一、对哈茨木霉转化子菌体形态观察及抗药性测定（论文文献综述）
彭新红[1]（2021）在《绿木霉菌GV29-8厚垣孢子形成分子机制研究》文中认为木霉菌是一种广泛应用的生防真菌,能够防治多种植物病害。厚垣孢子是许多真菌在逆境下产生的一种繁殖体,具有细胞壁厚、抗逆性强等优点。与木霉菌分生孢子制剂相比,厚垣孢子制剂的货架期更长,防治效果也更好。但大规模生产真菌厚垣孢子非常困难。前期我们研究出了诱导木霉菌大量产生厚垣孢子的培养基和发酵新工艺,本研究通过对木霉菌厚垣孢子形成过程中不同生长发育阶段的转录组的比较分析,解析影响木霉菌厚垣孢子形成的关键基因及调控途径,为木霉菌厚垣孢子形成分子机制的解析,菌株遗传改良和发酵工艺控制提供理论指导。取得如下主要研究结果:1.通过多次系统地观察绿木霉菌GV29-8厚垣孢子形成过程,最终选择8个代表性时间点的24个样本进行转录组测序:产孢前期（20h/TVS1、24h/TVS2和26h/TVS3）;产孢初期（28h/TVS4和32h/TVS5）;产孢中期（38h//TVS6）;产孢盛期（45h/TVS7）;产孢后期（56h/TVS8）。24个样本共获得约206.07 Gb的可用数据（clean bases）,Q30均大于90.85%,总体mapping ratios为79.34%～85.96%。共获得19,737个基因,其中7332个是由stringtie软件预测的新基因。根据PCA分析,8个采样时间点样本被分为4个阶段:菌丝生长阶段S1（TVS1～TVS2）、厚垣孢子形成早中期阶段S2（TVS3～TVS6）,厚垣孢子形成盛期阶段S3（TVS7）,厚垣孢子形成后期和菌丝开始自溶阶段S4（TVS8）。2.将相邻阶段样本的转录组数据比较,共获得6462个差异基因（DEGs）。GO富集分析表明,S2比S1,DEGs主要显着富集到有机氮化合物代谢过程（GO:1901564）,共包含126个DEGs,下调表达的114个DEGs主要与有机氮化合物合成过程相关。S3比S2,DEGs主要显着富集到与次级代谢相关的四吡咯结合（GO:0046906）和血红素结合（GO:0020037）过程,共包含52个DEGs,主要是P450家族基因,且大部分参与有毒次级代谢产物的合成。S4比S3,DEGs则显着富集到脂质代谢过程（GO:0006629）,共包含54个DEGs,主要与磷脂、甘油酯以及脂肪酸代谢相关。KEGG富集分析表明,S2比S1,DEGs主要显着富集到核糖体（tre03010）途径。S3比S2,N-聚糖生物合成（tre00510）途径也被显着富集,包含14个DEGs,其中10个上调表达的DEGs参与甘露聚糖合成,3个下调表达的DEGs则与甘露聚糖的降解有关。将相邻时间点样本转录组数据比较,共获得5699个DEGs。KEGG富集分析表明TVS5比TVS4以及TVS6比TVS5,DEGs主要显着富集到细胞周期（tre04111）途径。WGCNA分析显示,与S1高度正相关的pink模块中主要是核糖体蛋白基因,显着富集到核糖体通路（tre03010）。与S2正相关的orange模块中主要是与氧化还原和跨膜运输过程相关基因,苯丙氨酸代谢（tre00360）、谷胱甘肽代谢（tre00480）、色氨酸代谢（tre00380）和次生代谢产物生物合成（tre01110）途径均被富集。与S4呈高度正相关的black和purple模块中主要是参与代谢、氧化还原和运输过程的基因,脂肪酸代谢（tre01212）、不饱和脂肪酸生物合成（tre01040）、氨基糖和核苷酸糖代谢（tre00520）以及淀粉和蔗糖代谢过程相关基因均被富集。其中,氨基糖和核苷酸糖代谢（tre00520）通路中共有16个基因发生差异表达,主要与几丁质代谢相关。与S4呈负相关的dark red和green模块中代谢和氧化还原基因占主导,脂肪酸降解（tre00071）通路在该模块中被富集。3.根据转录组数据分析,发现氨基糖和核苷糖代谢通路富集到较多的差异基因,其中几丁质酶Ech2基因、几丁质合成酶Chs1＿7926和Chs1＿8917基因表达量变化比较大。添加25g/L和45g/L几丁质代谢的一种中间代谢产物N-乙酰-D-氨基葡萄糖（Glc NAc）均显着抑制绿木霉菌GV29-8厚垣孢子形成。为了研究氨基糖和核苷糖代谢通路中几丁质酶和几丁质合成酶基因对绿木霉菌厚垣孢子形成的影响,构建了Ech2、Chs1＿7926和Chs1＿8917基因的敲除、过表达和回复株系。结果表明,Ech2基因敲除突变株的厚垣孢子产量较野生型菌株显着提高,同时生长速度和分生孢子产量也增加,但菌丝生物量减少。Chs1＿7926和Chs1＿8917基因敲除突变株无法正常形成厚垣孢子,且菌丝形态异常。同时菌株的生长速率、生物量、分生孢子产量及分生孢子萌发率均显着降低。添加25 g/L Glc NAc后突变株在厚垣孢子诱导培养基中培养的菌丝异常程度有所恢复但仍无法形成完整的厚垣孢子,其生长速率和分生孢子产量均有所增加。综上所述,通过对绿木霉菌GV29-8厚垣孢子形成过程中不同阶段样本转录组数据进行GO、KEGG、STC和WGCNA分析,初步明确了可能在厚垣孢子形成的各阶段中具有重要作用的代谢通路和基因。推测有机氮化合物代谢过程中的DEGs可能参与菌株生长早期（S1）菌丝的同化吸收作用,消耗培养基中的大量外源氮素,导致氮素缺乏（S2）;同时,在菌丝生长过程中与次级代谢相关的DEGs差异表达伴随着次级代谢产物和活性氧自由基的累积;由此产生的缺氮和不利培养条件可能使菌株启动细胞周期基因,调控细胞分化,诱导菌丝向厚垣孢子形态的转化。在厚垣孢子形成盛期（S3）和后期（S4）,甘露聚糖、几丁质、糖原和脂质合成代谢途径DEGs高表达,可能有利于厚垣孢子细胞壁的构建和能量储存。通过构建几丁质酶和几丁质合成酶基因的敲除、过表达和回复株系,初步明确了氨基糖和核苷糖代谢通路关键基因对绿木霉GV29-8菌株厚垣孢子形成的影响。我们的研究结果为解析影响木霉菌厚垣孢子形成的相关途径和基因提供了理论依据。
韩静[2]（2021）在《TasMYB27转录因子调控棘孢木霉抗链格孢菌分子机制》文中研究表明木霉属是一类具有生物防治作用的真菌,其拮抗特性是基于多种机制的激活。为了探究TasMYB27转录因子在棘孢木霉CGMCC11653抗杨树叶枯病病原菌-链格孢菌的应答进程中所发挥的功能,本研究通过转基因手段在棘孢木霉中过表达TasMYB27基因,对转基因木霉进行分子生物学及生理上的检测,并通过酵母单杂交和TasMYB27原核表达蛋白及纯化来验证TasMYB27对其下游基因进行概括分析,探讨该基因的相关功能,从而对挖掘其棘孢木霉的解毒调控网络奠定基础。研究结果如下:通过生物信息学分析,在棘孢木霉MYB转录因子家族中获得15条TasMYBs转录因子,在启动子区域的顺式作用调控元件的预测揭示了多种响应元件。此外还检索到18条和TasMYB27同源性高的序列,比对发现均含有MybDNA-Bind6结构域,其第一个亮氨酸（Trp）残基被苯丙氨酸取代（Phe）,可能有助于识别新的靶基因;蛋白质二级结构预测TasMYB27蛋白以无规则卷曲最多,三级结构以1h88.1.C模板进行建模,TasMYB27蛋白核心结构由β-折叠组成片层,周围围绕3个α-螺旋。在JGI棘孢木霉基因组中获取TasMYB27基因的CDS序列,设计特异性引物克隆得到717 bp的TasMYB27基因全长CDS序列,生物信息学分析该基因编码238 aa,分子量为27.39 kDa,为亲水蛋白。motif和启动子顺式作用元件分析,TasMYB27含有多个抗逆响应元件,荧光定量PCR技术对该基因进行表达模式分析,链格孢菌次生代谢物胁迫下该基因在24 h显着表达,因此推测TasMYB27基因可能参与调控棘孢木霉抗链格孢菌次生代谢物胁迫。PEG-CaCl2介导原生质体法对棘孢木霉进行转化,分子检测获得2个阳性转基因株系;形态学检测发现Tas-OE较Tas-WT相比同心轮纹更加明显,但瓶梗与分生孢子形态并无差别;生理学水平检测确定Tas-OE对链格孢菌的抑制能力和次生代谢物耐受性均有所增强,POD、CAT酶活性检测Tas-OE均高于Tas-WT。建立TasMYB27原核表达体系,优化蛋白表达条件为0.1 mmol/L、37℃、3h,并成功纯化出69.5 kDa的高质量可溶性TasMYB27蛋白。酵母双杂交试验表明,TasMYB27转录因子具有转录自激活活性;在酵母单杂随机DNA文库中筛选了 6个TasMYB27转录因子识别的DNA序列,对其中一个未知的新元件“TCGGGATGTA”通过序列两段碱基逐一缺失进行验证,确定新元件的核心碱基序列为“GATG”。综上所述,对棘孢木霉MYB转录因子家族进行了全面的生物信息学分析,并围绕TasMYB27转录因子进行了次生代谢物胁迫下的时序响应模式分析,基因功能研究以及其所识别的顺式作用元件进行探究,通过获得的发现和结论可为探索棘孢木霉响应次生代谢物胁迫应答信号转导网络提供有意义的线索。
于溪佳[3]（2020）在《海盐诱导下哈茨木霉对潮霉素B的耐药机制探究》文中提出随着抗生素的广泛应用,真菌耐药现象随之出现;同时由于近年来抗真菌药物研发进入瓶颈期,新抗生素的研发速度减慢,使得真菌耐药问题变得更加严峻。因此,为缓解或解决真菌临床耐药问题,耐药分子机制的解析愈发重要和急迫。本文研究了海盐对哈茨木霉的潮霉素B耐受性的影响及可能的作用因素,并结合哈茨木霉基因在不同培养条件下的转录情况对耐药机制和相关基因靶点进行分析。针对盐对真菌耐药性产生影响的问题,本文利用浓度梯度调控,研究了海盐对哈茨木霉的潮霉素B耐受性影响。研究结果表明海盐的存在会显着提高海洋来源的哈茨木霉对潮霉素B的耐受性,使耐药浓度从40 μg/mL提高至500 μg/mL。六株真菌的潮霉素耐受性实验结果表明,海盐对五株其他海洋或陆地来源的真菌（两株塔宾曲霉,两株黑曲霉和一株毛霉）也有同样的作用。同时,海盐也可提高哈茨木霉对同类氨基糖苷抗生素G418以及非同类抗真菌药物多菌灵的耐受性。但这并非是由于海盐引起的渗透压改变或潮霉素B与离子发生螯合导致的,主要起到作用的是海盐中存在的一些金属阳离子包括K+,Na+,Mg2+和Ca2+,且作用强度为Ca2+>K+>Mg2+>Na+。阴离子中SO42-可能对耐药性有一定作用,而Cl-和Br-几乎不起作用。对海盐和潮霉素B存在下哈茨木霉的转录情况进行分析,发现三种潜在的耐药机制。首先,海盐存在下真菌的细胞壁及其相关基因的表达量发生变化,细胞壁厚度变为原来的2.3倍,可能形成生物膜,一定程度上阻碍了药物的进入。其次,海盐和潮霉素诱导钠钾泵蛋白和药物转运蛋白的相关基因表达量上调,调节离子稳态及促进药物外排导致耐药性增加。最后,海盐和潮霉素可能激活了氨基糖苷钝化酶,使潮霉素B钝化从而提高哈茨木霉的耐受性。利用CRISPR Cas9技术对相关的显着差异表达基因进行敲除,突变株的耐药实验结果表明,编码钠钾泵蛋白的M431DRAFT512552基因在盐诱导哈茨木霉的潮霉素B耐药性产生上起到较大作用,在含有海盐的PDA上,600 μg/mL潮霉素B对突变株Δ512552的抑菌率比野生型低19.06%;17-β羟基类固醇脱氢酶突变株△504126对潮霉素B耐受性略有提高,在PDA和含有海盐的PDA上潮霉素B对突变株△504126的抑菌率分别比野生型低8.51%和7.50%;此外,氨基酸通道蛋白△506686突变株对潮霉素B的耐受性也略有变化,在普通PDA上对潮霉素B的最高耐受浓度从野生型的 50 μg/mL 提高至 70 μg/mL。本研究有望丰富真菌耐药机制的研究,为新的抗生素或药物研发提供可选择的作用靶点,这对临床合理使用抗真菌药物、降低耐药性菌株有重要意义。
李俊辉[4]（2020）在《深绿木霉荧光蛋白标记体系构建及对西洋参根腐病的生防作用研究》文中进行了进一步梳理西洋参根腐病作为土传病害,给西洋参的种植造成了严重影响。而木霉作为一种重要的生防真菌,在生物防治领域有重要的贡献。实验室前期研究中发现,深绿木霉（Trichoderma atroviride）HB20111对该病具有较好的防治效果。因此,本论文以深绿木霉为研究对象,一方面利用分子标签技术,改造深绿木霉菌株,使其成为我们“可视化”的工具。另一方面,通过高通量测序,从土壤微生物群落的角度,探究应用深绿木霉后对西洋参根际土壤微生物群落的影响,从生态学角度探究深绿木霉HB20111防治根腐病的相关机制,以期为西洋参根腐病相关的生物防治提供一定的理论依据。实验取得的结果如下:（1）以植物与农杆菌双元表达质粒（p CAMBIA1301）为母载体,在多克隆为点处引入来源于真菌RNAi基因沉默干扰质粒（p Silent-1）的Hyg表达框、Trcp启动子和终止子序列。构建了丝状真菌表达载体P-Trcp-HYG-Ds Red-GPDA,然后以含红色荧光蛋白基因的质粒p CMV-C-Ds Red为模板,克隆获得红色荧光蛋白基因序列,插入载体多克隆位点作为报告基因;同时在红色荧光蛋白N端引入真菌gpd A启动子（来源于p AN8-1-gpd A）,通过农杆菌介导的遗传转化法,最终获得表达红色荧光蛋白的深绿木霉菌株,为深绿木霉HB20111与植物或植物病原菌的互作研究提供了强有力的技术工具。（2）通过农杆菌介导转化实现工具载体在深绿木霉内的转化表达,荧光显微镜下观察到带有红色荧光蛋白表达的木霉转化菌株。转化过程中,实验确定以150μg/m L的潮霉素B作为筛选转化子的筛选浓度,以150μg/m L的头孢霉素作为农杆菌的抑菌浓度;正交试验优化了农杆菌的转化方法,结果发现,我们确定最佳的实验条件为农杆菌OD值为0.8,共培养时间为36h和孢子的浓度为106个/m L时,转化效率最高,我们按最佳的转化条件进行实验;通过探究三种农杆菌EHA105,LBA4404和AGL1对深绿木霉的转化效率时发现,使用EHA105农杆菌用于深绿木霉的转化其效果最佳,是深绿木霉（HB20111）的最佳农杆菌类型。最终的转化效率达到约110个转化子/106个木霉孢子。（3）探究了在大田实验中,接种深绿木霉对西洋参出芽率、西洋参根腐病的发病率的影响;实验结果发现接种木霉的试验组的西洋参的发芽率要高于对照组,在防治西洋参根腐病的发病率上,接种深绿木霉能有效防控根腐病,其防治效果高达74.2%;通过高通量测序和现代生物信息学方法,分析了接种深绿木霉对西洋参根际微生物群落结构和丰度的影响,其结果发现:接种深绿木霉对西洋参根围组的真菌和细菌微生物多样性影响不大;但在根际中,接种木霉的西洋参根际真菌和细菌群落结构和丰度则发生了显着变化;通过真菌的功能预测发现,接种深绿木霉可以显着减少西洋参根际群落中植物病原菌的相对丰度,通过微生物之间的互作关系网络图发现,木霉对其中包含西洋参根腐病病原镰刀菌在内的多种植物病原菌呈负相关性。
李俊香[5]（2019）在《甜瓜棒孢叶斑病菌鉴定及农杆菌介导的遗传转化体系建立》文中研究表明甜瓜（Cucumis melo L.）是我国最重要的葫芦科作物之一,栽培广泛,具有重要的经济价值。为害甜瓜的病害多达数十种,其中真菌病害最为普遍,侵染的真菌种类也较多,而且仍然存在新突发病害。本文鉴定一种甜瓜叶斑病,研究该病菌的生物学特性,筛选针对该病菌的杀菌剂,以期指导该病害的防控;同时应用农杆菌介导方法,创建该病菌的突变体库,为致病基因研究奠定基础。取得的主要研究结果如下:1、甜瓜棒孢叶斑病菌鉴定2015年10月在我国广西武鸣甜瓜主要种植区进行病害调查时发现一种叶斑病。将病样分离病原真菌,通过形态学观察、多基因鉴定和致病性试验鉴定病原菌。在PDA平板上,病原菌菌落圆形,中间墨绿色,边缘浅褐色,气生菌丝茂盛。分生孢子呈圆柱形或倒棍棒形,单生或串生,直立或稍微弯曲,具0-13个隔膜,大小为3.1-6.4×14-138.9μm。通过克隆并测定该菌的4个保守序列ITS1,2、ITS4,5、ACT和TUB2,说明该菌为多主棒孢。甜瓜叶片上分离纯化的病原菌回接到甜瓜幼苗,表现出与病害调查时田间相似的症状并再次分离到同一病原菌。该菌通常危害植物叶片引起叶斑病,寄主广泛。接种该病原菌的西瓜（Citrullus lanatus）和黄瓜（Cucumis sativus L.）幼苗及离体叶片也可以发病。病原菌菌丝生长的适宜碳源是可溶性淀粉和葡萄糖,适宜氮源是KNO3、NaNO3和蛋白胨,适宜温度是25-29°C,适宜pH是6-9。适宜分生孢子萌发的碳源是蔗糖和葡萄糖,pH是5-8。2、甜瓜棒孢叶斑病菌杀菌剂筛选为筛选甜瓜棒孢叶斑病菌的高效杀菌剂,在室内采用菌丝生长速率法测定22种杀菌剂对甜瓜棒孢叶斑病菌Cc-SY和Cc-12菌株菌丝生长的抑制能力。结果表明,50%咪鲜胺锰盐WP对甜瓜棒孢叶斑病菌Cc-SY和Cc-12菌株的EC50都最小,病菌对它的敏感性最高,抑菌效果最好;30%苯醚甲环唑SC、40%氟硅唑EC和80%福美双WG对甜瓜棒孢叶斑病菌Cc-12菌株的EC50均小于5μg/mL,抑菌效果较好,但在Cc-SY菌株上抑菌效果减弱。在试验浓度下,2个甜瓜棒孢叶斑病菌供试菌株对25%嘧菌酯SC、75%百菌清WP和90%多菌灵WG都非常不敏感,说明这3种杀菌剂对甜瓜棒孢叶斑病的防控不能起到有效作用。3、甜瓜棒孢叶斑病菌全基因组测序对多主棒孢甜瓜分离物Cc-12菌株进行了全基因组测序,获得了大小为44 M的基因组序列。以模式真菌的分化时间作为校正时间,估算C.cassiicola的分化时间为82.5 Mya。细胞降解酶是真菌成功侵染并定殖寄主的重要因子,注释结果显示葡萄糖苷水解酶有351个。4、农杆菌介导的多主棒孢遗传转化本研究利用ATMT转化技术,将T-DNA随机插入到甜瓜棒孢叶斑病菌基因组中,获得了具有潮霉素抗性的甜瓜棒孢叶斑病菌T-DNA插入突变体,初步建立了稳定高效的根癌农杆菌介导的甜瓜棒孢叶斑病菌遗传转化体系。同时,优化转化效率的影响因素,转化效率可以达到每106个分生孢子转化获得102-148个转化子。这为获得致病突变体材料提供潜在可能,为深入研究多主棒孢菌的致病机制奠定基础。突变体分子鉴定检测到潮霉素磷酸转移酶基因片段特异条带,Southern blot杂交结果表明T-DNA是随机整合到Cc-12菌株基因组中的,突变体单拷贝比例为90%。表型变异突变体对其进行致病性试验。筛选出3株无致病力突变体（CT0001,CT0022和CT0013）,1株致病力严重减弱突变体（CT0005）。利用TAIL-PCR技术和多主棒孢的基因组数据,进一步获得了这4株单拷贝插入低致病力突变体T-DNA的侧翼序列。这些结果为进一步鉴定致病相关基因奠定了基础。
田程[6]（2019）在《哈茨木霉T2-16防控西瓜枯萎病的微生态机制初探》文中提出为探明土壤接种哈茨木霉T2-16对西瓜枯萎病发生的影响及其微生态学机制,本试验利用连作6年西瓜土壤设计3个处理方式:105个/g木霉孢悬液拌土（A）、105个/ml木霉孢悬液浸种（B）和清水对照（CK）进行盆栽试验。通过调查栽种在该土壤之中的西瓜品种早佳“8424”的枯萎病发病率和生长势,木霉菌在西瓜根部定殖动态变化,以及根际土壤酶活性和微生物群落结构等指标,来探究哈茨木霉T2-16微生态调控防治西瓜枯萎病的机理,为西瓜枯萎病的综合防控提供理论依据。试验主要结果如下:1、哈茨木霉T2-16不同处理方式能有效防控西瓜枯萎病的发生,同时对西瓜植株具有促生效应。30d后,各处理西瓜枯萎病发生程度趋于稳定状态。其中,A处理防治西瓜枯萎病效果最好,其相对防效达到了67.41%;另外,该处理中的单株西瓜平均蔓长、地上部鲜重分别达到了87.25 cm、35.86 g,较CK分别增加了54.20%、179.07%。2、以PEG-CaCl2为介导,利用原生质体转化法建立了哈茨木霉T2-16的最适转化体系,20℃,1000μg/ml的G418浓度培养条件下,成功获得了能稳定表达绿色荧光蛋白的哈茨木霉T2-16转化菌株TG2-10。通过生物学特征鉴定发现TG2-10与野生型菌株生长速率、产孢量、生防效果以及菌落形态等特性无明显差异。利用激光共聚焦显微镜观察发现转化菌株TG2-10能侵染并有效定殖于西瓜根系组织,并在西瓜根系缠绕形成类网状结构。3、利用实时荧光定量PCR技术对木霉菌与尖孢镰刀菌西瓜专化型（FON）进行定量检测,结果表明施加哈茨木霉T2-16后,根际土壤中木霉菌数量相对于清水对照增加了10倍的数量集,且在发病全过程中保持稳定水平;与此同时,随着西瓜枯萎病发生,西瓜根际土壤和根系中FON数量发生显着变化,A处理的根际土壤中FON数量呈先增加后降低的变化趋势,西瓜根系中FON数量低于定量检测下限;相反地,CK处理西瓜根际土壤中FON数量呈先降低后增加的变化趋势,西瓜根系中FON数量呈先升高后降低的变化趋势。说明哈茨木霉T2-16能诱导木霉菌高效增殖来有效阻止FON对西瓜植株的侵染。4、土壤中施加哈茨木霉T2-16能有效增加可培养细菌和放线菌的数量,减少可培养真菌的数量,在发病高峰期时效果最明显。同时,对西瓜根际土壤的酶活性检测发现,哈茨木霉T2-16能不同程度提高土壤中酸性磷酸酶（S-ACP）、蔗糖酶（S-SC）、纤维素酶（S-CL）以及过氧化氢酶（S-CAT）活性;随着西瓜枯萎病的发生,根际土壤酶活性有着不同程度的变化,其中S-ACP和S-CAT活性呈先上升后降低再上升的趋势,S-CL活性不断上升至发病高峰期后逐渐下降,而S-SC活性呈显着增加趋势。5、通过微生物16S/ITS高通量测序分析发现,哈茨木霉T2-16能提高土壤中细菌微生物多样性,降低真菌微生物多样性。分析细菌种群结构发现,哈茨木霉T2-16能显着降低土壤中Mizugakiibacter、Jatrophihabitans和Gemmatirosa等细菌菌属的丰富度,增加Sphingomona、Streptomyces和Pseudomonas的丰富度,其中Pseudomonas的丰富度增加了130多倍。分析真菌种群结构发现,Trichoderma在A处理中维持在48.98%-70.48%的丰富度,而在CK处理中只有0.74%-2.54%的丰富度,进一步说明哈茨木霉T2-16能稳定地在土壤及西瓜根际定殖。并且,哈茨木霉T2-16能不同程度降低土壤中Penicillium、Chaetomium、Aspergillus等真菌菌属的丰富度。另外发现,土壤中细菌菌属Sphingomonas、Streptomyces、Pseudomonas和真菌菌属Trichoderma、Arthrographis、Talaromyces等与西瓜枯萎病发病率呈负相关关系,而细菌菌属Jatrophihabitans、Escherichia-Shigella、Gemmatimonas和真菌菌属Chaetomium、Dendroclathra、Zopfiella等与西瓜枯萎病发病率呈正相关关系。
田程,张屹,肖姬玲,朱菲莹,唐炎英,魏林,梁志怀[7]（2019）在《哈茨木霉T2-16的GFP标记及其生防特性》文中研究指明优化高效拮抗生防菌哈茨木霉T2-16的转化条件,筛选出与野生型菌株具有相似生防特性的阳性转化子,为生防木霉菌T2-16的定殖动态、分布规律等研究打下基础。通过PCR和分子克隆技术构建具有G418抗性基因的绿色荧光（GFP）表达载体pKN-sGFP,利用PEG-CaCl2介导的原生质体转化法,获得强荧光表达的哈茨木霉T2-16转化子,并将其与野生型菌株的生物特性进行比较,筛选出与野生型菌株具有相似生防特性的阳性转化子。试验结果显示,哈茨木霉T2-16在20℃培养条件下对1000μg/mL G418敏感,在上述优化条件下,转化获得稳定遗传的阳性转化子TG2-10;进一步比较其与野生型菌株的生物特性发现,两者之间无明显差异,可用于下一步哈茨木霉T2-16生防机理的研究。
李自博[8]（2018）在《人参根系自毒物质在连作障碍中的化感作用及其缓解途径研究》文中研究指明人参（Panax ginseng C.A.Meyer）是多年生药用植物,药用和经济价值极高,是我国名贵中药材。栽培过人参的参地俗称“老参地”,10-20年内不能重复栽参,否则会出现“烧须、烂根、病害多发、产量降低”等连作障碍问题。本研究利用高效液相色谱法分离鉴定了老参地人参根系分泌物中的自毒酚酸物质,采用宏基因组分子测序方法探明了其对人参根际土壤真菌多样性及结构的影响。选用哈茨木霉菌Tri41抑制人参锈腐病菌并消减人参根系分泌物中的自毒酚酸物质,通过基因标记明确了Tri41可以在土壤和有机肥的混合基质中定殖。提出一套“日光旋耕消毒+化学药剂灭生+生物菌肥复苏”的病害防治技术,旨在为人参连作障碍的解除提供理论基础依据。1.明确了水杨酸、没食子酸、苯甲酸、3-苯基丙酸和肉桂酸五种自毒酚酸物质是人参连作障碍中根系分泌的主要化感物质。本研究从连作六年的人参根际土壤中共收集鉴定出水杨酸、没食子酸、苯甲酸、3-苯基丙酸和肉桂酸五种酚酸物质的种类和含量。明确了这些酚酸物质会对人参种子萌发和人参幼苗生长有较强的抑制作用,另外也发现这五种酚酸物质对人参锈腐病病原菌的菌丝生长和孢子萌发有影响,这种影响取决于这几种酚酸在土壤中浓度大小。室内试验和盆栽试验研究均表明,水杨酸、没食子酸和苯甲酸在0.5mmol·L-1浓度下,3-苯基丙酸与肉桂酸在0.05mmol·L-1浓度下,自毒酚酸物质抑制人参种子萌发和人参幼苗生长,且抑制作用最强,同时也对人参锈腐病病原菌的促进作用最强。这五种自毒酚酸物质的存在会增加人参锈腐病的发病率,影响人参的品质,加重人参连作障碍。2.利用宏基因组分子测序方法证明了自毒酚酸物质可以改变根际土壤真菌结构,加重人参连作障碍的发生。对经过土壤真菌样本进行分析,经过五种自毒酚酸物质（肉桂酸除外）处理后的土壤中镰孢菌属（有性态赤霉属）和导致人参锈腐病的病原菌毁灭柱孢菌等致病菌数量显着增加。PCA分析表明,未种植人参的新林土、连作人参土壤和肉桂酸处理连作人参土壤这三组处理与其他酚酸处理空间分布较远,另外,这三组处理之间空间分布同样较远,这表明人参连作土壤的结构与未种植人参的新林土的土壤结构有很大差异,自毒酚酸物质（肉桂酸除外）处理后人参连作土壤的真菌结构发生了变化。酚酸处理后栽种的人参处理组的各项生长指标显着低于新林土栽种人参处理组,人参锈腐病的发病率和病害严重度显着高于新林土栽种人参处理组。根据土壤真菌系统发育分析的以及室外实验的结果可以看出,肉桂酸处理后的土壤真菌结构与未种植人参的新林土处理更为相似,虽然人参锈腐病发病率及病害严重度均与其他四种酚酸处理没有显着差异,但是人参生长指标较好。推测自毒酚酸物质中的肉桂酸可能不是导致人参连作障碍的主要原因。3.利用哈茨木霉菌Tri41抑制人参连作障碍中主要病害人参锈腐病的生长,并消减了土壤中存在的自毒酚酸物质。哈茨木霉菌Tri41通过空间竞争和营养竞争的方式抑制人参锈腐病的生长,在20℃条件下,哈茨木霉菌Tri41在9天时对人参锈腐病菌的抑制率为72.32%;25℃条件下,哈茨木霉菌Tri41在9天时对人参锈腐病菌的抑制率高达79.53%。通过将哈茨木霉菌Tri41和自毒酚酸物质共同培养发现,哈茨木霉菌Tri41可以显着消减人参根际土壤中的自毒酚酸物质。通过测定人参根系中重要的三种防御酶系,证明了五种自毒酚酸物质对人参根系防御酶的活性有降低作用,而生防木霉菌Tri41的加入可以提高人参根系防御酶的活性。自毒酚酸物质对人参连作障碍中主要的土传病害-人参锈腐病的病原菌的生长有促进作用,施入生防哈茨木霉菌Tri41后,消减了土壤中的五种酚酸物质,显着降低了人参锈腐病的发病率及病害严重度。4.确定了生防哈茨木霉Tri41可以在有机肥和土壤的混合体中长期定殖。通过农杆菌AGL-1将原生质体导入哈茨木霉菌Tri41中,获得的哈茨木霉转化子Tri41-g,遗传稳定性强,荧光性强。哈茨木霉转化子Tri41-g在菌丝生长、产孢量及抑菌能力等方面与原始野生菌株差异不显着,产孢和菌丝生长对环境的最适条件没有发生变化,能够稳定遗传,且荧光性较强。转化子Tri41可以发挥重要作用,在土壤和有机肥中定殖的试验研究继续使用。本研究继续利用绿色荧光基因标记技术分别跟踪并监测了哈茨木霉转化子Tri41-g在有机肥、新林土土壤以及土肥混合中的定殖动态,另外还探究了是否种植人参植株,对转化子Tri41定殖的影响。结果表明哈茨木霉转化子Tri41-g可以稳定遗传并且可以长时间定殖在土肥混合的处理组中,哈茨木霉转化子Tri41-g的菌落数量在土肥混合的处理组中显着高于其他处理组。种植人参的土肥混合处理更有利于哈茨木霉转化子Tri41-g的定殖。5.提出一套“日光旋耕消毒+化学药剂灭生+生物菌肥复苏”老参地病害防治技术。经田间验证表明,此技术可有效地改善土壤微生物区系,降低人参病害发病率,提高人参产量和质量。本研究与人参主产区的种植基地合作,采用化学药剂棉隆和多菌灵拌肥处理、物理轮作、翻晒处理等多种改良措施,研究了其对人参连作土壤微生物区系、土壤化学性质、土壤酶活性、人参主要生长指标和人参锈腐病发病率的影响。结果表明,未经药肥处理的人参连作土壤中土壤真菌含量最多,土壤酸化严重,土壤化学性质最差,土壤酶活性最低,生长指标最低且人参锈腐病发病最重。未栽参的森林土处理则反之。药肥处理可使人参连作土壤中真菌数量下降27%,碱化土壤pH,增强土壤化学性质,提高土壤酶活性,人参生长指标提高52%,人参锈腐病的发病率下降69%。相比于轮作玉米处理组和翻晒处理组,棉隆和多菌灵拌肥两组处理,特别是棉隆拌肥处理的改良效果更好,有效地缓解了人参连作障碍。对于人参生产实践,解除人参连作障碍具有理论基础和指导意义。
解宇娇[9]（2018）在《人参生防菌Psn86对有机专用肥适生机制及生防效果研究》文中研究表明人参（Panax ginseng C.A.Mey）历来被视为百草之王,是我国最重要的药用植物之一,具有极高的药用价值,也是长白山区调整农业种植结构、农民增收致富的主要途径。国家明令禁止新林地开垦栽参,故农田栽参将成为一种必然趋势。农田地杂菌繁多,人参病害加重且防治较难,进而对人参的品质及产量造成严重影响。木霉菌作为生防菌广泛应用于植物病害防治,目前国内外关于木霉菌防治植物土传病害已有大量报道。近年来,将具有调节植物生长、改良土壤特性、拮抗土传病原微生物等功能的一种或多种微生物与传统有机肥复配,经二次发酵制得的生物有机肥广受好评。本文对生防菌哈茨木霉Psn86的主要生物学特性、对人参锈腐病菌抑制作用、GFP标记及定殖示踪及在土壤和有机肥中的定殖示踪、与有机肥混合对人参防御酶系的影响进行了研究,为生防菌哈茨木霉Psn86的防病机制和推广应用提供理论依据。1.生防菌哈茨木霉Psn86的主要生物学特性。对生防菌哈茨木霉Psn86主要生物学特性研究表明,哈茨木霉Psn86菌丝生长最适培养基为PSA,产孢最适培养基为PDA;哈茨木霉Psn86菌丝生长和产孢最适培养pH值均为6;最适培养温度均为30℃,最适碳源均为蔗糖,最适氮源均为牛肉膏,最适培养时间均为第3d,哈茨木霉Psn86菌丝生长最适光暗条件为全黑暗培养,产孢最适光暗条件为光照。2.哈茨木霉Psn86对人参锈腐菌抑制作用。通过对峙培养,研究了生防菌哈茨木霉Psn86对人参锈腐病菌的拮抗作用。结果表明,温度影响生防菌株哈茨木霉菌Psn86对人参锈腐病菌的抑制作用,20℃下哈茨木霉菌Psn86对人参锈腐病菌的抑制率为75.82%,25℃下哈茨木霉菌Psn86对人参锈腐病菌的抑制率为81.33,升高了7.27%。通过室内盆栽试验防效测定结果表明,预防试验处理组的防治效果明显好于治疗试验处理组,转代培养对哈茨木霉Psn86的抑制能力没有较大影响。3.生防菌哈茨木霉Psn86的GFP标记及定殖示踪及在土壤和有机肥中的定殖示踪。利用农杆菌介导的真菌遗传转化技术,成功地将带潮霉素基因和gfp基因的质粒AGL-1转到了生防菌哈茨木霉菌Psn86菌株内,得到了转化子菌株Psn86-g。本试验中获得的转化子菌株Psn86-g,遗传稳定且荧光性强。将转化子菌株Psn86-g与菌株Psn86在培养时间、pH、温度和对人参锈腐病菌的抑菌作用等条件下菌丝和产孢的情况进行了比较,试验结果表明:与菌株Psn86相比,转化子菌株Psn86-g菌丝生长和产孢均略低,但菌丝最适生长条件和产孢最适生长条件没有发生变化,抑菌能力由84.00%下降到81.60%,但是差异不显着。4.生防菌哈茨木霉Psn86与有机肥混合对人参防御酶系的影响。通过对土肥混合以及土肥混合接种人参锈腐病对人参7种防御酶活性及ASAFR和H2O2含量测定,结果表明,与对照相比,土肥混合以及土肥混合接种人参锈腐病均会诱导人参氧化物酶（POD）,超氧化物歧化酶（SOD）,过氧化氢酶（CAT）,丙苯氨酸解氨酶（PAL）,多酚氧化酶（PPO）等多种防御酶活性上升,防御酶活性维持在较高的水平,可以使人参植株的抗病性增强。由以上结论可以推测,哈茨木霉Psn86主要抗病机制为诱导人参植株防御酶系活性的增加。
蔡枫[10]（2017）在《木霉NJAU 4742促生作用及其Hydrophobin家族基因特性研究》文中指出木霉Trichodermaguizhouense NJAU 4742是由本课题组分离筛选并进行商业化应用（生物有机肥）的重要菌株。在盆栽和大田实验条件下,该菌株均表现出优异的植物促生和生防土传真菌病害的功效。围绕其开展的一系列研究工作不仅具有科学参考价值,而且具有重要的实际指导意义。Hydrophobin（简写为HFB）,是一类丝状真菌特有的具有高度表面活性的双亲小分子蛋白,其同时拥有疏水结构域和亲水结构域,可以自组装式地在疏水-亲水界面形成单分子蛋白膜,这对真菌自身生长及与周围环境或宿主互作都具有重要生物学意义。本研究首先对该菌株进行了盆栽和大田实验以验证其植物促生效应和根际定殖能力;然后利用基因转录分析、酵母异源表达、基因敲除和超表达等方法,在基因和蛋白水平上探究了木霉NJAU 4742菌株hfb家族基因的特性,主要结果如下:1.在盆栽和田间试验条件下,NJAU 4742菌株可有效定殖于根际,并促进番茄苗生长,与不接菌对照组相比生物量提高20%以上,田间产量提高10%。通过HPLC、LC/MS、GC/MS、NMR等手段从该菌株发酵液中分离纯化获得一促生活性物质——Harzianolide,可显着促进番茄根系生长和根尖分化,可能是NJAU 4742促生作用的重要机理之一。2.通过基因挖掘技术,从NJAU 4742菌株基因组中发现10个hfb基因,并较为完整地绘制了木霉HFB小蛋白家族的系统发育进化树,整理和命名了 16个HFB蛋白（hfb基因）,首次发现并命名7个新的HFB蛋白（hfb基因,分别是hfb8、hfb10、hfb11、hfb12、hfb14、hfb15、hfb16）。同时,对NJAU4742菌株（培养基内）营养菌丝和（培养基上）气生菌丝的HFB家族全员转录响应分析（HFBome）表明,hfb4、hfb10、hfb8和hfb3为两种菌丝形态阶段的主要表达基因,hfb4为孢子形态阶段的唯一（hfb家族）表达基因;并发现,与植物体共培养并不能显着影响hfb基因转录水平的变化,hfb4除外——hfb4的转录水平在木霉与植物体共培养时显着降低,猜想HFB4极有可能参与了木霉与宿主植物识别、互作等重要过程,猜想在后文得到证实。3.利用毕赤酵母（Pichiapastories）胞外表达系统,高效表达了三个具有表面活性的HFB小蛋白（基因来自木霉）:HFB4、HFB8和HFB15及其带蓝绿色和粉色荧光标记的HFB4::GFPuv和HFB8::mRFP融合蛋白,为后续跟踪定位HFB分布、转移提供了可能;且发现HFB蛋白可有效附着于人工材料如玻璃珠和生物体材料如植株根系,证明HFB蛋白参与木霉定殖根表过程。4.将PEG介导的木霉菌原生质体转化技术与部分重叠PCR技术（overlapping-PCR）及真菌菌落PCR技术相结合,对哈茨木霉基因编辑技术进行改进,成功地在1个月内完成基因敲除与突变子纯化等全部必要操作;分别获得T.guizhouense NJAU 4742及哈茨木霉国际标准株T.harzianum CBS 226.95的hfb4敲除株4株和3株,hfb4超表达株各3株。同时,对相关超表达株的hfb4基因拷贝数进行了 qPCR鉴定,验证各超表达菌株均含2拷贝hfb4（野生型为1拷贝）。5.通过对NJAU 4742及其姐妹菌株T.harzianum CBS 226.95的hfb4突变子进行表型研究,明确hfb4的基因功能:HFB4是T.guizhouense NJAU 4742菌株HFB家族中最为主要和关键的成员之一,证明其直接参与了真菌通过分泌HFB蛋白降低液体表面张力以长出气生菌丝的过程;并在气生菌丝生长阶段与HFB3、HFB8和HFB10一同为菌丝提供支撑、保护和粘附作用,直至产孢;最后在孢子表面形成HFB4蛋白膜,以增加孢子表面疏水性,帮助孢子通过风媒传播。同时,HFB4可帮助木霉菌抵御杀真菌剂（氟康唑）和氧化剂（甲萘醌）的侵害,其包裹在细胞表面增加细胞表面疏水性,产生类似“雨衣”的效应,极有可能是木霉菌抵御外界不良环境因子及氧自由基的重要分子,而对两性霉素B起到“锚定”作用,增加其对细胞的毒害;另外,HFB4也是NJAU 4742菌株应对机械损伤的响应蛋白,在受到机械损伤时hfb4转录水平显着上调,基因敲除后,相关反应“迟钝”。然而,相关表型在T.harzianum中相反,这主要是由于菌株间hb家族成员的内部调控差异造成的。在姐妹菌株T.harzianum CBS 226.95中,HFB4的功能极有可能被HFB10取代,T.harzianum的孢子表面疏水性主要来源于hfb10的表达,hfb4的敲除不产生显着影响。此外,HFB4还参与了木霉菌-植物-病原真菌的互作过程,其可调节菌丝表面的亲疏水性（粘附性）。综上,Trichoderma guizhouense NJAU 4742是一株高效的植物促生菌,其促生机理之一是分泌类植物激素Harzianolide促进作物根系生长;其可有效定殖根表的原因之一拥有数量众多的表面活性小蛋白HFB;主要表达基因hfb4参与了木霉菌气生菌丝形成、菌丝和孢子表面疏水性能维持、孢子风媒传播、机械损伤反应、逆境抵御及病原真菌拮抗等一系列过程。
二、对哈茨木霉转化子菌体形态观察及抗药性测定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、对哈茨木霉转化子菌体形态观察及抗药性测定（论文提纲范文）
（1）绿木霉菌GV29-8厚垣孢子形成分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要符号对照表 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 木霉菌及其生物防治应用现状和存在的问题 |
| 1.1.1 木霉菌概述 |
| 1.1.2 木霉菌的生物防治作用机制 |
| 1.1.3 木霉菌的生物防治应用现状 |
| 1.1.4 木霉菌生防制剂种类及其在生产应用中存在的问题 |
| 1.2 真菌厚垣孢子形成的相关研究 |
| 1.2.1 真菌厚垣孢子概述 |
| 1.2.2 培养条件对真菌厚垣孢子形成的影响 |
| 1.2.3 真菌厚垣孢子形成的相关分子机制的研究 |
| 1.2.4 木霉菌厚垣孢子形成的相关研究 |
| 1.3 转录组测序技术在真菌厚垣孢子形成机制研究中的应用 |
| 1.4 真菌几丁质代谢途径的功能研究 |
| 1.4.1 真菌几丁质的功能 |
| 1.4.2 真菌几丁质代谢途径 |
| 1.5 研究的目的和意义 |
| 1.6 研究技术路线 |
| 第二章 绿木霉GV29-8 菌株厚垣孢子形成的转录组学研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 菌株培养 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 仪器 |
| 2.1.4 取样 |
| 2.1.5 c DNA文库的构建及转录组测序 |
| 2.1.6 测序数据的生物信息学分析 |
| 2.1.7 使用RT-q PCR验证转录组数据 |
| 2.1.8 绿木霉菌GV29-8 厚垣孢子形成过程中糖原、脂质和几丁质的含量分析 |
| 2.1.9 统计分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 绿木霉GV29-8 菌株厚垣孢子的形成过程观察及转录组测序时间点的确定 |
| 2.2.2 转录组数据统计分析 |
| 2.2.3 厚垣孢子形成过程中各样本之间的相关性分析 |
| 2.2.4 厚垣孢子形成过程中差异基因表达分析 |
| 2.2.5 相邻阶段比较DEGs的 GO和 KEGG富集分析 |
| 2.2.6 相邻时间点比较DEGs的 GO和 KEGG富集分析 |
| 2.2.7 相邻时间点比较DEGs的 STC分析 |
| 2.2.8 厚垣孢子形成过程中表达基因加权共表达网络(WGCNA)分析 |
| 2.2.9 绿木霉菌GV29-8 在厚垣孢子形成过程中糖原、脂质和几丁质含量的变化 |
| 2.2.10 RNA-seq基因表达的验证 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 氨基糖和核苷糖代谢通路关键基因对绿木霉GV29-8 厚垣孢子形成的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 供试菌株、质粒和引物 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.1.4 N-乙酰-D-氨基葡萄糖对绿木霉GV29-8 菌株厚垣孢子形成的影响 |
| 3.1.5 Ech2 基因敲除突变株的获得 |
| 3.1.6 Ech2 基因回复突变株的获得 |
| 3.1.7 Ech2 基因过表达突变株的获得 |
| 3.1.8 Ech2 基因对绿木霉GV29-8 菌株厚垣孢子形成的影响 |
| 3.1.9 Chs1_7926和Chs1_8917 基因敲除突变株的获得 |
| 3.1.10 Chs1_7926和Chs1_8917 基因回复突变株的获得 |
| 3.1.11 Chs1_7926和Chs1_8917 基因过表达突变株的的获得 |
| 3.1.12 Chs1_7926和Chs1_8917 基因对绿木霉GV29-8 菌株厚垣孢子形成的影响 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 N-乙酰-D-氨基葡萄糖影响绿木霉GV29-8 菌株厚垣孢子的形成 |
| 3.2.2 Ech2 基因对绿木霉GV29-8 菌株厚垣孢子形成的影响 |
| 3.2.3 Chs1_7926和Chs1_8917 基因对绿木霉GV29-8 菌株厚垣孢子形成的影响 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 结论 |
| 4.1 主要结论 |
| 4.2 主要创新点及研究成果 |
| 4.3 存在的问题和展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
（2）TasMYB27转录因子调控棘孢木霉抗链格孢菌分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1 绪论 |
| 1.1 引言 |
| 1.2 木霉菌抗病相关转录因子的研究 |
| 1.3 MYB转录因子的研究 |
| 1.4 木霉菌的防御胁迫机制及链格孢菌次生代谢物的研究 |
| 1.5 木霉菌的转基因方法及应用 |
| 1.6 本研究的主要内容及目的意义 |
| 2 棘孢木霉MYB转录因子家族的生物信息学分析 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 数据库 |
| 2.1.2 分析软件 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 棘孢木霉MYB转录因子家族成员的鉴定 |
| 2.2.2 棘孢木霉MYB基因结构分析及系统进化树构建 |
| 2.2.3 棘孢木霉MYB基因氨基酸序列motif分析 |
| 2.2.4 棘孢木霉MYB基因启动子区域顺式作用元件预测 |
| 2.2.5 木霉基因组TasMYB27转录因子及同源序列的系统发育及比对结果 |
| 2.2.6 木霉基因组TasMYB27转录因子及同源序列的蛋白质结构分析 |
| 2.3 试验结果与分析 |
| 2.3.1 TasMYBs转录因子家族的鉴定和分类 |
| 2.3.2 TasMYBs转录因子家族的保守结构域及基因结构分析 |
| 2.3.3 TasMYBs转录因子家族的motif可视化分析 |
| 2.3.4 TasMYBs转录因子家族的顺式作用元件可视化分析 |
| 2.3.5 木霉基因组TasMYB27及同源序列的系统进化树及比对分析 |
| 2.3.6 木霉基因组TasMYB27及同源序列的蛋白质结构分析 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 棘孢木霉MYB家族的讨论 |
| 2.4.2 TasMYB27转录因子及其同源基因的讨论 |
| 2.5 本章小结 |
| 3 棘孢木霉TasMYB27转录因子的遗传转化和转化子生理活性检测 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 菌株与质粒 |
| 3.1.2 引物 |
| 3.1.3 培养基 |
| 3.1.4 主要试剂及仪器 |
| 3.2 试验材料 |
| 3.2.1 棘孢木霉基因组DNA及总RNA的提取 |
| 3.2.2 棘孢木霉TasMYB27基因的克隆 |
| 3.2.3 棘孢木霉TasMYB27基因表达特性分析 |
| 3.2.4 过表达载体构建及PEG介导原生质体的木霉遗传转化 |
| 3.2.5 转基因棘孢木霉的PCR检测 |
| 3.2.6 转基因棘孢木霉的形态及显微观察 |
| 3.2.7 转基因棘孢木霉的抗病能力检测 |
| 3.2.8 转基因棘孢木霉的酶活检测 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 棘孢木霉TasMYB27基因的获得与分析 |
| 3.3.2 棘孢木霉TasMYB27基因的表达模式 |
| 3.3.3 棘孢木霉TasMYB27基因过表达载体的获得 |
| 3.3.4 转基因棘孢木霉的获得 |
| 3.3.5 转基因棘孢木霉的分子检测 |
| 3.3.6 转基因棘孢木霉的形态及显微观察 |
| 3.3.7 转基因棘孢木霉的抗病能力检测 |
| 3.3.8 转基因棘孢木霉的酶活能力检测 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 棘孢木霉遗传转化的讨论 |
| 3.4.2 棘孢木霉转化子抗链格孢菌能力的讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 4 棘孢木霉TasMYB27转录因子蛋白表达纯化和下游基因作用元件的识别 |
| 4.1 试验材料 |
| 4.1.1 菌株与质粒 |
| 4.1.2 引物 |
| 4.1.3 培养基 |
| 4.1.4 主要试剂及仪器 |
| 4.2 试验方法 |
| 4.2.1 原核表达载体构建及蛋白融合菌株的转化 |
| 4.2.2 重组蛋白的小量诱导表达及诱导条件优化 |
| 4.2.3 重组蛋白的纯化 |
| 4.2.4 TasMYB27自激活活性验证 |
| 4.2.5 随机DNA文库筛选 |
| 4.2.6 pGADT7-rec2-TasMYB27与pHIS2-元件的酵母单杂交 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 c5x-TasMYB27原核表达载体的获得 |
| 4.3.2 TasMYB27重组蛋白的小量诱导表达 |
| 4.3.3 c5x-TasMYB27重组蛋白的诱导表达条件优化 |
| 4.3.4 重组蛋白rTasMYB27的纯化 |
| 4.3.5 pGBKT7-TasMYB27载体的获得 |
| 4.3.6 pGBKT7-TasMYB27转录自激活活性检测 |
| 4.3.7 pGADT7-rec2-TasMYB27载体的获得 |
| 4.3.8 与TasMYB27结合的随机DNA文库序列的确定 |
| 4.3.9 pGADT7-rec2-TasMYB27与pHIS2-元件的酵母单杂交 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 TasMYB27蛋白诱导表达和纯化的讨论 |
| 4.4.2 TasMYB27结合顺式作用元件调控下游基因的讨论 |
| 4.5 本章小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表的学术论文 |
| 致谢 |
| 东北林业大学硕士学位论文修改情况确认表 |
（3）海盐诱导下哈茨木霉对潮霉素B的耐药机制探究（论文提纲范文）
| 学位论文数据集 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 真菌耐药现象 |
| 1.2 真菌耐药机制研究现状 |
| 1.2.1 药物转运能力的改变 |
| 1.2.2 药物靶标的改变 |
| 1.2.3 代偿和代谢途径的利用 |
| 1.2.4 生物膜的形成 |
| 1.3 氨基糖苷类药物抗性机制研究现状 |
| 1.3.1 胞内药物浓度的降低 |
| 1.3.2 药物靶标的修饰 |
| 1.3.3 药物钝化酶的修饰 |
| 1.3.4 潮霉素B抗性机制研究现状 |
| 1.4 盐对真菌生理状态影响研究现状 |
| 1.4.1 盐离子转运机制及稳态调节 |
| 1.4.2 盐对真菌生长代谢的影响 |
| 1.4.3 盐对药物作用的影响 |
| 1.5 木霉研究现状 |
| 1.5.1 木霉的组学研究现状 |
| 1.5.2 盐胁迫与木霉的研究现状 |
| 1.6 论文的研究意义与目的 |
| 1.7 论文的研究内容与方案 |
| 第二章 海盐对哈茨木霉耐药性的影响及作用因素探究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料和仪器 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 培养基的配制 |
| 2.3.2 不同浓度抗真菌药物培养基的配制 |
| 2.3.3 接菌方法 |
| 2.3.4 代谢产物的萃取及处理方法 |
| 2.3.5 代谢产物的液质检测方法 |
| 2.3.6 核磁检测方法 |
| 2.3.7 菌丝形态的观察 |
| 2.4 实验结果和讨论 |
| 2.4.1 海盐对不同真菌的潮霉素B耐受性影响 |
| 2.4.2 海盐对哈茨木霉的不同药物耐受性影响 |
| 2.4.3 渗透压对哈茨木霉的潮霉素B耐受性影响 |
| 2.4.4 不同离子对哈茨木霉等真菌的潮霉素B耐受性影响 |
| 2.4.5 离子螯合对哈茨木霉的潮霉素B耐受性影响 |
| 2.4.6 不同培养条件下菌丝形态及细胞壁的变化 |
| 2.4.7 不同培养条件下代谢产物的变化 |
| 2.5 本章小结 |
| 第三章 海盐对哈茨木霉及其潮霉素B耐受性影响的转录组学分析与分子机制探究 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料和仪器 |
| 3.2.1 实验材料 |
| 3.2.2 实验装置 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 样品的准备 |
| 3.3.2 表达量的计算及表达差异分析 |
| 3.3.3 差异基因功能注释 |
| 3.4 实验结果和讨论 |
| 3.4.1 差异表达基因数量分析 |
| 3.4.2 差异表达基因GO功能分类及富集 |
| 3.4.3 差异表达基因KOG功能注释及富集 |
| 3.4.4 差异表达基因KEGG注释 |
| 3.4.5 各种相关基因筛选 |
| 3.4.5.1 糖类代谢及转运相关基因 |
| 3.4.5.2 离子转运蛋白相关基因 |
| 3.4.5.3 药物转运蛋白相关基因 |
| 3.4.5.4 氨基糖苷类钝化酶相关基因 |
| 3.4.5.5 转录因子相关基因 |
| 3.4.5.6 其他基因 |
| 3.4.6 哈茨木霉对潮霉素B耐药分子机制分析 |
| 3.5 本章小结 |
| 第四章 耐药相关基因敲除突变株的构建及其潮霉素耐受性研究 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 实验材料和仪器 |
| 4.2.1 实验材料 |
| 4.2.2 实验仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 同源臂片段的构建 |
| 4.3.2 敲除质粒的构建 |
| 4.3.3 原生质体制备与转化 |
| 4.3.4 基因组DNA提取 |
| 4.3.5 转化子的验证 |
| 4.3.6 抗性实验方法 |
| 4.4 实验结果和讨论 |
| 4.4.1 目标敲除基因 |
| 4.4.2 敲除同源臂片段的构建 |
| 4.4.3 敲除转化子的筛选验证 |
| 4.4.4 Δ512552突变株耐药性研究 |
| 4.4.5 Δ504126突变株耐药性研究 |
| 4.4.6 Δ506686突变株耐药性研究 |
| 4.5 本章小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 5.1 结论 |
| 5.2 创新点 |
| 5.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 引物列表 |
| 致谢 |
| 研究结果及发表的学术论文 |
| 作者及导师简介 |
| 附件 |
（4）深绿木霉荧光蛋白标记体系构建及对西洋参根腐病的生防作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 木霉菌在生防方面的研究进展 |
| 1.1.1 木霉菌拮抗机制 |
| 1.1.2 木霉菌促生作用 |
| 1.1.3 木霉菌对作物的生防研究进展 |
| 1.2 农杆菌介导的丝状真菌荧光蛋白遗传转化研究 |
| 1.2.1 农杆菌介导转化 |
| 1.2.2 农杆菌介导(ATMT)的真菌转化的特点 |
| 1.2.3 荧光蛋白标记在植物病理中的应用 |
| 1.3 西洋参根腐病相关研究进展 |
| 1.3.1 西洋参根腐病 |
| 1.3.2 生物防治相关研究 |
| 1.4 土壤微生物群落的研究进展 |
| 1.4.1 研究土壤微生物的重要性 |
| 1.4.2 高通量测序技术探究土壤微生物 |
| 1.5 本实验的研究意义和技术路线 |
| 1.5.1 研究意义 |
| 1.5.2 技术路线 |
| 第2章 真菌荧光蛋白表达载体的构建 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 菌株及质粒 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 所用引物及序列 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 质粒的转化 |
| 2.2.2 质粒的提取 |
| 2.2.3 实验操作 |
| 2.2.4 载体构建步骤 |
| 2.2.5 构建载体转化与验证 |
| 2.3 结果与讨论 |
| 2.3.1 重组质粒图谱 |
| 2.3.2 PCR检测电泳结果 |
| 2.3.3 酶切检测电泳结果 |
| 2.3.4 测序结果 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 农杆菌介导深绿木霉转化体系的构建与优化 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 菌株及质粒 |
| 3.1.2 培养基 |
| 3.1.3 试剂及器材 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 农杆菌的转化 |
| 3.2.2 确定抑制农杆菌生长所需的头孢霉素浓度 |
| 3.2.3 确定筛选木霉转化子所需的潮霉素B浓度 |
| 3.2.4 农杆菌介导转化深绿木霉 |
| 3.2.5 木霉基因组的提取与纯化 |
| 3.2.6 木霉转化子的验证 |
| 3.2.7 假定转化子的遗传稳定性分析 |
| 3.2.8 深绿木霉转化条件的优化 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 农杆菌转化PCR验证 |
| 3.3.2 筛选转化子所需潮霉素的B浓度 |
| 3.3.3 抑制农杆菌生长所需的头孢霉素浓度 |
| 3.3.4 假转化子检测 |
| 3.3.5 转化子的遗传稳定性分析 |
| 3.3.6 转化条件的优化 |
| 3.3.7 不同农杆菌对ATMT介导转化深绿木霉的转化效率的影响 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 高通量测序分析深绿木霉对西洋参根腐病的生防作用 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 菌株 |
| 4.1.2 试剂与耗材 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 实验设计 |
| 4.2.2 现场准备 |
| 4.2.3 样品的收集 |
| 4.2.4 样品的处理与调查 |
| 4.2.5 土壤样品基因组的提取 |
| 4.2.6 测序分析 |
| 4.3 结果与讨论 |
| 4.3.1 接种深绿木霉对西洋参出苗率的影响 |
| 4.3.2 接种深绿木霉对西洋参发病率的影响 |
| 4.3.3 OUT聚类分析 |
| 4.3.4 Alpha多样性分析 |
| 4.3.5 Bate多样性分析 |
| 4.3.6 菌群差异分析 |
| 4.3.7 土壤微生物的功能预测与分析 |
| 4.3.8 微生物之间的互作关系分析 |
| 4.4 本章小结 |
| 第5章 全文总结 |
| 5.1 总结 |
| 5.2 有待进一步研究的问题 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要科研成果 |
| 一、发表学术论文 |
| 附录 |
（5）甜瓜棒孢叶斑病菌鉴定及农杆菌介导的遗传转化体系建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 多主棒孢的研究进展 |
| 1.1.1 多主棒孢的分类地位和特征 |
| 1.1.2 多主棒孢的寄主范围及危害 |
| 1.1.3 多主棒孢叶斑病的防治 |
| 1.2 根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化研究进展 |
| 1.2.1 ATMT技术在真菌上的应用与发展 |
| 1.2.2 根癌农杆菌及其介导的真菌遗传转化 |
| 1.2.3 ATMT相对于其他转化技术的优点 |
| 1.2.4 ATMT技术在真菌中的研究趋势 |
| 1.2.5 ATMT技术存在的问题和局限 |
| 1.2.6 ATMT技术的未来及在真菌中的进一步应用 |
| 1.3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 甜瓜棒孢叶斑病菌鉴定 |
| 2.1 前言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 供试菌株 |
| 2.2.2 试验试剂 |
| 2.2.3 供试培养基 |
| 2.2.4 仪器设备 |
| 2.2.5 试验方法 |
| 2.2.5.1 甜瓜棒孢叶斑病的标本采集 |
| 2.2.5.2 病原菌的分离及纯化 |
| 2.2.5.3 病原菌菌落形态观察 |
| 2.2.5.4 病原菌分生孢子形态观察 |
| 2.2.5.5 甜瓜棒孢叶斑病菌菌丝DNA提取 |
| 2.2.5.6 DNA提取质量和浓度检测 |
| 2.2.5.7 甜瓜棒孢叶斑病菌的分子鉴定 |
| 2.2.5.8 甜瓜棒孢叶斑病菌致病性测定 |
| 2.2.5.9 温度对菌丝生长的影响 |
| 2.2.5.10 pH对菌丝生长的影响 |
| 2.2.5.11 碳源对菌丝生长的影响 |
| 2.2.5.12 氮源对菌丝生长的影响 |
| 2.2.5.13 病原菌分生孢子的萌发规律和方式 |
| 2.2.5.14 pH对孢子萌发的影响 |
| 2.2.5.15 碳源对孢子萌发的影响 |
| 2.2.5.16 培养基种类对产孢的影响 |
| 2.2.5.17 不同杀菌剂对甜瓜棒孢叶斑病菌的室内毒力测定 |
| 2.2.5.18 数据处理 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 甜瓜棒孢叶斑病的田间症状 |
| 2.3.2 甜瓜棒孢叶斑病菌菌落形态 |
| 2.3.3 甜瓜棒孢叶斑病菌显微形态 |
| 2.3.4 甜瓜棒孢叶斑病菌菌丝DNA提取质量和浓度 |
| 2.3.5 甜瓜棒孢叶斑病菌分子鉴定 |
| 2.3.6 甜瓜棒孢叶斑病菌致病性测定 |
| 2.3.7 温度对Cc-12 菌株生长的影响 |
| 2.3.8 pH对 Cc-12 菌株生长的影响 |
| 2.3.9 碳源对Cc-12 菌株生长的影响 |
| 2.3.10 氮源对Cc-12 菌株生长的影响 |
| 2.3.11 Cc-12 菌株分生孢子萌发规律和特点 |
| 2.3.12 pH对孢子萌发的影响 |
| 2.3.13 碳源对孢子萌发的影响 |
| 2.3.14 培养基种类对产孢的影响 |
| 2.3.15 22种杀菌剂对甜瓜棒孢叶斑病菌Cc-SY菌株的室内毒力比较 |
| 2.3.16 22种杀菌剂对甜瓜棒孢叶斑病菌Cc-12 菌株的室内毒力比较 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 甜瓜棒孢叶斑病菌全基因组测序 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.2.2.1 甜瓜棒孢叶斑病菌菌丝DNA提取 |
| 3.2.2.2 建库测序和组装 |
| 3.2.2.3 基因组注释 |
| 3.2.2.4 比较基因组分析 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 基因组测序及组装 |
| 3.3.1.1 二代数据量统计 |
| 3.3.1.2 17-mer分析及基因组大小估计 |
| 3.3.1.3 三代组装数据量统计 |
| 3.3.1.4 基因组组装结果 |
| 3.3.1.5 线粒体组装结果 |
| 3.3.1.6 基因组组装评估 |
| 3.3.1.7 单碱基深度统计图 |
| 3.3.1.8 GC含量及深度分布分析 |
| 3.3.2 基因组注释 |
| 3.3.2.1 重复序列注释 |
| 3.3.2.2 基因注释 |
| 3.3.3 基因功能注释 |
| 3.3.3.1 KEGG数据库注释 |
| 3.3.3.2 GO数据库注释 |
| 3.3.3.3 Swiss-Prot数据库注释 |
| 3.3.3.4 NR数据库注释 |
| 3.3.3.5 eggNOG数据库注释 |
| 3.3.3.6 KOG数据库注释 |
| 3.3.4 非编码RNA注释 |
| 3.3.5 比较基因组分析 |
| 3.3.5.1 基因家族鉴定 |
| 3.3.5.2 系统发育分析 |
| 5.3.5.3 分化时间估算 |
| 3.3.5.4 基因家族扩张和收缩分析 |
| 3.3.5.5 基因组共线性分析 |
| 3.3.6 病原真菌致病性研究 |
| 3.3.6.1 病原与宿主互作(PHI)数据库注释 |
| 3.3.6.2 碳水化合物注释 |
| 3.3.6.3 细胞色素P450 数据库(CYPs)注释 |
| 3.3.6.4 分泌蛋白预测 |
| 3.3.6.5 转运蛋白注释 |
| 3.3.6.6 转录因子注释 |
| 3.3.6.7 次级代谢产物注释 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章 根癌农杆菌介导的甜瓜棒孢叶斑病菌遗传转化体系的建立 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 菌株及质粒 |
| 4.2.2 供试培养基 |
| 4.2.3 试剂及耗材 |
| 4.2.4 主要仪器设备 |
| 4.2.5 试验方法 |
| 4.2.5.1 质粒提取 |
| 4.2.5.2 质粒转入大肠杆菌 |
| 4.2.5.3 质粒转入农杆菌 |
| 4.2.5.4 Cc-12 菌株对潮霉素的敏感性 |
| 4.2.5.5 Cef抑制农杆菌正常生长的浓度筛选 |
| 4.2.5.6 Tim抑制农杆菌正常生长的浓度筛选 |
| 4.2.5.7 Cc-12 菌株对抗生素的敏感性 |
| 4.2.5.8 分生孢子的制备 |
| 4.2.5.9 根癌农杆菌细胞的制备 |
| 4.2.5.10 根癌农杆菌与多主棒孢菌共培养 |
| 4.2.5.11 转化子筛选 |
| 4.2.5.12 pH对转化效率的影响 |
| 4.2.5.13 共培养温度对转化效率的影响 |
| 4.2.5.14 共培养时间对转化效率的影响 |
| 4.2.5.15 根癌农杆菌浓度对转化效率的影响 |
| 4.2.5.16 Ca~(2+)浓度对转化效率的影响 |
| 4.2.5.17 Cc-12 转化子基因组DNA的提取 |
| 4.2.5.18 Cc-12 转化子的PCR鉴定 |
| 4.2.5.19 Southern blot检测突变体的T-DNA插入拷贝数 |
| 4.2.5.20 Cc-12 转化子的遗传稳定性分析 |
| 4.2.5.21 表型变异突变体筛选 |
| 4.2.5.22 致病性变异突变体筛选 |
| 4.2.5.23 热不对称PCR |
| 4.2.5.24 重组质粒的筛选 |
| 4.2.5.25 转化子完整T-DNA的扩增 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 质粒提取 |
| 4.3.2 质粒转入农杆菌 |
| 4.3.3 Cc-12 菌株对潮霉素的敏感性 |
| 4.3.4 抑制农杆菌正常生长的Cef浓度筛选 |
| 4.3.5 抑制农杆菌正常生长的Tim浓度筛选 |
| 4.3.6 Cc-12 菌株对抗生素的敏感性 |
| 4.3.7 根癌农杆菌介导的甜瓜棒孢叶斑病菌遗传转化 |
| 4.3.8 Cc-12 转化子的PCR检测 |
| 4.3.9 Southern blot检测Cc-12 转化子的T-DNA插入拷贝数 |
| 4.3.10 Cc-12 转化子的遗传稳定性 |
| 4.3.11 甜瓜棒孢叶斑病菌Cc-12 菌株转化子菌落形态特征比较 |
| 4.3.12 表型变异突变体致病性测定 |
| 4.3.13 致病性变异突变体Southern blot杂交分析 |
| 4.3.14 T-DNA插入侧翼序列扩增 |
| 4.3.15 T-DNA插入侧翼序列分析 |
| 4.3.16 转化子完整T-DNA的扩增 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 结论与展望 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ 部分代表性转化菌株的菌落形态 |
| 附录Ⅱ 表型变异突变体致病性测定(使用孢子) |
| 附录Ⅲ 表型变异突变体致病性测定(使用菌块) |
| 附录Ⅳ 作者简介 |
| 致谢 |
（6）哈茨木霉T2-16防控西瓜枯萎病的微生态机制初探（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 西瓜枯萎病研究进展 |
| 1.1.1 西瓜枯萎病的概述 |
| 1.1.2 西瓜枯萎病的防控技术 |
| 1.2 木霉研究进展 |
| 1.2.1 木霉概述 |
| 1.2.2 木霉防病机制 |
| 1.2.3 木霉对土壤环境的影响 |
| 1.2.4 木霉定殖研究进展 |
| 1.3 土壤微生物群落结构研究进展 |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 1.5 研究内容与技术路线 |
| 1.5.1 研究内容 |
| 1.5.2 研究技术路线 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 试验材料 |
| 2.1.1 供试菌株 |
| 2.1.2 供试培养基 |
| 2.1.3 供试西瓜品种及土壤 |
| 2.2 供试试剂及仪器设备 |
| 2.2.1 供试试剂 |
| 2.2.2 仪器设备 |
| 2.3 哈茨木霉T2-16对西瓜枯萎病发生及植株生长势的影响 |
| 2.3.1 哈茨木霉T2-16孢悬液的制备 |
| 2.3.2 盆栽试验 |
| 2.3.3 西瓜枯萎病发生情况调查 |
| 2.3.4 西瓜植株生长势测定 |
| 2.4 哈茨木霉T2-16防控西瓜枯萎病的行为学探究 |
| 2.4.1 GFP表达载体的构建 |
| 2.4.2 哈茨木霉T2-16转GFP体系优化 |
| 2.4.3 转化子的遗传稳定性检测 |
| 2.4.4 转化子的生物学特性检测 |
| 2.4.5 转化子在西瓜根际的定殖动态变化 |
| 2.5 木霉菌与尖孢镰刀菌西瓜专化型(FON)的数量检测 |
| 2.5.1 西瓜根及根际土壤的采集 |
| 2.5.2 总DNA的提取 |
| 2.5.3 木霉菌的荧光定量检测 |
| 2.5.4 FON的荧光定量检测 |
| 2.6 哈茨木霉T2-16对土壤可培养微生物数量及酶活性的影响 |
| 2.6.1 根际土壤可培养微生物数量的测定 |
| 2.6.2 根际土壤酶活性的测定 |
| 2.7 哈茨木霉T2-16对土壤微生物多样性的影响 |
| 2.7.1 土壤微生物多样性检测 |
| 2.7.2 高通量测序数据分析 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 哈茨木霉T2-16对西瓜枯萎病发生及植株生长势的影响 |
| 3.1.1 哈茨木霉T2-16对西瓜枯萎病发生的影响 |
| 3.1.2 哈茨木霉T2-16对西瓜植株蔓长的影响 |
| 3.1.3 哈茨木霉T2-16对西瓜植株地上部分鲜重的影响 |
| 3.2 哈茨木霉T2-16防治西瓜枯萎病的行为学探究 |
| 3.2.1 GFP表达载体的构建 |
| 3.2.2 哈茨木霉T2-16转GFP体系优化 |
| 3.2.3 转化子的遗传稳定性检测 |
| 3.2.4 转化子的生物学特性检测 |
| 3.2.5 哈茨木霉T2-16在西瓜根际的定殖动态变化 |
| 3.3 木霉菌与尖孢镰刀菌西瓜专化型(FON)数量检测 |
| 3.4 哈茨木霉T2-16对土壤可培养微生物及酶活性的影响 |
| 3.4.1 哈茨木霉T2-16对土壤可培养微生物的影响 |
| 3.4.2 哈茨木霉T2-16对土壤酶活性的影响 |
| 3.5 哈茨木霉T2-16对土壤微生物多样性的影响 |
| 3.5.1 哈茨木霉T2-16对土壤细菌多样性的影响 |
| 3.5.2 哈茨木霉T2-16对土壤真菌多样性的影响 |
| 3.6 土壤微生物与西瓜枯萎病相关性分析 |
| 第4章 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 攻读学位期间所发表的学术论文 |
| 致谢 |
（7）哈茨木霉T2-16的GFP标记及其生防特性（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.1.1 供试菌株与西瓜品种 |
| 1.1.2 质粒与感受态细胞 |
| 1.1.3 培养基 |
| 1.1.4 试剂 |
| 1.2 试验方法 |
| 1.2.1 哈茨木霉T2-16野生型菌株抗生素浓度的筛选 |
| 1.2.2 GFP表达载体的构建 |
| 1.2.3 哈茨木霉T2-16野生型菌株原生质体的制备 |
| 1.2.4 PEG-CaCl2介导的原生质体转化 |
| 1.2.5 哈茨木霉T2-16转化子的筛选及稳定性检测 |
| 1.2.6 哈茨木霉T2-16转化子的分子鉴定 |
| 1.2.7 哈茨木霉T2-16野生型菌株与转化子生长特性的比较 |
| 1.2.8 哈茨木霉T2-16野生型菌株与转化子对不同病原菌的拮抗效果比较 |
| 1.2.9 哈茨木霉T2-16野生型菌株与转化子对西瓜枯萎病的防治效果 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 哈茨木霉T2-16野生型菌株抗生素浓度的筛选 |
| 2.2 GFP表达载体的构建 |
| 2.3 哈茨木霉T2-16转化子的荧光稳定性检测 |
| 2.4 哈茨木霉T2-16转化子的分子鉴定 |
| 2.5 哈茨木霉T2-16野生型菌株与转化子生物学特性比较 |
| 2.6 哈茨木霉T2-16野生型菌株与转化子对不同枯萎病菌的拮抗效果 |
| 2.7 哈茨木霉T2-16野生型菌株与转化子对西瓜枯萎病的防治效果 |
| 3 讨论 |
（8）人参根系自毒物质在连作障碍中的化感作用及其缓解途径研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 人参连作障碍研究进展 |
| 1.1 人参连作障碍及其发生原因 |
| 1.1.1 人参栽培现状 |
| 1.1.2 人参连作障碍及其危害 |
| 1.1.3 人参连作障碍产生原因 |
| 1.2 根系分泌物自毒物质的化感作用 |
| 1.2.1 化感作用的含义及其研究进展 |
| 1.2.2 自毒作用及其危害 |
| 1.2.3 根系分泌物中酚酸物质及其化感自毒作用研究进展 |
| 1.3 人参连作障碍缓解途径研究进展 |
| 1.3.1 人参连作障碍的化学缓解途径 |
| 1.3.2 人参连作障碍的物理缓解途径 |
| 1.3.3 人参连作障碍的生物缓解途径 |
| 1.3.4 人参连作障碍的综合缓解途径 |
| 第二章 连作人参根系分泌物中酚酸物质的化感效应研究 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 试验材料 |
| 2.1.2 人参根系分泌中化感物质的收集与鉴定 |
| 2.1.3 酚酸物质的化感作用 |
| 2.1.4 数据分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 人参根际土壤中化感物质的测定 |
| 2.2.2 酚酸物质对人参种子萌发及幼苗生长的影响 |
| 2.2.3 酚酸物质对人参锈腐病菌菌丝生长的影响 |
| 2.2.4 酚酸物质对人参锈腐病菌孢子萌发的影响 |
| 2.2.5 酚酸物质对人参锈腐病病害严重度的影响 |
| 2.3 小结 |
| 第三章 酚酸物质对人参根际土壤真菌群落结构及多样性的影响 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 试验材料 |
| 3.1.2 土壤样品采集及Illumina平台测序 |
| 3.1.3 数据与生物信息分析处理: |
| 3.2 结果分析 |
| 3.2.1 优化测序结果 |
| 3.2.2 不同处理组人参根系土壤真菌多样性指数分析 |
| 3.2.3 不同处理组人参根系土壤真菌群落结构分析 |
| 3.2.4 不同处理组人参根系土壤真菌群落结构分类学分析 |
| 3.2.5 不同处理组人参根系土壤真菌群落结构主成分分析 |
| 3.2.6 不同处理组对人参生长率、人参锈腐病发病率及病害严重度的影响 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 生防哈茨木霉菌Tri41对人参连作障碍缓解作用研究 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 试验材料 |
| 4.1.2 哈茨木霉菌Tri41对人参锈腐病菌抑制作用 |
| 4.1.3 哈茨木霉菌Tri41对酚酸物质的消减作用 |
| 4.1.4 接种Tri41对人参根系防御酶活性的影响 |
| 4.1.5 数据处理 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.2.1 哈茨木霉菌株Tri41与人参锈腐病菌的对峙培养 |
| 4.2.2 转代对哈茨木霉Tri41菌株抑菌活性的影响 |
| 4.2.3 哈茨木霉菌Tri41对酚酸物质的消减作用 |
| 4.2.4 Tri41对人参根际土壤中酚酸物质的消减作用 |
| 4.2.5 接种哈茨木霉菌Tri41盆栽人参根系防御反应酶系测定 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 木霉菌Tri41GFP在土壤和有机肥中的定殖示踪研究 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 试验材料 |
| 5.1.2 哈茨木霉菌Tri41遗传体系构建 |
| 5.1.3 哈茨木霉菌Tri41转化前后差异分析 |
| 5.1.4 哈茨木霉菌Tri41转化子定殖研究 |
| 5.1.5 数据分析 |
| 5.2 结果与分析 |
| 5.2.1 构建哈茨木霉Tri41菌株遗传转化体系 |
| 5.2.2 转化前后哈茨木霉Tri41生物学差异分析 |
| 5.2.3 在不同有机肥及土壤中哈茨木霉Tri41-g转化子的定殖动态研究 |
| 5.2.4 哈茨木霉Tri41转化子在有无作物的有机肥及土壤中的定殖特性研究 |
| 5.3 小结 |
| 第六章 人参连作障碍的化学防控及物理防控途径研究 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 试验地情况概述 |
| 6.1.2 试验材料 |
| 6.1.3 土壤微生物、理化性质及酶活性测定 |
| 6.1.4 数据分析 |
| 6.2 结果与分析 |
| 6.2.1 土壤微生物区系的测定 |
| 6.2.2 土壤化学性质的测定 |
| 6.2.3 土壤酶活性的测定 |
| 6.2.4 人参生长指标及根部病害发病率的测定 |
| 6.3 小结 |
| 第七章 论文研究结论 |
| 7.1 研究结论 |
| 7.2 论文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表学术论文 |
| 论文图表统计 |
（9）人参生防菌Psn86对有机专用肥适生机制及生防效果研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 生防菌定殖机制研究进展 |
| 1 植物根际生防菌定殖机制研究进展 |
| 1.1 土壤微生物结构和多样性 |
| 1.2 生防菌根际的定殖特性 |
| 1.3 影响生防菌根际定殖的主要因素 |
| 2 植物内生生防菌定制机制研究进展 |
| 2.1 植物内生菌的结构和多样性 |
| 2.2 植物内生菌对植物的影响 |
| 2.3 生防菌植物体内的定殖特性 |
| 3 生物有机肥的应用现状 |
| 3.1 生物有机肥对土壤微生物的影响 |
| 3.2 生物有机肥对土传病害的防治作用 |
| 4 生物技术在生防菌定殖中的应用 |
| 4.1 基因标记技术 |
| 4.2 核酸探针检测技术 |
| 4.3 免疫学技术 |
| 4.4 荧光定量PCR技术 |
| 第二章 哈茨木霉Psn86生物学特性研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 供试方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 不同培养基对哈茨木霉Psn86菌丝生长和产孢量的影响 |
| 2.2 不同pH对哈茨木霉Psn86菌丝生长和产孢量的影响 |
| 2.3 不同温度对哈茨木霉Psn86菌丝生长和产孢量的影响 |
| 2.4 不同碳源对哈茨木霉Psn86菌丝生长和产孢量的影响 |
| 2.5 不同氮源对哈茨木霉Psn86菌丝生长和产孢量的影响 |
| 2.6 不同光照条件对哈茨木霉Psn86菌丝生长和产孢量的影响 |
| 2.7 培养时间对哈茨木霉Psn86菌丝生长和产孢的影响 |
| 3 结论与讨论 |
| 第三章 哈茨木霉Psn86对人参锈腐菌抑制作用研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 供试方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 对峙培养 |
| 2.2 转代培养对菌株抑菌效果的影响 |
| 2.3 挥发性代谢物和难挥发性代谢物对人参锈腐病的拮抗作用 |
| 2.4 哈茨木霉Psn86对人参锈腐病盆栽防效测定 |
| 3 结论与讨论 |
| 第四章 生防菌哈茨木霉Psn86的GFP标记及在土壤和有机肥中的定殖示踪 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 试验材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 哈茨木霉遗传转化体系的建立 |
| 2.2 哈茨木霉Psn86转化前后的生物学异质性 |
| 2.3 哈茨木霉Psn86-g转化子在不同有机肥及土壤中的定殖动态研究 |
| 2.4 哈茨木霉Psn86转化子在有无作物处理的有机肥及土壤中的定殖特性 |
| 3 结论与讨论 |
| 第五章 人参专用菌肥对人参防御酶系的影响 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 供试材料 |
| 1.2 试验方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 过氧化物酶(POD)活性变化 |
| 2.2 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性变化 |
| 2.3 抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性变化 |
| 2.4 H_2O_2含量变化 |
| 2.5 多酚氧化酶(PPO)活性变化 |
| 2.6 过氧化氢酶(CAT)活性变化 |
| 2.7 超氧阴离子自由基(ASAFR)含量变化 |
| 2.8 总超氧化物歧化酶(T-SOD)活性变化 |
| 2.9 谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性变化 |
| 3 结论与讨论 |
| 第六章 结论与讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表论文情况 |
（10）木霉NJAU 4742促生作用及其Hydrophobin家族基因特性研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词及专有词汇检索表 |
| 第一章 文献综述 |
| 1 木霉属真菌Trichoderma的研究重要性 |
| 1.1 木霉菌的促生作用及其机理 |
| 1.2 木霉菌的根际定殖机理 |
| 2 HFB功能研究进展 |
| 2.1 HFB生物学功能研究进展 |
| 2.2 HFB对胁迫条件的反应 |
| 2.3 HFB参与真菌与其他生物互作 |
| 2.4 HFB与另一真菌小蛋白家族Cerato-Platanin(CP)的异同点 |
| 3 本研究的目的、意义和技术路线 |
| 3.1 本研究的目的和意义 |
| 3.2 研究技术路线 |
| 参考文献 |
| 第二章 木霉NJAU 4742菌株的促生作用与田间定殖效果研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 NJAU 4742菌株盆栽促生效果 |
| 2.2 NJAU 4742菌株不同次生代谢物的促生活性 |
| 2.3 不同浓度P19物质的促生活性 |
| 2.4 促生物质P19结构鉴定 |
| 2.5 NJAU 4742菌株田间促生效果 |
| 2.6 NJAU 4742菌株根际定殖效应 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第三章 木霉HFB家族成员鉴定及其HFBome转录响应 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 木霉HFB系统发育进化树 |
| 2.2 NJAU 4742菌株的hfb基因命名 |
| 2.3 NJAU 4742菌株菌丝HFBome转录响应 |
| 2.4 NJAU 4742菌株孢子HFBome转录响应 |
| 3 讨论 |
| 4 本章结论 |
| 参考文献 |
| 第四章 毕赤酵母高效分泌HFB蛋白的表达系统构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 酵母HFB表达载体的构建 |
| 2.2 HFB重组蛋白的获得与验证 |
| 2.3 HFB重组蛋白的功能特性鉴定 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第五章 木霉hfb4敲除株和超表达株的构建 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 hfb4基因敲除载体构建 |
| 2.2 hfb4基因超表达载体构建 |
| 2.3 hfb4敲除突变子筛选 |
| 2.4 hfb4超表达突变子筛选 |
| 2.5 超表达菌hfb4基因拷贝数鉴定 |
| 2.6 突变子hfb4转录水平鉴定 |
| 2.7 突变子HFB4蛋白表达鉴定 |
| 2.8 hfb4基因编辑对其他hfb基因的影响 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 第六章 木霉hfb4基因功能研究 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 木霉hfb4突变子菌丝生物量 |
| 2.2 木霉hfb4突变子生长速度 |
| 2.3 木霉hfb4突变子气生菌丝形成能力 |
| 2.4 木霉hfb4突变子孢子和菌丝表面疏水性 |
| 2.5 木霉hfb4突变子气生孢子传播能力 |
| 2.6 木霉hfb4突变子机械损伤反应 |
| 2.7 木霉hfb4突变子抗杀真菌制剂能力 |
| 2.8 木霉hfb4突变子抗氧化剂能力 |
| 2.9 木霉hfb4突变子植物根系定殖力 |
| 2.10 木霉hfb4突变子生物膜形成 |
| 2.11 木霉hfb4植物病原真菌拮抗力 |
| 2.12 不同供试菌株孢子和菌丝HFBome的转录响应 |
| 2.13 不同供试菌株hfb4对机械损伤的转录响应 |
| 3 讨论 |
| 4 本章小结 |
| 参考文献 |
| 全文总结及研究展望 |
| 一 全文总结 |
| 二 研究展望 |
| 创新点 |
| 附录 |
| 附录1 木霉属真菌系统发育进化树 |
| 附录2 丝状真菌Hydrophobin基因功能研究进展 |
| 附录3 酵母用BMG和BMM培养基配方 |
| 附录4 15%浓度SDS-PAG凝胶配制方法 |
| 附录5 木霉Trichoderma guizhouense NJAU 4742、T.harzianum CBS226.95及相关hfb4突变子在GSM培养基表面形成气生菌丝的能力及其对外源添加HFB4蛋白的响应 |
| 博士期间已发表和待发表论文及发明专利 |
| 一 已发表论文 |
| 二 待发表论文 |
| 三 发明专利 |
| 致谢 |
四、对哈茨木霉转化子菌体形态观察及抗药性测定（论文参考文献）
- [1]绿木霉菌GV29-8厚垣孢子形成分子机制研究[D]. 彭新红. 中国农业科学院, 2021
- [2]TasMYB27转录因子调控棘孢木霉抗链格孢菌分子机制[D]. 韩静. 东北林业大学, 2021(08)
- [3]海盐诱导下哈茨木霉对潮霉素B的耐药机制探究[D]. 于溪佳. 北京化工大学, 2020(02)
- [4]深绿木霉荧光蛋白标记体系构建及对西洋参根腐病的生防作用研究[D]. 李俊辉. 齐鲁工业大学, 2020(02)
- [5]甜瓜棒孢叶斑病菌鉴定及农杆菌介导的遗传转化体系建立[D]. 李俊香. 华中农业大学, 2019
- [6]哈茨木霉T2-16防控西瓜枯萎病的微生态机制初探[D]. 田程. 湖南大学, 2019(06)
- [7]哈茨木霉T2-16的GFP标记及其生防特性[J]. 田程,张屹,肖姬玲,朱菲莹,唐炎英,魏林,梁志怀. 中国生物防治学报, 2019(02)
- [8]人参根系自毒物质在连作障碍中的化感作用及其缓解途径研究[D]. 李自博. 沈阳农业大学, 2018(04)
- [9]人参生防菌Psn86对有机专用肥适生机制及生防效果研究[D]. 解宇娇. 沈阳农业大学, 2018(11)
- [10]木霉NJAU 4742促生作用及其Hydrophobin家族基因特性研究[D]. 蔡枫. 南京农业大学, 2017(07)