免疫球蛋白和细胞因子融合基因表达载体构建家族特异性抗淋巴瘤疫苗

一、构建免疫球蛋白与细胞因子融合基因表达载体的家族特异性抗淋巴瘤疫苗（论文文献综述）

唐娇^[1]（2021）在《新型小分子TRK抑制剂研发及BTK抑制剂耐药克服策略》文中研究表明蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK）是参与调节细胞增殖和死亡相关信号转导的关键激酶。根据其结构,可以分为受体酪氨酸激酶（receptor PTK,RTK）和非受体酪氨酸激酶（non-receptor PTK,NRTK）两类。RTK主要包括血小板源性生长因子受体（platelet-derived growth factor receptor,PDGFR）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）、成纤维生长因子受体（fibroblast growth factor receptor,FGFR）、原肌球蛋白受体激酶（tropomyosin receptor kinase,TRK）等;NRTK是传递胞内信号的胞质蛋白,可以与细胞膜结合或具有核特异性,主要包括脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase,Syk）、在肝癌中表达的酪氨酸激酶（tyrosine kinase expressed in hepatocellular carcinoma,TEC）和粘附斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）等激酶家族。PTK的异常表达通常导致肿瘤的发生、发展,因此,PTK已经成为抗肿瘤治疗的重要靶点。酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors,TKIs）与PTK的ATP结合位点竞争性结合,已在肿瘤治疗方面取得了很大进展,但获得性耐药的产生限制了其疗效。本论文主要开展了针对突变型TRK的第二代TRK小分子抑制剂ASD-098的抗肿瘤活性及机制研究。同时针对BTK抑制剂耐药的细胞,重点探索了其产生获得性耐药的分子机制和应对策略。TRK家族是典型的受体酪氨酸激酶,包括TRKA、TRKB和TRKC三个成员,分别由NTRK1、NTRK2、NTRK3基因编码。正常生理条件下,TRK充当神经营养蛋白的高亲和力受体,在神经元的生长和发育中起重要作用,但NTRK突变或重排而导致TRK异常激活是恶性肿瘤的驱动力之一。第二代TRK小分子抑制剂是对突变型NTRK亚型具有更高活性的新一代抑制剂,能够有效克服由激酶结构域突变介导的获得性耐药。目前国际上主要有LOXO-195和TPX-0005两个第二代TRK抑制剂成功上市,且仅有LOXO-195选择性抑制TRK活性。因此,为了研发具有我国自主知识产权的第二代选择性TRK抑制剂,我们评价了新型小分子TRK抑制剂ASD-098的药理学活性。激酶测试结果显示ASD-098是一个高效的TRK抑制剂,显着抑制非突变型及耐药突变型TRK活性;对耐药突变激酶的抑制活性比LOXO-195强1～4倍,比第一代抑制剂LOXO-101至少强10～40倍,并且其代谢产物ASD-097对TRK同样有明显抑制活性。细胞增殖抑制实验表明ASD-098选择性地抑制非突变型和突变型TRK融合蛋白阳性细胞的增殖,在高表达非突变型TRKA/B/C融合蛋白的Ba/F3细胞中,ASD-098抑制细胞增殖的IC50<0.3 n M,强于LOXO-101和Etrectinib;更重要的是,ASD-098同样显着抑制高表达突变型TRK融合蛋白阳性细胞增殖,如表达TPM3-TRKA G595R、LMNA-TRKA G667C和ETV6-TRKC G623R的Ba/F3细胞,活性比LOXO-195强3～4倍。此外,ASD-098抑制TRK及其介导的下游ERK1/2磷酸化、诱导细胞G0/G1期阻滞和细胞凋亡。体内抗肿瘤药效实验发现ASD-098通过抑制TRK-ERK1/2信号通路而显着抑制裸小鼠皮下移植瘤生长,对非突变型TRK融合蛋白阳性肿瘤如AFAP1-TRKB WT及突变型TRK融合蛋白阳性肿瘤如TPM3-TRKA G595R、ETV6-TRKC G623R均有显着疗效,而没有明显毒性;ASD-098同时具有良好的药代动力学特性,在肿瘤组织中,比LOXO-195有更高暴露水平和吸收速率,且消除更慢。以上结果说明ASD-098是一个高效的第二代TRK抑制剂,可用于克服临床上突变型NTRK融合基因产生的耐药。布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase,BTK）属于非受体酪氨酸激酶TEC家族,是BCR信号通路中的关键成分,对许多B细胞来源恶性肿瘤细胞增殖和存活至关重要,因此,BTK是一个重要的抗肿瘤靶点。BTK抑制剂伊鲁替尼（ibrutinib）是一种ATP竞争性抑制剂,与BTK的ATP结合位点的Cys481共价结合,已经上市,用于治疗慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia,CLL）、套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma,MCL）和华氏巨球蛋白血症（Waldenstroms macroglobulinemia,WM）等,但几乎有三分之一的患者对ibrutinib存在原发性固有耐药,而其他患者应用ibrutinib后出现获得性耐药。因此,研究ibrutinib耐药机制并寻找有效策略克服ibrutinib耐药十分重要。弥漫性大B细胞淋巴瘤DOHH-2经过ibrutinib长期处理产生了对ibrutinib耐药,该耐药细胞株命名为DOHH2/Ibru-2。在DOHH2/Ibru-2细胞中,没有发现BTK缺失和突变,但m TOR和AKT高激活;进一步研究发现PI3K/m TOR抑制剂BKM120选择性抑制DOHH2/Ibru-2细胞中AKT和m TOR磷酸化,并且联用BKM120和ibrutinib能够克服m TOR和AKT高激活引起的耐药。另外,在稳定表达BTK C481S对ibrutinib耐药的32D细胞中也证实联用BTK抑制剂和PI3K/m TOR抑制剂可以克服点突变引起的获得性耐药。综上所述,ASD-098是一个新型高效的第二代TRK小分子抑制剂,在克服NTRK突变引起的获得性耐药治疗中具有广阔前景;另外,对于BTK抑制剂耐药患者,联合抑制BTK和PI3K/m TOR信号通路可能是克服ibrutinib耐药的有效策略。

田苗^[2]（2009）在《MAGE-4与热休克蛋白70融合DNA疫苗的构建及体内抑瘤效应的研究》文中研究表明本研究将MAGE-4基因克隆入pcDNA3.1+质粒中,之后用阳离子脂质体成功将pcDNA3.1/MAGE-4质粒导入小鼠结肠腺癌细胞CT26中,建立了表达人MAGE-4的鼠肿瘤细胞系CT26/MAGE-4。然后采用两步次级克隆的方法,构建真核表达质粒pcDNA3.1/HSP70后,再将HSP70基因双酶切亚克隆入pcDNA3.1/MAGE-4载体,获得了能够同时表达两种外源基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1/HSP70/MAGE-4。将该真核重组体进行BALB/c小鼠免疫,分离脾淋巴细胞。进而通过MTT法检测小鼠脾淋巴细胞对CT26/MAGE-4细胞的毒性,证明了MAGE-4与Hsp70融合DNA疫苗能够显着增强小鼠脾淋巴细胞对CT26/MAGE-4细胞的杀伤作用。又将免疫后的小鼠脾淋巴细胞与CT26/MAGE-4细胞进行混合培养,采用ELISA法检测混合培养上清中IL-2和IFN-γ的水平,以确定针对MAGE-4的T细胞反应,结果显示IL-2和IFN-γ的水平明显高于其它组。经小鼠CT26/MAGE-4肿瘤模型研究表明MAGE-4和Hsp70融合DNA重组体能明显抑制表达MAGE-4的CT26细胞的生长,显着延长小鼠的生存时间,其治疗效果好于单独肿瘤基因疫苗（pcDNA3.1/MAGE-4、pcDNA3.1/HSP70）及共注射疫苗（pcDNA3.1/MAGE-4+pcDNA3.1/HSP70）。本研究提示融合基因疫苗pcDNA3.1/HSP70/MAGE-4对表达MAGE-4的肿瘤具有良好的治疗作用,较单独肿瘤疫苗组及共注射肿瘤疫苗组效果显着增强。

汤永民,冯建华^[3]（2009）在《儿童非霍奇金淋巴瘤的免疫治疗进展》文中进行了进一步梳理

李绵洋^[4]（2008）在《IgHV框架区DNA疫苗体外转染树突细胞诱导抗B淋巴瘤的细胞毒T细胞》文中研究表明【目的】应用免疫球蛋白重链基因可变区家族的框架区基因与细胞因子编码序列融合的DNA疫苗,体外转染树突细胞,刺激培养外周血淋巴细胞,以确定框架区DNA疫苗能否诱发抗原特异性细胞毒T淋巴细胞的产生,为该疫苗下一步应用于主动免疫或过继性T细胞治疗的临床试验提供实验依据。【方法】鉴定已经构建的人免疫球蛋白重链基因可变区（IgHV）的框架区基因（FR）与粒-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）序列融合的家族性DNA疫苗,无内毒素试剂盒方法提取质粒。采集人外周血单个核细胞（PBMC）,采用贴壁培养分离,细胞因子GM-CSF、IL-4诱导,细胞因子“鸡尾酒”促成熟的方法培养树突细胞（DC）,用流式细胞仪检测DC的表型;基因枪方法将疫苗DNA质粒转染DC,反转录聚合酶链反应（RT-PCR）及酶联免疫吸附试验（ELISA）方法确认转染质粒的表达。同时将悬浮的PBMC在IL-2等细胞因子诱导下培养,用转染后的DC刺激培养以诱导抗原特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）的产生。用流式细胞仪检测培养的淋巴细胞表型,采用合成的MHC五聚体（MHCPentamer）方法检测抗原特异性细胞毒T淋巴细胞,用荧光标记的流式细胞术方法（FATAL）分析培养的T淋巴细胞对B细胞淋巴瘤细胞的杀伤作用,并采用基因测序仪方法对所培养的淋巴细胞进行T细胞受体β链可变区（TCRBV）基因扫描分析,观察培养前后T细胞各个克隆的变化情况。【结果】制备供转染用的无内毒素质粒IgHV1-GM-CSF/pcDNA3.0,经酶切、PCR鉴定,测序结果显示包含IgHV1前导肽、FR区以及连接的GM-CSF cDNA序列,FR区序列包含受HLA-A*0201限制性的抗原九肽QLVQSGAEV的编码序列。外周血PBMC经细胞因子诱导可以产生形态典型的DC,显微镜下计数典型形态的DC占85.0%～96.5%,获得DC数量占PBMC的6.9%～11.3%;细胞因子促成熟后,DC表面CD80、CD83、CD86等标志明显增高,显示获得成熟的DC。比较4种方法转染DC的效率,由高到低依次为Nucleofector电转染、基因枪、Lipofectamine 2000和FuGENE 6,但电转染后细胞死亡多,且失去多突触结构而变成圆形,因此选择基因枪方法转染DC,并对基因枪转染DC条件进行了优化。经RT-PCR及ELISA方法检测转染后的DC的GM-CSF水平增高,证明转染的质粒DNA能够在DC中表达。对2例正常人及2例B细胞淋巴瘤患者的PBMC进行细胞培养及转染或抗原肽刺激,FCM分析显示体外培养的淋巴细胞主要以CD8+T淋巴细胞增生为主;Pentamer检测结果显示转染IgHV1-GM-CSF融合疫苗的DC能够诱导抗原特异性CTL产生,最高可达4.36%;相应的抗原9肽也可以诱导CTL的产生,但时相要早于前者。杀伤试验显示转染DNA疫苗DC刺激的T细胞对具有同样IgHV1家族特征的B细胞淋巴瘤细胞具有增强的杀伤作用,2次刺激后的患者的T细胞对肿瘤细胞杀伤率为32.4±4.9%,而抗原9肽诱导的杀伤率为18.1±3.5%。TCRBV基因扫描显示淋巴瘤、白血病患者治疗后T细胞各个TCRβ家族中一些淋巴细胞消失,呈寡克隆分布或完全缺失,仅少数保持多克隆分布,而经过DC及细胞因子的刺激培养后,TCRβ则呈现完整的多克隆分布;经过DNA疫苗刺激的则呈现部分家族个别优势克隆特征,提示抗原诱导的CTL克隆可能存在于其中。【结论】1.采用基因枪方法成功转染由人PBMC诱导培养的原代DC,制备家族性IgHV框架区DNA疫苗免疫的DC。2.家族性IgHV框架区DNA疫苗体外能够诱导抗原特异性CTL细胞,对同IgH家族的B细胞淋巴瘤细胞具有杀伤作用。

张颜^[5]（2008）在《融合型独特型B细胞淋巴瘤DNA疫苗的制备及其免疫学活性测定》文中研究指明目的B细胞淋巴瘤的膜表面免疫球蛋白（surface membrane immunoglobulin,mIg）独特型（idiotype,Id）来自基因重排,由可变区的重链（VH）和轻链（VL）基因所决定,其突出的个体化特征即肿瘤特异性抗原（TSA）正好满足了抗肿瘤疫苗的特异性的需要。将来源于个体的恶性增殖的B细胞的Ig特异性片段VH和VL通过基因克隆制备成单链抗体可变区片段（scFv）,二者由一段短肽连接,可以模拟完整免疫球蛋白的免疫原性。由于scFv源于自身抗原,单独应用不足以诱导抑制肿瘤细胞的免疫反应,为此人们在提高免疫原性方面做了大量的研究。研究者发现利用配体与细胞表面受体的结合可提高抗原呈递给抗原提呈细胞（APC）的效率,提高抗原特异性免疫反应。Biragyn将单核细胞趋化蛋白3（Monocyte chemotactic protein-3,MCP3）与scFv偶联作为疫苗免疫小鼠,发现其表达的融合蛋白具有Ig的天然构象及趋化因子的功能,能和抗原结合,同时吸引抗原提呈细胞（特别是未成熟树突状细胞）向抗原靠近,诱导的免疫反应强于免疫球蛋白疫苗。同时,抗肿瘤的DNA疫苗也是最近研究的一个热点,本研究利用小鼠B细胞淋巴瘤细胞株A20的scFv和MCP3的融合基因构建DNA疫苗,并用该疫苗免疫同源小鼠,LDH法检测小鼠的脾细胞与靶细胞A20孵育后的CTL活性。比较表达scFv和MCP3-scFv的DNA疫苗产生的细胞免疫反应对肿瘤细胞的杀伤效果,探讨融合型独特型DNA疫苗在抗肿瘤免疫反应中是否能诱导T细胞介导的抗肿瘤反应,诱导的抑瘤效果是否高于独特型DNA疫苗,为提高独特型疫苗的免疫原性提供理论基础,为淋巴瘤疫苗的制备及临床试验研究拓宽思路。方法:1真核表达质粒的构建1.1 PCR引物设计根据A20细胞IgVH cDNA、IgVL cDNA与MCP3序列分别设计MCP3-scFv和scFv的上下游引物,此部分实验已经完成[1]。根据EGFP序列设计EGFP上下游引物,序列均来源于Genebank。1.2 PCR扩增目的片段以pGLo/MCP3-scFv为模板,分别用MCP3上游引物和VL下游引物扩增MCP3-scFv,VH上游引物和VL下游引物扩增scFv。以含有EGFP基因序列的质粒PCX-EGFP为模板,分别用引物EGFP上游引物和EGFP下游引物扩增EGFP基因。1.3 pGEM T-easy载体克隆MCP3-scFv、scFv、EGFP片段以及鉴定1.4 DNA质粒构建将PCR产物MCP3-scFv、scFv、EGFP酶切后,定向克隆到真核表达载体pTARGET ,得到真核表达质粒pTARGET/EGFP、pTARGET/scFv-EGFP和pTARGET/MCP3-scFv-EGFP,将三种质粒转化感受态细菌及酶切鉴定,选取阳性克隆测序。2质粒转染及鉴定将构建的质粒分别电穿孔法转染至培养至对数生长期的人脐静脉内皮细胞ECV-304,转染后48小时,在倒置荧光显微镜下观察融合蛋白的表达。3质粒准备和免疫小鼠3.1质粒纯化应用QIAGEN/Endofree Plasmid Maxi,Giga Kit分离纯化质粒pTARGET/EGFP、pTARGET/scFv-EGFP、pTARGET/MCP3-scFv-EGFP。每种质粒内毒素水平控制在0.1 EU/ug以下,制备成为符合动物实验要求的质粒。3.2 DNA疫苗免疫动物将18只Babl/c小鼠按随机区组方法分成三组:pTARGET/EGFP组; pTARGET/scFv-EGFP组;pTARGET/MCP3-scFv-EGFP组。6只/组。在小鼠双侧股四头肌肌内注射2.5g/L盐酸布比卡因,每侧50μl。5天后每组质粒取50微克溶至50微升0.9%NaCL分别注射于小鼠两侧的股四头肌,接种三次,每次间隔两周。4 LDH释放法测定CTL的特异性杀伤率于小鼠免疫结束后第5天取脾细胞作为效应细胞,A20细胞为靶细胞,将效靶比例设置为20/1、50/1、100/1,应用LDH释放法测定CTL活性。5统计学分析CTL的杀伤率数据分析采用SPSS（13.0）统计软件进行,3组间比较采用方差分析,两两比较采用SNK-q检验,P<0.05认为有统计学意义。结果:1真核表达质粒经相应的限制性内切酶酶切鉴定均正确。测序结果显示目的片段基因序列与相关文献报道基本符合。2细胞转染及荧光观察:融合基因真核表达质粒转染ECV后经倒置荧光显微镜下观察发现,pTARGET/EGFP、pTARGET/scFv-EGFP和pTARGET/MCP3-scFv-EGFP在转染后48h和72h均表达带较强绿色荧光的蛋白,间接提示融合蛋白成功表达。3各组CTL杀伤率（%）为:效靶比例为100/1时:pTARGET/MCP3-scFv-EGFP组:68.45±5.72 ; pTARGET/scFv-EGFP组:14.20±4.39 ; pTARGET /EGFP组: 10.76±1.02。pTARGET/MCP3-scFv-EGFP组与其它两组比较均有统计学差异（P<0.05）。结论:1成功构建两种DNA疫苗: pTARGET/scFv-EGFP和pTARGET/MCP3-scFv-EGFP。2 DNA疫苗免疫动物后可诱导出特异性细胞免疫反应。同时试验证明,与scFv疫苗相比,MCP3与scFv融合的独特型DNA疫苗能诱导高效的抗肿瘤免疫应答。

李树蕾^[6]（2006）在《结核分枝杆菌热休克蛋白70增强肝细胞癌相关抗原661基因疫苗的免疫效果》文中指出肿瘤基因疫苗是近10年来发展起来的新型疫苗,具有安全、有效、制备容易、保存运输方便等优点,因而受到广泛重视。肝细胞癌相关抗原661（hepatic carcinoma-associated 661, HCA661）是一种癌/睾丸抗原（cancer/testis antigen, CT antigen）,选择性表达于肝细胞癌;除睾丸精原细胞外,在正常组织中不表达。CT抗原具有免疫原性,在肿瘤病人体内诱导自发体液和细胞免疫反应。由于睾丸外层有白膜作为免疫屏障,CT抗原可以直接用于抗原特异性肿瘤疫苗的研究。结核分枝杆菌热休克蛋白70（mycobacterium tuberculosis heat shock protein 70,mtHSP70）分子是CD40配体,作为抗原肽载体和天然佐剂促进抗原进入MHC I和MHC II类分子途径,诱导产生抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic Tlymphocytes,CTL）和抗体。mtHSP70羧基端的多肽结合结构域是CD40的最小有效结合部位,足以发挥该作用,并且能够更好地减少机体产生针对mtHSP70的免疫反应。本实验首次利用PCR技术直接从人类真核细胞基因组钓取HCA661基因,构建了真核基因疫苗pCI-HCA661和pCI-HCA661-mtHSP70C;成功建立了体外表达检测系统pCI-eGFP和pCI-HCA661-eGFP;从原核表达系统pQE-HCA661中成功表达并纯化HCA661蛋白;基因疫苗免疫小鼠后取小鼠脾细胞及血清,通过流式细胞术、免疫组化、western blotting印记和ELISA等方法证实,mtHSP70羧基端能够增强HCA661基因疫苗的抗原特异性免疫效果,并最大程度减少机体产生对mtHSP70的免疫应答。

黄亚渝^[7]（2005）在《MAGE-n与CD80融合基因肿瘤疫苗的构建及体内抑瘤效应的研究》文中研究指明长久以来,恶性肿瘤一直严重威胁着人类的健康和生命,传统的治疗方法不尽如人意。免疫治疗通过提高肿瘤的免疫原性,诱导机体产生特异性的抗肿瘤免疫反应,达到治疗肿瘤的目的,是一种变被动为主动的生物治疗方法。在研究者的共同努力下,有关肿瘤免疫治疗的基础和临床应用研究已取得一定的进展,在肿瘤的防治上也显示出一定的效果。但是人们仍在不断地探索和尝试,力图研制出高效、广谱的肿瘤疫苗,以挽救更多肿瘤患者的生命,给人们带来新的希望。 MAGE-n是由我室首次报道的,克隆自肝细胞癌细胞系的,MAGE家族基因的新成员（GeneBank登录号AF443295）,它与MAGE-A亚家族基因有较高的同源性。MAGE-n分子上存在可诱导MAGE-n特异性CTL的抗原表位,而且在体内能产生特异性的抗肝癌免疫效应。CD80是一种共刺激分子,在T细胞的活化和抗肿瘤免疫反应中起着重要作用。CpG作为一种免疫佐剂,可以诱发机体产生多种免疫学效应。本研究构建MAGE-n与CD80融合基因肿瘤疫苗,以CpG为佐剂,研究其对小鼠细胞免疫及体液免疫的影响,并利用小鼠肿瘤模型观察对肿瘤的防治作用。 1.MAGE-n基因的克隆、原核表达、抗血清的制备及其在不同组织中的表达

仲凯励,张伟京,张云生,毛宁^[8]（2004）在《人B细胞淋巴瘤细胞系Namalwa CDR3基因片段的克隆及其DNA疫苗制备》文中研究说明目的 :为探讨B细胞淋巴瘤细胞膜表面免疫球蛋白可变区的互补决定区 3能否在动物体内激发特异性抗独特型抗体 ,以人B细胞淋巴瘤细胞系Namalwa为模型 ,克隆其膜表面免疫球蛋白重链可变区互补决定区 3（CDR3）基因片段作为抗原基因 ,构建DNA疫苗质粒。方法 :以RT PCR的方法获得互补决定区 3（CDR3）基因片段 ,进而克隆了小鼠单核细胞趋化因子 （MCP 3）基因作为佐剂分子 ,以重组PCR的方法获得CDR3和MCP 3基因的融合基因片段 ,克隆在真核表达载体pcDNA3 1中构建DNA疫苗质粒 ,然后通过脂质体转染的方法验证该质粒在真核细胞中的表达情况。结果 :应用分子生物学的方法获得了以Namalwa细胞mIgCDR3作为抗原基因的DNA疫苗质粒。结论 :人B细胞淋巴瘤细胞系NamalwaCDR3基因的DNA疫苗构建正确 ,体外瞬时转染实验证明该质粒能够在真核细胞中正确表达。所构建的重组表达质粒为下一步的抗B细胞淋巴瘤基因疫苗的体内动物实验工作打下基础

刘静,朱平^[9]（2004）在《B细胞淋巴瘤的抗独特型免疫治疗》文中提出

刘辉,朱平,林宁晶,张英,卜定方,王奕嘉,王逸群,杨英^[10]（2004）在《构建免疫球蛋白与细胞因子融合基因表达载体的家族特异性抗淋巴瘤疫苗》文中进行了进一步梳理目的 构建免疫球蛋白重链可变区 （IgHV）基因片段与细胞因子粒细胞 巨噬细胞集落刺激因子 （GM CSF）或白细胞介素 2 （IL 2 ）的融合基因表达载体作为家族特异性抗淋巴瘤核酸疫苗 ,接种动物了解该疫苗抗淋巴瘤免疫功能。方法 从脐带血免疫球蛋白基因文库获得 6个片段长度差异较大的IgHV3基因片段 ,测序后利用生物信息资源分析预测其重链可变区的T细胞表位 ,分析IgHV1 6个片段。选择包含了绝大多数T细胞表位的IgHV1、IgHV3基因 ,将框架区 （FR）为主的IgHV（FR）基因片段及IgHV（FR）与GM CSF或IL 2基因连接后形成的融合基因克隆到真核表达载体中。表达载体通过脂质体转染COS细胞 ,ELISA法确定GM CSF或IL 2的表达情况。将一些表达载体作为核酸疫苗免疫小鼠 ,通过间接免疫荧光法和细胞因子分泌法检测小鼠抗同一家族淋巴瘤和正常淋巴细胞的免疫反应。结果 计算机评分系统预测显示在每个IgHV序列中约存在 30个左右分别受HLA位点限制的T细胞表位 ,90 %以上的T细胞表位位于框架区 ,积分排位于前 1 0 %的T细胞表位都位于框架区。构建了去除CDR3区后以框架区 （FR）为主的IgHV1 （FR）和IgHV3（FR）真核表达载体。将GM CSF或IL 2基因连接到 2个IgHV基因的 3′端。IgHV （FR ） GM CSF/pcDNA3.0中GM CSF的表达量高于对照组 2 0

二、构建免疫球蛋白与细胞因子融合基因表达载体的家族特异性抗淋巴瘤疫苗（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、构建免疫球蛋白与细胞因子融合基因表达载体的家族特异性抗淋巴瘤疫苗（论文提纲范文）

（1）新型小分子TRK抑制剂研发及BTK抑制剂耐药克服策略（论文提纲范文）

（2）MAGE-4与热休克蛋白70融合DNA疫苗的构建及体内抑瘤效应的研究（论文提纲范文）

（3）儿童非霍奇金淋巴瘤的免疫治疗进展（论文提纲范文）

（4）IgHV框架区DNA疫苗体外转染树突细胞诱导抗B淋巴瘤的细胞毒T细胞（论文提纲范文）

（5）融合型独特型B细胞淋巴瘤DNA疫苗的制备及其免疫学活性测定（论文提纲范文）

（6）结核分枝杆菌热休克蛋白70增强肝细胞癌相关抗原661基因疫苗的免疫效果（论文提纲范文）

（7）MAGE-n与CD80融合基因肿瘤疫苗的构建及体内抑瘤效应的研究（论文提纲范文）

（10）构建免疫球蛋白与细胞因子融合基因表达载体的家族特异性抗淋巴瘤疫苗（论文提纲范文）

四、构建免疫球蛋白与细胞因子融合基因表达载体的家族特异性抗淋巴瘤疫苗（论文参考文献）

• [1]新型小分子TRK抑制剂研发及BTK抑制剂耐药克服策略[D]. 唐娇. 中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所), 2021(08)
• [2]MAGE-4与热休克蛋白70融合DNA疫苗的构建及体内抑瘤效应的研究[D]. 田苗. 吉林大学, 2009(08)
• [3]儿童非霍奇金淋巴瘤的免疫治疗进展[J]. 汤永民,冯建华. 中国小儿血液与肿瘤杂志, 2009(01)
• [4]IgHV框架区DNA疫苗体外转染树突细胞诱导抗B淋巴瘤的细胞毒T细胞[D]. 李绵洋. 中国人民解放军军医进修学院, 2008(09)
• [5]融合型独特型B细胞淋巴瘤DNA疫苗的制备及其免疫学活性测定[D]. 张颜. 河北医科大学, 2008(01)
• [6]结核分枝杆菌热休克蛋白70增强肝细胞癌相关抗原661基因疫苗的免疫效果[D]. 李树蕾. 吉林大学, 2006(10)
• [7]MAGE-n与CD80融合基因肿瘤疫苗的构建及体内抑瘤效应的研究[D]. 黄亚渝. 第四军医大学, 2005(06)
• [8]人B细胞淋巴瘤细胞系Namalwa CDR3基因片段的克隆及其DNA疫苗制备[J]. 仲凯励,张伟京,张云生,毛宁. 中国免疫学杂志, 2004(11)
• [9]B细胞淋巴瘤的抗独特型免疫治疗[J]. 刘静,朱平. 肿瘤防治研究, 2004(06)
• [10]构建免疫球蛋白与细胞因子融合基因表达载体的家族特异性抗淋巴瘤疫苗[J]. 刘辉,朱平,林宁晶,张英,卜定方,王奕嘉,王逸群,杨英. 中华医学杂志, 2004(01)

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