一、细胞因子佐剂对HIV DNA疫苗免疫效果的影响（论文文献综述）
周珈[1]（2021）在《佐剂在新冠疫苗和HIV疫苗的研发探索》文中进行了进一步梳理[目的]胞壁酰二肽（Muramyl Dipeptide,MDP）是一种由N-乙酰胞壁酸与L-丙氨酸-D-异谷酰胺的短氨基酸链连接而成的具有免疫刺激功能的短肽。人们对MDP及其衍生物的结构修饰进行了广泛的研究,以期有效地提高其佐剂活性,增强疫苗的免疫应答。本实验探讨MDP用作佐剂在新冠亚单位重组蛋白疫苗的效应,以期在体内提高新冠疫苗的免疫反应。[方法]所用动物品系为Bal B/C小鼠,雌性,6至8周龄,然后将30只小鼠随机分成6只每组,共5组,分别是50μg疫苗组,“20μg MDP+10μg疫苗”组,“20μg MDP+50μg疫苗”组,“100μg MDP+10μg疫苗”组,“100μg MDP+50μg疫苗”组。亚单位疫苗S蛋白与MDP进行肌肉注射联合免疫。各组分别在第0、第3周时,进行免疫,免疫次数均为2次。在第2次免疫完成后的2周,眼球取血,分离血清,待用于体液免疫的检测。体液免疫应答通过对小鼠血清进行100、1000、10000倍稀释后,用ELISA技术检测其特异性IgG抗体。[结果]ELISA结果显示:①将小鼠血清稀释100倍后,“与50μg疫苗组相比,20μg MDP+50μg疫苗组在使用等量疫苗剂量时加入20μg MDP情况下,在小鼠体内诱导了显着增强的IgG抗体反应（P<0.05）”。“与50μg疫苗组相比,100μg MDP+10μg疫苗组在减少疫苗剂量时加入100μg MDP情况下,在小鼠体内诱导了显着增强的IgG抗体反应（P<0.05）”。“与50μg疫苗组相比,100μg MDP+50μg疫苗组在使用等量疫苗剂量时加入100μg MDP情况下,在小鼠体内诱导了显着增强的IgG抗体反应（P<0.05）”。“与50μg疫苗组相比,20μg MDP+10μg疫苗组在减少疫苗剂量时加入20μg MDP情况下,未在小鼠体内诱导显着增强的IgG抗体反应（P>0.05）”。②将小鼠血清稀释1000倍后,“与50μg疫苗组相比,100μg MDP+50μg疫苗组在使用等量疫苗剂量时加入100μg MDP情况下,在小鼠体内诱导了显着增强的IgG抗体反应（P<0.05）”,“与50μg疫苗组相比,其余三组小鼠未在体内诱导显着增强的IgG抗体反应（P>0.05）”。③将小鼠血清稀释10000倍后,“与50μg疫苗组相比,四组小鼠未在体内诱导显着增强的IgG抗体反应（P>0.05）”。[结论]MDP作为佐剂可有效增强新冠蛋白疫苗在小鼠体内的体液免疫反应。【目的】在体外和体内,表面负电的生物分子（基因）和药物可以被层状双金属氢氧化物（LDH）有效递送。通过将金刚院胺（Adamantanamine,Ada）修饰至NiZnAl表面,研究Ada修饰的层状双金属氢氧化物NiZnAl作为佐剂在HIV DNA疫苗中的应用前景。【方法】24只6至8周龄的BalB/C雌性小鼠,小鼠每组6只,并随机分成4个组,四组分别是,空白对照组,HIV DNA疫苗组,Ada+HIV DNA疫苗组,NiZnAl-Ada+HIV DNA疫苗组。HIV Gag DNA疫苗和HIV gpl40 DNA疫苗通过质粒提取获得,与NiZnAl-Ada、Ada进行联合免疫。各组小鼠进行3次免疫,免疫间隔的时间为,第0、2、4周,第三次为最后一次免疫,然后再进行2周的饲养,眼球采血、取脾脏,进行体液免疫,和细胞免疫的检测。体液免疫应答通过对小鼠血清进行500、1000、5000倍稀释后,用ELISA技术检测其Gag特异性和gpl40特异性IgG抗体;在单细胞水平上,通过使用ELISPOT检测IFN-y细胞因子分泌情况;流式细胞仪检测CD4+T和CD8+T细胞中CD107a、IFN-y、TNF-a、IL-2、IL-4的分泌,B细胞表面分子CD40、CD69和树突状细胞表面分子CD80、CD86的分泌情况。【结果】ELISA实验结果:①当小鼠血清稀释500倍、1000倍、5000倍后,“与空白对照组相比,HIVDNA疫苗组小鼠显示,其体内诱导了显着增强的IgG抗体反应,该反应为Gag特异性（P<0.05）”。“与空白对照组相比,Ada+HIV DNA疫苗组小鼠显示,其体内诱导了显着增强的IgG抗体反应,该反应为Gag特异性（PC0.05）”。“与空白对照组相比,NiZnAl-Ada+HIVDNA疫苗组小鼠显示,其体内诱导了显着增强的IgG抗体反应,该反应为Gag特异性（P<0.05）”。“与HIVDNA疫苗组相比,Ada+HIV DNA疫苗组小鼠显示,其未在小鼠体内诱导显着增强的IgG抗体反应,该反应为Gag特异性（P>0.05）”。“与HIVDNA疫苗组相比,NiZnAl-Ada+HIV DNA疫苗组小鼠显示,其未在小鼠体内诱导显着增强的IgG抗体反应,该反应为Gag特异性（P>0.05）”。②当小鼠血清稀释500倍、1000倍、5000倍后,“与空白对照组相比,HIV DNA疫苗组小鼠显示,其在小鼠体内诱导了显着增强的IgG抗体反应,该反应为gpl40特异性（P<0.05）”。“与空白对照组相比,Ada+HIVDNA疫苗组小鼠显示,其在小鼠体内诱导了显着增强的IgG抗体反应,该反应为gpl40特异性（P<0.05）”。“与空白对照组相比,NiZnAl-Ada+HIV DNA疫苗组小鼠显示,其在小鼠体内诱导了显着增强的IgG抗体反应,该反应为gpl40特异性（P<0.05）”。“与HIVDNA疫苗组相比,Ada+HIVDNA疫苗组小鼠显示,其未在小鼠体内诱导显着增强的IgG抗体反应,该反应为gpl40特异性（P>0.05）”。“与HIVDNA疫苗组相比,NiZnAl-Ada+HIV DNA疫苗组小鼠显示,其未在小鼠体内诱导显着增强的IgG抗体反应,该反应为gpl40特异性（P>0.05）”。ELISPOT实验结果:①“与空白对照组相比,HIVDNA疫苗组在小鼠体内诱导了显着增强的IFN-y的表达（P<0.05）”。“与空白对照组相比,Ada+HIV DNA疫苗组在小鼠体内诱导了显着增强的IFN-y的表达（P<0.05）”。与空白对照组相比,NiZnAl-Ada+fflVDNA疫苗组在小鼠体内诱导了显着增强的IFN-y的表达（PC0.05）”。②“与HIVDNA疫苗组相比,Ada+HIVDNA疫苗组未在小鼠体内诱导显着增强的IFN-y的表达（P>0.05）”。“与HIVDNA疫苗组相比,NiZnAl-Ada+HIV DNA疫苗组未在小鼠体内诱导显着增强的IFN-y的表达（P>0.05）”。流式细胞术实验结果:①“与空白对照组相比,在HIV DNA疫苗组、Ada+HIV DNA疫苗组和NiZnAl-Ada+HIV DNA疫苗组中,CD4+T细胞中CD107a、IFN-y、TNF-a、IL-2、IL-4的分泌均无明显统计学意义（P>0.05）”。“与HIV DNA疫苗组相比,在Ada+fflV DNA疫苗组和NiZnAl-Ada+HIV DNA疫苗组中,CD4+T细胞中CD107a、IFN-y、TNF-a、IL-2、IL-4的分泌均无明显统计学意义（P>0.05）”。②“与空白对照组相比,在HIV DNA疫苗组、Ada+fflV DNA疫苗组和NiZnAl-Ada+fflV DNA疫苗组中,CD8+T细胞中CD107a、IFN-y、TNF-a、IL-2、IL-4的分泌均无明显统计学意义（P>0.05）”。“与HIV DNA疫苗组相比,在Ada+HIV DNA疫苗组和NiZnAl-Ada+HIV DNA疫苗组中,CD8+T细胞中CD107a、IFN-y、TNF-a、IL-2、IL-4的分泌均无明显统计学意义（P>0.05）”。③“与空白对照组相比,在NiZnAl-Ada+HIVDNA疫苗组中,树突状细胞CD80的分泌有明显统计学意义（P<0.05）”。“与空白对照组相比,在HIV DNA疫苗组、Ada+HIV DNA疫苗组中,树突状细胞CD80的分泌无明显统计学意义（P>0.05）”。“与HIVDNA疫苗组相比,在Ada+HIV DNA疫苗组和NiZnAl-Ada+HIV DNA疫苗组中,树突状细胞CD80的分泌无明显统计学意义（P>0.05）”。④“与空白对照组相比,在HIVDNA疫苗组、Ada+HIV DNA疫苗组和NiZnAl-Ada+HIV DNA疫苗组中,树突状细胞CD86的分泌无明显统计学意义（P>0.05）”。“与HIVDNA疫苗组相比,在Ada+HIV DNA疫苗组和NiZnAl-Ada+HIV DNA疫苗组中,树突状细胞CD86的分泌无明显统计学意义（P>0.05）”。⑤“与空白对照组相比,在HIVDNA疫苗组、Ada+HIV DNA疫苗组和NiZnAl-Ada+HIV DNA疫苗组中,B细胞CD40、CD69,其细胞因子的分泌无明显统计学意义（P>0.05）”。“与HIVDNA疫苗组相比,在Ada+HIVDNA疫苗组和NiZnAl-Ada+ffiVDNA疫苗组中,B细胞CD40、CD69,其细胞因子的分泌无明显统计学意义（P>0.05）”。【结论】1.层状双金属氢氧化物NiZnAl-Ada作为佐剂对HIV DNA疫苗诱发的体液免疫反应差异无统计学意义。2.层状双金属氢氧化物NiZnAl-Ada作为佐剂对HIV DNA疫苗诱发的IFN-y细胞免疫反应差异无统计学意义。3.层状双金属氢氧化物NiZnAl-Ada作为佐剂对HIV DNA疫苗诱发的T细胞免疫反应差异无统计学意义。
石亚星[2]（2020）在《胞壁酰二肽的HIV DNA疫苗佐剂效应研究和原发性胆汁性胆管炎的临床病理研究》文中认为[目的]胞壁酰二肽（MDP）是细菌中普遍存在的具有佐剂效应的肽类物质。近年来,MDP及其衍生物作为佐剂分子被广泛研究。因此,探讨MDP在HIV DNA疫苗中的免疫佐剂效应,可为HIV DNA疫苗的研发提供科学依据。[方法]将18只小鼠随机分为三组,分别为:空白组、HIV DNA疫苗组和“HIV DNA疫苗+MDP”组,每组6只。通过质粒提取获得HIVGag DNA疫苗和HIV Env DNA疫苗。使用MDP作为佐剂,与上述HIV DNA疫苗联合免疫小鼠,一共免疫三次,每次间隔时间为两周。免疫完成两周后,提取小鼠免疫细胞,进行流式细胞术检测,主要检测指标有:CD4+T细胞和CD8+T细胞的IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ分泌情况和树突状细胞表面CD80、CD86的表达变化;同时,分离小鼠血清,将血清稀释100倍、1000倍、10000倍,通过ELISA检测小鼠血清中Gag特异性IgG和Env特异性IgG滴度。[结果]流式细胞术结果显示:①三组小鼠的Gag特异性CD4+T细胞和CD8+T细胞的IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ分泌均无显着差异（P>0.05）;②Env特异性CD4+T细胞IL-2的分泌在“HIV DNA疫苗+MDP”组和空白组差异具有统计学意义（P<0.05）,其他细胞因子的分泌在三组小鼠的Env特异性CD4+T细胞中均无显着差异（P>0.05）;③三组小鼠的Env特异性CD8+T细胞的IL-2、IL-4、TNF-α、IFN-γ分泌均无显着差异（P>0.05）;④三组小鼠树突状细胞的CD80、CD86表达差异无明显统计学意义（P>0.05）。ELISA结果显示:①在小鼠血清稀释100倍、1000倍、10000倍时,“HIV DNA疫苗+MDP”组的Gag特异性IgG滴度与HIVDNA疫苗组相比差异均有统计学意义（P<0.05）;②在小鼠血清稀释100倍、1000倍、10000倍时,HIV DNA疫苗组的Gag特异性IgG滴度与空白组相比差异均无显着统计学差异（P>0.05）;③“HIVDNA疫苗+MDP”组的Env特异性IgG滴度在小鼠血清稀释1000倍、10000倍时,与HIV DNA疫苗组相比差异具有统计学意义（P<0.05）,在小鼠血清稀释100倍时,无明显统计学差异（P>0.05）;④HIV DNA疫苗组的Env特异性IgG滴度在小鼠血清稀释100倍时,与空白组相比差异具有统计学意义（P<0.05）;在小鼠血清稀释1000倍、10000倍时,与空白组相比差异均无显着统计学差异（P>0.05）。[结论]（1）在小鼠模型中,MDP可以有效增强HIV DNA疫苗诱发的特异性IgG反应（Gag和Env）。（2）在小鼠模型中,MDP对HIV DNA疫苗诱发的细胞免疫反应无显着增强效应。[目的]探讨原发性胆汁性胆管炎（PBC）的病理诊断方法和指标。[方法]收集2015年1月至2019年3月昆明医科大学病理学教研室肝穿病例68例,包括PBC 55例和原发性胆汁性胆管炎-自身免疫性肝炎重叠综合征（PBC-AIH OS）患者13例。将55例PBC根据患者血清抗线粒体抗体二型（AMA-M2）滴度分为AMA-M2阳性PBC组28例、AMA-M2阴性PBC组27例;根据PBC分期分为PBC Ⅰ期15例、PBC Ⅱ期14例、PBC Ⅲ期9例和PBC Ⅳ期7例。收集患者的性别、年龄、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰转移酶（GGT）等临床资料评估重要的实验室指标的变化情况,采用免疫组化法检测AMA、Kelch样蛋白12（KLHL12）和己糖激酶1（HK1）在PBC和PBC-AIH OS中的表达情况,分析AMA、KLHL12和HK1在PBC中的临床诊断价值,以期为PBC的临床诊断提供新的自身抗体标志物。[结果]（1）AMA-M2阳性PBC、AMA-M2阴性PBC和PBC-AIH OS三组患者的性别、年龄、ALT、AST、ALP等临床指标差异无统计学意义。（2）免疫组化结果显示:AMA主要表达于胆管上皮细胞及肝细胞的胞浆中;KLHL12主要表达于肝细胞的胞浆中;HK1主要表达于Kupffer细胞、胆管上皮细胞及炎细胞的细胞质和细胞膜中。AMA-M2阳性PBC组、AMA-M2阴性PBC组和PBC-AIH OS组三组两两相比,AMA表达阳性率和表达强度差异在AMA-M2阳性PBC组和AMA-M2阴性PBC组具有统计学意义（P值分别为0.003、0.012）,其余两两相比无显着统计学差异（P>0.05）;KLHL12表达阳性率和表达强度差异在AMA-M2阳性PBC组和AMA-M2阴性PBC组具有统计学意义（P值分别为0.003、0.012）,其余两两相比无显着统计学差异（P>0.05）;HK1表达阳性率差异在AMA-M2阳性PBC组和AMA-M2阴性PBC组具有统计学意义（P=0.042）;HK1表达强度差异在AMA-M2阳性PBC组和PBC-AIH OS组具有统计学意义（P=0.026）,其余两两相比无显着统计学差异（P>0.05）。AMA、KLHL12和HK1在PBC不同分期的表达强度和表达阳性率差异均无明显统计学意义（P>0.05）。[结论]（1）AMA、KLHL12 和 HK1 在 AMA-M2 阳性 PBC、AMA-M2 阴性 PBC和PBC-AIHOS三组肝穿组织的表达部位无差异;（2）AMA、KLHL12和HK1的表达阳性率和阳性强度与PBC分期均无明显相关性;（3）在本实验检测的三种指标中,KLHL12表达阳性率在AMA-M2阳性PBC组和AMA-M2阴性PBC组均最高,其检测可能有助于PBC的临床诊断;（4）KLHL12和HK1在AMA-M2阴性PBC中具有较高的阳性率,可能有助于AMA-M2阴性PBC患者的诊断;（5）本实验结果表明,KLHL12和HK1可能不能作为PBC和PBC-AIH OS的鉴别指标。
王羽[3]（2019）在《细胞因子辅助免疫的抗体制备与应用及基于亲和力的免疫检测灵敏度研究》文中进行了进一步梳理抗体作为免疫检测技术开发的关键原料,其质量直接决定了相应免疫检测方法的性能。对于一些免疫原性低,甚至不具备免疫原性的目标检测物,传统的免疫方式较难以获得高质量的目标抗体。同时在免疫检测过程中,抗原与抗体间的亲和力对所建立的检测方法灵敏度的影响也是不可忽视的。因此,开发高质量检测抗体及明确抗原与抗体间的亲和力对免疫检测方法灵敏度的影响十分有意义。本研究通过应用细胞因子作为分子佐剂辅助免疫制备单克隆抗体,在DNA免疫和皮下免疫两种免疫策略中证实了细胞因子作为分子佐剂对制备单克隆抗体的积极效果。进一步分析了高亲和力抗体所识别的具体抗原表位信息,以及抗原表位氨基酸对抗原-抗体免疫反应亲和力的影响,明确了亲和力在抗原与抗体结合与解离反应过程中的重要作用。通过分析系列与检测抗体具有不同亲和力的竞争抗原对竞争法免疫检测灵敏度的影响,明确了竞争抗原与检测抗体的亲和力和样本中待检抗原与检测抗体的亲和力差异对竞争法免疫检测灵敏度的影响。最后,应用制备得到的高亲和力单克隆抗体开发了抗缪勒氏管激素（Anti-mullerian hormone,AMH）及和肽素（Copeptin,CPP）全自动化学发光检测试剂（Chemiluminescence immuneassay,CLIA）,试剂具有优异的使用性能,并可用于临床样本的检测。主要研究结果如下:（1）通过将合成得到的mFlt3L、mGM-CSF、mCCL20基因片段连接到载体pCAGGS上,成功构建重组载体pCAGGS-mFlt3L,pCAGGS-mGM-CSF及pCAGGS-mCCL20。并验证了其可在293F细胞中有效表达目标蛋白,表明可作为分子佐剂进一步实验。（2）利用分子佐剂（mFlt3L、mGM-CSF、mCCL20）辅助DNA免疫的策略成功制备了针对AMH的高亲和力抗体,使用KD值小于4 nM的两株高亲和力单克隆抗体成功构建了AMH化学发光检测方法。该分析方法对AMH检测表现出高度敏感性和特异性。检测范围为0.12520 ng mL-1,检出限为0.099 ng mL-1。孵育时间仅需30 min,而商品ELISA试剂盒需3 h。用于临床血清标本中AMH的检测,结果与标准AMH检测ELISA试剂盒具有高度一致性。（3）通过分子佐剂（mFlt3L、mGM-CSF、mCCL20）辅助皮下免疫后,杂交瘤的阳性率明显提高,且经过一次杂交瘤制备、亚克隆筛选便得到8株稳定分泌抗体的细胞株,对比皮下普免两次杂交瘤制备得到4株的得率,此策略明显提高抗体的开发效率。经过纯度和效价检测,所制备的抗体纯度均可达到90%,效价均大于1:105;经过细胞免疫化学实验确认,所制备的抗体可与天然的和肽素发生特异性反应,具备免疫检测试剂开发的要求。通过亲和力表征对比,发现分子佐剂辅助免疫制备的抗体亲和力远高于皮下普免制备的抗体,最高亲和力抗体的KD值可达10-1010 M。（4）经过生物信息学软件分析及肽扫描,最终确定了4株高亲和抗体的表位序列,均位于152161（APEPFEPAQP）。经过丙氨酸突变扫描和分子动力学分析,发现4株抗体的表位关键氨基酸主要为脯氨酸（P）、苯丙氨酸（F）和谷氨酰胺（Q）。最终明确抗原氨基酸序列中含疏水氨基酸较多的位置容易形成抗原表位。（5）通过在免疫层析和间接竞争ELISA检测体系同时研究竞争抗原与检测抗体间的亲和力变化对检测体系灵敏度的影响,发现适度下调竞争抗原与抗体的亲和力后,检测限（Limit of detection,LOD）显着下降,在免疫层析体系中最高下降至原LOD的9.5%,在间接竞争ELISA体系中最高下降至原LOD的12.1%,最佳灵敏度改善效果LOD低至0.09 nmol L-1。表明适度的降低竞争抗原与检测抗体之间的亲和力可以改善竞争免疫检测方法学的灵敏度。（6）选用抗CPP高亲和力抗体作为捕获抗体,磁珠作为固相载体,成功构建了可用于CPP检测的全自动CLIA,检测范围1.21250 pmol L-1,且最低检出限LOD仅为6.25 pmol L-1,完全满足临床应用需求(<18.9 pmol L-1)。再者,全自动CLIA的样本孵育时间仅为30 min,而对照ELISA则需要2 h以上。用于临床血清标本中的CPP检测,与市售CPP检测ELISA试剂盒相比,结果具有显着一致性。因此,所构建的全自动CLIA分析方法可以成功用于CPP的临床快速检测。
欧阳国文[4]（2017）在《H7亚型禽流感DNA疫苗及其免疫佐剂的初步研究》文中提出禽流感是一类由A型流感病毒引起的禽类的疾病。它给养禽业造成了巨大的经济损失,与此同时威胁着人类的健康。2013年3月,上海发现首例感染H7N9亚型流感的病例。2017年1月,广东发现的H7N9亚型流感病毒既能感染人也能感染禽类,且对禽类呈现高致病性。到2017年5月17日,人感染H7N9亚型流感病毒共1508例,其中死亡人数为577例,而且造成大量的禽类死亡。近年来,禽流感DNA疫苗等新型疫苗的研究越来越受关注。DNA疫苗具有安全性高和对变种病毒应对快速等优点,但仍存在转染效率和免疫原性低等不足,而开发筛选合适的佐剂可能会改善这些不足。为研制H7亚型禽流感DNA疫苗,首先通过RT-PCR扩增H7亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/O Y1/2013（H7N9）的HA基因,之后根据鸡密码子偏嗜性优化该基因,得到优化的HA基因op HA7。分别将H7亚型禽流感病毒的未优化和优化的HA基因克隆至真核表达载体p CK,构建了重组质粒p CKHA7和p CKop HA7。这些重组质粒经测序确认正确后,将其转染到293T细胞中,之后通过Western blot检测其表达量。结果显示重组质粒p CKop HA7和p CKHA7均能高效地表达目的蛋白HA,且优化型质粒表达水平明显高于未优化型质粒,表达的目的蛋白大小均约70 k Da。为研制鸡和鸭IFN-α、IL-2高效表达真核质粒,并将其作为DNA疫苗免疫佐剂,分别根据鸡和鸭密码子偏嗜性将NCBI（National Center for Biotechnology）序列数据库公布的鸡和鸭IFN-α、IL-2基因组序列进行优化,得到鸡和鸭IFN-α、IL-2优化基因（op Ch IFN-α、op Ch IL-2、op Du IFN-α、op Du IL-2）。通过PCR在优化的鸭IFN-α、IL-2基因3’端添加HIS标签序列,得到含有HIS标签的优化的鸭IFN-α、IL-2基因（op Du IFN-α+HIS、op Du IL-2+HIS）。之后分别将这些优化的基因（即op Ch IFN-α、op Ch IL-2、op Du IFN-α+HIS、op Du IL-2+HIS）克隆至真核表达载体p CK,构建了优化型重组质粒（p CKop Ch IFN-α、p CKop Ch IL-2、p CKop Du IFN-α+HIS、p CKop Du IL-2+HIS）。这些重组质粒经测序确认正确后,将其转染到293T细胞中,之后通过Western blot检测,结果显示这些优化型重组质粒均能高效地表达目的蛋白,且这些蛋白大小均在15-25 k Da之间。为评估免疫佐剂对DNA疫苗免疫效果的影响,试验将30只5周龄SPF鸡分为4组。其中对照组12只鸡注射p CK空载体,p CKop HA7免疫组6只鸡注射p CKop HA7质粒,p CKop HA7和p CKop Ch IFN-α联合免疫组6只鸡注射p CKop HA7和p CKop Ch IFN-α质粒,p CKop HA7和p CKop Ch IL-2联合免疫组6只鸡注射p CKop HA7和p CKop Ch IL-2质粒。采取腿部多点注射方式进行免疫。首免第14天进行二免,二免第14天用滴鼻点眼的方式以100μL 106 EID50的A/chicken/Guangdong/Q1/2016（H7N9）病毒攻击所有试验鸡。结果显示:p CK空载体对照组免疫期间血清抗体平均值都为0log2,攻毒后7天内全部死亡;p CKop HA7免疫组血清抗体平均值由一免第14天的0.6log2上升至二免第14天的4.8log2,攻毒后无死亡,排毒率为50%,保护率为50%;p CKop HA7和p CKop Ch IFN-α联合免疫组血清抗体平均值由一免第14天的3.7log2上升至二免第14天的6.2log2,且高于p CKop HA7免疫组1.4log2,攻毒后无死亡,排毒率为33.33%,保护率为66.67%;p CKop HA7和p CKop Ch IL-2联合免疫组血清抗体平均水平由一免第14天的2.4log2上升至二免第14天的6.2log2,且高于p CKop HA7免疫组1.4log2,攻毒后无死亡,排毒率为33.33%,保护率为66.67%。综上所述,H7亚型禽流感DNA疫苗p CKop HA7免疫SPF鸡后能诱导机体产生良好的抗体水平,并抵御H7N9亚型禽流感病毒的攻击。此外,p CKop Ch IFN-α质粒和p CKop Ch IL-2质粒均能促进机体产生更高的抗体水平,增强了H7亚型禽流感DNA疫苗的免疫效果。
李欣[5]（2017）在《HIV-1通用型gp120DNA疫苗的制备及免疫原性研究》文中提出艾滋病即获得性免疫缺陷综合征（AIDS）,是由人类免疫缺陷病毒（HIV）感染人体后造成人的免疫系统缺陷。HIV是一种慢病毒（Lentivirus）,属逆转录病毒科的一种。目前在人群中传播的HIV可分为两型,即HIV-1和HIV-2。全球绝大多数的AIDS病例都是由HIV-1引起的。我国流行的HIV-1是以B’,CRF07/08 BC和CRF01 AE 3种亚型为主。由于HIV病毒具有高度的遗传复制变异性,所以临床上很难制备特异性通用型中和抗体,使艾滋病疫苗开发极具挑战性。本研究以在我国HIV-1主要流行的3种主要HIV-1亚型的gp120蛋白序列优化筛选通用型抗原和镶嵌抗原构建的gp120DNA疫苗进行制备和鉴定,用EP电转化法在实验小鼠和兔体内进行gp120 DNA疫苗不同免疫条件下的免疫效果评价。1.将HIV-1通用型ConS和ConTAE gp120序列插入pVAX1载体和含有鼠可溶性PD1的pVAX1-msPD1改良载体,构建的pVAX1-ConS,pVAX1-ConTAE,pVAX1-msPD1-ConS,pVAX1-msPD1-ConTAE 4种重组质粒大量制备后,通过Western blot检测gp120蛋白的表达,结果表明,4种重组质粒的蛋白具有很高的表达水平,能够被自然感染HIV-1患者的抗体识别,并且能够模拟天然病毒蛋白。2.用4种质粒转染293T细胞制备包被抗原,进行HIV-1特异性抗体检测的ELISA方法的建立和反应条件的优化。用HIV-1囊膜蛋白Env质粒和pNL荧光素酶标记的HIV-1骨架质粒,加入PEI,在opti-MEM中包装生成只具有一个复制周期的假病毒,将假病毒侵染ghost X4/R5细胞,通过多标记酶标仪检测,计算细胞相对荧光单位（RLU）用于免疫中和效果的评价。3.为了评价不同DNA疫苗的免疫表达效果,分别将4种ConS,ConTAE,msPD1-ConS,msPD1-ConTAE gp120 DNA疫苗,按照60 V、10 ms电击条件通过电转化法连续三次免疫BALB/c雌性小鼠。结果4种疫苗都能产生高滴度的抗体免疫应答,能够中和HIV-1 B亚型1级假病毒CNE40。4.用12月龄雌性新西兰大白兔,通过电转化法接种ConS gp120 DNA疫苗和ConTAE gp120 DNA疫苗。按照90 V,10 ms和60 V,10 ms两种电压条件,以及注射部位涂擦Imiquimod免疫佐剂等方式连续免疫三次。结果表明,90 V,10 ms高电压条件下,并不能显着提高DNA疫苗的免疫效果,用60 V,10 ms的低电压条件下注射免疫,能够使DNA疫苗产生高水平持久性的免疫应答。
马金柱[6]（2014）在《EEEV/WEEV病毒样颗粒疫苗和DNA疫苗的构建及实验免疫研究》文中指出东方马脑炎病毒（Eastern Equine Encephalitis Virus, EEEV）和西方马脑炎病毒（Western Equine Encephalitis Virus, WEEV）能够引起人和某些动物发生传染性脑炎,该病具有传染性强、发病率和致死率高等特点,所以它们属于高危病原,已经引起国际高度重视,已被列为二类生物恐怖试剂。自从EEEV和WEEV被发现以来,已经给人类造成了巨大的经济损失。目前,市场上尚无有效EEEV和WEEV疫苗,用于预防EEEV和WEEV的疫苗主要采用灭活疫苗、弱毒疫苗和病毒活载体疫苗,但是,这些疫苗存在各自缺点,且它们不适用于人类。另外,EEEV和WEEV能够以气溶胶和蚊虫叮咬等方式传播,加上近年来生态环境的变化和国际间交流频率的增加给它们的传播提供了便利条件,使它们具有随时爆发的可能。因此,研制新型高效EEEV和WEEV的储备疫苗是预防和紧急应对它们爆发的有效手段。近几年,病毒样颗粒（Virus Like Particles, VLPs）作为新型疫苗已显示出安全性好和免疫原性强等优点,具有巨大的开发和应用潜力；另外,DNA疫苗已展示了它自身得天独厚的优势,对于多种疾病的预防和治疗具有广阔的应用前景。因此,本研究对EEEV和WEEV的病毒样颗粒疫苗和DNA疫苗进行了探索性研究,并建立了东、西方马脑炎假病毒中和试验的检测方法,以为EEEV和WEEV新型储备疫苗的研究提供重要参考。本研究主要分为五部分。第一部分：EEEV/WEEV假病毒中和试验的建立。为了有效评价抗体中和活性和避免自然病毒EEEV和WEEV作为中和试验所用的病原具有潜在的生物安全隐患,本研究首次利用HIV慢病毒包装系统和EEEV、WEEV的结构蛋白构建了这两种病毒的假病毒。假病毒鉴定结果显示获得的假病毒形态、结构与文献报道的EEEV、WEEV具有一致性,并且,假病毒感染抑制实验结果表明EEEV、WEEV假病毒的感染能力分别能被EEEV和WEEV的抗体所抑制,在此基础上,利用获得的假病毒分别建立了检测EEEV和WEEV抗体中和试验,检测结果表明该方法能够有效评价机体中抗体的中和作用。第二部分：EEEV病毒样颗粒疫苗的构建、鉴定与实验免疫研究。近些年,病毒样颗粒作为新型疫苗已展示了许多独特的优点,具有巨大的开发和应用前景。目前,EEEV的病毒样颗粒方面研究尚未见到报道,因此,本研究首次利用杆状病毒表达系统（Bac to Bac系统）通过基因重组技术构建了表达EEEV结构蛋白（C、E3、E2、6K和E1）的重组杆状病毒（BmNPV-C-E）, BmNPV-C-E感染的家蚕细胞BmN可正确表达EEEV VLPs。免疫实验结果表明获得的EEEV VLPs免疫小鼠之后,VLPs能够有效诱导小鼠T淋巴细胞活化、刺激小鼠血清中产生高水平的细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-α和中和抗体；另外,VLPs能够刺激马淋巴细胞发生特异性地活化、增殖,并且,马血清中产生高水平的VLPs中和抗体,且具有较强的中和作用。因此,免疫结果表明EEEV VLPs能够有效刺激小鼠和马的细胞免疫和体液免疫活化,具有较强的免疫原性。第三部分：WEEV病毒样颗粒疫苗的构建、鉴定与实验免疫研究。目前,已有很多病毒样颗粒疫苗研制成功,但是,尚无WEEV病毒样颗粒疫苗的研究,因此,本研究首次利用Bac to Bac系统和WEEV结构基因（C、E3、E2、6K和E1）构建了重组杆状病毒（AcMNPV-C-E）, AcMNPV-C-E能够在昆虫细胞SF9中正确表达WEEV VLPs,并且,制备的VLPs具有较强的免疫原性,能够刺激小鼠产生抗原特异性的IFN-γ+T细胞免疫反应,可诱导小鼠的脾细胞产生高水平的IL-2、IL-4、IFN-γ以及血清中产生高水平且具有中和作用的WEEV VLPs抗体；另外,VLPs能够诱导马淋巴细胞发生活化、增殖,产生细胞免疫,并且,马血清中产生高水平的VLPs中和抗体,产生较强的体液免疫。第四部分：东方马脑炎DNA疫苗的构建、鉴定与免疫原性研究。近年来,DNA疫苗是新兴发展起来的新型疫苗,与其它疫苗相比具有很多独特的优势,显示出了巨大的发展潜力,但是,目前,东方马脑炎DNA疫苗方面研究较少。因此,.本实验成功构建了重组表达载体pcDNA3.1-C-E-eeev,鉴定结果表明pcDNA3.1-C-E-eeev能在293T细胞中表达EEEV的E1和E2蛋白,并且,表达的蛋白能够包装成EEEV VLP且可释放到细胞外；另外,免疫实验表明pcDNA3.1-C-E-eeev具有较强的免疫原性,能诱导小鼠产生抗原特异性IFN-γ+T细胞免疫反应和抗原特异性CD4+T细胞产生IL-2、IL-4和IFN-γ免疫反应以及抗原特异性CD8+T细胞产生较强的IL-2和IFN-y免疫反应,并且,pcDNA3.1-C-E-eeev可诱导B淋巴细胞活化,产生高水平的中和抗体,并能够有效中和EEEV假病毒的感染。此外,免疫结果表明CpG与Poly（I:C）佐剂均可显着增强pcDNA3.1-C-E-eeev的免疫原性,其中,混合佐剂(CpG/Poly（I:C）应用产生的免疫增强作用要显着强于CpG或Poly（I:C）单独使用所产生的免疫效果,这表明不同佐剂的混合（CpG/Poly（I:C）或联合应用非常有望成为提高DNA疫苗免疫原性的一种新的有效方法。第五部分：西方马脑炎DNA疫苗的构建、鉴定与免疫原性研究。自从DNA疫苗被研究以来,已经展示出了很多自身特有的优点,具有巨大的研发潜力,但是,目前,西方马脑炎DNA疫苗的研究较少。因此,本研究利用真核表达载体pcDNA3.1和WEEV结构基因（C、E3、E2、6K和E1））构建了重组表达载体pcDNA3.1-C-E-weev,间接免疫荧光和电镜鉴定结果显示pcDNA3.1-C-E-weev能够在293T细胞中表达WEEV的E1蛋白和VLP,并且,表达的VLP可释放到细胞外；免疫实验结果显示pcDNA3.1-C-E-weev能够诱导小鼠T细胞活化和刺激小鼠产生高水平的细胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ以及中和抗体,表明pcDNA3.1-C-E-weev能够有效诱导小鼠细胞免疫和体液免疫活化。终上所述,本研究结果表明,利用杆状病毒表达系统制备的EEEV和WEEV VLPs和构建的EEEV、WEEV的DNA疫苗均具有较强的免疫原性,具有作为疫苗的开发潜力。本研究结果为EEEV和WEEV新型储备疫苗奠定了良好基础。
侯爵[7]（2013）在《HIV-1 DNA疫苗佐剂及两种病毒载体基因表达谱研究》文中研究说明时至今日,HIV疫苗研究仍面临众多难题。以DNA为载体的HIV疫苗中,如何提高抗原免疫原性,提高特异性免疫应答强度是关键性难点；而以病毒为载体的疫苗,如何根据病毒载体诱导免疫应答反应的特点来选择病毒载体类型,亦是亟需解决的问题。为增强DNA疫苗免疫原性,本研究中选取多种类型佐剂,考察候选佐剂的免疫学特性及潜在的生物学机制,以期寻找适宜的HIV DNA疫苗佐剂。本文中利用体外建立的小鼠骨髓来源的树突状细胞（BMDC）模型,结合Toll-Like Receptor（TLR）信号通路激活、树突状细胞活化及其分泌细胞因子类型等实验,综合评价了寡聚核苷酸（CpG）、卡介菌多糖核酸注射液（BCG-PSN）、鞭毛素蛋白（Flagellin）、铜绿假单胞菌注射液（PA-MSI IA）及霍乱肠毒素B亚单位（CTB）等五种不同类型佐剂体外免疫激活效果。经体外实验筛选出的PA-MSHA和CTB佐剂,与HIV DNA疫苗联合免疫小鼠,研究佐剂增强DNA疫苗抗原特异性免疫应答反应。结果显示,PA-MSHA和CTB均能够激活TLR信号通路,进而刺激BMDC成熟,促进BMDC分泌多种细胞因子；PA-MSHA应用于HIV DNA疫苗中呈现剂量依赖效应,低剂量PA-MSHA可增强HIV-1 Env DNA疫苗诱导的特异性细胞免疫反应及抗体应答水平,而高剂量则反映出免疫抑制效应。本文亦首次证实CTB作为常用粘膜佐剂,可通过肌肉注射提高HIV-1 DNA疫苗的免疫原性,能够诱导高水平的抗原特异性细胞及体液免疫应答,且抗原特异性免疫反应强度可能与CTB诱导的炎症应答相关。为改善HV Gag DNA疫苗免疫原性弱的困境,首创性的借助]HIV Gag与宿主蛋白亲环素A（CyPA）的特异性相互作用可促进树突状细胞成熟和抗原提呈,进而激活T细胞应答的假说,设计了以HIV-1 Gag为抗原,以CyPA为基因佐剂的DNA疫苗。经多种策略验证了CyPA具有Gag抗原特异性佐剂效果；且CyPA的基因佐剂效应源自与Gag抗原的特异性相互作用,当单点突变CyPA失去与Gag结合能力后则不再具备佐剂效果,而三点突变CyPA由于仍然保持与Gag的相互作用则体现出增强细胞免疫应答特性。CyPA与Gag联合免疫,可提高Gag诱导的特异性细胞免疫应答的广谱性,并Gag/CyPA双表达盒系统可诱导长达半年的高水平Gag特异性细胞免疫应答。本研究中选择了两种HIV疫苗候选病毒载体,利用临床试验系统比较了黄热病毒疫苗与痘病毒疫苗接种后基因表达谱的差异,重点分析了在免疫接种后各个时间点基因本体学及信号通路的特征,并结合时间序列分析和转录因子动态分析策略,研究了两种病毒载体诱导的基因表达谱动态变化过程。结果显示,黄热病毒疫苗在免疫接种后非常早期（4小时）即有众多基因差异性表达,而痘病毒疫苗在免疫后9-14天时才出现基因表达峰值。黄热疫苗接种后可迅速激活免疫系统,在接种后5-7天天然免疫和获得性免疫应答广泛激活,细胞因子表达升高尤其是Ⅰ型干扰素介导的信号通路激活,在28天时仍有细胞因子受体及炎症因子的表达上调；而痘病毒疫苗接种后前3天基本无基因表达改变,在第9-14天表达峰值时差异基因主要集中在淋巴细胞分化、T细胞活化、NF-κB信号通路调节、淋巴细胞归巢及天然免疫应答中应激性防御反应和树突状细胞趋化等,第28天时仍有持续性转录因子活化表达,TLR信号通路激活和T、B细胞活化调节。时间序列分析显示,黄热疫苗诱导的免疫应答相关基因及信号通路的变化模式较为复杂,而痘病毒疫苗诱导免疫相关基因的变化相对简单。结合转录因子调控预测分析,黄热病毒疫苗接种早期即诱导大量转录因子如STAT1、IRF9、IRF7、 FOS及JUNB等在不同时间点调控基因表达,而痘病毒疫苗诱导转录调控因子无显着性改变。本研究为HIV DNA疫苗免疫原性,优化佐剂筛选策略等提供了新途径,并为选择合适疫苗用病毒载体提供了新思路。
马晓林[8]（2013）在《细胞因子影响鼠卵透明带3 DNA疫苗免疫不育效果的研究》文中指出哺乳动物受精过程中,卵子表面的透明带3（ZP3）蛋白作为精子初级受体,参与精子与卵子的结合并诱发顶体反应。ZP3特异性抗体能够与天然的ZP3结合从而阻断精卵结合导致不育。利用ZP3作为抗原制备的疫苗来诱导免疫不育是人类理想的避孕手段,也是控制动物生育的人道之选。长期以来,人们尝试利用不同类型的不育疫苗、发送途径及免疫佐剂增强ZP3疫苗的免疫反应,以开发出高效的避孕疫苗。DNA疫苗是一种安全、廉价、易于生产及保存的疫苗类型,在病毒性疾病的预防和控制方面得到了广泛的应用。本实验室前期的研究结果表明,肌肉注射和滴鼻免疫鼠ZP3 （mZP3） DNA疫苗均能导致小鼠不育,但DNA疫苗激发的体液免疫反应较弱,需要通过添加免疫佐剂来增强免疫不育的效果。增强树突状细胞（dendritic cells, DCs）对DNA疫苗的递呈效率,是提高DNA疫苗免疫原性的关键。粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF）能够促进包括DCs在内的抗原递呈细胞（antigen presenting cells, APCs）对DNA疫苗的加工递呈,继而影响疫苗免疫反应的强度及类型。因此,本研究构建了鼠GM-CSF重组真核表达载体,通过尾静脉注射方式转染小鼠并用RT-PCR方法检测,确认了GM-CSF重组质粒在动物细胞中的有效表达。为验证GM-CSF对包括DCs在内的APCs递呈抗原活性的影响,将GM-CSF提前4d或同时与mZP3 DNA疫苗肌肉注射小鼠,检测共刺激因子CD80、CD83、CD86的表达情况。结果表明,GM-CSF能够促进肌肉注射部位及脾脏组织中共刺激因子的表达,GM-CSF与mZP3 DNA疫苗同时注射时共刺激因子表达水平最高。因此,GM-CSF能够促进APCs的成熟,增强DNA疫苗的免疫原性,GM-CSF和mZP3 DNA疫苗同时注射的共免疫策略可以用于后续不育疫苗的研究。此外,由2型辅助性T细胞（type 2 T helper cell, Th2）分泌的白细胞介素-5（interleukin-5,IL-5）在诱导体液免疫方面表现突出。本研究将GM-CSF质粒单独或与IL-5重组质粒联合免疫,来探讨这两种细胞因子对mZP3 DNA疫苗免疫不育效果的影响。在免疫接种GM-CSF 4d后,共免疫接种IL-5和mZP3 DNA疫苗,通过合笼实验来确定mZP3 DNA疫苗的抗生育效果；通过检测小鼠体液免疫和细胞免疫水平评价细胞因子作为佐剂的功效；以测定的树突状细胞的成熟状况确定GM-CSF质粒在免疫起始阶段所发挥的作用。研究表明,GM-CSF和IL-5共免疫能够显着提高由mZP3 DNA疫苗引起的体液免疫反应,表现为血清中IgG抗体及脾脏中CD4+T细胞表达IL-4的水平升高,且疫苗诱导的免疫反应没有对卵巢结构造成损伤。成熟DCs细胞表面标记MHC-II及CD-86分子表达水平上调表明,GM-CSF在DNA疫苗免疫的起始阶段发挥重要的辅助作用。这说明GM-CSF和IL-5联合免疫能够增强mZP3 DNA疫苗体液免疫反应,这种免疫方式够较为安全而有效的增强DNA疫苗的免疫原性。除了IL-5以外,白细胞介素-4（interleukin-4,IL-4）也能够增强DNA疫苗的体液免疫反应,且GM-CSF和IL-4两种重组细胞因子蛋白能够促进DCs在体外的存活及增殖。为研究GM-CSF质粒和IL-4质粒对mZP3 DNA疫苗免疫效果不育的影响,本研究将IL-4单独或与GM-CSF共免疫小鼠。结果表明,接种GM-CSF 4d后再同时免疫IL-4和mZP3DNA疫苗能够明显的降低小鼠的生育率。与mZP3单独免疫相比,初次免疫后第42d共免疫组小鼠血清中IgG抗体水平显着增高。说明GM-CSF和IL-4共免疫能够增强mZP3 DNA疫苗激发的体液免疫及不育。ZP3疫苗通过吸入或口服等粘膜途径给药是理想的免疫方式,为了提高粘膜系统对mZP3 DNA疫苗刺激的有效的应答,本研究采用壳聚糖作为发送载体,通过滴鼻免疫GM-CSF的方式,研究其对mZP3 DNA疫苗粘膜免疫不育效果的影响。结果表明,GM-CSF质粒先于mZP3 DNA疫苗4d滴鼻免疫,能够有效的增强血清中ZP3特异性IgG和生殖道洗液中分泌性IgA（sIgA）的水平。GM-CSF质粒通过促进树突状细胞的成熟,增强了由mZP3 DNA疫苗诱导的Th2型免疫反应。更重要的是,GM-CSF与mZP3 DNA滴鼻共免疫在不影响正常卵泡发育的情况下,降低了小鼠的生育率及平均窝仔数。说明GM-CSF作为粘膜佐剂能够促进mZP3 DNA疫苗免疫不育的效果。GM-CSF和IL-5具有相同的细胞表面受体,在发挥免疫调节作用中具有协同效应。肌肉注射途径已经证明GM-CSF和IL-5共免疫能够增强mZP3DNA疫苗的抗生育效果。本研究通过滴鼻共免疫GM-CSF和IL-5,探讨其对mZP3 DNA疫苗粘膜免疫不育效果的影响。结果表明,GM-CSF滴鼻免疫4d后,再同时免疫mZP3和IL-5能够有效增强血清中IgG的水平,但生殖道洗液中sIgA的水平无明显变化,只是IL-5+mZP3免疫组sIgA的水平最高。合笼实验表明,虽然GM-CSF和IL-5共免疫能够降低小鼠的生育率,但平均窝仔数并没有显着地减少,说明GM-CSF和IL-5滴鼻共免疫对mZP3 DNA疫苗的抗生育效果的影响并不明显,这与肌肉免疫的结果不一致。由于IL-5单独或与GM-CSF共免疫都能够增强mZP3 DNA疫苗滴鼻免疫的抗体水平,其抗生育的效果需要进一步研究。结论：本研究通过肌肉注射和滴鼻免疫途径分别研究了GM-CSF,IL-4和IL-5对mZP3 DNA疫苗免疫不育效果的影响。其中,注射GM-CSF 4d后再注射IL-5+mZP3的免疫方式是开发系统免疫不育疫苗较为安全有效的免疫策略；而滴鼻GM-CSF 4d后再免疫mZP3的免疫方式是开发粘膜免疫不育疫苗较为安全有效的免疫策略。
刘燕瑜[9]（2012）在《Quil A、PICKCa对FMDV、PCV2-PRRSV DNA疫苗免疫增强作用的效果观察》文中指出Quil A是从南美Quillaja皂莫利纳的树皮中提取的三萜皂苷，通过高效液相色谱分析包含至少5种不同的皂苷，是一种表面活性剂，易溶于水、稳定、表面活性较好，是具有辅助属性的皂苷。1936年，第一次作为佐剂由Thibaulu和Richou部署在兽用疫苗，随之被发展起来。PICKCa是一种改进的佐剂，是复杂的基于聚肌胞核苷酸制定的，聚肌胞本身对人体有毒性作用，但同时也具有强烈的佐剂作用，卡那霉素和氯化钙能迅速水解于其中。作为一个带正电的分子，卡那霉素能够中和聚肌胞的负电荷，使聚肌胞更稳定，抗水解。添加氯化钙则有利于聚肌胞进入细胞。总之，PICKCa是一种稳定安全的佐剂。探讨QuilA、PICKCa及二者联合使用对实验动物免疫应答的调节作用，分别给小鼠、猪注射QuilA、PICKCa及二者混合物，于注射后不同时间采血，检测细胞因子水平；注射后第7d检测猪T淋巴细胞的体外增殖反应。实验结果表明小鼠和猪在注射药物之后均未出现任何不良反应；实验组动物的IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平均显着高于对照组；猪T淋巴细胞体外增殖能力也显着高于对照组。说明QuilA、PICKCa对小鼠和猪具有良好的免疫调节作用，是具有良好应用前景的免疫佐剂。为研究Quil A对O型口蹄疫DNA疫苗的免疫增强作用，在FMD核酸疫苗pVIRIL18P1中加入Quil A，经肌肉注射免疫猪，检测猪VP1结构蛋白抗体及细胞因子水平，观察T淋巴细胞增殖情况，并与无佐剂组进行比较。结果表明，首免用猪口蹄疫核酸疫苗pVIRIL18P1及二免用重组鸡痘疫苗vUTAL3CP1中加入Quil A，两次免疫后抗体水平、细胞因子水平及T淋巴细胞增殖率都显着升高，与空白对照组比较差异显着（P<0.05）甚至极显着（P<0.01），与未加佐剂组及商品化疫苗比较有显着差异。表明Quil A对O型口蹄疫DNA疫苗具有较好的免疫增强作用。为研究PICKCa对猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病二联核酸疫苗的免疫增强效果，在二联核酸疫苗pIRES-ORF2-ORF5m-ORF6a中加入PICKCa，经肌肉注射免疫猪，检测猪繁殖与呼吸综合征和猪2型圆环病毒病病毒抗体及细胞因子水平，观察T淋巴细胞增殖情况，并与无佐剂组进行比较。猪体免疫试验结果证明，构建的重组核酸疫苗加以PICKCa均能刺激实验猪产生PRRSV、PCV2抗体。细胞免疫检测结果表明PRRSV、PCV2特异性T淋巴细胞增殖、IFN-γ和IL-2分泌水平显着提高、CTL杀伤活性增强，表明其能够介导较好的Th1类免疫反应。重组核酸疫苗免疫猪的组织器官无病理损伤，可以防止猪体病毒血症的出现。攻毒保护实验证明，添加PICKCa佐剂的重组核酸疫苗对实验猪起到明显的免疫保护提升作用。
狄静[10]（2012）在《佐剂对HIV-1 gp120 DNA疫苗免疫效果的影响》文中研究指明艾滋病（Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS）又称获得性免疫缺陷综合征，是由人类免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus，HIV）引起的一种传染性及病死率非常高的疾病，世界上每年大约有200多万人死于艾滋病，感染人群在全世界分布极为广泛。在研制的各种HIV疫苗中，普遍认为DNA疫苗是一种具有发展潜力的新型疫苗，因为它可被直接转染进机体细胞内并且表达抗原蛋白，这样减少了体外进行蛋白表达和纯化的过程；质粒DNA结构简单，提纯质粒工艺简便，适合大规模生产。虽然DNA疫苗存在很多优势，但是HIV DNA疫苗的临床试验还没有成功的例子，主要原因即为HIV DNA疫苗的免疫原性较差，如何提高DNA疫苗的免疫效果仍是亟待解决的问题。近年来，对DNA疫苗的研究实验结果表明，佐剂可以显着提高DNA疫苗在机体内的免疫原性，增强疫苗的免疫效果。在本课题中，我们用HIV-1gp120DNA疫苗与实验室现有的一些佐剂联合免疫BALB/c小鼠，用间接ELISA法检测小鼠血清中抗gp120特异性IgG抗体水平，评价不同佐剂对HIV-1gp120DNA疫苗免疫效果的影响。在本实验中所用的HIV-1gp120DNA疫苗为中国疾病控制中心（CDC）构建的两种质粒pENVPOL （简称EP）和pGAGTNR（简称GT），为高纯度质粒DNA，不能含有宿主DNA，RNA以及蛋白质等杂质。而在实验室广泛应用的提取质粒DNA的方法为传统碱裂解法，这种方法主要采用酚氯仿等有机试剂抽提蛋白质以及RNA酶消化RNA，最终所提取的质粒DNA无法满足动物注射级应用的DNA疫苗的标准。在实验室现有的条件下，我们如何获取制备DNA疫苗的工艺方法是迫切解决的问题。在本课题研究的第一部分即为摸索一种经济、简便的方法从而大量制备符合动物实验应用的DNA疫苗。首先尝试了一些简便的提取质粒的实验操作，这些操作都是在碱裂解法的基础上进行改进的，通过各种实验方法的比较最终获得了一种最为有效的提取质粒DNA的方法。该方法主要为传统碱裂解法与氯化钙、PEG8000试剂相结合提取质粒DNA，氯化钙可选择性沉淀质粒中的大量RNA，PEG8000可选择性沉淀超螺旋质粒DNA。此方法大大降低了质粒中蛋白质、宿主RNA、基因组DNA、有机物质等杂质的残留。将所提取的质粒粗提液通过Q Sepharose F.F.强阴离子交换柱去除内毒素，最终制备了约7mg的HIV-1gp120双质粒DNA（内毒素<0.05EU/μg，浓度为2μg/μl）。经各项检测指标判断，质粒DNA的纯度以及含量均已满足后续动物实验应用的要求，并且制备DNA疫苗的成本低廉，操作简便，适合实验室应用。大量实验证明佐剂能够增强DNA疫苗的免疫原性，我们选用佐剂MF59、CpGODN、WFR联合EP+GT（质粒DNA）免疫BALB/c小鼠，随机分为4组：EP+GT；MF59+EP+GT；CpG ODN+MF59+EP+GT；WFR+EP+GT。每组6只小鼠，采用胫前肌肉注射的方式免疫，一共免疫三次，每次间隔2周。分别在不同时间点取小鼠血清，用间接ELISA方法检测小鼠血清中抗gp120特异性IgG体液免疫应答，结果表明应用WFR佐剂组的小鼠体液免疫应答水平与其他各组相比效果较好。在初次免疫后的56天用MTT法检测WFR+EP+GT组、EP+GT组及空白对照组小鼠脾细胞增殖能力，结果表明，gp120多肽对各组小鼠脾细胞均有刺激作用，用终浓度为1μg/ml gp120多肽比用10μg/ml gp120多肽更易刺激体外脾细胞的增殖情况，但是并无统计学差异。在有或无gp120多肽刺激的条件下，EP+GT+WFR组小鼠脾细胞的增殖程度均大于EP+GT组小鼠及健康空白小鼠的脾细胞增殖程度，具有统计学意义。用PFR佐剂免疫小鼠，随机分为2组：EP+GT，PFR+EP+GT，每组7只，分三次胫前肌肉注射免疫，间隔2周，分别在不同时间点检测小鼠体内针对gp120多肽的特异IgG体液免疫应答。结果发现PFR+EP+GT组的小鼠与单独应用质粒组的小鼠相比对抗原刺激产生更显着的体液免疫应答，并且在免疫后87天两组小鼠血清中抗gp120抗体仍然维持较高水平。本研究主要通过对提取质粒方法学的摸索，获得了一种制备动物实验应用的DNA疫苗的简便方法。将不同佐剂与HIV-1gp120DNA疫苗联合应用，结果表明WFR、PFR佐剂具有增强DNA疫苗免疫原性的作用，为进一步对该佐剂的深入研究提供了实验基础。
二、细胞因子佐剂对HIV DNA疫苗免疫效果的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞因子佐剂对HIV DNA疫苗免疫效果的影响（论文提纲范文）
（1）佐剂在新冠疫苗和HIV疫苗的研发探索（论文提纲范文）
| 第一篇 MDP佐剂在新冠疫苗中的研究 |
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二篇 微纳尺度表面工程化技术用于HIV疫苗佐剂研发 |
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结和展望 |
| 综述 纳米粒子的表面修饰在疫苗佐剂开发中的应用 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 附件 |
| 致谢 |
（2）胞壁酰二肽的HIV DNA疫苗佐剂效应研究和原发性胆汁性胆管炎的临床病理研究（论文提纲范文）
| 第一篇 胞壁酰二肽的HIV DNA疫苗佐剂效应研究 |
| 第一篇 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 DNA疫苗佐剂研究进展 |
| 参考文献 |
| 第二篇 原发性胆汁性胆管炎的临床病理研究 |
| 第二篇 缩略词表(以字母顺序排列) |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 原发性胆汁性胆管炎自身抗体的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）细胞因子辅助免疫的抗体制备与应用及基于亲和力的免疫检测灵敏度研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要符号表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 免疫检测技术相关研究 |
| 1.2.1 免疫荧光分析技术 |
| 1.2.2 免疫层析技术 |
| 1.2.3 酶联免疫吸附 |
| 1.2.4 电化学免疫分析 |
| 1.2.5 化学发光免疫分析技术 |
| 1.2.6 数字化单分子免疫分析技术 |
| 1.3 单克隆抗体制备技术 |
| 1.3.1 鼠单克隆抗体 |
| 1.3.2 嵌合抗体 |
| 1.3.3 噬菌体展示技术 |
| 1.3.4 基因工程小鼠制备完全人源化抗体技术 |
| 1.4 DNA免疫制备单克隆抗体技术 |
| 1.4.1 DNA免疫技术诱导宿主免疫反应的机制 |
| 1.4.2 DNA免疫制备单克隆抗体的优点 |
| 1.4.3 DNA免疫制备单克隆抗体的技术要点 |
| 1.5 免疫佐剂研究进展 |
| 1.5.1 免疫佐剂的作用机理 |
| 1.5.2 传统免疫佐剂 |
| 1.5.3 细胞因子免疫佐剂 |
| 1.6 抗原表位分析技术进展 |
| 1.6.1 生物信息学软件预测 |
| 1.6.2 肽扫描技术 |
| 1.6.3 氨基酸定点突变技术 |
| 1.6.4 噬菌体展示技术 |
| 1.7 和肽素临床研究 |
| 1.7.1 和肽素与心血管疾病 |
| 1.7.2 和肽素与糖尿病、肾病 |
| 1.7.3 和肽素与脓毒血症 |
| 1.7.4 和肽素与其他疾病 |
| 1.8 抗缪勒氏管激素临床研究 |
| 1.8.1 AMH与卵巢储备功能 |
| 1.8.2 AMH在预测卵巢反应性中的作用 |
| 1.8.3 AMH和妊娠结局 |
| 1.9 研究的目的、意义和内容 |
| 1.9.1 本研究的目的及意义 |
| 1.9.2 研究的内容 |
| 1.9.3 技术路线 |
| 第二章 细胞因子表达载体的构建及鉴定 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料与仪器 |
| 2.2.1 细胞株与载体质粒 |
| 2.2.2 仪器与设备 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 主要溶液配制 |
| 2.3 细胞因子重组质粒的构建 |
| 2.3.1 目的基因的合成与鉴定 |
| 2.3.2 重组质粒的构建及鉴定 |
| 2.3.3 重组质粒真核表达鉴定 |
| 2.4 结果与分析 |
| 2.4.1 酶切鉴定及测序 |
| 2.4.2 真核表达鉴定 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 细胞因子辅助DNA免疫制备抗缪勒氏管激素单克隆抗体及应用 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料与仪器 |
| 3.2.1 实验试剂 |
| 3.2.2 主要仪器设备 |
| 3.2.3 动物、抗原、细胞及血清样本 |
| 3.2.4 主要溶液配制 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 免疫策略 |
| 3.3.2 间接ELISA评价免疫效果 |
| 3.3.3 细胞融合 |
| 3.3.4 筛选及亚克隆 |
| 3.3.5 腹水制备及抗体亚类分析 |
| 3.3.6 腹水的效价检测及纯化 |
| 3.3.7 抗体的纯度和效价的测定 |
| 3.3.8 抗体亲和力测定 |
| 3.3.9 mAb-MPs及 AP-mAbs的制备 |
| 3.3.10 最佳抗体配对的筛选 |
| 3.3.11 全自动化学发光检测方法的建立 |
| 3.3.12 方法学优化和评价 |
| 3.3.13 统计分析 |
| 3.4 结果与分析 |
| 3.4.1 免疫效果评价 |
| 3.4.2 腹水中抗体亚型分析 |
| 3.4.3 腹水效价检测 |
| 3.4.4 纯化抗体SDS-PAGE分析 |
| 3.4.5 纯化抗体效价检测 |
| 3.4.6 纯化抗体亲和力表征 |
| 3.4.7 全自动化学发光分析方法的构建 |
| 3.4.8 全自动化学发光分析方法的评价 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 细胞因子辅助皮下免疫制备高亲和力抗和肽素单克隆抗体及表征 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料与仪器 |
| 4.2.1 实验试剂 |
| 4.2.2 主要仪器设备 |
| 4.2.3 动物、抗原及细胞 |
| 4.2.4 主要溶液配制 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 免疫策略 |
| 4.3.2 免疫效果评价 |
| 4.3.3 细胞融合、筛选及亚克隆 |
| 4.3.4 融合阳性率及稳定株数计算 |
| 4.3.5 腹水制备及抗体亚类分析 |
| 4.3.6 腹水抗体效价评价 |
| 4.3.7 腹水的纯化 |
| 4.3.8 抗体的纯度和效价的测定 |
| 4.3.9 免疫细胞化学鉴定 |
| 4.3.10 抗体亲和力表征及比较 |
| 4.4 结果与分析 |
| 4.4.1 免疫效果评价 |
| 4.4.2 腹水抗体亚型分析 |
| 4.4.3 腹水效价检测 |
| 4.4.4 纯化效果鉴定 |
| 4.4.5 抗体效价 |
| 4.4.6 特异性识别天然抗原鉴定 |
| 4.4.7 抗体亲和力检测及比较 |
| 4.5 小结 |
| 第五章 抗原表位氨基酸对免疫反应亲和力的影响 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 实验材料与仪器 |
| 5.2.1 实验试剂 |
| 5.2.2 主要仪器设备 |
| 5.2.3 主要溶液配制 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 抗原表位生物信息学分析 |
| 5.3.2 间接ELISA初步表位定位 |
| 5.3.3 肽扫描精确定位抗原表位 |
| 5.3.4 间接ELISA分析表位氨基酸 |
| 5.3.5 动力学方法分析表位氨基酸 |
| 5.4 结果与分析 |
| 5.4.1 IEDB分析CPP表位结果 |
| 5.4.2 DNAStar分析CPP抗原表位结果 |
| 5.4.3 抗原表位初步定位结果 |
| 5.4.4 抗原表位精确扫描结果 |
| 5.4.5 肽突变体间接ELISA结果与分析 |
| 5.4.6 肽突变体与抗体反应动力学分析 |
| 5.5 小结 |
| 第六章 竞争法免疫检测中竞争抗原与抗体的亲和力对检测灵敏度的影响 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 实验材料与仪器 |
| 6.2.1 主要试剂 |
| 6.2.2 主要仪器设备 |
| 6.2.3 主要溶液配液方法 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 改造竞争抗原亲和力分析 |
| 6.3.2 免疫荧光微球的制备及表征 |
| 6.3.3 CPP竞争免疫荧光层析检测体系的构建 |
| 6.3.4 CPP间接竞争ELISA检测体系的构建 |
| 6.3.5 竞争抗原亲和力变化对灵敏度的影响分析 |
| 6.4 结果与分析 |
| 6.4.1 改造竞争抗原亲和力表征结果 |
| 6.4.2 免疫荧光微球的表征 |
| 6.4.3 荧光免疫层析检测卡的优化 |
| 6.4.4 免疫层析检测体系灵敏度改善效果评价 |
| 6.4.5 间接竞争ELISA检测体系的优化结果 |
| 6.4.6 间接ELISA检测体系灵敏度改善效果 |
| 6.5 小结 |
| 第七章 高灵敏全自动和肽素化学发光免疫检测法的构建 |
| 7.1 引言 |
| 7.2 实验材料与仪器 |
| 7.2.1 实验试剂 |
| 7.2.2 主要仪器设备 |
| 7.2.3 样本的采集与保存 |
| 7.3 实验方法 |
| 7.3.1 免疫磁珠及酶标抗体的制备 |
| 7.3.2 全自动化学发光检测方法的建立 |
| 7.3.3 分析方法学优化 |
| 7.3.4 统计分析 |
| 7.4 结果与分析 |
| 7.4.1 最佳抗体配对的优化 |
| 7.4.2 AP-mAbs和 mAb-MPs优化 |
| 7.4.3 基质缓冲液溶液的pH和孵育时间优化 |
| 7.4.4 标准校正曲线建立 |
| 7.4.5 精密度、准确性、稳定性分析 |
| 7.4.6 特异性分析 |
| 7.4.7 与商品ELISA试剂盒对比分析 |
| 7.5 小结 |
| 结论与展望 |
| 一、结论 |
| 二、创新点 |
| 三、展望与不足 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ测序结果 |
| 攻读博士学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 附件 |
（4）H7亚型禽流感DNA疫苗及其免疫佐剂的初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 1 绪论 |
| 1.1 禽流感病毒近年来的流行概况 |
| 1.2 禽流感疫苗的研究 |
| 1.3 提高DNA疫苗免疫效果的策略 |
| 1.4 DNA疫苗的免疫佐剂 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 禽流感病毒 |
| 2.1.2 ChIFN-α、ChIL-2、DuIFN-α、DuIL-2 基因及质粒 |
| 2.1.3 载体与感受态细胞 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.1.5 主要试剂盒 |
| 2.1.6 工具酶 |
| 2.1.7 主要试剂 |
| 2.1.8 主要仪器和设备 |
| 2.1.9 常用试剂的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 基因的获取及优化 |
| 2.2.1.1 HA基因的获取及优化 |
| 2.2.1.2 鸡IFN-α 和IL-2 基因的优化及获取 |
| 2.2.1.3 含HIS标签的鸭IFN-α 和IL-2 基因的优化及获取 |
| 2.2.2 质粒的构建及抽提 |
| 2.2.2.1 H7亚型DNA疫苗质粒的构建及抽提 |
| 2.2.2.2 重组质粒pCKopChIFN-α、pCKopChIL-2 的构建及抽提 |
| 2.2.2.3 重组质粒pCKopDuIFN-α+HIS、pCKopDuIL2+HIS的构建及抽提 |
| 2.2.3 重组质粒的体外表达检测 |
| 2.2.4 SPF鸡的免疫 |
| 2.2.5 HI 抗体检测 |
| 2.2.6 攻毒试验 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 H7亚型AIV的HA基因的RT-PCR扩增结果 |
| 3.2 基因密码子优化结果 |
| 3.2.1 H7亚型AIV的HA基因的密码子优化结果 |
| 3.2.2 ChIFN-α 基因的密码子优化结果 |
| 3.2.3 ChIL-2 基因的密码子优化结果 |
| 3.2.4 DuIFN-α 基因的密码子优化结果 |
| 3.2.5 DuIL-2 基因的密码子优化结果 |
| 3.3 重组质粒的构建和鉴定 |
| 3.3.1 重组质粒pCKHA7和pCKopHA7的构建和鉴定 |
| 3.3.2 重组质粒pCKChIFN-α 和pCKopChIFN-α 的构建和鉴定 |
| 3.3.3 重组质粒pCKChIL-2 和pCKopChIL-2 的构建和鉴定 |
| 3.3.4 重组质粒pCKopDuIFN-α+HIS的构建和鉴定 |
| 3.3.5 重组质粒pCKopDuIL-2+HIS的构建和鉴定 |
| 3.4 重组质粒体外表达结果 |
| 3.4.1 HA7基因重组质粒Western blot检测结果分析 |
| 3.4.2 鸡IFN-α 和IL-2 基因重组质粒Western blot检测结果分析 |
| 3.4.3 鸭IFN-α 和IL-2 基因重组质粒Western blot检测结果分析 |
| 3.5 抗体检测结果 |
| 3.6 攻毒试验结果 |
| 4 讨论 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（5）HIV-1通用型gp120DNA疫苗的制备及免疫原性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩写对照表 |
| 第一章 前言 |
| 1.1 HIV与 AIDS |
| 1.2 HIV-1 基因组和分型 |
| 1.2.1 HIV-1 基因组 |
| 1.2.2 HIV-1 分型 |
| 1.2.3 Env基因和gp120 |
| 1.3 HIV DNA疫苗的研究 |
| 1.3.1 DNA疫苗的免疫原理 |
| 1.3.2 影响DNA疫苗的免疫效果的因素 |
| 1.4 研究的目的和意义 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 载体和菌种 |
| 2.1.2 细胞 |
| 2.1.3 抗体 |
| 2.1.4 实验动物 |
| 2.1.5 主要试剂 |
| 2.1.6 主要仪器 |
| 2.1.7 主要试剂以及培养基的配制 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 HIV-1 gp120 DNA疫苗的制备与鉴定 |
| 2.2.2 HIV-1 Env抗体ELISA检测方法的建立 |
| 2.2.3 HIV-1 假病毒的构建及滴度的测定 |
| 2.2.4 gp120 DNA疫苗对小鼠的免疫效果评价 |
| 2.2.5 gp120 DNA疫苗不同免疫方法对兔的免疫效果评价 |
| 第三章 结果 |
| 3.1 HIV-1 gp120 DNA疫苗的制备与鉴定 |
| 3.1.1 重组质粒双酶切鉴定 |
| 3.1.2 HIV-1 gp120 氨基酸序列 |
| 3.1.3 Western blot鉴定gp120 蛋白表达 |
| 3.2 HIV-1 Env抗体ELISA检测方法的建立 |
| 3.3 假病毒滴度的测定 |
| 3.4 gp120 DNA疫苗对鼠的免疫效果评价 |
| 3.4.1 小鼠临床体征的观测 |
| 3.4.2 gp120 DNA疫苗诱导小鼠HIV特异性抗体测定 |
| 3.4.3 免疫鼠血清对假病毒的中和效果 |
| 3.5 gp120 DNA疫苗不同免疫条件对实验兔免疫效果的评价 |
| 3.5.1 兔临床体征的观测 |
| 3.5.2 不同免疫条件对实验兔特异性抗体的检测结果 |
| 3.5.3 不同免疫条件对假病毒的中和效果评价 |
| 第四章 讨论 |
| 4.1 HIV-1 通用型gp120 DNA疫苗的制备及鉴定 |
| 4.2 假病毒和DNA疫苗免疫效果的评价方法 |
| 4.3 免疫条件与gp120 DNA疫苗免疫效果的关系 |
| 4.3.1 Imiquimod局部涂擦佐剂与免疫效果的关系 |
| 4.3.2 DNA疫苗导入方法对免疫效果的影响 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 致谢 |
| 附录1 pVAX1 表达载体 |
| 附录2 ConS和 ConTAE序列设计引物 |
| 附录3 |
（6）EEEV/WEEV病毒样颗粒疫苗和DNA疫苗的构建及实验免疫研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 引言 |
| 2 病毒样颗粒研究进展 |
| 2.1 病毒样颗粒的形成 |
| 2.2 病毒样颗粒的免疫原性 |
| 2.2.1 树突状细胞与病毒样颗粒 |
| 2.2.2 B淋巴细胞与病毒样颗粒 |
| 2.2.3 T淋巴细胞与病毒样颗粒 |
| 2.3 病毒样颗粒的种类 |
| 2.3.1 无囊膜的病毒样颗粒 |
| 2.3.2 囊膜型病毒样颗粒 |
| 2.4 病毒样颗粒的应用 |
| 2.4.1 病毒样颗粒作为分子载体 |
| 2.4.2 在基础研究和免疫测定中的应用 |
| 2.4.3 在疫苗方面的应用 |
| 2.5 结束语 |
| 3 核酸疫苗研究进展 |
| 3.1 核酸疫苗的构建 |
| 3.1.1 目的基因选择与获得 |
| 3.1.2 表达载体的选择 |
| 3.1.3 重组表达载体的获得 |
| 3.2 核酸疫苗的免疫机理 |
| 3.2.1 CpG基序与TLR9 |
| 3.2.2 DNA疫苗与AIM2 |
| 3.2.3 DNA疫苗与DAI |
| 3.2.4 DNA疫苗与其它传感器分子 |
| 3.3 核酸疫苗的佐剂 |
| 3.3.1 细胞因子佐剂 |
| 3.3.2 CpG佐剂 |
| 3.3.3 Poly(I:C)佐剂 |
| 3.4 核酸疫苗免疫方法 |
| 3.5 核酸疫苗的优点及存在问题 |
| 3.5.1 核酸疫苗存在的优点 |
| 3.5.2 核酸疫苗存在的问题 |
| 3.6 核酸疫苗的展望 |
| 4 实验一、EEEV/WEEV假病毒中和试验的建立 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 主要试剂 |
| 4.1.2 细菌、质粒、细胞 |
| 4.1.3 设备和仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 重组质粒的构建与鉴定 |
| 4.2.2 假病毒的包装与鉴定 |
| 4.2.3 假病毒感染滴度的测定 |
| 4.2.4 假病毒感染的抑制实验 |
| 4.2.5 假病毒中和试验的建立 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 目的基因扩增结果 |
| 4.3.2 重组质粒的鉴定结果 |
| 4.3.3 假病毒的获得与鉴定 |
| 4.3.4 假病毒感染滴度的测定 |
| 4.3.5 假病毒感染的抑制实验 |
| 4.3.6 假病毒中和试验的建立 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 5 实验二、EEEV病毒样颗粒疫苗的构建、鉴定与实验免疫研究 |
| 5.1 材料 |
| 5.1.1 菌种、质粒和细胞 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 家蚕细胞培养基 |
| 5.1.4 设备和仪器 |
| 5.1.5 实验动物 |
| 5.2 方法 |
| 5.2.1 重组杆状病毒基因组的获得 |
| 5.2.2 细胞转染与重组杆状病毒的获得 |
| 5.2.3 病毒样颗粒的表达与鉴定 |
| 5.2.4 动物免疫 |
| 5.2.5 免疫检测 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 目的基因扩增结果 |
| 5.3.2 重组质粒鉴定结果 |
| 5.3.3 重组杆状病毒基因组的鉴定结果 |
| 5.3.4 病毒样颗粒表达鉴定结果 |
| 5.3.5 病毒样颗粒免疫实验结果 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 6 实验三、WEEV病毒样颗粒疫苗的构建、鉴定与实验免疫研究 |
| 6.1 材料 |
| 6.1.1 质粒、菌种和细胞 |
| 6.1.2 主要试剂 |
| 6.1.3 昆虫细胞培养基 |
| 6.1.4 设备和仪器 |
| 6.1.5 实验动物 |
| 6.2 方法 |
| 6.2.1 重组杆状病毒基因组的获得 |
| 6.2.2 细胞转染与重组杆状病毒的获得 |
| 6.2.3 病毒样颗粒的表达与鉴定 |
| 6.2.4 病毒样颗粒的免疫原性研究 |
| 6.2.5 免疫指标的检测 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 目的基因扩增结果 |
| 6.3.2 重组质粒鉴定结果 |
| 6.3.3 重组杆状病毒基因组的鉴定结果 |
| 6.3.4 病毒样颗粒表达鉴定结果 |
| 6.3.5 病毒样颗粒免疫实验结果 |
| 6.4 讨论 |
| 6.5 小结 |
| 7 实验四、EEEV DNA疫苗的构建、鉴定与免疫原性研究 |
| 7.1 材料 |
| 7.1.1 细胞、细菌、质粒与实验动物 |
| 7.1.2 主要试剂 |
| 7.1.3 设备和仪器 |
| 7.2 方法 |
| 7.2.1 重组表达载体构建与鉴定 |
| 7.2.2 重组质粒的转染与表达蛋白鉴定 |
| 7.2.3 动物免疫 |
| 7.2.4 免疫指标检测 |
| 7.3 结果 |
| 7.3.1 目的基因扩增 |
| 7.3.2 重组质粒的鉴定结果 |
| 7.3.3 重组质粒表达的鉴定 |
| 7.3.4 重组质粒的免疫原性检测 |
| 7.4 讨论 |
| 7.5 小结 |
| 8 实验五、WEEV DNA疫苗的构建、鉴定与免疫原性研究 |
| 8.1 材料 |
| 8.1.1 主要试剂 |
| 8.1.2 细菌、质粒、细胞与实验动物 |
| 8.1.3 设备与仪器 |
| 8.2 方法 |
| 8.2.1 重组表达载体构建与鉴定 |
| 8.2.2 重组质粒的转染与表达蛋白鉴定 |
| 8.2.3 动物免疫 |
| 8.2.4 免疫指标检测 |
| 8.3 结果 |
| 8.3.1 目的基因扩增 |
| 8.3.2 重组质粒的鉴定结果 |
| 8.3.3 目的蛋白表达的鉴定 |
| 8.3.4 重组质粒的免疫原性检测 |
| 8.4 讨论 |
| 8.5 小结 |
| 9 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（7）HIV-1 DNA疫苗佐剂及两种病毒载体基因表达谱研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写词 |
| 前言 |
| (一) DNA疫苗佐剂发展概述 |
| (二) 化合物类佐剂 |
| (三) 基因佐剂 |
| (四) 病毒性疫苗载体的“佐剂”效应 |
| (五) 本研究主要内容 |
| 第一部分 HIV-1 DNA疫苗佐剂研究 |
| 实验材料与方法 |
| (一) 实验材料 |
| (二) 实验方法 |
| 实验结果 |
| (一) 五种佐剂免疫效果评价 |
| (二) CyPA基因佐剂免疫效果评价 |
| 第一部分 结论 |
| 第二部分 黄热病毒载体及痘病毒载体基因表达谱研究 |
| 引言 |
| 实验材料与方法 |
| (一) 研究对象及方案概述 |
| (二) 实验材料 |
| (三) 实验方法 |
| 实验结果 |
| (一) 病毒疫苗体外刺激BMDC激活TLR信号通路情况 |
| (二) 芯片数据质控分析及预处理 |
| (三) 差异基因挑选及后续功能分析 |
| (四) 时间序列分析 |
| (五) 转录因子比较分析 |
| 第二部分 结论 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 黄热病毒减毒活疫苗系统疫苗学特点及以其为载体的嵌合疫苗发展 |
| 参考文献 |
| 个人简历 |
| 发表文章目录 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）细胞因子影响鼠卵透明带3 DNA疫苗免疫不育效果的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一部分 文献综述 |
| 第一章 卵透明带不育疫苗的研究进展 |
| 引言 |
| 1 不同ZP疫苗类型及其免疫不育的效果 |
| 1.1 蛋白疫苗 |
| 1.2 病毒疫苗 |
| 1.3 DNA疫苗 |
| 2 细胞因子佐剂对DNA疫苗的影响 |
| 2.1 GM-CSF对DNA疫苗的影响 |
| 2.2 细胞因子IL-4和IL-5对DNA疫苗的影响 |
| 3 增强DNA疫苗粘膜免疫原性 |
| 4 降低ZP疫苗引起的卵巢炎 |
| 5 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 第二章 GM-CSF调控树突状细胞的发育与功能 |
| 引言 |
| 1 树突状细胞的分类、分布及功能 |
| 1.1 迁移性DCs的抗原捕获与递呈 |
| 1.2 类浆细胞DCs的抗原捕获与递呈 |
| 1.3 淋巴固有DCs抗原捕获与递呈 |
| 2 GM-CSF对DC亚群发育的影响 |
| 3 GM-CSF调控DC发育的分子机制 |
| 4 GM-CSF的临床应用 |
| 5 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究正文 |
| 第一章 细胞因子对小鼠卵透明带3 DNA疫苗肌肉免疫效果的影响 |
| 第一节 GM-CSF重组质粒的构建及其对APCS抗原递呈活性的影响 |
| 引言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 质粒 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 主要试剂 |
| 1.4 GM-CSF基因重组质粒的构建及鉴定 |
| 1.4.1 PCR引物的设计合成 |
| 1.4.2 脾脏总RNA的提取 |
| 1.4.3 反转录 |
| 1.4.4 GM-CSF基因片段的PCR扩增 |
| 1.4.5 双酶切 |
| 1.4.6 PCR产物胶回收 |
| 1.4.7 连接反应 |
| 1.4.8 重组质粒转化大肠杆菌 |
| 1.5 质粒DNA的大量制备、鉴定、纯化与定量 |
| 1.6 重组质粒肝脏转染及表达检测 |
| 1.6.1 尾静脉高压水动力转染 |
| 1.6.2 重组质粒在小鼠肝脏中的表达检测 |
| 1.7 GM-CSF对肌肉中APCs成熟的影响 |
| 1.7.1 重组质粒肌肉注射免疫小鼠 |
| 1.7.2 肌肉组织总RNA的提取及CD80分子的表达检测 |
| 1.8 肌肉注射GM-CSF对脾脏APCs成熟的影响 |
| 1.8.1 重组质粒肌肉注射免疫小鼠 |
| 1.8.2 脾脏组织总RNA的提取及共刺激分子的表达检测 |
| 1.9 数据统计 |
| 2 结果 |
| 2.1 小鼠GM-CSF真核表达载体的构建 |
| 2.2 重组质粒pcD-GM-CSF质粒在小鼠肝脏内的表达 |
| 2.3 mZP3 DNA疫苗的双酶切鉴定 |
| 2.4 GM-CSF对注射部位APCs成熟的影响 |
| 2.5 GM-CSF对脾脏APCs成熟的影响 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 肌肉注射GM-CSF和IL-5对mZP3 DNA疫苗免疫不育效果的影响 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 质粒和菌株 |
| 1.2 实验动物及抗体 |
| 1.3 生化试剂 |
| 1.4 mZP3融合蛋白的诱导表达及定量 |
| 1.5 mZP3蛋白Western blotting |
| 1.6 IL-5重组质粒的构建 |
| 1.7 重组质粒在小鼠肝脏中的表达检测 |
| 1.8 实验动物的免疫 |
| 1.9 合笼方法 |
| 1.10 卵巢组织学分析 |
| 1.11 抗体检测 |
| 1.12 T细胞增殖 |
| 1.13 细胞因子染色 |
| 1.14 流式细胞术检测DCs表面分子 |
| 1.15 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 mZP3蛋白的原核表达及Western blot鉴定 |
| 2.2 重组质粒pcD-IL-5的构建、大量制备及鉴定 |
| 2.3 重组质粒pcD-IL-5质粒在动物肝脏内的表达 |
| 2.4 肌肉注射GM-CSF和IL-5对mZP3 DNA疫苗生育率的影响 |
| 2.5 GM-CSF与IL-5对mZP3 DNA疫苗诱导的体液免疫的影响 |
| 2.6 卵巢形态学观察 |
| 2.7 细胞免疫反应 |
| 2.8 流式检测细胞因子的表达 |
| 2.9 GM-CSF促进DCs的成熟 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三节 肌肉免疫GM-CSF和IL-4 对mZP3 DNA疫苗免疫不育的影响 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 质粒和菌株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 生化试剂 |
| 1.4 IL-4重组质粒的构建 |
| 1.5 实验动物的免疫 |
| 1.6 合笼方法 |
| 1.7 抗体检测 |
| 1.8 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 重组质粒pcD-IL-4的构建、大量制备及鉴定 |
| 2.2 重组质粒pcD-IL-4在动物肝脏内的表达 |
| 2.3 肌肉注射GM-CSF和IL-4对mZP3 DNA疫苗生育率的影响 |
| 2.4 GM-CSF与IL-4对mZP3 DNA疫苗诱导的体液免疫反应的影响 |
| 2.5 Real-time PCR检测脾脏中IL-4的表达 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 滴鼻免疫细胞因子对mZP3 DNA疫苗不育效果的影响 |
| 第一节 滴鼻免疫GM-CSF对mZP3 DNA疫苗免疫不育效果的影响 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 质粒和菌株 |
| 1.2 实验动物 |
| 1.3 质粒DNA的提取、纯化与定量 |
| 1.4 壳聚糖-质粒复合物的制备及电泳检测 |
| 1.5 实验动物的免疫 |
| 1.6 抗体检测 |
| 1.7 T细胞增殖实验 |
| 1.8 肺和卵巢组织HE染色 |
| 1.9 小鼠卵ZP的间接免疫荧光测定 |
| 1.10 流式细胞术检测DCs表型 |
| 1.11 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 壳聚糖包裹质粒DNA |
| 2.2 GM-CSF和mZP3共免疫降低小鼠的生育率 |
| 2.3 体液免疫反应 |
| 2.4 抗体与卵子表面ZP3结合 |
| 2.5 细胞免疫反应和卵巢病理学 |
| 2.6 GM-CSF促进DCs细胞的成熟 |
| 2.7 小鼠肺的组织学检测 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二节 GM-CSF和IL-5滴鼻共免疫对mZP3 DNA疫苗免疫不育效果的影响 |
| 引言 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 质粒和菌株 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 质粒DNA的提取、纯化与定量 |
| 1.4 动物免疫 |
| 1.5 抗生育实验 |
| 1.6 抗体检测 |
| 1.7 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 体液免疫反应 |
| 2.2 GM-CSF和mZP3共免降低生育率 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 结论与展望 |
| 附录1 英文缩略语 |
| 附录2 主要实验仪器 |
| 博士期间已发表和待发表的论文 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（9）Quil A、PICKCa对FMDV、PCV2-PRRSV DNA疫苗免疫增强作用的效果观察（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一篇 文献综述 |
| 1 佐剂的研究进展 |
| 1.1 佐剂的简介 |
| 1.2 最新进展和未来的科学挑战 |
| 1.3 展望 |
| 2 DNA 疫苗的研究进展 |
| 2.1 DNA 疫苗简介 |
| 2.2 DNA 疫苗佐剂 |
| 2.3 前景与展望 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第1章 QuilA 与 PICKCa 对试验动物的免疫调节作用 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第2章 Quil A 对 O 型口蹄疫 DNA 疫苗的免疫增强作用 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第3章 PICKCa 对 PCV2-PRRSV DNA 疫苗免疫增强作用的研究 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
（10）佐剂对HIV-1 gp120 DNA疫苗免疫效果的影响（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第1章 引言 |
| 1.1 艾滋病及其疫苗的研究 |
| 1.1.1 艾滋病的概述 |
| 1.1.2 HIV 病毒结构及特性 |
| 1.1.3 HIV 疫苗的研究进展及分类 |
| 1.2 疫苗佐剂 |
| 1.2.1 传统佐剂 |
| 1.2.2 新型佐剂 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 主要材料试剂及实验设备 |
| 2.1.1 菌株和质粒 |
| 2.1.2 培养基 |
| 2.1.3 主要试剂和抗体 |
| 2.1.4 各种试剂的配制 |
| 2.1.5 实验动物 |
| 2.1.6 主要仪器设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 大肠杆菌 JM109 感受态细胞的制备 |
| 2.2.2 重组质粒的转化 |
| 2.2.3 DNA 疫苗的制备 |
| 2.2.4 DNA 疫苗的检测方法 |
| 2.2.5 质粒 DNA 的大量提取及纯化 |
| 2.2.6 实验动物分组及试剂 |
| 2.2.7 疫苗配制方法 |
| 2.2.8 免疫动物及采血 |
| 2.2.9 制备 ELISA 检测的阳性血清 |
| 2.2.10 标准曲线的绘制 |
| 2.2.11 ELISA 检测小鼠血清中抗 gp120 抗体水平 |
| 2.2.12 小鼠脾细胞增殖实验 |
| 2.2.13 统计学分析 |
| 第3章 实验结果 |
| 3.1 DNA 疫苗的制备 |
| 3.1.1 碱裂解法提取质粒 |
| 3.1.2 实验室小量提取质粒的条件摸索 |
| 3.1.3 去除内毒素方法的摸索 |
| 3.1.4 质粒 DNA 的大量提取及纯化 |
| 3.2 检测佐剂对 HIV-1 gp120 DNA 疫苗免疫效果的影响 |
| 3.2.1 制备 ELISA 检测的阳性血清 |
| 3.2.2 标准曲线的绘制 |
| 3.2.3 MF59、CpG ODN、WFR 佐剂对 DNA 疫苗体液免疫效果的影响 |
| 3.2.4 PFR 佐剂对 DNA 疫苗体液免疫效果的影响 |
| 3.3 MTT 法检测小鼠脾细胞的增殖结果 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
四、细胞因子佐剂对HIV DNA疫苗免疫效果的影响（论文参考文献）
- [1]佐剂在新冠疫苗和HIV疫苗的研发探索[D]. 周珈. 昆明医科大学, 2021(02)
- [2]胞壁酰二肽的HIV DNA疫苗佐剂效应研究和原发性胆汁性胆管炎的临床病理研究[D]. 石亚星. 昆明医科大学, 2020(02)
- [3]细胞因子辅助免疫的抗体制备与应用及基于亲和力的免疫检测灵敏度研究[D]. 王羽. 华南理工大学, 2019(06)
- [4]H7亚型禽流感DNA疫苗及其免疫佐剂的初步研究[D]. 欧阳国文. 华南农业大学, 2017(08)
- [5]HIV-1通用型gp120DNA疫苗的制备及免疫原性研究[D]. 李欣. 佛山科学技术学院, 2017(01)
- [6]EEEV/WEEV病毒样颗粒疫苗和DNA疫苗的构建及实验免疫研究[D]. 马金柱. 东北农业大学, 2014(01)
- [7]HIV-1 DNA疫苗佐剂及两种病毒载体基因表达谱研究[D]. 侯爵. 中国疾病预防控制中心, 2013(03)
- [8]细胞因子影响鼠卵透明带3 DNA疫苗免疫不育效果的研究[D]. 马晓林. 新疆大学, 2013(10)
- [9]Quil A、PICKCa对FMDV、PCV2-PRRSV DNA疫苗免疫增强作用的效果观察[D]. 刘燕瑜. 吉林大学, 2012(09)
- [10]佐剂对HIV-1 gp120 DNA疫苗免疫效果的影响[D]. 狄静. 吉林大学, 2012(10)