。IOPL,M,H均可维持LPS（100 ng/mL）诱导的炎性环境下BMDC的低成熟状态,并促进MLR反应体系中CD4+T细胞向Treg细胞方向分化,抑制Th1细胞及Th17细胞的分化。IOPL-BMDC显着缓解DSS诱导的急性炎症性肠病,并调控结肠炎小鼠脾脏及MLN中CD4+T细胞亚群分化,抑制Th1细胞分化,促进Treg细胞分化,对Th17细胞分化具有一定局限性。
葛改[9]（2020）在《复发性外阴阴道念珠菌病致病菌菌学特征及宿主Th1、Th2和Th17相关细胞因子血清水平研究》文中研究指明目的:评估复发性外阴阴道念珠菌病（Recurrent vulvovaginal candidiasis,RVVC）流行病学、临床特点和致病病原菌菌学特征及患者Th1、Th2、Th17相关促炎和抗炎细胞因子的表达,从致病菌和宿主免疫水平两方面探讨RVVC的可能发病机制,为RVVC的防治提供理论依据。方法:收集2017年10月至2018年5月济宁市第一人民医院确诊为RVVC、外阴阴道念珠菌病（Vulvovaginal candidiasis,VVC）患者流行病学、临床特点,分离培养致病病原菌,进行菌种鉴定、比对菌种分布和抗真菌药物体外药敏试验;收集患者及正常人血清,检测Th1、Th2和Th17相关细胞因子水平。结果:RVVC组/VVC组发病年龄范围分别为27-52岁/16-55岁,平均年龄为35.1岁/31.3岁,25-34岁年龄段高发。RVVC组发病年龄、平均年龄均晚于VVC组（P>0.05）。年龄、宿主及外界因素、遗传因素、菌种分布以及念珠菌菌株皆为诱发因素。本次实验共收集了98株菌,白念珠菌（Candida albicans,C.albicans）93株（94.9%）,光滑念珠菌（C.glabrata）3株（3.1%）,热带念珠菌（C.tropicalis）2株（2%）。RVVC组中非白念珠菌（non-albicans Candida species,NAC）比例（10%）高于VVC组（3.9%）（P>0.05）。两组药敏结果差异无统计学意义,C.albicans对米卡芬净的敏感性最高（100%/100%）,对特比奈芬耐药率最高,其次为两性霉素B（耐药率为88.9%/98.7%）、伊曲康唑（14.7%/0%）。NAC耐药率普遍高于C.albicans。RVVC组血清IFN-γ、TNF-α水平低于VVC组,IL-4水平高于VVC组,均有统计学意义;RVVC组IL-17A/IL-17F/IL-6/IL-10/IL-2低于VVC组,且无统计学意义。结论:RVVC/VVC都是多因素的疾病,RVVC/VVC病原菌多为C.albicans（94.9%）,而C.glabrata为NAC的首位致病菌,RVVC病原菌菌学特征与普通VVC均无差异。治疗敏感药物有棘白菌素类、第二、三代三唑类药物,第一代唑类药物已出现部分耐药现象。从宿主免疫学角度来看,Th1/Th2相关细胞免疫在RVVC中起着重要作用,而Th17相关免疫有待进一步验证。
李智伟[10]（2020）在《布鲁氏菌感染中巨噬细胞极化通过PD-1/PD-L2途径对T细胞亚群的调控作用研究》文中研究说明目的:布鲁氏菌病（brucellosis）是由布鲁氏菌（brucella）感染导致的一种人畜共患病。慢性程度高,免疫机制不清。本研究以布鲁氏菌病为疾病模型,探讨巨噬细胞极化和程序性死亡蛋白1（Programmed death 1,PD-1）及其配体2（Programmed cell death ligand2,PD-L2）通路在布鲁氏菌病发生发展中的作用及分子机制,为研究布鲁氏菌感染的免疫机制提供新的理论依据。通过研究明确布鲁氏菌持续感染时巨噬细胞极化特点以及淋巴细胞亚群的变化特点;阐明M2型巨噬细胞通过PD-1/PD-L2途径变化调控Th细胞的机制;探讨外膜蛋白2b（Outer membrane protein 2b,Omp2b）蛋白对巨噬细胞极化的影响。方法:（1）对581例布鲁氏菌病患者进行人口学,流行病学,临床特征和实验室检查特点分析。收集2017年9月至2019年6月就诊于维吾尔自治区人民医院住院和门诊的布鲁菌患者共126例,同期120例体检健康志愿者作为健康对照人群。通过流式细胞术检测外周血M1和M2型巨噬细胞以及PD-L2的表达;荧光定量PCR和Western Blot检测iNOS、Arg-1、TNF-α、IL-1RA的mRNA和蛋白表达。Aimplex法检测血清中TNF-α、IL-1RA水平。通过体外试验观察被布鲁氏菌刺激后的巨噬细胞功能特点改变。（2）通过流式细胞术检测外周血中淋巴细胞亚群,Th1,Th2,Th17,Treg细胞及其上PD-1的表达变化。荧光定量PCR和Western Blot检测T-bet、GATA-3、IFN-γ、IL-4的mRNA和蛋白表达。Aimplex法检测血清中IFN-γ和IL-4水平。通过分选布鲁氏菌患者的M2细胞和健康对照人群的CD4+T细胞,进行体外刺激试验。分别对PD-L2进行增强或阻断,以及对PD-1阻断,观察荧光定量PCR和Western Blot检测T-bet、GATA-3、IFN-γ、IL-4的mRNA和蛋白表达;Aimplex法检测IFN-γ和IL-4的变化情况。（3）将THP-1细胞诱导为M1和M2型巨噬细胞,加入Omp2b蛋白进行体外培养试验。通过流式细胞术检测CD86、CD80、CD206和CD163表达情况;荧光定量PCR和Western Blot检测iNOS、Arg-1、TNF-α和IL-1RA的mRNA和蛋白表达。Aimplex法检测TNF-α、IL-6、IL-1RA、IL-10的水平变化情况。观察Omp2b蛋白对M1和M2型巨噬细胞的影响。使用生物信息学分析Omp2b蛋白并进行免疫原性检验。结果:（1）流式细胞术检测发现M2型巨噬细胞在布鲁氏菌病时增加,PD-L2在M2细胞上表达降低。荧光定量PCR和Western Blot在分子和蛋白水平检测表明iNOS和TNF-α轻度增加,Arg-1和IL-1RA显着增加,Arg-1/iNOS和IL-1RA/TNF-α显着增加。血清中TNF-α增高,IL-1RA显着增高,IL-1RA/TNF-α显着增高。体外试验结果发现被布鲁氏菌刺激后的巨噬细胞吞噬能力下降,未刺激组的iNOS、TNF-α的mRNA和蛋白水平下降,而Arg-1、IL-1RA的mRNA相对水平升高。CD206表达上调,CD86、PD-L2和HLA-DR表达下调。（2）流式细胞术检测发现,CD3+T比例无明显变化,CD4+T比例下降,CD8+T、CD19+B、CD16+56+NK细胞比例增多,绝对数量检测发现所有淋巴细胞都增加。Th1降低,Th2增多,Th17不变,Treg增高,PD-1在Th1、Th2、Treg细胞上的表达增高。血清中IFN-γ轻度增加,IL-4明显增加,IL-4/IFN-γ显着增加。T-bet的mRNA和蛋白水平无明显变化,GATA-3和IL-4的mRNA和蛋白水平则升高,IFN-γ的mRNA和蛋白水平升高。体外试验结果发现,在加入了PD-L2后,M2型巨噬细胞会上调T-bet和IFN-γ的表达水平,并下调GATA-3和IL-4的表达水平。在加入了Anti-PD-L2后,M2型巨噬细胞会进一步下调T-bet的表达水平,并上调GATA-3和IL-4的表达水平,阻断PD-L2后则会得到相反的结果。加入PD-L2使T-bet和IFN-γ的表达水平升高后,进一步加入Anti-PD-L2阻断PD-L2可以下调T-bet和IFN-γ的表达水平。在加入PD-L2并阻断PD-L2后,T-bet、GATA-3、IFN-γ和IL-4的表达水平恢复到与M2组相同的水平。在阻断PD-L2或者阻断PD-1后T-bet、GATA-3、IFN-γ和IL-4的表达水平无明显差异。（3）体外试验表明,Omp2b刺激后的M2细胞上的CD86、CD80的表达水平上调,CD206和CD163表达水平下调;iNOS、TNF-α的mRNA和蛋白水平上调,Arg-1、IL-1RA的mRNA和蛋白水平下调;TNF-α,IL-6水平增多,IL-1RA、IL-10水平降低。Omp2b刺激后的M1细胞上的iNOS、Arg-1、IL-1RA的mRNA和蛋白无变化;TNF-α,IL-6水平增多,IL-1RA、IL-10水平无明显变化。生物信息学分析发现Omp2b蛋白中有3个Th表位、7个CTL表位,8个B细胞表位和1个TB联合表位,可以有效刺激宿主产生免疫应答。结论（1）布鲁氏菌病患者体内巨噬细胞以M2型极化占优势,M2型巨噬细胞上的PD-L2表达下调。体外试验表明布鲁氏菌能诱导巨噬细胞向M2方向极化以及表型改变,PD-L2参与了巨噬细胞极化及免疫应答改变。（2）布鲁氏菌病患者外周血中CD4+T淋巴细胞亚群数量增加,CD4/CD8比值下降。Th1细胞比例降低,Th2细胞比例增多,Treg细胞比例增多,Th1、Th2、Treg上的PD-1增高,PD-1参与了CD4+T亚群的调控。体外试验表明M2型巨噬细胞通过PD-1/PD-L2途径影响Th1/Th2平衡参与布鲁氏菌病的发生发展。（3）Omp2b蛋白能够抑制M2型极化,并促进M2型巨噬细胞向M1方向转变。生物信息学分析发现Omp2b蛋白中有10个T细胞表位,8个B细胞表位和1个T-B联合表位,可以有效刺激T细胞产生IFN-γ,发生Th1型免疫应答,有助于抵抗布鲁氏菌感染。
二、IL-4、IL-12、IL-6/STAT/SOCS途径对Th细胞分化调节机制的研究进展（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、IL-4、IL-12、IL-6/STAT/SOCS途径对Th细胞分化调节机制的研究进展（论文提纲范文）
（1）Th17细胞分化与调控的研究进展（论文提纲范文）
| 1 Th17细胞的发现与组成 |
| 2 Th17细胞的分化与生物学效应 |
| 3 Th17细胞的分化调控 |
| 3.1 Th17细胞分化的细胞因子调控 |
| 3.1.1 促进Th17细胞分化的细胞因子 |
| 3.1.1. 1 IL-1 |
| 3.1.1. 2 IL-6和TGF-β |
| 3.1.1. 3 IL-21 |
| 3.1.1. 4 IL-23 |
| 3.1.2 抑制Th17细胞分化的细胞因子 |
| 3.2 Th17细胞分化的转录因子调控 |
| 3.3 Th17细胞信号传导及转录激活因子通路的调控 |
| 4 结语 |
（2）Th17细胞中SOX-5介导RORγt基因新的增强子RORCE2与启动子相互作用的机制研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| Abstract |
| 中文摘要 |
| 第一章 前言 |
| 第二章 增强子RORCE2 通过增强RORγt的表达促进Th17 细胞的分化 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 结论 |
| 第三章 SOX-5 介导增强子RORCE2与RORγt启动子的相互作用影响Th17 细胞的分化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 结论 |
| 第四章 Th17 细胞中SOX-5与STAT3 协同诱导增强子RORCE2 的染色质开放 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 结论 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 文献综述 Th17 细胞中RORγt转录调控及转录后调控的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间研究成果 |
| 致谢 |
（3）新城疫病毒调节树突状细胞IL-12表达及其抑制抗原递呈机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 新城疫病毒蛋白功能及载体疫苗研究进展 |
| 1.1 病原学 |
| 1.1.1 病毒结构 |
| 1.1.2 NDV基因组和功能蛋白 |
| 1.2 NDV免疫逃避机制 |
| 1.2.1 V蛋白抑制JAK/STAT通路 |
| 1.2.2 V蛋白降解模式识别受体MDA-5 |
| 1.2.3 V蛋白抑制MAVS的信号转导 |
| 1.2.4 V蛋白促进MEK/ERK通路的激活 |
| 1.2.5 V蛋白抑制细胞凋亡 |
| 1.3 新城疫载体疫苗的研究进展 |
| 1.3.1 新城疫载体疫苗发展历史 |
| 1.3.2 新城疫载体疫苗的应用 |
| 第二章 树突状细胞与抗原递呈 |
| 2.1 DCs的亚群分类 |
| 2.1.1 经典DC |
| 2.1.2 其他DC亚群 |
| 2.2 DC与抗原递呈 |
| 2.2.1 DC的抗原摄取与迁移 |
| 2.2.2 DC的成熟与T细胞活化 |
| 2.2.3 CD4~+T细胞分化 |
| 第三章 副粘病毒抑制抗原递呈 |
| 3.1 副粘病毒对DC功能的影响 |
| 3.1.1 对DC表面成熟标记的影响 |
| 3.1.2 对DC细胞因子分泌的影响 |
| 3.1.3 对DC迁移的抑制 |
| 3.1.4 对DC吞噬能力的影响 |
| 3.2 副粘病毒抑制DC与T细胞的互作 |
| 3.2.1 诱导共培养细胞的凋亡 |
| 3.2.2 感染后DC表面糖蛋白会抑制T细胞增殖 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 NDV感染诱导DC成熟 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 毒株、细胞及实验动物 |
| 1.1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.1.3 小鼠骨髓源DC的分离培养 |
| 1.1.4 小鼠淋巴细胞分离 |
| 1.1.5 流式细胞术检测 |
| 1.1.6 上清细胞因子分泌的测定 |
| 1.1.7 DC的抗原摄取能力检测 |
| 1.1.8 DC迁移能力检测 |
| 1.1.9 DC细胞活性测定 |
| 1.1.10 统计学分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 BMDCs的培养与鉴定 |
| 1.2.2 NDV的感染效率检测 |
| 1.2.3 DC表面成熟分子标志检测 |
| 1.2.4 DC细胞因子分泌检测 |
| 1.2.5 DC吞噬能力检测 |
| 1.2.6 DC迁移能力检测 |
| 1.2.7 DC和T细胞的凋亡检测 |
| 1.3 讨论 |
| 1.3.1 宿主选择及NDV感染效率 |
| 1.3.2 小鼠DC感染后表型成熟 |
| 1.3.3 NDV弱毒感染并未诱导过高凋亡水平 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 NDV感染抑制DC抗原递呈并诱导Th2型应答 |
| 2.1 材料方法 |
| 2.1.1 毒株、质粒及实验动物 |
| 2.1.2 主要试剂与仪器 |
| 2.1.3 T细胞增殖(抗原递呈)检测 |
| 2.1.4 上清细胞因子分泌的测定 |
| 2.1.5 表达萤火虫荧光素酶的重组新城疫质粒prL-Luc构建 |
| 2.1.6 重组病毒的拯救 |
| 2.1.7 重组病毒的鉴定 |
| 2.1.8 荧光素酶活性检测 |
| 2.1.9 动物实验及分组 |
| 2.1.10 流式细胞术 |
| 2.1.11 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 NDV感染DC体外刺激小鼠T细胞增殖能力检测 |
| 2.2.2 共培养上清细胞因子分泌检测 |
| 2.2.3 NDV感染DC体外刺激小鼠T细胞分化能力检测 |
| 2.2.4 NDV诱导抑炎因子IL-10 的检测 |
| 2.2.5 prL-Luc质粒构建 |
| 2.2.6 重组病毒的鉴定 |
| 2.2.7 小鼠活体成像观察 |
| 2.2.8 脾脏DC成熟水平检测 |
| 2.2.9 脾脏淋巴细胞检测(体内抗原递呈) |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 NDV感染的DC功能不成熟导致小鼠T细胞增殖抑制 |
| 2.3.2 NDV感染会诱导免疫抑制因子IL-10 表达 |
| 2.3.3 NDV在小鼠的体内抗原递呈 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 NDV通过抑制小鼠DC IL-12p70分泌抑制T细胞增殖 |
| 3.1 材料方法 |
| 3.1.1 毒株及实验动物 |
| 3.1.2 主要试剂与仪器 |
| 3.1.3 DC的细胞处理与分组 |
| 3.1.4 荧光定量PCR(qRT-PCR) |
| 3.1.5 上清细胞因子分泌的测定 |
| 3.1.6 流式细胞术检测 |
| 3.1.7 Western blot检测 |
| 3.1.8 p-p65的ELISA检测 |
| 3.1.9 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 NDV抑制IL-12p70的生成 |
| 3.2.2 NDV通过抑制IL-12p40表达抑制IL-12p70生成 |
| 3.2.3 NDV通过抑制p38通路抑制p65的磷酸化入核 |
| 3.2.4 NDV感染并未抑制IL-12 受体表达 |
| 3.2.5 NDV感染抑制小鼠DC刺激T细胞的炎性因子分泌 |
| 3.2.6 外源细胞因子添加能恢复NDV造成的小鼠T细胞抑制 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 NDV抑制IL-12 的方式 |
| 3.3.2 NDV通过IL-12抑制小鼠T细胞下游细胞因子分泌和增殖 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 NDV通过抑制DC IL-12p70的分泌增强病毒感染效率 |
| 4.1 材料方法 |
| 4.1.1 毒株及实验动物 |
| 4.1.2 主要试剂与仪器 |
| 4.1.3 NDV的感染效率检测 |
| 4.1.4 NDV直接抑制T细胞的细胞因子生成和抗原递呈检测 |
| 4.1.5 不同NDV对抗原递呈的抑制水平 |
| 4.1.6 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 NDV抑制小鼠T细胞的细胞因子表达 |
| 4.2.2 IL-12p70降低是抗原递呈抑制的主要原因 |
| 4.2.3 IL-12 可以抑制NDV的感染 |
| 4.2.4 IFN-γ、TNF-α 和IL-6 均可以抑制NDV感染T细胞 |
| 4.2.5 多种NDV均能通过抑制IL-12造成小鼠T细胞增殖抑制 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 NDV能通过小鼠DC感染T细胞造成增殖抑制 |
| 4.3.2 NDV抑制IL-12 及下游细胞因子分泌增强感染效率 |
| 4.3.3 多株NDV都能抑制DC IL-12 分泌抑制T细胞增殖 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 博士学位期间取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）调节性B细胞亚群与系统性红斑狼疮发病的关系及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 英文摘要 |
| 第1章 综述 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 SLE与自身免疫反应 |
| 1.2.1 固有免疫系统在SLE中的作用 |
| 1.2.2 适应性免疫系统在SLE中的作用 |
| 1.3 Bregs研究进展 |
| 1.3.1 Bregs的定义及表型 |
| 1.3.2 Bregs的来源及发育 |
| 1.3.3 Bregs的生成调节 |
| 1.3.4 Bregs的功能 |
| 1.3.5 Bregs与自身免疫性疾病 |
| 1.3.6 Bregs与感染及肿瘤性疾病 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 材料和方法 |
| 2.1 研究对象、仪器和试剂 |
| 2.1.1 研究对象 |
| 2.1.2 主要实验仪器及试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 血液样本采集 |
| 2.2.2 PBMC分离及培养 |
| 2.2.3 流式细胞仪检测B细胞、Th细胞亚群 |
| 2.2.4 ELISA测定血浆标本和细胞上清液中的细胞分子水平 |
| 2.2.5 ELISA测定血浆标本和细胞上清液中的BAFF浓度 |
| 2.2.6 CBA试剂盒检测Th细胞功能分子水平 |
| 2.2.7 Bregs亚群分选及培养 |
| 2.2.8 共培养系统的建立 |
| 2.2.9 统计学方法 |
| 第3章 研究结果 |
| 3.1 研究对象的基本情况 |
| 3.2 SLE患者Bregs的表达情况 |
| 3.2.1 SLE患者外周血IL-10+/IL-35+/TGF-β1+Bregs亚群变化 |
| 3.2.2 SLE患者外周血不同表型Bregs的变化 |
| 3.2.3 SLE患者外周血IL-10、IL-35 以及TGF-β1水平 |
| 3.2.4 SLE患者外周血中Bregs功能变化的探索 |
| 3.2.5 小结 |
| 3.3 SLE患者外周血Th细胞及B细胞亚群的表达情况 |
| 3.3.1 SLE患者外周血Th细胞亚群及其功能分子的变化 |
| 3.3.2 SLE患者外周血B细胞亚群的变化 |
| 3.3.3 SLE患者外周血BAFF水平的变化 |
| 3.3.4 小结 |
| 3.4 Bregs及IL-10、IL-35、TGF-β1水平与SLE临床指标的关系 |
| 3.5 Bregs及IL-10、IL-35、TGF-β1水平与SLE器官受累的关系 |
| 3.6 免疫治疗后SLE患者外周血Bregs及及IL-10、IL-35、TGF-β1水平的变化 |
| 3.7 体外研究Bregs对SLE患者Th细胞亚群的影响 |
| 3.7.1 Transwell体系内Bregs对Th细胞的影响 |
| 3.7.2 小结 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 第6章 创新点 |
| 参考文献 |
| 附表 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（5）固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述一 扶正固卫、肺主皮毛理论与慢性阻塞性肺疾病呼吸道损伤修复 |
| 参考文献 |
| 文献综述二 蛋白质组学在中医药中的应用研究 |
| 参考文献 |
| 第一部分 固本止咳中药对COPD模型小鼠的治疗作用和调控呼吸道损伤修复作用研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 基于组学的固本止咳中药调控COPD模型小鼠呼吸道损伤修复机制的整体研究 |
| 前言 |
| 实验一 基于质谱技术的固本止咳中药成分分析 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 实验二 基于蛋白组学的固本止咳中药调控COPD模型小鼠损伤修复机制研究 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 基于JAK-STAT信号通路的固本止咳中药调控COPD模型小鼠呼吸道损伤修复机制研究 |
| 前言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）白细胞介素-27在支气管哮喘气道炎症和气道重构中的作用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 符号说明 |
| 引言 |
| 第一部分 预防性IL-27处理对哮喘模型小鼠气道炎症、气道高反应和气道重构的影响及相关的信号通路研究 |
| 一、材料及方法 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 主要仪器 |
| 2. 主要试剂 |
| 3. 主要配制试剂极其配制方法 |
| 4. 实验动物 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 哮喘动物模型的建立 |
| 2. 气道反应性测定 |
| 3. 支气管肺泡灌洗液中细胞计数及分类 |
| 4. ELISA法测定BALF的上层清液和血清中细胞因子的含量 |
| 5. 实时定量PCR(Quantitative real-time PCR)法检测肺组织中STAT1、STAT3、T-bet和GATA3 mRNA的表达 |
| 6. Wester blot检测肺组织中STAT1、 pSTAT1、 STAT3、 pSTAT3、 T-bet和GATA3蛋白的表达 |
| 7. 组织病理 |
| 8. 技术路线图 |
| (三) 统计学处理 |
| 二 结果 |
| 1. OVA诱导的哮喘模型小鼠症状及体征变化 |
| 2. 三组小鼠BALF中细胞总数和分类 |
| 2.1 IL-27降低小鼠BALF中细胞总数 |
| 2.2 IL-27降低小鼠BALF中不同的白细胞数量 |
| 3. IL-27改善小鼠的AHR |
| 4. IL-27减少急性哮喘模型三组小鼠BALF上清中IL-4、IL-5、IL-13、L-17含量,提高IFN-y含量 |
| 5. IL-27降低急性哮喘模型三组小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17含量,提高IFN-γ水平 |
| 6. IL-27提高小鼠肺组织STAT1、STAT3、T-bet mRNA的表达,减低GATA3 mRNA的表达 |
| 6.1 STAT1 mRNA PCR定量分析 |
| 6.2 STAT3 mRNA PCR定量分析 |
| 6.3 GATA3 mRNA PCR定量分析 |
| 6.4 T-bet mRNA PCR定量分析 |
| 7. IL-27提高小鼠肺组织STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT3和T-bet蛋白的表达,降低GATA3的表达 |
| 7.1 STAT1和磷酸化STAT1(p-STAT1)蛋白的表达 |
| 7.2 STAT3和磷酸化STAT3(p-STAT3)蛋白的表达 |
| 7.3 GATA3蛋白的表达 |
| 7.4 T-bet蛋白的表达 |
| 8. IL-27改善慢性小鼠哮喘模型的气道重构 |
| 8.1 IL-27改善小鼠基底膜增厚和气道平滑肌细胞增生程度 |
| 8.2 IL-27改善小鼠杯状细胞增生程度 |
| 8.3 IL-27减少小鼠上皮下纤维化程度 |
| 8.4 IL-27降低小鼠纤维母细胞的激活程度 |
| 8.5 IL-27改善小鼠血管生成状况 |
| 第二部分 治疗性IL-27处理对哮喘模型小鼠气道炎症、气道高反应和气道重构的影响 |
| 一、材料及方法 |
| (一) 实验材料 |
| 1. 主要仪器 |
| 2. 主要试剂 |
| 3. 主要配制试剂极其配制方法 |
| 4. 实验动物 |
| (二) 实验方法 |
| 1. 哮喘动物模型的建立 |
| 2. 气道反应性测定 |
| 3. 支气管肺泡灌洗液中细胞计数及分类 |
| 4. ELISA法测定BALF的上层清液和血清中细胞因子的含量 |
| 5. 实时定量PCR法检测肺组织中STAT1、STAT3、T-bet和GATA3 mRNA的表达 |
| 6. Wester blot检测肺组织中STAT1、pSTAT1、STAT3、pSTAT3、T-bet和GATA3蛋白的表达 |
| 7. 组织病理 |
| 8. 技术路线图 |
| (三) 统计学处理 |
| 二、结果 |
| 1. 哮喘模型小鼠症状及体征变化 |
| 2. 三组小鼠BALF中细胞总数和分类 |
| 2.1 IL-27不能降低小鼠BALF中细胞总数 |
| 2.2 IL-27对小鼠BALF中不同类型的白细胞含量无影响 |
| 3. IL-27不能改善小鼠的AHR |
| 4. IL-27对急性哮喘模型小鼠BALF上清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17和IFN-γ含量没有影响 |
| 5. IL-27不影响急性哮喘模型小鼠血清中IL-4、IL-5、IL-13、IL-17和IFN-y水平 |
| 6. IL-27不影响小鼠肺组织STAT1、STAT3、T-bet和GATA3 mRNA的表达. |
| 6.1 STAT1 mRNA PCR定量分析结果 |
| 6.2 STAT3 mRNA PCR定量分析结果 |
| 6.3 GATA3 mRNA的表达 |
| 6.4 T-bet mRNA PCR定量分析 |
| 7. IL-27对小鼠肺组织STAT1、p-STAT1、STAT3、p-STAT1、T-bet和GATA3蛋白的表达没有作用 |
| 7.1 STAT1和p-STAT1蛋白的表达 |
| 7.2 STAT3和p-STAT3蛋白的表达 |
| 7.3 GATA3蛋白的表达 |
| 7.4 T-bet蛋白的表达 |
| 8. IL-27对慢性小鼠哮喘模型气道重构没有影响 |
| 8.1 IL-27不改善模型小鼠基底膜增厚和气道平滑肌细胞增生 |
| 8.2 IL-27不影响模型小鼠杯状细胞增生状况 |
| 8.3 IL-27不能减少模型小鼠上皮下纤维化 |
| 8.4 IL-27不影响模型小鼠纤维母细胞的激活 |
| 8.5 IL-27不改善模型小鼠血管增生状况 |
| 讨论 |
| 1. 支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病 |
| 2. 预防性给予IL-27抑制OVA诱导的急性BA模型小鼠气道炎症和AHR |
| 3. 预防性给予IL-27可以改善OVA诱导的慢性哮喘模型小鼠气道重构 |
| 4. IL-27通过STAT1/STAT3信号途径改善OVA诱导的哮喘小鼠气道炎症、AHR和气道重构 |
| 5. 治疗性给予IL-27不能改善OVA诱导的BA小鼠气道炎症、AHR以及气道重构 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 综述 白细胞介素-27在T淋巴细胞免疫中的作用 |
| 1. IL-27的分子组成 |
| 2. IL-27的来源 |
| 3. IL-27的受体 |
| 4. IL-27的信号转导 |
| 5. IL-27在T细胞免疫中的作用 |
| 5.1 IL-27在Th1细胞免疫中的作用 |
| 5.2 IL-27在Th2细胞免疫中的作用 |
| 5.3 IL-27在Th17细胞免疫中的作用 |
| 5.4 IL-27在Treg免疫中的作用 |
| 5.5 IL-27在滤泡辅助T细胞(Tfh)免疫中的作用 |
| 5.6 IL-27在Th22细胞免疫中的作用 |
| 5.7 IL-27在Th9细胞免疫中的作用 |
| 5.8 IL-27在CD8~+T细胞免疫中的作用 |
| 6. 结语 |
| 7. 参考文献 |
| 附图表 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的学术成果 |
| 外文论文 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（7）MDSC分泌的Arg-1对肠炎小鼠Th17细胞的影响及橡黄素治疗机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 炎症性肠炎 |
| 1.2.1 炎症性肠炎概述 |
| 1.2.2 炎症性肠炎的机制 |
| 1.2 Th17细胞 |
| 1.2.1 Th17细胞概述 |
| 1.2.2 Th17细胞的起源和发育 |
| 1.2.3 Th17细胞的可塑性 |
| 1.2.4 Th17细胞在IBD中的功能 |
| 1.3 调节性免疫细胞概述 |
| 1.3.1 调节性T细胞 |
| 1.3.2 调节性B细胞 |
| 1.3.3 调节性红细胞 |
| 1.3.4 调节性的髓系细胞 |
| 1.4 MDSC与自身免疫病 |
| 1.4.1 MDSC的起源 |
| 1.4.2 MDSC的功能 |
| 1.4.3 MDSC扩增的调控机制 |
| 1.4.4 MDSC功能的调控机制 |
| 1.4.5 MDSC与自身免疫病 |
| 1.4.6 MDSC在炎症性肠炎中的作用 |
| 1.5 自身免疫病中MDSC与Th17细胞的关系 |
| 1.6 炎症性肠病中MDSC和Th17细胞的展望 |
| 第2章 肠炎小鼠中MDSC影响Th17细胞IL-17A和IL-17F的表达 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 实验材料和试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 Arg~(myeKO)小鼠的构建 |
| 2.3.2 炎症性肠炎小鼠模型的构建 |
| 2.3.3 肠炎分级评分标准 |
| 2.3.4 外周血单个核细胞的分离 |
| 2.3.5 脾脏单细胞悬液制备 |
| 2.3.6 小肠派氏集合淋巴结细胞分离 |
| 2.3.7 肠系膜淋巴结细胞分离 |
| 2.3.8 结直肠固有层淋巴结细胞分离 |
| 2.3.9 体外刺激PBMC实验 |
| 2.3.10 细胞表面染色 |
| 2.3.11 细胞内染色 |
| 2.3.12 抑制实验 |
| 2.3.13 抑制实验检测 |
| 2.3.14 荧光定量PCR |
| 2.3.15 转输实验 |
| 2.3.16 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 肠炎条件下Arg~(myeKO)小鼠Th17细胞IL-17A表达降低,IL-17F表达升高 |
| 2.4.2 肠炎条件下Arg~(myKO)小鼠MDSC比例下降 |
| 2.4.3 肠炎条件下Arg~(myeKO)小鼠肠组织中保护性因子表达下调 |
| 2.4.4 转输WT小鼠来源的MDSC缓解Arg~(myeKO)小鼠肠炎 |
| 2.5 实验讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 橡黄素通过ESR/STAT3通路促进MDSC存活 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 数据库 |
| 3.2.2 软件 |
| 3.2.3 仪器设备 |
| 3.2.4 试剂耗材 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 Arg~(myeKO)小鼠的构建 |
| 3.3.2 体外实验橡黄素处理髓系细胞 |
| 3.3.3 橡黄素治疗肠炎小鼠 |
| 3.3.4 肠炎分级评分标准 |
| 3.3.5 橡黄素互作基因的预测 |
| 3.3.6 基因富集和通路分析 |
| 3.3.7 小鼠骨髓细胞的分离 |
| 3.3.8 荷瘤小鼠脾脏细胞的分离 |
| 3.3.9 人脐带血单个核细胞的分离 |
| 3.3.10 细胞表面染色 |
| 3.3.11 细胞内染色 |
| 3.3.12 荧光定量PCR |
| 3.3.13 数据分析及统计方法 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 MDSC雌激素受体的激活通过STAT3通路上调Arg-1的分泌 |
| 3.4.2 扩增的MDSC减轻DSS诱导的小鼠肠炎 |
| 3.5 实验讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 在肠炎小鼠中橡黄素通过MDSC产生的Arg-1调节Th17细胞因子分泌 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 实验动物 |
| 4.2.2 实验材料和试剂 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 Arg~(myeKO)小鼠的构建 |
| 4.3.2 橡黄素治疗实验 |
| 4.3.3 外周血单个核细胞的分离 |
| 4.3.4 脾脏单细胞悬液制备 |
| 4.3.5 小肠派氏集合淋巴结细胞分离 |
| 4.3.6 肠系膜淋巴结细胞分离 |
| 4.3.7 结直肠固有层淋巴结细胞分离 |
| 4.3.8 体外刺激PBMC实验 |
| 4.3.9 细胞表面染色 |
| 4.3.10 细胞内染色 |
| 4.3.11 荧光定量PCR |
| 4.3.12 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 橡黄素通过上调ESR/pSTAT3促进MDSC促进Arg-1分泌 |
| 4.4.2 MDSC分泌的Arg-1促进Th17细胞IL-17A的表达,抑制IL-17F的水平 |
| 4.4.3 MDSC来源的Arg-1促进小鼠肠组织中保护性因子表达下调 |
| 4.5 实验讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 博士在读期间科研成果 |
| 致谢 |
（8）桦褐孔菌多糖对小鼠炎症性肠病模型的治疗作用及其机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词 |
| 第一章 引言 |
| 1.1 炎症性肠病 |
| 1.1.1 炎症性肠病流行病学 |
| 1.1.2 IBD的致病因素及病理学改变 |
| 1.1.3 IBD相关的发病机制 |
| 1.1.4 IBD的药物治疗 |
| 1.1.5 IBD的天然药物治疗 |
| 1.2 CD4~+T细胞与IBD |
| 1.2.1 Th1/Th2细胞平衡与IBD |
| 1.2.2 Th17/Treg细胞平衡与IBD |
| 1.3 DC与IBD |
| 1.3.1 DC的分类及功能 |
| 1.3.2 DC在IBD发病中的作用 |
| 1.3.3 DC回输治疗IBD |
| 1.4 桦褐孔菌及桦褐孔菌多糖 |
| 1.4.1 桦褐孔菌的生长环境及药用价值 |
| 1.4.2 桦褐孔菌多糖的生物活性 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 IOP的提取及对DSS诱导的慢性炎症性肠病的治疗作用 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料 |
| 2.2.1 主要试剂 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 实验动物 |
| 2.3 方法 |
| 2.3.1 IOP的提取与高效液相色谱检测 |
| 2.3.2 DSS诱导慢性结肠炎模型的建立及DAI评估 |
| 2.3.3 结肠的组织学检测及评分 |
| 2.3.4 结肠组织中TJ蛋白及JAK-STAT信号通路蛋白的免疫组织化学检测 |
| 2.3.5 结肠组织中TJ蛋白及JAK-STAT信号通路蛋白的蛋白质免疫印迹检测 |
| 2.3.6 CD4~+T细胞相关细胞因子及转录因子的检测 |
| 2.3.7 小鼠脾脏及肠系膜淋巴结中CD4~+T细胞亚群的检测 |
| 2.3.8 统计分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 IOP单糖组成分析 |
| 2.4.2 IOP对DSS诱导的慢性炎症性肠病的病理进展的影响 |
| 2.4.3 IOP对DSS诱导的慢性结肠炎小鼠结肠组织损伤程度的影响 |
| 2.4.4 IOP对结肠组织中CD4~+T细胞亚群细胞因子及转录因子表达情况的影响 |
| 2.4.5 IOP对DSS诱导的慢性结肠炎小鼠脾脏及MLN中Th1/Th2细胞平衡的影响 |
| 2.4.6 IOP对DSS诱导的慢性结肠炎小鼠脾脏及MLN中Th17/Treg细胞平衡的影响 |
| 2.4.7 IOP对DSS诱导的慢性结肠炎小鼠结肠组织中JAK-STAT信号通路的影响 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第三章 IOP对CD4~+T细胞体外分化的影响 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料 |
| 3.2.1 主要试剂 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 实验动物 |
| 3.3 方法 |
| 3.3.1 小鼠脾脏中CD4~+T细胞的分离及活化 |
| 3.3.2 Th1细胞、Th17细胞及Treg细胞的分化 |
| 3.3.3 细胞上清液中细胞因子的检测 |
| 3.3.4 体外活化的CD4~+T细胞相关的细胞因子及转录因子的检测 |
| 3.3.5 CD4~+T细胞的活化、增殖、定向分化检测 |
| 3.3.6 统计学分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 IOP对CD4~+T细胞的活化及增殖过程的影响 |
| 3.4.2 IOP对抗鼠CD3ε和抗鼠CD28抗体活化的CD4~+T细胞分化的影响 |
| 3.4.3 IOP对抗鼠CD3ε和抗鼠CD28抗体活化的CD4~+T细胞分化的影响 |
| 3.4.4 IOP对Th1细胞、Th17细胞、Treg细胞分化的影响 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第四章 IOP对BMDC成熟度及功能的影响 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料 |
| 4.2.1 主要试剂 |
| 4.2.2 主要仪器 |
| 4.2.3 实验动物 |
| 4.3 方法 |
| 4.3.1 BMDC的分离与培养 |
| 4.3.2 BMDC与CD4~+T细胞的MLR反应体系的建立 |
| 4.3.3 BMDC成熟度及CD4~+T细胞亚群分化情况的检测 |
| 4.3.4 细胞培养上清液中细胞因子检测 |
| 4.3.5 统计学分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 IOP对炎症环境下BMDC的耐受状态的影响 |
| 4.4.2 IOP对BMDC_(LPS)细胞因子分泌的影响 |
| 4.4.3 IOP对MLR体系中Th1细胞分化的影响 |
| 4.4.4 IOP对MLR体系中Th17细胞的分化的影响 |
| 4.4.5 IOP对MLR体系中Treg细胞的分化的影响 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第五章 IOP_L-BMDC对DSS诱导的急性结肠炎的治疗作用 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 材料 |
| 5.2.1 主要试剂 |
| 5.2.2 主要仪器 |
| 5.2.3 实验动物 |
| 5.3 方法 |
| 5.3.1 BMDC回输治疗DSS诱导的急性结肠炎 |
| 5.3.2 结肠组织组织学检测及组织学评分 |
| 5.3.3 结肠组织中TJ蛋白的检测 |
| 5.3.4 急性结肠炎小鼠脾脏及MLN中CD4~+T细胞亚群群分化的检测 |
| 5.3.5 统计分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 IOP_L-BMDC对DSS诱导的急性结肠炎的治疗作用 |
| 5.4.2 IOP_L-BMDC对结肠组织中TJ蛋白表达量的影响 |
| 5.4.3 IOP_L-BMDC对脾脏中Th1细胞、Th17细胞分化的影响 |
| 5.4.4 IOP_L-BMDC对MLN中Th1细胞、Th17细胞分化的影响 |
| 5.4.5 IOP_L-BMDC对脾脏及MLN中Treg细胞分化的影响 |
| 5.4.6 IOP_L-BMDC对结肠组织中CD4~+T细胞相关细胞因子的分泌的影响 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间发表论文 |
| 致谢 |
（9）复发性外阴阴道念珠菌病致病菌菌学特征及宿主Th1、Th2和Th17相关细胞因子血清水平研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 外阴阴道念珠菌病病原菌分离、鉴定及药敏试验 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 外阴阴道念珠菌病患者血清细胞因子检测 |
| 资料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 在读期间参与学术会议情况 |
| 在读期间参加培训情况 |
（10）布鲁氏菌感染中巨噬细胞极化通过PD-1/PD-L2途径对T细胞亚群的调控作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一部分 布病患者外周血巨噬细胞M2 极化及其PD-L2 改变特点 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 病人资料与方法 |
| 1.2 临床实验方案 |
| 1.3 试剂与耗材 |
| 1.4 研究方法 |
| 1.5 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二部分 布病患者淋巴亚群变化特点及PD-1/PD-L2 途径介导Th亚群平衡 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 研究内容与方法 |
| 1.3 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三部分 布鲁氏菌外膜蛋白Omp2b抑制巨噬细胞M2 极化影响Th1/Th2 失衡 |
| 1 研究内容与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 主要试剂与仪器 |
| 1.3 研究方法 |
| 1.4 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 结论 |
| 创新点和展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读博士学位期间获得的学术成果 |
| 个人简历 |
| 导师评阅表 |
四、IL-4、IL-12、IL-6/STAT/SOCS途径对Th细胞分化调节机制的研究进展（论文参考文献）
- [1]Th17细胞分化与调控的研究进展[J]. 冯婧,李新胜,侯振江. 中国免疫学杂志, 2021(13)
- [2]Th17细胞中SOX-5介导RORγt基因新的增强子RORCE2与启动子相互作用的机制研究[D]. 韩超. 中国人民解放军陆军军医大学, 2021(01)
- [3]新城疫病毒调节树突状细胞IL-12表达及其抑制抗原递呈机制研究[D]. 南福龙. 吉林大学, 2021(01)
- [4]调节性B细胞亚群与系统性红斑狼疮发病的关系及其机制研究[D]. 叶壮. 吉林大学, 2021(01)
- [5]固本止咳中药对COPD模型小鼠呼吸道损伤修复的调控机制研究[D]. 王明哲. 北京中医药大学, 2021(01)
- [6]白细胞介素-27在支气管哮喘气道炎症和气道重构中的作用[D]. 鲁德玕. 山东大学, 2020(04)
- [7]MDSC分泌的Arg-1对肠炎小鼠Th17细胞的影响及橡黄素治疗机制的研究[D]. 马占川. 吉林大学, 2020(08)
- [8]桦褐孔菌多糖对小鼠炎症性肠病模型的治疗作用及其机制研究[D]. 陈一方. 延边大学, 2020(05)
- [9]复发性外阴阴道念珠菌病致病菌菌学特征及宿主Th1、Th2和Th17相关细胞因子血清水平研究[D]. 葛改. 济宁医学院, 2020(01)
- [10]布鲁氏菌感染中巨噬细胞极化通过PD-1/PD-L2途径对T细胞亚群的调控作用研究[D]. 李智伟. 新疆医科大学, 2020(07)