一、《分子克隆实验指南》(第3版)（论文文献综述）
葛志毅[1]（2021）在《葡萄球菌噬菌体基因组遗传进化分析与其裂解酶活性测定》文中提出以金黄色葡萄球菌为主的葡萄球菌在人和动物感染中都扮演着重要的角色,而抗生素的治疗又因耐药性的出现而受到制约,因此需要更多更有效的替代治疗方法。葡萄球菌噬菌体作为一种独特的细菌病毒,可以寄生葡萄球菌,从而起到杀灭葡萄球菌的作用,而且其裂解酶是发挥杀灭细菌的一种重要工具,因此对这两方面进行研究对于以金黄色葡萄球菌为主的葡萄球菌的防治具有很大的意义。（1）于NCBI数据库中获取以金黄色葡萄球菌噬菌体为主的葡萄球菌噬菌体基因组信息。利用信息学的方法分析噬菌体核苷酸使用和噬菌体表型之间的关系、密码子使用偏嗜性、总体密码子的使用模式、奇偶偏好性、有效密码子数和GC3含量。结果显示,葡萄球噬菌体核苷酸使用和噬菌体表型之间存在显着关系,不同种群葡萄球菌噬菌体密码子使用、奇偶偏好性、有效密码子和GC3含量之间存在显着的的区别,葡萄球菌噬菌体基因组组成受遗传进化和突变的影响。（2）以葡萄球菌为宿主,双层平板法分离噬菌体。以污水中筛选到的一株金黄色葡萄球菌噬菌体vB＿SauS＿SAP3为研究对象,进行生物学特性分析。结果表明,该噬菌体能裂解5株金黄色葡萄球菌和1株产色葡萄球菌,最佳感染复数为1:0.1,当温度高于45°C时效价开始急剧下降,不耐酸,但表现出良好的碱耐受性。其这种宿主谱,碱性环境耐受性和其他金黄色葡萄球菌噬菌体论述的有所不同。该噬菌体基因组长度为41952bp,（G+C）M%含量为35.42%,其65个ORF中26个功能已知,39个是未知功能蛋白。电镜观察到该噬菌体末端有一个膨大的纤突,与葡萄球菌长尾科噬菌体的特征相符。系统发育树分析发现该噬菌体跟长尾科噬菌体Bacteriophage EW在同一进化分支上。其主要的衣壳蛋白基因和裂解酶基因都位于一个单独的分支。综合表明,该噬菌体为新型长尾科噬菌体,具有长尾科噬菌体的典型遗传进化特征。但仅仅属于所有长尾科金黄色葡萄球菌噬菌体中的一类,不属于首次发现的长尾科噬菌体。（3）根据噬菌体vB＿SauS＿SAP3基因组测序结果,体外扩增该噬菌体裂解酶基因。裂解酶基因与PET-30a（+）载体构建原核重组表达载体,体外表达裂解酶蛋白,并对裂解酶蛋白进行体外定性和体内治疗活性的验证。同时分析裂解酶的结构域结构,验证结构域的活性特点。结果表明,该裂解酶蛋白主要在包涵体表达,能在体外形成明显的抑菌圈,对已有的葡萄球菌均具有抑制作用。三维分析表明裂解酶蛋白具有两个明显的结构域,两个结构域蛋白具有不同的抑菌活性。但是裂解酶蛋白和结构域蛋白在小鼠体内保护活性不佳。
曾令江[2]（2021）在《莨菪碱脱氢酶催化机制及莨菪碱代谢工程研究》文中认为莨菪碱（Hyoscyamine）是茄科药用植物产生的代表性抗胆碱天然药物,其消旋体为着名药物阿托品（Atropine）。莨菪碱和阿托品均属于托品烷生物碱（Tropane alkaloids,TA）,莨菪碱在临床上广泛用于胃肠道不适、止痛解痉、治疗癫痫、晕车晕船等。茄科药用植物是工业化生产提取莨菪碱的唯一有效来源。其中,颠茄（Atropa belladonna L.）、草本曼陀罗（Datura stramonium）、三分三（Anisodus acutangulus）和澳洲毒茄杂交种（Duboisia×hybrid）等是生产莨菪碱的主要药材。颠茄是被《中华人民共和国药典》收录且人工种植面积最大的莨菪碱的药用原料植物。然而,莨菪碱在这些茄科药用植物中的含量很低,这也成为莨菪碱工业化利用的主效限制因子,直接导致其有效供给不足、价格居高不下。因此,开展莨菪碱的生物合成研究,鉴定合成莨菪碱的关键酶和相关基因,阐明关键酶的活性及其催化机制,对于拓展关于TA生物合成的认识具有重要科学意义;采用代谢工程育种技术培育莨菪碱高产的颠茄,能够从源头上降低莨菪碱生产成本和解决药物资源供给不足的问题,具有重要经济价值。根据已有研究,科学家推测莨菪醛（Hyoscyamine aldehyde）是莨菪碱生物合成的直接前体,其可能会被特定的乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase,ADH）还原生成莨菪碱,该酶有可能是提高莨菪碱产量的关键酶。此外,已有研究报道莨菪碱在莨菪碱6β-羟化酶（Hyoscyamine 6β-hydroxylase,H6H）催化下被转化为山莨菪碱并可进一步环氧化为东莨菪碱。因此阻断H6H介导的催化反应也是一种潜在的提高莨菪碱在植株中积累的代谢工程策略。本研究从颠茄中鉴定了一个在其侧根中高表达的乙醇脱氢酶基因并命名为莨菪碱脱氢酶基因（Hyoscyamine dehydrogenase,HDH）,对HDH催化活性和催化机制进行了研究,为采用代谢工程育种技术培育莨菪碱高产颠茄提供了一个重要基因;进一步研究HDH在颠茄莨菪碱生物合成中的代谢功能;考察了敲除Ab H6H基因对颠茄莨菪碱生物合成的影响。通过研究取得了以下结果:1.莨菪碱脱氢酶基因的克隆与表达研究采用表达相关性分析,从颠茄转录组中筛选获得了一个HDH候选基因的EST序列（aba＿locus＿4635）,随后采用末端快速扩增技术（Rapid-Amplification of c DNA Ends,RACE）获得了该候选基因1098 bp的全长c DNA。生物信息学分析结果显示,HDH属于氧化还原酶家族,编码1个含有366个氨基酸残基的多肽,其理论分子量为39 k Da。数字表达谱分析结果显示,HDH的组织表达模式与颠茄中已报道TA生物合成基因具有高度相似性,表现为在侧根中高水平表达。基于实时定量PCR的表达分析结果显示,HDH在颠茄侧根和主根中表达,在茎段和叶片中不表达;其在侧根中的表达量远高于在主根中的表达量。为进一步研究HDH在侧根中表达情况,从颠茄中克隆了1493 bp的HDH启动子（p HDH）片段。用p HDH驱动GUS报告基因表达,获得了转基因颠茄发根。对转基因颠茄发根的GUS染色和切片结果发现,p HDH主要在中柱鞘和内皮层特异性表达,这与TA生物合成途径中的PPAR和H6H等基因在中柱鞘表达结果具有高度相似性。上述关于HDH生物信息学和组织表达分析结果表明该基因极有可能是莨菪碱生物合成途径中的关键脱氢酶基因。2.莨菪碱脱氢酶的催化功能研究为研究HDH的催化功能,在大肠杆菌中重组并纯化获得了6×His-HDH重组蛋白,其分子量约为42.9 k Da,与HDH计算分子量吻合。HDH的底物（莨菪醛）极不稳定,很容易发生Retro-Claisen缩合反应。因此,莨菪醛不能在实验室制备也没有标准品可供购买。本研究采用体外连续催化的方法鉴定HDH还原莨菪醛功能:首先在酵母中表达CYP80F1并提取含有该酶的微粒体蛋白,在反应体系中加入海螺碱后,能够检测到莨菪醛（m/z为288.1584）的生成;在含有莨菪醛的该反应体系中加入纯化的重组HDH,能检测到莨菪碱的生产;而在对照反应体系中,未能检测到莨菪碱的生成。上述研究结果表明HDH能够将莨菪醛还原为莨菪碱。为进一步研究HDH作为还原酶的催化特性,使用莨菪醛的结构类似物苯乙醛作为底物对HDH的酶动力学进行了研究。HDH发挥还原酶催化活性的最适p H和温度分别为6.4和40°C。在最适反应条件下,HDH对苯乙醛的Km为44.46±10.73μM,kcat为228.4±21.39 min-1,kcat/Km为5.14 min-1.μM-1。由于HDH属于氧化还原酶家族,理论上能够氧化莨菪碱生成莨菪醛。以莨菪碱为底物,在反应体系中加入纯化的HDH,能够检测到莨菪醛。HDH发挥氧化酶催化活性的最适p H和温度分别为10.4和45°C。在最适反应条件下,HDH对莨菪碱的Km为33.36±4.69μM,kcat为7.49±0.51 min-1,kcat/Km为0.22 min-1.μM-1。通过比较HDH催化还原反应和催化氧化反应的kcat/Km,发现HDH的还原效率是其氧化效率的23.36倍。对HDH氧化莨菪碱的平衡常数测定结果表明,在p H 7.2（植物细胞生理p H）条件下HDH氧化活性很低。催化效率和平衡常数分析结果表明在植物细胞的生理p H条件下,HDH主要发挥还原酶功能。3.莨菪碱脱氢酶的催化机制研究为研究HDH将莨菪醛还原为莨菪碱的催化机制,采用结构生物学方法获得了分辨率为2.4?的HDH晶体结构。对HDH晶体结构分析发现,其是一个锌离子依赖的长链脱氢酶,包含两个结构域:一个由Rossman折叠组成的NADP（H）结合结构域;一个底物结合结构域。HDH催化活性中心包含一个由锌离子、Cys52、His74、Glu75和Cys168组成的四面体结构。Met124,Leu282和Ala305三个非极性氨基酸通过构型依赖的范德华力控制底物结合,构成了底物结合口袋。Ser54和Cys100两个极性氨基酸与底物的羰基形成氢键,是催化还原莨菪醛的关键残基。进一步采用点突变分析关键残基的功能,H74A点突变后,HDH对莨菪碱和苯乙醛均失去了催化活性;S54A还原苯乙醛的活性消失,其氧化活性极显着下降;C100G/Y/F三个点突变均保留了极低的催化活性。HDH点突变结果表明,Cys100可能与底物羰基形成氢键,从而稳定底物的朝向;Ser54在底物还原过程中,可能参与了质子传递。利用氘标记的[4-2H]NADPH研究了还原醛基的氢原子来源,只有以[4R-2H]NADPH作为辅因子时,才能检测到氘标记的还原产物,结果表明NADPH上的pro-R氢原子参与HDH催化的还原反应。4.过表达莨菪碱脱氢酶的代谢功能研究为研究HDH在莨菪碱生物合成代谢中的功能,采用基因工程技术获得了过表达HDH的颠茄发根。采用PCR对相关发根进行了检测,以区分对照发根和转HDH发根。在工程菌C58C1（p Ri A4、p BI121-HDH）中能够检测到423 bp的rol B基因片段、795 bp的NPTII片段和1184 bp的35S::HDH基因片段,在转HDH的发根也检测到上述相应基因片段。在对照农杆菌中C58C1（p Ri A4、p BI121）中能够检测到423 bp的rol B基因片段、795 bp的NPTII片段,但没有检测到1184 bp的35S::HDH基因片段;在用p BI121作为对照质粒转化的发根中,检测到rol B和NPTII的相应片段,而未能检测到35S::HDH片段。基因表达分析结果表明,转HDH基因发根中HDH表达量比对照得到了极大程度提高。分子检测结果表明,HDH基因整合到颠茄基因组中,同时其表达水平得到大幅度提高,意味着HDH介导的催化步骤得到强化。为了分析过表达HDH对颠茄TA合成的影响,采用LC-MS检测颠茄发根培养物中TA含量。结果显示对照发根中莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱含量分别为1.35mg/g（DW）、0.69 mg/g（DW）和0.43 mg/g（DW）;过表达HDH的不同发根株系中莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱含量分别为1.83～4.03 mg/g（DW）、1.16～1.73 mg/g（DW）和0.62～1.28 mg/g（DW）。上述研究结果表明在颠茄发根中过表达HDH能够有效促进莨菪碱、山莨菪碱和东莨菪碱的合成。虽然发根是代谢工程研究的有力工具,但由于其规模化培养技术并不成熟而难以实现商业化应用。本研究进一步采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法,培育获得了过表达HDH的颠茄植株。通过分子检测,鉴定出过表达HDH的转基因颠茄株系。过表达HDH颠茄植株中莨菪碱含量均得到显着提高。上述研究结果表明,HDH是一个能够有效提高颠茄植株中莨菪碱含量的重要基因。5.敲除莨菪碱6β-羟化酶提高莨菪碱含量的代谢工程研究莨菪碱6β-羟化酶（H6H）催化莨菪碱的6β-羟化转化为山莨菪碱,并能进一步将山莨菪碱环氧化为东莨菪碱。因此,敲除该基因可能会导致莨菪碱的积累水平提高。本文采用CRISPR/Cas9技术敲除颠茄H6H基因,并研究了敲除该基因对莨菪碱含量变化的影响。针对颠茄H6H第二外显子DNA序列设计了g RNA序列5’-TGGATTACCAGAAAAGCTGATGG-3’,并构建了植物表达载体p Cas9-H6H。在该表达载体中,g RNA由拟南芥U6启动子驱动表达;Cas9来源于酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）,由35S启动子驱动表达。经根癌农杆菌EHA105介导遗传转化获得了颠茄转基因植株,分子检测结果表明,在15株再生植物中,有11株为阳性转基因植物;转基因颠茄中H6H基因突变位点检测结果表明:11株转基因植物中,4株未发生编辑,7株被成功编辑,突变率约为63.6%;其中H9、H14和H15是纯合突变;H1为双等位突变;H4、H6和H8为单链突变。进一步对3个纯合突变的转基因颠茄植株进行生物碱含量分析,结果表明在纯合突变植株中均未检测到山莨菪碱和东莨菪碱,在根和叶中均出现莨菪碱的积累;在H9、H14和H15根中莨菪碱含量相对于野生型颠茄分别增加了3.68、4.21和4.28倍。在H9、H14和H15叶片中莨菪碱的含量分别比野生型增加了0.61、0.76和2.22倍。上述研究结果表明在颠茄植株中敲除H6H有效的阻止了莨菪碱向山莨菪碱和东莨菪碱的转化,从而增加了颠茄中莨菪碱的积累。综上所述,本研究包括两大部分研究内容:（1）莨菪碱脱氢酶（HDH）的分子生物学和生物化学研究;（2）莨菪碱的代谢工程研究。第一部分研究发现HDH在颠茄侧根中高水平表达并主要定位于中柱鞘和内皮层;HDH具有典型的氧化还原酶催化特征,既能将莨菪醛还原为莨菪碱,又能将莨菪碱氧化为莨菪醛,但在植物细胞生理p H条件下主要发挥还原酶的功能;酶动力学研究结果表明HDH是莨菪碱合成中的限速酶;HDH蛋白质晶体结构解析、关键氨基酸位点的突变和氘标记NADPH的饲喂示踪研究揭示了该酶的催化机制,其活性中心是一个由Zn2+、His74、Glu75、Cys52和Cys168组成的四面体结构;Met124、Leu282和Ala305三个非极性氨基酸构成底物结合口袋;His74、Ser54和Cys100是维持HDH催化活性的重要氨基酸;NADPH C4位的pro-R氢原子参与HDH催化的还原反应。第二部分研究发现过表达HDH能够提高颠茄发根和植株中莨菪碱的含量;敲除H6H能够阻断莨菪碱转化为山莨菪碱和东莨菪碱,并导致莨菪碱的积累和含量提高。HDH的表达分析和催化机制研究,对于完善TA生物合成的理论知识体系具有重要意义;开展莨菪碱的代谢工程研究并获得莨菪碱高含量的新材料,为解决莨菪碱药物资源供应问题提供了重要技术支撑。
塔淞[3]（2020）在《Wnt信号在急性缺血性脑卒中患者溶栓后出血转化中的作用和机制研究》文中研究表明缺血性脑卒中是由于脑部血管阻塞导致血流不能流入大脑而引起脑组织损伤的一种疾病,具有高发病率,高死亡率以及高致残率的特点。重组组织型纤溶酶原激活剂（Recombinant tissue-type plasminogen activator,rt-PA）是美国食品和药物管理局（FDA）批准的唯一急性缺血性脑卒中（Acute ischemic stroke,AIS）的治疗药物。静脉rt-PA溶栓会增加出血转化（Hemorrhagic transformation,HT）的风险,HT是AIS的主要并发症,严重威胁患者生命安全。经典Wnt/β-catenin信号通路（Canonical Wnt/β-catenin pathway）对维持血脑屏障（Blood-brain barrier,BBB）完整性起重要作用,极有可能是降低HT风险的潜在治疗靶点。然而,经典Wnt/β-catenin信号通路在卒中后HT中血脑屏障破坏中的作用缺乏深入的研究和确切的证据。因此,本课题从临床和分子细胞层面研究Wnt信号在急性缺血性脑卒中患者溶栓后出血转化中的作用和机制。主要研究内容包括以下两个方面:1.Wnt信号与缺血性脑卒中溶栓后出血转化的相关性研究。伴随基因测序技术的突飞猛进,基因检测引领脑血管疾病进入精准治疗的时代。通过基因诊断,可在病人发病前做到早知道,早预防,尤其是脑血管疾病更需要基因检测的指导及辅助诊断。本研究旨在探索经典Wnt信号通路相关的血液基因序列变异与接受rt-PA静脉溶栓治疗的AIS患者发生HT的关系。研究纳入355例接受rt-PA静脉溶栓（Intravenous thrombolysis,IVT）治疗的急性缺血性脑卒中患者。入组标准为相似的美国国立卫生研究院卒中量表（National Institute of Health Stroke Scale,NIHSS）基线评分;发病到开始治疗时间（Onset to treatment,OTT）为2-4小时;入院时及溶栓后24小时均行计算机断层扫描（Computered tomography,CT）;rt-PA给药前采集血样。利用定制的测序芯片测定了28个Wnt信号基因的126个单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNPs）和4个核心Wnt信号元件（GPR124、RECK、FZD4和CTNNB1）的外显子序列。结果显示与非PH组患者相比,PH组患者中分别属于WNT7A和GPR124的5个基因变异选择性富集,包括WNT7A SNPs（rs2163910,P=0.001,OR 2.727;rs1124480,P=0.002,OR 2.404）和GPR124 SNPs（rs61738775,P=0.012,OR 4.883;rs146016051 P<0.001,OR 7.607;rs75336000,P=0.044,OR 2.503）。RECK的两个SNPs在PH组患者中富集,但是差异没有统计学意义（rs12235235,P=0.090,OR 1.882;rs2274522,P=0.089,OR1.936）。2.GPR124 c.3587G>A突变对Wnt信号活性影响的机制研究。G蛋白偶联受体124（GPR124）是GPCRs粘附家族中的孤儿受体。研究发现,GPR124通过未明确的直接或间接机制发挥WNT7A/7B特异性的协同激活因子作用,对经典Wnt/β-catenin信号传导起作用。GPR124在成年小鼠的卒中的病理状态下,调节内皮细胞的Wnt信号传导,从而调节血脑屏障的完整性。这一研究发现证明了GPR124有潜力作为血脑屏障破坏的人类中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）疾病的潜在治疗靶点。根据临床患者基因检测结果,GPR124 c.3587G>A突变在PH患者中显着富集。研究通过Western Blot和免疫荧光实验检测GPR124c.3587G>A突变对蛋白表达和定位的影响;通过q PCR和TOP Flash实验检测此突变对经典Wnt/β-catenin信号通路活性的影响;通过免疫共沉淀实验检测GPR124和散乱蛋白（Dishevelled,DVL）的结合情况。研究结果显示GPR124c.3587G>A突变不影响GPR124蛋白的表达和定位;GPR124 c.3587G>A突变是存在功能学意义的,显着影响了经典Wnt/β-catenin信号通路的活性。DVL1和GPR124 wild-type（WT）结合,DVL2,DVL3则没有相互作用;GPR124 c.3587G>A突变型则是可以显着降低和DVL1的相互作用。DVL1三种结构域DIX,PDZ,DEP都和GPR124相互作用,其中PDZ结构域的作用更为突出,而DIX/DEP结构域的作用较小。综上所述,本课题研究证明了Wnt信号在急性缺血性脑卒中患者溶栓后出血转化中起重要作用。5个Wnt信号相关基因变异选择性富集在出血转化患者中,其中GPR124 c.3587G>A变异影响Wnt信号功能活性。研究结果拓宽了我们对急性缺血性脑卒中溶栓后出血转化的认识,也为临床上出血转化的预测提供了新的靶点和理论指导。
葛志毅,韩生义,曹小安,周建华,刘婷婷,刘永生,李学瑞[4]（2021）在《一株金黄色葡萄球菌噬菌体的分离鉴定与生物学特性》文中研究表明【背景】金黄色葡萄球菌作为一种条件致病菌,在临床感染中扮演着重要的角色,需要研究更多更有效的防治手段。【目的】分离金黄色葡萄球菌噬菌体,研究其生物学特性,从而为金黄色葡萄球菌的替代防治提供理论借鉴。【方法】以金黄色葡萄球菌D085为宿主从污水中分离得到一株噬菌体,命名为v BSau SSAP3,用PEG8000浓缩、氯化铯密度梯度离心获得高纯度的噬菌体,1%乙酸双氧铀染色噬菌体进行电镜观察。测定噬菌体宿主谱、最佳感染复数（Multiplicity of Infection,MOI）、一步生长曲线、热稳定性、pH值稳定性及有机溶剂对噬菌体活性的影响。平衡酚法获取噬菌体基因组,Illumina测序技术和SPAdes软件进行基因组测序分析。【结果】电镜下,噬菌体SAP3头部直径为60±5 nm,尾部长170±5 nm。噬菌体vBSauSSAP3还能裂解5株金黄色葡萄球菌和1株产色葡萄球菌,其最佳感染复数为0.1。噬菌体vBSauSSAP3潜伏期为20 min,60 min后进入平台期,裂解量约为210 PFU/cell;对45°C以下温度有一定耐受性,超过45°C开始急剧失活;能在中性pH值时保持稳定活性,酸性环境会使其急剧失活,对碱性环境有一定的抵抗力;对氯仿和异戊醇不耐受。其基因组分析结果表明:噬菌体基因组大小为41950bp,GC含量为35.42%,预测有65个开放阅读框（Open Reading Frame,ORF）。进化分析表明,噬菌体vBSauSSAP3属于长尾科噬菌体,是一种新型的噬菌体。【结论】噬菌体vBSauSSAP3是一株窄谱的能够耐受一定温度和碱性环境的长尾科新型噬菌体,对其研究可为金黄色葡萄球菌噬菌体的研究提供理论材料。
迟恒[5]（2020）在《食源性小肠结肠炎耶尔森菌IMBs-qPCR检测技术的研究》文中提出小肠结肠炎耶尔森菌是重要的人畜共患病原菌,可引起肠道疾病、关节炎、肠系膜淋巴结炎等肠道外综合症,对人类健康构成了严重的威胁。目前食品小肠结肠炎耶尔森菌的检测方法主要为培养法,该方法步骤繁琐且周期较长,具有一定的局限性。研制快速、准确检测食品中小肠结肠炎耶尔森菌的方法,在食品加工过程检测、保障食品安全中具有重要意义。本研究在克隆表达病原菌特异性蛋白的基础上,制备其特异性多抗免疫磁珠,并将免疫磁珠富集分离技术与荧光定量PCR检测技术结合,以期实现食品中小肠结肠炎耶尔森菌特异、灵敏、快速的检测。主要进展如下:1.小肠结肠炎耶尔森菌特异致病基因的克隆、表达与纯化:在对多株耶尔森菌菌株毒力基因检测、以及小肠结肠炎耶尔森菌特异致病性外膜蛋白基因ail和ompF生物信息学分析的基础上,构建了其原核表达载体,表达并纯化了浓度为5 mg/mL重组外膜蛋白Ail与OmpF。2.免疫磁珠的制备与参数优化:将重组外膜蛋白Ail与OmpF免疫成年雄性家兔,制备效价为1:3200的多克隆抗体。利用该多克隆抗体制备免疫磁珠,并优化免疫磁珠的制备参数,结果表明当25 μL浓度为10 mg/mL抗体与1 mg粒径为1.0-2.0 μm的羧基化磁珠在室温下振荡孵育6 h时,所制备的免疫磁珠偶联效率最好;且使用0.2 mg免疫磁珠捕获101-105CFU/mL小肠结肠炎耶尔森菌时,捕获效率接近80%,对非耶尔森菌的捕获效率低于10%,证明本研究制备免疫磁珠具有良好的特异性。3.小肠结肠炎耶尔森菌ompF基因敲除突变株的构建以及吸附纯化兔抗血清:通过对pKD46质粒抗性改造,以及重叠PCR延长转化片段同源臂至500 bp的方式,基于Red重组系统成功获得小肠结肠炎耶尔森菌ompF基因敲除突变株。将该菌株作为OmpF蛋白特异性多抗阳性血清制备的吸收菌株,提高检测的特异性,还可以将其作为本实验的阴性对照菌株。4.免疫磁珠捕获-荧光定量PCR（IMBs-qPCR）检测小肠结肠炎耶尔森菌方法的建立:通过在线软件设计小肠结肠炎耶尔森菌foxA的特异性引物;使用该引物建立荧光定量PCR标准曲线,确定检测最低限为64 CFU/mL;再加入沙门氏菌等干扰菌株,验证本检测方法具有良好的特异性;使用IMB s-qPCR方法检测人工污染牛奶、猪肉中的小肠结肠炎耶尔森菌,在菌液浓度为103-104 CFU/mL时,捕获率大于68%。该方法与培养法相对比,具有较高的一致性,且整个流程只需要12 h,极大缩短了检测时长。综上所述,本研究表达纯化小肠结肠炎耶尔森菌重组外膜蛋白并制备其特异性多克隆抗体,利用基因敲除突变菌株吸附除去血清中非特异性抗体。应用外膜蛋白抗体偶联的免疫磁珠对食品中小肠结肠炎耶尔森菌特异性捕获,并结合灵敏、特异的荧光定量PCR技术,建立IMBs-qPCR检测方法,提供了一种快速检测食品中小肠结肠炎耶尔森菌的有效备选方法。
王兵霞[6]（2019）在《水温对大鲵幼体生长和性腺分化的影响及Wnt4基因的表达分析》文中提出两栖动物的性腺分化是当今发育生物学的研究热点。两栖动物属于变温动物,其生长和性腺分化均受到环境温度的影响,研究温度对两栖动物的生长和性腺分化的影响,对于两栖动物保护具有重要的理论价值。本文在大鲵（Andrias davidianus）幼体适宜生长的水温范围内,设置了 14℃、21℃、24℃等3个水温梯度,分3次测量每个水温梯度下大鲵幼体的体重,采用石蜡切片、HE染色技术对其进行性别鉴定,旨在探究水温对大鲵幼体生长与性腺分化的影响。在性别鉴定的同时,依据本实验室高通量转录组测序数据筛选出的差异表达基因,选取了与性别分化相关的基因Wnt4,采用原位杂交技术对Wnt4在大鲵幼体精巢和卵巢中的表达进行了定位,还运用实时定量PCR技术、Western Bolt技术对Wnt4 的表达进行了定量,以此来探究Wnt4在大鲵幼体精巢和卵巢中的表达差异及水温变化对Wnt4表达量的影响。主要结果与结论如下:1.水温对大鲵幼体生长的影响。大鲵幼体在14℃水温下生长最慢,24℃次之,21℃最快;在3个水温梯度条件下,大鲵幼体生长速度差异显着（P<0.05）。表明在14℃～2 1℃水温范围内,大鲵幼体的生长速率随水温的升高而加快,但水温高于2 1℃对大鲵幼体的生长有抑制作用。2.水温对大鲵幼体性腺分化比例的影响。14℃水温组取材的9尾大鲵幼体为3♀6♂,雌雄性别比为1:2,雌性率为33%。21℃和24♂水温组取材的9尾大鲵幼体都为3♀6♂雌雄性别比均为2:1,21℃、24℃两组大鲵的雌性率均显着升高至67%。表明高水温可使大鲵幼体性腺分化趋向于雌性,而低水温可使大鲵幼体的性腺分化趋向于雄性。3.水温对大鲵幼体性腺分化时间的影响。在3个水温梯度下,出膜约327 d的大鲵幼体性腺的分化时间差异较大:①14℃水温组的部分大鲵幼体性腺初步分化出原始卵泡,个别大鲵幼体的性腺还未出现分化。②21℃、24℃水温组大鲵幼体的性腺已全部分化且分化程度明显。本文认为,大鲵幼体的性腺分化对水温的变化较为敏感,高水温可使其性腺的分化时间提前,分化进程加快。4.Wnt4在大鲵幼体精巢和卵巢中的定位分析。Wnt4 mRNA在14℃水温组卵巢中的强阳性表达主要集中在卵巢边缘的体细胞以及与卵巢相连的肾小管上皮细胞,Wnt4 mRNA在精巢中的表达强度较弱,表达部位主要集中在与精巢相连接的肾髓质、皮质交界处的肾小管细胞中;Wnt4 mRNA在24℃水温组卵巢中的强阳性表达主要集中在卵泡细胞中,同时在与卵巢相连的肾小管细胞内也有强阳性表达,Wnt4mRNA在精巢中的阳性表达主要集中在精巢基部接近中肾处非成熟区的精原细胞和体细胞、生精小叶内的精原细胞以及精巢横切面中部结缔组织的体细胞。5.Wnt4 mRNA在大鲵幼体精巢和卵巢中的表达量分析。实时定量PCR法检测Wnt4 mRNA的表达量由高到低的顺序为:14℃雌鲵>21℃雌鲵>21℃雄鲵>24℃雌鲵>24℃雄鲵>14℃雄鲵。14℃水温组的Wnt4mRNA的表达量在雌鲵和雄鲵之间差异显着（P<0.05）,且Wnt4 mRNA在雌鲵中的表达量约为雄鲵的2倍。而对于21℃和24℃两组而言,Wnt4mRNA的表达量在雌鲵和雄鲵之间差异均不显着（P>0.05）。Wnt4mRNA在14℃雌鲵中表达量最高,14℃雄鲵中表达量最低。且在同一水温条件下,Wnt4mRNA在大鲵幼体雌鲵中的表达量始终高于雄鲵。因此,本文认为Wnt4的表达与大鲵幼体卵巢的发育以及功能维持密切相关。6.Wnt4蛋白在大鲵幼体精巢和卵巢中的表达量分析。Western Bolt结果表明Wnt4蛋白表达量由高到低的顺序依次为:14℃雌鲵>14℃雄鲵>21℃雄鲵>24℃雌鲵>21℃雌鲵>24℃雄鲵。同一水温条件下,Wnt4蛋白在14℃、21℃两组大鲵幼体雌鲵和雄鲵之间表达量差异皆为极显着（P<0.01）,24℃水温组雌鲵和雄鲵之间表达量差异显着（P<0.05）。同一水温条件下,在14℃、24℃两组中,Wnt4蛋白在雌鲵中的表达量高于雄鲵,但21℃水温组Wnt4蛋白在雄鲵中的表达量要高于雌鲵,且差异极显着（P<0.01）。基于此,本文认为Wnt4的表达不具有性别特异性,Wnt4不仅参与大鲵幼体卵巢的发育过程,同时也是大鲵幼体精巢发育途径中的一部分。7.水温变化对Wnt4表达量的影响。本文的研究表明14℃水温组的大鲵幼体的性腺分化尚未成熟,在该温度条件下Wnt4 mRNA以及Wnt4蛋白在卵巢中的表达量最高。随着水温的升高,大鲵幼体性腺的分化更为成熟,但Wnt4 mRNA以及Wnt4蛋白的表达量均降低,因此,本文推测Wnt4在大鲵幼体卵巢发育的早期发挥更重要的作用。
陈尚文[7]（2019）在《重组德谷胰岛素前体蛋白的表达、发酵工艺优化和放大》文中提出基础胰岛素及类似药物的临床应用使糖尿病患者整体血糖得到了有效的控制。但因其作用时间短、稳定性差,以及依从性差等问题,促使研究者去开发一种作用平稳而持久、体内药效变异性小,副作用更小的新型胰岛素。德谷胰岛素即为这类新型胰岛素中的一种。本论文旨在构建重组德谷胰岛素前体蛋白的表达系统,并着重将其发酵工艺从实验室规模放大到中试规模,为实现德谷胰岛素的工业化生产打下基础。将人工合成的人胰岛素前体基因INS和HS631质粒连接为重组质粒HS631-INS,并转入大肠杆菌BL21（DE3）内,构建了稳定表达德谷胰岛素前体蛋白的重组工程菌HS631-INS/BL21。酶切图谱和测序结果显示:表达载体和前体基因大小及序列均与理论一致。前体蛋白经多步纯化得到了重组德谷胰岛素样品。质谱分析表明其分子量与德谷胰岛素理论值一致,均为5826Da。经胰岛素生物测定法检测,产物的效价为26.38IU/mg,有良好的生物学活性。在摇瓶实验中,初步比较分析了不同培养基及碳源、氮源、碳氮比和无机盐等对重组菌的菌体密度和德谷胰岛素前体蛋白表达量的影响。筛选出最适的培养基配方:葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、硫酸铵1.Og/L、三水磷酸氢二钾16.42g/L、磷酸二氢钾3.81g/L、七水硫酸镁4.93g/L和消泡剂0.2ml/L。在19L发酵罐上进一步系统研究了培养温度、pH、诱导剂浓度、补料培养基、补料速率和接种量等因素对菌体密度和前体蛋白表达的影响。得出最适操作参数:接种量1.0%,培养温度37.0℃、pH6.7和溶解氧浓度为30%±15%。以60%葡萄糖溶液为补料培养基,补料速率为0.5ml/min.L,诱导后补料速率为0.25ml/min.L;当菌体密度OD600达到75时,加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG诱导,诱导时间10h。菌体密度OD600达到184.0,德谷胰岛素前体蛋白表达量为]0.45g/L,远远高于目前公开报道的通过毕赤酵母菌表达的德谷胰岛素前体蛋白水平（4.5g/L）。通过几何相似法进一步将发酵工艺逐级放大至500L发酵罐规模。3批500L发酵结果:菌体密度OD600值达到163.3,德谷胰岛素前体蛋白表达量达到10g/L。稳定性实验表明500L发酵的菌体密度和前体蛋白表达量稳定、重显性好且易操作。同时实现了原料的国产化和降低生产成本。
姚绎[8]（2018）在《RNA复制表达技术的开发及其与宿主间关联的研究》文中提出代谢工程领域的主旨即通过人工改造的微生物生产人类所需的产物,而微生物改造技术的发展是其领域进步的基石。对于微生物特定性状的改造十分依赖于对于人工设计的外源基因在目的菌株内进行高效而可控的表达,而本课题即开发出一种全新的对于目的基因表达进行增强的方式。相较于传统菌种表达技术主体针对目的基因的拷贝数、转录、稳定性、翻译等过程进行优化,本课题首次提出可以通过RNA复制的方式针对目的基因的mRNA进行直接扩增,通过mRNA量的直接增加增强目的基因的表达。该方式提升的是目的基因的mRNA含量,与现有对于目的基因的调控方式互不干扰,从而可以实现其与其余调控方式的联合使用。本课题自Qβ噬菌体序列改造得到同样可在大肠杆菌内复制的表达序列,并将其进行通用化改造得到仿造噬菌体的RNA复制系统,以之实现针对人们需求目的基因的表达增强。本课题证明了该系统的有效性、复制性及通用性,可以为后续将之使用于具体工程菌株改造中提供基础。此外,本课题还对RNA复制系统发挥功能时与底盘菌株之间的关联进行了探索,并得出在敲除底盘菌株Rnc基因时,RNA复制系统的效果具有很大改善。同时,本课题也对RNA复制系统在两种目的产物ALA及PHB生产中的效果进行验证,并均使产物产量得到了提升。本课题还验证了RNA复制系统在革兰氏阳性菌乳酸菌（Lb.caseil Zhang）中同样可以发挥功能。这些研究同样预示着本课题所提出的RNA复制系统在代谢工程领域的应用前景。综上所述,本课题构建了促进目的基因表达的一种新方法,即通过RNA复制系统增加mRNA表达量。该方法在报告基因与实际产物中均工作良好,有望成为未来代谢工程菌种改造的又一有力工具。
张咏雪[9]（2016）在《甜菜M14品系BvM14-STPK蛋白响应盐胁迫磷酸化功能位点的探究》文中指出在二倍体栽培甜菜（Beta vulgaris L.）的染色体组上加入了野生白花甜菜（Beta corolliflora Zoss.）第9号染色体而得到的单体附加系——甜菜M14品系,具有很多特殊的性状,如耐盐、抗旱、耐寒和无融合生殖等,甜菜M14品系是去发掘优质基因与蛋白质点的极其难得的植物材料。前期工作中,课题组在比较未处理组的对照,对200、400 mM NaCl处理下,甜菜M14品系的叶片及根部总蛋白开展了定量蛋白质组学研究,在叶中获得40个差异蛋白质,根中获得36个差异蛋白质,本研究的甜菜M14品系丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine-threonine protein kinase,STPK）是一个响应根部盐胁迫与信号转导相关的差异蛋白质点,受盐胁迫上调表达3.24倍。STPK用来使多种功能蛋白发生磷酸化,是一类特别的蛋白激酶,参与多种生命过程中。从相关研究中发现,STPK对盐、干旱和低温胁迫诱导有显着的抗性作用,可以参与各种代谢过程。本试验基于课题组前期盐胁迫蛋白质组学研究,并在相同盐浓度处理下的转录组数据库中获得基因的cDNA序列,利用PCR操作得到甜菜M14品系丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因（BvM14-STPK）cDNA全长,共计1 668bp,最大ORF为1 527bp,编码508个Aa,具有STPK保守结构域,该基因编码的蛋白成亲水性,属蛋白激酶C家族。荧光定量数据揭示在甜菜M14品系叶、根中BvM14-STPK基因均有广泛表达,与未胁迫组比,在200、400mM NaCl浓度下生长的叶片中,该基因均上调表达;而在200、400mM NaCl处理的根部中,该基因先上调表达,后下调表达,说明该基因可以迅速应答盐胁迫,但在不同组织中的表达情况并不相同。磷酸化是细胞参与生命活动过程中的必不可少反应,识别具有行使功能的磷酸化位点是确定蛋白磷酸化机制的必要步骤,本试验进一步构建了BvM14-STPK基因的原核表达体系来研究其磷酸化位点,以未转基因的空载菌株为对照,对转BvM14-STPK基因的大肠杆菌BL21（DE3）菌体进行诱导蛋白表达,在37℃、0.5 mM IPTG的诱导下蛋白表达量最大,结果表明BvM14-STPK蛋白主要表达位置为沉淀中,存在的主要形式是包涵体;Western印迹结果呈阳性,说明BvM14-STPK融合蛋白能正确表达,进一步对蛋白质样品进行胶内酶解,并经过除盐、富集,酶解后的多肽段采用LC-MS/MS举行质谱鉴定,并进行Green Plant Database检索,通过质谱匹配肽段数量、蛋白质序列覆盖度和MS/MS图谱质量来判断,共鉴定了8个关键的Ser磷酸化位点。磷酸化过程中位点对蛋白激酶的作用需要进一步进行鉴定,相邻Ser磷酸化位点的功能互补关系,将采取对鉴定的Ser磷酸化位点进行分段突变,共分为5段,分别将Ser突变成Asp和Phe,使蛋白激酶持续磷酸化和非持续磷酸化,并通过叶盘法侵染转入烟草中。
李澜,陈锦灿,杨兆元,李东哲,吴薇,饶文华,潘晓鸿,关雄[10]（2015）在《纳米Mg（OH）2对苏云金芽胞杆菌蛋白杀虫活性及抗紫外能力影响的研究》文中指出苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）制剂是目前产量最大、应用最广泛的微生物杀虫剂,但在施用过程中易受紫外线的影响而缩短持效期,成为Bt制剂应用受限的主要原因之一。本研究以纳米Mg（OH）2为载体,将其与Bt杀虫晶体蛋白进行负载,研究纳米Mg（OH）2负载Bt杀虫晶体蛋白后的生物杀虫活性及抗紫外能力。以共沉淀法制备纳米Mg（OH）2,利用X-射线粉末衍射（X-ray powder diffraction,XRD）对其尺寸进行表征,通过谢乐公式计算得出合成的纳米颗粒在101面的尺寸为12 nm。扫描电镜（scanning electron microscope,SEM）的结果表明,纳米颗粒为较规则的片状结构且分散均匀,与Cry蛋白负载后,其形貌没有发生明显的变化。以高效杀蚊Bt菌株LLP29为供试菌株,利用碱溶法获得Bt杀虫晶体蛋白。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE）和生物活性测试结果表明,Bt杀虫晶体蛋白与纳米Mg（OH）2进行一定负载后,能有效地提高其Cry蛋白的杀虫活性,同时增强抗紫外辐射能力,有效地保护蛋白结构免受破坏。本研究为获得生物相容性好、环境友好的纳米Bt高效制剂提供了理论基础。
二、《分子克隆实验指南》(第3版)（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、《分子克隆实验指南》(第3版)（论文提纲范文）
（1）葡萄球菌噬菌体基因组遗传进化分析与其裂解酶活性测定（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 金黄色葡萄球菌概述 |
| 1.1.1 金黄色葡萄球菌的生物学特性 |
| 1.1.2 金黄色葡萄球菌的致病力 |
| 1.2 葡萄球菌噬菌体概述 |
| 1.2.1 形态特征 |
| 1.2.2 葡萄球菌噬菌体的基因组特点及分类 |
| 1.2.3 葡萄球菌噬菌体的结合 |
| 1.2.4 细菌抗葡萄球菌噬菌体的机制 |
| 1.3 葡萄球菌噬菌体裂解酶研究概述 |
| 1.3.1 葡萄球菌噬菌体裂解酶的结构特点 |
| 1.3.2 葡萄球菌噬菌体裂解酶的作用位点 |
| 1.3.3 葡萄球菌噬菌体裂解酶的应用优势 |
| 1.3.3.1 裂解酶具有高效性 |
| 1.3.3.2 不易产生抗性 |
| 1.3.3.3 具有对细菌生物被膜的清除能力 |
| 1.3.3.4 便于开发改造 |
| 1.3.3.5 可以与其他抗菌剂联合应用 |
| 1.4 本研究的目的与意义 |
| 第二章 葡萄球菌噬菌体基因组遗传进化分析 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 葡萄球菌噬菌体全基因组序列来源 |
| 2.1.2 探究基因组核苷酸的使用和噬菌体表型之间的关系 |
| 2.1.3 葡萄球菌密码子使用偏嗜性分析 |
| 2.1.4 总体密码子使用模式角度分析遗传多样性 |
| 2.1.5 噬菌体奇偶偏好分析 |
| 2.1.6 有效密码子数和GC3 含量分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 基因组核苷酸的使用和噬菌体表型之间的关系 |
| 2.2.2 葡萄球菌密码子使用偏嗜性分析 |
| 2.2.3 总体密码子使用模式角度分析遗传多样性 |
| 2.2.4 噬菌体奇偶偏好分析 |
| 2.2.5 有效密码子数和GC3 含量分析 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 噬菌体vB_SauS_SAP3的生物学特性与基因组分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 菌株 |
| 3.1.2 主要试剂和仪器 |
| 3.1.3 主要溶液配制 |
| 3.1.4 噬菌体的分离 |
| 3.1.5 噬菌体的纯化 |
| 3.1.6 噬菌体的浓缩 |
| 3.1.7 噬菌体的超速离心 |
| 3.1.8 噬菌体的电镜观察 |
| 3.1.9 噬菌体的生物学特性分析 |
| 3.1.9.1 宿主谱测定 |
| 3.1.9.2 最佳感染复数测定(multiplicity of infection,MOI) |
| 3.1.9.3 一步生长曲线测定 |
| 3.1.9.4 热稳定性测定 |
| 3.1.9.5 不同pH对噬菌体活性影响的测定 |
| 3.1.9.6 有机试剂对噬菌体活性影响的测定 |
| 3.1.10 噬菌体基因组分析 |
| 3.1.10.1 噬菌体基因组的提取和核酸类型鉴定 |
| 3.1.10.2 噬菌体基因组分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 葡萄球菌分离 |
| 3.2.2 噬菌体的分离及纯化 |
| 3.2.3 噬菌体的浓缩、超速离心及电镜观察 |
| 3.2.4 噬菌体的生物学特性分析 |
| 3.2.4.1 宿主谱测定 |
| 3.2.4.2 最佳感染复数(MOI)测定 |
| 3.2.4.3 一步生长曲线测定 |
| 3.2.4.4 热稳定性测定 |
| 3.2.4.5 不同p H对噬菌体活性影响的测定 |
| 3.2.4.6 有机试剂对噬菌体活性影响的测定 |
| 3.2.5 噬菌体基因组的分析 |
| 3.2.5.1 噬菌体基因组的提取和核酸类型鉴定 |
| 3.2.5.2 噬菌体基因组分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 噬菌体vB_SauS_SAP3裂解酶的表达与活性评测 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 菌株和质粒 |
| 4.1.2 主要试剂和仪器 |
| 4.1.3 主要溶液配制 |
| 4.1.4 噬菌体裂解酶基因扩增 |
| 4.1.4.1 引物设计与合成 |
| 4.1.4.2 目的基因PCR扩增 |
| 4.1.5 裂解酶原核重组表达载体的构建 |
| 4.1.6 裂解酶重组表达载体的鉴定 |
| 4.1.7 裂解酶重组蛋白的原核表达 |
| 4.1.8 裂解酶重组蛋白的纯化 |
| 4.1.9 裂解酶重组蛋白的复性 |
| 4.1.10 裂解酶浓度检测 |
| 4.1.11 裂解酶结构域的预测和表达 |
| 4.1.12 裂解酶体外活性评测 |
| 4.1.12.1 抑菌活性检测与宿主谱测定 |
| 4.1.12.2 蛋白结合活性测定 |
| 4.1.13 裂解酶体内活性评测 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 裂解酶基因的扩增和酶切 |
| 4.2.2 裂解酶重组表达载体鉴定 |
| 4.2.3 裂解酶重组蛋白的表达和纯化 |
| 4.2.4 裂解酶蛋白浓度的测定 |
| 4.2.5 裂解酶蛋白结构域预测及表达 |
| 4.2.6 裂解酶蛋白的体外活性评测 |
| 4.2.6.1 抑菌活性测定 |
| 4.2.6.2 裂解酶蛋白和结构域的宿主谱测定 |
| 4.2.6.3 蛋白结合活性测定 |
| 4.2.7 裂解酶体内活性评测 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 附录A 99株葡萄球菌全基因组相关信息 |
| 附录B 葡萄球菌密码子使用偏嗜性分析结果 |
| 附录C 有效密码子数和GC3含量分析结果 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）莨菪碱脱氢酶催化机制及莨菪碱代谢工程研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 药用托品烷生物碱的来源和临床药效 |
| 1.2 托品烷生物碱生物合成 |
| 1.2.1 托品烷生物碱生物合成途径 |
| 1.2.2 组学助力托品烷生物碱生物合成途径解析 |
| 1.2.3 腐胺N-甲基转移酶(Putrescine N-methyltransferase,PMT) |
| 1.2.4 腐胺N-甲基氧化酶(N-Methylputrescine oxidase,MPO) |
| 1.2.5 Ⅲ型聚酮合成酶(TypeⅢpolyketide synthase,PYKS) |
| 1.2.6 托品酮合成酶(Tropinone synthase,CYP82M3) |
| 1.2.7 托品酮还原酶(Tropinone reductase,TR) |
| 1.2.8 苯丙氨酸氨基转移酶(L-Phenylalanine:4-hydroxyphenylpyruvate aminotransferase,Ar AT4) |
| 1.2.9 苯丙酮酸还原酶(Phenylpyruvic acid reductase,PPAR) |
| 1.2.10 海螺碱生物合成二酶系统:苯乳酸葡萄糖基转移酶(Phenyllactate UDP-glycosyltransferase,UGT1)和海螺碱合成酶(Littorine synthase,LS) |
| 1.2.11 海螺碱变位酶(Littorine Mutase,CYP80F1) |
| 1.2.12 莨菪碱脱氢酶/莨菪醛还原酶(Hyoscyamine dehydrogenase/Hyoscyamine aldehyde reductase,HDH/HAR) |
| 1.2.13 莨菪碱6β-羟化酶(Hyoscyamine6β-hydroxylase,H6H) |
| 1.3 托品烷生物碱生物合成酶催化机制研究 |
| 1.3.1 腐胺N-甲基转移酶催化机制 |
| 1.3.2 III型聚酮合酶催化机制 |
| 1.3.3 托品酮还原酶I和II的催化机制 |
| 1.3.4 莨菪碱6β-羟化酶催化机制 |
| 1.4 商业化生产托品烷生物碱的瓶颈和技术改良 |
| 1.4.1 商业化生产托品烷生物碱的瓶颈 |
| 1.4.2 代谢工程提高托品烷生物碱产量 |
| 1.4.3 微生物工厂生产托品烷生物碱 |
| 第2章 绪论 |
| 2.1 选题依据、研究目的与意义 |
| 2.2 拟解决的科学问题 |
| 2.3 研究内容和技术路线 |
| 第3章 莨菪碱脱氢酶基因克隆与功能鉴定 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 植物材料 |
| 3.1.2 质粒与菌株 |
| 3.1.3 常规试剂、耗材 |
| 3.1.4 自配试剂 |
| 3.1.5 培养基的配制 |
| 3.1.6 通用仪器设备 |
| 3.1.7 常规分子生物学方法 |
| 3.1.8 基于转录组挖掘HDH编码基因 |
| 3.1.9 HDH基因全长序列的获取 |
| 3.1.10 HDH基因的表达模式qPCR分析 |
| 3.1.11 颠茄基因组步移文库构建 |
| 3.1.12 HDH启动子克隆与pHDH::GUS载体构建 |
| 3.1.13 pHDH::GUS转基因毛状根获得 |
| 3.1.14 pHDH::GUS转基因毛状根组织化学染色 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 HDH候选基因的筛选 |
| 3.2.2 HDH候选基因克隆与表达分析 |
| 3.2.3 候选HDH启动子的表达分析 |
| 3.3 小结与讨论 |
| 第4章 莨菪碱脱氢酶催化活性鉴定 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 质粒与菌株 |
| 4.1.2 试剂 |
| 4.1.3 设备 |
| 4.1.4 HDH蛋白质表达和纯化 |
| 4.1.5 CYP80F1 蛋白质表达以及微体蛋白分离 |
| 4.1.6 HDH催化活性测定 |
| 4.1.7 HDH最适反应条件测定 |
| 4.1.8 HDH酶动力学参数K_m和V_(max)以及反应平衡常数测定 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 HDH原核表达载体构建及大肠杆菌异源表达纯化 |
| 4.2.2 HDH催化莨菪醛还原生成莨菪碱 |
| 4.2.3 HDH氧化莨菪碱生成莨菪醛 |
| 4.2.4 HDH最适反应条件 |
| 4.2.5 HDH平衡常数测定 |
| 4.2.6 HDH酶动力学参数 |
| 4.3 小结与讨论 |
| 第5章 莨菪碱脱氢酶催化机制解析 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 质粒与菌株 |
| 5.1.2 试剂 |
| 5.1.3 设备 |
| 5.1.4 HDH蛋白质大量诱导以及蛋白质纯化 |
| 5.1.5 HDH蛋白的晶体生长与结构解析 |
| 5.1.6 HDH蛋白的结构分析与分子对接 |
| 5.1.7 HDH点突变以及突变体活性分析 |
| 5.1.8 酶法合成[4-~2H]NADPH |
| 5.1.9 使用氘代[4-~2H]NADPH还原苯乙醛 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 获得HDH晶体以及结构解析 |
| 5.2.2 HDH蛋白结构解析 |
| 5.2.3 HDH蛋白的分子对接 |
| 5.2.4 HDH底物结合位点及催化关键残基 |
| 5.2.5 解析HDH催化机制 |
| 5.3 小结与讨论 |
| 第6章 过表达莨菪碱脱氢酶基因提高莨菪碱含量的代谢工程研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试剂与培养基配制 |
| 6.1.2 过表达HDH颠茄毛状根获得和分子检测 |
| 6.1.3 颠茄毛状根中托品烷生物碱的提取及含量测定 |
| 6.1.4 过表达HDH颠茄植株获得及分子检测 |
| 6.1.5 颠茄植株托品烷生物碱提取及含量测定 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 在颠茄发根中过表达HDH提高莨菪碱含量 |
| 6.2.2 过表达HDH培育莨菪碱含量提高的颠茄植株 |
| 6.3 小结与讨论 |
| 第7章 敲除莨菪碱6β-羟化酶基因提高莨菪碱含量的代谢工程研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 AbH6H编码区基因组序列的克隆与sg RNA设计 |
| 7.1.2 AbH6H敲除载体构建和工程菌的获得 |
| 7.1.3 AbH6H敲除转基因植株获得和分子检测 |
| 7.1.4 AbH6H敲除转基因纯合植株生物碱含量检测 |
| 7.2 结果与分析 |
| 7.2.1 AbH6H编码区基因组序列的克隆与sg RNA设计及载体构建 |
| 7.2.2 AbH6H基因组敲除转基因颠茄的获得与分子检测 |
| 7.2.3 敲除AbH6H的颠茄中托品烷生物碱含量分析 |
| 7.3 小结与讨论 |
| 第8章 总结与展望 |
| 8.1 结论 |
| 8.2 特色与创新 |
| 8.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 学习期间发表论文及参加课题 |
（3）Wnt信号在急性缺血性脑卒中患者溶栓后出血转化中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 缺血性脑卒中定义及诊疗现状 |
| 1.2 血脑屏障及出血转化的研究进展 |
| 1.3 Wnt信号通路及其研究进展 |
| 1.3.1 Wnt的起源 |
| 1.3.2 Wnt的配体和生物作用 |
| 1.3.3 Wnt受体:FZD和 LRP5/6 |
| 1.3.4 Wnt拮抗剂和激动剂 |
| 1.3.5 Wnt信号通路 |
| 1.3.6 Wnt信号与血脑屏障 |
| 1.4 本论文选题与研究内容 |
| 第2章 Wnt信号与缺血性脑卒中溶栓后出血转化的相关性研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 研究对象 |
| 2.2.1 纳入标准 |
| 2.2.2 剂量和给药方法 |
| 2.3 研究方法 |
| 2.3.1 临床评估 |
| 2.3.2 基因序列变异和多态性的检测 |
| 2.3.3 统计学方法 |
| 2.4 研究结果 |
| 2.4.1 临床资料结果 |
| 2.4.2 基因检测结果 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| A突变对Wnt信号活性影响的机制研究'>第3章 GPR124 c.3587G>A突变对Wnt信号活性影响的机制研究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和仪器 |
| 3.2.1 细胞系 |
| 3.2.2 细胞培养基和相关试剂 |
| 3.2.3 生物化学试剂及耗材 |
| 3.2.4 分子克隆相关试剂 |
| 3.2.5 RNA提取,逆转录及RT-q PCR试剂 |
| 3.2.6 分子克隆引物 |
| 3.2.7 RT-q PCR引物 |
| 3.2.8 实验抗体 |
| 3.2.9 实验仪器 |
| 3.2.10 试剂配制 |
| 3.3 实验方法和步骤 |
| 3.3.1 分子克隆实验方法 |
| 3.3.2 细胞培养 |
| 3.3.3 细胞转染 |
| 3.3.4 Western Blot |
| 3.3.5 细胞免疫荧光染色 |
| 3.3.6 RNA提取,逆转录和RT-q PCR |
| 3.3.7 双荧光素酶报告基因实验 |
| 3.3.8 免疫共沉淀实验 |
| 3.3.9 统计 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 构建实验所需质粒和转染效率的检测 |
| A突变对蛋白表达和定位的影响'>3.4.2 GPR124 c.3587G>A突变对蛋白表达和定位的影响 |
| A突变对Wnt/β-catenin通路活性的影响'>3.4.3 GPR124 c.3587G>A突变对Wnt/β-catenin通路活性的影响 |
| 3.4.4 GPR124和DVL的相互作用 |
| 3.4.5 GPR124和DVL1 结构域的相互作用 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 全文总结与展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得科研成果 |
| 致谢 |
（4）一株金黄色葡萄球菌噬菌体的分离鉴定与生物学特性（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验菌株 |
| 1.2 主要试剂和仪器 |
| 1.3 主要溶液配制 |
| 1.4 噬菌体的分离 |
| 1.5 噬菌体的纯化 |
| 1.6 噬菌体的浓缩 |
| 1.7 噬菌体的超速离心 |
| 1.8 噬菌体的电镜观察 |
| 1.9 噬菌体的生物学特性分析 |
| 1.9.1 宿主谱测定 |
| 1.9.2 最佳感染复数测定(Multiplicity of Infection,MOI) |
| 1.9.3 一步生长曲线测定 |
| 1.9.4 热稳定性测定 |
| 1.9.5 不同p H对噬菌体活性影响的测定 |
| 1.9.6 有机试剂对噬菌体活性影响的测定 |
| 1.1 0 噬菌体基因组分析 |
| 1.1 0. 1 基因组的提取和核酸类型鉴定 |
| 1.1 0. 2 基因组分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 噬菌体的分离及纯化 |
| 2.2 噬菌体的浓缩、超速离心及电镜观察 |
| 2.3 噬菌体的生物学特性分析 |
| 2.3.1 宿主谱测定 |
| 2.3.2 最佳感染复数(MOI)测定 |
| 2.3.3 一步生长曲线测定 |
| 2.3.4 热稳定性测定 |
| 2.3.5 不同p H对噬菌体活性影响的测定 |
| 2.3.6 有机试剂对噬菌体活性影响的测定 |
| 2.4 噬菌体基因组的分析 |
| 2.4.1 噬菌体基因组的提取和核酸类型鉴定 |
| 2.4.2 噬菌体基因组分析 |
| 3 讨论与结论 |
（5）食源性小肠结肠炎耶尔森菌IMBs-qPCR检测技术的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 文献综述 |
| 1.1 小肠结肠炎耶尔森菌概述 |
| 1.1.1 病原学研究 |
| 1.1.2 流行病学与药物敏感性 |
| 1.1.3 两种小肠结肠炎耶尔森菌外膜蛋白的概述 |
| 1.2 小肠结肠炎耶尔森菌检测技术进展 |
| 1.2.1 培养检测 |
| 1.2.2 分子生物学检测 |
| 1.2.3 免疫学检测 |
| 1.3 免疫磁珠分离技术 |
| 1.3.1 免疫磁珠的原理与结构特点 |
| 1.3.2 免疫磁珠分离技术的优势 |
| 1.3.3 免疫磁珠分离技术的实际应用 |
| 1.4 实时荧光定量PCR技术 |
| 1.4.1 实时荧光定量PCR技术原理与特点 |
| 1.4.2 实时荧光定量PCR技术的应用 |
| 1.5 Red重组技术 |
| 1.5.1 Red重组技术原理以及优势 |
| 1.5.2 Red重组技术应用实例 |
| 1.6 研究目的与内容 |
| 第2章 小肠结肠炎耶尔森菌外膜蛋白的表达纯化 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与方法 |
| 2.2.1 实验用菌株与载体 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 细菌的培养以及基因组提取 |
| 2.2.4 ail,ompF基因生物信息学分析及序列扩增 |
| 2.2.5 原核表达载体的构建与验证 |
| 2.2.6 重组外膜蛋白的表达与纯化 |
| 2.3 结果分析 |
| 2.3.1 ail,ompF基因生物信息学分析结果 |
| 2.3.2 外膜蛋白基因的扩增与16SrDNA验证 |
| 2.3.3 原核表达载体的构建 |
| 2.3.4 三种外膜蛋白的表达纯化结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 扩增基因的选择标准 |
| 2.4.2 表达载体选择与包涵体蛋白纯化 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 小肠结肠炎耶尔森菌免疫磁珠的制备与参数优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与方法 |
| 3.2.1 实验菌株与动物 |
| 3.2.2 主要试剂 |
| 3.2.3 重组外膜蛋白抗血清的制备 |
| 3.2.4 多克隆抗体的纯化以及效价的测定 |
| 3.2.5 多克隆抗体的免疫印迹分析(Western-blot) |
| 3.2.6 免疫磁珠的制备 |
| 3.2.7 免疫磁珠制备参数优化 |
| 3.2.8 免疫磁珠捕获小肠结肠炎耶尔森菌的特异性评价 |
| 3.2.9 扫描电镜(SEM)观察免疫磁珠-小肠结肠炎耶尔森菌复合物 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 重组外膜蛋白多克隆抗体的纯化以及效价的测定 |
| 3.3.2 多克隆抗体的免疫印迹分析(Western-blot)结果 |
| 3.3.3 免疫磁珠制备参数的优化 |
| 3.3.4 免疫磁珠捕获小肠结肠炎耶尔森菌特异性评价 |
| 3.3.5 扫描电镜(SEM)观察免疫磁珠-小肠结肠炎耶尔森菌复合物 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 免疫磁珠制备参数的优化 |
| 3.4.2 免疫磁珠捕获能力与特异性分析 |
| 3.4.3 两种抗体制备磁珠捕获效率差异分析 |
| 3.4.4 多抗交叉性原因分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 小肠结肠炎耶尔森菌ompF基因敲除突变株的构建 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 实验菌株以及载体 |
| 4.2.2 实验试剂 |
| 4.2.3 pKD46质粒抗性改造与验证 |
| 4.2.4 感受态细胞的制备与电转化 |
| 4.2.5 重叠PCR扩增抗性片段 |
| 4.2.6 抗性片段的电转化 |
| 4.2.7 PCR鉴定ompF基因敲除突变株 |
| 4.2.8 基因敲除菌株吸附纯化兔抗血清 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 pKD46质粒抗性改造与验证 |
| 4.3.2 重叠PCR扩增抗性片段结果 |
| 4.3.3 PCR鉴定小肠结肠炎耶尔森菌ompF基因敲除突变株 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 供体同源臂的长度对同源重组效率的影响 |
| 4.4.2 提高同源同组效率需注意的其他因素 |
| 4.4.3 构建ompF基因敲除突变株的意义 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 IMBs-qPCR检测食品中小肠结肠炎耶尔森菌方法建立 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与方法 |
| 5.2.1 材料与试剂 |
| 5.2.2 基于在线软件设计foxA荧光定量PCR引物 |
| 5.2.3 建立荧光定量PCR标准曲线 |
| 5.2.4 荧光定量PCR检测foxA基因的重复性检测 |
| 5.2.5 荧光定量PCR检测foxA基因的特异性评价 |
| 5.2.6 IMBs-qPCR检测食品(肉、奶)中小肠结肠炎耶尔森菌 |
| 5.2.7 IMBs-qPCR检测野生型与基因缺失菌株捕获效率差异 |
| 5.3 结果与分析 |
| 5.3.1 基于在线软件设计foxA荧光定量PCR引物 |
| 5.3.2 建立荧光定量PCR标准曲线 |
| 5.3.3 荧光定量PCR的重复性检测 |
| 5.3.4 荧光定量PCR检测foxA基因的特异性评价 |
| 5.3.5 IMBs-qPCR检测食品(肉、奶)中小肠结肠炎耶尔森菌 |
| 5.3.6 免疫磁珠对野生型与OmpF基因缺失型菌株捕获效率对比 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 荧光定量PCR检测基因的选择 |
| 5.4.2 IMBs-qPCR检测食品中的小肠结肠炎耶尔森菌 |
| 5.4.3 IMBs-qPCR检测体系的优化 |
| 5.4.4 IMBs-qPCR检测方法展望 |
| 5.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 发表论文和参加科研情况说明 |
| 致谢 |
（6）水温对大鲵幼体生长和性腺分化的影响及Wnt4基因的表达分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 两栖动物的性别发育 |
| 1.2 温度对动物生长和性腺分化的影响 |
| 1.3 外源性激素对性腺分化的影响 |
| 1.4 性别相关基因对性腺分化的影响 |
| 1.5 Wnt4的研究现状 |
| 1.6 大鲵性腺的研究现状 |
| 1.7 研究目的及意义 |
| 第2章 水温对大鲵幼体生长和性腺分化的影响 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.2 试剂与仪器 |
| 2.1.3 方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 不同水温对大鲵幼体生长发育的影响 |
| 2.2.2 不同水温梯度组大鲵幼体的性腺分化比例、分化时间 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 水温对大鲵幼体生长发育的影响 |
| 2.3.2 水温对大鲵幼体性腺分化比例、分化时间的影响 |
| 第3章 Wnt4基因在大鲵幼体性腺中的表达分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 材料 |
| 3.1.2 仪器与试剂 |
| 3.1.3 方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 不同水温处理组总RNA的质量 |
| 3.2.2 cDNA质量的验证 |
| 3.2.3 PCR扩增产物序列 |
| 3.2.4 蓝白斑筛选、质粒线性化以及探针的制备 |
| 3.2.5 质粒测序 |
| 3.2.6 质粒线性化 |
| 3.2.7 探针的合成 |
| 3.2.8 荧光实时定量PCR法检测Wnt4基因的表达量 |
| 3.2.9 灰度分析 |
| 3.3 Wnt4mRNA在大鲵幼体性腺中的原位杂交 |
| 3.3.1 14℃水温组Wnt4 mRNA的原位杂交 |
| 3.3.2 24℃水温组Wnt4 mRNA的原位杂交 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 Wnt4在大鲵精巢和卵巢中的表达特点 |
| 3.4.2 温度变化对Wnt4表达的影响 |
| 第4章 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
（7）重组德谷胰岛素前体蛋白的表达、发酵工艺优化和放大（论文提纲范文）
| 致谢 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 胰岛素和糖尿病 |
| 1.2 胰岛素的分类与特点 |
| 1.3 人胰岛素和德谷胰岛素的结构特点 |
| 1.4 德谷胰岛素的作用机制 |
| 1.5 德谷胰岛素的研究 |
| 1.6 德谷胰岛素的制备方法 |
| 1.7 本选题研究意义和研究内容 |
| 第2章 重组德谷胰岛素前体蛋白表达载体的构建 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器设备 |
| 2.2.1 菌种与载体 |
| 2.2.2 药品试剂 |
| 2.2.3 主要仪器与型号 |
| 2.2.4 实验溶液的配制 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 琼脂糖凝胶电泳检测方法 |
| 2.3.2 外源蛋白浓度检测方法 |
| 2.3.3 重组德谷胰岛素体内生物学活性检测方法 |
| 2.3.4 宿主的选择 |
| 2.3.5 目的基因的克隆与表达质粒构建 |
| 2.3.6 感受态细胞的制备 |
| 2.3.7 重组HS631-INS质粒的转化 |
| 2.3.8 阳性克隆菌鉴定 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 人胰岛素INS基因序列合成 |
| 2.4.2 HS631-INS表达载体构建及鉴定 |
| 2.4.3 重组德谷胰岛素前体蛋白表达鉴定 |
| 2.4.4 重组德谷胰岛素的结构鉴定与活性测定 |
| 2.5 本章小结 |
| 第3章 重组工程菌发酵培养基的优化 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和仪器设备 |
| 3.2.1 菌种 |
| 3.2.2 药品试剂 |
| 3.2.3 实验主要仪器和型号 |
| 3.2.4 实验溶液配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 摇瓶培养 |
| 3.3.2 分析方法 |
| 3.3.3 统计分析软件 |
| 3.3.4 培养基筛选 |
| 3.3.5 培养基中碳源的优化 |
| 3.3.6 培养基中氮源的选择 |
| 3.3.7 碳氮配比的优化 |
| 3.3.8 无机盐浓度的优化 |
| 3.4 结论与分析 |
| 3.4.1 种子生长曲线与菌龄的确定 |
| 3.4.2 培养基筛选结果 |
| 3.4.3 碳源的优化结果 |
| 3.4.4 氮源的筛选结果 |
| 3.4.5 碳氮配比的优化结果 |
| 3.4.6 无机盐浓度的优化结果 |
| 3.5 优化结果验证 |
| 3.6 本章小结 |
| 第4章 重组工程菌发酵工艺研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和仪器设备 |
| 4.2.1 菌种 |
| 4.2.2 药品试剂 |
| 4.2.3 实验仪器及型号 |
| 4.2.4 实验溶液配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 摇瓶培养 |
| 4.3.2 19L发酵罐培养 |
| 4.3.3 分析方法 |
| 4.3.4 重组工程菌发酵过程中各因素的影响 |
| 4.3.5 重组工程菌在19L发酵罐上的发酵工艺优化 |
| 4.3.6 接种量对菌体生长和前体蛋白表达的影响 |
| 4.3.7 优化条件下的重组工程菌发酵工艺的放大 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 不同培养温度对重组工程菌生长的影响 |
| 4.4.2 不同pH值对于重组工程菌生长的影响 |
| 4.4.3 IPTG浓度对重组工程菌表达前体蛋白的影响 |
| 4.4.4 诱导时间对重组工程菌表达前体蛋白的影响 |
| 4.4.5 补料培养基的对菌体生长和前体蛋白表达的影响 |
| 4.4.6 补料速率对菌体生长和前体蛋白表达的影响 |
| 4.4.7 不同发酵和诱导条件对前体蛋白表达的影响 |
| 4.4.8 接种量对菌体生长和前体蛋白表达的影响 |
| 4.4.9 优化后的发酵工艺验证 |
| 4.5 本章小结 |
| 第5章 重组工程菌发酵工艺放大研究 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料与仪器设备 |
| 5.2.1 菌种 |
| 5.2.2 药品试剂 |
| 5.2.3 主要仪器与设备型号 |
| 5.2.4 实验溶液配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 菌种库的建立 |
| 5.3.2 种子培养 |
| 5.3.3 发酵培养 |
| 5.3.4 分析方法 |
| 5.3.5 原料替代实验 |
| 5.3.6 发酵工艺的中试放大 |
| 5.3.7 500L发酵工艺稳定性实验 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 原料替代实验 |
| 5.4.2 100L发酵工艺放大结果 |
| 5.4.3 100L发酵工艺稳定性验证 |
| 5.4.4 500L发酵工艺放大结果 |
| 5.4.5 500L发酵工艺稳定性结果 |
| 5.4.6 不同规模发酵罐发酵培养结果比较 |
| 5.5 本章小结 |
| 第6章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 展望 |
| 参考文献 |
（8）RNA复制表达技术的开发及其与宿主间关联的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要英文缩略词对照表 |
| 第1章 前言 |
| 1.1 问题的提出 |
| 1.2 选题背景及意义 |
| 1.3 文献综述 |
| 1.3.1 代谢工程综述 |
| 1.3.2 细菌中传统提升目的基因表达的方法综述 |
| 1.3.3 病毒及真核生物中的RNA复制行为综述 |
| 1.3.4 Qβ噬菌体及其复制过程综述 |
| 1.3.5 RNA复制过程在方法学中的应用 |
| 1.4 论文研究方法 |
| 1.5 论文结构 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌种 |
| 2.1.2 质粒 |
| 2.1.3 细菌细胞培养实验试剂 |
| 2.1.4 分子生化实验试剂 |
| 2.1.5 DNA分子量测定 |
| 2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 培养基的配置 |
| 2.3.2 分子克隆技术 |
| 2.3.3 使用酶标仪测量细菌生长曲线 |
| 2.3.4 使用流式细胞分析仪测定细菌荧光表达量 |
| 2.3.5 使用实时荧光定量核酸扩增检测仪检测RNA含量 |
| 2.3.6 ALA发酵及产量测定 |
| 2.3.7 PHB发酵及产量测定 |
| 2.3.8 HEK293T细胞培养及转染 |
| 2.3.9 转基因鼠的构建 |
| 2.3.10 血清生长激素浓度的测量 |
| 第3章 RNA复制系统的建立 |
| 3.1 在大肠杆菌中使用DNA对Qβ噬菌体序列进行表达 |
| 3.2 仿噬菌体RNA复制系统的建立 |
| 3.2.1 使用报告基因替换噬菌体结构蛋白 |
| 3.2.2 匹配复制系统功能的启动子筛选 |
| 3.2.3 简化仿噬菌体RNA复制系统的建立 |
| 3.3 仿噬菌体RNA复制系统复制功能的验证 |
| 3.3.1 对接头序列的必要性进行验证 |
| 3.3.2 对序列完整的必要性进行验证 |
| 3.3.3 对负链的存在进行验证 |
| 3.3.4 对负链的必要性进行验证 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 对噬菌体生成过程的讨论 |
| 3.4.2 复制系统的构建及其简化 |
| 3.4.3 复制系统的复制功能验证 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 RNA复制相关基因的改造 |
| 4.1 对RNA复制抑制基因的敲除 |
| 4.1.1 对推测RNA复制抑制基因Rnc的敲除 |
| 4.1.2 敲除Rnc基因后复制功能的验证 |
| 4.1.3 敲除Rnc基因后显着改善高浓度模板时的复制效率 |
| 4.2 对RNA复制必须基因的过表达 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 对Rnc基因的敲除 |
| 4.3.2 对EF-Ts和EF-Tu基因的过表达 |
| 4.4 小结 |
| 第5章 RNA复制系统的优化 |
| 5.1 对于启动子的更换 |
| 5.2 对于复制系统相关元件的更换 |
| 5.2.1 对于复制必须序列的优化 |
| 5.2.2 对于复制酶的优化 |
| 5.3 对于复制系统性能的其余探索 |
| 5.3.1 对于目的基因容量的探索 |
| 5.3.2 对于复制调节序列的添加 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 对于启动子的优化 |
| 5.4.2 对于复制系统本身的优化 |
| 5.4.3 对于复制系统性能的其余探索 |
| 5.5 小结 |
| 第6章 复制系统在代谢工程方面的应用 |
| 6.1 使用复制系统增强目的产物的产量 |
| 6.1.1 使用复制系统增强ALA的产量 |
| 6.1.2 使用复制系统增强PHB的产量 |
| 6.2 在乳酸菌中测试RNA复制系统 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 使用复制系统增强实际产物的产量 |
| 6.3.2 在乳酸菌中应用RNA复制系统 |
| 6.4 小结 |
| 第7章 复制系统应用于真核系统尝试 |
| 7.1 RNAe技术的开发 |
| 7.2 RNAe技术的应用前景 |
| 7.3 讨论 |
| 7.4 小结 |
| 第8章 总结与展望 |
| 8.1 论文总结 |
| 8.2 论文展望 |
| 8.2.1 对底盘菌株与RNA复制系统之间的互作探讨 |
| 8.2.2 对通过优化设计减少复制过程中双链RNA的产生的探讨 |
| 8.2.3 对筛选更优复制系统的探讨 |
| 8.2.4 对将RNA复制系统与其余改造手段相结合的探讨 |
| 8.2.5 对将RNA复制系统应用于代谢工程领域的展望 |
| 8.2.6 对将RNA复制系统应用于真核系统的展望 |
| 参考文献 |
| 附录A 人工合成DNA序列 |
| 致谢 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
（9）甜菜M14品系BvM14-STPK蛋白响应盐胁迫磷酸化功能位点的探究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 甜菜M14 品系 |
| 1.1.1 甜菜M14 品系获得 |
| 1.1.2 甜菜M14 品系研究进展 |
| 1.2 植物丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 |
| 1.2.1 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 |
| 1.2.2 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的生理功能 |
| 1.3 磷酸化(位点)对蛋白激酶的影响 |
| 1.4 质谱鉴定蛋白质磷酸化位点技术 |
| 1.5 定点突变技术 |
| 1.6 研究目的及意义 |
| 1.7 本试验技术路线 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 植物材料 |
| 2.1.2 菌株及质粒载体 |
| 2.1.3 试剂及试剂盒 |
| 2.1.4 试验所需试剂及培养基的配制 |
| 2.1.5 试验所需引物 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 材料处理 |
| 2.2.2 甜菜M14 品系BvM14-STPK基因c DNA全长的获得 |
| 2.2.3 甜菜M14 品系Bv M14-STPK基因叶、根表达分析 |
| 2.2.4 BvM14-STPK基因原核表达体系的研究 |
| 2.2.5 质谱识别BvM14-STPK蛋白磷酸化位点 |
| 2.2.6 BvM14-STPK基因磷酸化位点定点突变 |
| 2.2.7 BvM14-STPK基因转化烟草 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 甜菜M14 品系Bv M14-STPK基因c DNA全长的获得 |
| 3.1.1 甜菜M14 品系根RNA的获得 |
| 3.1.2 甜菜M14 品系BvM14-STPK基因c DNA获得 |
| 3.2 甜菜M14 品系BvM14-STPK基因的生物信息学分析 |
| 3.2.1 BvM14-STPK基因c DNA全长的序列分析 |
| 3.2.2 BvM14-STPK蛋白氨基酸多重序列比对分析 |
| 3.2.3 BvM14-STPK蛋白的系统发育树 |
| 3.2.4 BvM14-STPK蛋白的亲/疏水性预测分析 |
| 3.2.5 BvM14-STPK蛋白亚细胞定位预测分析 |
| 3.3 甜菜M14 品系盐胁迫下Bv M14-STPK基因特异性表达分析 |
| 3.3.1 甜菜M14 品系叶、根c DNA的获得 |
| 3.3.2 BvM14-STPK基因实时荧光定量PCR引物特异性检测 |
| 3.3.3 BvM14-STPK基因的叶、根特异性表达定量分析 |
| 3.3.4 BvM14-STPK基因的叶、根特异性表达结果半定量PCR的验证 |
| 3.4 利用BvM14-STPK基因原核表达体系研究磷酸化位点 |
| 3.4.1 原核表达载体pET28a-BvM14-STPK的构建 |
| 3.4.2 BvM14-STPK蛋白的原核诱导表达 |
| 3.4.3 原核表达的BvM14-STPK融合蛋白的Western印迹鉴定 |
| 3.5 BvM14-STPK蛋白激酶磷酸化位点的质谱鉴定 |
| 3.6 突变磷酸化位点的Bv M14-STPK基因转化烟草 |
| 3.6.1 植物表达载体pBI121-BvM14-STPK的构建 |
| 3.6.2 植物表达载体pBI121-BvM14-STPK转化农杆菌 |
| 3.6.3 利用叶盘法侵染获得T0 代转基因突变植株 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 甜菜M14 品系BvM14-STPK基因对盐胁迫的响应 |
| 4.2 甜菜M14 品系BvM14-STPK蛋白激酶磷酸化位点的选择 |
| 4.3 甜菜M14 品系BvM14-STPK蛋白激酶磷酸化位点的突变 |
| 4.4 下一步试验思路 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读学位论文期间发表的学术论文 |
（10）纳米Mg（OH）2对苏云金芽胞杆菌蛋白杀虫活性及抗紫外能力影响的研究（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.1.1 菌株 |
| 1.1.2 供试虫源 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 Bt杀虫晶体蛋白制备、Zeta电位的测定与SDS-PAGE分析 |
| 1.2.2 纳米Mg(OH)2合成和表征 |
| 1.2.3 杀虫晶体蛋白在纳米Mg(OH)2上的吸附和抗紫外分析 |
| 1.2.4纳米Mg(OH)2负载Bt杀虫晶体蛋白后对致倦库蚊幼虫的生测分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 纳米Mg(OH)2负载Bt杀虫晶体蛋白前后尺寸和形貌分析 |
| 2.2 纳米Mg(OH)2负载杀虫蛋白后抗紫外能力分析 |
| 2.3 纳米Mg(OH)2负载杀虫晶体蛋白后对致倦库蚊幼虫的生物活性分析 |
| 3 讨论 |
| 4 结论 |
四、《分子克隆实验指南》(第3版)（论文参考文献）
- [1]葡萄球菌噬菌体基因组遗传进化分析与其裂解酶活性测定[D]. 葛志毅. 中国农业科学院, 2021(09)
- [2]莨菪碱脱氢酶催化机制及莨菪碱代谢工程研究[D]. 曾令江. 西南大学, 2021
- [3]Wnt信号在急性缺血性脑卒中患者溶栓后出血转化中的作用和机制研究[D]. 塔淞. 吉林大学, 2020(03)
- [4]一株金黄色葡萄球菌噬菌体的分离鉴定与生物学特性[J]. 葛志毅,韩生义,曹小安,周建华,刘婷婷,刘永生,李学瑞. 微生物学通报, 2021(04)
- [5]食源性小肠结肠炎耶尔森菌IMBs-qPCR检测技术的研究[D]. 迟恒. 天津大学, 2020(01)
- [6]水温对大鲵幼体生长和性腺分化的影响及Wnt4基因的表达分析[D]. 王兵霞. 陕西师范大学, 2019(06)
- [7]重组德谷胰岛素前体蛋白的表达、发酵工艺优化和放大[D]. 陈尚文. 浙江大学, 2019(03)
- [8]RNA复制表达技术的开发及其与宿主间关联的研究[D]. 姚绎. 清华大学, 2018(04)
- [9]甜菜M14品系BvM14-STPK蛋白响应盐胁迫磷酸化功能位点的探究[D]. 张咏雪. 黑龙江大学, 2016(05)
- [10]纳米Mg（OH）2对苏云金芽胞杆菌蛋白杀虫活性及抗紫外能力影响的研究[J]. 李澜,陈锦灿,杨兆元,李东哲,吴薇,饶文华,潘晓鸿,关雄. 农业生物技术学报, 2015(11)