一、附睾内细胞间的相互作用:结构完整与精子成熟的重要决定因素（论文文献综述）
肖凯[1]（2021）在《水牛精浆外泌体蛋白质组的初步研究》文中研究表明水牛（Bubalus bubalis）是我国南方亚热带地区一种优良的乳肉兼用型大家畜,具有广泛的产业开发价值,但相比地处中温带的牛属物种,水牛的繁殖率较低,精子活力低下是其中重要影响因素之一,极大的限制了奶水牛业的发展和本地水牛品种改良的步伐。精子是一种高度特化和浓聚的已不能生长和分裂的细胞,基因组的转录和翻译功能几乎处于沉默状态,主要依赖于精浆发育内环境调节其成熟过程。正常的受精不仅取决于精子发育的内在因素,还受到精浆等外部因素的影响,这些因素会影响精子的功能。精浆外泌体是来源于雄性生殖道内众多附属性腺分泌的胞外囊泡,在精子成熟和受精过程中扮演重要角色。蛋白质组学技术是研究哺乳动物精子成熟与发育的重要手段,可以高通量寻找影响精子受精的功能蛋白质,有助于筛选关键基因或生物标志物,目前,精浆外泌体的蛋白质组研究报道较少。本研究通过蛋白质组学技术探索水牛精浆外泌体与精子功能的关系,发现外泌体调节精子功能的关键因子并进行分析,有助于解释水牛活力低下的成因,阐明水牛雄性生殖机制。本文研究的主要内容如下:一、水牛精浆外泌体的分离与鉴定。使用改良后的差速离心+蔗糖垫法分离提取精浆外泌体,通过蛋白质印迹（Western blot）验证外泌体蛋白标志物CD81、TSG101和ALIX,结果均阳性表达。通过纳米颗粒跟踪分析仪（NTA）分析外泌体粒径大小,结果显示粒径集中于119.4 nm附近,占比99.2%;通过透射电子显微镜（TEM）观察外泌体形态,结果显示其具有明显的茶托状结构。二、水牛精子、精浆及精浆外泌体蛋白质表达谱的构建和生物信息学分析。利用液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学策略在精子、精浆和精浆外泌体中分别鉴定到1894种、1247种和1343种蛋白质。对蛋白质表达谱进行GO分析,结果显示精子、精浆和外泌体蛋白质主要参与氧化还原过程和蛋白质转运过程,具有ATP、GTP结合能力,定位于胞外外泌体、细胞质、线粒体上。KEGG分析显示,精子、精浆和精浆外泌体蛋白质富集最丰富的均为代谢通路;精子在能量代谢相关的通路上参与的蛋白质数量最多;精浆通过补体系统和蛋白酶体通路起到稳定内环境的作用;外泌体中蛋白质参与了蛋白酶体通路,说明蛋白酶体通路可能是外泌体发挥保护功能的主要方式。三、水牛高低活力精浆外泌体的定量蛋白质组学分析。利用i TRAQ结合液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学策略对高低活力精浆外泌体进行定量分析。以高活力水牛精浆外泌体表达蛋白质作为对照组,筛选到差异表达蛋白质160个（差异倍数>1.2）,包括下调表达蛋白质119个,上调表达蛋白质41个,低活力精浆外泌体中差异蛋白质变化总体呈现下降趋势。对差异蛋白质进行GO分析,结果显示大部分差异蛋白质定位于精子和囊泡,具有水解酶、金属蛋白酶活性,参与精卵识别、受精、单受精、精子与透明带的结合、单生物生殖、细胞识别等过程。KEGG分析结果显示,差异蛋白质主要参与PPAR信号通路、钙信号通路、c AMP信号通路等,其中IZUMO1等10种蛋白质表达量在低活力精浆外泌体显着下调。综上所述,本研究首次分离并鉴定水牛精浆外泌体,构建了水牛精子、精浆和精浆外泌体蛋白质表达谱,获得水牛高低活力精浆外泌体差异蛋白质表达谱,通过比较水牛高低活力精浆外泌体的差异表达蛋白质,筛选出了一批可能与精子功能相关的外泌体蛋白质,分析外泌体与水牛精子活力维持的关系,为水牛雄性生殖机理研究提供新的视角。
任发[2]（2021）在《奶山羊精子发生关键分子挖掘与性控精液研究》文中研究表明奶山羊产业是我国奶业发展的重要组成部分,而目前我国优质高产奶山羊存栏量不足,良种问题成为奶山羊种业发展面临的重大挑战。在生产中充分发挥优秀种公羊的繁殖力,对于奶山羊群体的遗传改良具有显着作用。雄性动物繁殖力依赖于精子发生,且在睾丸曲细精管中进行,包含精原细胞有丝分裂、精母细胞减数分裂以及圆形精子细胞变形等过程,受到极其严格且精密的分子调控。当前高通量测序技术的发展使得人们进一步认识到精子发生中成千上万的分子变化,而这些关键分子的精确表达对于维持精子发生至关重要。然而,目前关于奶山羊精子发生的关键分子特征尚不清楚。此外,利用性控精液进行人工授精是快速扩繁高产奶山羊的有效途径,但性控精液在奶山羊方面仍有待进一步研究。因此,本研究以关中奶山羊为试验对象,利用免疫组织化学染色和组织观察法解析了奶山羊雄性生殖细胞与支持细胞的发育规律,并通过转录组学测序技术对精子发生潜在关键分子进行挖掘,在此基础上初步建立了一种奶山羊性控精液分选方法。本研究主要获得以下结果:1.采集8组不同日龄（15 d、30 d、45 d、60 d、75 d、90 d、180 d和240 d）的奶山羊睾丸组织,利用免疫组织化学染色和组织形态学观察,对雄性生殖细胞和支持细胞发育规律进行探究。结果表明:（1）奶山羊曲细精管直径随着睾丸发育而持续增加,且在75～90 d增长速度最快,在90 d时初次出现曲细精管管腔、圆形精子细胞和少量精子,提示奶山羊已经进入初情期。在180 d观察到大量精子,提示奶山羊已经进入性成熟阶段;（2）性原细胞在75 d前彻底转化为未分化精原细胞,未分化精原细胞在30 d启动分化,而在75～90 d未分化精原细胞增殖状态较为活跃,提示生精过程被激活;（3）SOX9和AMH均可作为奶山羊睾丸支持细胞的分子标记物,且AMH仅在未成熟的支持细胞中表达。支持细胞的增殖状态在45 d较为活跃,90 d后发育成熟。2.利用RNA-seq技术对奶山羊性成熟前（45 d）和性成熟后（240 d）的曲细精管组织进行转录组测序,挖掘并分析精子发生的关键lnc RNA和m RNA。结果表明:（1）在曲细精管组织中鉴定到11612个lnc RNA和18217个m RNA,其中性成熟前后差异表达lnc RNA和m RNA分别为7594和11986个;（2）挖掘出229个潜在精子发生关键m RNA,在性成熟后曲细精管样本中挖掘出KIT、DMRT1和SOX9等42个下调基因,DDX4、SYCP1和SYCP3等187个上调基因,发现PI3K/Akt、MAPK、AMPK、Ras和Rap1等信号通路可能调控精子发生;（3）在lnc RNA-m RNA互作网络发现TCONS＿00029023、TCONS＿00035144、TCONS＿00017872、TCONS＿00051085和TCONS＿00033882及其靶基因GSKIP、KAT8、MBD3L1、NANOS3和PRM3等关键分子可能参与调控奶山羊精子发生。3.采用单细胞转录组测序（single cell RNA sequencing,sc RNA-seq）技术对出生后45 d、90 d和180 d的奶山羊曲细精管单细胞悬液进行测序,从单细胞水平系统解析精子发生的关键分子特征。结果表明:（1）捕获了来自3个不同日龄曲细精管的25373个细胞,成功鉴定精子发生过程所包含的精原细胞、精母细胞、圆形精子细胞、支持细胞、间质细胞、巨噬细胞、内皮细胞等细胞类型及其在不同日龄的细胞数量占比;（2）挖掘出一批潜在的睾丸生殖细胞及体细胞标记基因,例如在精原细胞高表达SOHLH1、PAGE4和DMRT1,精母细胞高表达YBX2、HSPB9和LYPD4,圆形精子细胞高表达PRM2、SPEM1和PRSS37,支持细胞高表达AMH、INHA和EGR1,间质细胞高表达INSL3、ACTA2和STAR等,解析了睾丸体细胞与生殖细胞相互作用的关键信号通路（睾酮、维甲酸、PDGF、FGF和WNT通路等）及其分子特征;（3）通过Monocles算法对9个生殖细胞亚群进行拟时序分化轨迹分析,揭示了生殖细胞分化过程中精原细胞、精母细胞以及圆形精子细胞的关键分子特征,例如DMRT1、TOP2A和TNP1等,成功构建了奶山羊精子发生单细胞转录图谱。4.利用RNA-seq数据对奶山羊性染色体编码基因进行注释,挖掘性染色体关键分子并进行性控精液研究。结果表明:（1）在奶山羊性染色体上鉴定出ABCB7、ABCD1和ACE2等500个X染色体编码基因,以及SRY、USP9Y和UTY等9个Y染色体编码基因,挖掘出TLR7和TLR8等19个X染色体编码受体基因;（2）通过免疫组织化学染色发现TLR7/8蛋白在睾丸圆形精子细胞、附睾精子和成熟精子中均有表达,且TLR7/8阳性精子占比接近50%;（3）TLR7/8蛋白在奶山羊X精子尾部特异表达,激活TLR7/8信号通路后可通过GSK3α/β-己糖激酶途径降低X精子的线粒体活性和ATP水平,最终导致X精子运动能力下降;（4）利用分选所得X精子进行体外受精,获得雌性胚胎比例为80.52%±6.75%,雄性胚胎比例为19.48%±6.75%。综上所述,本研究在从组织学层面解析奶山羊雄性生殖细胞与支持细胞发育规律的基础上,利用RNA-seq和sc RNA-seq技术对奶山羊精子发生关键分子进行挖掘与分析,明确了雄性生殖细胞与支持细胞发育的关键时间节点,筛选出一批精子发生潜在关键基因和lnc RNA,鉴定了睾丸曲细精管的主要细胞类型并解析其关键分子特征,成功构建了奶山羊精子发生的单细胞转录图谱。此外,利用RNA-seq测序数据注释出X染色体和Y染色体编码的关键基因,并在此基础上初步建立了一种奶山羊性控精液分选方法。本研究将为奶山羊的分子育种和性控精液研究提供新的科学依据,同时为哺乳动物精子发生和雄性不育等相关研究提供理论参考。
费露敏[3]（2021）在《Occludin蛋白第二胞外环22AA通过下调Occludin和诱导细胞凋亡可逆性调节紧密连接》文中提出在睾丸中,在生精小管和血管之间有一个血睾屏障（BTB）。支持细胞紧密连接（TJ）是BTB的重要组成部分。近几年的研究发现支持细胞紧密连接（TJ）异常导致BTB破坏是男性不育的一个重要原因。Occludin蛋白是血-睾丸屏障（BTB）中支持细胞紧密连接（TJ）的重要结构蛋白,有研究发现Occludin第二细胞外环的22-氨基酸肽（22AA）可以通过Occludin蛋白可逆性调节紧密连接,但其调控机制尚不清楚。本研究通过构建小鼠模型,结合Western Blot,Real time PCR,免疫荧光双标,细胞涂片等生物分子技术探究22AA是否影响Occludin的表达和定位及Occludin相关miR（miR-122-5p）的表达;如何动态影响支持细胞和精子细胞数量;22AA是否影响后代的数量等上述问题进行深入研究。1.通过对成年雄性KM鼠（6-8周龄）睾丸组织注射配制的22AA封闭肽（结构与Occludin第二胞外环的22-氨基肽相同）构建小鼠模型。将小鼠随机分成六组,每组六只。2.通过对构建的模型小鼠进行Western Blot,免疫荧光检测TJ崩坏和重建后Occludin蛋白的表达与定位,发现对照组Occludin蛋白主要分布在生精小管基底膜以及支持细胞TJ间。注射封闭肽（22AA）后前27天Occludin蛋白表达量逐渐减少,分布减少,形态逐渐不完整,37天后Occludin开始恢复少量表达。第47天时Occludin形态结构与对照组基本类似。QPCR检测Occludin相关miR（miR-122-5p）表达发现miR-122-5p与Occludin蛋白表达呈负相关。22AA可以可逆下调Occludin蛋白表达,上调miR-122-5p表达。3.通过对模型小鼠进行免疫荧光双标检测支持细胞及精子细胞的形态结果及细胞凋亡情况,发现对照组生精小管内有大量支持细胞和精子细胞存在,边界清晰,有少量凋亡细胞Bax分布。注射封闭肽（22AA）后前27天,支持细胞和精子细胞形态逐渐不完整,第27天时基本看不见完整形态的支持细胞和精子细胞,表达逐渐减少,凋亡蛋白Bax表达逐渐增加。37天后开始恢复表达,支持细胞和精子细胞开始在生精小管基底层少量分布,凋亡蛋白Bax减少,表明TJ开始恢复重建。22AA可以可逆促进支持细胞和精子细胞凋亡,破坏支持细胞形态。4.通过对模型小鼠细胞涂片检测TJ崩坏和重建后精子数量,并且对小鼠进行生育能力分析,发现注射封闭肽（22AA）后前27天,精子数量大量减少,小鼠产仔数也逐渐减少,37天后开始恢复,精子数量逐渐增加,产仔数也逐渐增加。每组小鼠精子数量和产仔数差异显着。22AA可以可逆改变精子数量,影响雄性小鼠生育能力。
李小英[4]（2021）在《基于睾丸支持细胞研究4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制》文中研究说明不育症是严重影响哺乳动物繁殖能力的一类生殖系统疾病。营养缺乏、饲养管理不当、季节性原因、遗传原因（如杂交不育）和疾病等均可导致不育。在引起哺乳动物不育的因素中,雄性因素约占一半左右。无精子症、少精子症、弱精子症、精子无力症等是引起雄性不育的主要病因。少精症是以精子数量显着稀少为特征的雄性不育症类型,病因复杂发生机制仍不十分明确。遗传因素和环境因素均可导致精子数量减少,遗传因素对精子数量的影响主要通过精子形成过程中相应基因的表达和调控作用来实现。因此,寻找影响精子形成的特异性靶基因（蛋白）并阐释其作用机制,对于少精症的精准治疗和预后具有重要的理论价值和意义。4.1R蛋白是一种由epb41基因编码的细胞膜骨架蛋白组分,在红细胞和多种非红细胞组织中发挥作用。本文从以下三个方面阐述4.1R蛋白基于睾丸支持细胞在少精症发生中的作用机制:（1）以雷公藤多苷溶液诱导雄性C57BL/6J小鼠（7周龄）构建的少精症模型小鼠为研究对象,利用western blotting、q-PCR和免疫荧光技术检测4.1R蛋白在少精症小鼠睾丸内的表达特点。利用异硫氰酸荧光素（FITC）睾丸活体注射检测少精症模型小鼠血睾屏障完整性,并检测血睾屏障形成相关蛋白的表达,阐述4.1R蛋白表达与睾丸支持细胞（Sertoli）连接功能间的相关性。检测Wnt/β-catenin信号通路组分在少精症模型小鼠睾丸内的表达特点,阐述4.1R蛋白表达与Sertoli细胞增殖间的相关性。少精症小鼠模型研究结果:western blotting检测显示epb41基因在正常C57BL/6J小鼠睾丸内表达135k D和80k D两种亚型。即4.1R-135k D蛋白和4.1R-80k D蛋白。与对照相比较,少精症模型小鼠睾丸内4.1R-135k D蛋白表达显着下降（P<0.05）,4.1R-80k D蛋白表达无显着变化;epb41m RNA表达降低,差异不显着;4.1R蛋白在少精症模型小鼠睾丸Sertoli细胞膜上表达下降,而各级生精细胞细胞膜上的表达则无显着差异。少精症模型小鼠血睾屏障受损,FITC从基底室进入近腔室并分散其中。与对照组相比较,少精症模型小鼠睾丸内β-catenin蛋白表达显着下降,而E-cadherin表达增加。血睾屏障相关蛋白ZO-1表达显着下降（P<0.05）,occludin和claudin-11表达均下降;Wnt/β-catenin信号通路组分Wnt3a、β-catenin表达显着下降（P<0.05）,GSK3β、c-myc和CDK4表达也下降,但差异不显着。（2）以小鼠epb41基因第3外显子为模板,设计2对sg RNAs并构建p GL3-U6-epb41-sg RNAa-puromycin和p Sp Cas9（BB）-epb41-sg RNAb-2A-GFP重组质粒载体。转染N2a细胞,验证第3外显子基因序列与4.1R蛋白亚型表达之间的相关性。以小鼠epb41基因为模板构建LV-Epb41（43286-1）过表达慢病毒载体和LV-Epb41-sg RNA（05765-1）基因敲除慢病毒载体,分别转染TM4细胞（正常小鼠睾丸支持细胞系,即Sertoli细胞）和原代Sertoli细胞。检测细胞中4.1R蛋白、血睾屏障相关蛋白和Wnt/β-catenin信号通路组分表达水平,阐述4.1R蛋白在体外培养Sertoli细胞增殖和连接中的作用机制。研究结果显示:重组质粒载体转染的N2a细胞中4.1R-135k D蛋白不再表达,而4.1R-80k D蛋白正常表达。LV-Epb41-sg RNA（05765-1）慢病毒载体转染TM4细胞和原代Sertoli细胞,4.1R-135k D蛋白被抑制表达,而4.1R-80k D蛋白正常表达。LV-Epb41（43286-1）过表达慢病毒载体转染TM4细胞和原代Sertoli细胞,显着提高4.1R-135k D蛋白（P<0.05）和4.1R-80k D蛋白的表达,证实已成功实现Sertoli细胞内4.1R-135k D蛋白的抑制表达和过表达。4.1R-135k D蛋白基因敲除的TM4细胞中血睾屏障相关蛋白β-catenin、E-cadherin和ZO-1表达均显着下降;Wnt/β-catenin信号通路组分WB检测结果显示:蛋白Wnt3a、β-catenin、c-myc、GSK3β和Cyclin D1均显着下降（P<0.05）,CDK4表达也下降,CDK6表达则上升。4.1R-135k D蛋白过表达TM4细胞中β-catenin、ZO-1和occludin表达均上升,E-cadherin表达下降,差异均不显着;Wnt/β-catenin信号通路组分WB检测结果显示:蛋白Wnt3a,β-catenin,c-myc,GSK3β和Cyclin D1表达均上升,CDK4和CDK6表达则下降,差异均不显着。4.1R-135k D蛋白基因敲除原代Sertoli细胞中,血睾屏障相关蛋白β-catenin、ZO-1和occludin表达均显着下降;Wnt/β-catenin信号通路组分WB检测结果显示:蛋白Wnt3a、β-catenin和CDK4均显着下降（P<0.05）,c-myc和GSK3β表达也下降,Cyclin D1和CDK6表达则上升。4.1R-135k D蛋白过表达原代Sertoli细胞中β-catenin,ZO-1和occludin表达上升,E-cadherin表达下降,差异均不显着;Wnt/β-catenin信号通路组分蛋白Wnt3a,β-catenin,c-myc,GSK3β,CDK4和CDK6表达均上升,Cyclin D1表达则下降,差异均不显着。（3）以7周龄雄性C57BL/6J小鼠为实验对象,将p GL3-U6-epb41-sg RNAa-puromycin和p Sp Cas9（BB）-epb41-sg RNAb-2A-GFP质粒载体及LV-Epb41（43286-1）载体分别通过活体原位电穿孔转染法和慢病毒载体注射法作用于小鼠睾丸,比较两种载体转染方法的蛋白表达效率和靶向性,并利用免疫荧光法检测载体处理后睾丸组织中4.1R蛋白及血睾屏障相关蛋白的表达水平。阐述4.1R蛋白在活体水平对Sertoli细胞连接的调节作用与机制。质粒载体和慢病毒载体睾丸活体转染结果显示:质粒载体电转染法比慢病毒载体注射法更快在活体内表达,即质粒载体转染后3天,即在睾丸组织中高效表达,使Sertoli细胞中4.1R蛋白表达降低。慢病毒载体注射法表达相对较慢,注射后5天才可以在睾丸中表达。过表达慢病毒载体可显着提高4.1R蛋白在Sertoli细胞中的表达。4.1R-135k D蛋白基因敲除载体作用于活体睾丸,BTB相关蛋白表达变化规律与少精症模型小鼠中的变化规律相同。4.1R-135k D蛋白过表达载体作用于睾丸活体,显着提高BTB相关蛋白的表达,E-cadherin表达除外。综上得出结论:（1）小鼠睾丸和Sertoli细胞中均表达4.1R-135k D和4.1R-80k D两种4.1R蛋白亚型,4.1R-135k D蛋白表达下降与精子细胞数量显着减少相关。（2）小鼠Sertoli细胞系中4.1R-135k D蛋白表达下降,引起β-catenin表达下降,从而使Wnt/β-catenin信号通路组分表达异常,抑制睾丸支持细胞增殖。（3）成年小鼠睾丸组织Sertoli细胞中4.1R-135k D蛋白表达下降,引起血睾屏障相关蛋白表达异常,导致细胞连接异常,精子细胞形成的微环境受损。因此,由于Sertoli细胞中4.1R-135k D蛋白表达下降,可引起Sertoli细胞数量减少或血睾屏障受损,导致精子数量显着减少。
范小瑞[5]（2021）在《猪隐睾睾丸精子发生障碍的分子机制研究》文中研究指明目的:自发性单侧隐睾公猪是一侧睾丸位于腹部或腹股沟管,这使得睾丸接近或位于体温环境。不同品种的仔猪中,单侧隐睾的发病率为2%。猪隐睾症主要关注的问题是,腹部异常高温导致隐睾睾丸正常精子发生中断。生殖细胞的建立和维持是保证一个物种生存的关键,受多种因素的影响,其中温度是最主要的因素。雄性生殖细胞（精子）是由精子发生的复杂过程产生的。精子发生是在低于核心体温2-8°C的阴囊温度下进行。睾丸暴露在体温环境导致精子发生阻滞,但具体的分子机制尚不清楚。自发性单侧隐睾是研究体温对精子发生影响的良好动物模型。方法:本研究以断奶前仔猪（20d,15Kg左右,4头）、隐睾和对侧阴囊公猪睾丸（7-9月龄,140-150Kg,4头）为研究对象,手术摘取两侧睾丸,部分置于液氮,用于提取总mRNA和蛋白,以及进行RNA-seq和i TARQ检测;部分置于Bouin氏固定液中,用于TUNEL、HE染色和免疫组织化学分析。雄性健康SD大鼠（30d,90～100g,6只）,手术诱导单侧隐睾,隐睾30d,3只手术摘取两侧睾丸,置于Bouin氏固定液中,用于免疫组织化学分析;3只用生物素示踪法检测两侧睾丸血睾屏障通透性变化。结果:1.自发单侧隐睾公猪睾丸支持细胞和生殖细胞数量的变化HE染色结果显示,与对侧阴囊睾丸相比,隐睾睾丸只含有支持细胞和少量精原细胞,未见减数分裂后的生殖细胞。形态计量学研究结果显示,与对侧阴囊睾丸相比,隐睾睾丸生殖细胞总数显着减少,支持细胞总数无显着变化;较断奶前仔猪睾丸,隐睾睾丸生殖细胞和支持细胞总数均显着增加。2.自发单侧隐睾对公猪睾丸增殖和凋亡相关蛋白表达与定位的影响TUNEL结果显示,精原细胞凋亡信号明显减少。qRT-PCR和Western Blot结果显示,隐睾组中PCNA和Bax的蛋白和mRNA水平显着降低;细胞凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达升高。免疫组织化学结果显示,PCNA表达于精原细胞的细胞核。隐睾导致Bax在精原细胞的重新分配,从细胞质转移至细胞核表达。Bcl-2在各实验组中优先表达于近管腔部位生殖细胞的细胞质和细胞核。与对侧阴囊组相比,隐睾组PCNA阳性细胞和TUNEL阳性细胞减少。3.自发单侧隐睾对公猪睾丸自噬相关蛋白表达与定位的影响qRT-PCR和Western Blot结果显示,隐睾组中LC3和Beclin1的蛋白和mRNA水平显着降低;p62的表达显着升高。免疫组织化学结果显示,LC3表达于精原细胞的细胞质。与对侧阴囊组相比,隐睾组LC3阳性细胞减少。4.自发单侧隐睾对公猪睾丸血睾屏障紧密连接分子表达与定位的影响qRT-PCR和Western Blot结果显示,隐睾组中Claudin-11的蛋白和mRNA水平显着升高;Occludin和ZO-1蛋白和mRNA水平显着降低。免疫组织化学结果显示,隐睾导致Claudin-11、Occludin和ZO-1的异位表达:由细胞膜转移至细胞质表达。5.单侧隐睾对大鼠睾丸血睾屏障通透性的影响免疫组织化学结果显示,隐睾导致Claudin-11和ZO-1的异位表达:由细胞膜转移至细胞质表达。生物素示踪结果显示,生物素进入隐睾睾丸管腔。6.转录组学分析自发单侧隐睾对公猪睾丸基因表达的影响RNA-seq结果显示,断奶前仔猪和隐睾睾丸组织比较,共有6901个差异表达基因,其中4603个上调,2298个下调。隐睾和对侧阴囊睾丸组织比较,共有13873个差异基因,其中8216个上调,5657个下调。GO富集分析显示,隐睾睾丸和断奶前仔猪睾丸相比,较多差异基因的功能与细胞黏附、细胞发展和精子发生等有关;隐睾和对侧阴囊睾丸组相比,较多差异基因的功能与精子发生、细胞分化和细胞迁移等有关。KEGG Pathway富集分析显示,断奶前仔猪与隐睾睾丸相比,差异基因较多富集于代谢、ECM受体相互作用和细胞黏附等信号通路。隐睾睾丸与对侧阴囊睾丸相比,差异基因较多富集于物质代谢、细胞黏附分子（CAMs）和信号转导相关通路（凋亡、吞噬、Ras和MAPK通路）等,且CAMs通路相关基因大多上调表达,包括CLDN11（Claudin-11）。下调基因中Nectin-3在细胞黏附、迁移和极化中发挥作用。7.蛋白质组学分析自发单侧隐睾对公猪睾丸蛋白表达的影响结果显示,隐睾组和断奶前仔猪相比,1459个差异蛋白:773个上调,686个下调;隐睾组和对侧阴囊组相比,1424个差异蛋白:656个上调,768个下调。GO富集分析显示,隐睾组和断奶前仔猪相比,较多差异蛋白的功能与细胞黏附、代谢和胞外基质等有关;隐睾组和对侧阴囊组相比,较多差异蛋白的功能与精子发生、繁殖和能量代谢有关。KEGG Pathway富集分析显示,隐睾组和断奶前仔猪相比,差异蛋白主要富集在黏着斑信号、DNA复制和视黄醇代谢通路。隐睾组和对侧阴囊组相比,差异蛋白主要富集在DNA复制、蛋白酶体、缝隙连接和黏着连接通路。SDR5A1和CYP11A等的下调表达,提示睾酮合成和代谢受阻。结论:隐睾导致猪睾丸生殖细胞增殖不足,过度凋亡和自噬;支持细胞结构和功能受损,血睾屏障（BTB）通透性增加,支持细胞供能不足,最终导致猪睾丸生精障碍。
张飞[6]（2021）在《长白公猪性成熟前后睾丸组织环状RNA、信使RNA N6-腺苷甲基化修饰的发掘鉴定及差异表达分析》文中进行了进一步梳理睾丸发育、精子生成过程涉及生殖细胞、间质细胞和支持细胞在内的多种细胞协同作用,该过程受到极其复杂和严格的分子时空调控,人们对其理解仍十分有限。环状RNA作为一类新的长链非编码RNA存在于人和牛等动物的睾丸及精清中,可能参与调控睾丸发育及精子发生过程。然而,公猪睾丸组织发育成熟过程中环状RNA的表达谱及其潜在生物学功能尚不清楚。N6-甲基腺苷（m6A）修饰是存在于RNA内部最常见的一类修饰,参与调控细胞分化、个体发育等多种生理病理进程,但关于m6A与睾丸发育、精子发生之间的关系目前仍知之甚少。因此,本文选取性成熟前后两个不同发育阶段的长白公猪睾丸组织,利用高通量测序技术和生物信息学等手段,揭示不同阶段睾丸中的环状RNA和m6A表达特征并比较分析其表达差异,预测和解析差异表达的环状RNA、m6A修饰在睾丸发育和精子发生事件中的潜在生物学功能,为增进了解环状RNA、m6A修饰参与公猪精子发生、睾丸发育调控等提供新的线索。本论文得到研究结果如下:本研究对未成年（30日龄,D30）和性成熟（210日龄,D210）长白公猪睾丸进行组织形态学观察。H&E染色结果显示,30日龄长白公猪睾丸曲细精管尚未发育完整,睾丸内未见明显管腔,处于性成熟前阶段;210日龄长白公猪睾丸体积显着增大,曲细精管发育完全,内含大量不同类型的生殖细胞并产生大量圆形精子及长形精子,已达到性成熟后阶段。使用去除核糖体RNA及线性RNA的总RNA-Seq来检测D30和D210长白公猪睾丸组织中环状RNA的表达谱。高通量测序显示睾丸组织中含有丰富的环状RNA,性成熟前后睾丸中分别鉴定出34521与31803个环状RNA。生物信息学分析发现这些环状RNA广泛分布于常染色体和性染色体上,长度主要位于100～10000 nt之间（58.97%）,主要来源于源头基因的外显子区域,大部分环状RNA由1-7个外显子形成（86.54%）,并且部分源头基因可以产生多个环状RNA。在公猪睾丸成熟过程中共发现来源于1526个源头基因的2326个差异表达的环状RNA,其中1003个D210公猪睾丸组织中上调,1323个下调。此外,差异表达的环状RNA源头基因GO功能分析显示这些环状RNA主要与精子发生、激素生物合成过程的正调控、生殖细胞发育、雄性减数分裂等生物过程有关。KEGG通路富集分析发现他们分别参与了干细胞多能性调节、紧密连接、粘附连接、cAMP等信号通路。因此,以上结果表明性成熟前后公猪睾丸表达大量的环状RNA,这些环状RNA呈现发育阶段特异性的动态表达模式,且主要与睾丸发育、精子发生等生物学过程密切相关。这些结果将有望为鉴定种公猪睾丸发育状态及筛选优秀种公猪提供一种潜在的分子标记物。同时为了研究睾丸发育成熟过程中m6A甲基化修饰的动态变化,本研究绘制了长白猪性成熟前后睾丸转录组范围信使RNA m6A甲基化图谱。本研究描述了m6A甲基化修饰在睾丸发育过程中的广泛分布模式,并分析了基因表达与m6A甲基化修饰的关系,同时广泛地鉴定了性成熟前后m6A甲基化修饰差异基因,这些基因可能与睾丸的生物学功能的密切相关。这些结果为确定睾丸中mRNA m6A甲基化的存在及其图谱提供了依据,并扩展了对m6A在哺乳动物器官发育和生长中作用的认识。
栾兆进[7]（2021）在《雄激素对绵羊附睾谷胱甘肽过氧化物酶5抗氧化的调节机制研究》文中研究说明附睾上皮细胞（Epididymis epithelial cells,EECs）形成的附睾腔微环境对维持精子的正常成熟起着关键作用,活性氧（Reactive Oxygen Species,ROS）是细胞氧化还原代谢的副产物,附睾中适量的ROS通过调节c AMP水平在精子成熟和获能的生理过程中起重要作用,而过量的ROS会使精子受到氧化应激的损伤,因此,维持附睾腔微环境的氧化还原平衡对于精子成熟具有主要的作用。谷胱甘肽过氧化物酶5（Glutathione Peroxidase 5,GPX5）在附睾中高表达,目前,没有关于绵羊EECs中GPX5功能及其调节的研究报道。因此,本实验在优化绵羊附睾上皮细胞体外培养条件的基础上,研究了雄激素对绵羊附睾上皮细胞中GPX5功能的调节机制,研究结果如下:1.EGF对绵羊EECs体外增殖的影响。采用CCK-8法测定细胞生长情况,RT-PCR检测EECs中功能标记基因GPX5和AR表达,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,Western blot检测细胞中EGFR、AKT和FOXO1磷酸化水平。结果显示50 ng/m L EGF可以显着促进EECs的增殖,且不同代EECs细胞均可正常表达GPX5和AR基因;EGF极显着提高了处于S期的细胞比例（P<0.01）,显着降低了细胞凋亡指数（P<0.05）。与对照组相比,EGFR抑制剂Gefitinib的添加极显着降低了处于S期的细胞比例（P<0.01）,凋亡指数极显着升高（P<0.01）;PI3K/AKT抑制剂LY294002的添加显着降低处于S期的细胞比例（P<0.05）,但凋亡指数无显着变化（P>0.05）。与对照组相比,EGF可以极显着提高EECs细胞的EGFR、AKT和FOXO1磷酸化水平（P<0.01）;与EGF组相比,EGF+Gefitinib组EECs中EGFR、AKT和FOXO1磷酸化水平极显着降低（P<0.01）,而EGF+LY294002组EECs的AKT和FOXO1磷酸化水平呈极显着降低（P<0.01）。2.海藻糖对绵羊EECs体外增殖的作用。利用酶标仪检测EECs增殖情况,RT-PCR检测不同传代的EECs功能标记,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡,DCFH-DA检测细胞内ROS水平,酶化学法检测细胞内抗氧化剂水平,q RT-PCR和ELISA检测细胞GPX5的表达。结果表明:100 mmol/L海藻糖有效地提高EECs的生长能力,极显着增加处于S期细胞比例（P<0.01）,并极显着降低凋亡率（P<0.01）;100 mmol/L海藻糖培养的EECs在体外可连续传代14次,而且标记基因GPX5和AR正常表达。与对照组相比,100 mmol/L海藻糖处理的细胞ROS极显着降低（P<0.01）,CAT和GPXs活性分别呈极显着（P<0.01）和显着（P<0.05）升高,GPX5的m RNA和蛋白表达分别表现出极显着（P<0.01）和显着（P<0.05）上调。3.绵羊EECs中GPX5的抗氧化作用。采用si RNA干扰绵羊EECs的GPX5基因表达,分为si RNA-GPX5、si RNA-NC转染对照组和对照组,采用CCK-8检测细胞增殖,DCFH-DA探针检测细胞内ROS水平,采用TBA法检测细胞内MDA含量,免疫荧光检测细胞内8-OHd G水平,q RT-PCR检测EECs中主要的抗氧化基因的m RNA表达量。结果表明:随着H2O2处理浓度的增加,与对照组相比,si RNA-GPX5组的增殖能力不断下降。与对照组相比,si RNA-GPX5细胞中的ROS含量和MDA产生量分别呈极显着（P<0.01）和显着（P<0.05）的升高,si RNA-GPX5细胞中的8-OHd G水平明显的增多。si RNA-GPX5+T组细胞中GPX1和GPX3的m RNA表达量较si RNA-GPX5处理组有显着的升高（P<0.05）,SOD和GPX4的m RNA表达量比si RNA-GPX5处理组有极显着的升高（P<0.01）。4.睾酮、AR及其共调节因子对绵羊EECs中GPX5的调节作用。采用CCK-8检测不同浓度睾酮处理的EECs增殖情况,q RT-PCR检测GPX5、AR、SRC-1、CBP、p300、NCOR2 m RNA表达量,免疫荧光法和Western Blot法检测GPX5、AR、SRC-1、CBP、p300、NCOR2的表达量,双荧光素酶报告基因检测AR与GPX5基因的结合作用、结合位点以及AR转录活性。结果表明,外源性睾酮对EECs的增殖呈现浓度依赖性,其中,100 nmol/L睾酮组的细胞生长最好。100 nmol/L睾酮组的细胞GPX5m RNA和蛋白表达量极显着高于对照组（P<0.01）,而1 000 nmol/L睾酮组细胞GPX5 m RNA和蛋白表达量与对照组差异不显着（P>0.05）,却分别极显着（P<0.01）和显着（P<0.05）低于100 nmol/L睾酮组。与对照组相比,100 nmol/L睾酮组AR在细胞核中的表达明显增多（P<0.05）,AR m RNA和蛋白表达量分别呈极显着（P<0.01）和显着（P<0.05）的提高;然而1 000 nmol/L睾酮组细胞AR m RNA和蛋白的表达量显着低于对照组（P<0.05）。1 000 nmol/L睾酮组细胞CBP、p300、SRC-1蛋白表达呈现极显着增高（P<0.01）,特别是核内的表达量增高明显。si RNA-AR组细胞GPX5 m RNA和蛋白的表达量与对照组差异不显着（P>0.05）。pc DNA3.1-AR组GPX5 m RNA和蛋白表达量较对照组呈极显着（P<0.01）和显着（P<0.05）升高。p GL3-GPX5-pro-wt+pc DNA3.1-AR组的荧光素酶活性显着高于p GL3-GPX5-pro-wt+pc DNA3.1组（P<0.05）,与p GL3-GPX5-pro-wt相比,p GL3-GPX5-pro-mut1组荧光素酶活性显着下调（P<0.05）。si RNA-AR组细胞SRC-1和p300蛋白表达量极显着高于对照组（P<0.01）。si RNA-SRC-1组细胞GPX5 m RNA和蛋白表达量较对照组显着的降低（P<0.05）,si RNA-p300组细胞GPX5的m RNA和蛋白的表达量均显着低于对照组（P<0.05）。si RNA-SRC-1和si RNA-p300组细胞AR蛋白表达量与对照组差异不显着（P>0.05）,si RNA-SRC-1和si RNA-p300组的细胞AR的转录活性显着降低（P<0.05）。综上所述,EGF通过EGFR/PI3K/AKT通路上调FOXO1的磷酸化增强绵羊EECs体外生长能力。海藻糖通过增加CAT、GPXs的酶活性和GPX5的表达量发挥抗氧化活性以促进EECs的体外增殖。GPX5可以有效地保护绵羊EECs免受脂质过氧化损伤及DNA的氧化损伤。睾酮对绵羊EECs GPX5、AR及其共调节因子的表达具有浓度依赖性的调节效应,睾酮通过AR及其共调节因子SRC-1和p300/CBP调节GPX5表达,AR以靶向结合的方式促进GPX5转录。SRC-1和p300/CBP可以提高AR转录活性,在AR表达明显降低时维持靶基因GPX5的表达量。
李讨讨[8]（2021）在《基于转录组学的藏绵羊睾丸功能基因鉴定及其表达调控》文中研究表明绵羊睾丸发育和精子发生直接决定着公羊的繁殖力。藏绵羊作为我国青藏高原及其毗邻地区最重要的家畜品种之一,具有繁殖力低、性成熟晚等生殖特点。因此,研究其睾丸发育和精子发生的调控机理对绵羊生殖生物学研究具有重要意义。然而目前在绵羊（尤其藏绵羊）上有关睾丸功能维持的分子生物学认识仍然非常欠缺。本研究以3月龄（性成熟前）、1岁龄（性成熟后）、3岁龄（成年）藏绵羊睾丸组织作为研究材料,进行如下研究:1)借助RNA-seq技术及生物信息学分析对3个发育阶段睾丸组织中的m RNA、circ RNA和mi RNA表达谱进行分析,并进行差异表达分析和功能富集分析;2)根据“ce RNA假说”及circ RNAs、mi RNAs和m RNAs的表达变化趋势,构建ce RNA调控网络;3)基于3月龄和1岁龄组的睾丸转录组数据,对潜在的免疫稳态维持相关候选基因进行鉴定,并对这些基因所富集的mi RNA-m RNA模块及circ RNA-mi RNA-m RNA调控网络进行分析;4)原代分离培养绵羊睾丸支持细胞,以研究精子发生关键基因及相关的circ RNA-mi RNA-m RNA轴在绵羊睾丸细胞中的生物学作用。研究的主要结果如下:1.在3月龄vs 1岁龄、1岁龄vs 3岁龄、3月龄vs 3岁龄睾丸中,分别鉴定到26084（10247个上调,15837个下调）、57个（27个上调,30个下调）、25535个（10017个上调,15518个下调）差异表达m RNAs;分别鉴定到3982（2079个上调,1903个下调）、414（201个上调,213个下调）和4060个（2107个上调,1953个下调）差异表达circ RNAs;分别鉴定到715个（561个上调,154个下调）、57个（46个上调,11个下调）、790个（628个上调,162个下调）差异表达mi RNAs。随机选择的10个m RNAs、10个circ RNAs和12个mi RNAs的RT-q PCR验证结果表明RNA-seq获得的转录组数据是可靠的。差异表达m RNAs、差异表达circ RNAs来源基因、及二者共享基因的GO和KEGG分析结果均显示,它们主要参与生长、发育、生殖、免疫、代谢等相关生物学过程;显着富集在m TOR、TGFβ等生殖相关,以及紧密连接、减数分裂等细胞连接或细胞发育密切相关的信号通路上。2.基于circ RNAs、mi RNAs和m RNAs共表达ce RNA网络分析发现,差异表达circ RNAs的靶基因主要涉及细胞发育、生殖等生物学过程以及粘附连接、局部粘附、ECM-受体相互作用、肌动蛋白细胞骨架调节、MAPK、Wnt、TGFβ等信号通路。在此基础上,构建了睾丸功能（如精子发生、生殖细胞发育、细胞周期、减数分裂、血-睾屏障等）密切相关基因的ce RNA调控网络;通过RT-q PCR、Western blot、免疫荧光染色和双荧光素酶分析发现,BOLL基因主要表达于减数分裂后的圆形和长形精子细胞中,并且其表达受到circ＿029155/mi R-760-3p信号轴的调控。3.基于性成熟前、后藏绵羊睾丸的转录组测序和功能富集数据,共筛选出1118个免疫相关差异表达m RNAs（包括873个下调和245个上调的m RNAs）。GO和KEGG富集分析结果显示,它们主要富集在免疫系统发育、细胞粘附/连接、刺激反应调节、免疫反应调节等生物学过程,以及细胞粘附、T细胞和B细胞受体信号通路、白细胞跨内皮迁移、趋化因子、NF-κB、PI3K/Akt等信号通路上。在此基础上,构建了与睾丸免疫稳态维持相关候选基因的潜在mi RNA-m RNA网络和circ RNA-m RNA-m RNA网络。此外,双荧光素酶分析证实了ITGB1/circ＿013761/circ＿014236与mi R-29b以及ITGB1/circ＿001254与mi R-1185-3p间存在靶向关系。4.由构建的ce RNA网络可知,IGF1基因受到oar-mi R-29b和circ＿026259的潜在调控。RT-PCR、RT-q PCR、荧光原位杂交和免疫荧光分析显示,它们在发育的藏绵羊睾丸中具有相似的RNA分布模式:广泛分布于生殖细胞、间质细胞和支持细胞中。随后,采用两步酶消化法成功分离获得了绵羊睾丸支持细胞。RNase R酶消化法、PCR和Sanger测序证实了circ＿026259的环化特征,即由绵羊KLHL5基因第2-5个外显子产生,且由第2和第5个外显子反向剪接形成环化结构（将circ＿026259命名为circ KLHL5）。通过一系列双荧光素酶、过表达、敲低、CCK-8、Ed U染色、细胞流式分析发现,circ KLHL5可通过靶向oar-mi R-29b促进支持细胞中IGF1基因的表达,进而诱导支持细胞的增殖并抑制其凋亡。综上所述,转录组测序结合相关分子生物学方法揭示了许多差异表达基因在发育的藏绵羊以年龄依赖的表达模式参与生殖细胞发育、减数分裂、血-睾屏障、免疫稳态等生物学过程,并且这些基因中的大多数表达可能受到mi RNAs和/或circ RNAs的调控,以响应不断发育的睾丸内环境及持续的精子发生过程。同时,鉴定到一个由绵羊KLHL5基因产生的新的环状RNA circ KLHL5,并证实其通过靶向oar-mi R-29b调节IGF1基因的表达和睾丸支持细胞的发育。这些发现填补了有关绵羊睾丸组织circ RNAs认识的空白,丰富了现有的绵羊转录组信息,并为进一步理解绵羊及其他高原哺乳动物睾丸发育和精子发生机制提供了理论依据。
常征辉[9]（2021）在《益肾兴阳胶囊对少弱精子症模型的治疗作用与机制研究》文中进行了进一步梳理少弱精子症是常见的男性不育疾病之一,其发病率在近些年逐年升高,亟需安全有效的治疗手段。西医治疗本病存在一定的局限性,疗效欠佳,中医药在男性不育的防治方面有独特优势。益肾兴阳胶囊作为一种中成药,早期主要用于治疗阳痿早泄,现在越来越广泛地用于治疗少弱精子症,因此研究并揭示益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的作用机制具有重要意义。然而,目前尚未对其整体的药效机理形成全面的认识,为此迫切需要有效的研究思路和方法来对其药效物质基础及作用机制进行研究,指导临床安全、合理地用药。论文包括文献综述、网络药理学预测和实验研究。文献综述系统总结了近年来中医药对少弱精子症的研究进展,探讨了传统中医药对少弱精子症的认识、中医辨证分型、中药复方研究等进展;从现代医学角度探讨了少弱精子症的病因、睾丸生精功能的调控机制、治疗方法等。以上内容的探讨,为本课题顺利开展做了铺垫。研究目的:本研究拟通过网络药理学预测益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的关键靶点、生物通路等相关机制,为动物实验药效机制研究奠定基础。设计动物实验,观察益肾兴阳胶囊对少弱精子症模型精子质量、生精细胞凋亡、增殖分化、以及精子能量代谢的影响,阐述其作用机制,为益肾兴阳胶囊组方用药及作用机制提供实验探索。研究方法:1.网络药理学通过多个中药成分与靶标数据库收集和筛选益肾兴阳胶囊的化学成分,构建益肾兴阳胶囊作用靶点PPI网络（protein protein interaction network,PPI network）;同时从疾病基因数据库对少弱精子症靶点进行检索及筛选;并将疾病基因映射到PPI网络,获取益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的关键作用靶点;构建益肾兴阳胶囊来源中药-成分-靶点-模块-通路网络,通过富集分析预测益肾兴阳胶囊的潜在作用机制。2.实验研究。复制环磷酰胺诱导的少弱精子症小鼠模型,采用精液分析、电镜、流式细胞、Western Blot等方法,对正常组、模型组、益肾兴阳胶囊高、中、低剂量组、枸橼酸氯米芬对照组、万艾可对照组、汇仁肾宝对照组进行精子质量、精子腺嘌吟核苷三磷酸（Adenosine triphosphate,ATP）含量、生精细胞周期、睾丸超微结构、睾丸组织 B 细胞淋巴瘤-2 基因（B-cell lymphoma 2,Bcl-2）、Bcl-2 相关 X 蛋白（Bcl-2 Associated X Protein,Bax）、磷脂酶肌醇 3-激酶（Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3k）、蛋白激酶B（Protein kinase B,Akt）、干细胞因子（Stem Cell Factor,SCF）、C-Kit 原癌基因（C-Kit proto-oncogeneprotein,C-Kit）、A 细胞凋亡信号调节激酶 1（Apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1）、c-JunN 端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）表达的检测。复制雷公藤多苷诱导的少弱精子症大鼠模型,采用精液分析、ELISA、流式细胞、RT-PCR等方法,对正常组、模型组、益肾兴阳胶囊高、中、低剂量组、枸橼酸氯米芬对照组、万艾可对照组、汇仁肾宝对照组进行精子质量、性激素水平、线粒体膜电位、睾丸组织TGF-β1/Smads信号转导通路蛋白、电压依赖性阴离子通道2（Voltage-dependent anion channel 2,VDAC2）、电压依赖性阴离子通道 3（Voltage-dependent anion channel 3,VDAC3）、细胞周期检查点激酶 1（Cell cycle checkpoint kinase 1,CHK1）、细胞周期检查点激酶 2（Cell cycle checkpoint kinase 2,CHK2）蛋白表达的检测。研究结果:1.网络药理学共得到益肾兴阳胶囊418个化学成分、2447个靶点和少弱精子症134个致病基因;其中17个靶点为益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的关键作用靶点,它们参与了 8个关键模块;中药-成分-靶点-模块-通路网络分析发现,其中有57个成分参与调控了关键的作用靶点和关键模块,有可能影响生精细胞凋亡、增殖分化和精子能量代谢。2.动物实验首先模型建立成功,与正常对照组相比,模型动物少弱精子症成立。小鼠实验药效学研究显示,益肾兴阳胶囊可以改善少弱精子症小鼠模型精子质量和精子ATP含量（P<0.01）;睾丸组织超微结构与模型组相比,益肾兴阳胶囊各组生精细胞、支持细胞线粒体明显增多,轻微肿胀,并且可见正常形态高尔基体,睾丸超微结构改善明显。作用机制研究显示,益肾兴阳胶囊可以调控少弱精子症小鼠模型生精细胞周期、睾丸组织Bcl-2、Bax、PI3k、Akt、SCF、C-Kit、ASK1、JNK 蛋白表达（P<0.05）。大鼠实验药效学研究显示,益肾兴阳胶囊可以改善少弱精子症大鼠模型精子质量、性激素水平和精子线粒体膜电位（P<0.05）。作用机制研究显示,益肾兴阳胶囊可以调控少弱精子症大鼠模型睾丸组织TGF-β1/Smads信号转导通路、VDAC2、VDAC3、CHK1、CHK2蛋白表达（P<0.05）。通过动物实验,验证了网络药理学相关的生物学通路预测。研究结论:1.益肾兴阳胶囊可以显着提高少弱精子症模型精子质量并改善睾丸组织超微结构损伤情况。2.益肾兴阳胶囊可以抑制少弱精子症模型生精细胞凋亡,具体机制可能与调控 Bcl-2、Bax、PI3k、Akt、SCF、C-Kit、ASK1、JNK 蛋白表达有关。3.益肾兴阳胶囊可以改善睾丸的生精功能,促进生精细胞增殖分化,具体机制可能与调控TGF-β1/Smads信号转导通路以及CHK1、CHK2蛋白表达有关。4.益肾兴阳胶囊可以增强少弱精子症模型精子能量代谢,具体机制可能与提高线粒体膜电位、增强VDAC2、VDAC3蛋白表达有关。综上所述,本研究证实了益肾兴阳胶囊具有补肾精、促生殖的治疗效果,也揭示了益肾兴阳胶囊通过抑制生精细胞凋亡、促进生精细胞增殖分化、增强精子能量代谢治疗少弱精子症的相关作用机制。
韩林东[10]（2021）在《环境内分泌干扰物DEHP致未成熟睾丸生殖损伤及远期影响》文中研究说明第一部分DEHP致未成熟睾丸生殖损伤的体视学评价及相关机制研究目的:探讨环境内分泌干扰物邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（Di-（2-ethylhexyl）phthalate,DEHP）暴露对青春前期大鼠未成熟睾丸生殖功能的影响及机制。方法:将青春前期雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为2组,于生后（Postnatal day,PND）22-35天进行灌胃建模;对照组为玉米油灌胃,实验组为DEHP（500mg/kg/d）灌胃染毒。暴露结束后于PND36取材进行研究,测量大鼠体重、睾丸重量、睾丸器官系数、血清性激素水平等指标;通过糖原PAS（Periodic Acid-Schiff）染色观察睾丸形态学改变;运用体视学方法研究睾丸内不同组织结构定量指标以及生精上皮内精子发生主要细胞的定量数据;同时运用转录组测序及生物信息学方法筛选相关通路及基因,揭示DEHP致未成熟睾丸损伤的分子机制,并且运用实时定量逆转录聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR）对测序结果进行验证。结果:与对照组相比,DEHP导致青春前期大鼠体重、睾丸重量及睾丸器官系数分别下降5.4%、29.1%、33.0%,血清睾酮水平降低,黄体生成素（luteinizing hormone,LH）降低,卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone,FSH）升高;DEHP致未成熟睾丸组织生精小管明显萎缩并伴有生精上皮空泡化、生精细胞排列疏松、生精细胞脱落等病理特征。体视学定量研究发现睾丸体积减少29.2%,睾丸内生精小管、生精上皮体积分别减少37.3%、38.4%,睾丸间质体积无明显变化,但体积分数明显增加48.6%;生精上皮厚度减少21.2%、生精小管直径减小16.3%、生精小管长度缩短12.1%;生精上皮内B型精原细胞、Ⅰ-Ⅷ期粗线期精母细胞、Ⅸ-ⅩⅣ期精母细胞、球形精子细胞、变形精子细胞数量明显减少,非B型精原细胞、前细线期精母细胞、细线期/偶线期精母细胞、Sertoli细胞及Leydig细胞数量无明显变化。转录组测序发现,对照组与DEHP组间有5548个差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,其中540个基因表达上调,5008个基因表达下调,生物信息学分析后发现DEHP对未成熟睾丸的生殖毒性可能通过类固醇激素合成、视黄醇代谢、细胞黏附分子（cell adhesion molecules,CAMs）、氧化磷酸化等信号通路介导,并受通路内相关基因表达变化的影响。q RT-PCR验证结果与转录组测序结果具有相同的趋势。结论:青春前期DEHP暴露显着影响大鼠生长发育,导致大鼠体重降低,睾丸重量减少,以及血清睾酮、LH水平降低;严重引起睾丸形态学损伤,干扰睾丸内精子发生过程,生精小管严重萎缩并伴有B型精原细胞、Ⅰ-Ⅷ期粗线期精母细胞、Ⅸ-ⅩⅣ期精母细胞、球形精子细胞、变形精子细胞显着减少。通过转录组测序及生物信息学分析推测睾丸生殖功能损伤主要通过类固醇激素合成、视黄醇代谢、CAMs、氧化磷酸化信号通路介导。第二部分DEHP致未成熟睾丸生殖损伤的远期影响及基因表达水平的动态评价目的:第一部分研究显示青春前期DEHP暴露导致大鼠未成熟睾丸生殖功能明显受损,本部分我们将继续随访观察,进一步探讨青春前期DEHP暴露对大鼠生殖功能损伤的远期影响及基因表达水平动态评价。方法:与第一部分同样的SD大鼠及分组策略,于暴露结束后随访至成年,明确生殖发育两个关键时期性成熟期（PND52）及成年期（PND90）的影响情况,在两个时期分别测量大鼠体重、睾丸重量、睾丸器官系数、性激素水平并且于成年期行附睾尾精子计数、畸形率统计及交配实验;定性观察不同时期睾丸组织形态学特征、定量研究不同时期睾丸组织结构及生精细胞体视学指标,同时运用转录组测序及生物信息学方法对恢复过程中基因表达水平进行动态评价,并且运用q RT-PCR对测序结果进行验证。结果:青春前期DEHP暴露后,性成熟期大鼠体重、睾丸重量、睾丸器官系数仍较对照组偏低,成年期后恢复至正常水平;血清睾酮、LH、FSH在性成熟期仍未达到正常水平,成年期后睾酮、FSH恢复至正常水平,但LH仍较正常值偏低。睾丸组织形态学病理特征在性成熟期损伤程度较前有所减轻,但此期出现明显的长形精子细胞异常,包括长形精子细胞畸形、长形精子细胞滞留等病变特征,成年期后形态学特征基本能恢复正常。体视学定量研究发现睾丸及睾丸不同组织结构体积在性成熟期得到快速恢复,成年后各项指标均恢复至正常水平。生精上皮厚度、管腔直径、生精小管直径及长度在性成熟期仍低于正常水平,成年期能得到显着恢复。生精上皮内明显减少的B型精原细胞、Ⅰ-Ⅷ期粗线期精母细胞、Ⅸ-ⅩⅣ期精母细胞数量在性成熟期已恢复正常;球形精子细胞、变形精子细胞、长形精子细胞数量在性成熟期仍低于正常水平,成年期后才逐步恢复正常。成年后通过精子计数、精子畸形率统计及交配实验均较对照组无明显差异,提示生育能力未受到明显影响。转录组测序发现性成熟期及成年期差异基因分别为2006个及222个,上调基因分别为1192个及130个,下调基因分别为814个及92个;通过生物信息学分析推测性成熟期可能通过DNA复制、错配修复、同源联会信号通路、MAPK等通路介导损伤恢复过程,成年期激活的松弛素及核糖体信号通路对生殖损伤的恢复有重要贡献。q RT-PCR验证结果与转录组测序结果具有相同的趋势。结论:青春前期DEHP暴露对生殖功能的影响在性成熟期仍残留部分损伤,到成年期后基本恢复正常。转录组测序结果发现生殖损伤的恢复可能与改变生殖相关信号通路基因表达水平有关。
二、附睾内细胞间的相互作用:结构完整与精子成熟的重要决定因素（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、附睾内细胞间的相互作用:结构完整与精子成熟的重要决定因素（论文提纲范文）
（1）水牛精浆外泌体蛋白质组的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 精子发生与成熟 |
| 1.1.1 精子结构 |
| 1.1.2 精子的发生 |
| 1.1.3 精子的成熟 |
| 1.2 外泌体的研究背景 |
| 1.2.1 外泌体的发现、定义和组成 |
| 1.2.2 外泌体的生物发生 |
| 1.2.3 外泌体的功能 |
| 1.2.4 外泌体的分离与鉴定 |
| 1.3 外泌体与精子活力 |
| 1.3.1 精浆外泌体 |
| 1.3.2 精浆外泌体在精子成熟过程中的作用 |
| 1.4 蛋白质组学概况 |
| 1.4.1 蛋白质组学研究概况 |
| 1.4.2 蛋白质组学在精浆外泌体中的应用 |
| 1.5 本研究的目的、意义及技术路线 |
| 第二章 水牛精浆外泌体的分离鉴定与蛋白质表达谱的构建 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 精液的处理 |
| 2.1.3 精子和精浆总蛋白的提取 |
| 2.1.4 基于超高速差速离心结合蔗糖垫纯化方法对精浆外泌体的分离和提取 |
| 2.1.5 精浆外泌体蛋白的提取 |
| 2.1.6 BCA法测定蛋白质浓度 |
| 2.1.7 蛋白免疫印迹法检测精浆外泌体的蛋白标志物 |
| 2.1.8 透射电子显微镜(TEM)观察精浆外泌体形态 |
| 2.1.9 纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)分析外泌体颗粒尺寸 |
| 2.1.10 蛋白质的还原烷基化和酶切 |
| 2.1.11 反相高效液相色谱(RP-HPLC)预分离 |
| 2.1.12 肽段脱盐 |
| 2.1.13 LC-MS/MS分析 |
| 2.1.14 数据检索与生物信息学分析 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.2.1 基于超高速差速离心结合蔗糖垫提取水牛精浆外泌体的鉴定 |
| 2.2.2 水牛精子活力的检测 |
| 2.2.3 精子、精浆和精浆外泌体蛋白质的质谱鉴定结果及Venn分析 |
| 2.2.4 蛋白质的理化性质统计 |
| 2.2.5 高丰度蛋白质分析 |
| 2.2.6 精子、精浆和精浆外泌体的基因本体论(GO)分析 |
| 2.2.7 精浆外泌体中生殖相关蛋白质的挖掘 |
| 2.2.8 精子、精浆和精浆外泌体的信号通路分析 |
| 2.2.9 精浆外泌体蛋白质互作网络(PPI) |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 水牛高低活力精浆外泌体的差异蛋白质组学分析 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 精液的采集及处理 |
| 3.1.3 水牛精浆外泌体的分离和提取 |
| 3.1.4 水牛精浆外泌体蛋白质的提取与浓度测定 |
| 3.1.5 水牛精浆外泌体的鉴定 |
| 3.1.6 蛋白质的还原烷基化和酶切 |
| 3.1.7 iTRAQ标记 |
| 3.1.8 反相高效液相色谱(RP-HPLC)预分离 |
| 3.1.9 肽段脱盐 |
| 3.1.10 LC-MS/MS分析 |
| 3.1.11 数据检索与生物信息学分析 |
| 3.2 实验结果与分析 |
| 3.2.1 高低活力水牛精液的检测 |
| 3.2.2 质谱鉴定结果及质量控制 |
| 3.2.3 差异表达蛋白质(DEPs)分析 |
| 3.2.4 基因本体论分析 |
| 3.2.5 KEGG通路分析 |
| 3.2.6 差异表达蛋白质的互作网络(PPI)分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 全文结论 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间发表的论文 |
（2）奶山羊精子发生关键分子挖掘与性控精液研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 哺乳动物精子发生 |
| 1.1.1 精原干细胞自我更新与分化 |
| 1.1.2 精母细胞与减数分裂 |
| 1.1.3 圆形精子细胞变形及调控 |
| 1.1.4 睾丸发育与精子发生 |
| 1.2 精子发生相关lncRNA及其功能 |
| 1.2.1 LncRNA的形成和作用机制 |
| 1.2.2 LncRNA预测和分析数据库 |
| 1.2.3 LncRNA在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.3 单细胞转录组测序技术在精子发生中的应用 |
| 1.3.1 scRNA-seq技术发展概述 |
| 1.3.2 scRNA-seq技术在精子发生的研究进展 |
| 1.3.3 scRNA-seq技术在睾丸体细胞的研究进展 |
| 1.4 性控精液研究及应用概述 |
| 1.4.1 流式细胞仪分离X、Y精子研究进展 |
| 1.4.2 流式分选技术在牛性控精液的应用 |
| 1.4.3 流式分选技术在山羊性控精液的应用 |
| 1.4.4 基于基因/蛋白表达差异分离X、Y精子研究进展 |
| 1.5 本研究的目的与意义 |
| 第二章 奶山羊雄性生殖细胞与支持细胞发育规律研究 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验动物 |
| 2.1.2 主要设备及试剂 |
| 2.1.3 睾丸石蜡包埋及组织切片 |
| 2.1.4 睾丸切片HE染色 |
| 2.1.5 免疫组织化学染色 |
| 2.1.6 数据分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 奶山羊睾丸曲细精管发育规律 |
| 2.2.2 奶山羊未分化精原细胞发育规律 |
| 2.2.3 奶山羊未分化精原细胞的分化进程 |
| 2.2.4 奶山羊未分化精原细胞增殖规律 |
| 2.2.5 奶山羊曲细精管精母细胞发育规律 |
| 2.2.6 奶山羊曲细精管精子发育规律 |
| 2.2.7 奶山羊曲细精管支持细胞发育规律 |
| 2.2.8 奶山羊曲细精管支持细胞的增殖状态 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 奶山羊睾丸曲细精管组织发育规律分析 |
| 2.3.2 奶山羊曲细精管性原细胞的迁移进程 |
| 2.3.3 奶山羊曲细精管精原细胞的发育规律 |
| 2.3.4 奶山羊曲细精管支持细胞的发育规律 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 奶山羊精子发生关键lncRNA和 mRNA挖掘 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验动物 |
| 3.1.2 主要设备及试剂 |
| 3.1.3 奶山羊睾丸曲细精管分离 |
| 3.1.4 奶山羊睾丸曲细精管组织RNA提取 |
| 3.1.5 RNA质检与建库 |
| 3.1.6 数据分析 |
| 3.1.7 qPCR验证 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 奶山羊性成熟前和性成熟后睾丸组织学差异 |
| 3.2.2 RNA-seq及数据质控 |
| 3.2.3 奶山羊基因组特征比对分析 |
| 3.2.4 奶山羊曲细精管长链非编码RNA的鉴定 |
| 3.2.5 奶山羊曲细精管长链非编码RNA和 mRNA特征分析 |
| 3.2.6 奶山羊性成熟前后长链非编码RNA和 mRNA差异表达分析 |
| 3.2.7 奶山羊精子发生相关mRNA的 GO和 KEGG分析 |
| 3.2.8 奶山羊精子发生相关lncRNA的 GO与 KEGG分析 |
| 3.2.9 奶山羊精子发生关键mRNA挖掘 |
| 3.2.10 奶山羊精子发生相关lncRNA-mRNA共表达分析 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 曲细精管组织样本为RNA-seq数据分析奠定良好基础 |
| 3.3.2 奶山羊曲细精管lncRNA特征分析 |
| 3.3.3 奶山羊精子发生关键分子挖掘 |
| 3.3.4 奶山羊精子发生关键重要信号通路挖掘 |
| 3.3.5 奶山羊精子发生关键lncRNA-mRNA挖掘 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 奶山羊精子发生单细胞转录图谱构建及关键分子挖掘 |
| 引言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验动物 |
| 4.1.2 主要设备及试剂 |
| 4.1.3 主要数据库及数据分析软件 |
| 4.1.4 奶山羊睾丸曲细精管单细胞悬液制备 |
| 4.1.5 单细胞RNA-seq文库的制备和测序 |
| 4.1.6 单细胞RNA-seq数据分析 |
| 4.1.7 奶山羊雄性生殖细胞分化谱系构建 |
| 4.1.8 差异表达基因及功能富集分析 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 奶山羊曲细精管单细胞数据质控 |
| 4.2.2 奶山羊曲细精管主要细胞类型鉴定 |
| 4.2.3 奶山羊精子发生过程中主要细胞类型的分子特征 |
| 4.2.4 奶山羊精子发生与睾丸体细胞关键基因表达分析 |
| 4.2.5 奶山羊生殖细胞分化谱系构建及关键基因表达模式 |
| 4.2.6 奶山羊精子发生过程中涉及的细胞周期变化 |
| 4.2.7 奶山羊精原细胞关键基因挖掘与功能富集分析 |
| 4.2.8 scRNA-seq与RNA-seq精子发生关键mRNA比较分析 |
| 4.3 讨论 |
| 4.3.1 奶山羊曲细精管中主要细胞类型鉴定 |
| 4.3.2 奶山羊精子发生及睾丸体细胞关键基因挖掘 |
| 4.3.3 雄性生殖细胞与睾丸体细胞相互作用的关键分子特征 |
| 4.3.4 奶山羊雄性生殖细胞分化轨迹及精原细胞差异基因功能富集 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 奶山羊性染色体关键分子挖掘与性控精液研究 |
| 引言 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验动物 |
| 5.1.2 主要设备及试剂 |
| 5.1.3 奶山羊性染色体编码基因鉴定 |
| 5.1.4 免疫组织化学染色 |
| 5.1.5 奶山羊精液采集 |
| 5.1.6 精液处理及精子浮游分选 |
| 5.1.7 奶山羊精子运动特征检测 |
| 5.1.8 奶山羊精子顶体完整率检测 |
| 5.1.9 奶山羊精子质膜完整率检测 |
| 5.1.10 奶山羊精子线粒体活性检测 |
| 5.1.11 奶山羊精子ATP水平检测 |
| 5.1.12 奶山羊精卵体外受精试验 |
| 5.1.13 奶山羊胚胎性别鉴定 |
| 5.1.14 Western Blotting检测奶山羊精子蛋白的表达变化 |
| 5.1.15 数据分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 奶山羊性染色体编码基因注释与编码受体基因鉴定 |
| 5.2.2 TLR7和TLR8在奶山羊睾丸、附睾和精子中的表达及定位 |
| 5.2.3 TLR7/8激活剂对奶山羊精子运动性能的影响 |
| 5.2.4 TLR7/8激活剂抑制X精子的运动能力 |
| 5.2.5 TLR7/8激活剂降低X精子ATP水平和线粒体活性 |
| 5.2.6 体外受精所得胚胎的性别鉴定 |
| 5.3 讨论 |
| 5.3.1 奶山羊性染色体关键基因挖掘 |
| 5.3.2 TLR7和TLR8在奶山羊X精子的尾部特异表达 |
| 5.3.3 TLR7/8信号通路激活抑制X精子的运动性能 |
| 5.3.4 TLR7/8信号通过GSK3α/β-己糖激酶途径影响X精子运动能力 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论与创新点 |
| 6.1 研究结论 |
| 6.2 研究创新点 |
| 6.3 下一步研究计划 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（3）Occludin蛋白第二胞外环22AA通过下调Occludin和诱导细胞凋亡可逆性调节紧密连接（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 文献综述 |
| 1 血睾屏障(blood-testis barrier,BTB)的结构功能 |
| 2 支持细胞紧密连接的结构功能 |
| 3 Occludin蛋白研究进展 |
| 3.1 Occludin蛋白结构 |
| 3.2 Occludin蛋白功能 |
| 3.3 Occludin蛋白在组织中的表达分布 |
| 3.4 Occludin蛋白与生殖相关 |
| 3.5 Occludin蛋白的磷酸化 |
| 4 小结 |
| 第一章 材料与试剂 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 主要实验试剂 |
| 1.3 主要仪器设备和工具 |
| 1.4 主要试剂配制 |
| 第二章 实验方法 |
| 2.1 制备封闭肽介导的破坏TJ的小鼠动物模型 |
| 2.1.1 实验分组 |
| 2.1.2 制备封闭肽介导的破坏TJ的小鼠动物模型 |
| 2.2 WB检测比较Occludin在 TJ崩解及重建后的表达差异 |
| 2.2.1 总蛋白提取 |
| 2.2.2 总蛋白浓度测定 |
| 2.2.3 SDS-PAGE电泳 |
| 2.3 免疫荧光检测Occludin在 TJ崩解及重建后的表达及定位差异 |
| 2.3.1 组织石蜡制作 |
| 2.3.2 石蜡切片脱蜡复水 |
| 2.3.3 抗原热修复 |
| 2.3.4 免疫荧光染色 |
| 2.4 免疫荧光双标检测模型小鼠SC和精子细胞形态结构和细胞凋亡 |
| 2.4.1 组织石蜡制作 |
| 2.4.2 石蜡切片脱蜡复水 |
| 2.4.3 抗原热修复 |
| 2.4.4 免疫荧光染色步骤 |
| 2.5 QPCR检测比较miR-122-5p在 TJ崩解及重建后的表达差异 |
| 2.5.1 RNA的提取 |
| 2.5.2 荧光定量PCR的操作步骤 |
| 2.6 细胞涂片检测精子数量变化 |
| 2.7 检测TJ崩解及重建后小鼠生育能力的变化 |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 22AA能够下调Occludin表达 |
| 3.2 22AA能够影响Occludin的定位和分布 |
| 3.3 22AA能促进SC细胞凋亡,破坏SC的形态结构 |
| 3.4 22AA能够促进精子细胞凋亡 |
| 3.5 22AA能够上调miR-122-5p的表达 |
| 3.6 22AA能够改变精子数量 |
| 3.7 22AA能够影响雄性小鼠生育后代的产仔数 |
| 第四章 讨论 |
| 第五章 结果与结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 附录1:主要实验试剂 |
| 附录2:实验常用仪器 |
| 在校期间公开发表论文及着作情况 |
（4）基于睾丸支持细胞研究4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| SUMMARY |
| 中英文缩略词表 |
| 第一章 研究背景 |
| 1 少精症与动物模型 |
| 2 少精症与精子发生 |
| 3 4.1R蛋白与精子发生 |
| 4 血睾屏障与精子发生 |
| 5 Wnt/β-catenin信号通路与精子发生 |
| 6 研究意义与内容 |
| 7 试验方案 |
| 第二章 4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的表达与作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料、仪器与试剂 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 仪器 |
| 2.3 试剂 |
| 3 方法 |
| 3.1 少精症小鼠模型的建立 |
| 3.2 睾丸组织中4.1R蛋白表达水平检测 |
| 3.3 睾丸组织中epb41 基因转录水平检测 |
| 3.4 睾丸组织中4.1R蛋白表达分布检测 |
| 3.5 血睾屏障功能分析 |
| 3.6 统计方法 |
| 4 结果 |
| 4.1 少精症模型小鼠精子密度测定 |
| 4.2 少精症模型小鼠附睾和睾丸形态学检测 |
| 4.3 4.1R蛋白在小鼠睾丸组织中的表达 |
| 4.4 少精症小鼠睾丸中epb41 基因转录水平检测 |
| 4.5 少精症小鼠睾丸组织中4.1R蛋白表达分布 |
| 4.6 少精症模型小鼠血睾屏障功能分析 |
| 4.7 少精症模型小鼠睾丸中Wnt/β-catenin信号通路组分转录检测 |
| 4.8 少精症模型小鼠睾丸中Wnt/β-catenin信号通路组分蛋白表达 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第三章 4.1R蛋白表达对睾丸支持细胞增殖和连接的调节作用研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料、仪器与试剂 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 仪器 |
| 2.3 试剂 |
| 3 方法 |
| 3.1 Epb41 基因CRISPR-cas9 质粒载体构建与验证 |
| 3.2 CRISPR-Cas9 慢病毒载体构建 |
| 3.3 过表达慢病毒载体的构建 |
| 3.4 TM4 细胞培养 |
| 3.5 原代睾丸支持细胞培养 |
| 3.6 Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP慢病毒载体转染TM4 细胞 |
| 3.7 Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP慢病毒载体转染原代睾丸支持细胞 |
| 3.8 过表达慢病毒载体转染TM4 细胞 |
| 3.9 过表达慢病毒载体转染原代睾丸支持细胞 |
| 3.10 慢病毒载体转染后TM4 细胞增殖检测 |
| 4 结果 |
| 4.1 Epb41-sg RNAs与 pGL3-U6-sg RNA-puromycin和 pSpCas9(BB)-2A-GFP载体连接 |
| 4.2 pGL3-U6-epb41-sg RNAa-puromycin和 pSpCas9(BB)-epb41-sg RNAb-2A-GFP共转染N2a细胞 |
| 4.3 Lenti-Cas9-sgRNA-EGFP 慢病毒载体检测 |
| 4.4 过表达慢病毒载体的构建与验证 |
| 4.5 慢病毒载体转染TM4 细胞 |
| 4.6 慢病毒载体转染原代睾丸支持细胞 |
| 4.7 慢病毒载体转染后TM4 细胞增殖检测 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第四章 4.1R蛋白表达对体内睾丸支持细胞间连接的调节作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料、仪器与试剂 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 仪器 |
| 2.3 试剂 |
| 3 方法 |
| 3.1 质粒载体电转染小鼠活体睾丸组织 |
| 3.2 慢病毒载体睾丸活体转染 |
| 3.3 小鼠活体睾丸转染效果验证 |
| 4 结果 |
| 4.1 质粒载体活体电转染睾丸组织方法验证 |
| 4.2 重组CRISPR-Cas9 基因敲除质粒载体电转染睾丸 |
| 4.3 过表达慢病毒载体转染睾丸 |
| 5 讨论 |
| 6 小结 |
| 第五章 总结与展望 |
| 1 总结 |
| 2 创新点 |
| 3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 在读期间发表论文和研究成果等 |
| 导师简介 |
| 附件 |
（5）猪隐睾睾丸精子发生障碍的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 隐睾症及其激素调节机制的研究进展 |
| 1.1 隐睾症 |
| 1.2 隐睾症流行病学研究 |
| 1.3 隐睾症激素调节机制的研究 |
| 2 隐睾影响哺乳动物精子发生的研究进展 |
| 2.1 哺乳动物精子发生 |
| 2.2 隐睾影响精子发生的研究 |
| 3 隐睾睾丸形态计量学研究进展 |
| 3.1 隐睾睾丸细胞计数的研究 |
| 3.2 隐睾睾丸生殖细胞和支持细胞的研究 |
| 4 隐睾睾丸细胞增殖研究进展 |
| 4.1 增殖相关蛋白的研究 |
| 4.2 睾丸细胞增殖的研究 |
| 4.3 隐睾影响睾丸细胞增殖的研究 |
| 5 隐睾睾丸细胞凋亡的研究进展 |
| 5.1 凋亡的概念及分子机制的研究 |
| 5.2 凋亡调节哺乳动物精子发生的研究 |
| 5.3 隐睾影响精子发生的凋亡信号研究 |
| 6 隐睾睾丸自噬的研究进展 |
| 6.1 自噬的概念及作用机制的研究 |
| 6.2 自噬调节精子发生的研究 |
| 6.3 隐睾睾丸自噬的分子机制研究 |
| 7 隐睾睾丸支持细胞间血睾屏障研究进展 |
| 7.1 血睾屏障紧密连接分子组成的研究 |
| 7.2 隐睾影响血睾屏障紧密连接分子的研究 |
| 8 转录组测序技术在隐睾睾丸的研究进展 |
| 8.1 转录组与转录组测序技术 |
| 8.2 转录组测序技术在睾丸基因表达差异的研究 |
| 8.3 转录组测序技术在隐睾睾丸基因表达差异的研究 |
| 9 蛋白质组学技术在隐睾睾丸的研究进展 |
| 9.1 蛋白质组学与蛋白质组学技术 |
| 9.2 蛋白质组学技术在睾丸蛋白表达差异的研究 |
| 9.3 蛋白质组学技术在隐睾睾丸蛋白表达差异的研究 |
| 10 本研究的目的与意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 自发单侧隐睾公猪睾丸支持细胞和生殖细胞数量的变化 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和样品采集 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 制作石蜡切片 |
| 2.2 HE染色 |
| 2.3 睾丸的形态计量学 |
| 2.4 睾丸细胞计数 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 猪睾丸组织形态学变化 |
| 3.2 猪睾丸组织形态计量学变化 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第三章 自发单侧隐睾对公猪睾丸增殖和凋亡相关蛋白表达与定位的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和样品采集 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 TUNEL法检测细胞凋亡 |
| 2.2 总RNA提取和qRT-PCR |
| 2.2.1 总RNA提取 |
| 2.2.2 cDNA合成 |
| 2.2.3 引物设计 |
| 2.2.4 qRT-PCR |
| 2.3 总蛋白提取和Western Blot |
| 2.3.1 总蛋白提取 |
| 2.3.2 Western Blot |
| 2.4 免疫荧光化学 |
| 2.5 免疫组织化学 |
| 2.6 数据统计与分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 隐睾对生殖细胞凋亡的影响 |
| 3.2 隐睾对猪睾丸增殖和凋亡相关基因mRNA表达水平的影响 |
| 3.3 隐睾对猪睾丸增殖和凋亡相关蛋白表达量的影响 |
| 3.4 隐睾对猪睾丸增殖和凋亡相关蛋白定位的影响 |
| 4 讨论 |
| 4.1 隐睾对猪睾丸生殖细胞和支持细胞增殖的影响 |
| 4.2 隐睾对猪睾丸生殖细胞和支持细胞凋亡的影响 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 自发单侧隐睾对公猪睾丸自噬相关蛋白表达与定位的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和样品采集 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 总RNA提取和qRT-PCR |
| 2.2 总蛋白提取和Western Blot |
| 2.3 免疫组织化学 |
| 2.4 数据统计与分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 隐睾对猪睾丸自噬相关基因LC3、p62和Beclin1 mRNA表达水平的影响 |
| 3.2 隐睾对猪睾丸自噬相关蛋白LC3、p62和Beclin1表达水平的影响 |
| 3.3 隐睾对猪睾丸自噬蛋白LC3定位的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第五章 自发单侧隐睾对公猪睾丸血睾屏障紧密连接分子表达与定位的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和样品采集 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 总RNA提取和qRT-PCR |
| 2.2 总蛋白提取和Western Blot |
| 2.3 免疫组织化学 |
| 2.4 数据统计与分析 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 隐睾对猪睾丸血睾屏障紧密连接相关基因Claudin-11、Occludin和ZO-1mRNA表达水平的影响 |
| 3.2 隐睾对猪睾丸血睾屏障紧密连接相关蛋白Claudin-11、Occludin和ZO-1表达水平的影响 |
| 3.3 隐睾对猪睾丸支持细胞标记蛋白GATA-4 定位的影响 |
| 3.4 隐睾对猪睾丸血睾屏障紧密连接相关蛋白Claudin-11、Occludin和ZO-1定位的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第六章 单侧隐睾对大鼠睾丸血睾屏障通透性的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和样品采集 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 大鼠隐睾模型的建立 |
| 2.2 免疫组织化学 |
| 2.3 血睾屏障通透性检测 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 隐睾对大鼠睾丸血睾屏障紧密连接相关蛋白Claudin-11和ZO-1定位的影响 |
| 3.2 隐睾对大鼠睾丸血睾屏障通透性的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第七章 转录组学分析自发单侧隐睾对公猪睾丸基因表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和样品采集 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 3.1 断奶前仔猪、隐睾和对侧阴囊睾丸的转录组学分析 |
| 3.2 差异基因GO分析 |
| 3.3 差异基因KEGG分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 隐睾对精原细胞分化的影响 |
| 4.2 隐睾对生殖细胞减数分裂的影响 |
| 4.3 隐睾对细胞间连接的影响 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 第八章 蛋白组学分析自发单侧隐睾对公猪睾丸蛋白表达的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 实验动物和样品采集 |
| 1.2 主要仪器和试剂 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 蛋白的鉴定 |
| 3.2 蛋白定量和差异蛋白筛选 |
| 3.3 差异表达蛋白GO分析 |
| 3.4 差异表达蛋白KEGG分析 |
| 4 讨论 |
| 4.1 隐睾对睾酮产生的影响 |
| 4.2 隐睾对细胞周期的影响 |
| 4.3 隐睾对细胞连结的影响 |
| 4.4 隐睾对代谢的影响 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 全文结论 |
| 创新点 |
| Abstract |
| 英文缩写对照表 |
| 附录 |
| 致谢 |
（6）长白公猪性成熟前后睾丸组织环状RNA、信使RNA N6-腺苷甲基化修饰的发掘鉴定及差异表达分析（论文提纲范文）
| 本项研究受下列基金资助 |
| 致谢 |
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩写与符号清单 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 猪睾丸发育过程及其表观遗传调控 |
| 1.1.1 公猪的性成熟 |
| 1.1.2 猪睾丸发育过程 |
| 1.1.3 间质细胞在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.1.4 睾丸发育与精子发生的表观遗传调控 |
| 1.2 环状RNA在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.2.1 环状RNA的生物起源、特性及功能 |
| 1.2.2 环状RNA的数据发掘、分析及研究方法 |
| 1.2.3 环状RNA在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.2.4 结论和展望 |
| 1.3 m6A修饰在睾丸发育与精子发生中的作用 |
| 1.3.1 m6A修饰概述 |
| 1.3.2 m6A修饰的检测 |
| 1.3.3 m6A修饰的生物学功能 |
| 1.3.4 哺乳动物精子发生过程中m6A修饰的动态调节 |
| 1.3.5 结论与展望 |
| 第二章 性成熟前后长白种公猪睾丸组织学观察与分析 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验方法 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 睾丸大小 |
| 2.2.2 性成熟前后长白种公猪睾丸组织学特征 |
| 2.2.3 睾丸组织显微观察结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.3.1 石蜡切片及H&E染色 |
| 2.3.2 性成熟前后长白种公猪睾丸发育情况 |
| 2.3.3 性成熟前后长白种公猪睾丸组织结构观察 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 性成熟前后公猪睾丸文库构建及环状RNA的鉴定与基本特征 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 睾丸组织样本RNA提取及质检结果 |
| 3.2.2 RNA文库构建及高通量测序数据质量分析 |
| 3.2.3 环状RNA的鉴定 |
| 3.2.4 性成熟前后长白种公猪睾丸组织中环状RNA的基本特征 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 性成熟前后长白种公猪睾丸环状RNA的差异表达及生物信息学分析 |
| 引言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 实验材料 |
| 4.1.2 实验方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 性成熟前后公猪睾丸组织中显着差异表达环状RNA的鉴定与分析 |
| 4.2.2 性成熟前后公猪睾丸组织环状RNA测序结果的试验验证 |
| 4.2.3 差异环状RNA的GO分析 |
| 4.2.4 差异环状RNA的 KEGG信号通路富集分析 |
| 4.2.5 环状RNA靶miRNA预测 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 性成熟前后长白种公猪睾丸转录组信使RNA甲基化图谱的建立 |
| 引言 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 实验材料 |
| 5.1.2 实验方法 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 数据质控与序列统计 |
| 5.2.2 参考基因组比对 |
| 5.2.3 全基因组m6A Peak扫描分析 |
| 5.2.4 差异Peak分析 |
| 5.2.5 m6A Motif分析 |
| 5.2.6 RNA-seq基因/转录本差异结果分析 |
| 5.2.7 RNA-seq中差异基因GO富集分析 |
| 5.2.8 RNA-seq中差异基因KEGG富集分析 |
| 5.2.9 MeRIP-seq中差异m6A Peak GO富集分析 |
| 5.2.10 MeRIP-seq中差异m6A Peak KEGG富集分析 |
| 5.3 讨论 |
| 5.4 小结 |
| 第六章 结论与展望 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（7）雄激素对绵羊附睾谷胱甘肽过氧化物酶5抗氧化的调节机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 1 引言 |
| 1.1 附睾的结构与功能 |
| 1.1.1 附睾的结构 |
| 1.1.2 附睾的基因表达 |
| 1.1.3 附睾功能的调节 |
| 1.1.4 附睾液的组分 |
| 1.1.5 附睾对精子成熟的作用 |
| 1.2 附睾抗氧化 |
| 1.2.1 ROS与精子 |
| 1.2.2 附睾中的抗氧化剂 |
| 1.3 EECs体外培养 |
| 1.3.1 EECs体外培养的意义 |
| 1.3.2 EGF概述 |
| 1.3.3 海藻糖概述 |
| 1.4 附睾特异性表达的GPX5 |
| 1.4.1 GPX5 基因的结构与定位 |
| 1.4.2 GPX5 基因的表达特性 |
| 1.4.3 GPX5 基因的功能研究 |
| 1.4.4 GPX5 基因的调节机制 |
| 1.5 研究目的与意义 |
| 2 实验一、EGF经 EGFR/PI3K/AKT通路激活FOXO1 磷酸化促进绵羊EECs体外增殖 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 实验动物 |
| 2.1.2 主要仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 EECs的体外分离培养与鉴定 |
| 2.2.2 EECs的体外传代培养 |
| 2.2.3 EECs的鉴定 |
| 2.2.4 EECs生长曲线测定 |
| 2.2.5 EGF体外对绵羊EECs功能的影响 |
| 2.2.6 EGF对 EECs细胞周期的影响 |
| 2.2.7 EECs的凋亡测定 |
| 2.2.8 EGFR和 PI3K/AKT通路抑制剂对细胞周期分布和细胞凋亡率的影响 |
| 2.2.9 EGFR和 PI3K/AKT通路抑制剂对EGFR、AKT和 FOXO1 磷酸化水平的影响 |
| 2.2.10 数据统计与分析 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 绵羊EECs分离培养 |
| 2.3.2 绵羊成纤维细胞分离与纯化 |
| 2.3.3 绵羊EECs的鉴定 |
| 2.3.4 EGF对绵羊EECs体外增殖的影响 |
| 2.3.5 EGF对 EECs体外培养传代的影响 |
| 2.3.6 EGF维持绵羊EECs的表达特性 |
| 2.3.7 EGF对 EECs细胞周期及凋亡的影响 |
| 2.3.8 EGFR和 PI3K/AKT通路抑制剂对细胞周期分布和细胞凋亡率的影响 |
| 2.3.9 EGF 影响 EECs 细胞 FOXO1 磷酸化 |
| 2.4 讨论 |
| 3 实验二、海藻糖在绵羊EECs体外增殖过程中的抗氧化作用 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 实验细胞 |
| 3.1.2 主要仪器 |
| 3.1.3 主要试剂 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 EECs分离培养与传代 |
| 3.2.2 EECs生长曲线测定 |
| 3.2.3 EECs细胞周期检测 |
| 3.2.4 EECs细胞凋亡检测 |
| 3.2.5 海藻糖对绵羊EECs表达特性的维持 |
| 3.2.6 ROS检测 |
| 3.2.7 SOD酶活性检测 |
| 3.2.8 CAT酶活性检测 |
| 3.2.9 GPXs酶活性检测 |
| 3.2.10 qRT-PCR检测GPX5 m RNA表达量 |
| 3.2.11 ELISA检测GPX5 蛋白表达量 |
| 3.2.12 数据统计与分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 海藻糖有助于提高绵羊EECs活性 |
| 3.3.2 海藻糖改变绵羊EECs细胞周期分布 |
| 3.3.3 海藻糖抑制绵羊EECs凋亡 |
| 3.3.4 海藻糖维持绵羊EECs功能特性 |
| 3.3.5 海藻糖对EECs内 ROS和抗氧化酶的作用 |
| 3.3.6 海藻糖对EECs内 GPX5 表达的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 4 实验三、绵羊附睾GPX5 基因的抗氧化功能 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验细胞 |
| 4.1.2 主要仪器 |
| 4.1.3 主要试剂 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 绵羊EECs的 siRNA-GPX5 的瞬时转染 |
| 4.2.2 qRT-PCR检测GPX5 mRNA表达量 |
| 4.2.3 ELISA检测GPX5 蛋白表达量 |
| 4.2.4 CCK-8 检测细胞增殖 |
| 4.2.5 ROS检测 |
| 4.2.6 MDA检测 |
| 4.2.7 8-OHd G检测 |
| 4.2.8 抗氧化酶mRNA表达量检测 |
| 4.2.9 数据统计与分析 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 RT-PCR检测干扰的EECs GPX5 mRNA表达量 |
| 4.3.2 ELISA检测干扰的EECs GPX5 蛋白表达量 |
| 4.3.3 GPX5 干扰对EECs抗氧化应激的影响 |
| 4.3.4 GPX5 干扰对EECs中 ROS含量的影响 |
| 4.3.5 GPX5 干扰对EECs脂质过氧化的影响 |
| 4.3.6 GPX5 干扰的EECs中8-OHd G含量 |
| 4.3.7 雄激素对GPX5 干扰的EECs抗氧化基因表达的影响 |
| 4.4 讨论 |
| 5 实验四、睾酮、AR和共调节因子对绵羊附睾GPX5 表达的调节 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 主要仪器 |
| 5.1.3 主要试剂 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 睾酮处理的EECs生长曲线测定 |
| 5.2.2 qRT-PCR检测GPX5、AR和共调节因子mRNA表达量 |
| 5.2.3 睾酮对GPX5、AR和共调节因子蛋白表达的免疫荧光分析 |
| 5.2.4 睾酮对GPX5、AR和共调节因子蛋白表达的相对定量分析 |
| 5.2.5 siRNA干扰AR对 GPX5、SRC-1和p300 表达的影响 |
| 5.2.6 AR过表达对GPX5 表达的影响 |
| 5.2.7 双荧光素酶报告基因检测AR与GPX5 的结合作用及结合位点 |
| 5.2.8 绵羊EECs siRNA-SRC-1和siRNA-p300 的瞬时转染 |
| 5.2.9 siRNA-SRC-1和siRNA-p300 干扰效率检测 |
| 5.2.10 绵羊EECs干扰SRC-1或p300后GPX5和AR表达量检测 |
| 5.2.11 绵羊EECs SRC-1和p300对AR活性的影响 |
| 5.2.12 数据统计与分析 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 不同浓度睾酮对绵羊 EECs 体外增殖的影响 |
| 5.3.2 睾酮对绵羊EECs中 GPX5 表达的影响 |
| 5.3.3 睾酮对绵羊EECs中 AR表达的影响 |
| 5.3.4 睾酮对绵羊EECs中 AR共调节因子表达的影响 |
| 5.3.5 AR以序列特定的方式调节绵羊GPX5 的表达 |
| 5.3.6 AR调节绵羊EECs SRC-1和p300 蛋白的表达 |
| 5.3.7 SRC-1和p300 调节绵羊EECs GPX5 的表达 |
| 5.3.8 SRC-1和p300 对绵羊EECs AR表达和转录活性的影响 |
| 5.4 讨论 |
| 6 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
（8）基于转录组学的藏绵羊睾丸功能基因鉴定及其表达调控（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 摘要 |
| Summary |
| 第一章 文献综述 |
| 1 睾丸的生物学功能概述 |
| 1.1 精子发生 |
| 1.2 睾丸支持细胞的生物学功能 |
| 1.3 免疫豁免特性 |
| 1.3.1 血-睾屏障 |
| 1.3.2 免疫抑制 |
| 2 非编码RNAs及其在雄性动物生殖系统中的研究进展 |
| 2.1 miRNAs及其在哺乳动物睾丸中的研究进展 |
| 2.2 CircRNAs及其在雄性动物生殖系统中的研究进展 |
| 3 转录组测序技术在哺乳动物生殖系统中的应用研究进展 |
| 4 研究目的及意义 |
| 第二章 不同发育期藏绵羊睾丸circRNA/miRNA/mRNA表达谱特征分析 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品收集 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 组织形态学分析 |
| 1.3.2 总RNA提取及质检 |
| 1.3.3 cDNA文库和小RNA文库的构建及测序 |
| 1.3.4 数据质控及mRNA、circRNA、miRNA的鉴定 |
| 1.3.5 差异表达分析 |
| 1.3.6 功能富集分析 |
| 1.3.7 RT-qPCR验证 |
| 1.3.8 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 不同发育阶段藏绵羊睾丸组织形态学特征比较分析 |
| 2.2 mRNA、circRNA和miRNA测序数据概述 |
| 2.3 差异表达分析 |
| 2.3.1 差异表达mRNA分析 |
| 2.3.2 CircRNA表征及差异表达分析 |
| 2.3.3 差异表达miRNA分析 |
| 2.4 测序结果验证 |
| 2.4.1 mRNA测序结果验证 |
| 2.4.2 CircRNA测序结果验证 |
| 2.4.3 miRNA测序结果验证 |
| 2.5 功能注释与富集分析 |
| 2.5.1 差异表达mRNAs功能注释与富集分析 |
| 2.5.2 差异circRNAs来源基因功能注释与富集分析 |
| 2.5.3 差异circRNAs来源基因与差异mRNAs共享基因的功能富集分析 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第三章 CircRNA-miRNA-mRNA整合分析及睾丸功能维持相关基因的ceRNA调控网络鉴定 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 主要试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 CircRNA-miRNA-mRNA关联性分析 |
| 1.3.2 功能注释与富集分析 |
| 1.3.3 荧光素酶报告基因载体构建及鉴定 |
| 1.3.4 细胞转染及双荧光素酶活性检测 |
| 1.3.5 RT-qPCR检测 |
| 1.3.6 Western blot分析 |
| 1.3.7 组织免疫荧光染色(间接法) |
| 1.3.8 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 CircRNA/miRNA/mRNA关联性分析 |
| 2.2 ceRNA网络中mRNAs的功能富集分析 |
| 2.3 CircRNA-miRNA-mRNA网络构建 |
| 2.4 Circ_015256/circ_029155-miR-760-3p-BOLL靶向关系验证 |
| 2.5 Circ_029155/miR-760-3p/BOLL在睾丸中的表达特征 |
| 2.6 BOLL蛋白在绵羊睾丸中的表达与分布特征 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第四章 睾丸免疫特权维持相关基因的鉴定及其ceRNA调控网络研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 主要试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 免疫相关差异表达基因鉴定与筛选 |
| 1.3.2 免疫相关miRNA-mRNA对及ceRNA共表达网络构建 |
| 1.3.3 RT-qPCR分析 |
| 1.3.4 Western blot分析 |
| 1.3.5 免疫荧光染色 |
| 1.3.6 双荧光素酶报告试验 |
| 1.3.7 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 性成熟前、后睾丸差异基因功能分类 |
| 2.2 免疫相关基因鉴定及表达特征分析 |
| 2.3 免疫相关差异基因的RT-qPCR验证 |
| 2.4 免疫相关基因编码蛋白的表达与定位 |
| 2.5 免疫相关基因功能注释分析 |
| 2.6 免疫相关基因的miRNA-mRNA调控网络分析 |
| 2.7 免疫相关差异miRNAs的RT-qPCR验证 |
| 2.8 免疫相关基因的circRNA-miRNA-mRNA互作网络分析 |
| 2.9 免疫相关差异表达circRNAs的RT-qPCR验证 |
| 2.10 靶向关系验证 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第五章 CircKLHL5靶向miR-29b/IGF1信号轴对绵羊睾丸支持细胞发育的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验动物及样品采集 |
| 1.2 试验仪器与试剂 |
| 1.2.1 试验仪器 |
| 1.2.2 试验试剂 |
| 1.3 试验方法 |
| 1.3.1 藏绵羊睾丸支持细胞的体外分离与纯化 |
| 1.3.2 支持细胞纯度鉴定 |
| 1.3.3 载体构建、细胞培养与转染 |
| 1.3.4 支持细胞核质分离 |
| 1.3.5 CircHLHL5成环鉴定 |
| 1.3.6 CCK-8分析 |
| 1.3.7 EdU染色 |
| 1.3.8 RT-qPCR |
| 1.3.9 Western blot |
| 1.3.10 细胞免疫荧光染色(间接法) |
| 1.3.11 酪胺信号放大-荧光原位杂交(TSA-FISH) |
| 1.3.12 流式检测细胞凋亡 |
| 1.3.13 双荧光素报告基因检测 |
| 1.3.14 数据统计分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 Circ_026259/miR-29b/IGF1轴的组织表达特征 |
| 2.2 绵羊睾丸支持细胞形态及免疫荧光鉴定 |
| 2.3 睾丸支持细胞中circKLHL5的鉴定 |
| 2.4 CircKLHL5转染效率检测 |
| 2.5 CircKLHL5可促进绵羊睾丸支持细胞增殖并抑制其凋亡 |
| 2.6 CircKLHL5与miR-29b靶向关系验证 |
| 2.7 Oar-miR-29b对睾丸支持细胞增殖和凋亡的影响 |
| 2.8 Oar-miR-29b与IGF1基因间靶向关系验证 |
| 2.9 IGF1转染效率检测 |
| 2.10 IGF1基因对支持细胞增殖和凋亡的影响 |
| 2.11 Oar-miR-29b可逆转circKLHL5对支持细胞表型的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 第六章 全文结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
| 导师简介 |
（9）益肾兴阳胶囊对少弱精子症模型的治疗作用与机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 文献综述 |
| 综述一 中医药对少弱精子症的研究进展 |
| 1. 中医药对少弱精子症的认识 |
| 2. 中医病因及辨证分型 |
| 3. 中药复方研究 |
| 参考文献 |
| 综述二 现代医学对少弱精子症的研究进展 |
| 1. 少弱精子症的病因 |
| 2. 睾丸生精细胞增殖分化相关机制 |
| 3. 少弱精子症的西医治疗 |
| 4. 小结 |
| 参考文献 |
| 第一部分 益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的网络药理学预测 |
| 1. 引言 |
| 2. 方法与材料 |
| 2.1 益肾兴阳胶囊活性成分筛选及作用靶点预测 |
| 2.2 益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症PPI网络的构建 |
| 2.3 功能模块分析及作用机制解析 |
| 3. 结果 |
| 3.1 益肾兴阳胶囊化学成分筛选、作用靶点和疾病靶点预测结果 |
| 3.2 少弱精子症和益肾兴阳胶囊蛋白互作网络构建 |
| 3.3 功能模块分析结果 |
| 3.4 益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的作用机制和有效成分分析 |
| 3.5 益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的活性成分验证 |
| 4. 讨论 |
| 5.结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 益肾兴阳胶囊对少弱精子症模型治疗作用与机制的实验研究 |
| 第一章 益肾兴阳胶囊对少弱精子症小鼠模型的实验研究 |
| 第一节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症小鼠模型精子质量影响 |
| 参考文献 |
| 第二节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症小鼠模型精子ATP影响 |
| 参考文献 |
| 第三节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症小鼠模型生精细胞周期影响 |
| 参考文献 |
| 第四节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症小鼠模型睾丸组织生精细胞、支持细胞超微结构影响 |
| 第五节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症小鼠模型睾丸组织PI3K、Akt、SCF、C-Kit、ASK1、JNK、Bcl-2、Bax蛋白表达影响 |
| 参考文献 |
| 第二章 益肾兴阳胶囊对少弱精子症大鼠模型的实验研究 |
| 第一节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症大鼠模型精子质量影响 |
| 参考文献 |
| 第二节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症大鼠模型血清性激素影响 |
| 参考文献 |
| 第三节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症大鼠模型精子线粒体膜电位影响 |
| 参考文献 |
| 第四节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症大鼠模型睾丸组织TGF-β1/Smads信号转导通路影响 |
| 参考文献 |
| 第五节 益肾兴阳胶囊对少弱精子症大鼠模型睾丸组织VDAC2、VDAC3、CHK1、CHK2蛋白表达的影响 |
| 参考文献 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）环境内分泌干扰物DEHP致未成熟睾丸生殖损伤及远期影响（论文提纲范文）
| 英汉缩略语名词对照 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 DEHP致未成熟睾丸生殖损伤的体视学评价及相关机制研究 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 5 参考文献 |
| 第二部分 DEHP致未成熟睾丸生殖损伤的远期影响及基因表达水平的动态评价 |
| 1 材料与方法 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 4 小结 |
| 5 参考文献 |
| 全文总结 |
| 文献综述 邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯对精子发生的影响 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的论文及参与课题 |
四、附睾内细胞间的相互作用:结构完整与精子成熟的重要决定因素（论文参考文献）
- [1]水牛精浆外泌体蛋白质组的初步研究[D]. 肖凯. 广西大学, 2021(12)
- [2]奶山羊精子发生关键分子挖掘与性控精液研究[D]. 任发. 西北农林科技大学, 2021
- [3]Occludin蛋白第二胞外环22AA通过下调Occludin和诱导细胞凋亡可逆性调节紧密连接[D]. 费露敏. 阜阳师范大学, 2021(12)
- [4]基于睾丸支持细胞研究4.1R蛋白在少精症小鼠模型中的作用机制[D]. 李小英. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [5]猪隐睾睾丸精子发生障碍的分子机制研究[D]. 范小瑞. 山西农业大学, 2021(02)
- [6]长白公猪性成熟前后睾丸组织环状RNA、信使RNA N6-腺苷甲基化修饰的发掘鉴定及差异表达分析[D]. 张飞. 安徽农业大学, 2021
- [7]雄激素对绵羊附睾谷胱甘肽过氧化物酶5抗氧化的调节机制研究[D]. 栾兆进. 内蒙古农业大学, 2021
- [8]基于转录组学的藏绵羊睾丸功能基因鉴定及其表达调控[D]. 李讨讨. 甘肃农业大学, 2021(01)
- [9]益肾兴阳胶囊对少弱精子症模型的治疗作用与机制研究[D]. 常征辉. 北京中医药大学, 2021(02)
- [10]环境内分泌干扰物DEHP致未成熟睾丸生殖损伤及远期影响[D]. 韩林东. 重庆医科大学, 2021(01)