一、细胞因子和地塞米松对人原代培养肝细胞ICAM-1表达的调控研究（论文文献综述）
孟霞[1]（2020）在《PXR/AKR1B7信号通路在急性肾损伤中的作用及机制研究》文中提出急性肾损伤（Acute kidney injury,AKI）是一组以肾脏功能在短期内急速下降为标志的常见临床综合征,其病因复杂,常见的致病因素有肾毒性药物（如顺铂,cisplatin,CP）、缺血缺氧损伤、重症感染等,具有高发病率和高死亡率等特点。肾小管上皮细胞（Renal tubular epithelial cells,RTEC）损伤是AKI的主要病理基础,损伤后的细胞正常结构遭到破坏,骨架排列失常,管腔侧的刷状缘丢失,基底膜破坏,最终导致细胞变性或死亡。在AKI早期即存在线粒体形态结构和功能的异常,RTEC中富含线粒体,细胞生理功能的行使以及细胞修复和再生离不开线粒体的能量供给,细胞线粒体形态和功能的稳定对于肾功能的维持具有重要意义,线粒体损伤能够引起细胞凋亡坏死诱发肾脏疾病。目前导致AKI的确切致病机制尚不十分清楚,也缺乏有效的干预手段。孕烷X受体（Pregnane X receptor,PXR）是核受体（nuclear receptor,NR）超家族中NR1I亚家族的成员,主要在肝脏、肾脏、肠道等组织中高表达。PXR在机体对异源性/内源性源性物质的防御机制过程中发挥重要的生物调节作用和“解毒”功能,作为配体依赖性转录因子,能够调节多种靶基因转录和表达,广泛参与机体内异源性/内源性物质代谢、能量代谢、免疫炎症反应、细胞增殖、细胞迁移、细胞凋亡、肿瘤耐药等多种生理或病理生理过程,在肝脏、肠道、心血管等组织器官的多种疾病以及癌症的发生发展中具有重要的作用,但PXR在急性肾损伤中的作用尚不清楚,因此在本研究中,我们探讨了PXR在AKI中的作用及具体机制。醛酮还原酶（Aldo-keto reductase,AKRs）是一类NADPH依赖的氧化还原酶,可对脂肪醛、糖类、甾体类激素和致癌物等多种有害的过氧代谢产物进行还原,在氧化应激、药物代谢、激素合成、炎症反应、致癌物解毒等生命活动中发挥重要作用。AKR1B是AKRs中最大的一个家族,包括醛糖还原酶（AR）和AR样蛋白。AKR1B7（Aldo-Keto Reductase Family 1,Member B7,醛酮还原酶家族1,成员B7）在解毒脂质过氧化物的过程中发挥重要作用。在肝脏和结肠中,PXR特异性激动剂孕烯醇酮-16a-碳腈（pregnane-16α-carbonitrile,PCN）可以明显的上调AKR1B7的表达,在人肝癌细胞株细胞中也证实AKR1B7是PXR的下游基因,提示PXR和AKR1B7之间可能存在调控关系,但目前在肾脏中两者之间的关系尚无研究报道。基于既往研究背景和我们的前期实验,本研究推测,肾毒性药物或肾缺血再灌注损伤等各种损伤因素作用下肾脏PXR表达下降,下调其靶基因AKR1B7的表达,介导线粒体功能障碍,导致肾小管上皮细胞损伤及AKI的发生,上调或激活肾组织PXR可能对AKI具有重要保护作用。为探讨其中的机制,本课题将在动物、细胞和分子水平深入研究PXR/AKR1B7信号通路在AKI中的作用,我们设计了以下四部分实验进行探究。第一部分 PXR在急性肾损伤患者肾组织中的表达目的:观察急性肾损伤肾组织中PXR定位和定量表达,并分析其与肾功能的相关性。方法:1.（1）选取20例急性肾损伤患者的肾活检组织,并收集患者临床资料,6例肾癌切除术患者的癌旁正常肾组织作为对照。（2）C57BL/6J小鼠单次腹腔注射顺铂（20 mg/kg）制备AKI模型,分别在注射CP后的1 d、2 d、3 d处死小鼠,留取肾脏组织。（3）体外将在两种不同处理的细胞模型中完成:1)培养小鼠RTECs细胞系,待细胞长至70%80%时,分别给予不同浓度的CP（0、2、4、6、8μg/ml）诱导RTECs损伤,24 h后收取细胞;2)待培养的RTECs长至70%80%时,在不同的时间点给予CP（5μg/ml）刺激,并在CP刺激2 h、6 h、12 h和24 h后收集细胞。2.样品分析:免疫组化染色（IHC）检测肾脏组织中PXR的定位和表达,Real-time PCR和Western blot分别检测小鼠肾皮质组织和体外培养的RTEC中PXR的表达变化。结果:1.IHC结果显示正常肾组织中PXR主要表达于近端肾小管上皮细胞,远端肾小管和集合管表达相对较少,在肾小球的系膜细胞、内皮细胞和足细胞中也有表达,而AKI患者肾活检组织中PXR的表达明显减少,下降至对照组的33.67%（P<0.0001）。而且,AKI患者肾组织中PXR的表达与血尿素氮（BUN）（r=-0.6377,P<0.01）和血清肌酐（SCr）（r=-0.7819,P<0.001）峰值浓度呈负相关。2.IHC结果显示与在人肾组织中观察的结果一致,正常小鼠肾组织中可见PXR的表达,并且在近端肾小管上皮细胞中表达最多,而在CP作用3天后的AKI小鼠模型中PXR在近端小管中表达明显减少。同时在CP诱导的AKI小鼠模型的肾脏中PXR m RNA和蛋白表达也明显下调,呈时间依赖性性的下降,注射CP第1天,肾皮质中的PXR m RNA即明显下降,第3天最低,降至对照组的26.95%（P=0.0055）;PXR蛋白水平在注射CP后第2天开始下降,第3天最低,降至对照组的56.22%（P<0.0001）。3.体外培养的RTECs,CP呈剂量依赖性和时间依赖性方式抑制PXR表达,CP（5μg/ml）刺激细胞12 h,PXR m RNA表达出现明显下降,24 h达最低,降至对照组的60.84%（P<0.0001）。结论:急性肾损伤肾组织中PXR表达显着下降,与血尿素氮和血肌酐峰值浓度呈负相关。第二部分 PXR在顺铂诱导的急性肾损伤中的作用目的:探讨PXR在顺铂诱导的急性肾损伤中的作用。方法:1.模型制备:（1）动物模型:1)应用野生型（WT）SD大鼠和PXR基因全身敲除（PXR-/-）大鼠单次腹腔注射CP（7.5 mg/kg）诱导AKI模型,分为4组:野生型对照（WT）组、WT+CP组、PXR-/-对照组、PXR-/-+CP组,注射CP 72 h后处死大鼠,留取血清、肾脏标本;2)应用野生型C57/B6J小鼠给予PXR激动剂PCN（50 mg/kg/day,I.P）预处理2天后,给予CP（20 mg/kg,I.P）制备AKI小鼠模型,分为3组:对照组（Sham）、CP组、CP+PCN组,PCN继续给予3天,CP作用72 h后处死小鼠,留取血清、肾脏标本;3)应用WT大鼠和PXR-/-大鼠给予PCN预处理2天后,给予CP（7.5 mg/kg,I.P）制备AKI大鼠模型,PCN继续给予3天,分为6组:WT组、WT+CP组、WT+CP+PCN组、PXR-/-组、PXR-/-+CP组、PXR-/-+CP+PCN组,CP作用72h后处死大鼠,留取血清、肾脏标本;4)应用C57BL/6J小鼠尾静脉高压注射PXR过表达质粒/空载质粒,36 h后腹腔注射CP（20 mg/kg）制备AKI小鼠模型,分为3组:对照（NC）组、NC+CP组、PXR+CP组,72h后处死小鼠,留取血清、肾脏标本。（2）细胞模型:1)RTECs给予PCN预处理2 h后,用CP（5μg/ml）刺激制备细胞损伤模型,分为3组:对照（Ctrl）组、CP组、CP+PCN组,CP刺激24 h后收取细胞。此外在稳定表达p Ds Red2-mito或mt-m Keima-cox8质粒（含有线粒体定位信号）的RTECs中构建此模型,收取细胞;2)RTECs瞬时转染PXR-si RNA,转染24 h后用PCN预处理,再用CP刺激制备细胞损伤模型,分为6组:si NC（Vehicle组、CP组、CP+PCN组）、si PXR（Vehicle组、CP组、CP+PCN组）,刺激24h后收取细胞和上清;3)制备稳定过表达PXR的RTECs给予CP（5μg/ml）刺激,分为4组:NC组（转染空载质粒）、NC+CP组、PXR组、PXR+CP组,CP作用24h后收取细胞,此外在稳定表达p Ds Red2-mito或mt-m Keima-cox8质粒的RTECs中构建此模型,收取细胞;4)应用自噬抑制剂BAFa1预处理稳定过表达PXR的RTECs,再给予CP刺激诱导细胞损伤模型,分为6组:NC（Vehicle组、CP组、CP+BAFa1组）、PXR（Vehicle组、CP组、CP+BAFa1组）,24 h后收取细胞。2.样品分析:血生化仪检测血清中Scr和BUN浓度,PAS染色观察肾脏组织病理损伤,透射电镜观察肾组织中线粒体形态结构,IHC检测促凋亡因子Cyt-c的释放和巨噬细胞标记分子F4/80的表达,TUNEL染色法检测肾脏组织的细胞凋亡情况,Annexin V/PI双染结合流式细胞术检测体外细胞凋亡率,Real-time PCR检测肾皮质中肾小管早期损伤标志物KIM-1和NGAL的表达,Western blot、Real-time PCR或ELISA法检测肾皮质或RTEC中细胞凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、caspase 3、cleaved caspase 3）、炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）、线粒体生物合成相关基因（PGC-1α、TFAM、SOD2、NRF2）、线粒体融合相关基因（Mfn1、Mfn2、OPA1）和线粒体自噬相关基因（LC3I、LC3II、P62、Atg3、Atg5、Atg7、PINK1、Parkin、fundc1、Nix）的表达水平。Mito Sox染色测定线粒体ROS含量,JC-1法检测线粒体膜电位（MMP）,荧光素酶法检测细胞ATP含量,Seahorse生物能量分析仪检测线粒体氧消耗率（OCR）,用p Ds Red2-Mito或mt-m Keima-cox质粒标记RTECs中线粒体,激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）观察线粒体数量和形态,并根据荧光变化评估线粒体自噬活性。结果:1.体内研究（1）顺铂处理后的WT大鼠SCr、BUN浓度与对照组相比均明显增高,PXR基因敲除进一步加重CP引起的大鼠SCr和BUN浓度增高（SCr:91.05±21.22 vs.215.70±41.55μmol/L,P<0.0001;BUN:32.98±5.70 vs.72.46±18.34 mmol/L,P<0.0001）;PXR激动剂PCN能保护小鼠肾功能,与CP组相比,PCN干预后小鼠SCr和BUN浓度明显下降（SCr:93.70±19.45 vs.44.20±10.61μmol/L,P<0.0001;BUN:73.62±11.72 vs.40.57±9.18 mmol/L,P<0.0001）;与PXR激动剂相似,小鼠尾静脉高压注射PXR质粒诱导其过表达亦显着改善AKI小鼠肾功能,与NC+CP组相比,PXR过表达组小鼠SCr和BUN浓度明显降低（SCr:219.23±29.17 vs.56.58±30.94μmol/L,P<0.0001;BUN:76.41±7.47 vs.47.55±11.56 mmol/L,P<0.0001）。（2）AKI模型肾小管上皮细胞出现不同程度的肿胀、变性、坏死,肾小管扩张、管型形成,肾组织中肾小管损伤标志物KIM-1和NGAL表达均显着上调。PXR基因敲除显着加重CP诱导的肾损伤,肾小管上皮细胞变性坏死更加严重,损伤范围增大,同时肾脏中KIM-1和NGAL的表达进一步增高,给予PCN治疗或过表达PXR均显着减轻CP导致的肾损伤,逆转CP诱导的KIM-1和NGAL高表达。同时,透射电镜结果显示PXR基因敲除进一步加重CP导致的肾组织线粒体损伤,出现更为严重的线粒体肿胀、嵴断裂消失、基质见异常透亮区,PCN治疗或过表达PXR均显着改善CP引起的肾组织线粒体形态和结构损伤。（3）AKI模型肾组织中细胞凋亡增加,与对照组相比,TUNEL染色阳性凋亡细胞数显着增加,促凋亡蛋白Bax和活化的凋亡执行蛋白cleaved caspase 3表达明显上调,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达显着降低,敲除PXR基因进一步增加CP诱导的肾组织细胞凋亡、促凋亡蛋白Bax和凋亡执行蛋白cleaved caspase 3的表达,抗凋亡蛋白Bcl-2也进一步下调,而PCN治疗或过表达PXR均显着减少CP诱导的细胞凋亡和促凋亡蛋白的表达,并上调Bcl-2表达,同时IHC显示PCN治疗或过表达PXR均显着抑制CP诱导的促凋亡因子Cyt-c的释放。（4）AKI模型肾组织中免疫细胞浸润增多,炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达和分泌增加,PXR基因敲除进一步加重CP诱导炎症因子的表达和分泌,而PCN治疗或过表达PXR可明显减少CP诱导的巨噬细胞浸润和炎症因子表达。（5）AKI模型肾皮质中自噬相关基因（LC3II、Atg3、Atg5、Atg7）和线粒体生物合成相关基因（PGC-1α、TFAM、SOD2、NRF2）表达明显下降,而PXR基因敲除进一步下调上述基因的表达。2.体外研究（1）体外培养的RTECs在CP刺激后细胞凋亡率明显增高,促凋亡相关蛋白（Bax、cleaved caspase 3、Cyt-c）和细胞炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）的表达明显增加,抗凋亡蛋白Bcl-2和未活化的caspase 3下降;PCN预处理或PXR过表达均显着抑制CP诱导的细胞凋亡,减少促细胞凋亡相关蛋白和炎症因子的表达,逆转抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,而敲低PXR则消除了PCN对RTECs损伤的保护作用。（2）RTECs在CP刺激后出现线粒体功能障碍,表现为线粒体内ROS产生增多,MMP降低,mt DNA拷贝数以及ATP含量减少,OCR和最大呼吸容量降低;PCN预处理或PXR过表达均明显减少CP诱导的线粒体ROS积累,阻断CP引起的线粒体MMP、mt DNA拷贝数以及ATP含量的下降,逆转了线粒体OCR和最大呼吸容量。（3）RTECs在CP刺激后,细胞中线粒体稳态失衡,线粒体生物合成相关基因（PGC-1α、TFAM、SOD2、NRF2）、线粒体融合相关基因（Mfn1、Mfn2、Opa1）和线粒体自噬相关基因（Atg3、Atg5、Atg7、PINK1、Parkin、Fundc1、Nix）表达均明显降低,自噬体底物P62表达增加,而PCN预处理或PXR过表达可明显恢复或增加上述线粒体质量控制相关基因的表达,维持线粒体稳态。（4）在LSCM镜下,转染含有线粒体定位信号p Ds Red2-mito质粒的RTECs中线粒体形态呈线状和网状,给予CP刺激后线粒体形态完整性受损,表现为红色荧光减少、强度减弱,异常的点状、片状线粒体增多,而PCN预处理或过表达PXR均可逆转CP诱导的线粒体形态损伤,与此一致,稳定表达mt-m Keima-cox8质粒的RTECs在给予CP刺激后,线粒体内红素荧光减弱,绿色荧光强度增加,线粒体自噬活性减弱,而PCN预处理或PXR过表达可逆转由CP导致的绿色荧光强度增加,并转换为红色荧光,提示线粒体自噬活性增强。（5）流式细胞术结果显示BAFa1抑制细胞自噬后,部分消除了过表达PXR对CP诱导的细胞凋亡的保护作用。结论:PXR基因敲除加重顺铂诱导的肾功能及肾脏病理损伤、肾小管细胞凋亡、炎症反应和线粒体功能障碍;PXR激动剂PCN或过表达能显着改善顺铂诱导的线粒体功能障碍和肾组织病理损伤。第三部分 PXR在肾缺血再灌注诱导的急性肾损伤中的作用目的:探讨PXR在肾缺血再灌注损伤（I/R）诱导的急性肾损伤中的作用。方法:1.动物模型:（1）选取810周龄,雄性,PXR-/-大鼠和WT大鼠,分为4组:WT+Sham组、WT+I/R组、PXR-/-+Sham组、PXR-/-+I/R组,WT大鼠和PXR-/-大鼠用微动脉夹夹闭双侧肾动脉35 min后,再灌注24 h制备I/R诱导的AKI模型,处死大鼠留取血清、肾脏标本;（2）选取8周龄,雄性,C57BL/6J小鼠,分为3组:Sham组,I/R组,I/R+PCN组,给予PCN（50 mg/kg/day,I.P）预处理2天,每日一次（qd）,再给予微动脉夹夹闭双侧肾动脉35 min后灌注24 h制备I/R诱导的AKI小鼠模型,处死小鼠留取血清、肾脏标本。2.样品分析:血生化仪检测血清中的Scr和BUN浓度评估肾功能,PAS染色观察肾组织的病理学改变,TUNEL染色法检测肾脏细胞凋亡情况,Real-time PCR法检测肾组织肾小管早期损伤标志物KIM-1、NGAL m RNA表达水平。结果:（1）与对照组相比,WT模型组大鼠SCr和BUN均都明显升高,敲除PXR基因进一步加重肾功能损伤（SCr:61.00±7.96 vs.73.37±15.03μmol/L,P<0.05;BUN:8.40±1.82 vs.10.94±2.92 mmol,P<0.05）;在小鼠I/R模型中,给予PCN治疗后可明显降低SCr和BUN水平（SCr:154.70±11.49 vs.101.66±7.96μmol/L,P<0.0001;BUN:668.13±5.54 vs.44.11±6.48 mmol/L,P<0.0001）,保护肾功能。（2）I/R导致的AKI模型组肾脏出现不同程度的肾小管上皮细胞肿胀、变性、坏死,管型形成,PXR基因敲除进一步加重I/R导致的肾小管坏死,累积的病变范围增大,肾小管上皮细胞萎缩,管腔扩张更加明显,肾小管损伤病理评分进一步升高（2.24±0.27 vs.2.67±0.31,P=0.0276）;给予PCN治疗能显着减轻I/R诱导的肾小管损伤,肾小管损伤病理评分显着降低（2.51±0.14 vs.1.40±0.08,P<0.0001）。同时,Real-time PCR结果显示I/R导致肾皮质中肾小管损伤标志物KIM-1和NGAL m RNA表达均显着增加,与WT+I/R组相比,PXR-/-+I/R组KIM-1和NGAL的表达分别进一步上调了0.70倍（P<0.0001）和1.74倍（P<0.0001）;与I/R模型组相比,PCN+I/R治疗组小鼠肾皮质中KIM-1和NGAL的表达分别减少了48.40%（P<0.0001）和51.72%（P=0.0042）。（3）TUNEL染色结果显示WT模型组大鼠肾脏细胞凋亡数明显增加,PXR基因敲除进一步加重肾组织细胞凋亡数（9.67±2.33 vs.12.67±2.50,P=0.0408）。结论:PXR基因敲除加重肾缺血再灌注诱导的肾小管损伤和细胞凋亡;PCN激活PXR可改善肾缺血再灌注诱导的肾功能损伤和肾组织病理损伤。第四部分 AKR1B7介导PXR在急性肾损伤中的保护作用及其机制研究目的:筛选AKI肾组织中PXR的靶基因,明确PXR对AKR1B7表达的调控,并探讨AKR1B7在AKI中的作用及其对线粒体功能的影响。方法:1.PXR靶基因的筛选与鉴定:应用基于i TRAQ的定量蛋白质组学分析WT大鼠和PXR-/-大鼠肾脏组织中的差异蛋白质表达。Real-time PCR检测PXR-/-大鼠和过表达PXR后的RTEC细胞中AKR1B7的表达,及其在CP刺激后AKR1B7的表达变化。双荧光素酶报告基因法检测PXR与AKR1B7启动子序列的结合活性。RNA荧光原位杂交法（RNA-FISH）检测RTECs中AKR1B7的表达及亚细胞定位。2.PXR靶基因AKR1B7的作用研究（1）动物模型:1)C57BL/6J小鼠单次腹腔注射CP（20 mg/kg）制备AKI模型,分别在注射CP后1 d、2 d、3 d后处死小鼠,留取肾脏组织;2)C57BL/6J小鼠尾静脉高压注射AKR1B7过表达质粒/空载质粒,36 h后给予CP（20 mg/kg）诱导AKI小鼠模型,分为三组:NC组、NC+CP组、AKR1B7+CP组,CP作用72 h后处死小鼠,留取血清、肾脏标本。（2）细胞模型:1)RTECs分别给予不同浓度的CP（0、2、4、6、8μg/ml）刺激24 h;2)RTECs细胞给予CP（5μg/ml）刺激不同时间（0、2、6、12、24 h）;3)制备稳定过表达AKR1B7的RTECs给予CP（5μg/ml）刺激,分为四组:NC组、NC+CP组、AKR1B7组、AKR1B7+CP组,CP刺激24h后收取细胞,供后续检测。此外在稳定表达p Ds Red2-mito质粒的RTECs中构建此模型,收取细胞;4)应用自噬抑制剂BAFa1预处理过表达AKR1B7的RTECs,再给予CP刺激诱导细胞损伤,分为六组:NC（Vehicle组、CP组、CP+BAFa1组）、AKR1B7（Vehicle组、CP组、CP+BAFa1组）,24 h后收取细胞。（3）样品分析:血生化仪检测SCr和BUN的浓度,PAS染色观察肾脏组织病理学改变,透射电镜观察肾组织中线粒体形态,IHC检测促凋亡因子Cyt-c的释放和巨噬细胞标记分子F4/80的表达,TUNEL染色法检测肾组织的细胞凋亡情况,Annexin V/PI双染结合流式细胞术检测体外培养细胞凋亡率,Real-time PCR检测肾皮质中肾小管早期损伤标志物KIM-1和NGAL的表达,Western blot或Real-time PCR法检测肾皮质或RTEC中AKR1B7、凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2、caspase 3、cleaved caspase 3）、炎症因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）、线粒体生物合成相关基因（PGC-1α、TFAM、SOD2、NRF2）、线粒体自噬相关基因（LC3II、P62、Atg3、Atg5、Atg7、PINK1、Parkin、fundc1、Nix）和线粒体融合相关基因（Mfn1、Mfn2、OPA1）等表达水平。线粒体分离、Mito-Tracher染色结合FISH技术检测线粒体中AKR1B7的表达,转录组测序技术分析过表达AKR1B7后的RTEC内的差异表达基因。Mito Sox染色测定线粒体ROS含量,JC-1法检测MMP,荧光素酶法检测细胞ATP含量,Seahorse生物能量分析仪检测线粒体呼吸功能指标OCR,LSCM观察转染p Ds Red2-mito质粒后的RTECs中线粒体形态变化。结果:1.（1）蛋白质组学分析显示PXR-/-大鼠和WT大鼠相比肾组织中差异表达蛋白（上调≥1.5倍或下调≤0.67倍,P<0.05）有152个,其中表达上调的有105个,下调的有47个。AKR1B7是显着下调差异蛋白之一。Real-time PCR显示AKR1B7在PXR-/-大鼠肾脏中表达降低了46.27%（P<0.001）,在RTECs中过表达PXR上调AKR1B7 1.30倍（P<0.0001）,双荧光素酶报告基因法检测显示AKR1B7是PXR的下游靶点,激活PXR能明显增加AKR1B7的启动子序列的荧光素酶活性。（2）在CP诱导的AKI小鼠模型肾组织中AKR1B7与PXR的表达趋势一致,呈时间依赖性的下降,注射CP第1天,肾皮质中AKR1B7 m RNA即明显下降,第3天最低,降至对照组35.26%（P<0.0001）。（3）RNA-FISH结果显示在CP刺激的RTECs中AKR1B7 m RNA表达减少,PCN预处理能恢复其表达;体外培养的RTECs中,CP呈时间依赖性和剂量依赖性地方式抑制AKR1B7表达,CP（5μg/ml）刺激细胞12 h,AKR1B7 m RNA表达出现明显下降,24 h达最低,降至对照组的60.19%（P<0.0001）。2.体内研究（1）尾静脉高压注射AKR1B7过表达质粒36 h后,在小鼠肾皮质中AKR1B7的表达增高了1.76倍（P=0.0005）。（2）过表达AKR1B7明显改善AKI小鼠肾功能,降低SCr和BUN水平SCr:82.21±38.90 vs.45.08±20.33μmol/L,P=0.034;BUN:28.65±5.99 vs.14.34±3.01 mmol/L,P<0.0001)。（3）过表达AKR1B7减轻CP诱导的肾小管病理损伤（1.53±0.29 vs.0.61±0.17,P<0.0001）,降低肾皮质KIM-1和NGAL表达,线粒体形态和结构损伤也得到恢复。（4）过表达AKR1B7显着减少CP诱导的肾脏细胞凋亡（12.38±3.11 vs.6.38±1.92,P=0.0001）,下调Bax的表达,上调Bcl-2的表达,同时IHC过表达AKR1B7显着抑制CP诱导的促凋亡因子Cyt-c的释放。（5）过表达AKR1B7明显减少CP诱导的巨噬细胞浸润和炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达。3.体外研究（1）RTECs过表达AKR1B7显着降低CP诱导的细胞凋亡,下调促凋亡相关蛋白Bax和促凋亡因子Cyt-c的表达,逆转了抗凋亡相关蛋白Bcl-2的减少,同时明显抑制了CP引起的炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表达和分泌。（2）过表达AKR1B7明显改善了线粒体功能障碍,减少CP诱导的线粒体ROS积累,阻断MMP、mt DNA拷贝数以及ATP含量的下降,逆转CP对OCR和最大呼吸容量的抑制。（3）Mito-Tracher染色结合RNA-FISH分析和线粒体分离技术显示在线粒体中检测到AKR1B7 m RNA,转录组测序技术分析AKR1B7的过度表达显着增强包括LDHB、Eya2和Lars2在内的线粒体保护基因的表达。（4）过表达AKR1B7能恢复或上调与线粒体质量控制相关基因的表达,与NC+CP组相比,AKR1B7+CP组细胞线粒体生物合成相关基因（PGC-1α、TFAM、SOD2、NRF2）、线粒体自噬相关基因（Atg3、Atg5、Atg7、PINK1、Fundc1、Nix）和线粒体融合相关基因（Mfn1、Mfn2、Opa1）的m RNA表达明显增加,而自噬体底物P62表达下调。（5）LSCM镜下显示,转染p Ds Red2-mito质粒后的RTECs中过表达AKR1B7逆转CP引起的的荧光强度改变,管状和网状线粒体增多,恢复线粒体形态完整性。（6）应用BAFa1抑制细胞自噬,部分消除了过表达AKR1B7对CP诱导的细胞凋亡的保护作用。结论:肾脏中AKR1B7是PXR的靶基因,过表达AKR1B7能通过调控线粒体质量控制减轻顺铂诱导的线粒体功能障碍,进而改善肾功能,减轻肾小管损伤、细胞凋亡和炎症反应。
雒诚龙[2]（2018）在《不同浓度生物素对3T3-L1脂肪细胞脂代谢的影响》文中提出为了研究不同浓度生物素对于3T3-L1脂肪细胞代谢的影响,本试验分为细胞诱导及生物素干预两部分。第一部分:将3T3-L1细胞诱导分化为3T3-L1脂肪细胞;第二部分:在细胞培养液中加入不同剂量的生物素为试验组,使培养基内生物素浓度分别达0μmol/L、0.2μmol/L、0.5μmol/L、1μmol/L,每组试验3个平行样,每个平行样2次重复,分别在12 h、24 h、48 h时,收集细胞上清液及脂肪细胞并检测。试验结果表明:培养的3T3-L1细胞于P6代后存活率趋于稳定;采用三联诱导法诱导的3T3-L1脂肪细胞是具有生物活性的,可用于后续试验。在各时间点,添加生物素会促TG沉积并提升GLUT-4、PK、ACC1、FAS、PPARγ、Perilipin A、ADRP等m RNA表达量;降低甘油释放量及瘦素、TNF-α、IL-6等因子含量及HSL与ATGL m RNA的表达量。而以1μmol/L生物素干预会极显着和极显着（P<0.05,P<0.01）提高GLUT-4、PK、ACC1、PPARγ、Perilipin A m RNA的表达量,极显着（P<0.01）提升ADRP m RNA表达量;显着或极显着（P<0.05,P<0.01）降低了甘油释放量与ATGL m RNA的表达量。以0.5μmol/L生物素干预12 h时显着（P<0.05）提升了HSL m RNA表达量;48 h时极显着（P<0.01）提升了m RNA表达量。结论:体外条件下培养3T3-L1脂肪细胞,添加生物素可提升ADPN含量及FAS、ACC1、GLUT-4、PK、Perilipin A、ADRP m RNA表达量;降低瘦素、TNF-α、IL-6含量及HSL、ATGL m RNA表达量达到促TG沉积抑制TG分解的目的,且最适浓度为1μmol/L。
黄琪[3]（2017）在《长链脂肪酸受体激动剂筛选及其抗糖尿病药理机制研究》文中认为随着社会老龄化加剧和人们生活方式的改变,2型糖尿病及其并发症的发病率不断提高,正日益成为突出的全球性健康问题,研究和发现新的糖尿病治疗靶点及其相关药物具有重要的现实意义。2型糖尿病是一种常见的内分泌疾病,该病的显着特征是患者的胰岛β细胞功能受损和胰岛素敏感性降低。近来的研究发现,对游离脂肪酸信号感知及代谢过程与胰岛素分泌和外周组织胰岛素敏感性联系紧密。GPR40主要表达在胰岛β细胞上,可以直接促进糖刺激的胰岛素分泌,GPR120表达分布广泛,与食欲、糖脂代谢和骨的生成过程紧密相连。巨噬细胞和脂肪细胞中的GPR120信号能够起到抗炎的作用,通过减轻外周组织慢性炎症反应改善胰岛素敏感性。另外,GPR40和GPR120都可以促进肠内分泌细胞中肠促胰激素的释放,间接促进胰岛素释放并且增加饱腹感、提升胰岛素敏感性。选择性的GPR40激动剂作为糖依赖的促胰岛素释放候选药物的降糖作用已经在临床试验中得到了验证,GPR120亦被视作有希望的抗糖尿病药物靶标。本论文内容主要分为三个部分:第一部分（第2章和第3章）:GPR120受体调节、激动剂的发现与研究。我们利用高表达h GPR120的细胞与钙流信号检测体系,筛选得到选择性的GPR120激动剂L34（EC50=100 n M）。L34不仅能促进β细胞糖刺激的胰岛素分泌,改善小鼠的口服糖耐量,而且表现出很强的抵抗脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）诱导的巨噬细胞炎症的作用。连续4周口服给予L34（50 mg/kg）显着改善了高胰岛素血症、肝脂肪浸润和胰岛素抵抗。在进一步的分子机制探究中我们发现,L34抑制了db/db小鼠的肝脏和脂肪组织中的炎症反应通路的激活,同时减少了炎症相关基因的表达。实验结果显示L34表现出多种机制的抗糖尿病作用,这为选择性GPR120激动剂应用于T2DM治疗提供了理论依据。另一方面,我们发现人参皂苷Rb2可以诱导巨噬细胞RAW264.7中GPR120表达升高,从而增强内源性GPR120激动剂亚麻酸（ALA）的抗炎作用。在LPS诱导的巨噬细胞炎症模型中,提前孵育Rb2可以显着增强ALA的抗炎作用;与ALA单独作用相比,显着降低了炎症通路的激活和炎症相关酶的表达,从而显着降低炎症因子的表达与分泌。这部分实验结果展示了GPR120表达量的可调节性及其与抗炎效应之间的紧密联系,并提示GPR120仍然可以作为长期用药的抗炎靶标来改善胰岛素抵抗。第二部分（第4章）:GPR40受体激动剂的发现与抗糖尿病药效研究。利用高表达h GPR40的细胞与钙流信号检测体系,我们筛选得到一系列化学结构新颖的GPR40选择性激动剂,其中GPR40激动剂compound（R）-7k（EC50=81 n M）是完全激动剂。随后的细胞水平及体内药理药效实验中compound（R）-7k亦显示出了完全激动剂的特性:在小鼠胰岛β细胞MIN6上表现出比部分激动剂TAK875（EC50=27 n M）更强的促进糖刺激胰岛素分泌的作用;在小鼠急性降糖实验中,compound（R）-7k（10 mg/kg）体现了比TAK875更显着的增强急性口服糖耐量作用。通过对compound（R）-7k的药理药效研究,我们阐述了GPR40完全激动剂在T2DM治疗中的优势。第三部分（第5章）:人参皂苷Rb2通过调节自噬改善非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）。尽管大量研究认为对脂质代谢稳态失衡的调节将是治疗NAFLD的关键所在,但安全有效的NAFLD治疗药物还没有被充分研究和发现,临床仍处于NAFLD治疗缺乏安全有效药物的状态。天然产物是新药发现与研究的重要来源,有诸多的中药复方和天然小分子化合物被报道有改善NAFLD作用。自噬是一种细胞内的自我保护机制,是将细胞内损伤或多余的细胞成分进行自我消化,并为细胞器重新合成提供物质和能量循环的过程。研究表明自噬与NAFLD密切相关,但是目前,对促进肝细胞自噬可以改善NAFLD的结论仍存在争议。我们发现天然产物人参皂苷单体Rb2可以有效改善db/db小鼠的肝脂肪变性,胰岛素抵抗和肝细胞自噬。在体外实验中,Rb2可以通过促进细胞内自噬流从而减少高糖高脂诱导的肝细胞模型中的脂质堆积。进一步的机制研究中,我们通过研究Rb2与自噬的关系,发现Rb2通过激活AMPK-mTOR和sirt1-Foxo1信号通路改善自噬,阐明了Rb2改善非酒精性脂肪肝和胰岛素抵抗的分子药理机制,为自噬作为新的干预靶标治疗非酒精性脂肪肝提供理论依据。
张辉艳,张绪清[4]（2016）在《糖皮质激素阻止肝衰竭发生与发展的机制》文中进行了进一步梳理本文先介绍糖皮质激素及其受体在肝衰竭发生与发展中的作用;然后介绍糖皮质激素通过抑制免疫应答而阻止原发性肝损伤、内毒素/TNFα等细胞因子介导的继发性肝损伤的机制;最后介绍糖皮质激素增强肝细胞保护、阻止肝细胞死亡的机制。
周文丽[5]（2012）在《定向肝细胞分化及相关基因表达调控》文中研究表明终末期肝病（End stage liver disease，ESLD）是很多肝脏疾病的终末状态，预后较差，肝移植是目前治疗ESLD的首选治疗方案，但供肝不足和免疫排斥是影响肝移植治疗的难题。干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞，能为细胞移植和生物人工肝提供充足的高活力的干细胞及终末分化的肝细胞而有望用于ESLD的治疗。肝细胞核因子4a（hepatocyte nuclear factor4a, HNF4α）是一个分子量为54KD的锌指蛋白，HNF4a在肝脏高表达，能与40余种靶基因的启动子和和增强子相互作用以调控肝细胞功能相关基因表达，参与糖、脂肪酸、胆固醇的代谢，肝脏解毒、胆汁酸代谢和蛋白合成等。HNF4α影响着肝细胞重要生物学功能，是肝脏发育和肝细胞分化的重要调控者，深入了解HNF4α的生物学特性及其调控网络，对提高肝细胞功能、优化肝细胞分化及治疗肝脏疾病具有重要意义。小泛素相关修饰物（small ubiquitin-related modifier，SUMO）是一种结构上与泛素相似，广泛存在于真核生物的高度保守的小蛋白家族,在脊椎动物中有3个成员SUMO-1, SUMO-2和SUMO-3。 SUMO2和SUMO3具有形成多聚SUMO链的特性，大量研究表明SUMO化作为一种重要的多功能的蛋白质翻译后修饰方式，在胚胎发育及胚胎干细胞向肝细胞分化的过程中发挥了重要作用。泛素（Ubiquitin）是一类低分量的蛋白质，泛素化在蛋白质的定位、代谢、功能、调节和降解中都起着十分重要的作用。研究表明SUMO化修饰可以通过与泛素竞争底物的相同赖氨酸残基位点,进而拮抗底物由泛素化修饰所介导的蛋白酶体降解。我们对人胚胎干细胞（human embronic stem cells, hESCs）及HNF4α的SUMO化翻译后修饰已有多年的研究基础，本课题以人胚胎干细胞为研究模型，通过观察HNF4a和肝细胞相关功能蛋白在hESCs向肝细胞分化发育过程中不同发育阶段的表达情况，迸一步证实HNF4a基因的表达水平与肝细胞生物学功能基因表达密切相关；通过研究肝细胞去分化过程中及不同发育阶段的肝脏组织中HNF4a与SUMO的变化，初步阐释HNF4a的SUMO化修饰对肝细胞分化和功能影响的机制。结果显示HNF4a在正常成熟的肝细胞中表达最高，肝细胞生物学功能基因如白蛋白、细胞色素氧化酶、甲状腺激素结合蛋白、甲胎蛋白、纤维连接蛋白等的表达水平与HNF4a的表达密切相关。Western Blotting观察到肝细胞去分化过程中HNF4a、SUMO2的表达逐渐降低，与RNF4的降低高度吻合；此外采用不同发育阶段的胚胎肝脏以及成人肝脏组织免疫组织化学染色，发现在成人肝脏组织中SUMO2、RNF4高表达，而T1、T2胚胎肝脏组织中几乎无表达。本研究显示HNF4a是调控肝细胞分化和维护肝细胞生物学功能的重要转录蛋白；结合我们前期研究发现SUMO2通过SUMO化调控HNF4a的稳定性而影响肝细胞功能相关基因的表达，其在肝细胞分化过程中的调控作用可能通过竞争性抑制RNF4介导的泛素化而维持HNF4a稳定表达。我们将通过上调及下调HNF4a、SUMO2、RNF4的表达，观察其对肝细胞体外生存时间、肝细胞分化与去分化、肝细胞功能相关基因表达的影响，寻找HNF4a对肝细胞功能相关基因表达调控和HNF4a的SUMO化修饰的直接证据，因部分实验正在进行中故未包含在此论文中。
李江[6]（2011）在《供体脂肪干细胞对大鼠小体积肝移植免疫调节及促移植肝再生的研究》文中进行了进一步梳理第一部分30%小体积肝移植大鼠模型手术技巧及改良背景：活体肝移植显着缓解了供肝短缺矛盾,如何使供体献出的肝量最小,同时受体得到最大的临床受益成为了目前的研究热点,而制作稳定的小体积肝移植模型是上述研究的基础。目的：探索一种简便、稳定的小体积肝移植大鼠模型的建立方法,为进一步对脂肪源性间充质干细胞对大鼠小体积肝移植术后免疫及肝再生影响的研究提供最佳的模型。方法：供受体均为SD大鼠,雌雄各半。以Kamada“二袖套法”非动脉化原位肝移植大鼠模型为基础并参考国内外文献,制作30%小体积肝移植模型,其中原位减除肝叶后再进行灌注的方法获取供肝40对为I组；采用供肝冷灌注后全肝切取体外减除肝叶的方法获取供肝20对为II组,I、II组共60对为改良前模型组。采用供肝冷灌注后原位减除肝叶获取供肝,并对供肝切取、血管／胆管的套入方法以及手术诸多细节进行优化和改良制作模型80对为改良组（III组）。其中改良前组以肝中叶为供肝,供受体体重相近；改良组以肝中叶+右叶为供肝,供体体重<受体100-120g。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分组主要观察供体手术各阶段时间,比较术后1天、7天血浆谷氨酰丙氨酸转移酶（ALT）、总胆红素（TB）、血氨（AMON）值,术后7天肝脏病理学HE染色观察组织损伤及排斥反,用于比较不同供肝灌注方法和肝叶减除方法在供肝获取上优劣。改良前、后分组主要观察手术成功率,术后并发症和术后第1天、7天、14天的生存率及生存情况分析,用于证实改良模型的优势。结果：改良后模型（Ⅲ组）较改良前不论是Ⅰ组（体内肝叶减除）还是Ⅱ组（体外肝叶减除组）的供肝获取时间和肝叶减除时间均显着缩短（P<0.05）；Ⅱ组的供肝冷缺血时间显着长于Ⅰ组和Ⅲ组（P<0.05）；而改良前后的无肝期、受体手术时间无显着差别（P>0.05）。改良后的小体积肝移植模型手术成功率较改良前显着提高（92.5%vs80.0%,P=0.029）,而且术后1天、7天及14天存活率均高于改良前模型,其中1天存活率两者差异无统计学意义（85.0%vs66.7%,P=0.071）,7天和14天两者的差异有统计学意义（62.5%vs37.6%,P=0.032；50.0%vs20.0%,P=0.01）。生存分析发现改良模型较改良前的术后中位生存时间延长了9天（14d vs5d,P=0.002）。改良模型的手术总并发症例次较改良前组显着较少（43/60vs9/80,P<0.001）,其中改良前模型发生2种或以上并发症的有17例,而改良模型无1例发生2种或以上并发症。分层分析发现,改良组供肝断面出血、供肝灌注不良、肝后下腔静脉狭窄、气体栓塞的发生例次显着少于改良前组（P<0.05）,而其他并发症的发生两组差异无统计学差异。结论：采用肝中叶+肝右叶供肝同时供体体重<受体100-120g的方法以及对操作技术的改良,能建立稳定的30%小体积肝移植大鼠模型,而且在操作简便、减少并发症、提高手术成功率和术后存活率等方面有显着优势。第二部分大鼠脂肪间充质干细胞的分离、培养、鉴定及体外诱导向肝细胞分化的研究背景：2001年英国的Zuk等从抽脂术抽取的脂肪组织悬液中分离、培养得到一群贴壁生长的多能干细胞,此后其他研究小组也证实了这些细胞是一群具有向多胚层分化潜能的成体干细胞,即脂肪间充质干细胞（Adipos-derived Mesenchymal Stem Cells, AMSCs）.由于AMSCs有与BMSCs相似的分化潜能,而且分离培养要求较低,相同体积组织获取的干细胞数量更多,加之脂肪储备量巨大,取材方便容易,对供体创伤小,使AMSCs必将成为最佳的种子细胞来源。目前,对于AMSCs的分离培养由于种属来源、取材方式和部位的不同,方法各异,差异和相互矛盾的地方较多。目的：本实验探讨从大鼠腹股沟皮下脂肪组织中分离培养AMSCs简易、高效的方法,以及其鉴定和体外向肝样细胞分化潜能等方面的问题,为后续AMSCs对小体积肝移植供肝保护的研究做准备。方法：取健康雄性SD大鼠,体重200-220g,乙醚吸入麻醉后,超净工作台内取腹股沟皮下脂肪,仔细剔除血管及淋巴组织（机械性纯化）后,采用胶原酶消化直接贴壁法分离AMSCs。1：3传代培养,绘制第Ⅲ,Ⅴ,Ⅸ代细胞生长曲线,计算细胞倍增时间。流式细胞仪检测第Ⅴ代AMSCs表面抗原及细胞周期,电镜观察细胞超微结构,台盼兰染色检测细胞活力。取本实验第一部分建立成功的30%小体积肝移植存活24h后的模型SD大鼠肝脏,均浆离心后的上清液作为分化诱导培养液,对第V代AMSCs进行体外诱导培养,观察细胞形态变化并于诱导后12d和24d免疫组化检测A1b、CK18。结果：1.原代细胞4-6h后开始沉降贴壁,5d左右细胞大量增殖,约第10天细胞长满培养瓶底,细胞为长梭形,呈成纤维细胞样或漩涡样生长,随着传代次数增多,细胞形态逐渐单一。体外培养条件下各代AMSCs经历生长滞缓期（接种后第1-3d）,对数增值期（接种后第3-6d）和生长平台期（接种第7d后）,生长曲线呈“S”形,细胞倍增时间58.4±6.2h,传至第1X代细胞增殖能力无明显减弱。透射及扫描电镜观察第V代AMSCs具有幼稚细胞的结构特征。2.流式细胞检测Go/G1细胞占78.3%,S期占9.2%,G2/M期12.5%；CD44表达率约98.5%,CD90表达率约92.6%,CD49d表达率约90.5%,CD29表达率约73.1%,CD45表达率约0.3%,CD34表达率约0.6%。证实所得到的细胞为AMSCs,且纯度较高。3.诱导第5天开始梭形的AMSCs细胞两极缩短,开始发生形态变化,12d后多角形细胞明显增多,胞质丰富,胞质内颗粒丰富,胞核明显,出现双核细胞。免疫组化检测到诱导后12d和24d的细胞爬片Alb和CK18表达呈阳性。4.第V代AMSCs台盼兰染色后,计算细胞活力为96.6±1.7%。结论：采用胶原酶消化直接贴壁法,加上对切取的脂肪在培养前进行仔细的机械纯化,大鼠腹股沟皮下脂肪能够获取大量质量较高的AMSCs。采用大鼠小体积肝移植术后24h的成活供肝制备的诱导培养液,能在体外成功诱导AMSCs向肝样细胞分化,为后续的体内移植研究提供了理论基础。第三部分联合供体脂肪间充质干细胞移植诱导30%小体积肝移植大鼠免疫低反应及促肝再生机制的初探背景：小体积肝移植由于供肝体积小,移植后的肝细胞在经受缺血再灌注和急性排斥反应损伤的同时还必须迅速的再生,才能使移植获得成功。间充质干细胞（MSCs）免疫源性低,不论其来源供体或受体以及第三方,均不易引起排斥或移植物抗宿主反应,还能减轻受体对移植物的排斥反应甚至产生特异性的免疫耐受,同时还具有多向分化潜能（如向肝细胞分化）。其中脂肪间充质干细胞（AMSCs）不但具有MSCs的分化潜能和免疫调节能力,而且储备量巨大,取材方便容易,对供体创伤小,因而使AMSCs的应用有望成为提高小体积供肝移植成功率的最佳方法。本部分实验将第二部分所获得的AMSCs输入第一部分成功建立的30%小体积肝移植大鼠模型,希望能够诱导免疫低反应的同时促进供肝的再生,并通过血清学和病理学检测来初步探讨一些相关的机制。目的：观察AMSCs诱导30%小体积肝移植大鼠模型免疫低反应的同时促进移植肝再生的效果,并对相关机制进行初步探讨,为进一步广泛和深入的研究,以及临床应用提供一些基础性依据。方法：应用第二部分的方法所获得雄性Lewis大鼠的AMSCs,将其移植入采用第二部分改良方法成功建立的Lewis-Wistar大鼠30%小体积肝移植模型。分为A组（对照组）；B组（FK506组）；C组（AMSCs单次输入组）；D组（AMSCs术前预输注和术后多次输入组）。对比各组术后的生存情况,各监测时间点的肝脏酶谱,血清IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10、TGFβ1值,移植肝病理学表现,免疫组化检测PCNA、Ki-67、TGF-β1、ICAM-1、IDO以及细胞凋亡在移植肝的表达。C组和D组行SRY原位杂交+Alb/CK18免疫组化双染色检测AMSCs的定植和分化。D组大鼠制作脾细胞悬液进行单向混合淋巴细胞反应（MLR）和IL-2逆转试验,体内过继转移试验用以了解是否诱导特异性免疫耐受。结果：1.中位生存时间：A组8±0.55d；B组144±1.1d；C组10±1.1d；D组21±2.2d,D组生存时间显着长于A-C组（P=0.001）。2.肝脏酶谱：ALT、AST和TB在术后各组均明显升高,A组和C组术后随时间呈持续上升,B组在使用FK506期间各指标虽有回落,但撤药后再度迅速回升,在术后第7天时A-C组间各指标无显着差别,均显着高于D组。3.血清细胞因子：术后各组别各细胞因子均明显升高（显着高于正常对照）,其中IL-2和INF-γ在A组和C组术后随时间迅速上升,术后第5天B组（FK506停药第1天）与D组的上升幅度均较A组和C组低,但之后B组的上升明显加快,在第7天时D组显示出下降趋势,但包括B组在内的其余三组则显着持续升高,此三组间比较无差异,而且均显着高于D组。而IL-4和IL-10在各组别的变化与上述两细胞因子刚好相反。TGF-β1在各组别术后都显着升高,其A组和C组随时间持续升高,B组在术后第5天时血清TGF-β1的升高被抑制,曾一度显着低于A组和C组,但此后又再次显着升高,第7天时升高的程度和A、C组已无差别,D组则随时间逐渐下降,术后1-5天下降较快,而后5-7天则下降缓慢,术后第7天虽显着低于A-C组,但仍显着高于用于正常对照的本底值（263.1±62.8vs19.8±9.3）。4.移植肝免疫组化：IDO（定位于胞浆）在各组模型大鼠术后均有明显的表达,而且随时间的推移各组的表达强度变化不大,组间无统计学差异。ICAM-1（定位于胞膜）和TGF-β1（定位于胞浆）在各组移植肝均有明显表达,A-C组术后持续高水平表达,D组在术后第5天时表达逐渐下降,第7天时显着低于A-C组。PCNA（定位于胞核）和Ki-67（定位于胞核）在术后第1天各组别移植肝内均明显表达,但A-C组随后则显着下降,术后第7天每高倍镜视野仅可.见数个或十余个阳性细胞,而D组术后两者的表达始终维持较高的水平,在各时间点的阳性细胞数均显着高于其他三组,且在术后第5和第7天部分阳性细胞可见双核和多核的增值细胞。凋亡小体在术后各组移植肝均可见,散在分布于肝实质,D组每高倍镜视野仅可见数个,显着少于A-C组,而且炎症反应较重的汇管区则见不到凋亡小体。5.SRY原位杂交+CK18/A1b免疫组化双染色：术后第5天,C组仅在汇管区见数个褐色胞核细胞滞留（SRY阳性细胞）,而D组汇管区均可见大片状褐色胞核细胞,同时在肝实质区域也可见散在胞浆紫兰色（CK18阳性细胞）而胞核呈褐色的SRY+CK18套染阳性细胞,占9.7±1.7%。术后第7天,C组仅在个别汇管区见到数枚胞核呈褐色的细胞停留,而肝实质内无阳性细胞,D组汇管区褐色胞核细胞减少,而肝实质内双阳性细胞则明显增多,占31.4±10.5%,部分成群集聚并可见双核或多核细胞。SRY+A1b套染双阳性细胞在两组移植肝也呈现相似的变化。6.移植肝免疫排斥分级：术后第1天,各组移植物肝小叶结构基本正常,汇管区可见以少量淋巴细胞为主的混合炎性细胞浸润,血管、胆管基本完好,小叶间静脉内膜轻度水肿增厚,肝实质结构紧密,无明显坏死或炎性侵润,Banff评分0-1级。术后第5天,A组和C组移植肝小叶结构存在,但大量淋巴细胞为主的混合炎性细胞浸润,胆管周围被炎性细胞包裹,血管内皮下炎性浸润水肿增厚明显,肝实质少量炎性浸润。Banff评分II级；B组表现与A组和C组相似,但汇管区炎性浸润较轻,血管壁水肿轻微,Banff评分I级；D组肝小叶结构正常,少量淋巴细胞为主的炎性浸润,与第1天比较变化不明显,Banff评分0-1级。术后第7天,A组、B组和C组汇管区和肝实质均见大量以淋巴细胞为主的混合炎性浸润,并伴静脉周围肝细胞坏死,Banff评分III级；D组汇管区淋巴细胞浸润较前明显增多,血管壁水肿增加,但结构完好,肝实质炎性浸润较少,Banff评分0-1级。7.单相混合淋巴细胞反应（MLR）及IL-2逆转试验：D组对供体品系Lewis大鼠和无关品系SD大鼠的淋巴细胞刺激百分率（SI%）分别为32.7±3.7%和39.7±12.3%,无统计学差别（P=0.257）,反应体系中加入IL-2后能够使D组对两种刺激因素的免疫低反应均得到逆转,SI%分别升高为89.9±7.9%和91.44±7.6%,前后对比有显着统计学差异（P<0.001,P=0.002）。8.体内过继试验：过继大鼠对供体品系的Lewis大鼠和无关品系SD大鼠所产生的迟发型超敏反应FI值为0.55±0.18mm和0.59±0.11mm,两组比较无统计学差异（P=0.644）,但与正常大鼠对以上两品系大鼠所产生的FI值（0.86±0.21mml,0.91±0.11mm）相比较均有统计学差异（P=0.036,P=0.002）。结论：1.术前预输注和术后多次输注AMSCs能够通过多种机制抑制排斥反应的同时促进了移植肝的再生,加速了肝脏酶谱的恢复,显着延长了小体积移植肝和受体的存活时间,而且AMSCs能定植于移植物,并向肝样细胞分化。2.术前预输注和术后连续多次输注AMSCs,可能通过影响IL-2, INF-γ和IL-4, IL-10的分泌,使Th0细胞向Th2表型方向偏移；通过表达和/或促移植物表达IDO等途径,来抑制受体对供肝的免疫排斥反应。并且AMSCs对降低受体的免疫排斥反应可能存在剂量依赖性。3. AMSCs能减少TGF-β1在血液中的含量,有可能对全身和局部的炎症反应均有可能产生很强的抑制作用,但同时AMSCs在移植肝内定植后,可能表达或促周围细胞表达TGF-β1来抑制T细胞的活性和增值,表达ICAM-1来趋化T细胞,通过细胞间接触或其他途径抑制T细胞的活化和增值,从而诱导受体对移植物的低免疫反应效应。5. AMSCs可能通过释放一些细胞因子或其他途径对凋亡相关基因或调控基因产生影响,而减少移植肝实质细胞的凋亡,有益于减轻移植肝的再灌注损伤。6.使用AMSCs能够对受体免疫产生抑制,但并未表现出特异性耐受,未形成特异性免疫过继。7.多次输注AMSCs可能上调移植肝内PCNA和Ki-67的表达,使小体积供肝术后维持较高增值状态。
张坤[7]（2009）在《紫外线诱导的细胞DNA损伤模式研究》文中提出DNA是储存与传递遗传信息的重要生物大分子，其分子的完整性对生物体生命活动至关重要。过量的紫外辐射可引起细胞内DNA碱基发生突变、DNA断裂、DNA-DNA交联、DNA-蛋白交联以及染色体畸变等损伤。DNA损伤若不能及时修复，细胞将发生癌变或死亡。不同剂量紫外线对细胞DNA的损伤模式不同，可能引起的修复机制有差别。因此，研究不同剂量紫外线诱导细胞DNA损伤模式的变化对于进一步探讨DNA损伤修复机制，预防某些修复缺陷性疾病的发生有一定的现实意义，并对遗传学、肿瘤学、衰老学和毒理学等研究具有一定的理论价值。本文采用彗星电泳法检测紫外线对细胞DNA损伤的效应以及不同种类细胞的敏感性差异；应用彗星电泳、DCFH-DA荧光探针检测法以及NAC抗氧化剂等方法检测了低剂量紫外线对细胞DNA的损伤；采用流式细胞仪、MTT、细胞计数等方法检测了中等剂量UVC对细胞DNA的损伤；应用原子力显微镜和彗星电泳方法检测了高剂量紫外线对细胞DNA的损伤。主要内容：1、检测相同剂量不同功率紫外线诱导的细胞DNA损伤。彗星电泳和HE染色的实验结果表明：离体培养的K562细胞和原代培养的小鼠肝细胞经不同功率相同剂量的UVC或UVB照射后，DNA损伤程度无差异。2、检测不同波长UV照射白血病K562细胞DNA的损伤。彗星电泳的检测结果显示：照射剂量0-440 J／m2的UVA不会对K562细胞DNA造成即时性损伤；UVB、UVC可以造成K562细胞DNA的损伤，并在一定范围内呈现照射剂量依赖效应。UVB在20～320 J／m2照射剂量下与细胞DNA损伤的相关性为0．9344和0．956：UVC在3．2～180 J／m2照射剂量下与细胞DNA损伤的相关性为0．9841和0．994：相同照射剂量下UVC对细胞DNA的损伤程度显着高于UVB。3、检测了不同细胞对UVC的敏感性。不同肿瘤细胞应答UVC损伤的敏感性存在差异：SMMC-7721细胞的敏感性高于HepG2细胞。正常细胞与肿瘤细胞应答UVC损伤的敏感性也存在差异：hepa1-6细胞的敏感性高于原代培养的小鼠肝细胞。不同活化程度的正常细胞对UVC损伤的敏感性不同：活化淋巴细胞比静息淋巴细胞敏感性高。4、检测了不同周期时相的K562细胞对于UVC的敏感性：彗星检测发现G2期的细胞最为敏感，其次为M期、S期和G1期。5、K562细胞和原代培养的小鼠肝细胞在低剂量UVB和UVC照射后经孵育，彗星电泳能够检测出即时检测不能发现的细胞DNA损伤。低剂量UV照射后，胞内ROS含量升高，并在细胞孵育后含量降低。实验组中加入ROS清除剂NAC后可以降低细胞DNA的损伤。这提示低剂量UV照射造成的延时损伤可能以ROS引发的损伤修复有关。6、K562细胞经中等剂量（60 J／m2）UVC照射后的DNA损伤在20h内修复或消失。UVC致细胞DNA损伤具有延时效应。UVC照射细胞后，随孵育时间的延长细胞DNA损伤程度加剧，2小时后DNA损伤达到最大值，孵育4小时后DNA损伤程度开始下降，孵育至20小时损伤程度恢复至未照射细胞的水平。细胞计数的结果表明，照射后12h细胞数目降至最低，而后细胞数目丌始增加。UVC照射使K562细胞周期被阻滞于G1／S期或G2／M期。7、优化了用于原子力显微镜观察的细胞DNA提取系统。建立了用原子力显微镜观察DNA的阳性模型。8、K562细胞经高剂量UV照射后的DNA损伤严重。高剂量UVC照射后，K562细胞DNA损伤严重，发生断裂、交联（DNA链间或链内），K562细胞增殖能力减弱。高剂量UVB照射后，DNA小片段交联在一起。结论：相同剂量不同功率的UVC或UVB照射后，DNA损伤程度无差异。UV造成的细胞DNA损伤与照射波段、剂量密切相关。UVC对细胞DNA的损伤能力大于UVB。UVB、UVC造成的K562细胞DNA的损伤在一定范围内呈现照射剂量依赖效应。我们得到UVB、UVC在一定剂量范围与DNA损伤之间的线性方程。UBV：y=0．1196x-0．0534，R2=0．9344或y=0．0814x-0．0627，R2=0．956。UVC：y=0．2018x+0．9053，R2=0．9841或y=0．1251x+0．6914，R2=0．994。不同细胞应答UVC损伤的敏感性存在差异，这可能与细胞的增殖速度不同有关；周期时相的细胞对UVC的敏感性不同进一步证明了这一点。不同剂量紫外线诱导的细胞DNA损伤有不同的模式。实验发现低剂量UVB与UVC照射K562细胞和原代培养的小鼠肝细胞后经孵育，彗星电泳能够检测出即时检测不能发现的细胞DNA损伤并且细胞内ROS含量升高，进一步实验加入ROS清除剂NAC后可以降低细胞DNA的损伤，表明延时检测到的DNA损伤与ROS有一定关系。中等剂量UVC对K562细胞DNA的损伤具有延时效应并且在20小时内可以恢复。此剂量下的UVC照射后细胞周期被阻滞在G1／S期或G2／M期。应用原子力显微镜直接观测到高剂量UVC照射细胞后，K562细胞DNA损伤严重，发生断裂、交联。与UVB相比，UVC照射后细胞DNA链的直径变细，DNA链的交联可能多为链间交联。
吕国良,李兰娟[8]（2008）在《胚胎干细胞向肝细胞的诱导分化研究》文中认为胚胎干细胞在体外一定条件下能够分化为与原代培养肝细胞表型相似,并表达部分成熟肝细胞功能的类肝细胞。尽管目前在诱导条件的优化、分化过程的调控及临床应用的安全性等方面仍面临一系列问题,但研究胚胎干细胞向肝系的诱导分化及纯化,为终末期肝病的细胞移植治疗、生物人工肝及药物代谢和毒理研究提供了丰富的细胞来源。
叶姗姗[9]（2008）在《孕烷X受体配体筛选模型与乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选模型的构建》文中提出I孕烷X受体配体筛选模型的构建孕烷X受体（pregnane X receptor，PXR），核受体NR1I亚家族成员之一。PXR由位于N端的DNA结合域（DNA binding domain，DBD）和C端的配体结合域（ligand binding domain，LBD）组成。PXRLBD形成巨大、球状、可伸缩的配体结合口袋，能被大量外源性物质和内源性甾体活化。PXRLBD结合配体后，被活化而发生构象变化，招募辅调控因子（如人甾体受体辅活化因子-1，steroidreceptor coactivator-1，SRC-1）形成复合物，通过其DBD结合到药物代谢酶基因启动子的特定DNA序列上，从而调控CYP3A4等药物代谢酶基因的表达。外源药物通过充当配体结合并活化PXR，诱导药物代谢酶基因的表达，从而影响联合用药的代谢，导致临床上药物-药物相互作用。因此，PXR和药物的相互作用是药物代谢酶诱导作用和药物相互作用的重要分子基础之一。PXR与药物相互作用研究模型的构建和应用将有助于核受体介导的药酶诱导作用和药物代谢性相互作用的研究。本研究利用共表达载体pETDuet-1-SRC88-PXRLBD在Escherichia coli中共表达SRC88（SRC-1的88个氨基酸）和PXRLBD，获得了可溶性表达的PXRLBD，并根据PXR与配体的结合特性，采用平衡透析模型和高效液相色谱法，建立了体外研究PXR和药物相互作用的新方法，为体外筛选PXR的配体药物提供了新模型。一PXRLBD蛋白的表达1 pGEX-4T-1-PXRLBD Rosetta（DE3）表达菌株的构建PXRLBD片段通过BamHⅠ和XhoⅠ位点的介导插入pGEX-4T-1载体的多克隆位点。此亚克隆过程在Ecoli DH5α中完成，经限制性内切酶消化。确证和DNA序列测定确证后，转化表达宿主Ecoli Rosetta（DE3）。2 GST-PXRLBD蛋白的表达与鉴定500mL 2×YT培养基中，接种带有pGEX-4T-1-PXRLBD重组子的Rosetta（DE3），培养至OD600为0．6左右，加IPTG（终浓度50μmol／L），20-25℃诱导培养10h。收集细菌，对细菌破碎液，细菌破碎液上清和细菌破碎液沉淀进行SDS-PAGE，结果表明GST-PXRLBD蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在。构建新的表达菌株，利用SRC88与PXRLBD的共表达实现PXRLBD的可溶性表达。3 pETDuet-1-SRC88-PXRLBD Rosetta（DE3）表达菌株的构建SRC88片段通过NcoⅠ和HindⅢ位点的介导插入pETDuet-1载体的多克隆位点-1，PXRLBD片段通过NdeⅠ和XhoⅠ位点的介导插入pETDuet-1载体的多克隆位点-2（PXRLBD C-端设计His-tag以便于蛋白纯化）。此亚克隆过程在E．coli DH5α中完成，经限制性内切酶消化确证和DNA序列测定确证后，转化表达宿主E.coli Rosetta（DE3）。4 PXRLBD和SRC88蛋白共表达500mL含1％葡萄糖的LB培养基中，接种带有pETDuet-1-SRC88-PXRLBD重组子的Rosetta（DE3）。培养至OD600为0．6左右，离心去除上清，用500 mL含50μmol／L IPTG的2×YT培养基重悬细菌沉淀，20-25℃诱导培养10h。5 PXRLBD蛋白的纯化与鉴定表达菌液离心去除上清培养液，用1×PBS重悬细菌沉淀物。细菌经Frenchpressure cell press破碎后，超声破碎，随即高速离心取上清用His Bind Resin纯化后获得纯化液8mL。纯化液进行SDS-PAGE，在分子量34KD附近出现明显的PXRLBD表达条带，在分子量10KD附近出现明显的SRC88表达条带。纯化液进行Western blot分析，一抗为人PXR101-260aa的多克隆抗体，在分子量34KD附近出现明显的PXRLBD表达条带。纯化液经BCA蛋白浓度测定试剂盒测得纯化液蛋白浓度为（0．411±0．005）g／L。二PXR配体筛选模型的构建将透析袋A和B放入盛有18mL含克霉唑（11．1μmol／L）的1×PBS缓冲液的试管中，透析袋C和D放入盛有18mL含地塞米松（11．1μmol／L）的1×PBS缓冲液的试管中，透析袋A和C内均加入2mL纯化的PXRLBD溶液，透析袋B和D内均加入2mL His·Bind Resin Elute Buffer作为对照组。4℃透析，A和B透析12h达到平衡，C和D透析24h达到平衡。分别取透析袋袋内外的溶液，其中A和C溶液加蛋白酶K（终浓度10μg／mL）4℃消化1h后加甲醇（1：1）沉淀蛋白，并用高效液相色谱法进行含量分析，B和D溶液不加蛋白酶K直接加甲醇（1：1）进行含量分析。透析平衡后，袋内游离药物浓度等于袋外游离药物浓度（即袋外药物总浓度），因此透析袋袋内与PXRLBD结合的药物浓度等于袋内药物总浓度减去袋内游离药物浓度即袋内药物总浓度减去袋外药物总浓度。以袋内药物峰面积与袋外药物峰面积的比值A作为表征，结果表明克霉唑组A=1．382±0．086，表明袋内药物总浓度高于袋外药物浓度，即PXRLBD与克霉唑发生结合，地塞米松组A=1．004±0．012，表明袋内药物总浓度等于袋外药物浓度，即PXRLBD与地塞米松结合作用不明显，模型建立成功。Ⅱ乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选模型的构建乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）在神经肌肉接头和脑胆碱能突触水解神经递质乙酰胆碱，来终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号的正常传递。乙酰胆碱酯酶抑制剂能够选择性抑制脑内乙酰胆碱酯酶的活性，延长乙酰胆碱在大脑内的存留时间，提高阿尔茨海默氏病（Alzheimer’s Disease，AD）病人的胆碱神经功能，减轻病人认知能力的下降。目前乙酰胆碱酯酶抑制剂已经成为治疗轻、中度阿尔茨海默氏病的主流产品。经FDA批准上市的乙酰胆碱酯酶抑制剂共5种：他克林（Tarcrine）、多奈哌齐（Donepezil，E2020）、利伐司替明（Rivastigmine）、加兰他敏（Galanthamine）和石杉碱甲（Huperzine A），但是已有的乙酰胆碱酯酶抑制剂还存在半衰期短、较严重的外周胆碱能系统副作用等缺点，它们的临床应用受到限制。因此，寻找作用时间长、副作用小的新一代乙酰胆碱酯酶抑制剂仍是目前AD药物研究的热点。本研究利用HEK293细胞表达重组人乙酰胆碱酯酶，通过酶动力学研究考察酶活性，建立乙酰胆碱酯酶抑制剂的筛选模型，并应用该模型测定一系列新化合物的抑制活性。一HEK293细胞表达重组人乙酰胆碱酯酶（rhAChE）pCMV-AChE由Hebrew University的Hermona Soreq教授赠送。pCMV-AChE经DNA序列测定确证AChE部分与AChE结构基因序列（GenBank Accession No：NM000665）一致。利用阳离子脂质体lipofectamineTM2000介导pCMV-AChE瞬时转染HEK293细胞，rhAChE分泌表达至细胞培养液中，收集细胞培养液作为酶液分析AChE活性。二酶活性研究采用改进的Ellman方法：反应体系中加入酶液和显色剂DTNB（5,5’-二硫代双-2-二硝基苯甲酸），37℃孵育5min，加入底物ATCh（碘化硫代乙酰胆碱）37℃孵育一定时间，加入SDS终止反应，用酶标仪在412nm处测定吸光度（OD值），酶反应速率v用OD／min表示。1酶底物动力学研究反应速率对不同底物浓度作图得底物浓度曲线，通过底物浓度曲线确定反应体系中底物浓度条件。反应速率对不同酶量作图得酶量曲线，通过酶量曲线确定反应体系中酶量条件。反应速率对不同反应时间作图得反应时间曲线，通过反应时间曲线确定反应体系中孵育时间条件。米氏常数Km测定的酶促反应条件：pH7．4，酶量4μL，底物浓度：0．075，0．1，0．125，0．175，0．25，0．3μmol／L，反应温度37℃，反应时间15min，酶反应速率v用OD／min表示，1／v对1／[S]作图获得Lineweaver-Burk图并回归分析得到Km值为151．9μmol／L。2酶活力测定酶活力计算公式：U（μmol／min）=V×A／（ε×L）计算，A表示吸光度随时间的变化率（1／min），V表示反应总体积，消光系数ε=13．6L／mmol／mm，光程L=10mm。1．6mL反应体系：pH7．4，酶量32μL，底物浓度1．25mmol／L，反应温度37℃，在412nm处测定OD值，每隔0．5min读数，连续测定3min。反应测得A=0．05934／min，rhAChE酶活力为0．698mU（μmol／min）。3酶抑制作用动力学研究多奈哌齐是AChE的可逆性抑制剂，多奈哌齐对AChE的抑制作用为竞争性和非竞争性结合的混合类型，酶抑制常数Ki和K’i通过二次作图法获得：不同抑制剂浓度下进行Lineweaver-Burk作图（一次作图）获得一系列曲线，一次作图各系列的斜率对[I]进行二次作图获得Ki，纵轴截距对[I]进行二次作图获得K’i。反应体系条件：pH7．4，酶量4μL，多奈哌齐浓度：0，2．5，5．0，10，20，40，80nmol／L，底物浓度：0．065，0．125，0．25，0．5μmol／L，反应温度37℃，反应时间15min，通过二次作图法测得Ki=16．03nmol／L，K’i=18．36nmol／L。三酶抑制剂筛选模型的建立和应用1多奈哌齐IC50的测定多奈哌齐是AChE的可逆性抑制剂，文献报道IC50为14．0nmol／L。选择7个浓度测定多奈哌齐对rhAChE的抑制率，以化合物摩尔浓度的负对数与酶抑制率进行线性回归求取IC50值。反应体系条件：pH7．4，酶量4μL，多奈哌齐浓度：0，1．25，2．5，5．0，10．0，20．0，40．0，80．0nmol／L，底物浓度：0．125mmol／L，反应温度37℃，反应时间15min。结果测得多奈哌齐IC50=14．0nmol／L。2新化合物IC50的测定新化合物来源：多奈哌齐中的二甲氧基茚酮（与AChE外周位点结合）和利伐司替明的苄基胺（与AChE中心位点结合）用氧原子连接，并且通过苄基胺结构中胺烷基的位置、种类变化，设计并合成了一系列苯氧茚酮类衍生物2a-m，3a-m。每种化合物根据预试结果，选择6-8个浓度测定该化合物对rhAChE的抑制率，以化合物摩尔浓度的负对数与酶抑制率进行线性回归求取IC50值。
邓俊良[10]（2008）在《神经内分泌因子及代谢产物对体外培养犊牛肝细胞PEPCK、SCD及脂肪细胞HSL基因表达的调控研究》文中研究说明以围产期能量代谢障碍为病理学基础的酮病和脂肪肝是奶牛重要的群发性常见多发病。研究表明,酮病、脂肪肝是奶牛能量负平衡的结果,脂肪动员、肝脂沉积、低糖血症和酮体生成增多是奶牛酮病和脂肪肝的主要环节。围产期奶牛能量代谢特点是干物质摄入减少及能量负平衡,糖异生是反刍兽生糖的主要途径,磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）是糖异生途径的主要关键酶,通过上调PEPCK基因的表达量可直接影响肝脏糖异生的能力,从而缓解低血糖。脂肪动员是缓解能量负平衡的唯一途径。一方面弥补糖异生作用降低所引起的能量亏欠;另一方面释放大量游离脂肪酸（NEFA）进入血液及肝脏,可引发脂肪肝和酮病。而脂肪动员是由甘油三酯脂肪酶（又称激素敏感脂肪酶HSL）催化完成的。HSL的表达量直接体现脂肪动员的程度,所以调控脂肪动员是防治脂肪肝、酮病等围产期能量代谢障碍性疾病的重要措施。肝脂沉积也是脂肪肝、酮病发病根源之一。在肝脂沉积过程中,硬脂酰CoA去饱和酶（SCD）是单不饱和脂肪酸（MUFA）生物合成的限速酶,SCD可促进甘油三酯（TG）合成底物的形成,从而促进TG的合成。所以调控SCD酶的表达能直接调控脂肪的合成。而神经内分泌因子和代谢产物是调节糖代谢、脂肪代谢,缓解酮病和脂肪肝的主要途径。因此本研究将通过体外（肝细胞和脂肪细胞培养）途径,运用分子生物学技术（定量RT-PCR、荧光定量PCR法）,重点研究部分神经内分泌因子及代谢中间产物对奶牛糖异生关键酶（PEPCK）、甘油三酯合成关键酶（SCD）基因表达和脂肪动员关键酶（HSL）的活性及基因表达的分子调控机制。阐明神经内分泌因子及代谢中间产物在奶牛酮病、甘油三酯合成、脂肪动员中的调控作用,为从基因水平和蛋白质水平揭示奶牛酮病、脂肪肝发病机制奠定分子生物学基础和理论依据。实验选取临床检查健康的新生荷斯坦犊牛,按照本实验建立的犊牛肝细胞原代单层培养方法进行培养,观察其生长形态,肝细胞培养至48h完全贴壁,为加样的最佳时机。以β-actin为内参,以相同的cDNA为模板,优化了RT-PCR反映条件,成功地对目的基因（PEPCK、β-actin）进行了克隆扩增、克隆、鉴定及测序,测序结果与GeneBank报道一致。在肝细胞培养到48h时,分别在培养液中添加0、1、10、100和1000nmol/mL胰岛素（INS）,0、1、10、100和500pg/mL胰高血糖素（GN）,0、5、10、15、20、30、40、50、60、100和150ng/mL胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）,每浓度梯度设三个重复。通过RT-PCR法检测INS、GN和IGF-Ⅰ对糖异生关键酶PEPCKmRNA表达的影响。采用SYBR greenⅠ染料法建立了适时荧光定量PCR的优化反应条件,成功地对目的基因（β-actin、SCD）进行了扩增,两基因的扩增效率相同。在肝细胞培养到48h时,分别在培养液中添加0、5、10、20、50IU/mL的INS,0、50、100、500、1000pg/mL的GN,0、50、100、500、1000pg/mL神经肽Y（NPY）,每浓度梯度设三个重复,以β-actin为内参基因,用荧光PCR方法检测肝细胞SCDmRNA的表达。通过犊牛前脂肪细胞原代单层培养（整个培养期为14d）,培养至第8、12d,用油红0工作液和台盼蓝工作液对脂肪细胞分别进行染色,观察其生长形态;第14d,脂肪细胞分化成大的单脂滴的脂肪细胞。此时,在生长良好的脂肪细胞培养介质中分别添加0、10、20、30、40、50μg/L的IGF-Ⅰ,0、100、250、500、750、1000nmol/L的胰高血糖素样肽Ⅰ（GLP-Ⅰ）,0、10、20、40、80、160mg/L的地塞米松、0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mmol/L的油酸,0、10、20、30、40、50mg/L的乳酸（每浓度梯度设三个重复）,再分别进行培养24h后提取细胞总RNA,通过荧光定量PER扩增,观察IGF-Ⅰ、GLP-Ⅰ、地塞米松、油酸及乳酸处理的脂肪细胞HSLmRNA丰度的变化。提取处理的脂肪细胞总蛋白,测定所提细胞总蛋白浓度,用脂肪酶测定试剂盒测定处理脂肪细胞HSL活性的变化。结果显示:1.INS和IGF-Ⅰ能显着下调体外培养犊牛肝细胞PEPCK基因表达,并呈现剂量依赖性,但INS浓度在1～10和100～1000nmol/mL时抑制效应趋缓;IGF-Ⅰ浓度在10～15ng/mL时抑制效果稍趋平缓外,其抑制作用有明显剂量依赖性,IGF-Ⅰ＞100ng/mL后几乎检测不到PEPCK。GN能促进犊牛肝细胞PEPCK基因mRNA的表达,具有浓度依耐性,各浓度组间差异极显着,在10～100pg/mL时促进效果最明显,浓度≥100pg/mL上调效应趋于饱和。因此,INS和IGF-Ⅰ通过减弱而GN通过促进肝PEPCKmRNA表达来调节肝糖异生。2.INS浓度≥5IU/mL、NPY浓度≥50pg/mL对体外培养的犊牛肝细胞SCDmRNA表达有明显促进肝脏,且呈剂量依赖促进效应。GN浓度≥50pg/mL明显抑制肝脏SCDmRNA表达,且呈剂量依赖抑制效应。由此表明,INS和NPY可通过促进SCDmRNA表达,促进肝脂沉积:而GN可通过抑制SCDmRNA表达,减少肝脂沉积。3.IGF-Ⅰ、GLP-Ⅰ、油酸、乳酸对体外培养脂肪细胞HSLmRNA表达及酶活性均呈现明显抑制作用,并存在剂量依赖性。IGF-Ⅰ浓度≥20μg/L对HSLmRNA的表达抑制作用显着,浓度≥30μg/L对酶活性抑制作用显着;GLP-Ⅰ浓度≥100nmol/L对HSLmRNA表达及酶活性抑制作用显着:油酸浓度≥1.0mmol/L显着抑制HSLmRNA表达,浓度≥0.5mmol/L极显着抑制HSL活性;乳酸浓度≥20mg/L显着抑制HSLmRNA表达,浓度≥40mg/L显着抑制HSL活性。地塞米松浓度≥20mg/L显着促进HSLmRNA表达,浓度≥10mg/L显着促进HSL活性。表明IGF-Ⅰ、GLP-Ⅰ、乳酸、油酸、地塞米松可通过影响奶牛脂肪细胞内HSLmRNA表达和酶活性影响脂肪代谢,除地塞米松可促进脂肪分解外,GF-Ⅰ、GLP-Ⅰ、乳酸、油酸均抑制脂肪分解,促进脂肪的沉积。
二、细胞因子和地塞米松对人原代培养肝细胞ICAM-1表达的调控研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞因子和地塞米松对人原代培养肝细胞ICAM-1表达的调控研究（论文提纲范文）
（1）PXR/AKR1B7信号通路在急性肾损伤中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 引言 |
| 第一部分 PXR在急性肾损伤患者肾组织中的表达 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第二部分 PXR在顺铂诱导的急性肾损伤中的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 第三部分 PXR在肾缺血再灌注诱导的急性肾损伤中的作用 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 第四部分 AKR1B7 介导PXR在急性肾损伤中的保护作用及其机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 全文小结 |
| 研究创新与不足 |
| 参考文献 |
| 主要英文缩略词 |
| 综述 孕烷X受体的生物学功能与疾病进展 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文 |
| 致谢 |
（2）不同浓度生物素对3T3-L1脂肪细胞脂代谢的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.2 脂肪组织与脂肪细胞 |
| 1.3 影响脂肪细胞发育的因素 |
| 1.4 脂肪细胞脂代谢 |
| 1.5 研究的目的与意义 |
| 1.6 试验技术路线 |
| 第2章 3T3-L1细胞的培养及诱导分化 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 不同生物素浓度对3T3-L1脂肪细胞分泌细胞因子的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第4章 不同生物素浓度对3T3-L1脂肪细胞脂肪合成及相关基因转录表达的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 不同生物素浓度对 3T3-L1 脂肪细胞脂肪分解及相关基因转录表达的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第6章 不同生物素浓度对3T3-L1脂肪细胞脂滴蛋白基因转录表达的影响 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.3 讨论 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 全文结论与存在的问题 |
| 7.1 结论 |
| 7.2 存在的问题 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）长链脂肪酸受体激动剂筛选及其抗糖尿病药理机制研究（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 引言 |
| 1.1 脂肪酸调节的能量代谢与2型糖尿病 |
| 1.1.1 脂肪酸的结构、分类和来源 |
| 1.1.2 脂肪酸的信号感知和代谢过程调节着糖脂代谢平衡 |
| 1.2 细胞膜上的脂肪酸受体：G蛋白偶联受体 |
| 1.2.1 中、短链脂肪酸受体：GPR41（FFA3）、GPR43（FFA2）和GPR84 |
| 1.2.2 长链脂肪酸受体：GPR40/FFA1和GPR120/FFA4 |
| 1.3 胰岛素及其信号通路在T2DM治疗中的重要地位 |
| 1.3.1 肠促胰激素对胰岛素分泌调节中的重要作用 |
| 1.3.2 慢性低度炎症反应损伤外周胰岛素信号通路 |
| 1.4 GPR40激动剂是潜在的糖尿病治疗药物 |
| 1.4.1 GPR40的基因、蛋白与信号传导 |
| 1.4.2 GPR40的组织分布与生理功能 |
| 1.4.3 GPR40激动剂研发进展 |
| 1.5 GPR120靶标在治疗肥胖、糖尿病中的应用 |
| 1.5.1 GPR120的基因、蛋白与信号传导 |
| 1.5.2 GPR120的组织分布与生理功能 |
| 1.5.3 GPR120激动剂研发进展 |
| 1.6 脂肪酸代谢对肝脏脂肪变性的影响 |
| 1.6.1 肝脏在脂质代谢中的重要作用 |
| 1.6.2 肝细胞自噬及其调节 |
| 1.6.3 非酒精性脂肪肝的治疗 |
| 第2章 GPR120激动剂筛选及其药理药效研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 生物实验材料和仪器 |
| 2.2.2 化学试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 质粒的扩增与抽提 |
| 2.3.3 稳定过表达受体细胞株的构建 |
| 2.3.4 基因表达分析 |
| 2.3.5 蛋白质免疫印迹实验（细胞和组织） |
| 2.3.6 钙流信号检测 |
| 2.3.7 糖刺激的胰岛素分泌实验（GSIS） |
| 2.3.8 促GLP-1 分泌实验 |
| 2.3.9 动物实验 |
| 2.3.10 口服葡萄糖耐量实验（OGTT） |
| 2.3.11 腹腔注射胰岛素耐量实验（IPITT） |
| 2.3.12 动物血清生化参数测定 |
| 2.3.13 肝脏TG含量测定 |
| 2.3.14 动物组织石蜡切片制备 |
| 2.3.15 组织标本形态学检测 |
| 2.3.16 统计分析 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 GPR120稳定过表达细胞株的构建 |
| 2.4.2 GPR120小分子激动剂的筛选和发现 |
| 2.4.3 L34促进肠内分泌细胞分泌GLP-1 |
| 2.4.4 L34促进糖刺激的胰岛 β 细胞分泌胰岛素 |
| 2.4.5 L34提升正常小鼠口服糖耐量 |
| 2.4.6 L34减轻LPS诱导的巨噬细胞炎症反应 |
| 2.4.7 L34长期给予改善db/db小鼠胰岛素敏感性 |
| 2.4.8 L34改善肝脏和脂肪组织中的胰岛素受体信号通路 |
| 2.4.9 L34减轻db/db小鼠肝脏和脂肪组织中的低度炎症反应 |
| 2.5 讨论 |
| 第3章 人参皂苷Rb2通过提高巨噬细胞中GPR120表达增强ω-3脂肪酸的抗炎作用 |
| 3.1 序言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 MTT法检测细胞活性 |
| 3.3.2 小发夹RNA（shRNA）的构建和转染 |
| 3.3.3 RNA提取与qPCR检测基因表达 |
| 3.3.4 ELISA检测炎症因子的分泌量 |
| 3.3.5 一氧化氮（NO）含量的检测 |
| 3.3.6 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 ALA对LPS诱导的巨噬细胞炎症反应有抑制作用 |
| 3.4.2 Rb2增加RAW264.7 巨噬细胞中GPR120的表达量 |
| 3.4.3 Rb2增强了ALA对巨噬细胞中炎症因子的抑制作用 |
| 3.4.4 Rb2表现出的抗炎活性依赖于ALA对GPR120的激活 |
| 3.4.5 Rb2增强了ALA对巨噬细胞中炎症相关酶表达的抑制作用 |
| 3.4.6 Rb2增强了ALA对巨噬细胞中炎症下游IKK/NF-κB通路的抑制作用 |
| 3.4.7 Rb2通过JNK和P38发挥抗炎作用，而不是通过ERK |
| 3.5 讨论 |
| 第4章 GPR40激动剂筛选及其药理药效研究 |
| 4.1 序言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 细胞培养 |
| 4.3.2 钙流信号检测 |
| 4.3.3 GSIS实验 |
| 4.3.4 促GLP-1 分泌实验 |
| 4.3.5 OGTT |
| 4.3.6 梯度质粒转染钙流实验 |
| 4.3.7 体外PPARγ 激动活性测试 |
| 4.3.8 统计分析 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 GPR40激动剂的筛选 |
| 4.4.2 compound (R)-7k促进 β 细胞葡萄糖依赖的胰岛素分泌 |
| 4.4.3 compound (R)-7k的药物代谢动力学参数 |
| 4.4.4 compound (R)-7k改善小鼠口服糖耐量 |
| 4.4.5 compound (R)-7k是GPR40完全激动剂 |
| 4.4.6 compound (R)-7k促进肠内分泌细胞中GLP-1 的分泌 |
| 4.4.7 compound (R)-7k肝毒性初步探究 |
| 4.5 讨论 |
| 第5章 人参皂苷Rb2通过调节自噬改善非酒精性脂肪肝 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 动物实验 |
| 5.3.2 糖耐量、胰岛素耐量实验和血清生化分析 |
| 5.3.3 细胞培养 |
| 5.3.4 细胞培养 |
| 5.3.5 MTT |
| 5.3.6 蛋白免疫印迹实验 |
| 5.3.7 自噬流监测 |
| 5.3.8 油红（ORO）染色和肝脏TG含量检测 |
| 5.3.9 肝脏形态学检测 |
| 5.3.10 统计分析 |
| 5.4 实验结果 |
| 5.4.1 Rb2明显改善肥胖2型糖尿病小鼠的空腹血糖和胰岛素抵抗 |
| 5.4.2 Rb2明显改善肥胖2型糖尿病小鼠的肝脏功能和肝脂肪浸润 |
| 5.4.3 Rb2明显改善肥胖2型糖尿病小鼠的肝脏自噬及其相关通路 |
| 5.4.4 Rb2时间依赖、浓度依赖地促进肝细胞中的自噬流 |
| 5.4.5 Rb2对肝细胞中脂质堆积的抑制作用依赖于自噬促进作用 |
| 5.4.6 Rb2通过调节AMPK的激活和sirt1的表达改善肝细胞中受损的自噬活性 |
| 5.5 讨论 |
| 第6章 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 附录1 缩略词表 |
| 附录2 引物序列 |
| 附录3 发表论文首页 |
| 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果 |
（4）糖皮质激素阻止肝衰竭发生与发展的机制（论文提纲范文）
| 1 糖皮质激素分泌减少及其受体异常在肝衰竭发生与发展中的作用 |
| 2 糖皮质激素抑制免疫应答而阻止原发性肝损伤 |
| 2.1 诱导免疫细胞凋亡[7] |
| 2.2 调节CD4+T细胞各亚群的比例 |
| 2.3 抑制肝内细胞间黏附分子-1表达 |
| 3 糖皮质激素阻止内毒素/TNFα等细胞因子介导的继发性肝损伤 |
| 4 糖皮质激素能增强肝细胞保护、阻止肝细胞死亡 |
（5）定向肝细胞分化及相关基因表达调控（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 前言 |
| 第一部分 胚胎干细胞体外诱导分化为肝细胞 |
| 一、材料、试剂 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第二部分 HNF4α在肝细胞分化中的作用 |
| 一、材料、试剂 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 第三部分 SUMO 化在肝细胞分化中的作用 |
| 一、材料、试剂 |
| 二、方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 博士期间发表论文 |
| 综述 |
| HNF 4α与肝细胞分化调节 |
| 参考文献 |
| 多能干细胞向肝细胞分化的微环境 |
| 参考文献 |
| Stem Cell Differentiation and Human Liver Disease |
| References |
| 致谢 |
（6）供体脂肪干细胞对大鼠小体积肝移植免疫调节及促移植肝再生的研究（论文提纲范文）
| 中英文缩略对照 |
| 引言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 30%小体积肝移植大鼠模型手术技巧及改良 |
| 引言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 大鼠脂肪间充质干细胞的分离、培养、鉴定及体外诱导向肝细胞分化的研究 |
| 引言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 联合供体脂肪间充质干细胞移植诱导30%小体积肝移植大鼠免疫低反应及促肝再生机制的初探 |
| 引言 |
| 材料 |
| 方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 脂肪源性间充质干细胞的生物学特性及其临床应用展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的文章及获奖情况 |
| 致谢 |
（7）紫外线诱导的细胞DNA损伤模式研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 引言 |
| 1.1 DNA的损伤 |
| 1.2 DNA损伤的修复 |
| 1.3 DNA损伤的检测方法 |
| 1.4 紫外线照射导致的细胞DNA损伤研究 |
| 1.5 本论文的研究目的和意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 实验方法、实验材料与实验装置 |
| 2.1 单细胞凝胶电泳方法 |
| 2.2 原子力显微镜观察DNA损伤 |
| 2.3 流式细胞仪检测细胞周期 |
| 2.4 细胞周期同步化 |
| 2.5 细胞计数 |
| 2.6 ROS检测 |
| 2.7 MTT检测 |
| 2.8 细胞形态观察(HE染色光学显微镜) |
| 2.9 细胞培养 |
| 2.10 UV照射装置 |
| 参考文献 |
| 第三章 紫外线对不同类型细胞DNA损伤研究 |
| 3.1 实验材料和仪器试剂 |
| 3.2 相同剂量不同功率UV诱导的细胞DNA损伤 |
| 3.3 不同波长UV照射后人白血病K562细胞DNA的损伤 |
| 3.4 UVC诱导不同类型肝癌/肝细胞的DNA损伤 |
| 3.5 UVC诱导人外周血淋巴细胞DNA损伤 |
| 3.6 UVC诱导不同周期时相的K562细胞DNA损伤 |
| 3.7 讨论 |
| 3.8 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 中等剂量UVC诱导的细胞DNA损伤研究 |
| 4.1 实验材料和仪器试剂 |
| 4.2 UVC照射后细胞代谢活力的变化 |
| 4.3 UVC诱导K562细胞DNA损伤的延时变化 |
| 4.4 UVC诱导K562细胞DNA损伤的细胞周期的变化 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 高剂量UV诱导细胞DNA损伤模式研究 |
| 5.1 实验材料和仪器试剂 |
| 5.2 高剂量UVC照射对K562细胞增殖的影响 |
| 5.3 K562细胞DNA交联阳性模型的建立 |
| 5.4 原子力显微镜观察DNA提取条件筛选 |
| 5.5 原子力显微镜观察甲醛诱导的K562细胞DNA损伤 |
| 5.6 原子力显微镜观察UVC诱导的K562细胞DNA损伤 |
| 5.7 原子力显微镜观察UVB诱导的K562细胞DNA损伤 |
| 5.8 讨论 |
| 5.9 结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 低剂量UV诱导细胞DNA损伤研究 |
| 6.1 实验材料和仪器试剂 |
| 6.2 低剂量UVC照射K562细胞与小鼠原代培养肝细胞DNA损伤的延时检测 |
| 6.3 UVB照射小鼠原代培养肝细胞DNA损伤的检测 |
| 6.4 低剂量UVB照射K562细胞与小鼠原代培养肝细胞DNA损伤的延时检测 |
| 6.5 低剂量UVC照射K562细胞与小鼠原代培养肝细胞后的ROS含量检测 |
| 6.6 低剂量UVB照射K562细胞与小鼠原代培养肝细胞后的ROS含量检测 |
| 6.7 抗氧化剂NAC对UVC诱导的K562细胞DNA损伤的影响 |
| 6.8 讨论 |
| 6.9 结论 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间研究成果 |
（9）孕烷X受体配体筛选模型与乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选模型的构建（论文提纲范文）
| 目次 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 论文缩略词表 |
| 第一章：孕烷X受体配体筛选模型的构建 |
| 前言 |
| 实验材料与试剂 |
| 基本实验操作 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章：乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选模型的构建 |
| 前言 |
| 实验材料与试剂 |
| 基本实验操作 |
| 实验方法 |
| 实验结果 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述：孕烷X受体介导药物代谢酶诱导作用和药物相互作用 |
| 研究生在读期间的业绩 |
（10）神经内分泌因子及代谢产物对体外培养犊牛肝细胞PEPCK、SCD及脂肪细胞HSL基因表达的调控研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 反刍动物能量代谢研究进展 |
| 1 反刍动物葡萄糖代谢特点 |
| 2 反刍动物脂肪代谢特点 |
| 3 围产期反刍兽能量代谢的调节及酮病、脂肪肝的主要发病环节 |
| 4 小结 |
| 第二节 神经内分泌因子及代谢产物对能量代谢关键酶影响的研究进展 |
| 1 糖异生关键酶及其调控 |
| 2 脂肪动员关键酶HSL及其调控研究进展 |
| 3 甘油三酯(TG)合成关键酶SCD及其调控研究进展 |
| 4 小结 |
| 第三节 定量PCR技术的研究进展 |
| 1 定量PCR(Q-PCR)反应原理 |
| 2 定量PCR方法 |
| 3 定量PCR技术的应用及其展望 |
| 4 小结 |
| 结束语 |
| 第二章 胰岛素、胰高血糖素、胰岛素样生长因子-Ⅰ对体外培养犊牛肝细胞PEPCKMRN表达的影响 |
| 1 材料和方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 本章结论 |
| 第三章 神经内分泌因子对体外培养肝细胞SCDMRNA的影响 |
| 第一节 硬脂酰COA去饱和酶实时荧光定量RT-PCR的建立 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 分析讨论 |
| 5 小结 |
| 第二节 胰岛素、胰高血糖素和神经肽Y对初生犊牛原代培养肝细胞SCDMRNA表达的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 本章结论 |
| 第四章 神经内分泌因子及代谢产物对体外培养脂肪细胞HSLMRNA表达和酶活性的影响 |
| 第一节 IGF-Ⅰ、GLP-Ⅰ、地塞米松、油酸、乳酸对体外培养犊牛脂肪细胞HSLMRNA表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果与分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第二节 IGF-Ⅰ、GLP-Ⅰ、地塞米松、油酸、乳酸对体外培养犊牛脂肪细胞HSL活性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 本章结论 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 论文附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文、着作及获奖情况 |
四、细胞因子和地塞米松对人原代培养肝细胞ICAM-1表达的调控研究（论文参考文献）
- [1]PXR/AKR1B7信号通路在急性肾损伤中的作用及机制研究[D]. 孟霞. 南京医科大学, 2020(06)
- [2]不同浓度生物素对3T3-L1脂肪细胞脂代谢的影响[D]. 雒诚龙. 新疆农业大学, 2018
- [3]长链脂肪酸受体激动剂筛选及其抗糖尿病药理机制研究[D]. 黄琪. 中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所), 2017(01)
- [4]糖皮质激素阻止肝衰竭发生与发展的机制[J]. 张辉艳,张绪清. 胃肠病学和肝病学杂志, 2016(05)
- [5]定向肝细胞分化及相关基因表达调控[D]. 周文丽. 第二军医大学, 2012(09)
- [6]供体脂肪干细胞对大鼠小体积肝移植免疫调节及促移植肝再生的研究[D]. 李江. 昆明医科大学, 2011(10)
- [7]紫外线诱导的细胞DNA损伤模式研究[D]. 张坤. 西北大学, 2009(09)
- [8]胚胎干细胞向肝细胞的诱导分化研究[J]. 吕国良,李兰娟. 国际流行病学传染病学杂志, 2008(03)
- [9]孕烷X受体配体筛选模型与乙酰胆碱酯酶抑制剂筛选模型的构建[D]. 叶姗姗. 浙江大学, 2008(06)
- [10]神经内分泌因子及代谢产物对体外培养犊牛肝细胞PEPCK、SCD及脂肪细胞HSL基因表达的调控研究[D]. 邓俊良. 四川农业大学, 2008(01)